KR20220032005A - Atpase-매개 질환 치료용 조성물 및 방법 - Google Patents

Atpase-매개 질환 치료용 조성물 및 방법 Download PDF

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보리스 칸토르
아라빈드 아소칸
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드와이트 코에벨
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듀크 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 대상체에서 ATPase-매개 질환의 치료를 위한 핵산 발현 카세트, 벡터, 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

ATPASE-매개 질환 치료용 조성물 및 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 5월 14일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/847,416호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
연방 후원 설명
본 발명은 국립중개과학발전센터(National Center for Advancing Translational Sciences)에 의해 수여된 보조금 번호 제UL1TR002553호 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 연방 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
전자적으로 제공된 서열 목록의 참조에 의한 포함
본 출원은 90 kb의 바이트 크기를 갖고, 2020년 5월 14일에 생성된 전자 텍스트 파일명 "20-489-WO_SequenceListing_ST25.txt"으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 이러한 전자 파일에 포함된 정보는 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 핵산 발현 카세트, ATPase 예컨대 ATP1A3을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 및 이의 조성물, 및 대상체에서 ATPase-매개 질환의 치료를 위한 유전자 치료 방법을 제공한다.
소아성 교대성 편마비(AHC: Alternating Hemiplegia of Childhood)는 심각한 발달 장애, 편마비 에피소드, 튜불린, 간질, 행동 문제, 및 종종 퇴행으로도 나타나는 파괴적인 신경 장애이다. AHC는 3.2/1000 환자/년 및 29세까지 적어도 4.5%로 추산되는 심각한 이환율 및 사망률 증가를 유발한다(문헌[Panagiotakaki et. al. (2015) Orphanet J Rare Dis. 10: 123]). 이는 약 1,000,000 명의 소아 중 1 명에게 영향을 미친다. 사례의 약 80%는 ATP1A3 돌연변이에 의해 발생하며 D801N 돌연변이가 가장 흔한 돌연변이이다(환자의 약 40%). AHC는 ATPase 돌연변이에 의해 유발되는 ATPase-관련 질환의 한 예이며 ATP1A3 돌연변이에 의해 유발되는 가장 흔한 장애이다. ATPase-관련 질환은 또한 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환과 같은 다른 원인으로 인한 2차 ATPase 결핍 장애를 포함한다.
ATP1A3은 뉴런에서 발현되는 Na/K-ATPase 단백질의 주요 서브유닛인 반면, ATP1A2는 신경교(glia)에서 발현된다. ATP1A3는 효소이고, 신호 전달 인자이며, 가장 중요한 것은, 뇌 에너지의 50%를 소비하는 펌프이다(문헌[Holm et al. (2016) Biochem Biophys Acta. 1857(11): 1807-1828]). ATP1A3 돌연변이로 인한 원발성 Na/K-ATPase 기능장애는 AHC 및 기타 신경유전 장애를 유발한다. 또한, 다른 일반적인 신경 장애로 인한 이 펌프의 2차 기능장애는 간질, 뇌졸중, 저혈당, 급성 운동실조, 근긴장 이상을 포함하는 이러한 장애의 병태 생리와 알츠하이머병 및 파킨슨병을 포함한 신경퇴행성 질환의 뉴런 사멸에 기여한다. D801N 및 I810N을 포함하여 돌연변이를 유발하는 ATP1A3 질환은 신경 흥분성의 심각한 이상을 초래한다(문헌[Hunanyan et al. (2015) Epilepsia 56(1): 82-93]; 문헌[Hunanyan et al. (2018) Epilepsia 59(7): 1455-1468]; 문헌[Helseth et al. (2018) Neurobiol Dis. 119: 100-112]). 정상 수준의 ATP1A3 단백질 발현에도 불구하고, 이러한 돌연변이는 HeLa 세포 및 COS 세포(정상의 약 54%로 감소) 및 마우스 뇌(정상의 약 58%로 감소)에서 ATPase 효소 활성을 감소시킨다(문헌[Heinzen et al. (2012) Nat Genet. 44(9): 1030-1034]; 문헌[Clapcote et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA. 106(33): 14085-14090]; 문헌[Kirshenbaum et al. (2013) PLoS One. 8(3): e60141]).
현재, AHC에 사용할 수 있는 유일한 치료법은 칼슘 채널 차단제 플루나리진이며, 이는 편마비 발작의 부분적 감소를 유발하지만 일반적으로 질환의 다른 매우 심각한 징후에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, AHC를 비롯한 ATP1A3-매개 질환의 치료를 위한 새롭고 효과적인 치료법이 필요하다. 또한 다른 ATPase 활성의 2차적 결핍 또는 심각한 뇌전증성 뇌병증(epileptic encephalopathy)을 초래하는 ATP1A2 돌연변이와 같은 다른 ATPase의 돌연변이로 인한 다른 장애를 치료하기 위한 효과적인 치료법이 절실히 필요하다.
본 개시내용은 부분적으로, 대상체에서 ATPase-매개 질환(예컨대, AHC)의 치료를 위한 핵산 발현 카세트, 벡터, 약학 조성물, 키트, 및 방법을 제공한다.
본 개시내용의 일 양태는 ATPase를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, ATPase는 ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP2C1, ATP6A1, ATP6V1B1, ATP6V0A4, ATP7A, ATP7B, 또는 ATP11C이다. 일부 실시형태에서, ATPase는 ATP1A3이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, ATPase를 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07 중 어느 하나로 기재된 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체, 또는 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 서열과 적어도 50% 내지 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 핵산 발현 카세트는 CpG 메틸화 부위를 감소시키고 포유류 발현을 위해 코돈-최적화된 ATP1A3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 핵산 발현 카세트는 프로모터 및 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된 ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터(예컨대, 뉴런-특이적 프로모터 또는 심장-특이적 프로모터)이다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 뉴런-특이적 프로모터는 시냅신 1, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II, 튜불린 알파 1, 뉴런-특이적 에놀라제, 및 혈소판-유래 성장 인자 베타 사슬 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 프로모터는 인간 시냅신 프로모터이며, 이는 시냅손 1 프로모터의 근위 영역(-422 내지 -22)을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 인간 시냅신 프로모터는 SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, 또는 SEQ ID NO: 09 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적으로 활성 프로모터, 예컨대 인간 β-액틴, 인간 신장 인자-1α, 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서와 조합된 닭 β-액틴, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40, 또는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 핵산 발현 카세트는 전사 종결 신호, 예컨대 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA), 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 신호(SV40pA), 또는 합성 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 ATPase를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, ATPase는 ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP2C1, ATP6A1, ATP6V1B1, ATP6V0A4, ATP7A, ATP7B, 또는 ATP11C이다. 다른 실시형태에서, ATPase는 ATP1A3이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 헤르페스 단순 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 알파바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라브도바이러스 벡터, 홍역 바이러스 벡터, 뉴캐슬병 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 또는 피코나바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 및 AAV13로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형이다. 본 개시내용의 다른 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 AAV1, AAV8, 또는 AAV9로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형이다. 본 개시내용의 또 다른 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 AAV9이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 벡터는 AAV9-hSyn-ATP1A3-p2A-mCherry(pBK828) 벡터를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, ATPase를 코딩하는 핵산 서열은 벡터 내의 핵산 발현 카세트에 포함되어 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 벡터는 다음의 요소: (a) 역위 말단 반복 서열(ITR); (b) 프로모터; (c) 전사 종결자; 및 (d) 플랭킹 역위 말단 반복 서열(ITR) 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 벡터는 조직 특이적 프로모터, 예컨대 뉴런-특이적 프로모터, 근육-특이적 프로모터, 간-특이적 프로모터, 또는 심장-특이적 프로모터를 포함한다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 벡터는 인간 시냅신 프로모터로부터 유도되는 프로모터를 포함하며, 이는 SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, 또는 SEQ ID NO: 09 중 어느 하나로 기재된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 벡터는 구성적으로 활성 프로모터, 예컨대 인간 β-액틴, 인간 신장 인자-1α, 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서와 조합된 닭 β-액틴, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40, 및 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 벡터는 전사 종결자, 예컨대 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA), 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 신호(SV40pA), 또는 합성 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 ATPase를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 ATPase를 코딩하는 핵산 서열 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체에서 ATPase-매개 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기술된 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 이의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 이에 따라 대상체에서 ATPase-매개 질환이 치료 또는 예방된다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 이의 조성물은 근육 내 주입, 전신적으로, 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구적으로, 대뇌내부심실로(intracerebraoventricularly), 대조내(intra-cisterna magna), 해마내(intrahippocampal), 및 척추강내(intrathecally)로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, 대상체는 E815K 돌연변이, D801N 돌연변이, I180N 돌연변이, R756C 돌연변이, 또는 V589F 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 ATP1A3 단백질 돌연변이를 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, ATPase-매개 질환은 급속-발병 근긴장 이상-파킨슨병(RDP: rapid-onset dystonia-parkinsonism), 소아성 교대성 편마비 (AHC: alternating hemiplegia of childhood), 뇌전증성 뇌병증(EE: epileptic encephalopathy), 소뇌성 운동실조증(cerebellar ataxia), 무반사(areflexia), 요족(pes cavus), 시신경 위축(optic atrophy) 및 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)(CAPOS) 증후군, 열 유발 발작성 무력증 및 뇌병증(FIPWE: fever induced paroxysmal weakness and encephalopathy), 소뇌성 운동실조증의 재발성 에피소드(RECA: recurrent episodes of　cerebellar ataxia), 조기-발병 정신분열증(early-onset　schizophrenia) 편측 마비가 없는 안면 뇌병증 MRI 이상의 근긴장 이상(D-DEMO: Dystonia Dysmorphism of the face Encephalopathy MRI abnormalities without hemiplegia) 증후군 및 소아성 급속 발병 운동실조(CROA)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, ATPase-매개 질환은 AHC이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 ATPase-매개 질환(예컨대, AHC)의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 핵산 발현 카세트, 벡터, 또는 이의 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 ATPase-매개 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 본 개시내용의 조성물 및 사용 지침을 포함한다.
도 1은 본원에 기술된 핵산 발현 카세트, 벡터 및 조성물에 사용될 수 있는 다음의 요소 5' ITR, hSyn 프로모터, ATP1A3 트랜스진, cMyc 태그, FLAG 태그, p2A 펩티드, mCherry, 폴리 A(pA), 및 3' ITR을 포함하는 대표적인 단리된 핵산 분자의 개략도이다.
도 2는 pBK828(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA, 활성 벡터)을 포함하는 AAV 벡터의 구조물 맵이다.
도 3은 pBK292(대조군 벡터)를 포함하는 AAV 벡터의 구조물 맵이다.
도 4는 본 개시내용의 일 실시형태에 따라 3 mM 우아바인(Na/K-ATPase의 특이적 억제제)의 존재 및 부재 하에 AAV-cherry(n=2)가 주입된 것에 비해 해마 내로 AAV-ATP1A3-cherry(n=2) 바이러스가 주입된 성체 야생형(WT) 마우스의 해마에서의 ATPase 활성에 대한 AAV-ATP1A3의 영향을 나타내는 막대 그래프이다. AAV를 각각의 후면(dorsal) 해마 내로 실질-내(intra-parenchymal) 반구 당 1 μL를 주입하였다(4 × 1013 vg/mL, 마우스 당 총 2 μL).
도 5는 트랜스진이 결여된 대조군 벡터(AAV9-CTL, 각 군에서 n=3)와 비교하여 P40 WT 마우스의 동측 해마 우아바인-민감성 ATPase 활성(nmol Pi/mg 단백질/분)에 대한 P10의 외측(lateral) 뇌실(ventricle)에 활성 벡터(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA, AAV9-Tr로 지칭됨, 4 × 1013 vg/mL의 5 μL 용량)의 일측(unilateral) 대뇌내부심실내(ICV) 주입의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6a 내지 6b는 20 × 1010 vg(V=4 × 1013 vg/mL의 5 μL) 마우스의 해마내 주입 후 10일차에 성체 Mashl+/- 마우스에서 AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 형질도입을 나타내는 에피형광(epifluorescence) 이미지이다. 도 6a는 CA1 해마 피라미드 층의 뉴런 이미지이다. 도 6b는 동일한 마우스의 뉴런간 지향층(stratum oriens)의 이미지이다.
도 7a 내지 7b는 본 개시내용의 일 실시형태에 따라 P10에서 우측 외측 뇌실에서 ICV 주입 4주 후 AAV9-ATP1A3-mCherry-FLAG(4 × 1013 vg/mL; V=5 μL)의 mCherry 발현을 나타내는 공초점 이미지이다. 도 7a는 CA1 복부(ventral) 해마를 나타낸다. 도 7b는 소뇌 푸르키니에(Purkinje) 세포 및 깊은 핵(삽입)을 나타낸다. DAPI로 염색된 이미지(푸른색). 붉은색은 mCherry이다. 스케일 바는 50 μm이다. n=3 마우스
도 8은 Mashl+/- 마우스에서 빔 시험에 대한 AAV-ATP1A3-Cherry 및 AAV-cherry의 효과를 나타내는 그래프이다. 20 × 1010 vg(부피 5 μl)의 활성 벡터의 해마로의 일측 해마내 주입을 2 내지 3개월령 마우스에서 수행하였다. 주입 후 3주차에 시험을 수행하였다.
도 9a 내지 9f는 FLAG-태그 녹색 형광, mCherry 적색 형광 및 청색의 DAPI(염색 핵)에 의해 평가된 벡터 형질도입을 나타내는 공초점 이미지이다. P10으로 주입을 수행하고 P40으로 희생시켰다. 도 9a는 해마 CA3 영역 벡터 형질도입(20 × 1010 vg의 일측 ICV 주입)을 나타내는 이미지이다. 도 9b는 도 9a에서 박스인, CA3 영역을 촬영한 고배율 이미지를 나타내는 이미지이다. 도 9c는 동일한 ICV 용량을 유사하게 주입한 후 해마 CA1 영역에서의 발현을 나타내는 이미지이다. 도 9D는 동일한 ICV 용량을 유사하게 주입한 후, CA1 영역에서 또한 촬영한, 고배율 이미지를 나타내는 이미지이다. 도 9e는 대조내(ICM) 주입 2시간 후 0.4% 트립판 블루의 소뇌의 염색을 나타내는 이미지이며 소뇌의 강력한 염색을 나타낸다. 도 9f는 AAV9-ATP1A3-mcherrry(15 × 1010 vg)의 ICM 주입 후 소뇌 벡터 형질도입을 나타내는 이미지이다. 강력한 바이러스 벡터 매개 발현을 나타내는 강력한 신호가 소뇌 푸르키니에 세포에서 나타났지만 더 깊은 영역에서는 나타나지 않았다. 도 9a, 도 9b 및 도 9c의 스케일 바는 10이고, 도 9b는 5 ㎛이고 도 9e는 20 ㎛이다.
도 10a 내지 10h는 P40에서 리포터 유전자 발현을 나타낸다(모두 공초점 병합 이미지, FLAG, 녹색; mCherry, 적색; DAPI, 푸른색으로 핵 염색): 해마(a, b)에서 높고 ICM 주입 부위(e)에 가까운 소뇌. 피질(c, d)에서 더 낮고, P10에서 각각 9 × 1010(총 27 × 1010 vg/마우스)의 벡터 주입된 ICM 및 양측 ICV 후 ICM 주입 부위(f), 뇌간(g) 및 시상(h)에서 멀리 떨어진 소뇌의 임의의 곳에 있는 경우 매우 낮다. 도 10a는 해마 CA1 영역에서 P40에서 리포터 유전자의 발현 이미지이다. 도 10b는 도 10a의 이미지의 고출력 이미지이다. 도 10c는 감각운동 피질에서 리포터 유전자의 발현 이미지이다. 도 10d는 도 10c의 이미지 확대이다. 도 10e는 ICM 주입 부위에 가까운 소뇌에서 리포터 유전자의 발현 이미지이다. 도 10f는 ICM 주입 부위에서 멀리 떨어진 소뇌에서 리포터 유전자의 발현 이미지이다. 도 10g는 중뇌에서 리포터 유전자의 발현 이미지이다. 도 10h는 시상에서 리포터 유전자의 발현 이미지이다. 스케일 바=100 μm(a, c), 10 μm(b, d) 및 500 μm(e 내지 h).
도 11은 ICM 및 ICV 주입을 통해 처리된 하기 마우스 군 중 냉수 유도 편마비의 비교를 나타내는 그래프이다: WT 비주입 마우스(나이브), 대조군 벡터로 처리한 WT 마우스(WT CTRL), 활성 벡터로 처리한 WT(WT 처리), 대조군 벡터로 처리한 Mashl+/- 마우스(Het CTRL), 및 활성 벡터로 처리한 Mashl+/-(Het 처리). 마우스에 P10(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 22.5 × 1010 vg/동물, 또는 ATP1A3 트랜스진이 없는 대조군 벡터로, 각 부위에서 7.5 × 1010vg에서 각 외측 뇌실에 ICM 및 양측 ICV를 주입하였다. 비교군은 WT 나이브(n=10), WT-CTRL 군(n=10), WT-처리(n=4), Het-CTRL(n=10), Het-처리(n=9)였다. 이들을 P40에서 비교하였다.
도 12는 ICM 및 ICV 주입(Het 처리)을 통해 대조군 벡터(Het CTRL)로 처리한 Mashl+/- 마우스와 활성 벡터로 처리한 Mashl+/- 사이에 냉수 유도 근긴장 이상의 지속기간 비교를 나타내는 그래프이다. 마우스에 P10(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 22.5× 1010 vg/동물, 또는 ATP1A3 트랜스진이 없는 대조군 벡터로, 각 부위에서 7.5 × 1010 vg, [0045]와 같이)에서 각 외측 뇌실에 ICM 및 양측 ICV를 주입하고 P40에서 비교하였다.
도 13은 ICM 및 ICV 주입(Het 처리)을 통해 대조군 벡터(Het CTRL)로 처리한 Mashl+/- 마우스와 활성 벡터로 처리한 Mashl+/- 사이에 냉수 유도 발작의 비교를 나타내는 그래프이다. 마우스에 P10으로 각 외측 뇌실에 ICM 및 양측 ICV를 주입하고, P40(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40-polyA 22.5 × 1010 vg/동물, 각 부위에서 7.5 × 1010 vg에서, [0045] 같이)에서 희생시키고 P40에서 비교하였다.
도 14는 ICM 및 ICV 주입을 통해 처리된 다음의 마우스 군 중 균형 빔을 가로지르는 시간의 비교를 나타내는 그래프이다: WT 비주입 마우스(나이브), 대조군 벡터로 처리한 WT 마우스(WT CTRL), 활성 벡터로 처리한 WT(WT 처리), 대조군 벡터로 처리한 Mashl+/- 마우스(Het CTRL), 및 활성 벡터로 처리한 Mashl+/-(Het 처리). 마우스에 P10((AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 22.5 × 1010 vg/동물, 또는 ATP1A3 트랜스진이 없는 대조군 벡터로, 각 부위에서 7.5 × 1010 vg, [0045]와 같이)에서 각 외측 뇌실에 ICM 및 양측 ICV를 주입하고 P40에서 비교하였다.
도 15는 P10에서 활성 벡터가 주입된 마우스에서 상기 [0045]에 기술된 상기 ICM 및 양측 ICV 활성 및 대조군 벡터 주입 요법으로 주입된 마우스에서 생존에 대한 주요 긍정적인 효과를 나타내는 처리군 및 대조군을 비교하는 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내는 그래프이다(p=0.009). 군은 대조군 벡터로 처리한 WT 마우스(WT CTRL), 활성 벡터로 처리한 WT(WT 처리), 대조군 벡터로 처리한 Mashl+/- 마우스(Het CTRL), 및 활성 벡터로 처리한 Mashl+/-(Het 처리)였다. 마우스에 P10(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 22.5 × 1010 vg/동물, 또는 ATP1A3 트랜스진이 없는 대조군 벡터로, 각 부위에서 7.5 × 1010 vg, [도 11 의 도면의 설명]과 같이)에서 각 외측 뇌실에 ICM 및 양측 ICV를 주입하고 P90을 통해 성체를 추적하였다.
도 16은 3마리 마우스 WT-Tr(소뇌), WT-CTL(소뇌) 및 HET-Tr(해마)의 웨스턴 블롯이다. FLAG 밴드는 상부 밴드이고 β 액틴은 하부 밴드이다. 마우스에 P10(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 22.5 × 1010 vg/동물, 또는 ATP1A3 트랜스진이 없는 대조군 벡터로, 각 부위에서 7.5 × 1010 vg, 9 내지 10/군)에서 각 외측 뇌실에 ICM 및 양측 ICV를 주입하고 P90 후 웨스턴 블롯을 위해 희생시켰다.
도 17은 P10에서 ICM 및 양측 ICV 주입를 조합하고 P90(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 22.5 × 1010 vg/동물, 또는 ATP1A3 트랜스진이 없는 대조군 벡터로, 각 부위에서 7.5 × 1010 vg) 후 희생시킨 해마에서 처리군 및 대조군의 웨스턴 블롯 농도측정 결과를 비교하는 그래프이다. WT CTRL, n=2 마우스; 활성 벡터로 처리한 WT(WT 처리), n=2 마우스; Mashl+/- CTRL (HeT CTRL), n=2 마우스; 활성 벡터로 처리한 Mashl+/-(Het 처리), n=3 마우스.
본 개시내용의 원리의 이해를 촉진하기 위해, 이제 바람직한 실시형태에 대한 참조가 이루어질 것이며 특정 언어가 이를 설명하기 위해 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 개시내용의 범위에 대한 어떠한 제한도 의도되지 않으며, 본 개시내용과 관련된 당업자에게 통상적으로 발생하는 바와 같이 본원에 예시된 바와 같이 본 개시내용의 그러한 변경 및 추가 수정이 고려된다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 관사 "하나의(a, an)"는 본원에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하는데 사용된다. 예컨대, "하나의 요소"는 적어도 하나의 요소를 의미하고 하나 초과의 요소를 포함할 수 있다.
"약"은 주어진 값이 원하는 결과에 영향을 미치지 않고 끝점에 "약간 위" 또는 "약간 아래"일 수 있음을 제공함으로써 수치 범위 끝점에 유연성을 제공하는데 사용된다. 수치와 관련된 용어 "약"은 수치가 수치의 5% 이하 만큼 플러스 또는 마이너스로 변할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포괄하다(include)" 및 변형(예컨대, "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)" 및 "포괄하다(includes)", "포괄하는(including)")은 언급된 성분, 특징, 요소, 또는 단계 또는 성분, 특징, 요소 또는 단계의 군을 포괄하는 것을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하는 것은 아님을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는"은 대안적인("또는") 것으로 해석되는 경우 조합의 결여뿐만 아니라 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 지칭하고 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 전이 어구 "본질적으로 이루어진"(및 문법적 변형)은 청구된 발명의 언급된 물질 또는 단계를 포함하는 것 "및 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"으로 해석되어야 한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 동등한 것으로 해석되어서는 안된다.
또한, 본 개시내용은 또한 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예컨대, 명세서에서 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함한다고 언급한 경우, A, B 또는 C 중 임의의 것, 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략되고 포기(disclaimed)될 수 있다는 것이 특히 의도된다.
본원의 값의 범위를 언급하는 것은 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 개별적인 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서 역할을 하기 위한 것일 뿐이며, 각각의 개별적인 값은 마치 개별적으로 본원에서 인용되는 것처럼 본 명세서에 포함된다. 예컨대, 농도 범위가 1% 내지 50%로 언급되는 경우, 2% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 1% 내지 3% 등과 같은 값이 본 명세서에서 명시적으로 열거되는 것으로 의도된다. 이들은 구체적으로 의도된 예일 뿐이며, 열거된 최소값과 최대값 사이에 그리고 이를 포함하는 수치 값의 모든 가능한 조합이 본 개시내용에서 명시적으로 언급되는 것으로 간주되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 용어는 본 개시내용이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
ATPASE-매개 질환의 유전자 치료
본 발명자들은 플루나리진에 대한 반응을 포함하는 인간 상태를 충실하게 재현하는 D801N 돌연변이(본원에서 Mashlool, Mashl, 또는 Mashl+/-로 지칭됨)의 녹-인 마우스 모델을 개발하였으며, 이는 인간에서 관찰되는 것과 유사하다.유전적 ATP1A3 질환을 치료하기 위해 유전자 요법을 사용하는 것을 지지하는 것은 I810N ATP1A3 돌연변이를 보유하는 마우스 모델에서 비록 다르지만 야생형 Atp1a3 유전자를 함유하는 박테리아 인공 염색체(BAC: bacterial artificial chromosome)를 수정된 난모세포의 전핵에 주입함으로써 행동 이상을 구조했다는 것이다. 이러한 행동 개선은 뇌-특이적 Na+, K+-ATPase 활성의 16% 증가와 관련이 있었다. 대안적인 접근법은 유전자 치료법을 사용하는 것이다. 이러한 접근법은 마우스 모델 및 인간에서 희귀하고 심각한 신경유전 장애에 대한 유망한 치료법으로 입증되었다. AHC에서 효과적인 것으로 입증될 수 있는 유전자 치료법은 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 2차 ATPase 결핍의 다른 신경 장애의 치료에 영향을 미칠 수 있는데, 그 이유는 이러한 장애에서 ATP1A3 기능장애가 뉴런 사멸 및 퇴행을 담당하는 것으로 나타났기 때문이다. 이는 상기 I810N 모델(문헌[Clapcote et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 106(33): 14085-14090]) 및 ATPase 활성의 약 40% 감소를 야기하는 ATP1A3의 돌연변이인 D801N 모델(240+19, 야생형에서 및 134+25 nmol Pi/분/mg 단백질, Mashl 마우스에서, 각 군에서 n=3, p= 0.002)에서 나타났다. 이들은 또한 돌연변이 마우스에서 비정상적인 해마 발화 및 행동 이상을 유발한다(문헌[Clapcote et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 106(33): 14085-14090]; 문헌[Hunanyan et al. (2015) Epilepsia 56(1):82-93]; 문헌[Hunanyan et al. (2018) Epilepsia 59(7): 1455-1468]; 문헌[Masoud et al. (2017) Curr Treat Options Neurol. 19(2):8]; 문헌[Heinzen et al. (2012) Nat Genet. 44(9):1030-1034]; 문헌[Helseth et. al. (2018) Neurobiol Dis. 119:100-112]; 문헌[Holm et al. (2016) Biochim Biophys Acta. 1857(11):1807-1828]; 문헌[Ikeda et al. (2017) Brain Res. 1666: 27-37]).
해마는 α-서브유닛 돌연변이가 있는 인간 환자(및 마우스)가 측두엽 기원의 발작을 일으키고 기억력 결손을 갖기 때문에 AHC 표현형과 관련된 뇌 영역 중 하나이다. AHC 표현형과 관련된 또 다른 영역은 대뇌 피질이다. AHC 돌연변이가 있는 인간 및 마우스 둘 모두는 또한 신피질 발병 발작, 행동 장애 및 인지 결손을 나타낸다. 또한, 기저핵, 소뇌 및 시상은 근긴장 이상, 운동 제어 이상 및 운동실조로 인해 관련이 있다. 소뇌가 특히 관심 영역이다. 이는 AHC 환자가 항상 운동실조가 있고, 종종 PET 스캔에서 소뇌 대사저하 및 MRI에서 소뇌 위축이 있기 때문이며 소뇌가 근긴장 이상 발생에 관여하기 때문이다(문헌[Severino et al. (2020) J Neurol. 2020 May;267(5):1300-1311]; 문헌[Ghusayni et al. (2020) European J Ped Neurol; Feb 13:S1090-3798(20)30032-5]; 문헌[Isaksen et al. (2017) PLoS Genet. 13(5): e1006763]). 실시예 섹션에서 본원에 기술된 결과는 다른 신경유전 장애에서의 연구와 유사한 D801N 마우스 모델에서 유전자 치료법의 치료 효과를 뒷받침한다. 본원에 기술된 결과는 효소, 펌프, 및 신호 전달 인자를 표적으로 하는 유전자 치료법을 구성하는 임의의 ATPase 결핍의 효과적인 유전자 치료법의 최초 입증이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ATPase-매개 질환"은 ATPase를 코딩하는 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는 질환 및/또는 장애를 지칭한다. 용어 "ATPase"는 아데노신 트리포스페이트(ATP)에서 포스페이트 결합의 가수분해를 촉매하여 아데노신 디포스페이트(ADP) 또는 역반응을 형성하는 효소의 부류를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ATP1A3-매개 질환"은 ATP1A3 유전자의 돌연변이 또는 ATP1A3 단백질 펌프의 기능장애를 특징으로 하는 질환 및/또는 장애를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ATP1A3"은 ATPase Na+/K+ 수송 서브유닛 알파 3[Homo Sapiens(인간)] 유전자를 지칭하며, 여기서 이러한 유전자에 의해 코딩된 단백질은 P-형 양이온 수송 ATPase의 패밀리, 및 Na+/K+ -ATPase의 서브패밀리에 속한다. Na+/K+-ATPase는 원형질막을 가로질러 Na+ 및 K+ 이온의 전기화학적 구배를 설정하고 유지하는 역할을 하는 통합 막 단백질이다. 본 개시내용에 따르면, ATP1A3 단백질을 코딩하는 추가 핵산 서열과 함께 또는 이와 조합하여 기능하는 ATP1A3 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ATP1A3 폴리뉴클레오티드"는 ATP1A3 단백질을 코딩하고, 벡터, 플라스미드, 또는 번역가능한 구조물에 존재하는 경우 세포, 조직, 기관 또는 유기체에서 이러한 ATP1A3 단백질을 발현하는 임의의 핵산 중합체이다. ATP1A3 폴리뉴클레오티드는 세포 내부에서 발현되는 전구체 분자를 포함한다. ATP1A3 폴리뉴클레오티드 또는 이의 처리된 형태가 플라스미드, 벡터, 게놈, 또는 세포 내 전달용 다른 핵산 발현 벡터에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, ATP1A3 폴리뉴클레오티드는 AAV 바이러스 게놈의 성분으로서 설계되어 AAV 바이러스 입자로 포장되며, 이는 세포 내에서 처리되어 야생형 ATP1A3 단백질을 발현한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형 ATP1A3 단백질"은 UniProtKB No. P13637을 갖는 ATP1A3 단백질, 또는 임의의 자연 발생 이소형 또는 ATP1A3의 상이한 이소형을 코딩하는 전사 변이체를 코딩하는 임의의 다수의 대안적으로 스플라이싱된 전사 변이체를 포함하는, ATP1A3 유전자에 의해 코딩된 변이체일 수 있다. 야생형 ATP1A3 단백질은 또한 자연 발생 APT1A3 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 보유하는 자연 발생 ATP1A3 단백질 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 서열 동일성을 갖는 ATP1A3 단백질 서열을 포함할 수 있다.
ATP1A3 유전자의 돌연변이는 야생형 ATP1A3 폴리뉴클레오티드 서열에 비해 ATP1A3 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변경을 지칭하며, 이에 따라 ATP1A3 단백질 돌연변이체가 발현된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ATP1A3 단백질 돌연변이체"는 야생형 ATP1A3 단백질의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 ATP1A3 단백질을 지칭한다. ATP1A3-매개 질환과 관련될 수 있는 ATP1A3 단백질 돌연변이체의 예는 비제한적으로 다음의 돌연변이를 포함한다: E815K, D801N, G947R, I180N, R756C, V589F, E818K, T613M, E277K, D923N, R756H, V589F, F913del, S137F, S137Y, Q140L, D220N, I274N, I274T, V322D, C333F, T335P, G358C, G358V, I363N, T370N, L371P, S684F, G706R, G755A, G755C, G755S, L757P, I758S, T771I, T771N, S772R, N773I, N773S, F780L, D801E, D801Y, L802P, T804I, D805E, D805H, M806K, 806R, P808L, I810F, I810N, I810S, S811P, L839P, G867D, D923N, C927F, C927Y, A955D, 및 D992Y 및 임의의 다른 질환-유발 ATP1A3 단백질 돌연변이체. 일부 실시형태에서, ATP1A3 단백질 돌연변이체는 D801N 돌연변이를 포함한다.
ATP1A3 유전자의 돌연변이는 다양한 신경계 질환, 운동 장애 및 간질을 유발할 수 있다. ATP1A3-매개 질환의 예는 비제한적으로 급속-발병 근긴장 이상-파킨슨병(RDP), 소아성 교대성 편마비(AHC), 뇌전증성 뇌병증(EE), 소뇌성 운동실조증, 무반사, 요족, 시신경 위축 및 감각신경성 난청(CAPOS) 증후군, 열 유발 발작성 무력증 및 뇌병증(FIPWE, RECA 또는 소뇌성 운동실조증을 동반한 재발성 뇌병증으로도 지칭됨), 소뇌성 운동실조증의 재발성 에피소드(RECA), 조기-발병 정신분열증, 편측 마비가 없는 안면 뇌병증 MRI 이상의 근긴장 이상(D-DEMO) 증후군 및 소아성 급속 발병 운동실조(CROA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이는 향후 기타 ATP1A3 돌연변이에 의해 유발되거나 ATP1A3 단백질 구조 또는 기능 이상에 의해 유발되는 것으로 설명될 가능성이 있는 기타 질환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ATP1A3-매개 질환은 소아성 교대성 편마비(AHC), 간질, 뇌졸중, 저혈당 급성 운동실조, 근긴장 이상 및 알츠하이머병 및 파킨슨병을 포함하는 신경퇴행성 질환에서의 뉴런 사멸을 포함한다. 일부 실시형태에서, ATP1A3 트랜스진(예컨대, AAV9-특이적 프로모터-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA) 또는 관련 구조물을 포함하는 벡터의 사용은 상기 장애의 특정 조직을 표적으로 하는 ATP1A3 벡터로부터 이익을 얻을 수 있는 기타 ATPases의 돌연변이로 인한 장애의 치료를 포함할 수 있다. 이의 예는 ATP6V1B1 또는 ATP6V0A4 ATPase 유전자의 돌연변이로 인한 V-ATPase의 기능 저하에 의해 유발된 신장 질환을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 발현 카세트, 벡터 또는 관련 구조물은 다른 ATPase 결핍을 초래하는 다른 ATPase 유전자의 돌연변이로부터 야기된 ATPase-매개 질환을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 트랜스진은 해당 질환에 대한 관련 ATPase일 수 있고 프로모터는 관련 기관계(organ system) 또는 세포에서 ATPase 유전자의 발현을 유도할 수 있는 것일 수 있다. ATPase-매개 질환의 예는 ATP6A1 돌연변이에 의해 유발된 면역결핍 장애, ATP7A 또는 ATP7B 돌연변이에 의해 유발된 간질환을 포함한다. 다른 예는 중추 신경계 장애 예컨대 ATP1A2 돌연변이에 의해 야기된 편마비 두통 또는 뇌전증성 뇌병증, 또는 ATP1A1 돌연변이에 의해 유발된 말초신경병증 및 저마그네슘혈증/지적 장애 증후군이다. 다른 예는 미오신(Myosin) 및 ATP2A1 유전자와 같이 근육 질환을 유발하는 ATPase 유전자에 대한 돌연변이 또는 ATP11C의 돌연변이와 같이 혈액학적 질환을 유발하는 돌연변이 및 피부 질환을 유발하는 ATP2C1 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 발현 카세트, 활성 벡터 또는 관련 구조물의 사용은 임의의 ATPase의 기능장애에 의해 야기되는 증상을 유발하는 다른 질환 상태로부터 야기되는 장애를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 트랜스진은 해당 질환에 대한 관련 ATPase일 수 있고 프로모터는 관련 기관계 또는 세포에서 ATPase 유전자의 발현을 유도할 수 있는 것일 수 있다. 이러한 질환의 예는 자가포식성 간 질환을 동반한 글리코실화의 선천성 장애에서 볼 수 있는 이차적 V-ATPase 오조립 및 V-ATPase의 기능장애를 초래하는 VMA21 유전자 돌연변이 및 신장 V-ATPase의 비정상 수송 및 이차적 신장 질환을 초래하는 WDR72 유전자 돌연변이이다. 다른 것들은 위장 증상을 유발하는 만성 점막 염증으로 인한 2차 비정상 ATPase 기능을 갖는 염증성 장 질환을 포함한다.
핵산 발현 카세트
본 개시내용은 부분적으로 ATPase(예컨대, ATP1A3)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 핵산 발현 카세트를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 발현 카세트"는 하나 이상의 원하는 세포 유형, 조직 또는 기관에서 유전자 발현을 지시하는 하나 이상의 전사 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 및/또는 조절 요소, 폴리아데닐화 서열, 및 인트론)를 포함하는 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 발현 카세트는 트랜스진을 함유할 수 있지만, 핵산 발현 카세트는 또한 핵산 서열이 삽입된 세포에서 내인성 유전자의 발현을 지시하는 것으로 예상된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스진"은 트랜스진이 도입된 세포에서 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 외래 핵산 서열을 지칭한다. 트랜스진은 이것이 도입된 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 이종 핵산 서열, 이것이 도입된 세포에서 자연적으로 발견되는 핵산 서열의 돌연변이체인 핵산 서열, 또는 이것이 도입된 세포에서 자연 발생 핵산과 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 트랜스진은 이것이 도입된 동일한 유기체 유래 또는 상이한 유기체 유래의 유전자를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 트랜스진은 비제한적으로 ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B1, ATP1B2, ATP1B3, ATP1B4, ATP2A1, ATP2A2, ATP2A3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4, ATP2C1, ATP2C2, ATP3, ATP4, ATP5A1, ATP5B, ATP5C1, ATP5C2, ATP5D, ATP5E, ATP5F1, ATP5G1, ATP5G2, ATP5G3, ATP5H, ATP5I, ATP5J, ATP5J2, ATP5L, ATP5L2, ATP5O, ATP5S, ATP6A1, ATP6AP1, ATP6AP2, ATP6V1A, ATP6V1B1, ATP6V1B2, ATP6V1C1, ATP6V1C2, ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1E2, ATP6V1F, ATP6V1G1, ATP6V1G2, ATP6V1G3, ATP6V1H, ATP6V0A1, ATP6V0A2, ATP6V0A4, ATP6V0B, ATP6V0C, ATP6V0D1, ATP6V0D2, ATP6V0E, ATP11C, ATP7A, ATP7B, ATP8A1, ATP8B1, ATP8B2, ATP8B3, ATP8B4, ATP9A, ATP9B, ATP10A, ATP10B, ATP10D, ATP11A, ATP11B, ATP11C, ATP12A, ATP13A1, ATP13A2, ATP13A3, ATP13A4, ATP13A5, VMA21, V-ATPase, 또는 WDR72 또는 ATPase를 코딩하는 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스진은 ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열이다.
용어 "핵산 서열," "핵산 분자," "폴리뉴클레오티드," 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 다양한 길이를 가질 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 핵산 분자는, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 시험관 내 번역에 의해 생성된 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 또는 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 하나 이상에 의해 생성된 단편일 수 있다. 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오티드(예컨대 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드), 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체(예컨대, 자연 발생 뉴클레오티드의 α-거울상이성질체), 또는 이들의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티, 또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티의 변형 또는 치환을 가질 수 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스터 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스터 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트, 모폴리노, 등을 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥(ssDNA, dsDNA, ssRNA, 또는 dsRNA)일 수 있다.
용어 "뉴클레오티드"는 통상적인 뉴클레오티드 염기, 당 잔기 및 뉴클레오티드간 포스페이트 연결을 갖는 서열뿐만 아니라, 이러한 임의의 또는 모든 모이어티의 변형을 함유하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 자연적으로 발견되는 퓨린 및 피리미딘 염기 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U)을 함유하지 않는 모이어티뿐만 아니라, 이들의 변형된 형태 또는 유사체 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬에 하나 초과의 뉴클레오티드의 RNA 및 DNA 서열을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 변형된 RNA 또는 DNA 서열은 핵산의 하나 이상의 성분, 즉, 당, 염기, 및 포스페이트 모이어티가 자연에서 발생하는 것과 상이한 핵산 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된" 핵산 분자(예컨대, 단리된 DNA, 단리된 cDNA, 또는 단리된 벡터 게놈)은 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분의 적어도 일부로부터, 예컨대 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 핵산과 관련하여 통상적으로 발견되는 폴리펩티드 또는 핵산으로부터 분리되거나 실질적으로 이것이 없는 핵산 분자를 의미한다.
마찬가지로, "단리된" 폴리펩티드는 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분의 적어도 일부, 예컨대 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 폴리펩티드와 관련하여 통상적으로 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산으로부터 분리되거나 실질적으로 이것이 없는 폴리펩티드를 의미한다.
일부 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, 및 이의 임의의 단편, 이소형, 및/또는 상동체로 기재된 바와 같이, ensemble.org(HGNC ID: HGNC:801, UniProtKB 식별자 P13637에 해당하는 ATP1A3 단백질 코딩)에 제공되어 있다. 다른 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 02, 및 이의 임의의 단편, 이소형, 및/또는 상동체로 기재된 바와 같은 cDNA 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 07, 및 이의 임의의 단편, 이소형, 및/또는 상동체로 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 다음의 GenBank 접근 번호로 기재된 임의의 핵산 서열일 수 있다: BC009282.2, BC015566.2, AK295078.1,　AK296557.1, AK295833.1, AK316069.1, BC013763.1, KJ896471.1, JF432325.1, KR710324.1, KR710323.1, 또는 KR710322.1 또는 NCBI 접근 번호: NM_152296.5, XM_016934231.2, NM_001256213.1, XM_004060817.3, NM_001256214.2, 또는 AK223569.1. 다른 실시형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 03(NCBI 참조 서열: P13637-1)으로 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 06으로 기재된 아미노산 서열을 갖는 야생형 ATP1A3 단백질을 코딩하거나, SEQ ID NO: 03 또는 SEQ ID NO: 06에 기재된 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 서열을 코딩한다.
표 1은 본 개시내용의 트랜스진과 관련된 예시적인 서열을 제공한다.
[표 1]
핵산 및 아미노산 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본원에 제공된 바와 같이 본 개시내용의 일 실시형태에 따라, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07 중 임의의 것과 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 핵산 서열과 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성을 가질 수 있다. ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 핵산 서열과 1 내지 10%, 10 내지 20%, 30 내지 40%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 99%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 99%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 99%, 70 내지 100%, 80 내지 85%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 99%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 99%, 또는 90 내지 100%를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 핵산 서열과 80% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 핵산 서열과 85% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 핵산 서열과 90% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 핵산 서열과 95% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, 또는 SEQ ID NO: 07로 기재된 핵산 서열과 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 ATP1A3에 대한 단백질을 코딩하는 아미노산 서열로 번역될 수 있는 mRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 02로 기재된 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체를 갖는 cDNA 서열이다.
용어 "서열 동일성"은 시험 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 기준 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교 시 동일하거나 유사한 잔기(즉, 뉴클레오티드 염기 또는 아미노산)의 수를 지칭한다. 서열 동일성은 유사성 또는 동일성의 영역을 확인하기 위해 핵산의 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 서열 동일성은 일반적으로 동일한 잔기를 확인하기 위해 정렬에 의해 결정된다. 매치, 미스매치, 및 갭이 비교된 서열간에 확인될 수 있다. 대안적으로, 서열 동일성은 갭을 고려하지 않고 총 정렬된 서열의 동일한 위치의 수/길이 × 100으로 결정될 수 있다. 하나의 비-제한적인 실시형태에서, 용어 "적어도 90%의 서열 동일성"은 참조 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대해 90 내지 100%의 동일성 퍼센트를 지칭한다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예시적인 목적을 위해 시험 및 참조 올리고뉴클레오티드 또는 100개 뉴클레오티드의 길이가 비교된다고 가정할 때, 시험 올리고뉴클레오티드의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 기준 올리고뉴클레오티드의 것과 다르다는 사실을 나타낸다. 차이점은 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로 정의된다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 CpG 메틸화 부위를 감소시키고 포유류 발현(예를 들어, 인간 세포 발현)을 위해 코돈-최적화된 ATP1A3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 핵산 발현 카세트는 코돈 최적화된 핵산 서열을 함유하지 않는다.
용어 "코돈 최적화된"은 발현을 개선하기 위해, DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않고 숙주 유기체(예를 들어, 인간과 같은 포유류)의 전형적인 코돈 사용을 반영하도록 핵산 분자의 코돈을 변경하는 것을 지칭한다. 코돈 최적화를 위한 많은 방법과 소프트웨어 도구가 이전에 보고되었다. 예컨대 genomes.urv.es/OPTIMIZER/; 문헌[Puigb
Figure pct00004
et al., Nucleic Acids Res. (2007)(웹 서버 발행): W126-W131]; 문헌[Chin et al. (2014) Bioinformatics, 30(15):2210-2]; 문헌[Fuglsang, (2003) Protein Expr Purif., 31(2):247-9]; 문헌[Narum et al., (2001) Infect. Immun., 69(12):7250-7253], 문헌[Outchkourov et al., (2002) Protein Expr. Purif, 24(1):18-24], 문헌[Humphreys et al., (2000) Protein Expr. Purif., 20(2):252-64]을 참조한다.
당업자는 ATP1A3을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트가 전사/번역 제어 신호 또는 분비 신호 서열을 함유할 수 있으며, 이는 핵산 발현 카세트에 또는 벡터 백본에 의해 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있는 이러한 외인성 번역 제어 서열은 천연 및 합성 둘 모두의 다양한 기원일 수 있다.
다양한 프로모터/인핸서 요소가 원하는 수준 및 조직-특이적 발현에 따라 사용될 수 있다. 프로모터는 조직-특이적이거나 편재할 수 있고 원하는 유전자 발현 패턴에 따라 구성적이거나 유도성일 수 있다. 프로모터는 천연 또는 외래일 수 있고 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래는 전사 개시 영역이 도입된 야생형 숙주에서 전사 개시 영역이 발견되지 않는 것으로 의도된다.
프로모터는 관심 표적 세포에서 기능하도록 선택될 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 특정 세포 유형에서만 활성을 갖는 프로모터를 지칭한다. 핵산 발현 카세트에서 조직-특이적 프로모터의 사용은 영향을 받지 않은 조직에서 원치 않는 트랜스진 발현을 제한할 수 있을 뿐만 아니라 트랜스진 유도 숙주 면역 반응으로부터 탈출함으로써 지속적인 트랜스진 발현을 촉진할 수 있다. 조직 특이적 프로모터는 비제한적으로 뉴런-특이적 프로모터, 근육-특이적 프로모터, 간-특이적 프로모터, 골격근-특이적 프로모터, 및 심장-특이적 프로모터를 포함한다.
뉴런-특이적 프로모터는 비제한적으로 시냅신 I(SYN) 프로모터, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II 프로모터, 튜불린 알파 I 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제 프로모터 및 혈소판-유래 성장 인자 베타 사슬 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴런-특이적 프로모터는 인간 시냅신 프로모터이다. 다른 실시형태에서, 뉴런-특이적 프로모터는 SEQ ID NO: 04 또는 SEQ ID NO: 09 인간 프로모터 서열로 기재된 핵산 서열을 갖는 인간 시냅신 프로모터 또는 SEQ ID NO: 08로 기재된 마우스 프로모터 서열이다. 다른 실시형태에서, 인간 시냅신 프로모터는 시냅손 1 프로모터(-422 내지 -22)의 근위 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시냅신 1 프로모터(-422 내지 -22)의 근위 영역은 SEQ ID NO: 05에 기재된 핵산 서열을 갖는다.
간-특이적 프로모터는 비제한적으로 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서/갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터, 인간 알부민(hALB) 프로모터, 갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터, α-1-항-트립신 프로모터, 소 알부민(bAlb) 프로모터, 뮤린 알부민(mAlb) 프로모터, 인간 a1-항트립신(hAAT) 프로모터, ApoE 인핸서 및 hAAT 프로모터로 구성된 ApoEhAAT 프로모터, 트랜스티레틴(TTR) 프로모터, 간 지방산 결합 단백질 프로모터, B형 간염 바이러스(HBV) 프로모터, hAAT 프로모터 및 a1-마이크로글로불린 인핸서로 이루어진 DC172 프로모터, 인간 알부민 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서를 함유하는 DC190 프로모터, 및 기타 천연 및 합성 간-특이적 프로모터를 포함한다.
근육 특이적 프로모터는 비제한적으로 MHCK7 프로모터, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터/인핸서, 트로포닌 I(TnIS) 프로모터의 느린 이소형, MYODI 프로모터, MYLK2 프로모터, SPc5-12 프로모터, 데스민(Des) 프로모터, unc45b 프로모터, 및 기타 천연 및 합성 근육-특이적 프로모터를 포함한다.
골격근-특이적 프로모터는 비제한적으로 HSA 프로모터, 인간 α-골격 액틴 프로모터를 포함한다.
심장-특이적 프로모터는 비제한적으로 MYH6 프로모터, TNNI3 프로모터, 심장 트로포닌 C(cTnC) 프로모터, 알파-미오신 중쇄(α-MHC) 프로모터, 미오신 경쇄 2(MLC-2), 및 MYBPC3 프로모터를 포함한다.
구성적 프로모터는 관련 유전자의 지속적인 전사를 가능하게 하는 프로모터를 지칭한다. 구성적 프로모터는 항상 활성이며 비제한적으로 간, 신장, 골격근, 심장 근육, 평활근, 횡격막 근육, 뇌, 척수, 내피 세포, 장 세포, 폐 세포(예컨대 평활근 또는 상피), 복막 상피 세포 및 섬유아세포를 포함하여 다양한 세포 및 조직에서 유전자를 발현하기 위해 사용될 수 있다.
구성적 프로모터는 비제한적으로 CMV 주요 즉시-조기 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 주요 즉시-조기 프로모터, 신장 인자 1-α(EF1-α) 프로모터, 시미안 액포형성(simian vacuolating) 바이러스 40(SV40) 프로모터, AmpR 프로모터, PγK 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 유전자(Ubc) 프로모터, MFG 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, EGR1 프로모터, FerH 프로모터, FerL 프로모터, GRP78 프로모터, GRP94 프로모터, HSP70 프로모터, β-kin 프로모터, 뮤린 포스포글리세레이트 키나제(mPGK) 또는 인간 PGK(hPGK) 프로모터, ROSA 프로모터, 인간 유비퀴틴 B 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 또는 임의의 다른 천연 또는 합성 유비퀴틴 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 구성적으로 활성 프로모터는 인간 β-액틴, 인간 신장 인자-1α, 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서와 조합된 닭 β-액틴, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40, 또는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
유도성 프로모터는 양성 또는 음성 대조군에 의해 조절될 수 있는 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터를 조절할 수 있는 인자는 비제한적으로 화학 작용제(예컨대 메탈로티오네인 프로모터 또는 호르몬 유도성 프로모터), 온도 및 빛을 포함한다.
조직-특이적 프로모터는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)의 인핸서 요소(예를 들어, 사이토메갈로바이러스 인핸서에 융합된 뉴런-특이적 프로모터)에 작동 가능하게 연결되거나 조합되어 탠덤 프로모터(예컨대 뉴런-특이적/구성적 탠덤 프로모터)를 형성할 수 있다. 2개 이상의 조직-특이적 프로모터가 존재할 때, 단리된 핵산은 동시에 2개 이상의 상이한 조직을 표적으로 할 수 있다.
인핸서 요소는 전사를 향상시키는 기능을 하는 핵산 서열이다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATP1A3 트랜스진 서열 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용에 따른 핵산 발현 카세트는 전사 종결 신호를 추가로 포함한다. 전사 종결 신호는 전사 동안 유전자의 끝을 표시하는 핵산 서열이다. 전사 종결 신호의 예는 비제한적으로 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA), 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 신호(Sv40 polyA), 및 합성 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 핵산 서열 AATAAA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Sv40 PolyA는 SEQ ID NO: 17에 기재된 서열, 또는 SEQ ID NO: 17에 기재된 서열과 적어도 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인트론"은 트랜스진 발현을 향상시킬 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 인트론은 또한 핵산 발현 카세트의 일부일 수 있거나 발현 벡터의 발현 카세트의 상류 또는 하류에 위치해있을 수 있다. 인트론은 비제한적으로 SV40 인트론, EF-1알파 유전자　인트론 1, 또는 MVM 인트론을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 발현 카세트는 인트론을 함유하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 발현 또는 폴리펩티드 생산과 관련하여 용어 "향상시키다" 및 "향상"은 예를 들어, 적어도 약 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 2배, 2.5배, 3배, 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 그 이상 만큼 표시된 핵산 또는 폴리펩티드의 정상 상태 수준의 증가 및/또는 신장을 지칭한다.
일부 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 질환 세포에서 돌연변이 ATP1A3 유전자와의 상동성 재조합을 위한 "공여자" 주형으로서 사용된다. 본 개시내용에 따른 추가 실시형태는 징크 핑거 뉴클레아제, TALENS, RNA-가이드 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR/Cas98, 및 기타 프로그램가능한 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 편집 뉴클레아제와 핵산 서열의 공동-투여를 포함한다.
벡터
본 개시내용의 또 다른 양태는 ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어진 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어진다.
임의의 적합한 벡터를 사용하여 본 개시내용의 단리된 핵산을 관심 표적 세포 또는 대상체에 전달할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 전달 벡터의 선택은 표적 숙주의 연령 및 종, 시험관 내 대 생체 내 전달, 원하는 발현 수준 및 지속성, 의도된 목적(예를 들어, 치료 또는 효소 생산), 표적 세포 또는 기관, 전달 경로, 단리된 핵산의 크기, 안전성 문제 등을 포함하여 당업계에 공지된 다수의 인자에 기초하여 이루어질 수 있다.
당업계에 공지되어 있고 본 개시내용의 단리된 핵산(예를 들어, 바이러스 및 비-바이러스 벡터)을 전달하고 선택적으로 발현하는데 사용될 수 있는 적합한 벡터는 바이러스 벡터(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스, 또는 헤르페스 단순 바이러스), 지질 벡터, 폴리-리신 벡터, 핵산 분자와 함께 사용되는 합성 폴리아미노 중합체 벡터, 예컨대 플라스미드 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는 중합체 기반 벡터(예컨대, 폴리에틸렌이민(PEI), 키토산, 폴리 (DL-락티드)(PLA), 또는 폴리 (DL-락티디-코-글리코시드)(PLGA), 덴드리머, 폴리메타크릴레이트) 펩티드 기반 벡터, 지질 나노입자, 고체 지질 나노입자, 또는 양이온 지질 기반 벡터일 수 있다.
재조합 바이러스 벡터를 생성하고 핵산 전달을 위해 바이러스 벡터를 사용하기 위한 프로토콜을 문헌[Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates; (1989)] 및 기타 표준 실험실 매뉴얼(예컨대 문헌[Vectors for Gene Therapy, In:　Current Protocols in Human Genetics, John Wiley and Sons, Inc.; 1997])에서 확인할 수 있다.
"재조합"은 유전 공학의 결과로서 유전 물질의 새로운 조합을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 재조합 유기체(예컨대 박테리아)는 유전자 변형의 결과로서 모체 중 하나와 상이한 유전 물질을 포함하는 유기체일 수 있으며, 재조합 DNA는 인공 DNA의 형태일 수 있으며, 재조합 단백질 또는 효소는 인공적으로 생산되고 정제된 형태의 단백질 또는 효소일 수 있으며, 재조합 바이러스는 유전 물질을 재조합하여 형성된 바이러스일 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 발현 카세트 및/또는 트랜스진(예를 들어, ATP1A3 및 이의 변이체)는 재조합 바이러스 벡터에 통합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 핵산 전달 비히클로서 기능하고 비리온 내에 포장된 벡터 게놈(예를 들어, 바이러스 DNA)을 포함하는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 지칭한다. 대안적으로, 일부 맥락에서, 용어 "벡터"는 벡터 게놈/바이러스 DNA만을 지칭하기 위해 사용된다.
유전자 치료법에 적합한 임의의 적합한 재조합 바이러스 벡터는 본 개시내용에 따른 조성물 및 방법에 사용하기에 적합하다. 이러한 바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 다음으로부터 유도된 벡터를 포함한다: 아데노비리대(Adenoviridae); 비르나비리대(Birnaviridae); 분야비리대(Bunyaviridae); 칼리시비리대(Caliciviridae), 캐필로바이러스 군(Capillovirus group); 칼라바이러스 군(Carlavirus group); 카모바이러스 바이러스 군(Carmovirus virus group); 콜리모바이러스 군(Group Caulimovirus); 클로스테로바이러스 군(Closterovirus Group); 코멜리나 황색 반상 바이러스 군(Commelina yellow mottle virus group); 코모바이러스 바이러스 군(Comovirus virus group); 코로나비리대(Coronaviridae); PM2 파지 군; 코르시코비리대(Corcicoviridae); 크립틱 바이러스 군(Group Cryptic virus); 크립토바이러스 군(group Cryptovirus); 쿠쿠모바이러스 군 패밀리(Cucumovirus virus group family)([PHgr]6 파지 군; 사이시오비리대(Cysioviridae); 카네이션 링스팟 군(Group Carnation ringspot); 디안토바이러스 바이러스 군(Dianthovirus virus group); 잠두 위조 군(Group Broad bean wilt); 파바바이러스 바이러스 군(Fabavirus virus group); 필로비리대(Filoviridae); 플라비비리대(Flaviviridae); 푸로바이러스 군(Furovirus group); 제미니바이러스 군(Group Germinivirus); 지아디아바이러스 군(Group Giardiavirus); 헤파드나비리대(Hepadnaviridae); 헤르페스비리대(Herpesviridae); 호르데이바이러스 바이러스 군(Hordeivirus virus group); 일라바이러스 바이러스 군(Illarvirus virus group); 이노비리대(Inoviridae); 이리도비리대(Iridoviridae); 레비비리대(Leviviridae); 리포트릭스비리대(Lipothrixviridae); 루테오바이러스 군(Luteovirus group); 마라피바이러스 바이러스 군(Marafivirus virus group); 옥수수 황백화 왜소 바이러스 군(Maize chlorotic dwarf virus group); 이크로비리대(icroviridae); 마이오비리대(Myoviridae); 네크로바이러스 군(Necrovirus group); 네포바이러스 바이러스 군(Nepovirus virus group); 노다비리대(Nodaviridae); 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae); 파보바비리대(Papovaviridae); 파라믹소비리대(Paramyxoviridae); 파스닙 황색 반점 바이러스 군(Parsnip yellow fleck virus group); 파르티티비리대(Partitiviridae); 파보비리대(Parvoviridae); 완두 출 모자이크 바이러스 군(Pea enation mosaic virus group); 피코드나비리대(Phycodnaviridae); 피코르나비리대(Picornaviridae); 플라즈마비리대(Plasmaviridae); 프로도비리대(Prodoviridae); 폴리드나비리대(Polydnaviridae); 포텍스바이러스 군(Potexvirus group); 포티바이러스(Potyvirus); 폭시이리대(Poxyiridae); 레오비리대(Reoviridae); 레트로비리대(Retroviridae); 라브도비리대(Rhabdoviridae); 리지디오바이러스 군(Group Rhizidiovirus); 시포비리대(Siphoviridae); 소베모바이러스 군(Sobemovirus group); SSV 1-형 파지; 텍티비리대(Tectiviridae); 테누이바이러스(Tenuivirus); 테트라비리대(Tetraviridae); 토바모바이러스 군(Group Tobamovirus); 토브라바이러스 군(Group Tobravirus); 토가비리대(Togaviridae); 톰버스바이러스 군(Group Tombusvirus); 토로바이러스 군(Group Torovirus); 토티비리대(Totiviridae); 티모바이러스 군(Group Tymovirus); 및 식물 바이러스 위성체(satellites).
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)(예컨대, AAV 혈청형 및 유전적으로 변형된 AAV 변이체), 헤르페스 단순 바이러스(예컨대, 예컨대, HSV-1, HSV), 레트로바이러스 벡터(예컨대, MMSV, MSCV), 렌티바이러스 벡터(HIV-1, HIV-2), 및 알파바이러스 벡터(예컨대, SFV, SIN, VEE, M1), 플라비바이러스 벡터(예컨대, 쿤진, 웨스트 나일, 뎅기열 바이러스), 라브도바이러스 벡터(예컨대, 라비어스, VSV), 홍역 바이러스 벡터(예컨대, MV-Edm), 뉴캐슬병 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터(VV), 또는 피코나바이러스 벡터(예컨대, 콕사키바이러스)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 개시내용의 재조합 바이러스 벡터는 ATP1A3 트랜스진을 포장 및 전달할 수 있는 임의의 유형의 바이러스 벡터 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 설계 조작되고 생성될 수 있는 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전달 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 본원에서 사용된 용어 "아데노바이러스"는 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 및 아비아데노바이러스 속(Aviadenovirus　genera)을 포함하는 모든 아데노바이러스를 포함한다.
아데노바이러스 게놈의 다양한 영역이 맵핑되었고 당업자에 의해 이해된다. 다양한 Ad 혈청형의 게놈 서열 뿐만 아니라, Ad 게놈의 특정 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있고 GenBank 및 NCBI로부터 접근할 수 있다(예를 들어, GenBank 접근 번호 J0917, M73260, X73487, AF108105, L19443, NC 003266 및 NCBI 접근 번호 NC 001405, NC 001460, NC 002067, NC 00454 참조).
재조합 아데노바이러스(rAd) 벡터 게놈은 아데노바이러스 말단 반복 서열 및 포장 신호를 포함할 수 있다. "아데노바이러스 입자" 또는 "재조합 아데노바이러스 입자"는 각각 아데노바이러스 캡시드 내에 포장된 아데노바이러스 벡터 게놈 또는 재조합 아데노바이러스 벡터 게놈을 포함한다. 일반적으로, 아데노바이러스 벡터 게놈은 약 28 kb 내지 38 kb(천연 게놈 크기의 약 75% 내지 105%)의 크기에서 가장 안정하다. 큰 결실 및 비교적 작은 트랜스진을 함유하는 아데노바이러스 벡터의 경우, 당업계에 공지된 방법에 의해 "스투터(stutter) DNA"를 사용하여 벡터의 전체 크기를 원하는 범위 내로 유지할 수 있다.
아데노바이러스의 게놈은 관심 유전자 산물을 코딩하고 발현하지만 정상적인 용해성 바이러스 생활 주기에서 복제하는 능력의 관점에서 비활성화되도록 조작될 수 있다. 아데노바이러스 균주 Ad 유형5(Ad5) 또는 아데노바이러스의 다른 균주(예를 들어, Ad2, Ad3, Ad7 등)로부터 유래된 적합한 아데노바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다. AAV는 파보바이러스이며 작은 정이십면체 비리온을 가지며 크기가 약 4.7 kb(예컨대, 약 4.5 kb, 4.6 kb, 4.8 kb, 4.9 kb, 또는 5.0 kb) 이하의 단일 가닥 DNA 분자를 함유할 수 있다. 바이러스는 DNA 분자의 센스 또는 안티센스 가닥을 포함하며 어느 가닥이든 비리온에 통합된다. 두 개의 개방 판독 틀은 일련의 Rep 및 Cap 폴리펩티드를 코딩한다. Rep 폴리펩티드(예컨대, Rep50, Rep52, Rep68 및 Rep78)는 AAV 게놈의 복제, 구조(rescue) 및 통합에 관여하지만, 4개의 Rep 폴리펩티드 모두가 없을 때 상당한 활성이 관찰될 수 있다. Cap 단백질(예컨대, VP1, VP2, VP3)은 비리온 캡시드를 형성한다. 게놈의 5' 및 3' 말단에서 rep 및 cap 개방 판독 틀을 플랭킹시키는 것은 역 말단 반복부(ITR)이다. 전형적으로, 재조합 AAV(rAAV) 벡터에서, 전체 rep 및 cap 코딩 영역이 절제되고 관심 있는 트랜스진으로 대체된다.
재조합 AAV 벡터는 일반적으로 바이러스를 생성하기 위해 시스(cis)로 말단 반복부(TR)만을 필요로 한다. 다른 모든 바이러스 서열은 필요하지 않으며 트랜스(trans)로 공급될 수 있다. 전형적으로, rAAV 벡터 게놈은 벡터에 의해 효율적으로 포장될 수 있는 트랜스진의 크기를 최대화하기 위해 하나 이상의 TR 서열만을 보유할 것이다. 구조적 및 비-구조적 단백질 코딩 서열은 트랜스로(예를 들어, 플라스미드와 같은 벡터로부터, 또는 서열을 포장 세포 내로 안정적으로 통합함으로써) 제공될 수 있다. 본 개시내용의 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈은 적어도 하나의 말단 반복부(TR) 서열(예를 들어, AAV TR 서열), 선택적으로 2개의 TR(예를 들어, 2개의 AAV TR)을 포함하며, 이는 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 말단에 있을 것이며 이종 핵산 서열의 측면에 있지만 인접할 필요는 없다. TR은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 헤어핀 구조를 형성하고 역 말단 반복부로서 기능하는(즉, 복제, 바이러스 포장, 통합 및/또는 프로바이러스 구조 등과 같은 원하는 기능을 매개) 임의의 바이러스 말단 반복부 또는 합성 서열을 포함한다. TR은 AAV TR 또는 비-AAV TR일 수 있다. 예를 들어, 다른 파보바이러스(예컨대 개 파보바이러스(CPV), 마우스 파보바이러스(MVM), 인간 파보바이러스 B-19)의 것과 같은 비-AAV TR 서열 또는 임의의 다른 적합한 바이러스 서열(예컨대, SV40 복제의 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀)이 TR로 사용될 수 있으며, 이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 또한, TR은 "이중-D 서열"과 같이 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다.
"AAV 말단 반복부" 또는 "AAV TR"은 비제한적으로 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11를 포함하는 임의의 AAV, 또는 현재 알려져 있거나 나중에 발견되는 임의의 다른 AAV로부터 유래될 수 있다. AAV 말단 반복부는 말단 반복부가 원하는 기능, 예를 들어 복제, 바이러스 포장, 통합 및/또는 프로바이러스 구조 등을 매개하는 한, 천연 말단 반복부 서열을 가질 필요가 없다(예를 들어, 천연 AAV TR 서열은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있음). 일부 실시형태에서, 벡터는 AAV2 게놈으로부터 유래된 플랭킹 ITR을 포함한다. 본 개시내용의 ITR은 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 18로 기재된 서열, 또는 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 18에 기재된 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
야생형 AAV는 이의 DNA를 비-분할 세포에 통합할 수 있고, 인간 염색체 19로의 안정적인 통합의 높은 빈도를 나타낼 수 있다. rAAV 벡터 게놈은 일반적으로 AAV 말단 반복부 서열 및 포장 신호를 포함할 것이다.
"AAV 입자" 또는 "rAAV 입자"는 각각 AAV 캡시드 내에 포장된 AAV 벡터 게놈 또는 rAAV 벡터 게놈을 포함한다. AAV rep/cap 유전자는 단일 플라스미드에서 발현될 수 있다. AAV rep 및/또는 cap 서열은 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, rep/cap 서열은 하이브리드 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터(예를 들어, 결실된 아데노바이러스 벡터의 Ela 또는 E3 영역에 삽입된 것)에 의해 제공될 수 있다. EBV 벡터는 또한 AAV cap 및 rep 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이 방법의 한 가지 장점은 EBV 벡터가 에피솜이지만, 연속적인 세포 분열 전반에 걸쳐 높은 복제 수를 유지한다는 것이다(즉, "EBV 기반 핵 에피솜"으로 지정된 염색체 외 요소로서 세포에 안정적으로 통합됨, 문헌[Margolski (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67] 참조). AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있고 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다.
그러나, rAAV 벡터 자체는 캡시드(cap) 및 Rep 단백질을 코딩하는 AAV 유전자를 함유할 필요는 없다. 본 개시내용의 특정 실시형태에서, rep 및/또는 cap 유전자는 AAV 게놈으로부터 결실된다. 대표적인 실시형태에서, rAAV 벡터는 통합, 절제 및 복제에 필요한 말단 AAV 서열(ITR)만을 보유한다.
AAV 캡시드 유전자에 대한 공급원은 비제한적으로 AAV1, AAV2, AAV3(3a 및 3b 포함), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh39, AAVrh43, AAVcy.7, 및 소 AAV, 염소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 조류 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 바이러스 분류 국제 위원회(ICTV: International Committee on Taxonomy of Viruses)에 의해 AAV로 분류된 임의의 다른 바이러스를 포함하여 천연적으로 단리된 혈청형을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, AAV 캡시드는 캡시드 진화에 의해 또는 천연적으로 단리된 AAV 변이체로부터 원하는 혈청형 특징 예컨대 향상되거나 특이적인 조직 친화성 및 숙주 면역 반응 탈출을 포획하도록 합리적인 캡시드 조작에 의해 생성된 키메라로서, 비제한적으로 AAV-DJ, AAV-HAE1, AAV-HAE2, AAVM41, AAV-1829, AAV2 Y/F, AAV2 T/V, AAV2i8, AAV2.5, AAV9.45, AAV9.61, AAV-B1, AAV-AS, AAV9.45A-String(예컨대, AAV9.45-AS), AAV9.45Angiopep, AAV9.47-Angiopep, 및 AAV9.47-AS., AAV-PHP.B, AAV-PHP.eB, 및 AAV-PHP.S를 포함한다.
따라서, 본원에서 특이적 AAV 캡시드 단백질(예컨대, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV1 또는 AAV12 캡시드 단백질)을 지칭할 때 이는 천연 캡시드 단백질뿐만 아니라 본 발명의 변형 이외의 변형을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 변형은 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV8, 또는 AAV9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 재조합 AAV 벡터는 혈액-뇌 장벽을 용이하게 통과하는 능력으로 인해 AAV9를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)는 일반적으로 다음의 요소 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다: (1) 역위 말단 반복 서열(ITR); (2) 프로모터(예컨대, 뉴런-특이적 프로모터); (3) 트랜스진(예컨대, ATP1A3 이의 단편, 이의 이소형, 또는 이의 상동체를 코딩하는 핵산 서열); (4) 전사 종결자(예컨대, 폴리아데닐화 신호); 및 (5) 플랭킹 역위 말단 반복 서열(ITR).
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 링커 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "링커 서열"은 짧은 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 링커 서열은 적어도 6 뉴클레오티드 서열, 적어도 15 뉴클레오티드, 27 뉴클레오티드, 또는 적어도 30 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 6 내지 27 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 링커 서열은 6 뉴클레오티드, 15 뉴클레오티드, 및/또는 27 뉴클레오티드를 갖는다. 링커 서열은 벡터 구조물의 다양한 코딩된 요소를 연결하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 트랜스진 및 Myc 태그가 링커를 통해 작동가능하게 연결될 수 있거나, Myc 태그 및 FLAG가 링커를 통해 작동가능하게 연결될 수 있거나 FLAG 태그 및 mCherry 태그가 링커를 통해 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 벡터 요소는 직접적으로(예컨대, 링커를 통하지 않고) 연결될 수 있다. 예시적인 링커 서열이 표 2에 제시되어 있다:
[표 2]
대표적인 링커 서열
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 벡터는 형광 단백질 태그(예컨대, mCherry, sfGFP, 및 mKikGR) 및/또는 에피토프 태그(예컨대, HA, Myc, FLAG)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, mCherry 태그는 SEQ ID NO: 16에 기재된 핵산 서열에 의해, 또는 SEQ ID NO: 16에 기재된 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, Myc 태그는 SEQ ID NO: 12에 기재된 핵산 서열에 의해, 또는 SEQ ID NO: 12에 기재된 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, FLAG 태그는 SEQ ID NO: 14에 기재된 핵산 서열에 의해, 또는 SEQ ID NO: 14에 기재된 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩될 수 있다.
다른 실시형태에서, 벡터는 선택적으로 2A 자가-절단 펩티드(2A 펩티드)를 포함할 수 있으며, 이는 길이가 약 18 내지 22 아미노산일 수 있고 세포에서 재조합 단백질의 절단을 유도할 수 있는 펩티드 부류이다. 2A 펩티드의 예는 비제한적으로 P2A, E2A, F2A 및 T2A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2A 펩티드는 P2A일 수 있다. 일부 실시형태에서, P2A는 SEQ ID NO: 22에 기재된 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 22에 기재된 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 2A 펩티드는 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site) 요소와 조합될 수 있으며, 이는 단일 전사체 내에서 4개의 분리된 펩티드의 생성을 가능케 할 수 있다. IRES 요소의 위치는 5'UTR일 수 있지만, 핵산 서열의 다른 곳에서도 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 선택적으로 인트론을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 인트론을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 재조합 AAV 벡터는 ATP1A3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성 벡터는 도 1에 도시된 구조물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성 벡터는 AAV9-pBK828-ATP1A3-cherry(본원에서 AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 또는 AAV9-ATP1A3-Cherry 또는 활성 벡터로도 지칭됨)(도 2)를 포함한다. 본 개시내용의 AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 벡터는 ITR, 인간 Syn 프로모터, ATP1A3 개방 해독 틀(ORF), 하나 이상의 에피토프 태그(예컨대, Myc 태그, 또는 FLAG 태그), P2A 서열, 하나 이상의 형광 태그(예컨대, mCherry 태그), Sv40 polyA 꼬리, 및 플랭킹 ITR(도 1)을 포함할 수 있다. AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 벡터는 또한 요소 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA 벡터는 5'에서 3' 순서로 작동가능하게 연결된 다음의 요소를 포함할 수 있다: AAV-ITR, 인간 Syn 프로모터, ATP1A3 트랜스진, 링커 서열, Myc 태그, 링커 서열, FLAG 태그, 링커 서열, p2A 서열, 링커 서열, mCherry 태그, Sv40 polyA 서열, 및 AAV-ITR.
활성 벡터는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 21로 기재된 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 21로 기재된 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 재조합 AAV 대조군 벡터는 AAV9-hSyn-mCherry-pBK292-9(도 3)를 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 AAV9-pBK828-ATP1A3-cherry 벡터에 대한 대조군 벡터로서 사용될 수 있는 트랜스진을 포함하지 않는다.
[표 3]
핵산 구조물
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
다른 실시형태에서, 재조합 AAV 벡터는 AAV1을 포함한다. 일 실시형태에서, 재조합 AAV 벡터는 ATP1A3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 벡터는 AAV1-pBK828-1-ATP1A3-cherry를 포함한다. AAV1-pBK828-1-ATP1A3-cherry 벡터는 ITR, 인간 Syn 프로모터, ATP1A3 개방 해독 틀(ORF), 링커, Myc 태그, FLAG 태그, P2A 서열, mCherry 개방 해독 틀, Sv40 polyA 꼬리, 및 플랭킹 ITR을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV1-pBK828-1-ATP1A3-cherry 벡터는 5'에서 3' 순서로 작동가능하게 연결된 다음의 요소를 포함할 수 있다: AAV-ITR, 인간 Syn 프로모터, ATP1A3 트랜스진, 링커 서열, Myc 태그, 링커 서열, FLAG 태그, 링커 서열, mCherry 태그, Sv40 polyA 서열, 및 AAV-ITR.
또 다른 실시형태에서, 재조합 AAV 벡터는 AAV1-hSyn-mCherry-pBK292-1을 포함하며, 이는 AAV1-pBK828-1-ATP1A3-cherry 벡터에 대한 대조군 벡터로서 사용될 수 있는 트랜스진을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "개방 해독 틀(ORF)"은 번역될 수 있는 능력을 갖는 판독 틀의 부분을 지칭한다. ORF는 시작 코돈(예컨대, ATG)으로 시작하고 종결 코돈(예컨대, TAA, TAG, TGA)에서 끝나는 코돈의 연속 사슬일 수 있다. 판독 틀은 아미노산을 지정하는 코돈으로 판독되는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 위형화(pseudotyped)되며, 이는 원하는 표적 세포와의 상호작용을 개선할 수 있도록 특정 AAV 균주의 하이브리드를 생성하는 실행을 지칭한다. 하이브리드 AAV는 한 균주의 캡시드와 또 다른 균주의 게놈을 취하여 생성될 수 있다. 예컨대, AAV2의 게놈과 AAV5의 캡시드의 하이브리드인 AAV2/5는 AAV2가 비하이브리드화를 달성할 수 있는 것보다 뇌 세포에서 보다 큰 정확도와 범위를 달성하는데 사용될 수 있다. 위형화된 rAAV의 생산이 예컨대 국제공개 WO01/83692호에 개시되어 있다.
다른 유형의 rAAV 변이체, 예컨대 캡시드 돌연변이가 있는 rAAV가 또한 고려된다. 예컨대 문헌[Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)]을 참조한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열이 당업계에 공지되어 있는 것으로 이해된다.
본 개시내용의 핵산 분자를 포함하도록 구조화될 수 있는 재조합 AAV의 예가 국제 특허 출원 제PCT/US2012/047999호(국제공개 WO 2013/016352호)에 기재되어 있으며 이는 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 방법이 AAV 벡터를 생산하는데 사용될 수 있다. 하나의 특정 방법에서, AAV 스톡은 AAV 포장 기능을 코딩하는 re/cap 벡터 플라스미드와 재조합 AAV 게놈을 함유하는 벡터 플라스미드를 헬퍼 아데노바이러스로 감염된 인간 세포 내로 동시-형질감염시켜 생산될 수 있다. 재조합 AAV 생산의 일반적인 원리를 예컨대 문헌[Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539]; 및 문헌[Muzyczka, (1992) Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)]에서 검토한다. 다양한 접근법이 문헌[Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); 문헌[Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984)]; 문헌[Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985)]; 문헌[McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988)]; 문헌[및 Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)]. 문헌[Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)]; 미국특허 제5,173,414호; 미국특허 제5,658,776호; 국제공개 WO 95/13392호; 국제공개 WO 96/17947호; 국제공개 WO 97/09441호; 국제공개 WO 97/08298호; 국제공개 WO 97/21825호; 국제공개 WO 97/06243호; 국제공개WO 99/11764호; 문헌[Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250]; 문헌[Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615]; 문헌[Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132]; 미국특허 제5,786,211호; 제5,871,982호; 및 제6,258,595호에 기술되어 있다. 전술한 문서는 재조합 AAV 생산에 관한 문서의 섹션을 특히 강조하면서 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.
재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)는 당업계의 표준 방법에 의해 예컨대 컬럼 크로마토그래피 또는 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 재조합 바이러스 벡터를 정제하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
ATP1A3을 코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포에 제공될 수 있다. 예컨대, 주형이 비-바이러스(예컨대, 플라스미드) 또는 바이러스 벡터에 의해 공급될 수 있다.
AAV rep 및/또는 cap 유전자는 대안적으로 유전자를 안정하게 발현하는 포장 세포에 의해 제공될 수 있다. 포장 세포의 생산 방법은 바이러스(예컨대, AAV) 입자 생산을 위해 필요한 모든 성분을 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하는 것이다. 예컨대, 일 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자가 없는 바이러스 rAAV 게놈, rAAV 게놈과 별개인 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선별 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드(또는 다중 플라스미드)가 세포의 게놈 내로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링(문헌[Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081]), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함는 합성 링커의 부가(문헌[Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73])와 같은 절차에 의해 또는 직접적으로, 블런트-말단 라이게이션(문헌[Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666])에 의해 박테리아 플라스미드 내로 도입된다. 포장 세포주는 이어서 헬퍼 바이러스 예컨대 아데노바이러스와 함께 감염된다. 이러한 방법의 이점은 세포가 선별가능하고 rAAV의 대량 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 포장 세포 내로 도입하기 위해 플라스미드 보다는 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스를 사용하는 것이다.
일 실시형태에서, 포장 세포는 안정하게 형질전환된 암세포 예컨대 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동족체 293 계통)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 포장 세포는 형질전환되지 않은 암세포, 예컨대 낮은 계대 293 세포(아데노바이러스의 E1으로 형질전환된 인간 태아 신장 세포, MRC-5 세포(인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유아세포), Vero 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포(레수스 태아 폐 세포)이다.
추가 실시형태에서, 전달 벡터는 하이브리드 Ad-AAV 전달 벡터이다. 간단하게, 하이브리드 Ad-AAV 벡터는 아데노바이러스 (i) 바이러스 복제 및 캡슐화를 위한 5' 및 3' 시스-요소를 포함하는 아데노바이러스 벡터 게놈, 및 추가로 (ii) AAV5' 및 3' 역 말단 반복(ITR), AAV 포장 서열, 및 AAV ITR에 의해 플랭킹된 이종서열을 포함하는 AAV 벡터 게놈을 포함하며, 여기서 재조합 AAV 벡터 게놈은 아데노바이러스 5' 및 3' 시스-요소에 의해 플랭킹된다. 아데노바이러스 벡터 게놈은 전술된 바와 같이 추가로 결실될 수 있다.
본 개시내용에서 사용하기 위한 또 다른 벡터는 헤르페스 단순 바이러스(HSV)를 포함한다. HSV는 장기 유전자 유지를 위한 잠복 기능만을 나타내는 벡터를 생성함으로써 세포에 트랜스진을 전달하기 위해 변형될 수 있다. HSV 벡터는 최대 20 킬로베이스 이상의 큰 DNA 삽입을 허용하고; 매우 높은 역가로 생산될 수 있고; 세포용해 주기가 일어나지 않는 한 중추 신경계에서 장기간 트랜스진을 발현하는 것으로 나타났기 때문에 핵산 전달에 유용하다.
헤르페스바이러스는 또한 AAV 포장 방법에서 헬퍼 바이러스로서 사용될 수 있다. AAV Rep 단백질을 코딩하는 하이브리드 헤르페스바이러스는 유리하게는 확장가능한 AAV 벡터 생산 계획을 촉진할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현하는 하이브리드 헤르페스 단순 바이러스 유형 I(HSV-1) 벡터가 기술되어 있다(문헌[Conway et al. (1999) Gene Therapy 6:986] 및 국제 공개 WO 00/17377호).
본 개시내용의 다른 실시형태에서, 관심 전달 벡터는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스는 일반적으로 종 특이적 세포 표면 수용체, 예컨대 CD4(HIV의 경우); CAT(MLV-E; 생태성 뮤린 백혈병 바이러스 E의 경우); RAM1/GLVR2(뮤린 백혈병 바이러스-A; MLV-A의 경우); GLVR1(긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 및 고양이 백혈병 바이러스 B(FeLV-B)의 경우)에 결합한다. 복제-결함 레트로바이러스만을 생산하는 특수 세포주("포장 세포"로 지칭됨)의 개발은 유전자 치료법에 대한 레트로바이러스의 유용성을 증가시켰고, 결함 레트로바이러스는 유전자 치료법 목적을 위한 유전자 전달에서 사용하는 것을 특징으로 한다. 복제-결함 레트로바이러스는 표준 기술에 의해 헬퍼 바이러스의 사용을 통해 표적 세포를 감염시키는데 사용될 수 있는 비리온 내로 포장될 수 있다.
또 다른 적합한 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 하위유형이지만 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 고유한 능력을 가지고 있으며, 따라서 광범위한 적용 가능성을 가질 수 있다.
또 다른 적합한 벡터는 폭스바이러스 벡터이다. 이러한 바이러스는 100개 초과의 단백질을 함유한다. 바이러스의 세포외 형태는 2개의 막을 갖는 반면 세포내 입자는 내막만을 갖는다. 바이러스의 외부 표면은 양면이 오목한 코어를 둘러싸고 있는 지질 및 단백질로 이루어져 있다. 폭스바이러스는 감염 후 특이적 항체와 교차-반응 항체 둘 모두를 포함하여 항원적으로 매우 복잡하다. 폭스바이러스는 다양한 범위의 세포를 감염시킬 수 있다. 폭스바이러스 유전자 발현은 트랜스진의 발현을 위한 벡터로서 우두증 바이러스를 사용하는 것에 대한 관심으로 인해 잘 연구되어있다.
또 다른 대표적인 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 복제 rAAV 바이러스에 의해 제공된다. 또 다른 실시형태에서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 프로바이러스는 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합될 수 있다.
바이러스 역가를 향상시키기 위해, 생산적 AAV 감염을 촉진하는 헬퍼 바이러스 기능(예컨대, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)가 세포에 제공될 수 있다. AAV 복제에 필수적인 헬퍼 바이러스 서열이 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 서열은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공될 것이다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 서열은 또 다른 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해, 예컨대 효율적인 AAV 생산을 촉진하는 모든 헬퍼 유전자를 운반하는 비-감염성 아데노바이러스 미니플라스미드로서 제공될 수 있다.
또한, 헬퍼 바이러스 기능은 헬퍼 서열이 염색체에 삽입되거나 안정한 염색체외 요소로서 유지되는 포장 세포에 의해 제공될 수 있다. 일반적으로, 헬퍼 바이러스 서열은 AAV 비리온 내로 포장될 수 없으며, 예컨대 TR에 의해 플랭킹되지 않는다.
상기 전술된 바와 같은 바이러스 전달 방법 외에, 비-바이러스 방법이 또한 사용될 수 있다. 유전자 전달의 다수의 비-바이러스 방법은 거대분자의 흡수 및 세포내 수송을 위해 포유류 세포에 의해 사용되는 정상적인 메커니즘에 의존한다. 특정 실시형태에서, 비-바이러스 전달 시스템은 표적화된 세포에 의해 핵산 분자의 흡수를 위한 세포내 이입 경로에 의존한다. 이러한 유형의 예시적인 핵산 전달 시스템은 리포좀 유도 시스템, 폴리-리신 접합체, 및 인공 바이러스 외피를 포함한다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 벡터가 본 개시내용의 실시에 사용된다. 네이키드 플라스미드가 조직에 주입되어 세포 내로 도입될 수 있다. 발현은 여러 달에 걸쳐 연장될 수 있다. 양이온성 지질이 배양에서 일부 세포 내로 DNA를 도입하는데 도움이 될 수 있다. 양이온성 지질 플라스미드 DNA 복합체를 마우스의 순환에 주입하면 장기(예컨대, 폐)에서 DNA를 발현할 수 있다. 플라스미드 DNA의 하나의 장점은 이것이 비-복제 세포 내로 도입될 수 있다는 것이다.
대표적인 실시형태에서, 핵산 분자(예컨대, 플라스미드)는 이의 표면 상에 양의 변화를 갖는 지질 입자에 포획될 수 있고, 선택적으로 표적 조직의 세포 표면 항원에 대한 항체로 태깅될 수 있다.
양친매성 양이온 분자로 이루어진 리포좀은 시험관 내 및 생체 내 핵산 전달을 위한 유용한 비-바이러스 벡터이다. 양으로 하전된 리포좀은 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 핵산과 복합체화되어 지질:핵산 복합체를 형성하는 것으로 여겨진다. 지질:핵산 복합체는 유전자 전달 벡터로서 몇몇 이점을 갖는다. 바이러스 벡터와 달리, 지질:핵산 복합체는 본질적으로 비제한된 크기의 발현 카세트를 전달하는데 사용될 수 있다. 복합체가 단백질이 결여되어 있으므로, 이들은 면역 및 염증 반응을 더 적게 유발할 수 있다. 또한, 이들은 복제 또는 재조합하여 감염원을 형성할 수 없으며 통합 빈도가 더 낮다.
양친매성 양이온 지질:핵산 복합체는 동물 및 인간 둘 모두에서 생체 내 형질감염에 사용될 수 있으며 긴 저장 기간을 갖도록 제조될 수 있다.
또한, 본 개시내용에 따른 벡터는 진단 및 스크리닝 방법에서 사용될 수 있으며, 이에 따라 ATP1A3을 코딩하는 핵산은 세포 배양 시스템에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되거나, 대안적으로, 형질전환 동물 모델 스크리닝 방법에서 사용될 수 있으며, 이에 따라 관심 핵산은 세포 배양 시스템에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되거나, 대안적으로 형질전환 동물 모델에서 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 비제한적으로 당업자에게 명백한 바와 같이, 유전자 표적화, 제거, 전사, 번역 등을 평가하기 위한 프로토콜에서의 사용을 포함하여 다양한 비-치료적 목적을 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 안전성(전파, 독성, 면역원성 등) 평가 목적을 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 이러한 데이터는 임상 효율의 평가 전에 규제 승인 절차의 일부로서 미국 식품 의약국(United States Food and Drug Administration)에 의해 고려된다.
유전자 치료 방법, 약학 제형, 및 투여 방식
본 개시내용의 또 다른 양태는 본원에 기술된 ATPase 트랜스진(예컨대, ATP1A3) 및/또는 핵산 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 조성물, 약학 제형을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의의 조성물은 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV) 및/또는 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 및 선택적으로, 다른 약제, 약학 제제, 안정화제, 완충제, 담체, 보조제, 희석제 등을 포함하거나 이로 이루지거나 이로 본질적으로 이루어진다. 주입의 경우, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 호흡가능한 것일 수 있고, 선택적으로 고체 또는 액체 미립자 형태일 수 있다.
"약학적으로 허용되는"은 생물학적이지 않거나 달리 바람직하지 않은 물질, 즉 물질이 독성과 같은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않고 단리된 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 따라서, 이러한 약학 조성물은 예컨대 생체 외 세포의 형질감염 또는 단리된 핵산 또는 벡터를 대상체에 직접 투여하는데 사용될 수 있다.
조성물은 또한 다른 성분 예컨대 희석제 또는 보조제를 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 희석제 및 보조제는 수용자에게 비독성이고 바람직하게는 사용되는 용량 및 농도에서 불활성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 또는 다른 유기산; 항산화제 예컨대 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성 반대 이온 예컨대 소듐; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 Tween, 플루로닉 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
주입용으로 적합한 약학적인 담체, 희석제 또는 부형제는 멸균 수용액 또는 분산제 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액을 즉석 제조하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우, 형태는 멸균되어야 하며 용이하게 주입할 수 있을 정도로 유동적으로 존재해야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 유지를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅에 의해, 분산액의 경우 요망되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에 등장화제, 예컨대 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
일부 실시형태에서, 멸균 주입가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 요망되는 양으로 재조합 바이러스 벡터(예컨대 rAAV)를 혼입시킨 다음 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주입가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 사전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조 기술이다.
근육 내 주입 목적의 경우, 보조제 예컨대 참기름 또는 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜 중의 용액뿐만 아니라 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 원하는 경우 완충될 수 있으며, 액체 희석제는 우선 염수 또는 글루코스로 등장화된다. 유리산(DNA는 산성 포스페이트기를 함유함) 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV) 용액은 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV) 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 그리고 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용되는 멸균 수성 매질은 당업자에게 잘 공지된 표준 기술에 의해 모두 용이하게 수득가능하다.
약학 조성물은 주입가능한 제형으로서 또는 경피 수송에 의해 대상체에 전달될 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육 내 주입 및 경피 수송 둘 모두를 위한 다양한 제형이 이미 개발되었으며 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터는 투여 및 취급의 용이를 위해 임의의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 사용될 수 있다.
본 개시내용의 방법에 따라 투여될 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)의 역가는 예컨대 특정 재조합 바이러스 벡터, 투여 방식, 치료 목적, 개체, 및 표적화될 세포 유형에 따라 달라질 것이며, 당업계에서 표준인 방법에 의해 결정될 수 있다.
바이러스 벡터의 경우, 바이러스 입자는 특정 표적 세포에 적합한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 감염 다중도로 세포와 접촉될 수 있다. 투여될 바이러스의 역가는 표적 세포 유형 및 특정 바이러스 벡터에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 적어도 약 103　바이러스 입자, 적어도 약 105　입자, 적어도 약 107 입자, 적어도 약 109　입자, 적어도 약 1011　입자, 또는 적어도 약 1012　입자가 세포에 투여된다. 예시적인 실시형태에서, 약 107 내지 약 1015　입자, 약 107　내지 약 1013　입자, 약 108　내지 약 1012 입자, 약 1010　내지 약 1015　입자, 약 1011　내지 약 1015　입자, 약 1012　내지 약 1014　입자, 또는 약 1012　내지 약 1013　입자가 투여된다. 용량이 또한 바이러스 게놈(vg) 단위로 표현될 수 있다.
본 개시내용의 벡터가 투여될 세포는 비제한적으로 뉴런 세포(말초 및 중추 신경계 포함), 망막 세포, 상피 세포(진피, 장, 호흡기, 방광, 폐, 복막 및 유방 조직 상피 포함), 근육(심장, 폐 평활근 세포를 포함하는 평활근, 골격근, 및 횡경막 포함), 췌장 세포(섬 세포 포함), 신장 세포, 간 세포(실질 포함), 장 세포, 섬유아세포(예컨대, 피부 섬유아세포 예컨대 인간 피부 섬유아세포), 섬유아세포-유래 세포, 내피 세포, 장 세포, 생식 세포, 폐 세포(기관지 세포 및 폐포 세포 포함), 전립선 세포, 줄기 세포, 전구체 세포, 수지상 세포 등을 포함하여 임의의 유형일 수 있다. 또한, 세포는 위에 표시된 바와 같이 임의의 종 기원일 수 있다.
본 개시내용에 따른 벡터로 표적 세포를 형질도입하는 방법이 본 개시내용에 의해 고려된다. 용어 "형질도입"은 본 개시내용의 복제-결함 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)를 통해 생체 내 또는 시험관 내에서 수용 세포에 ATPase 트랜스진의 투여/전달됨에 따라 수용 세포에 의한 ATPase의 발현을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용은 ATP1A3을 코딩하는 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)의 유효 용량(또는 본질적으로 동시에 투여되는 용량 또는 간격을 두고 주어지는 용량)을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 방법을 제공한다.
생체 내 형질도입 방법은 유효 용량, 또는 유효 다중 용량의 핵산 발현 카세트 또는 본 개시내용의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 동물(인간 포함)에 투여하는 단계를 포함한다. 용량이 장애/질환의 발달 전에 투여되는 경우, 투여는 예방적이다. 용량이 장애/질환의 발달 후에 투여되는 경우, 투여는 치료적이다. 본 개시내용의 실시형태에서, 유효 용량은 치료될 장애/질환 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화(제거 또는 감소)시키고/시키거나, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 예방하고/하거나, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 예방하고/하거나, 질환의 정도를 감소시키고/시키거나, 질환의 후퇴(부분적으로 또는 모두)를 야기하고/하거나, 생존을 연장시키는 것이다. 본 개시내용의 방법으로 예방 또는 치료하기 위해 고려되는 질환의 예는 AHC이다.
재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)를 이용한 형질도입은 또한 시험관 내에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 원하는 표적 세포가 대상체로부터 제거되고, 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)로 형질도입되어 대상체 내로 재도입된다. 대안적으로, 동종 또는 이종 표적 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우 사용될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)의 형질도입 또는 대상체 내로 형질도입된 세포의 재도입을 위한 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 세포는 예컨대 적절한 배지에서 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)를 표적 세포와 결합하고 서던 블롯 및/또는 PCR과 같은 통상적인 기술을 사용하여, 또는 선별 마커를 사용하여 관심 DNA를 보유하는 이들 세포를 스크리닝함으로써 시험관 내에서 형질도입될 수 있다. 이어서 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV) 또는 형질도입된 세포는 약학 조성물로 제형화될 수 있고, 상기 조성물은 다양한 기법, 예컨대 근육 내, 정맥 내, 피하 및 복강 내 주입에 의해, 예컨대 카테터를 사용하여 평활근 및 심장 근육 내 주입에 의해, 척수강내, 수조내, 뇌실내 또는 실질내로 뇌로 대상체에 도입될 수 있다.
본 개시내용의 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)를 사용하는 세포의 형질도입은 ATP1A3 또는 또다른 ATPase 유전자의 지속 발현을 초래할 수 있다. 따라서 본 개시내용은 대상체(예컨대 인간 환자)에 예컨대 ATP1A3을 발현하는 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)의 투여/전달 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)를 사용하여 조직(비제한적으로 조직 예컨대 신경계 및 근육, 기관 예컨대 뇌, 심장, 간, 및 샘 예컨대 침샘)을 형질도입하는 단계를 포함한다. 형질도입은 본원에 기술된 바와 같은 조직 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카세트를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 편집은 뉴클레아제 예컨대 징크 핑커 뉴크레아제 또는 CRISPR/Cas9, 및 공여 주형으로서 ATPase에서 돌연변이에 플랭킹된 정상 ATPase 서열을 사용하여 세포를 형질도입함으로써 달성된다. 이러한 실시형태에서, 뉴클레아제를 사용하는 형질도입은 병원성 변이체/돌연변이 근처에 있는 ATPase 유전자를 절단한 후 상동성 지시된 복구를 통해 개별 환자의 증상을 유발하는 변이체/돌연변이를 교정함으로써 ATPase-관련 질환을 치료 및/또는 예방한다.
본 개시내용의 단리된 핵산, 벡터, 및 조성물은 다양한 방법에서 추가로 사용될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체에서 ATPase-매개 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용에 기술된 ATPase(예컨대, ATP1A3)를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 발현 카세트, 벡터, 조성물, 또는 약학 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어져 대상체에서 ATPase-매개 질환이 예방된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되며 인간 및 비인간 동물 둘 모두를 지칭한다. 본 개시내용의 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예컨대 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 대상체는 ATP1A3-매개 질환에 걸릴 위험이 있거나 이를 앓고 있는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 또한 ATP1A3 유전자의 돌연변이에 의해 야기된 질환에 걸릴 위험이 있거나 이를 앓고 있는 인간 환자일 수 있다. 인간 환자는 임의의 연령일 수 있다(예컨대, 영아, 아동, 또는 성인).
본원에서 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 환자가 나타내거나 환자가 민감성일 수 있는 질환, 장애 또는 생리학적 병태에 대한 반응으로 이루어진 임상학적 개입을 지칭한다. 치료의 목적은 증상 완화 또는 예방, 질환, 장애, 또는 병태의 진행 또는 악화 늦춤 또는 멈춤, 및/또는 질환, 장애 또는 병태의 후퇴를 포함한다.
본원에서 사용된 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 핵산 분자 및/또는 조성물 및/또는 약학 조성물의 유효량은 연령, 체중, 및 환자(대상체) 병태의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
치료제의 유효량은 일반적으로 적어도 10% 까지, 보다 일반적으로 적어도 20% 까지, 가장 일반적으로 적어도 30% 까지, 전형적으로 적어도 40% 까지, 보다 전형적으로 적어도 50% 까지, 가장 전형적으로 적어도 60% 까지, 종종 적어도 70% 까지, 보다 종종 적어도 80% 까지, 가장 종종 적어도 90% 까지, 통상적으로 적어도 95% 까지, 보다 통상적으로 적어도 99% 까지, 가장 통상적으로 적어도 99.9%까지 증상을 감소 또는 완화하는 양이다.
본원에서 사용된 용어 "질환"은 비제한적으로 유기체의 부분에 영향을 미치는 구조 또는 기능의 임의의 비정상적인 상태 및/또는 장애를 포함한다. 이는 감염성 질환과 같은 외부 인자에 의해, 또는 암, 암 전이 등과 같은 내부 기능장애에 의해 야기될 수 있다.
인간, 영장류, 포유류, 포유류 대상체, 동물, 수의학적 대상체, 플라시보 대상체, 연구 대상체, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용되는 바와 같은 용어 "투여" 또는 "투여하기"는 제한 없이 외래 리간드, 시약, 플라시보, 소분자, 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물을 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체 등과 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여"는 예컨대 치료적, 약동학적, 진단적, 연구, 플라시보, 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 세포를 시약(예컨대, 핵산 분자)에 노출시키는 것 뿐만 아니라 시약을 유체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 유체는 세포와 접촉하고 있다. "투여하기"는 또한 예컨대 시약, 진단, 결합 조성물에 의한, 또는 또 다른 세포에 의한 세포의 시험관 내 및 생체 외 치료를 포함한다.
유효 용량의 단리된 핵산, 벡터 및 조성물의 투여는 비제한적으로 척추강내, 대조내, 대뇌내부심실내, 해마내, 근육내, 비경구, 정맥내, 구강, 협측, 비강, 폐, 두개내-실질-내, 골내, 또는 안구 내를 포함하여 당업계의 표준 경로에 의한 것일 수 있다. 해마내 투여는 단리된 핵산, 벡터, 또는 조성물을 해마 뇌(실질-내)의 물질에 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 대뇌내부심실내는 단리된 핵산, 벡터, 또는 조성물을 뇌척수액으로 채워져 있고 해마 옆에 있지만 이의 일부가 아닌 뇌실 내로 주입하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV, 특히 AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 바이러스(예컨대 AAV) 성분의 투여 경로 및 혈청형은 치료될 질환 상태 및 ATP1A3을 발현하는 표적 세포/조직을 고려하여 당업자에 의해 선택되고/되거나 매칭될 수 있다.
본 개시내용은 유효량의 rAAV 및 본원에 제공된 바와 같은 병용 요법을 포함하는 본 개시내용의 조성물의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예컨대, 전신 투여는 순환계에 투여하여 전신에 영향을 미치도록 하는 것이다. 전신 투여는 경장 투여 예컨대 위장관을 통한 흡수 및 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여를 포함한다.
특히, 본 개시내용의 벡터(예컨대, rAAV)의 실제 투여는 벡터를 대상체의 표적 조직 내로 수송할 물리적 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다.
바이러스 벡터 및 바이러스 캡시드는 CNS(예컨대, 뇌, 안구) 조직에 투여될 수 있으며 유리하게는 본 개시내용의 부재 시 관찰되는 것보다 바이러스 벡터 또는 캡시드의 더 넓은 분포를 초래할 수 있다.
본 개시내용에 따른 투여는 비제한적으로 뇌실, 대조(cisterna magna), 척수(spinal theca), 근육, 혈류 내로 주입 및/또는 뇌 내로 직접 주입을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 분자, 벡터, 및/또는 조성물은 CNS로 투여된다(예컨대, 뇌로 또는 안구로). 바이러스 벡터 및/또는 캡시드는 척수, 뇌간(숨뇌(medulla oblongata), 뇌교(pons)), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑질, 솔방울샘), 소뇌, 종뇌(telencephalon)(선조체, 후두부(occipital), 관자(temporal), 두정부(parietal) 및 전두엽 피질을 포함하는 대뇌, 기저핵, 해마 및 편도체(portaamygdala)), 대뇌 번연계(limbic system), 신피질, 선조체, 대뇌, 및 하구(inferior colliculus) 내로 도입될 수 있다. 본 개시내용의 핵산 분자, 벡터, 및/또는 조성물은 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 안구의 상이한 영역으로 투여될 수 있다.
핵산 분자, 벡터, 및/또는 조성물은 전달 벡터의 보다 분산된 투여를 위해 뇌척수액으로 전달될 수 있다(예컨대 요추 천자에 의해).
핵산 분자, 벡터, 및/또는 조성물은 비제한적으로 대뇌내부심실내, 대조내, 뇌실질내, 두개내, 척추강내, 안구내, 대뇌내, 뇌실내, 정맥내(예컨대, 만니톨과 같은 당의 존재 하에), 비강내, 귀내, 안구내(예컨대, 유리체내, 망막하, 전안부) 및 안구주위(예컨대, 테논하 영역) 전달뿐만 아니라 운동 뉴런에 역행 전달과 함께 근육 내 전달을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 원하는 영역으로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 핵산 분자, 벡터, 및/또는 조성물은 액체 제형으로 직접적인 주입(예컨대 정위(stereotactic) 주입)에 의해 CNS의 원하는 영역 또는 구획에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 원하는 영역에 국소 적용에 의해 또는 에어로졸 제형의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 안구로의 투여는 액상의 액적의 국소 적용에 의한 것일 수 있다. 추가의 대안으로서, 바이러스 벡터 및/또는 캡시드는 고체의 서방 제형으로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 하나 초과의 투여 경로가 활용될 수 있다(예컨대 ICV와 ICM 투여).
예컨대, 인산염 완충된 염수(PBS) 중의 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV)의 재현탁이 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분할 수 있으며, 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV, 그러나 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV와 함께 정상적인 방식으로 회피되어야 함)와 함께 공동-투여될 수 있는 담체 또는 기타 성분에 대해 알려진 제한은 없다. 재조합 바이러스 벡터가 rAAV를 포함하는 경우, rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 근육과 같은 특정 관심 표적 조직으로 표적화되도록 변형될 수 있다.
투여량은 투여 방식, 치료될 질환 또는 병태의 중증도, 개별 대상체의 병태, 특정 벡터, 및 전달될 유전자에 따라 달라지며, 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 핵산 분자 또는 벡터는 상기 용어가 상기 정의된 바와 같이 치료 유효량으로 대상체에 투여된다.
본원에 개시된 방법에서 투여될 벡터(예컨대, rAAV)의 용량은 예컨대 특정 재조합 바이러스 벡터, 투여 방식, 치료 목적, 개체, 및 표적화될 세포 유형에 따라 달라질 것이며, 당업계의 표준 방법으로 결정될 수 있다. 투여될 재조합 바이러스 벡터(예컨대, rAAV) 각각의 역가는 ml 당 약 1 × 106, 약 1 × 107, 약 1 × 108, 약 1 × 109, 약 1 × 1010, 약 1 × 1011, 약 1 × 1012, 약 1 × 1013, 약 1 × 1014, 또는 내지 약 1 × 1015 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위(즉, 각각 1 × 107 vg, 1 × 108 vg, 1 × 109 vg, 1 × 1010 vg, 1 × 1011 vg, 1 × 1012 vg, 1 × 1013 vg, 1 × 1014 vg, 1 × 1015)로 표현될 수 있다. 투여량은 또한 체중 킬로그램(kg) 당 바이러스 게놈(vg) 단위(즉, 각각 1 × 1010 vg/kg, 1 × 1011 vg/kg, 1 × 1012 vg/kg, 1 × 1013 vg/kg, 1 × 1014 vg/kg, 1 × 1015 vg/kg)로 표현될 수 있다. AAV와 같은 바이러스 벡터를 적정하는 방법이 문헌[Clark et al., Hum. Gene Ther., 10:1031-1039 (1999)]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 하나 초과의 투여(예컨대, 2, 3, 4 또는 그 이상의 투여)가 다양한 간격, 예컨대 매일, 매주, 매월, 또는 매년의 기간에 걸쳐 유전자 발현의 원하는 수준을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
표적 조직으로의 전달은 또한 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 데포(depot)를 전달함으로써 달성될 수 있다. 대표적인 실시형태에서, 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 데포는 골격, 심장 및/또는 횡경막 근육 조직 내로 이식되거나 조직이 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 필름 또는 다른 매트릭스와 접촉될 수 있다.
병용 요법이 또한 본 개시내용에 의해 고려된다. 본원에서 사용되는 병용은 동시 치료 및 순차적 치료 둘 모두를 포함한다. 본 개시내용의 방법과 표준 의학적 치료의 병용이 구체적으로 고려되며, 이는 전술된 바와 같은 대안적인 벡터, 요법 및 신규 요법의 효율을 향상시키도록 조작되고 생성된 신규 벡터와의 병용이다.
키트
본 개시내용의 다른 양태는 대상체에서 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 본원에 제공된 바와 같은 조성물 및 사용 설명서를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본원에 개시되고 설명된 모든 것을 제공한다.
다음의 실시예가 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.
실시예
실시예 1: AHC의 징후를 재현하는 마우스 모델은 유전자 치료법을 인간 적용으로 변환하기 위한 증거를 제공한다
현재 ATP1A3 돌연변이의 6종의 마우스 모델이 존재한다(문헌[Clapcote et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 106(33): 14085-14090]; 문헌[Hunanyan et al. (2015) Epilepsia 56(1):82-93]; 문헌[Hunanyan et al. (2018) Epilepsia 59(7): 1455-1468]; 문헌[Masoud et al. (2017) Curr Treat Options Neurol. 19(2):8]; 문헌[Heinzen et al. (2012) Nat genet. 44(9):1030-1034]; 문헌[Helseth et. al. (2018) Neurobiol Dis. 119:100-112]; 문헌[Holm et al. (2016) Biochim Biophys Acta. 1857(11):1807-1828]; 문헌[Ikeda et al. (2017) Brain Res. 1666: 27-37]). 이형접합 Mashlool 및 Matoub 마우스 모델이 AHC의 모든 징후를 재현하는 유일한 모델이다(문헌[Hunanyan et al. (2015) Epilepsia 56(1):82-93]; 문헌[Helseth et. al. (2018) Neurobiol Dis. 119:100-112]). 보고된 바와 같이 이러한 녹-인 마우스 각각은 C57BL/6J 배경에서 가장 흔한 2개의 돌연변이 중 하나를 가지고 있다. Mashlool(Mashl +/- )은 인간에서 평균 중증도의 AHC를 유발하는 가장 흔한 돌연변이(AHC 환자의 40%)인 D801N 돌연변이를 가지고 있다. Matoub 마우스(Matb +/ )는 두번째로 가장 흔한 돌연변이(AHC 환자의 26%)이며 인간에서 가장 심각한 표현형을 유발하는 E815K 돌연변이를 가지고 있다. Mashlool 및 Matoub 마우스는 스트레스(냉수 노출)로 유도된 편마비, 근긴장 이상 및 간질 발작뿐만 아니라 자발적인 증상을 나타낸다. 둘 모두 또한 인간 표현형과 유사하게 플루나리진에 대한 반응으로 유도된 편마비가 감소하지만 이러한 약물의 다른 이점은 없다(문헌[Hunanyan et al. (2015) Epilepsia 56(1):82-93]; 문헌[Hunanyan et al. (2018) Epilepsia 59(7): 1455-1468]; 문헌[Masoud et al. (2017) Curr Treat Options Neurol. 19(2):8]; 문헌[Mikati et al. (2000) Pediatr Neurol. 23(2):134-141]; 문헌[Helseth et al. (2018) Neurobiol Dis. 119:100-112]). 플루나리진에 대한 반응은 다른 어떤 모델에서도 입증되지 않은 이러한 두 모델의 또 다른 독특한 검증이다.
본원에 기술된 실시예의 경우, D801N(Mashl +/- ) 돌연변이체는 번성하는 콜로니를 유지하는 능력 및 장기 실험을 수행하는 능력을 제한하는 막대한 사망률을 갖는 E815K(Matb +/ ) 돌연변이체에 비해 인간에서 가장 흔한 돌연변이기 때문에 연구를 위해 이를 선택하였다. 발작성 발작(paroxysmal spells) 외에도, 사춘기 전(prepubescent) 및 성체 D801N 마우스는 또한 인간의 AHC 이환율과 밀접하게 유사한 행동 이상을 나타낸다. 이는 사망률 증가뿐만 아니라 균형, 충동성, 기억력 및 보행, 이상을 포함한다(문헌[Hunanyan et al. (2015) Epilepsia 56(1):82-93]; 문헌[Hunanyan et al. (2018) Epilepsia 59(7): 1455-1468]). D801N 마우스는 또한 탈분극을 퍼뜨리는 경향이 있고, 신경 흥분성이 증가하고 GABA성 급속 스파이크 억제 개재뉴런의 발화 장애를 갖는다(문헌[Hunanyan et al. (2015) Epilepsia 56(1):82-93]; 문헌[Hunanyan et al. (2018) Epilepsia 59(7): 1455-1468]). 따라서, D801N(Mashl +/- ) 모델을 사용하면 AHC 및 상기 언급한 다른 ATP1A3 관련 질환을 치료하기 위한 임상 적용으로 변환될 수 있는 새로운 치료법을 개발하는데 도움이 될 수 있다. 본원에 기술된 대부분의 실험에서, P10 연령군은 AHC 증상이 시작되는 연령에서 인간의 유아기에 해당하므로 연구를 위해 선택하였다. 행동 시험을 AHC 발현이 적어도 10년 동안 확립된 연령인, 인간의 청소년기에 해당하는 P40 부근에서 수행하였다.
실시예 2: AAV9 활성 벡터의 대뇌내부심실내(ICV) 주입은 주입 부위에 인접한 뇌 영역에서 ATPase 활성의 강력한 증가를 초래한다
AAV9 활성 벡터의 ICV 주입이 뇌 영역에서 우아바인 민감성 ATPase 활성 증가를 초래할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 우리는 이전에 기술된 ATPase 효소 활성 분석법을 수행하였다(문헌[Clapcote et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 106(33): 14085-14090]; 문헌[Ye et al. (2017) EMBO J., 36(16): 2419-2434]).
간략하게, WT 마우스에 4 × 1010 vg(각 측면에서 1μl)의 AAV9-Syn-ATP1A3-p2a-Cherry-SV40polyA(도 1) 또는 유사한 용량의 대조군 벡터(ATP1A3 트랜스진이 없는 벡터)를 해마 내로 주입하였다. 대조군 벡터(n=2)가 주입된 마우스에 비해 AAV9-Syn-ATP1A3-p2a-Cherry-SV40polyA(n=2)가 주입된 마우스의 해마에서 총 ATPase 활성이 22% 증가가 관찰되었으며, 우아바인 민감성 분획(도 4)에서는 훨씬 더 높았다(375%). 우아바인 둔감성 분획의 증가는 없었으며 이는 총 활성의 증가가 도 4로부터 계산된 바와 같이 우아바인 민감성 분획의 증가로 인간 것임을 나타낸다(AAV-ATP1A3-우아바인-민감성-분획 = 0.93-0.55 = 0.38; AAV-cherry-우아바인-민감성-분획 = 0.74-0.66 = 0.08; 비율 = 0.38/0.08 = 4.75 배 또는 375% 증가). AAV를 각각의 후면 해마 내로 실질-내 반구 당 1 μL를 주입하였다(4x1013 vg/mL, 마우스 당 총 2 μL).
활성 벡터(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA, V=5 μl, 4 × 1013 vg/ml, n=3/군)가 ICV로 P10에서 일측으로 주입된 P40 야생형 마우스는, 대조군 벡터(ATP1A3 트랜스진이 없는 벡터)에 비해 동측 해마에서 우아바인-민감성 ATPase 활성이 102% 더 높았던 것으로 나타났다(도 5, p=0.046 단측 Student's t-검정). 다른 동측 영역에서 변화는 통계적으로 유의한 차이를 달성하지 못하였으나(마우스 수는 군 당 단지 3마리였음) 해마에 근접한 영역에서 대조군 벡터에 비해 우아바인-민감성 ATPase 활성 증가를 나타냈다. 위의 일측 ICV 주입 후 대뇌 피질에서는 37% 더 높았고, 기저핵/시상에서는 26% 더 높았고 뇌간에서는 16% 더 높았고 소뇌에서는 없었다(모든 비교 p>0.05).
실시예 3: mCherry 발현에 의해 평가된 일측 해마내 및 대뇌내부심실내 주입 후 형질도입
P0 내지 P10 연령 및 성체 마우스에 주입된 Mashl+/- 및 WT-한배 새끼(littermate)에서 4 × 10 10 vg(V=5 μL의 4 × 1013 vg/mL의 AAV9-Syn-ATP1A3-p2a-mCherry-SV40polyA (AAV9-ATP1A3)의 해마내 주입을 24마리 마우스에서 수행하였다. 1개월 후 이들을 희생시켰다.
결과는 mCherry 신호에 의해 검출되고 성체 WT 마우스의 해마에서 예시된 바와 같이 모든 연령에서 활성 바이러스 벡터의 우수한 형질도입 효능을 입증하였다(도 6a 내지 6b). 일관되게, CA1에서 mCherry를 발현하는 뉴런의 비율은 >90%였고, CA3에서는 약 70%였다. 발현은 피라미드 세포 및 개재뉴런 둘 모두에서 강력하였다.
또한, ~P10 마우스에서 AAV9-ATP1A3 (4 × 1013 vg/mL; V=5 μl)의 일측 대뇌내부심실내 주입(ICV)은 P40에서 해마, 기저핵, 시상, 피질 및 심지어는 상대적으로 거리가 먼 소뇌를 포함하여 다양한 뇌 영역의 세포질에서 나타난 mCherry의 우수한 발현을 나타냈다(도 7a 내지 7b).
실시예 4: 돌연변이 마우스의 균형 빔 시험에서의 운동 성능 회복
일측 해마내 AAV9-Syn-ATP1A3-p2a-Cherry-SV40polyA가 돌연변이 마우스에서 운동 성능을 회복시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 균형 빔 시험을 수행하였다. 성체 돌연변이체 Mashl+/- 마우스(2 내지 3개월령 마우스)를 해마내 AAV9-Syn-ATP1A3-p2a-Cherry-SV40polyA(5μl의 4 × 1013 중의 20 1010 vg, n=6 마우스)로 처리하고 주입 후 21일차에 시험하였다. AAV-Syn-ATP1A3-p2a-Cherry-SV40polyA(n=3)로 처리한 Mashl+/- 마우스는 대조군 벡터 AAV-cherry(군 당 n=3, p=0.053, Student's t-검정 일측)로 처리한 Mashl+/- 마우스보다 우수한 성능을 가졌다(즉, 이들은 빔을 더 빨리 건넜음)(도 8). AAV의 주입을 2 내지 3개월령 마우스에서 수행하였다.
실시예 5: AAV9 활성 벡터의 ICV 및 대조내(ICM) 주입은 주입 부위에 인접한 뇌 영역에서 강력한 FLAG 리포터 유전자 발현을 야기한다
ICV 및 ICM 주입 후 리포터 유전자 발현 정도를 결정하기 위해 우리는 다음을 수행하였다. 1) P10에서 20 × 1010 vg의 일측 ICV 주입 및 P40에서 동물 희생(도 9a 내지 9d). 2) P10에서 15 × 1010 vg의 ICM 주입 및 P40에서 희생(도 9f). 동일한 AAV 활성 벡터의 3가지 용량을 사용하여 병용된 ICM 및 양측 ICV 주입의 증분 용량 연구를 P10에서 주입하고 P40에서 희생시켰다(AAV9-hSyn-ATP1A3-FLAG-p2a-Cherry-SV40polyA, 4 WT 마우스/용량, 도 10a 내지 10h). 연구한 3가지 용량은 각 부위(대조 및 2개의 외측 뇌실, 총 9 × 1010 vg/마우스)에서 3 × 1010 vg, 각 부위(총 18 × 1010 vg/마우스)에서 6x1010 vg 및 각 부위(총 27 × 1010 vg/마우스)에서 9 × 1010 vg였다.
강력한 트랜스진 발현이 더 높은 용량에서 관찰되었지만(도 9a 내지 9d, 9f 및 도 10a 내지 10h) 증분 용량 연구의 더 낮은 2개 용량에서는 관찰되지 않았다. 2개의 리포터 유전자인 ATP1A3 DNA의 3' 말단 뒤에 있는 FLAG와 그 사이에 절단 부위가 있는 mCherry를 사용하여 트랜스진 발현을 평가하였다. 특히, 해마는 일측 또는 양측 ICV 주입 후와 관계 없이 ICV 주입 측면의 CA3 및 CA1 해마 영역에서 세포가 거의 100% FLAG 발현을 나타냈다(도 9a 내지 9d 및 도 10a 내지 10b). 일측 ICV 주입 후, 반대측면에서 최소 발현이 존재하였다. 병용된 ICM 및 양측 ICV 주입으로 피질 및 소뇌는 주입 부위에 가까운 영역에서 훨씬 더 높은 비율로 총 세포의 약 10%에서 발현을 나타냈다: 이들 영역의 거의 모든 세포는 강력한 발현을 나타낸 반면(도 10a 내지 10e) 더 먼 영역은 발현이 있는 경우 매우 낮은 것으로 나타났다. 기저핵, 시상, 및 뇌간을 포함하는 심부 뇌 구조는 또한 거의 발현되지 않았다(도 10f 내지 10h).
이러한 실험에서, mCherry는 ATP1A3-FLAG로부터 절단되기 때문에 세포질에서 검출된 반면, ATP1A3-FLAG 융합 단백질은 펌프의 기능적 위치인 세포막에서 검출되었다(도 9a 내지 9f 및 도 10a 내지 10h). 이는 ATP1A3 트랜스진이 발현될뿐만 아니라 ATP1A3 단백질이 이의 기능적인 위치인 세포막으로 수송됨을 나타낸다. 활성 벡터에서, FLAG 코딩 DNA 서열은 ATP1A3 코딩 서열의 3' 말단에 있기 때문에, 이는 ATP1A3 코딩 서열이 전사된 후에만 전사될 것으로 예상된다. 따라서, FLAG에 대한 양성 신호의 입증은 활성 벡터를 통한 외인성 ATP1A3의 발현 및 전사를 나타낸다.
전체 고용량 일측 ICV의 투여가 다른 것의 거의 3배인 2개 용량을 사용하여 바로 인접한 영역을 넘어 형질도입을 증가시킬 것인지 여부를 연구하였다. 2개 용량은 7.5 × 1010 vg 일측 ICV 및 20 × 1010 vg 일측 ICV였다. 이들 둘 모두에서, 해마 뉴런의 거의 100%가 주입 부위의 동측에서 FLAG를 발현하였고 피질에서는 약 10% 및 다른 영역에서는 본질적으로 발현이 없었다. 이러한 데이터는 불필요하게 추가 벡터를 사용하지 않고 가장 높은 수준의 트랜스진 발현을 제공하는 투여 요법이 주입 부위 당 약 7.5 × 1010 vg이고 ICM 및 양측 ICV 주입이 필요함을 나타낸다. 이는 생존 및 행동을 조사하는 연구에서 총 22.5 × 1010 vg/동물에 대해 각 부위에서 7.5 × 1010의 병용 ICM 및 양측 ICV 용량의 사용을 정당화하였다.
실시예 6: 병용된 ICV 및 ICM 활성 벡터 주입은 Mashl +/- 표현형을 개선한다
P10에서 ICM 및 양측 ICV(22.5 × 1010 vg/동물, 각 부위에서 7.5 × 1010) 주입을 통해 투여된 활성 벡터와 대조군 벡터의 효과를 P40에서 비교하였다. 연구 군은 야생형 비처리(WT 나이브, n=10), 야생형 대조군(WT-CTL, n=10), 야생형 처리(WT-Tr, n=4), 돌연변이체 대조군(Het-CTL, n=10) 및 돌연변이체 처리(Het-Tr, n=9) 군이었다.
활성 벡터로 처리한 Mashl+/- 마우스는 편마비 발작의 발생이 유의하게 감소하고(도 11, p=0.0128, Het 대조군 n=4, Het 처리 n=6) 냉수 침지 시험에 의해 유도된 근긴장 이상 발작의 더 짧은 지속기간에 대한 경향을 경험하는 것으로 밝혀졌다(일원 ANOVA를 사용하여 모든 군을 비교한 경우 p= 0.00359 및 일측 Student's t-검정을 사용하여 Het-처리 및 Het-대조군을 비교한 경우 0.062, Het 대조군 n=4, Het 처리 n=6). 3개의 WT군의 마우스 중 어느 것도 근긴장 이상을 나타내지 않았으므로 이들 군은 도 12에 도시하지 않았다. 추가적으로, 활성 벡터가 투여된 마우스 중 어느 것도 냉수 유도된 간질 발작을 일으키지 않은 반면 대조군 벡터가 투여된 마우스의 25%는 발작을 일으켰다(도 13 Het 대조군 n=4, Het 처리 n=6). 후자의 비교는 통계적 유의성을 달성하지 못하였지만(p>0.05), 처음 2개는 위의 p 값으로 설명된 대로 수행되었다.
8 mm 균형 빔 시험에서도 유의한 개선이 관찰되었다. 특히, 활성 벡터가 투여된 돌연변이 Mashl+/- 마우스는 빔을 건너는 시간이 유의하게 더 짧았다(도 14, ANOVA를 사용하는 군 당 비교의 경우 p < 0.001, Het-Tr과 Het-CTRL 군 사이의 비교의 경우 양측 Student's t-검정 p=0.0105, WT 나이브 n=6, WT-CTRL n=10, WT-Tr n=4, Het-CTRL n=6, Het-Tr n=9).
실시예 7: 병용된 ICV 및 ICM 활성 벡터 주입은 장기간 개선된 생존을 야기한다
상기 마우스 군이 P90을 통해 성체로 따랐을 때, 활성 벡터로 처리한 군은 대조군 벡터(HET-CTL)를 주입한 돌연변이군과 비교하여 훨씬 더 우수하고 통계학적으로 유의한(p=0.009) 생존을 나타냈다(도 15). 동물을 P90 후에 희생시켰을 때 웨스턴 블롯은 샘플 웨스턴 블롯(도 16)에 의해 그리고 비교 농도계(도 17, p=0.032)에 의해 예시된 바와 같이 활성 벡터가 주입된 마우스의 해마 및 소뇌 둘 모두에서 FLAG 항체의 발현을 나타냈다. 도 17에 도시된 웨스턴 블롯은 소뇌 및 해마 둘 모두에서 P90에서 성체로의 FLAG 트랜스진의 지속적인 발현이 있음을 예시한다. FLAG 밴드 강도는 소뇌 세포용해물에서보다 해마 세포용해물에서 훨씬 더 강력하였다(도 16). 도 17에 도시된 그래프(WT-CTRL n=2, WT-Tr n=2, Het-CTRL n=2, Het-Tr n=3, post-hoc Student-Newman-Keuls 방법과 함께 일원 ANOVA를 사용하여 대조군과 처리군을 비교한 경우 p=0.032)는 WT 및 Het 처리군에서 P90에서의 성체로의 FLAG 트랜스진의 지속적인 발현을 예시한다.
실시예 8: 인간에서 소아성 교대성 편마비(AHC)의 AAV-매개 유전자 치료법
실시예 1 내지 8은 인간 AHC 환자에서 가장 흔히 발견되는 돌연변이인 D801N 돌연변이를 함유하는 Mashl+/- 마우스에서 AAV-매개 유전자 치료법의 효능을 입증한다. 이러한 결과는 ATP1A3 트랜스진을 사용한 AAV-매개 유전자 치료법이 AHC를 포함하여 ATP1A3-매개 질환을 가진 인간을 치료하기 위한 치료적 접근법임을 나타낸다.
인간에서 이러한 AAV-매개 유전자 치료법 접근법의 효능 및 안전성을 입증하기 위해, 다음의 단계를 취할 것이다.
1. 벡터, 용량 및 전달 경로를 최적화한다.
2. 용량 요법을 추가로 최적화하고 독성 연구를 개시한다.
3. 인간 연구 계획을 시작한다. Duke는 AHC 프로그램 데이터베이스에서 100명 초과의 환자가 있는 국제 AHC 컨소시엄의 선두 센터이다.
당업자는 본 개시내용이 목적을 수행하고 언급된 목적 및 이점뿐만 아니라, 그 안에 고유한 목적을 달성하도록 잘 구성되어 있음을 쉽게 이해할 것이다. 본원에 기술된 본 개시내용은 현재 바람직한 실시형태를 대표하는 것이며, 예시적인 것이며, 본 개시내용의 범주에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 청구범위의 범주에 의해 한정된 본 개시내용의 사상 내에 포함되는 변경 및 다른 용도가 당업자에게 발생할 것이다.
본 명세서에 언급된 임의의 비-특허 및 특허 문헌을 포함한 임의의 참고문헌이 선행기술을 구성한다는 것은 인정되지 않는다. 특히, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 임의의 문서에 대한 참조는 이러한 문서 중 어느 것도 미국 또는 임의의 다른 국가의 기술에 대한 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 승인을 구성하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 참고문헌에 대한 모든 논의는 저자가 주장하는 내용을 나타내며, 출원인은 본원에서 인용된 임의의 문서의 정확성과 적절성에 이의를 제기할 권리가 있다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 달리 명시적으로 지시되지 않는 한 인용되어 완전히 포함된다.
본 개시내용은 인용된 참고문헌에서 발견되는 임의의 정의 및/또는 설명 사이에 임의의 불일치가 있는 경우를 통제할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> DUKE UNIVERSITY MIKATI, Mohamad HUNANYAN, Arsen KANTOR, Boris ASOKAN, Aravind PURANAM, Ram KOEBERL, Dwight <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF ATPASE-MEDIATED DISEASES <130> 20-489-WO <150> US 62/847,416 <151> 2019-05-14 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatggagaga tgcagggatc tggagacgcg gagacaccgg aagcggagac acagaaagac 60 agaaaacaga tggggctggg ggaggggagg gccagtgagc tgttgagtgt ggccgtgcct 120 ggggtggcga gtgtgtgcct gggccggggt gattcagtga cgttgtgatc gtgtgtgcac 180 gcatctgcga ggccatcttc aactgtctgt ggctgtgatc ccgtgtttct gttgaaaatg 240 tacctcccca acccccaaga gaggaagtga ggaatcccag tagactgggg ggtgggtggg 300 cgggcagggg tgggagaggc tgaagggctg atggcgcagg agaaaggtgg gtccgccttc 360 tgtccccgcc ctccctgccc cgccggaggt ttctgtggaa actgcagctg aggaaggacg 420 agtgaaggtc acacagcaag agccaaaacg aggccgagca gaaagggaga gatggaggga 480 tggcgagaga cagagatggg gagagacaac gaagggggca gagtgggcgg gagggggatg 540 gggagagaga 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catcctctcc ctcattctcg gatacacctg gcttgaggct 1560 gtcatcttcc tcatcggcat catcgtggcc aatgtcccag agggtctgct ggccactgtc 1620 actgtgtgtc tgacgctgac cgccaagcgc atggcccgga agaactgcct ggtgaagaac 1680 ctggaggctg tagaaaccct gggctccacg tccaccatct gctcagataa gacagggacc 1740 ctcactcaga accgcatgac agtcgcccac atgtggtttg acaaccagat ccacgaggct 1800 gacaccactg aggaccagtc agggacctca tttgacaaga gttcgcacac ctgggtggcc 1860 ctgtctcaca tcgctgggct ctgcaatcgc gctgtcttca agggtggtca ggacaacatc 1920 cctgtgctca agagggatgt ggctggggat gcgtctgagt ctgccctgct caagtgcatc 1980 gagctgtcct ctggctccgt gaagctgatg cgtgaacgca acaagaaagt ggctgagatt 2040 cccttcaatt ccaccaacaa ataccagctc tccatccatg agaccgagga ccccaacgac 2100 aaccgatacc tgctggtgat gaagggtgcc cccgagcgca tcctggaccg ctgctccacc 2160 atcctgctac agggcaagga gcagcctctg gacgaggaaa tgaaggaggc cttccagaat 2220 gcctaccttg agctcggtgg cctgggcgag cgcgtgcttg gtttctgcca ttattacctg 2280 cccgaggagc agttccccaa gggctttgcc ttcgactgtg atgacgtgaa cttcaccacg 2340 gacaacctct gctttgtggg 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ctcttacttt gtgatcctgg cagaaaatgg cttcttgccc 3240 ggcaacctgg tgggcatccg gctgaactgg gatgaccgca ccgtcaatga cctggaagac 3300 agttacgggc agcagtggac atacgagcag aggaaggtgg tggagttcac ctgccacacg 3360 gccttctttg tgagcatcgt tgtcgtccag tgggccgatc tgatcatctg caagacccgg 3420 aggaactcgg tcttccagca gggcatgaag aacaagatcc tgatcttcgg gctgtttgag 3480 gagacggccc tggctgcctt cctgtcctac tgccccggca tggacgtggc cctgcgcatg 3540 taccctctca agcccagctg gtggttctgt gccttcccct acagtttcct catcttcgtc 3600 tacgacgaaa tccgcaaact catcctgcgc aggaacccag ggggttgggt ggagaaggaa 3660 aacctactac acgcgtacgc ggccgctcga gcagaaactc atctcagaag aggatctggc 3720 agcaaatgat atcctggatt acaaggatga cgacgataaa ggattcgtga gcaagggcga 3780 ggaggataac atggccatca tcaaggagtt catgcgcttc aaggtgcaca tggagggctc 3840 cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac 3900 ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg tggccccctg cccttcgcct gggacatcct 3960 gtcccctcag ttcatgtacg gctccaaggc ctacgtgaag caccccgccg acatccccga 4020 ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga 4080 cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa 4140 ggtgaagctg cgcggcacca acttcccctc cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat 4200 gggctgggag gcctcctccg agcggatgta ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat 4260 caagcagagg ctgaagctga aggacggcgg ccactacgac gctgaggtca agaccaccta 4320 caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg cgcctacaac gtcaacatca agttggacat 4380 cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca 4440 ctccaccggc ggcatggacg agctgtacaa gtaataagat acattgatga gtttggacaa 4500 accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct 4560 ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttagga acccctagtg attggagttg 4620 gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggtcgaccaa aggtcgcccg 4680 acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagtcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 4740 <210> 20 <211> 4803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic vector <400> 20 tcctgcaggc agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gtcccgggcg 60 tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gctgcgcaga gagggagtgg 120 ccaactccat cactaggggt tcctagtgca agtgggtttt taggaccagg atgaggcggg 180 gtgggggtgc ctacctgacg accgaccccg gacccactgg acaagcaccc aacccccatt 240 ccccaaattg cgcatcccct aatcagagag ggggagggga aacaggatgc ggcgaggcgc 300 gtgcgcactg ccaagcttca gcaccgcgga cagtgccttc gcccccgcct ggcggcgcgc 360 gcccaccgcc gcctcagcac tgaaggcgcg ctgacgtcac tcgccggtcc cccgacaaac 420 tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg cgccgccgcc ggccccagcc ggaccgcacc 480 acgcgaggcg cgagataggg gggcacgggc gcgacccatc tgcgctgcgg cgccggcgac 540 tcagcgctgc ctcagtctgc ggtgggcaag cggaggagtc gtgtcgtgcc tgagagcgca 600 gtcgagaagg taccgaggag atctgccgcc atgggggaca agaaagatga caaggactca 660 cccaagaaga acaagggcaa ggagcgccgg gacctggatg acctcaagaa ggaggtggct 720 atgacagagc acaagatgtc agtggaagag gtctgccgga aatacaacac agactgtgtg 780 cagggtttga cccacagcaa agcccaggag atcctggccc gggatgggcc taacgcactc 840 acgccaccgc ctaccacccc agagtgggtc aagttttgcc ggcagctctt cgggggcttc 900 tccatcctgc tgtggatcgg ggctatcctc tgcttcctgg cctacggtat ccaggcgggc 960 accgaggacg acccctctgg tgacaacctg tacctgggca tcgtgctggc ggccgtggtg 1020 atcatcactg gctgcttctc ctactaccag gaggccaaga gctccaagat catggagtcc 1080 ttcaagaaca tggtgcccca gcaagccctg gtgatccggg aaggtgagaa gatgcaggtg 1140 aacgctgagg aggtggtggt cggggacctg gtggagatca agggtggaga ccgagtgcca 1200 gctgacctgc ggatcatctc agcccacggc tgcaaggtgg acaactcctc cctgactggc 1260 gaatccgagc cccagactcg ctctcccgac tgcacgcacg acaacccctt ggagactcgg 1320 aacatcacct tcttttccac caactgtgtg gaaggcacgg ctcggggcgt ggtggtggcc 1380 acgggcgacc gcactgtcat gggccgtatc gccaccctgg catcagggct ggaggtgggc 1440 aagacgccca tcgccatcga gattgagcac ttcatccagc tcatcaccgg cgtggctgtc 1500 ttcctgggtg tctccttctt catcctctcc ctcattctcg gatacacctg gcttgaggct 1560 gtcatcttcc tcatcggcat catcgtggcc aatgtcccag agggtctgct ggccactgtc 1620 actgtgtgtc tgacgctgac cgccaagcgc atggcccgga agaactgcct ggtgaagaac 1680 ctggaggctg tagaaaccct gggctccacg tccaccatct gctcagataa gacagggacc 1740 ctcactcaga accgcatgac agtcgcccac atgtggtttg acaaccagat ccacgaggct 1800 gacaccactg aggaccagtc agggacctca tttgacaaga gttcgcacac ctgggtggcc 1860 ctgtctcaca tcgctgggct ctgcaatcgc gctgtcttca agggtggtca ggacaacatc 1920 cctgtgctca agagggatgt ggctggggat gcgtctgagt ctgccctgct caagtgcatc 1980 gagctgtcct ctggctccgt gaagctgatg cgtgaacgca acaagaaagt ggctgagatt 2040 cccttcaatt ccaccaacaa ataccagctc tccatccatg agaccgagga ccccaacgac 2100 aaccgatacc tgctggtgat gaagggtgcc cccgagcgca tcctggaccg ctgctccacc 2160 atcctgctac agggcaagga gcagcctctg gacgaggaaa tgaaggaggc cttccagaat 2220 gcctaccttg agctcggtgg cctgggcgag cgcgtgcttg gtttctgcca ttattacctg 2280 cccgaggagc agttccccaa gggctttgcc ttcgactgtg atgacgtgaa cttcaccacg 2340 gacaacctct gctttgtggg cctcatgtcc atgatcgacc caccccgggc agccgtccct 2400 gacgcggtgg gcaagtgtcg cagcgcaggc atcaaggtca tcatggtcac cggcgatcac 2460 cccatcacgg ccaaggccat tgccaagggt gtgggcatca tctctgaggg caacgagact 2520 gtggaggaca tcgccgcccg gctcaacatt cccgtcagcc aggttaaccc ccgggatgcc 2580 aaggcctgcg tgatccacgg caccgacctc aaggacttca cctccgagca aatcgacgag 2640 atcctgcaga atcacaccga gatcgtcttc gcccgcacat ccccccagca gaagctcatc 2700 attgtggagg gctgtcagag acagggtgca attgtggctg tgaccgggga tggtgtgaac 2760 gactcccccg ctctgaagaa ggccgacatt ggggtggcca tgggcatcgc tggctctgac 2820 gtctccaagc aggcagctga catgatcctg ctggacgaca actttgcctc catcgtcaca 2880 ggggtggagg agggccgcct gatcttcgac aacctaaaga agtccattgc ctacaccctg 2940 accagcaata tcccggagat cacgcccttc ctgctgttca tcatggccaa catcccgctg 3000 cccctgggca ccatcaccat cctctgcatc gatctgggca ctgacatggt ccctgccatc 3060 tcactggcgt acgaggctgc cgaaagcgac atcatgaaga gacagcccag gaacccgcgg 3120 acggacaaat tggtcaatga gagactcatc agcatggcct acgggcagat tggaatgatc 3180 caggctctcg gtggcttctt ctcttacttt gtgatcctgg cagaaaatgg cttcttgccc 3240 ggcaacctgg tgggcatccg gctgaactgg gatgaccgca ccgtcaatga cctggaagac 3300 agttacgggc agcagtggac atacgagcag aggaaggtgg tggagttcac ctgccacacg 3360 gccttctttg tgagcatcgt tgtcgtccag tgggccgatc tgatcatctg caagacccgg 3420 aggaactcgg tcttccagca gggcatgaag aacaagatcc tgatcttcgg gctgtttgag 3480 gagacggccc tggctgcctt cctgtcctac tgccccggca tggacgtggc cctgcgcatg 3540 taccctctca agcccagctg gtggttctgt gccttcccct acagtttcct catcttcgtc 3600 tacgacgaaa tccgcaaact catcctgcgc aggaacccag ggggttgggt ggagaaggaa 3660 aacctactac acgcgtacgc ggccgctcga gcagaaactc atctcagaag aggatctggc 3720 agcaaatgat atcctggatt acaaggatga cgacgataaa ggattcgcca cgaacttctc 3780 tctgttaaag caagcaggag acgtggaaga aaaccccggt cccggattcg tgagcaaggg 3840 cgaggaggat aacatggcca tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc acatggaggg 3900 ctccgtgaac ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg 3960 cacccagacc gccaagctga aggtgaccaa gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat 4020 cctgtcccct cagttcatgt acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc 4080 cgactacttg aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga 4140 ggacggcggc gtggtgaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggcg agttcatcta 4200 caaggtgaag ctgcgcggca ccaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac 4260 catgggctgg gaggcctcct ccgagcggat gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga 4320 gatcaagcag aggctgaagc tgaaggacgg cggccactac gacgctgagg tcaagaccac 4380 ctacaaggcc aagaagcccg tgcagctgcc cggcgcctac aacgtcaaca tcaagttgga 4440 catcacctcc cacaacgagg actacaccat cgtggaacag tacgaacgcg ccgagggccg 4500 ccactccacc ggcggcatgg acgagctgta caagtaataa gatacattga tgagtttgga 4560 caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt 4620 gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta ggaaccccta gtgattggag 4680 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggtcgac caaaggtcgc 4740 ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagtcga gcgagcgcgc agctgcctgc 4800 agg 4803 <210> 21 <211> 3517 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic vector <400> 21 agtgcaagtg ggtttttagg accaggatga ggcggggtgg gggtgcctac ctgacgaccg 60 accccggacc cactggacaa gcacccaacc cccattcccc aaattgcgca tcccctaatc 120 agagaggggg aggggaaaca ggatgcggcg aggcgcgtgc gcactgccaa gcttcagcac 180 cgcggacagt gccttcgccc ccgcctggcg gcgcgcgccc accgccgcct cagcactgaa 240 ggcgcgctga cgtcactcgc cggtcccccg acaaactccc cttcccggcc accttggtcg 300 cgtccgcgcc gccgccggcc ccagccggac cgcaccacgc gaggcgcgag ataggggggc 360 acgggcgcga cccatctgcg ctgcggcgcc ggcgactcag cgctgcctca gtctgcggtg 420 ggcaagcgga ggagtcgtgt cgtgcctgag agcgcagtcg agaaggtacc gaggagatct 480 gccgccatgg gggacaagaa agatgacaag gactcaccca agaagaacaa gggcaaggag 540 cgccgggacc tggatgacct caagaaggag gtggctatga cagagcacaa gatgtcagtg 600 gaagaggtct gccggaaata caacacagac tgtgtgcagg gtttgaccca cagcaaagcc 660 caggagatcc tggcccggga tgggcctaac gcactcacgc caccgcctac caccccagag 720 tgggtcaagt tttgccggca gctcttcggg ggcttctcca tcctgctgtg gatcggggct 780 atcctctgct tcctggccta cggtatccag gcgggcaccg aggacgaccc ctctggtgac 840 aacctgtacc tgggcatcgt gctggcggcc gtggtgatca tcactggctg cttctcctac 900 taccaggagg ccaagagctc caagatcatg gagtccttca agaacatggt gccccagcaa 960 gccctggtga tccgggaagg tgagaagatg caggtgaacg ctgaggaggt ggtggtcggg 1020 gacctggtgg agatcaaggg tggagaccga gtgccagctg acctgcggat catctcagcc 1080 cacggctgca aggtggacaa ctcctccctg actggcgaat ccgagcccca gactcgctct 1140 cccgactgca cgcacgacaa ccccttggag actcggaaca tcaccttctt ttccaccaac 1200 tgtgtggaag gcacggctcg gggcgtggtg gtggccacgg gcgaccgcac tgtcatgggc 1260 cgtatcgcca ccctggcatc agggctggag gtgggcaaga cgcccatcgc catcgagatt 1320 gagcacttca tccagctcat caccggcgtg gctgtcttcc tgggtgtctc cttcttcatc 1380 ctctccctca ttctcggata cacctggctt gaggctgtca tcttcctcat cggcatcatc 1440 gtggccaatg tcccagaggg tctgctggcc actgtcactg tgtgtctgac gctgaccgcc 1500 aagcgcatgg cccggaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aggctgtaga aaccctgggc 1560 tccacgtcca ccatctgctc agataagaca gggaccctca ctcagaaccg catgacagtc 1620 gcccacatgt ggtttgacaa ccagatccac gaggctgaca ccactgagga ccagtcaggg 1680 acctcatttg acaagagttc gcacacctgg gtggccctgt ctcacatcgc tgggctctgc 1740 aatcgcgctg tcttcaaggg tggtcaggac aacatccctg tgctcaagag ggatgtggct 1800 ggggatgcgt ctgagtctgc cctgctcaag tgcatcgagc tgtcctctgg ctccgtgaag 1860 ctgatgcgtg aacgcaacaa gaaagtggct gagattccct tcaattccac caacaaatac 1920 cagctctcca tccatgagac cgaggacccc aacgacaacc gatacctgct ggtgatgaag 1980 ggtgcccccg agcgcatcct ggaccgctgc tccaccatcc tgctacaggg caaggagcag 2040 cctctggacg aggaaatgaa ggaggccttc cagaatgcct accttgagct cggtggcctg 2100 ggcgagcgcg tgcttggttt ctgccattat tacctgcccg aggagcagtt ccccaagggc 2160 tttgccttcg actgtgatga cgtgaacttc accacggaca acctctgctt tgtgggcctc 2220 atgtccatga tcgacccacc ccgggcagcc gtccctgacg cggtgggcaa gtgtcgcagc 2280 gcaggcatca aggtcatcat ggtcaccggc gatcacccca tcacggccaa ggccattgcc 2340 aagggtgtgg gcatcatctc tgagggcaac gagactgtgg aggacatcgc cgcccggctc 2400 aacattcccg tcagccaggt taacccccgg gatgccaagg cctgcgtgat ccacggcacc 2460 gacctcaagg acttcacctc cgagcaaatc gacgagatcc tgcagaatca caccgagatc 2520 gtcttcgccc gcacatcccc ccagcagaag ctcatcattg tggagggctg tcagagacag 2580 ggtgcaattg tggctgtgac cggggatggt gtgaacgact cccccgctct gaagaaggcc 2640 gacattgggg tggccatggg catcgctggc tctgacgtct ccaagcaggc agctgacatg 2700 atcctgctgg acgacaactt tgcctccatc gtcacagggg tggaggaggg ccgcctgatc 2760 ttcgacaacc taaagaagtc cattgcctac accctgacca gcaatatccc ggagatcacg 2820 cccttcctgc tgttcatcat ggccaacatc ccgctgcccc tgggcaccat caccatcctc 2880 tgcatcgatc tgggcactga catggtccct gccatctcac tggcgtacga ggctgccgaa 2940 agcgacatca tgaagagaca gcccaggaac ccgcggacgg acaaattggt caatgagaga 3000 ctcatcagca tggcctacgg gcagattgga atgatccagg ctctcggtgg cttcttctct 3060 tactttgtga tcctggcaga aaatggcttc ttgcccggca acctggtggg catccggctg 3120 aactgggatg accgcaccgt caatgacctg gaagacagtt acgggcagca gtggacatac 3180 gagcagagga aggtggtgga gttcacctgc cacacggcct tctttgtgag catcgttgtc 3240 gtccagtggg ccgatctgat catctgcaag acccggagga actcggtctt ccagcagggc 3300 atgaagaaca agatcctgat cttcgggctg tttgaggaga cggccctggc tgccttcctg 3360 tcctactgcc ccggcatgga cgtggccctg cgcatgtacc ctctcaagcc cagctggtgg 3420 ttctgtgcct tcccctacag tttcctcatc ttcgtctacg acgaaatccg caaactcatc 3480 ctgcgcagga acccaggggg ttgggtggag aaggaaa 3517 <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p2A <400> 22 gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggagacgtgg aagaaaaccc cggtccc 57

Claims (61)

  1. ATPase를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서, ATPase는 ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP2C1, ATP6A1, ATP6V1B1, ATP6V0A4, ATP7A, ATP7B, 또는 ATP11C로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 발현 카세트.
  3. 제1항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01로 기재된 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체를 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  4. 제2항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01로 기재된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  5. 제1항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 02로 기재된 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체를 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  6. 제4항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 02로 기재된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  7. 제1항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 07로 기재된 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체를 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  8. 제4항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 07로 기재된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트는 CpG 메틸화 부위를 감소시키기 위해 코돈-최적화된, 포유류 발현을 위한 ATP1A3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ATP1A3을 코딩하는 핵산 서열은 프로모터 및 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된, 핵산 발현 카세트.
  11. 제9항에 있어서, 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터를 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  12. 제10항에 있어서, 뉴런-특이적 프로모터는 시냅신 1, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II, 튜불린 알파 1, 뉴런-특이적 에놀라제, 및 혈소판-유래 성장 인자 베타 사슬 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 발현 카세트.
  13. 제11항에 있어서, 프로모터는 인간 시냅신 프로모터인, 핵산 발현 카세트.
  14. 제12항에 있어서, 인간 시냅신 프로모터는 시냅손 1 프로모터의 근위 영역(-422 내지 -22)을 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  15. 제13항에 있어서, 인간 시냅신 프로모터는 SEQ ID NO: 05로 기재된 핵산 서열을 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  16. 제12항에 있어서, 인간 시냅신 프로모터는 SEQ ID NO: 04 또는 SEQ ID NO: 09로 기재된 핵산 서열을 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  17. 제9항에 있어서, 프로모터는 구성적으로 활성 프로모터의 군으로부터 선택되는, 핵산 발현 카세트.
  18. 제16항에 있어서, 구성적으로 활성 프로모터는 인간 β-액틴, 인간 신장 인자-1α, 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서와 조합된 닭 β-액틴, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40, 및 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 발현 카세트.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 발현 카세트는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA), 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 신호(SV40pA), 및 합성 폴리아데닐화 신호로 이루어진 군으로부터 선택되는 전사 종결 신호를 추가로 포함하는, 핵산 발현 카세트.
  20. ATase를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  21. 제19항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인, 벡터.
  22. 제20항에 있어서, 벡터는 재조합 바이러스 벡터인, 벡터.
  23. 제20항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 헤르페스 단순 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 알파바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라브도바이러스 벡터, 홍역 바이러스 벡터, 뉴캐슬병 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 또는 피코나바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  24. 제21항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 및 AAV13로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형인, 벡터.
  25. 제23항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 AAV1, AAV8, 또는 AAV9로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형인, 벡터.
  26. 제23항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 AAV9 벡터를 포함하는, 벡터.
  27. 제23항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 AAV8 벡터를 포함하는, 벡터.
  28. 제23항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 AAV1 벡터를 포함하는, 벡터.
  29. 제19항에 있어서, 벡터는 AAV9-hSyn-ATP1A3-p2A-mCherry(pBK828) 벡터를 포함하는, 벡터.
  30. 제28항에 있어서, 벡터는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 21로 기재된 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  31. 제28항에 있어서, 벡터는 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, 또는 SEQ ID NO: 21로 기재된 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 서열 핵산을 포함하는, 벡터.
  32. 제20항에 있어서, 비-바이러스 벡터는 중합체 기반 벡터, 펩티드 기반 벡터, 지질 나노입자, 고체 지질 나노입자, 또는 양이온 지질 기반 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  33. 제19항에 있어서, 핵산 서열은 핵산 발현 카세트 내에 포함되어 있는, 벡터.
  34. 제19항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1의 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체를 포함하는, 벡터.
  35. 제19항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 01과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 벡터.
  36. 제19항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 07의 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체를 포함하는, 벡터.
  37. 제19항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 07과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 벡터.
  38. 제19항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 06의 서열, 또는 이의 단편, 이소형, 또는 상동체를 포함하는, 벡터.
  39. 제19항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 06과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 벡터.
  40. 제19항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 다음의 요소: (a) 역위 말단 반복 서열(ITR); (b) 프로모터; (c) 전사 종결자; 및 (d) 플랭킹 역위 말단 반복 서열(ITR) 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터를 포함하는, 벡터.
  42. 제40항에 있어서, 뉴런-특이적 프로모터는 시냅신 1, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II, 튜불린 알파 1, 뉴런-특이적 에놀라제, 및 혈소판-유래 성장 인자 베타 사슬 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  43. 제40항에 있어서, 프로모터는 인간 시냅신 프로모터로부터 유도되는, 벡터.
  44. 제42항에 있어서, 인간 시냅신 프로모터는 시냅손 1 프로모터의 근위 영역(-422 내지 -22)을 포함하는, 벡터.
  45. 제42항에 있어서, 인간 시냅신 프로모터는 SEQ ID NO: 04로 기재된 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  46. 제42항에 있어서, 인간 시냅신 프로모터는 SEQ ID NO: 05 또는 SEQ ID NO: 09로 기재된 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  47. 제40항에 있어서, 프로모터는 구성적으로 활성 프로모터인, 벡터.
  48. 제46항에 있어서, 구성적으로 활성 프로모터는 인간 β-액틴, 인간 신장 인자-1α, 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서와 조합된 닭 β-액틴, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40, 및 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  49. 제39항에 있어서, 전사 종결자는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGHpA), 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 신호(SV40pA), 및 합성 폴리아데닐화 신호로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  50. 제20항 내지 제48항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 조성물.
  51. 제20항 내지 제48항 중 어느 한 항의 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  52. 대상체에서 ATPase-매개 질환의 예방 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 제20항 내지 제48항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제50항의 조성물 또는 제51항의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하여 대상체에서 ATPase-매개 질환이 예방되는, 방법.
  53. 대상체에서 ATPase-매개 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은 치료 유효량의 제20항 내지 제48항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제50항의 조성물 또는 제51항의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하여 대상체에서 ATPase-매개 질환이 치료되는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 벡터 또는 이의 조성물은 근육 내 주입, 전신적으로, 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구적으로, 대뇌내부심실로(intracerebraoventricularly), 대조내(intra-cisterna magna), 해마내(intrahippocampal), 및 척추강내(intrathecally)로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여되는, 방법.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 벡터 또는 이의 조성물은 대뇌내부심실내(intracerebroventricular) 및 대조내 주사에 의해 투여되는, 방법.
  56. 제52항 또는 제53항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  57. 제52항 또는 제53항에 있어서, 대상체는 E815K 돌연변이, D801N 돌연변이, I180N 돌연변이, R756C 돌연변이, 또는 V589F 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 ATP1A3 단백질 돌연변이를 갖는, 방법.
  58. 제52항 또는 제53항에 있어서, ATPase-매개 질환은 급속-발병 근긴장 이상-파킨슨병(RDP: rapid-onset dystonia-parkinsonism), 소아성 교대성 편마비(AHC: alternating hemiplegia of childhood), 뇌전증성 뇌병증(EE: epileptic encephalopathy), 소뇌성 운동실조증(cerebellar ataxia), 무반사(areflexia), 요족(pes cavus), 시신경 위축(optic atrophy) 및 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)(CAPOS) 증후군, 열 유발 발작성 무력증 및 뇌병증(FIPWE: fever induced paroxysmal weakness and encephalopathy), 소뇌성 운동실조증의 재발성 에피소드(RECA: recurrent episodes of　cerebellar ataxia), 조기-발병 정신분열증(early-onset　schizophrenia) 편측 마비가 없는 안면 뇌병증 MRI 이상의 근긴장 이상(D-DEMO: Dystonia Dysmorphism of the face Encephalopathy MRI abnormalities without hemiplegia) 증후군 및 소아성 급속 발병 운동실조(CROA)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  59. 제52항 또는 제53항에 있어서, ATPase-매개 질환은 AHC인, 방법.
  60. AHC의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 제20항 내지 제48항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제50항의 조성물 또는 제51항의 약학 조성물의 용도.
  61. 대상체에서 ATPase-매개 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 키트로서, 상기 키트는 제50항 또는 제51항의 조성물 및 사용 지침을 포함하는, 키트.
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