KR20220029910A - 프로제린-라민 a/c 결합 억제를 통해 노화세포의 핵 변형을 완화시키는 플라보노이드 모린 화합물의 용도 - Google Patents

프로제린-라민 a/c 결합 억제를 통해 노화세포의 핵 변형을 완화시키는 플라보노이드 모린 화합물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로제린-라민 A/C 결합 억제를 통해 노화세포의 핵 변형을 완화시키는 플라보노이드 모린 화합물의 용도에 대한 것으로, 천연물질인 플라보노이드 모린이 프로제린과 정상 라민과의 직접 결합을 방해함을 확인하였다. 그 결과 모린은 비정상적 핵모양을 정상적인 핵모양으로 되돌려서 결국 늙은 세포가 젊은 세포의 특징을 지니게 하였다. 이러한 모린의 작용은 항산화작용에 기인한 것이 아니라, 프로제린과의 결합에 의한 것이므로 신규 기전을 가지고 있다. 즉, 본 발명은 인간의 노화 요인 중에서 항산화 작용이 아닌, ‘핵기능 이상’에 초점을 맞추었다. 이를 위해서 프로제린과 라민과의 결합을 억제하는 물질로, 천연물인 모린을 찾았으며, 후속 연구를 통해서 모린의 항노화 기전을 밝혀냈으므로, 소아조로증 (Hunchinson-Gilford progeria syndrome; HGPS) 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Description

프로제린-라민 A/C 결합 억제를 통해 노화세포의 핵 변형을 완화시키는 플라보노이드 모린 화합물의 용도{Use of flavonoid morin alleviating nuclear deformation of the aged cells by interrupting the progerin-lamin A/C binding}
본 발명은 프로제린-라민 A/C 결합 억제를 통해 노화세포의 핵 변형을 완화시키는 플라보노이드 모린 화합물의 용도에 관한 것이다.
핵 라민(nuclear lamin)은 세포핵의 형태를 유지하는 데 중요한 단백질이지만, 이의 변형형인 프로제린(progerin)은 유전적 소아조로증 (Hunchinson-Gilford progeria syndrome; HGPS)을 일으키는 원인 유전자이다. 프로제린은 라민과 비정상적인 결합으로 라민의 역할을 방해하여 결국 정상적인 세포핵 형성을 방해한다. 비정상적인 핵모양은 소아조로증의 특징이며, 이로 인하여 정상인보다 훨씬 빠르게 노화된다.
유전적 소아조로증은 희귀질환이며, 우리나라엔 1명의 환자만 존재한다. 하지만, 정상인도 비록 적은 양이지만 프로제린이 생성되며, 노인이 되면 소아조로증과 마찬가지로 세포핵의 변형이 일어난다. 기존에 동일 기전으로 프로제린과 라민 사이의 결합을 억제하는 JH4라는 합성 화합물은 소아조로증 환자 유래 세포뿐만 아니라, 노인의 세포에 대해서도 같은 효과를 보였다. 이는 소아조로증과 일반 노화가 같은 기작으로 작동한다는 것을 알려주고 있다. 따라서 소아조로증은 물론 정상 노화까지 억제하기 위해서는 프로제린을 효과적으로 억제하는 것이 중요하다.
일반적으로 활성산소에 의한 산화적 스트레스는 결국 세포를 늙게 하고 결국 개체의 노화를 촉진한다. 이런 활성산소의 작용은 생쥐와 같이 대사율이 빠른 동물일 경우 매우 중요한 요인이다. 하지만, 인간의 노화과정을 이해하려면 이러한 활성산소에 의한 요인 뿐만 아니라, 다른 요인들도 동시에 고려해주어야 한다. 인간만의 유전병인 소아조로증은 라민이라는 유전자 내부에 변이가 생겨서 비정상적 라민 (일명 프로제린)이 생기며, 이 프로제린에 의해서 세포핵의 구조적 변형을 일으킨다. 이 세포핵의 구조적 변형으로 말미암아 세포핵의 기능이 약화되어 세포 전체 기능이 저하된다. 세포핵의 구조적 변형은 프로제린은 라민과 비정상적 결합이 그 원인이라는 보고가 있지만, 아직 명확한 분자기전을 잘 알려져 있지 않다.
한국등록특허 제10-1407044호 (2014.06.05. 등록)
이에, 본 발명은 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조로증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조로증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조로증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 프로제린-라민 A/C 결합 억제를 통해 노화세포의 핵 변형을 완화시키는 플라보노이드 모린 화합물의 용도에 대한 것으로, 천연물질인 플라보노이드 모린이 프로제린과 정상 라민과의 직접 결합을 방해함을 확인하였다. 그 결과 모린은 비정상적 핵모양을 정상적인 핵모양으로 되돌려서 결국 늙은 세포가 젊은 세포의 특징을 지니게 하였다. 이러한 모린의 작용은 항산화작용에 기인한 것이 아니라, 프로제린과의 결합에 의한 것이므로 신규 기전을 가지고 있다. 즉, 본 발명은 인간의 노화 요인 중에서 항산화 작용이 아닌, ‘핵기능 이상’에 초점을 맞추었다. 이를 위해서 프로제린과 라민과의 결합을 억제하는 물질로, 천연물인 모린을 찾았으며, 후속 연구를 통해서 모린의 항노화 기전을 밝혀냈으므로, 소아조로증 (Hunchinson-Gilford progeria syndrome; HGPS) 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
도 1은 프로제린-라민 A 상호작용의 억제제 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 2는 모린이 Ig-유사 도메인과 결합하여, 라민 A 및 프로제린 사이의 상호작용을 억제하는 결과를 나타낸다.
도 3은 프로제린을 발현하는 HEK293 세포에서 모린의 효과를 나타낸다.
도 4는 HGPS 세포에서 모린의 효과를 나타낸다.
본 발명은 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조로증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 프로제린(progerin) 및 라민 A(lamin A) 사이의 결합을 억제할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 조성물은 라민 A의 406 내지 533 잔기 영역인 lg-유사 도메인에 결합하여, 프로제린 및 라민 A 사이의 결합을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 조성물은 노화에 의한 핵 변형을 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조로증은 소아조로증 (Hunchinson-Gilford progeria syndrome; HGPS)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 캠퍼술폰산염, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 칼슘염 및 마그네슘염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 모린(morin) 화합물은 화학식 1로 표시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조로증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 노화에 의한 핵 변형을 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조로증은 소아조로증 (Hunchinson-Gilford progeria syndrome; HGPS)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에서 상기 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 조성물 전체에 대해서 0.001 ~ 30.0 중량% 함유하며, 상기 함량을 벗어나면 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조로증 예방, 개선 또는 치료 등의 약리효과가 나타나지 않거나 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 플라스미드 구축 및 정제
단백질-단백질 상호작용에 대해 조사하기 위해서, 재조합 단백질을 제작하였다. 재조합 라민 A 중간 영역 (잔기 301-564)이 사용되었다. GST-융합된 재조합 프로제린 C-말단 영역 (라민 A 넘버링에서 566-606 및 657-664; GST-프로제린)은 종결 코돈의 상류 100 aa의 PCR 클로닝을 통해 제작하였다. 헥사히스티딘 태그를 가진 인간 라민 A 406-553을 코딩하는, 새롭게 디자인된 플라스미드를 E.coil BL21 (DE3) 균주로 형질전환시켰다. GFP-프로제린 및 GFP-융합된 라민 A 발현 벡터는 T. Misteli (National Cancer Institute [NCI], Bethesda, Maryland, USA)로부터 제공받았다. Myc-ARF 벡터 및 OST-LAMINA Δ50 벡터는 Addgene으로부터 구입하였다. jetPEI (Polyplus Transfection)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 형질감염을 수행하였다.
2. 재조합 단백질의 정제
형질전환된 세포는 100 μg/ml 앰피실린 및 34 μg/ml 클로람페니콜이 포함된 2 L의 Terrific Broth 배지로 37℃에서, OD600이 1.0으로 측정될 때까지 배양한 후, 0.1 mM IPTG를 사용하여 30℃에서 6시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 세포들을 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl 및 2 mM 2-머캡토에탄올이 포함된 용해 완충액에 재현탁시켰다. 연속형 French press (Constant Systems Limited, United Kingdom)를 사용하여 23 kpsi 압력으로, 세포를 파괴시켰다. 4℃에서 19,000 g로 30분 동안 원심분리 후, 세포 찌거기를 제거하였다. 상등액을 Cobalt-talon affinity agarose resin (GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 헥사히스티딘이 태깅된 표적 단백질은 250 mM 이미다졸 및 0.5 mM EDTA가 첨가된 용해 완충액에 용출되었다. GSH-agarose resin을 사용하여, GST-융합된 재조합 프로제린을 정제하였다. 이후, 표적 단백질은 HiTrap Q column (GE Healthcare, USA) 상에 로딩하였다. NaCl 농도가 증가되는 선형 구배를 HiTrap Q column에 적용하였다. 정제된 단백질을 농축시켰고, 생화학적 분석에 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
3. 변형된 ELISA 분석
천연화합물 라이브러리 (L1400, lleckchem, Houston, TX, USA)로부터 프로제린-라민 A 결합 억제제를 분리하기 위해서, 이전 플랫폼을 변형한 ELISA를 확립하였다. 2 mM 트리스(비피리딘)루테늄(II)클로라이드[Tris(bipyridine)ruthenium (II)chloride] 및 10 mM 소듐 퍼설페이트(Sodium persulfate)를 사용하여, His-LMNA-M은 96-웰 플레이트 상에 고정시켰다. 차단 및 세척 후, 500 μM의 천연화합물을 플레이트 상에 적용하였다. 96-웰 플레이트를 TBST로 씻어냈고, 프로제린으로 반응시켰다. 이후, 본 발명자들은 anti-Gst-Ab (1: 1000, 2 시간) 및 anti-mouse-IgG-HRP (1: 50000, 1 시간)을 차례로 적용하였다. 2번 씻어낸 후, 플레이트를 TMB 용액 (CL07; Calbiochem) 및 중단 용액 (1N H2SO4)으로 반응시켰고, Decan reader를 사용하여, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 억제 분석
모린은 1 μM 내지 10 mM의 농도 범위로 10% DMSO에 희석하였다. 10 μM His-LMNA-M을 코팅하였고, 96-웰 플레이트에 고정시켰다. GST-프로제린 C-말단 영역 및 차등적으로 희석된 모린과 1시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 anti-GST-ab (1:1000, 2 시간) 및 anti-mouse-IgG-HRP (1: 50000, 1 시간)로 반응시켰다. 씻어낸 후, 플레이트를 TMB 용액 (CL07; Calbiochem) 및 중단 용액 (1N H2SO4)으로 차례로 반응시켰다. 플레이트의 흡광도는 450 nm에서 측정하였다.
5. 등온 적정 열량측정분석
the Korea Basic Science Institute (Ochang, Korea)에서 Auto-iTC200 Microcalorimeter (GE healthcare)를 사용하여, 등온 적정 열량측정분석(Isothermal titration calorimetry; ITC) 실험을 수행하였다. His-tagged Ig-like domain (잔기 406-553)을 샘플 세포 (370 μL; 27 μM)에서 제조하였고, GST-융합 프로제린 (180 μL; 178 μM)을 주입 실린지에 로딩하였다. Ig-like domain과 모린 또는 유사체들의 결합 친화도를 분석하기 위해, 본 발명자들은 이들 각각에 대하여 80 μM 및 500 μM의 농도로 샘플을 준비하였다. 모든 샘플들은 PBS로 밤새도록 투석하였다. 150초 간격으로 19번 주입(2 μL)에 대한 적정 측정을 25℃에서 수행하였고, 실린지는 750 rpm에서 혼합시켰다. 데이터는 MicroCal OriginTM software를 이용하여 분석하였다.
6. 세포 배양 및 시약
HGPS 환자 (AG03198, 10살 여성, 피부, 다리; AG03199, 10살 여성, 피부, 엉덩이) 유래 인간 섬유아세포는 Coriell Cell Repositories (Camden, NJ, USA)로부터 얻었고, 15% 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS) 및 2mM 글루타민이 첨가된, 항생제 무첨가 Eagle's minimal essential medium (EMEM)에서 유지시켰다. American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 얻은 HEK293 세포주는 10% FBS 및 1% 페닐실린-스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)에서 37℃로, 5% CO2 조건하에서 유지시켰다.
7. 항체
웨스턴 블랏팅 및 면역형광염색을 위해 다음의 항체가 사용되었다. GFP (1:1000, sc-9996, Santa Cruz Biotechnology), GST (1:5000, sc-138, Santa Cruz Biotechnology), actin (1:5000, sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), lamin A/C (1:5000, sc-376248, Santa Cruz Biotechnology), progerin (1:300, ab66587, Abcam) 및 H3K9me3 (1:2000, ab8898, Abcam).
8. 면역형광염색
세포를 커버 글라스에 상에 놓고, GFP-라민 A 및 GFP-프로제린 벡터로 형질감염시켰다. 100% 메탄올로 -20℃에서 1시간 동안 고정시킨 후, 세포를 차단 완충액 (PBS + anti-human-Ab; 1: 400)과 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 2번 씻어낸 후, 세포를 차단 완충액 (1: 200)에 녹인 anti-lamin A/C, 프로제린 또는 H3K9Me3으로 밤새도록 반응시켰고, 이후 차단 완충액 (1: 400)에 녹인 anti-goat Ab-FITC 또는 anti-rabbit Ab-rhodamine으로 7시간 동안 반응시켰으며, 마운팅하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다. 면역형광 신호는 형광현미경 (Zeiss and Logos)으로 검출하였다. 노화 특이적 산성-β-갈락토시다아제 활성 염색을 위해, 세포를 PBS (pH 7.2)로 한 번 씻어냈고, 0.5% 글루타르알데히드 함유 PBS로 고정시켰다. PBS로 씻어낸 후, 세포를 X-gal 용액 (9860; Cell Signaling Technology)에서 37℃로 밤새도록 염색하였다.
9. 핵 변형 계수
핵 변형 세포 계수를 위해, 면역형광 염색을 라민 A/C 항체로 수행하였다. 염색 후, 임의로 선택된 필드에서 비정상적인 핵막을 계수하였고, 백분율 또는 계수된 전체 세포의 실제 수로 표시하였다. 핵막의 비정상성은 다음에 기반하여 결정하였다: (1) 라민 A/C 라인이 돌출되거나 함몰됨, (2) 농포화 및 (3) 불규칙한 윤곽. 핵 변형을 가진 세포의 계수는 화합물 처리군을 알지 못하는 3명의 독립적인 관측자에 의해 수행되었다.
< 실시예 1> 천연화합물 라이브러리에서 프로제린 - 라민 A 결합 억제제 스크리닝
이전에, 고정화된 라민 중간 영역 단편을 커버하는 잔기 301-565 (LMNA-M) 및 잘려진 C-말단 50 아미노산 잔기 (프로제린, 라민 A 넘버링에서 잔기 566-606, 657-664)로 ELISA 기반 스크리닝을 통해, 합성화합물 JH4가 스크리닝되었다(J Clin Invest 126, 3879-3893, 2016). 본 발명에서는 500 μM 농도로 143개의 물질로 구성된, 상업적으로 구할 수 있는 천연화합물 라이브러리로부터 유사한 ELISA 분석을 수행하였다. 폴리스티렌 ELISA 플레이트에 라민 단백질을 강하게 고정시키기 위해서, 본 발명자들은 소듐 퍼설페이트 존재하에서 450 nm 가시광선을 통해 루테늄(VIII)-옥사이드로 빠르게 전환되는 트리스(비피리딘)루테늄(II)클로라이드[Tris(bipyridine)ruthenium(II)chloride]를 사용하여, 광-촉매 가교 반응을 적용하였다(도 1A). 스크리닝 결과, 3-인돌부티르산(3-indolebutyric acid), 고시폴(gossypol), 피세틴(fisetin) 및 모린(morin) 화합물이 후보 억제제로 확인되었다(도 1B 및 도 1C). 물론, 모린은 가장 강력한 억제 효과를 나타냈고, 본 발명자들은 플라보노이드 모린의 활성을 추가적으로 조사하기로 결정하였다.
본 스크리닝에서 시험된, 모린, 퀘르세틴(quercetin), 미리세틴(myricetin), 캠퍼롤(kaempferol) 및 피세틴(fisetin)은 플라보놀(flavonol)로서 매우 유사한 분자 구조를 갖는다. 비록 모린이 가장 약한 항산화 활성을 보이지만, 모린은 프로제린-라민 A 결합에 대해 가장 강력한 억제 활성을 나타냈다(도 1). 즉, 상기 결과는 모린이 항산화 활성을 갖는 것이 아니라, 단백질-단백질 상호작용의 직접적인 억제제로서 작용한다는 것을 뒷받침한다.
< 실시예 2> 라민 A의 Ig-유사 도메인 및 프로제린 간의 상호작용을 억제하는 모린 화합물
고정화된 LMNA-M 및 GST-융합된 재조합 프로제린을 이용한 ELISA 분석을 통해, 본 발명자들은 모린이 200 μM 농도에서 두 단백질의 상호작용을 50% 억제한다는 것을 측정할 수 있었다(도 2A). ITC 분석을 수행하여, 프로제린 또는 모린과 LMNA-M의 정량적 결합 친화도를 측정하였다. 본 발명자들은 정제 과정에서 LMNA-M이 3개의 특정 단편으로 분리되는 것을 관측하였으므로, 단백질 N-말단 서열분석을 통해 이들 각각의 밴드를 분석하였다. 본 발명자들은 분리된 짧은 단편 중 하나가 Ser406 잔기로 개시된다는 것을 확인하였다. 상기 단편의 분자량을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 본 발명에서 Ig-유사 도메인으로 언급한 406-553 라민 A 단편을 재구성하였다. 본 발명자들은 Ig-유사 도메인이 LMNA-M 단편에 비해, 프로제린에 대한 친화도가 유사하거나 또는 더 높은 것을 확인하였다. ITC 분석 결과, 라민 A 및 프로제린 결합에 비해 라민 A 및 모린 사이의 결합 친화도는 약 2배 정도 강한 것으로 나타났다(도 2B). 상기 결과는 프로제린이 라민 A의 Ig-유사 도메인과 결합하고, 모린은 Ig-유사 도메인과 결합하여 상기 상호작용을 억제하는 것으로 나타났다.
< 실시예 3> 프로제린 -발현 세포의 핵 변형을 개선시키는 플라보노이드 모린 화합물
라민 A 및 프로제린의 상호작용에 의해 야기되는 세포의 핵 변형을 방지하는데 있어, 모린의 효과를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 모린 처리 후, 정상적인 전장 길이 라민 A와 전장 길이 프로제린 유전자를 발현하는 HEK293 세포의 핵 형태를 비교하였다. 상기 실험에서, 본 발명자들은 GFP 융합 단백질을 발현하는 라민 A 또는 프로제린 구조체를 사용하여, 세포 외피 형태를 가시화하였다. 정상적인 라민 A-발현 세포와 달리, 프로제린-발현 세포는 심각한 핵 변형을 나타냈다(도 3A). 20 μM의 모린은 프로제린-발현 세포의 핵 변형을 급격하게 감소시켰고, 10 μM에서는 적당한 효과를 나타냈다(도 3A). 하지만, 모린은 라민 A를 발현하는 세포에서는 어떠한 효과도 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 3B).
세포 용해물에서 모린의 억제 역할을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 HEK293 세포에서 발현된 GST-융합된 프로제린 C-말단 영역과 GFP-융합된 라민 A로 GST-풀다운 분석을 수행하였다. 모린의 존재 유무에 따라, 세포 용해물을 수지-결합된 GST-융합 프로제린과 함께 반응시켰다. 모린은 프로제린 및 라민 A 사이의 결합을 용량 의존적 방식으로 감소시켰다. 정상 노화 세포는 소량이긴 하지만 프로제린을 발현하므로, 본 발명의 결과는 효과적인 농도의 모린이 체내에서 유지된다면 모린이 정상 노화 표현형을 개선할 수 있다는 것을 뒷받침한다.
< 실시예 4> HGPS 세포의 핵 변형을 개선시키는 모린 화합물
다음으로, 본 발명자들은 HGPS 세포의 핵 변형에 있어 모린의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 라민 A 항체와 면역형광분석을 통해 HGPS 세포의 변형된 핵 외피를 가시화하였다. HGPS 세포에 10 μM 모린을 3일 동안 처리하면, 핵 변형이 50% 까지 감소하였다. 또한, 20 μM 모린 처리를 통해, 변형된 핵의 수가 20% 수준으로 감소하였는데, 이는 대조군으로 사용한 합성화합물 JH4를 5 μM 처리한 것과 비슷한 수준이다(도 4A). 모린의 처리에도 불구하고, 세포 내에서 라민 A 또는 프로제린의 전사 수준은 영향을 받지 않았다(도 4B). 상기 결과는 HGPS 증상을 완화시키기 위한 기능성 식품의 성분으로 모린이 유망한 후보라는 것을 뒷받침한다.
정상 노화 과정에서 프로제린이 생성되므로, 정상 노화 세포에서 핵 변형이 관측되었다. 노화의 중요한 특징이 비가역적인 세포 증식 억제라는 점에서, 본 발명자들은 세포 증식에 있어서 모린의 효과를 확인하였다. HGPS 세포에 20 μM 모린을 5일 동안 적용하면, 핵 변형은 개선되었으나, 노화 마커인 H3K9me3 검출에 있어서는 유의성이 없었다. 본 발명자들은 더 높은 농도(30 μM)의 모린으로 7일 동안 HGPS 세포를 처리하면, H3K9me3의 발현이 약간 증가하는 것을 확인하였다. 종합하면, 모린은 합성화합물 JH4 수준으로, HGP 세포의 핵 변형을 감소시키는 효과를 갖지만, 세포의 노화 마커를 감소시키는 데는 불충분한 효과를 갖는다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 모린(morin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조로증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 프로제린(progerin) 및 라민 A(lamin A) 사이의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 조로증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 라민 A의 406 내지 533 잔기 영역인 lg-유사 도메인에 결합하여, 프로제린 및 라민 A 사이의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 조로증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 노화에 의한 핵 변형을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조로증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조로증은 소아조로증 (Hunchinson-Gilford progeria syndrome; HGPS)인 것을 특징으로 하는 조로증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 모린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조로증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 노화에 의한 핵 변형을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조로증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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CN106581374A (zh) * 2017-01-29 2017-04-26 毛华养 一种治疗早衰症的药物

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안진숙, 서울대학교 박사학위논문 (2020.2.) 1부.* *

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