KR20220020905A - 항-talen 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220020905A KR1020227000976A KR20227000976A KR20220020905A KR 20220020905 A KR20220020905 A KR 20220020905A KR 1020227000976 A KR1020227000976 A KR 1020227000976A KR 20227000976 A KR20227000976 A KR 20227000976A KR 20220020905 A KR20220020905 A KR 20220020905A
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토마스 찰스 페르텔
바브라 존슨 사수
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알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 무엇보다도, 샘플에서 TALEN 및/또는 FokI 뉴클레아제를 검출하기 위한 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-TALEN 항체 및 이의 용도
상호 참조
본 출원은 2019년 6월 13일에 출원된 미국 가출원 제62/861,214호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 2020년 6월 12일에 생성된 전술한 ASCII 사본의 명칭은 AT-021_02_SL_ST25.txt이며, 크기는 26,590 바이트이다.
기술분야
본 개시는 유전자 편집 단백질(예를 들어, Fok-1 또는 Fok1로도 지칭되는 촉매 도메인 FokI를 포함하는 TALEN 단백질) 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하되 이에 한정되지 않는 항원 결합 분자, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN®), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 RNA-유도 FokI 뉴클레아제(RFN)와 같은 게놈 편집 도구는 유전자의 정확한 교정, 삽입 또는 결실을 가능하게 하는 강력한 도구이다. TALEN, ZFN, 및 RFN은 게놈 내의 표적화된 부위에 결합하여 이를 절단할 수 있다. 생성된 절단된 DNA는, 비-상동성 말단 결합(NHEJ)의 내인성 세포 DNA 복구 메커니즘을 통해, 또는 복구 템플릿이 제공될 경우 상동성-지정 복구(HDR)를 통해 복구된다. TALEN은 DNA 절단 도메인(예를 들어, FokI)에 융합된 TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 사용한다. ZFN은 조작된 Cys2His2 아연-핑거에 연결된 FokI, DNA-결합 폴리펩티드와 같은 제한 엔도뉴클레아제 절단 또는 촉매 도메인으로 구성된다. RFN은 Cas9의 촉매 비활성 형태에 융합된 FokI 뉴클레아제로 구성된다. 포유류(예를 들어, 인간, 개, 소, 비인간 영장류 등)에서의 효율적인 게놈 편집에 대해, TALEN, ZFN 및 RFN이 높은 수준으로 발현될 것으로 예상된다. 지속적인 뉴클레아제 활성 및 표적 외 효과뿐만 아니라 잠재적 면역원성의 위험으로 인해, 다양한 유전자 편집 요법의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 뉴클레아제 단백질에 결합할 수 있는 게놈 편집 도구(예를 들어, 항-TALEN 및/또는 항-FokI 항체)를 인식하는 항체가 당업계에서 필요하다.
본 개시는 무엇보다도, 샘플에서 FokI 촉매 도메인 및 전장 TALEN 단백질의 검출을 위한 항체를 제공한다. 다음의 실시예를 포함하여 본원에서 기술된 바와 같이, 본 개시는 TALEN 및 FokI 단백질에 특이적으로 결합하는 항-TALEN 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 항-TALEN 항체는 유전자 편집 요법 및 프로세스를 평가하는 데 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 서열번호 3과 적어도 85% 동일한 가변 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 7과 적어도 85% 동일한 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-TALEN 항체를 제공한다. 일 구현예에서, 항-TALEN 항체는 인간화된다. 다양한 구현예에서, 항체는 다음의 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다: scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, dAb, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, IgE 항체, IgD 항체, IgM 항체, IgG1 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG1 항체, IgG2 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG2 항체, IgG3 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG3 항체, IgG4 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG4 항체, 적어도 하나의 비-자연 발생 아미노산을 포함하는 항체, 및 이들의 임의의 조합.
특정 구현예에서, 항체는 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄(HC)를 포함하고, 추가의 구현예에서, 항-TALEN 항체는 서열번호 12 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호 15 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 21을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-TALEN 항체는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3을 포함하며, 각각의 CDR은 표 1c에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 본원에서 제공된 항원 결합 분자의 VH와 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항-TALEN 항체가 제공된다.
다른 구현예에서, 항-TALEN 항체는 서열번호 7 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-TALEN 항체는 서열번호 22를 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호 23 내지 25로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 26 내지 28로부터 선택된 경쇄 CDR3를 포함한다. 또한, 항-TALEN 항체가 제공되며, 여기에서 경쇄는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 각각의 CDR은 표 1d에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 본원에서 제공된 항원 결합 분자의 VL과 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항-TALEN 항체가 제공된다.
또 다른 구현예에서, (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3를 포함하는 항-TALEN 항체가 본원에서 제공되고, 추가의 구현예에서, 항-TALEN 항체는 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 구현예에서, (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3를 포함하는 항-TALEN 항체가 본원에서 제공되고, 추가의 구현예에서, 항-TALEN 항체는 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
추가의 구현예에서, (a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3를 포함하는 항-TALEN 항체가 본원에서 제공되고, 추가의 구현예에서, 항-TALEN 항체는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다른 추가의 구현예에서, (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3를 포함하는 항-TALEN 항체가 본원에서 제공되고, 추가의 구현예에서, 항-TALEN 항체는 (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
또한, (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3를 포함하는 항-TALEN 항체가 제공되고, 추가의 구현예에서, 제23항의 항-TALEN 항체는 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다양한 구현예에서, 항-TALEN 항체는 검출 가능한 표지를 추가로 포함하고, 일부 구현예에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지, 광색소 화합물, 단백질성 형광 표지, 자기 표지, 방사성 표지, 및 합텐으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 검출 가능한 표지가 형광 표지인 경우, 형광 표지는, Atto 염료, 알렉사플루오르 염료, 양자 점, 히드록시쿠마린, 아미노쿠라민, 메톡시쿠마린, 캐스케이드 블루, 퍼시픽 블루, 퍼시픽 오렌지, 루시퍼 옐로우, NBD, R-피코에리트린(PE), PE-Cy5 접합체, PE-Cy7 접합체, 적색 613, PerCP, TruRed, FluorX, Fluorescein, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-로다민, 리사민 로카민 B, 텍사스 레드, 알로피코시아닌(APC), APC-Cy7 접합체, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP(Y66H 돌연변이), GFP(Y66F 돌연변이), EBFP, EBFP2, 아주리트, GFPuv, T-사파이어, 세루린, mCFP, mTurquoise2, ECFP, CyPet, GFP(Y66W 돌연변이), mKeima-Red, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP(S65A 돌연변이), 미도리시 시안, 야생형GFP, GFP(S65C 돌연변이), TurboGFP, TagGFP, GFP(S65L 돌연변이), 에머랄드, GFP(S65T 돌연변이), EGFP, 아자미 그린, ZsGreen1, TagYFP, EYFP, 토파즈, 비너스, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsYellow1, Kusabira 오렌지, mOrange, 알로피코시아닌(APC), mKO, TurboRFP, tdTomato, TagRFP, DsRed 단량체, DsRed2("RFP"), mStrawberry, TurboFP602, AsRed2, mRFP1, J-Red, R-피코에리트린(RPE), B-피코에리트린(BPE), mCherry, HcRed1, Katusha, P3, 페리디닌 엽록소(PerCP), mKate(TagFP635), TurboFP635, mPlum, 및 mRaspberry로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 형광 표지는 R-피코에리트린(PE) 또는 알로피코시아닌(APC)이다.
또한, 본원에서 제공되는 항-TALEN 항체 및 허용 가능한 담체 또는 운송체, 즉 약학적으로 허용 가능한 담체 및 운송체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본원에 개시된 항-TALEN 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 본원에 개시된 항-TALEN 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 중쇄 및 경쇄 암호화 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 또한, 하나 또는 둘 모두의 벡터를 포함하는 세포가 제공되며, 세포는 CHO 세포, Sp2/0 세포, 토끼 세포 및 대장균 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함한다. 본원에 개시된 항-TALEN 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은 적절한 조건 하에서 전술한 벡터 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 샘플에서 TALEN 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공되며, 일 구현예에서, 방법은 검출 가능한 표지에 접합된 항-TALEN 항체와 샘플을 접촉시키는 단계 및 샘플에서 TALEN 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고; 일부 구현예에서, 항-TALEN 항체는 본원에 제공된 항체, 또는 이의 인간화 형태를 포함한다. 또한, 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 포르말린 고정 샘플, 생체 외 성장 조직 또는 세포 배양 배지일 수 있다.
본 개시의 다양한 양태는 다음의 섹션에서 상세히 설명된다. 섹션의 사용은 본 개시를 제한하려는 것이 아니다. 각각의 섹션은 본 개시의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에 인용된 모든 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시에서 제공된 도면은 단지 예시를 위한 것이며, 한정하기 위한 것이 아니다.
도 1은 융합 #2299(13 내지 16으로 도면에 표시됨) 및 #2296(3, 6, 7, 8 및 11로 도면에 표시됨)으로부터의 하이브리도마 상청액의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 기술 분야(예를 들어, 유전자 조작, 세포 배양, 분자 유전자, 핵산 화학 및 생화학 분야)의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시가 보다 쉽게 이해되도록, 특정 용어가 먼저 아래에 정의된다. 다음의 용어 및 다른 용어에 대한 추가 정의는 본 개시 전체에 걸쳐 제시된다.
친화도 : 당업계에 공지된 바와 같이, "친화도"는 특정 리간드가 그의 파트너에 결합하는 조임도의 척도를 지칭한다. 친화도는 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도는 정량적 분석에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 농도 및/또는 리간드 농도는 가변될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 친화도는 유사한 조건(예를 들어, 농도) 하에서 기준과 비교될 수 있다.
아미노산 : 가장 넓은 의미에서, 예를 들어, 하나 이상의 펩티드 결합의 형성을 통해 폴리펩티드 사슬에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반 구조 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연적으로 발생하는 아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산은 합성 아미노산이고; 일부 구현예에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 일부 구현예에서, 아미노산은 L-아미노산이다. 용어 "표준 아미노산"은 자연적으로 발생하는 펩티드에서 흔히 발견되는 20개의 표준 L-아미노산 중 어느 하나를 지칭한다. 용어 "비표준 아미노산"은 합성으로 제조되는지 또는 천연 공급원으로부터 수득되는지에 관계없이, 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 내에 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은 전술한 일반 구조와 비교하여 구조적 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 아미노산은 일반 구조와 비교하여 메틸화, 아미드화, 아세틸화 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 "아미노산"은 유리 아미노산을 지칭하기 위해 사용되고; 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용된다.
항체 : 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정규 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 단백질의 종을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 자연에서 생산된 온전한 항체는 통상적으로 "Y-형상" 구조로서 지칭되는 것에 서로 연관되는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25 kD)로 이루어진 대략 150 kD의 사량체 제제이다. 각각의 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개의 아미노산 길이), 아미노-말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 선단부에 위치함)으로 구성되고, 이어서 3개의 불변 도메인: CH1, CH2, 및 카르복시-말단 CH3(Y 줄기의 기저부에 위치함)으로 구성된다. "스위치"로 통상적으로 지칭되는 짧은 영역은 중쇄 가변 영역과 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지 부분에 연결시킨다. 이러한 힌지 영역에서의 2개의 이황화 결합은 2개의 중쇄 폴리펩티드를 온전한 항체에서 서로 연결시킨다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인 - 아미노-말단 가변(VL) 도메인으로 구성되고, 이어서 카르복시-말단 불변(CL) 도메인으로 구성되며, 서로에게 "스위치"에 의해 분리된다. 온전한 항체 사량체는 중쇄 및 경쇄가 단일 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 2개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되며; 2개의 다른 이황화 결합은 이량체를 서로 연결시켜 사량체가 형성되도록 중쇄 힌지 영역을 서로 연결시킨다. 자연적으로 생산된 항체 또한 전형적으로 CH2 도메인 상에서 글리코실화된다. 천연 항체 내의 각각의 도메인은, 압축된 역평행 베타 배럴에서 서로에 대해 충진된 2개의 베타 시트(예를 들어, 3-, 4-, 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 "면역글로불린 접힘"을 특징으로 하는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "보체 결정 영역"(CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로 알려진 3개의 초가변 루프 및 4개의 다소 불변인 "프레임워크" 영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 함유한다. 천연 항체가 접힐 경우, FR 영역은 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 CDR 루프 영역은 이들이 Y 구조의 선단에 위치한 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성하도록 3차원 공간에서 합쳐진다. 자연 발생 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소에 결합하고, 예를 들어 세포독성을 매개하는 효과기 세포를 포함하는 효과기 세포 상의 수용체에 또한 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 다클론성이고; 일부 구현예에서, 항체는 단클론성이다.
결합 : 본원에서 사용되는 용어 "결합"은 일반적으로 2개 이상의 엔티티 사이 또는 이들 중의 비공유 연결을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. "직접" 결합은 엔티티 또는 모이어티 사이의 물리적 접촉을 수반하며; "간접" 결합은 하나 이상의 중간 엔티티와의 물리적 접촉에 의한 물리적 상호작용을 수반한다.
염색체 : 본원에서 사용되는 용어 "염색체"는 유전적 정보의 전달에 있어서 유전자 및 기능을 운반하는 진핵 세포의 핵에 관련 단백질을 갖는 DNA의 선형 분자를 지칭한다.
상응 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 관심 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 위치/동일성을 지칭한다. 당업자는 이를 이해할 것이고, 단순성을 위해, 폴리펩티드 내의 잔기는 종종 기준 관련 폴리펩티드에 기초한 정규 넘버링 시스템을 사용하여 지정되며, 예를 들어, 위치 190의 잔기에 "상응"하는 아미노산은 실제로 특정 아미노산 사슬 내의 190번째의 아미노산일 필요는 없고, 오히려 기준 폴리펩티드 내의 190번째에서 발견되는 잔기에 상응한다; 당업자는 "상응"하는 아미노산을 식별하는 방법을 용이하게 이해할 것이다.
검출 모이어티 : 본원에서 사용되는 용어 "검출 모이어티"는 검출 가능한 임의의 요소, 분자, 작용기, 화합물, 단편 또는 모이어티를 지칭한다. 일부 구현예에서, 검출 모이어티는 단독으로 제공되거나 사용된다. 일부 구현예에서, 검출 모이어티는 다른 제제와 연관하여(예를 들어, 다른 제제에 결합되도록) 제공 및/또는 사용된다. 검출 모이어티의 예는, 다양한 리간드, 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 135I, 125I, 123I, 64Cu, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, 89Zr 등), 형광 염료(예를 들어, 형광 염료, 아크리딘 염료, SYBR 염료, 로다민 염료, 옥사진 염료, 등). 화학발광제(예를 들어, 아크리디늄 에스테르, 안정화된 디옥세탄, 등), 전기화학발광제(예를 들어, 술포 태그(Sulfo Tag)), 생물발광제(예를 들어, 루시페린), 스펙트럼적으로 용해 가능한 무기 형광 반도체 나노결정(즉, 양자점), 금속 나노입자(예를 들어, 금, 은, 구리, 백금, 등). 나노클러스터, 상자성 금속 이온, 효소(예를 들어, 서양고추냉이 과산화효소, 알칼리 인산분해효소, 등). 비색 라벨(예를 들어, 염료, 콜로이드성 금, 등), 비오틴, 디곡시게닌, 합텐, 및 항혈청 또는 단클론 항체를 사용할 수 있는 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
조작 : 일반적으로, 용어 "조작된"은 사람의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 자연계에서 그 순서로 함께 연결되지 않은 둘 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오티드에서 서로 직접 연결되도록 사람의 손에 의해 조작될 경우, "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 개시의 일부 구현예에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는, 제1 코딩 서열과 작동 가능하게 연관되지만 제2 코딩 서열과 작동 가능하게 연관되지 않는 자연에서 발견되는 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 제2 코딩 서열과 작동 가능하게 연관되도록 사람의 손에 의해 연결된다. 유사하게, 세포 또는 유기체가 그의 유전 정보가 변경되도록 조작되는 경우(예를 들어, 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질이, 예를 들어, 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입, 또는 다른 메커니즘에 의해 도입되거나, 이전에 존재하던 유전 물질이, 예를 들어, 치환에 의해 또는 결실 돌연변이에 의해, 또는 교배 프로토콜에 의해 변경되거나 제거되는 경우), 세포 또는 유기체는 "조작된" 것으로 간주된다. 일반적인 관행이며 당업자에게 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 세포의 자손은 실제 조작이 종래 엔티티에 대해 수행되었더라도 통상적으로 "조작된" 것으로 또한 지칭된다.
발현 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 다음의 이벤트 중 하나 이상을 지칭한다: (1) (예를 들어, 전사에 의한) DNA 서열로부터 RNA 템플릿의 생산; (2) (예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 말단 형성에 의한) RNA 전사물의 가공; (3) 폴리펩티드 또는 단백질 내로의 RNA의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역 후 변형.
FokI : 본원에서 사용되는 용어 "FokI"(대안적으로 Fok1 또는 Fok-1로 지칭됨)는 플라보박테리움 오케아노코이트에서 자연적으로 발견되는 박테리아 IIS형 제한 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 천연 FokI는 N-말단 DNA-결합 도메인 및 C-말단에서의 비특이적 DNA 절단 도메인을 포함한다. FokI DNA 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 대해 독립적으로 기능할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, FokI는 FokI의 DNA 절단 도메인(즉, 뉴클레아제 도메인)을 포함하는 단백질을 암호화하는 단백질 또는 핵산을 지칭한다. FokI는 전체 FokI 단백질(서열번호 2) 또는 단지 촉매 뉴클레아제 도메인(서열번호 1)을 지칭할 수 있다. 용어 "FokI"는 돌연변이체, 유도체, 유사체, 절단물, 융합 작제물, 및 FokI 이량체를 포함하는 FokI의 다량체를 포함하는 FokI의 모든 단편 및 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, FokI는 재조합적으로 생산된다. 일부 구현예에서, FokI 폴리펩티드는 결합 모이어티 및/또는 검출 모이어티와 같은 추가 모이어티에 접합되거나 이에 태그된다. 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 "FokI"는 FokI 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체를 지칭하는 데 사용되고; 일부 구현예에서, "FokI"는 FokI 폴리펩티드 및 이의 단편 및 변이체를 암호화하는 핵산을 지칭하는 데 사용된다.
단편 : 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 분자의 "단편"은 전체의 이산 부분을 포함하지만, 전체 내에서 발견되는 하나 이상의 모이어티가 결여된 구조(예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 결여된 폴리펩티드)를 갖는다. 일부 구현예에서, 단편은 이러한 이산 부분으로 구성된다. 일부 구현예에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조적 요소 또는 모이어티(예를 들어, 폴리펩티드 도메인)로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 중합체(예를 들어, 핵산 중합체 또는 폴리펩티드)이다. 일부 구현예에서, 중합체 단편은, 전체 중합체에서 발견되는 단량체 단위(예를 들어, 잔기)의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 이상을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 중합체 단편은, 전체 중합체에서 발견되는 단량체 단위(예를 들어, 잔기)의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 전체 생물학적 분자는 전체의 "부모"로서 지칭될 수 있다.
융합 : "융합 분자"는 2개 이상의 서브유닛 분자가 연결되고, 바람직하게는 공유 결합되는 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 동일한 화학적 유형의 분자의 융합의 예는, 융합 단백질(예를 들어, FokI 절단 도메인에 대한 아연 핑거 단백질 또는 TALEN DNA 결합 도메인 사이의 융합) 및 융합 핵산(예를 들어, 전술한 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상이한 화학적 유형의 분자의 융합의 예는 핵산-폴리펩티드 융합(예를 들어, RNA 분자와 FokI 절단 도메인 사이의 융합)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
유전자 : 본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩티드 생성물)을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자는 코딩 서열(즉, 특정 산물을 암호화하는 서열)을 포함하고; 일부 구현예에서, 유전자는 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 유전자는 코딩(예를 들어, 엑손) 서열 및 비-코딩(예를 들어, 인트론) 서열 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는, 예를 들어, 유전자 발현의 하나 이상의 양태(예를 들어, 세포 유형 특이적 발현, 유도성 발현 등)를 조절하거나 이에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함할 수 있다.
유전자 또는 세포 요법 : 본원에서 사용되는 용어 "유전자 또는 세포 요법"은 이러한 요법이 요구되는 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 특이적 게놈 DNA 서열의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA 서열의 삽입 또는 결실은 특정 세포(즉, 표적 세포)에서 발생한다. 표적 세포는 포유동물 유래일 수 있고/있거나 포유동물 대상체 내의 세포일 수 있다. 포유류는 인간, 개, 고양이, 젖소, 양, 돼지, 라마, 비인간 영장류 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 이종 DNA는 표적 세포에 전달된다. 이종 DNA는, 이종 DNA가 발현되고 이에 의해 암호화된 치료제가 생산되는 방식으로, 선택된 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이종 DNA는, 일부 방식으로는 치료 생성물을 암호화하는 DNA의 발현을 매개할 수 있거나, 일부 방식으로는 치료 생성물의 발현을 직접 또는 간접적으로 매개하는 펩티드 또는 RNA와 같은 산물을 암호화할 수 있다. 유전자 또는 세포 요법은, 결함 유전자를 대체하거나 포유동물 또는 유전자가 도입되는 세포에 의해 생산된 유전자 산물을 보충하는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 전달하는 데에도 사용될 수 있다. 치료제를 암호화하는 이종 DNA는, 제품 또는 이의 발현을 강화하거나 달리 변경시키기 위해, 감염된 대상체의 세포 내로 도입되기 전에 변형될 수 있다. 유전자 또는 세포 요법은 또한 유전자 발현의 억제제 또는 억제자 또는 다른 조절자의 전달을 포함할 수 있다. 유전자 요법은 생체 내 또는 생체 외 기술을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 또는 세포 요법은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 RNA-유도 FokI 뉴클레아제(RFN)를 암호화하는 핵산을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법은 TALEN, ZFN 또는 RFN을 암호화하는 핵산을 포유류 세포 또는 표적 조직에 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 세포에 TALEN, ZFN 또는 RFN을 암호화하는 핵산을 투여하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 폴록사머 또는 리포좀과 같은 전달 운송체와 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는다. 유전자 요법 절차에 대한 검토는, 예를 들어, Anderson, Science 256:808-813 (1992); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Feuerbach 등, Kidney International 49:1791-1794 (1996); Urnov 등, Nature Reviews Genetics 11, 636-646 (2010); 및 Collins 등, Proceedings Biologicial Sciences / The Royal Society, 282(1821):pii 20143003 (2015)을 참조한다.
게놈 : 본원에서 사용되는 용어 "게놈"은 개별 유기체 또는 세포에 의해 운반되는 총 유전 정보를 지칭하며, 이의 염색체의 완전한 DNA 서열로 대표된다.
고친화도 결합 : 본원에서 사용되는 용어 "고친화도 결합"은 특정 리간드가 그의 파트너에 결합하는 높은 정도의 조임을 지칭한다. 친화도는 당업계에 공지된 것을 포함하는 임의의 이용 가능한 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 분석에서 Kd가 약 500 pM 이하(예를 들어, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 90 pM 미만, 약 80 pM 미만, 약 70 pM 미만, 약 60 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 20 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 5 pM 미만, 약 4 pM 미만, 약 3 pM 미만, 약 2 pM 미만, 등)인 경우, 결합은 고친화도인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 친화도가 선택된 기준 폴리펩티드에 비해 관심 폴리펩티드에 대해 더 강한 경우(예를 들어, Kd가 더 낮은 경우), 결합은 고친화도로 간주된다. 일부 구현예에서, 선택된 기준 폴리펩티드에 대한 Kd에 대 관심 폴리펩티드에 대한 Kd의 비가 1:1 이하(예를 들어, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1. 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 0.1:1, 0.05:1, 0.01:1, 또는 그 미만)인 경우, 결합은 고친화도로 간주된다. 일부 구현예에서, 관심 폴리펩티드에 대한 Kd가 선택된 기준 폴리펩티드에 대한 Kd의 약 100% 이하(예를 들어, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 또는 그 미만)인 경우, 결합은 고친화도로 간주된다.
상동성 : 본원에서 사용되는 용어 "상동성"은 중합체 분자들 사이, 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일부 구현예에서, 중합체 분자들은 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 경우, 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 중합체 분자들은 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 유사한 경우, 서로 "상동성"인 것으로 간주된다.
시험관 내 : 본원에서 사용되는 용어 "시험관 내"는 다세포 유기체 내에서가 아니라, 인공 환경, 예를 들어, 시험 튜브 또는 반응 용기, 세포 배양 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.
생체 내 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 세포 기반 시스템의 맥락에서, 이 용어는 (예를 들어, 시험관 내 시스템과 반대로) 살아있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
단리된 : 본원에서 사용되는 바와 같이, (1) (자연에서 및/또는 실험 환경에서) 초기에 생성될 때 연관되었던 구성 요소의 적어도 일부로부터 분리되었고/되었거나, (2) 사람의 손에 의해 설계, 생산, 준비 및/또는 제조된 물질 및/또는 엔티티를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 이들이 초기에 연관된 다른 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 물질에 실질적으로 다른 성분이 없는 경우, 물질은 "순수"하다. 일부 구현예에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질은, 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충제, 용매, 물 등)와 같은 특정 다른 성분과 조합된 후 여전히 "단리된" 또는 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 이러한 구현예에서, 물질의 단리 백분율 또는 순도는 이러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 한 가지 예를 들자면, 일부 구현예에서, 자연에서 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 중합체는, a) 그 기원 또는 유래의 출처에 의해, 자연에서 이의 본래 상태에서 이를 수반하는 성분의 일부 또는 전부와 연관되지 않는 경우; b) 자연에서 이를 생산하는 종으로부터 유래된 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없는 경우; c) 자연에서 이를 생산하는 종이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템으로부터의 성분에 의해 발현되거나 그렇지 않은 경우 이와 연관되어 발현되는 경우, "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 구현예에서, 화학적으로 합성되거나, 자연에서 폴리펩티드를 생성하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드로 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 하나 이상의 정제 기술을 거친 폴리펩티드는 a) 자연에서 그것이 연관되고/되거나 b) 처음 생산될 때 연관되는 다른 성분으로부터 분리되는 정도까지 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
링커 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 상이한 요소를 서로 연결하는 다중-요소 폴리펩티드의 부분을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, 당업자는, 둘 이상의 기능적 또는 조직적 도메인을 포함하는 구조를 갖는 폴리펩티드가 종종 이들을 서로 연결하는 이러한 도메인들 사이의 아미노산의 신장(stretch)을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 링커 요소를 포함하는 폴리펩티드는 일반적인 형태 S1-L-S2의 전체 구조를 가지되, S1 및 S2는 동일하거나 상이할 수 있고 링커에 의해 서로 연관된 2개의 도메인을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 강성 3차원 구조를 채택하지 않고 오히려 폴리펩티드에 유연성을 제공하는 경향이 있는 것을 특징으로 한다. 당업계에 공지된 폴리펩티드(예를 들어, 융합 폴리펩티드)를 조작할 때 적절히 사용될 수 있는 다양한 상이한 링커 요소(예를 들어, Holliger, P. 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J. 등 (1994) Structure 2: 1 121-1123 참조).
핵산 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 가장 넓은 의미에서, 용어 "핵산"은 올리고뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산 디에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능성 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 템플릿에 기초한 중합화에 의한 효소 합성(생체 내 또는 시험관 내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 생식, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상의 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산은 단일 가닥이고; 일부 구현예에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가지거나, 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 보체이다. 일부 구현예에서, 핵산은 효소 활성을 갖는다.
생리학적 조건 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 이는 세포 또는 유기체가 생존하고/하거나 번식하는 조건을 나타내는, 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다. 일부 구현예에서, 이 용어는 유기체 또는 세포 시스템에 대해 자연에서 발생할 수 있는 외부 또는 내부 환경의 조건을 지칭한다. 일부 구현예에서, 생리학적 조건은 인간 또는 비인간 동물의 신체 내에 존재하는 조건, 특히 수술 부위 및/또는 수술 부위 내에 존재하는 조건이다. 생리학적 조건은 일반적으로, 예를 들어, 약 20 내지 약 40°C의 온도 범위, 약 1의 대기압, 약 6 내지 약 8의 pH, 약 1 내지 약 20 mM의 포도당 농도, 대기 수준의 산소 농도, 및 지구 상에서의 중력을 포함한다. 일부 구현예에서, 실험실에서의 조건은 생리학적 조건 하에서 조작되고/되거나 유지된다. 일부 구현예에서, 생리학적 조건은 유기체에서 발견된다.
폴리펩티드 : 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 적어도 3개의 아미노산의 중합체의, 당업계에서 인식되는 의미를 갖는다. 당업자는, 용어 "폴리펩티드"가 본원에 인용된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라 이러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편(즉, 적어도 하나의 활성을 보유하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포함하도록 충분히 일반적인 것으로 의도된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 단백질 서열이 활성을 파괴하지 않고 일반적으로 일부 치환을 견딘다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 활성을 보유하고, 일반적으로 적어도 3 또는 4개 및 종종 최대 20개 이상의 아미노산을 포함하며, 적어도 약 30 내지 40%의 전체 서열 동일성(종종 약 50%, 60%, 70%, 또는 80%를 초과하고, 하나 이상의 고도로 보존된 영역에서 훨씬 더 높은 동일성, 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 초과하는 동일성을 갖는 적어도 하나의 영역을 포함함)을 공유하는 임의의 폴리펩티드는 동일한 부류의 다른 폴리펩티드와 함께 본원에서 사용되는 관련 용어 "폴리펩티드" 내에 포함된다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 모두를 함유할 수 있고, 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형체 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변형은, 예를 들어, 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체, 항체 단편, 이의 생물학적으로 활성인 부분, 및/또는 이의 특징적인 부분이다.
단백질 : 본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 이산 단위로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 단일 폴리펩티드가 이산 작용 단위이고, 이산 작용 단위를 형성하기 위해 다른 폴리펩티드와 영구적인 또는 일시적인 물리적인 연관성을 필요로 하지 않는 경우, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 이산적 기능적 단위가 서로 물리적으로 연관되는 둘 이상의 폴리펩티드로 구성되는 경우, 용어 "단백질"은 이산적 단위로서 함께 물리적으로 연관되고 기능하는 다수의 폴리펩티드를 지칭하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 아미노산 이외의 모이어티(예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸 등)를 포함할 수 있고/있거나 달리 처리되거나 변형될 수 있다. 당업자는 일부 구현예에서 용어 "단백질"이 세포에 의해 생산된 완전한 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 신호 서열이 있거나 없음) 및/또는 세포 내에서 활성인 형태(예를 들어, 절단된 형태 또는 복합체 형태)를 지칭할 수 있음을 이해할 것이다. 단백질이 다수의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 일부 구현예에서, 이러한 사슬은, 예를 들어, 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 공유 결합되거나, 다른 수단에 의해 결합될 수 있다.
기준 : 과학적 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 비교가 수행되는 표준 또는 대조군을 기술한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 관심 제제, 관심 동물, 관심 개체, 관심 집단, 관심 샘플, 관심 서열 또는 관심 값은 기준 또는 대조군 제제, 기준 또는 대조군 동물, 기준 또는 대조군 개체, 기준 또는 대조군 집단, 기준 또는 대조군 샘플, 기준 또는 대조군 서열 또는 기준 또는 대조군 값과 비교된다. 일부 구현예에서, 기준 또는 대조군은 관심 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험 및/또는 결정된다. 일부 구현예에서, 기준 또는 대조군은 선택적으로 유형 매체로 구현된, 역사적 기준 또는 대조군이다. 일반적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 기준 또는 대조군은 평가 중인 조건과 유사한 조건 또는 상황 하에서 결정되거나 특성화된다. 당업자는 특정 가능한 기준 또는 대조군에 대한 의존 및/또는 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재할 경우를 이해할 것이다.
샘플 : 본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 관심 공급원으로부터 수득되거나 유래된 생물학적 샘플을 지칭한다. 일부 구현예에서, 관심 공급원은 동물 또는 인간과 같은 유기체를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 조직 또는 체액이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 골수; 혈액; 모든 유형의 혈액 세포(예를 들어, T 세포); 복수; 조직 또는 미세 바늘 생검 샘플; 세포 함유 체액; 유리 유동 핵산; 담; 타액; 소변; 뇌척수액, 복막액; 흉수; 대변; 림프; 부인과 체액; 피부 면봉; 질 면봉; 구강 면봉; 비강면봉; 관 세척액 또는 기관지폐포 세척액과 같은 세정액 또는 세척액; 흡인물; 스크래핑; 골수 시편; 조직 생검 시편; 수술 시편; 대변, 기타 체액, 분비물, 및/또는 배설물; 및/또는 그로부터의 세포 등일 수 있거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 수득된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수득된 세포는 샘플을 수득한 개체로부터 유래된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심 공급원으로부터 직접 수득된 "1차 샘플"이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 1차 생물학적 샘플은 생검(예를 들어, 미세 바늘 흡인 또는 조직 생검), 수술, 체액(예를 들어, 혈액, 림프, 대변 등)의 수집 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 수득된다. 일부 구현예에서, 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 용어 "샘플"은 1차 샘플의 처리(예를 들어, 하나 이상의 성분을 제거하고/하거나 이에 하나 이상의 제제를 첨가함)에 의해 수득되는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 반투과성 멤브레인을 사용한 필터링. 이러한 "가공된 샘플"은, 예를 들어, 샘플로부터 추출되거나, 1차 샘플을 mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 단리 및/또는 정제 등과 같은 기술에 적용함으로써 수득된 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
특이적 결합 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 이는 결합이 발생하는 환경에서 가능한 파트너를 구별하는 결합제의 능력을 지칭한다. 다른 잠재적 표적이 존재할 경우, 하나의 특정 표적과 상호작용하는 결합제는 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 결합제와 그의 파트너 간의 연관성 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 구현예에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 구현예에서, 특이적 결합은 그의 파트너와 또 다른 엔티티 간의 대안적인 상호작용과 경쟁하는 결합제의 능력을 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 다양한 농도 범위에 걸쳐 이러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.
대상체 :"대상체"는 포유동물(예를 들어, 인간, 일부 구현예에서, 태아기 인간 형태를 포함함)을 의미한다. 일부 구현예에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특징을 갖는 하나 이상의 특성을 갖는 누군가이다. 일부 구현예에서, 대상체는 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고, 투여될 및/또는 투여된 개체이다.
실질적으로 : 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 관심 특성 또는 성질의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인 조건을 지칭한다. 생물학적 및 화학적 현상은 어느 때라도 완료되고/되거나 완전성으로 진행하거나 절대적 결과를 달성하거나 회피하는 경우가 거의 없다는 것을 생물학적 분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
변이체 : 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 기준 엔티티와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만, 기준 엔티티와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에서 기준 엔티티와 구조적으로 상이한 엔티티를 지칭한다. 많은 구현예에서, 변이체는 또한 기준 엔티티와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 엔티티가 기준 엔티티의 "변이체"로 적절하게 간주되는지 여부는 기준 엔티티와의 구조적 동일성의 정도에 기초한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 기준 엔티티는 소정의 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 정의에 의하면, 변이체는 하나 이상의 이러한 특징적인 구조적 요소를 공유하는 구별되는 화학 엔티티이다. 몇 가지 예를 들자면, 소분자는 특징적인 코어 구조 요소(예를 들어, 거대고리 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적인 펜던트 모이어티를 가질 수 있어서, 소분자의 변이체는 코어 구조 요소 및 특징적인 펜던트 모이어티를 공유하는 것이지만 코어 내에서는 다른 펜던트 모이어티 및/또는 존재하는 결합 유형(예를 들어, 단일 대 이중, E 대 Z, 등)과는 상이하고, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 아미노산으로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고/있거나 특정 생물학적 기능에 기여할 수 있고, 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 다른 것에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유 부착된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 하나 이상의 차이의 결과로서 기준 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 전체 서열 동일성을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 구현예에서, 기준 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 나타낸다. 많은 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 그 관심 폴리펩티드가 특정 위치에서의 소수의 서열 변경을 제외하고는 부모의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 경우, 부모 또는 기준 폴리펩티드의 "변이체"인 것으로 간주된다. 통상적으로, 부모와 비교하여, 변이체 내 잔기의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 치환된다. 일부 구현예에서, 부모와 비교하여, 변이체는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환된 잔기를 갖는다. 종종, 변이체는 매우 적은 수(예를 들어, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만)의 치환된 기능적 잔기(즉, 특정 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 갖는다. 또한, 변이체는 일반적으로 부모와 비교하여 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 첨가 또는 결실을 가지며, 종종 첨가 또는 결실을 갖지 않는다. 또한, 임의의 첨가 또는 결실은 통상적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개 미만이고, 통상적으로 약 5, 약 4, 약 3 또는 약 2개 미만의 잔기이다. 일부 구현예에서, 부모 또는 기준 폴리펩티드는 자연에서 발견되는 것이다. 일부 구현예에서, 변이체는 조작된다. 일부 구현예에서, 변이체는 자연적으로 발생한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 특정 관심 폴리펩티드의 복수의 변이체가 자연에서 발견될 수 있다.
벡터 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 이는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 분절이 연결될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 감마 레트로바이러스 벡터)이며, 여기에서 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 당업계에서 통상적으로 달성되거나 본원에 기술된 바에 따라 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 당업계에 잘 알려진 종래의 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반 및 보다 구체적인 참조 문헌에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) 참조, 이는 어떠한 목적으로든 본원에 참조로서 통합됨.
아연 핑거 단백질 : 본원에서 사용되는 용어 "아연 핑거 단백질"은 핵산(예를 들어, DNA)에 결합할 수 있는 "아연 핑거 도메인"을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "아연 핑거 도메인"은 아연 이온에 의해 안정화된 ββα 접힘부를 포함하는 개별적인 "핑거"를 지칭한다. 각각의 아연 핑거 도메인은 일반적으로 대략 30개의 아미노산을 포함한다. 아연 핑거 도메인은 주로 구조적으로 독립적이며, 상이한 환경에서 그의 구조 및 기능을 유지할 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 균등물로서 사용된다. 약/대략의 유무에 관계없이 본 출원에 사용된 임의의 숫자는 당업자에 의해 이해되는 임의의 정상적인 변동을 커버하는 것을 의미한다.
본 개시의 다른 특징, 목적 및 장점은 이어지는 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 개시의 구현예를 나타내지만, 단지 예시로서 주어지는 것이며, 한정하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 개시의 범위 내의 다양한 변경 및 변형은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
특정 구현예의 상세한 설명
본 개시는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 DNA 절단 도메인에 결합하는 항체 및 이의 용도를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항체는 면역학적으로 기능적 단편인 항체 결합 영역을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 항체의 "면역학적 기능적 단편"(또는 "단편")은 전장 사슬에 존재하는 아미노산의 적어도 일부가 결여되어 있지만 표적 항원에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 (예를 들어, FokI 및/또는 TALEN 단백질에 결합할 수 있는) 항체의 부분을 (그 부분이 어떻게 수득되거나 합성되는지에 관계없이) 포함하는 항체의 종이다. 이러한 단편은 표적 항원에 결합한다는 점에서 생물학적으로 활성이고, 주어진 에피토프에 결합하기 위해 온전한 항체를 포함하는 다른 항원 결합 분자와 경쟁할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 중화 단편이다. 일부 구현예에서, 단편은 표적 항원의 활성을 차단하거나 감소(예를 들어, 차단 효과)시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 표적 항원의 활성을 길항할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시의 항-TALEN 항체는 클론 2299.2G3.C6, 2299.5D4.C8, 2299.6B3.B8.B6, 2299.6G5.C7, 또는 2299.7F11.B4로서 본원에서 식별된 항체이고, 각각은 본원에 제공되고 표지된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 아미노산, 코딩, 가변성, 및 CDR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 클론 2299.2G3.C6, 2299.5D4.C8, 2299.6B3.B8.B6, 2299.6G5.C7, 또는 2299.7F11.B4는 FokI 촉매 도메인을 포함하는 분자에 특이적으로 결합한다.
면역학적 기능성 면역글로불린 단편은, scFv 단편, Fab 단편(Fab', F(ab')2, 등), 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR"), 디아바디(동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은, 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 중쇄 가변 도메인), 도메인 항체, 2가 항원 결합 도메인(2개의 항원 결합 부위를 포함함), 다중특이적 항원 결합 도메인, 및 단쇄 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 단편은 인간, 마우스, 랫트, 낙타류 또는 토끼를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원 결합 분자는 비-단백질 성분을 포함할 수 있다.
가변 영역은 일반적으로 3개의 초가변 영역(CDR)에 의해 결합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 일반적으로 특정 에피토프에 결합할 수 있는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 모두는 통상적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 관례상, 중쇄 내의 CDR 영역은 통상적으로 HC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다. 경쇄 내의 CDR 영역은 통상적으로 LC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 항-TALEN 항체는 항체의 전장 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 하나 이상의 상보성 결합 영역(CDR)을 포함하고, 일부 구현예에서는 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 부분을 포함한다. 이들 단편은 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있거나, 온전한 항체를 포함하는 항원 결합 도메인의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 이의 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상을 포함하는 이의 단편 항체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 경쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이다.
각각의 프레임워크에 대한 아미노산의 할당, CDR, 및 가변 도메인은 통상적으로 Kabat 넘버링(예를 들어, Kabat 등, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. 1991 참조), Chothia 넘버링(예를 들어, Chothia & Lesk, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani 등, (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia 등, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano 등, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조), 접촉 넘버링, 또는 AbM 방식(항체 모델링 프로그램(Antibody Modeling program), Oxford Molecular)의 번호 부여 체계를 따른다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 제시된 항-TALEN 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 방식에 따라 번호가 부여된다. 다른 구현예에서, 본원에서 제시된 항-TALEN 항체의 CDR은 Chothia 넘버링 방식에 따라 번호가 부여된다. 다른 구현예에서, 본원에서 제시된 항-TALEN 항체의 CDR은 접촉 넘버링 방식에 따라 번호가 부여된다. 다른 구현예에서, 본원에서 제시된 항-TALEN 항체의 CDR은 AbM 넘버링 방식에 따라 번호가 부여된다.
본원에서 기술된 항-TALEN 항체의 인간화 항체는 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화 단클론 항체는 항-TALEN 항체의 가변 도메인(또는 이의 항원 결합 부위의 전부 또는 일부) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 도메인을 포함한다. 대안적으로, 인간화 항체 단편은 쥣과 동물 또는 토끼 단클론 항체의 항원 결합 부위 및 인간 항체로부터 유래된 (항원 결합 부위가 결여된) 가변 도메인 단편을 포함할 수 있다. 조작된 단클론 항체의 생산을 위한 절차는, Riechmann 등, (1988) Nature 332:323, Liu 등, (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick 등, (1989) Bio/Technology 7:934, 및 Winter 등, (1993) TIPS 14:139에 기술된 내용들을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항체는 CDR 접목 항체이다. 항체를 인간화하기 위한 기술은, 예를 들어, 미국 특허 제5,869,619호; 제5,225,539호; 제5,821,337호; 제5,859,205호; 제6,881,557호; Padlan 등, (1995) FASEB J. 9:133-39; Tamura 등, (2000) J. Immunol. 164:1432-41; Zhang 등, (2005) Mol. Immunol. 42(12):1445-1451; Hwang 등, Methods. (2005) 36(1):35-42; Dall'Acqua 등, (2005) Methods 36(1):43-60; 및 Clark, (2000) Immunology Today 21(8):397-402에서 논의된 바 있다.
항-TALEN 항체의 변이체, 예를 들어, 본원에서 기술된 항원 결합 도메인 서열의 아미노산 서열과 각각 적어도 70 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 97%, 97 내지 99%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 또한 본 개시의 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표 1a에서 제공된 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 표 1b에서 제공된 경쇄 가변 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일하다.
일부 경우, 이러한 분자는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 경우, 변이체 형태는 2개의 가변 경쇄 및 2개의 가변 중쇄(또는 이의 하위 부분)를 함유한다. 당업자는 공지된 기술을 사용하여 본원에서 제시된 바와 같은 항-TALEN 항체의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 소정의 구현예에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적화함으로써 항원 결합 활성을 파괴하지 않고 변경될 수 있는 분자의 적절한 영역을 식별할 수 있다.
본 개시의 항-TALEN 항체는 또한 완전한 인간 단클론 항체일 수 있다. 완전한 인간 단클론 항체는 당업자에게 익숙한 임의의 수의 기술로 생성될 수 있다. 이러한 방법은, 인간 말초 혈액 세포의 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 형질전환(예를 들어, B 림프구 함유), 인간 B 세포의 시험관 내 면역화, 삽입된 인간 면역글로불린 유전자를 운반하는 면역화된 유전자 이식 마우스로부터의 비장 세포의 융합, 인간 면역글로불린 V 영역 파지 라이브러리로부터의 단리, 또는 본원의 개시에 기반하는 당업계에 공지된 바와 같은 다른 절차를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 특이적으로 결합하는 항-TALEN 항체가 이차적인 표적에 결합하는 것보다 하나의 표적에 더 단단하게 결합할 경우, "선택적"인 것으로 지칭된다. TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 특이적으로 결합하는 항-TALEN 항체는, 해리 상수(Kd)가 나노몰 범위(예를 들어, 약 1 nM)일 경우, 이의 표적 항원(예를 들어, TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인)에 "특이적으로 결합"하는 것으로 지칭된다. 항원 결합 도메인은 Kd가 1 내지 5 nM일 경우 "고친화도"로, Kd가 0.1 내지 0.5 nM일 경우 "매우 높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 약 1 nM의 Kd를 갖는다. 일 구현예에서, 오프레이트는 < 1 Х 10-5이다. 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 약 1 x 10-7 M 내지 1 x 10-12 M의 Kd로 TALEN 단백질 및 FokI 촉매 도메인을 포함하는 분자에 결합할 것이고, 또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 약 1 x 10-5 내지 1 x 10-12의 Kd로 결합할 것이다.
본원에서 제공된 바와 같이, 본 개시의 항-TALEN 항체는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 뉴클레아제 도메인(예를 들어, 서열번호 1)에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항-TALEN 항체는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 1 Х 10-6 M 미만, 1 Х 10-7 M 미만, 1 Х 10-8 M 미만, 또는 1 Х 10-9 M 미만의 KD로 결합한다. 일 특정 구현예에서, 항-TALEN 항체는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 1 Х 10-7 M 미만의 KD로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항-TALEN 항체는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 1 Х 10-8 M 미만의 KD로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-TALEN 항체는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 약 1 Х 10-7 M, 약 2 Х 10-7 M, 약 3 Х 10-7 M, 약 4 Х 10-7 M, 약 5 Х 10-7 M, 약 6 Х 10-7 M, 약 7 Х 10-7 M, 약 8 Х 10-7 M, 약 9 Х 10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 2 Х 10-8 M, 약 3 Х 10-8 M, 약 4 Х 10-8 M, 약 5 Х 10-8 M, 약 6 Х 10-8 M, 약 7 Х 10-8 M, 약 8 Х 10-8 M, 약 9 Х 10-8 M, 약 1 Х 10-9 M, 약 2 Х 10-9 M, 약 3 Х 10-9 M, 약 4 Х 10-9 M, 약 5 Х 10-9 M, 약 6 Х 10-9 M, 약 7 Х 10-9 M, 약 8 Х 10-9 M, 약 9 Х 10-9 M, 약 1 Х 10-10 M, 또는 약 5 Х 10-10 M의 KD로 결합한다. 특정 구현예에서, Kd는 Koff/Kon의 몫으로 계산되고, Kon 및 Koff는, 예를 들어, Biacore® 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 측정된 Fab 단편과 같은 1가 항체를 사용하여 결정된다. 다른 구현예에서, Kd는 Koff/Kon의 몫으로 계산되고, Kon 및 Koff는, 예를 들어, Biacore® 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 측정된 Fab 단편과 같은 2가 항체를 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 항-TALEN 항체는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 1 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 2 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 3 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 4 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 5 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 7 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 8 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 9 Х 10-4 M-1 s-1 미만, 1 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 2 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 3 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 4 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 5 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 6 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 7 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 8 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 9 Х 10-5 M-1 s-1 미만, 1 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 2 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 3 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 4 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 5 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 6 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 7 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 8 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 9 Х 10-6 M-1 s-1 미만, 또는 1 Х 10-7 M-1 s-1 미만의 결합 속도(kon)로 결합한다. 특정 구현예에서, kon은, 예를 들어, BlAcore® 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 측정된 Fab 단편과 같은 1가 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, kon은, 예를 들어, BlAcore® 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 측정된 2가 항체를 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 항-TALEN 항체는 TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 1 Х 10-2 s-1 미만, 2 Х 10-2 s-1 미만, 3 Х 10-2 s-1 미만, 4 Х 10-2 s-1 미만, 5 Х 10-2 s-1 미만, 6 Х 10-2 s-1 미만, 7 Х 10-2 s-1 미만, 8 Х 10-2 s-1 미만, 9 Х 10-2 s-1 미만, 1 Х 10-3 s-1 미만, 2 Х 10-3 s-1 미만, 3 Х 10-3 s-1 미만, 4 Х 10-3 s-1 미만, 5 Х 10-3 s-1 미만, 6 Х 10-3 s-1 미만, 7 Х 10-3 s-1 미만, 8 Х 10-3 s-1 미만, 9 Х 10-3 s-1 미만, 1 Х 10-4 s-1 미만, 2 Х 10-4 s-1 미만, 3 Х 10-4 s-1 미만, 4 Х 10-4 s-1 미만, 5 Х 10-4 s-1 미만, 6 Х 10-4 s-1 미만 7 Х 10-4 s-1 미만, 8 Х 10-4 s-1 미만, 9 Х 10-4 s-1 미만, 1 Х 10-5 s-1 미만, 또는 5 Х 10-4 s-1 미만의 해리 속도(koff)로 결합한다. 특정 구현예에서, koff는, 예를 들어, BlAcore® 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 측정된 Fab 단편과 같은 1가 항체를 사용하여 결정된다. 다른 구현예에서, koff는, 예를 들어, BlAcore® 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 측정된 2가 항체를 사용하여 결정된다.
TALEN 단백질 및/또는 FokI 촉매 도메인에 결합하는 본원에서 제공된 항-TALEN 항체는 가변 중쇄(VH)를 포함하고, 여기에서 VH의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1a에 제시된 VH 서열로부터 선택된다. FokI 촉매 도메인에 특이적으로 결합하는 항-TALEN 항체는 가변 중쇄(VH)를 포함하고, 여기에서 VH의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1a에 제시된 VH 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VH 아미노산 서열은 표 1a에 제시된 VH 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일하다. Kabat CDR 정의는 굵은 글씨체로 표시되어 있고, Chothia CDR 정의는 밑줄로 표시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
FokI 촉매 도메인에 결합하는 본원에서 제공된 항-TALEN 항체는 가변 경쇄(VL)를 포함하고, 여기에서 VL의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1b에 제시된 VL 서열로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VL 아미노산 서열은 표 1b에 제시된 VL 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일하다. Kabat CDR 정의는 굵은 글씨체로 표시되어 있고, Chothia CDR 정의는 밑줄로 표시되어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Fok1 촉매 도메인에 특이적으로 결합하는 항-TALEN 항체가 본원에서 제공되고, 여기에서 항-TALEN 항체는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하되, VH의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1a에 제시된 VH 서열로부터 선택되고, VL의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1b에 제시된 VL 서열로부터 선택된다.
일부 구현예에서, Fok1 촉매 도메인에 특이적으로 결합하는 항-TALEN 항체는 표 1a에 제시된 VH 서열의 VH CDR 1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH CDR1, CDR2, 및 CDR3은 표 1c에 제시된 CDR 서열로부터 선택된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 구현예에서, Fok1 촉매 도메인에 특이적으로 결합하는 항-TALEN 항체는 표 1b에 제시된 VL 서열의 VL CDR 1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, VL CDR1, CDR2, 및 CDR3은 표 1d에 제시된 CDR 서열로부터 선택된다.
Figure pct00007
Figure pct00008
본원에 개시된 조성물의 제조 및 용도뿐만 아니라, 본 발명의 방법의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 분자 생물학, 생화학, 연산 화학, 단백질 조작, 항체 구조 및 기능, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야의 종래의 기술을 당업계의 기술 분야의 범위 내에 있는 바와 같이 사용한다. 이러한 기술은 다음의 문헌에서 충실히 설명된다. 예를 들어, Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 제3판, 2001 및 후속 판; Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 주기적 업데이트 판; METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 제3판, Academic Press, San Diego, 1998 및 후속 판 참조.
게놈 편집 기술
전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제
전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)는 통상적으로 DNA의 특정 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 제한 효소를 지칭한다. 이들은 일반적으로 TAL 효과기 DNA-결합 도메인 및 DNA 절단 도메인, 즉 DNA 가닥을 절단하는 뉴클레아제를 포함한다. 전사 활성화제-유사 효과기(TALE)는 실질적으로 임의의 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, TALEN은 유전자 편집에 사용하기 위해 또는 게놈을 실시간으로 편집하기 위해 세포 내로 도입될 수 있다.
야생형 FokI 절단 도메인, FokI 엔도뉴클레아제의 일부, 절단 특이성 및 절단 활성을 개선하도록 설계된 돌연변이를 갖는 변이체와 같은 FokI 절단 도메인 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 비특이적 DNA 절단 도메인이 TALEN 작제물에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, FokI 도메인은 적절한 배향 및 간격을 갖는 표적 게놈 내의 부위에 대한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 작제물을 포함하는 이량체로서 기능한다. 일부 구현예에서, TALEN은 엔도뉴클레아제(예를 들어, FokI) 절단 도메인 또는 절단 반-도메인을 포함한다. 개시된 항체는 표적화된 통합을 포함하는 임의의 TALEN-매개 유전자 편집에 사용될 수 있으며; 뉴클레아제-매개 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물은 그 전체가 참조로서 통합된 WO2015127439A1에 기술되어 있다.
아연 핑거 뉴클레아제
아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 징크 핑거 기반 DNA-결합 도메인 및 DNA-절단(즉, 뉴클레아제) 도메인(예를 들어, FokI)으로 이루어진 단백질 키메라이다. ZFN은 DNA 분자 내의 특정 위치에 이중 가닥 절단(DSB; 이중 가닥 DNA 분자의 두 가닥 모두에서 동일하거나 매우 가까운 지점에서 절단)을 도입할 수 있으며, 이는 후속하여 표적화된 게놈 영역을 비활성화, 대체, 삽입 또는 편집하는 데 사용될 수 있다.
아연 핑거는 진핵생물에서 발견되는 가장 흔한 DNA 결합 모티프 중 하나이다. 이들 단백질은 아연 조정에 이용 가능한 시스테인 및 히스티딘 잔기의 수와 위치에 따라 분류된다. 아연 핑거는 2개의 역평행 β 가닥, 및 α 나선으로 구성된다. 아연 이온은 이러한 도메인 유형의 안정성에 매우 중요하다 - 금속 이온이 없는 경우, 도메인은 소수성 코어를 갖기에는 너무 작기 때문에 펴진다. 매우 잘 조사된 아연-핑거의 하나의 서브세트(C2H2 부류)는, 베타 가닥 내의 한 쌍의 시스티딘 잔기 및 아연 이온의 결합을 담당하는 알파 나선 내의 2개의 히스티딘 잔기를 포함한다. 아연 핑거 단백질의 두 가지 다른 부류는 C4 및 C6 부류이다. 아연 핑거는 DNA 및 아연 이온과 상호작용할 경우 DNA-결합 단백질에 대한 독특한 구조적 모티프를 제공하기 때문에, 조절에 있어서 중요하다. 각각의 개별 핑거의 구조는 고도로 보존되고, ββα 접힘부로서 구성되어 아연 이온에 의해 함께 유지되는 약 30개의 아미노산 잔기로 구성된다. α-나선은 핑거의 C-말단 부분에서 발생하는 반면, β-시트는 N-말단 부분에서 발생한다.
ZFN의 DNA-결합 도메인은 이들 도메인의 예상되는 모듈성으로 인해 2개 내지 8개의 아연 핑거 모티프로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, ZFN은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아연 핑거 모티프를 포함한다. 각각의 아연 핑거 모티프는 통상적으로 3-염기 쌍 서열을 인식하고 이에 결합하는 것으로 간주되며, 이와 같이, 더 많은 아연 핑거를 포함하는 단백질은 더 긴 서열을 표적화하며, 따라서 표적 부위에 대한 더 큰 특이성 및 친화도를 갖는다. 선택된 서열에 결합하도록 아연 핑거 결합 도메인을 조작하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Beerli 등, (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo 등, (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등, (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등, (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 등, (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416 참조. 당업계에 공지된 아연 핑거 조작 방법은 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어, 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기에서 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호 참조. 최종 생성물의 요구되는 사양에 따라, 포함된 아연 핑거는 병렬, 순차 또는 이분 기술을 통해 또는 시험관 내 세포 기반 기술을 통해 선택될 수 있다. 파지(phage) 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 및 국제 특허 공개 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; 및 WO 01/88197 참조. 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 강화는, 예를 들어 WO 02/077227에 기술된 바 있다.
FokI의 비-특이적 뉴클레아제 도메인은 그의 천연 DNA-결합 도메인과 기능적으로 독립적이므로 ZFN의 제작에 사용될 수 있다. 이중 가닥 절단을 달성하기 위해 도메인은 이량체화되어야 하기 때문에, 뉴클레아제는 또한 다이어그램에 도시된 바와 같이 그의 표적 서열에 결합된 또 다른 ZFN 분자에 의해 반대 가닥에 결합되어야 한다. 두 표적 부위 모두를 표적으로 하는 ZFN이 존재하는 한, 두 표적 부위가 동일할 필요는 없다. 이량체를 형성하기 위해, 2개의 ZFN 분자는 각각의 인식 부위와 4 내지 6 염기쌍 이상 떨어져 있어야 하지만, 이량체화되지 않을 정도로 너무 멀리 떨어져 있지 않아야 한다. 하나의 ZFN 분자가 하나의 가닥 상에서 그의 표적 서열에 결합하는 반면, 또 다른 ZFN 분자는 다이어그램에 도시된 바와 같이, 반대 가닥 상에서 그의 표적 서열에 결합한다. 뉴클레아제 도메인은 이량체화되고 각각의 가닥은 그 자체의 가닥을 절단하여 DSB를 생성한다. FokI는 동종 또는 이종이량체로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, FokI는 동종이량체이다. 일부 구현예에서, FokI는 이종이량체이다.
RNA-유도 FokI 뉴클레아제
RNA-유도 FokI 뉴클레아제(RFN)는 Cas9 뉴클레아제(Cas9) DNA-결합 도메인 및 DNA-절단 도메인(예를 들어, FokI-절단 도메인)으로 이루어진 단백질 키메라이다. RFN은 5' 말단에서 표적 부위 상보성의 17 내지 20개의 뉴클레오티드를 갖는 가이드 RNA(gRNA)의 사용을 통해 특정 DNA 서열을 특이적으로 표적화한다. DNA 분자 내의 특정 위치에 이중 가닥 절단(DSB; 이중 가닥 DNA 분자의 두 가닥 모두에서 동일하거나 매우 가까운 지점에서 절단)을 도입하고, 후속하여 표적화된 게놈 영역을 비활성화, 대체, 삽입 또는 편집하는 데 사용될 수 있도록, RFN은 FokI DNA 절단 도메인의 이량체화를 필요로 한다.
CRISPR
CRISPR-연관 Cas 시스템은 짧은 RNA를 사용하여 DNA 절단 복합체를 특정 뉴클레오티드 서열로 유도하기 위해 박테리아 및 고세균에서 진화되었다. CRISPR/Cas 시스템은 진핵 세포에서의 게놈 편집에 적합하다. Cas9는 DNA를 권출하고, gRNA의 20개 염기쌍 스페이서 영역에 대한 상보성을 확인하므로, 포유류 세포 게놈에서 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 선행하는 DNA 서열을 특이적으로 표적화한다. DSB의 도입은 2개의 내인성 DNA 복구 메커니즘, 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 또는 상동성-유도 복구(HDR) 중 하나를 통한 표적 서열 변경을 가능하게 한다. CRISPR/Cas 시스템은 또한 표적 서열을 변경하지 않고 전사 억제 및 활성화를 포함하는 유전자 조절에 사용되었다. CRISPR/Cas 시스템에 기초한 표적화된 유전자 조절은 효소적으로 불활성인 Cas9(dCas9)를 사용한다. 프로그램 가능한 dCas9에 대한 추가 Cas9 설명 및 gRNA 요건은 미국 특허 제14/536319호, 제14/320498호, 및 제14/320467호에 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
게놈 편집 시스템
전술한 바와 같이, TALEN, ZFN 및 RFN은 게놈 내의 표적화된 부위에 결합하고 절단할 수 있어서, 특히 복구 템플릿이 제공될 경우, 특이적 DNA 서열의 삽입 또는 결실을 가능하게 한다. 선택적 절단은 DNA 결합 도메인(예를 들어, TAL 효과기 DNA 결합 도메인)에 의한 서열 특이적 표적화 및 FokI 뉴클레아제에 의한 DNA 절단을 통해 달성된다. TALEN 작제물이 표적 유전자좌에서 이중 가닥 절단을 생성한 후, 상동성 재조합 기계는 손상된 염색체와 염색체 외 단편 간의 상동성을 탐색하고, 단편이 원래의 서열을 함유하는지의 여부와 상관없이 염색체의 2개의 파손된 말단 사이의 단편 서열을 복제하여, 관심 유전자를 게놈에 삽입한다.
상동성 매개 유전자 편집에 더하여, TALEN 접근법은 비-상동성 말단 접합에 의해 매개된 유전자 편집(녹아웃 및 삽입)에도 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 표적화된 FokI-매개 뉴클레아제 활성을 갖는 완전한 TALEN을 형성하기 위해 조립되는 "반-TALEN"을 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 핵산 작제물(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 표적화된 FokI-매개 뉴클레아제 활성을 갖는 "반-TALEN"을 암호화하는 2개 또는 4개의 핵산 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이량체 TALEN, 또는 2개의 "반-TALEN"을 포함하는 TALEN을 암호화한다.
일부 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 뉴클레아제 절단 후 게놈 삽입을 거치는 공여자 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 서열은 재조합이 필요한 게놈 서열과 동일성을 공유하는 하나 이상의 상동성 영역(들)을 가질 것이다. 일부 구현예에서, 공여자 서열은 재조합이 필요한 게놈 서열과 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 상동성 영역(들)을 가질 것이다. 일부 구현예에서, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9%의 서열 동일성이 상동성 영역에 걸쳐 존재한다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 길이에 따라, 1% 내지 100%의 임의의 서열 동일성의 값이 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 요법의 일부로서, DNA는 공여자 DNA가 발현되고 이에 의해 암호화된 치료제가 생산되는 방식으로 선택된 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 공여자 DNA는, 일부 방식으로는 치료 생성물을 암호화하는 DNA의 발현을 매개할 수 있거나, 일부 방식으로는 치료 생성물의 발현을 직접 또는 간접적으로 매개하는 펩티드 또는 RNA와 같은 산물을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 유전적인 결함 또는 결핍으로부터 기인하는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 치료제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 유전적 결함 또는 결핍으로부터 기인하는 암 또는 임의의 다른 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 치료제를 암호화한다. 일부 구현예에서, 공여자 DNA는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다.
게놈 편집을 위한 기술 및 프로토콜은 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, US 제2005/0215502호; US 제2007/0134796호; WO 2005/084190; WO2014204578, Urnov 등, Nature Reviews Genetics 11, 636-646 (2010); Rahman 등, Human Gene Therapy 22(8): 925-933 (2011); Tsai 등, Nature Biotechnology (2014) 32: 569-576; 및 Collins 등, Proceedings Biological Sciences / The Royal Society, 282(1821):pii 20143003 (2015) 참조. 예를 들어, 게놈 편집은 생체 내 또는 생체 외(예를 들어, 시험관 내)에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법은 TALEN, ZFN 또는 RFN을 암호화하는 핵산을 포유류 세포 또는 표적 조직에 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 세포에 TALEN, ZFN 또는 RFN을 암호화하는 핵산을 투여하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 폴록사머 또는 리포좀과 같은 전달 운송체와 복합체화된 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, TALEN, ZFN 또는 RFN을 암호화하는 핵산은 전기천공을 통해 형질감염된다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 전달 시스템은 미세주입에 의한 것과 같은 TALEN-, ZFN- 또는 RFN-암호화 mRNA의 직접 전달을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는다. 바이러스 벡터 전달 시스템의 예는 인테그라아제 결핍 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스에 기초한 벡터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 게놈 편집 시스템의 성분은 대상체에게 투여되기 전에 혼합된다. 일부 구현예에서, 게놈 편집 시스템의 성분은 별도로 투여된다. 게놈 편집 성분의 별도의 투여는 결정된 기간에 의해 본질적으로 동시에, 순차적으로 또는 분리될 수 있다.
본원에서, 시료에서 FokI를 검출 및/또는 측정하기 위한 고도로 민감하고 신뢰성 있는 방법이 기술된다. 본원에서 나타낸 바와 같이, 이들 방법은 FokI를 생리학적 수준으로 검출할 수 있다.
검출 모이어티
본원에서 사용되는 검출 모이어티는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 구조의 모이어티를 포함한다. 검출 모이어티는 검출 가능한 임의의 요소, 분자, 작용기, 화합물, 단편 또는 모이어티를 지칭한다. 검출 모이어티는, 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 135I, 125I, 123I, 64Cu, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, 89Zr 등), 형광 염료(예를 들어, 형광 염료, 아크리딘 염료, SYBR 염료, 로다민 염료, 옥사진 염료, 등). 화학발광제(예를 들어, 아크리디늄 에스테르, 안정화된 디옥세탄, 등), 전기화학발광제(예를 들어, 술포 태그(Sulfo Tag)), 생물발광제(예를 들어, 루시페린), 스펙트럼적으로 용해 가능한 무기 형광 반도체 나노결정(즉, 양자점), 금속 나노입자(예를 들어, 금, 은, 구리, 백금, 등). 나노클러스터, 상자성 금속 이온, 효소(예를 들어, 서양고추냉이 과산화효소, 알칼리 인산분해효소, 등). 비색 라벨(예를 들어, 염료, 콜로이드성 금, 등), 비오틴, 디곡시게닌, 합텐, 및 항혈청 또는 단클론 항체를 사용할 수 있는 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 항-FokI 항체는 검출 모이어티와 연관된다. 항-FokI 항체는 검출 모이어티와 공유 또는 비공유 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 모이어티는 술포-태그, 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 인산분해효소, FITC, 디곡시게닌, 아크리단, RPE, 루시페린, 형광단, 발색단, 방사성 동위원소, 또는 비오틴으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 검출 모이어티는 전기화학발광(ECL) 표지이다. 일반적으로, ECL-기반 분석은 전기화학발광 화합물을 표지(본원에서는 ECL 표지로 지칭됨)로서 사용하는 것을 포함한다. 전기화학발광이 가능한 임의의 화합물이 ECL 표지로서 사용될 수 있다. ECL 표지의 예는, 예를 들어, Re, Ru, Ir 및 Os를 포함하는 VII 및 VIII 족의 금속으로부터, 금속이 유래된 트리스-비피리딜-루테늄(RuBpy) 모이어티와 같은 유기금속 화합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, ECL 표지는 술포-태그 표지이다. ECL 공정에서 ECL 표지와 반응하는 종은 본원에서 ECL 코어활성제로서 지칭된다. ECL에 대해 일반적으로 사용되는 코어활성제는 3차 아민(예를 들어, 트리프로필아민(TPA)), 옥살레이트, 및 퍼술페이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-TALEN 항체는 검출 모이어티와 연관된다. 검출 모이어티는 공유 접합을 통해 또는 비-공유 연관을 통해 항-TALEN 항체와 연관될 수 있다. 항-TALEN 항체에 대한 검출 모이어티의 공유 접합은 직접적으로 이루어지거나 링커를 통해 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 모이어티는 ECL 태그(예를 들어, 술포-태그), 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 인산분해효소, FITC, 디곡시게닌, 아크리단, RPE, 루시페린, 형광단, 발색단, 방사성 동위원소, 또는 비오틴으로부터 선택된다.
본원에 기술된 항-TALEN 항체는 면역분석에서 검출 모이어티의 존재 또는 강도를 측정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 분석에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분자(예를 들어, TALEN 단백질)를 포함하는 FokI의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의한 전기화학발광, 발광, 형광, 또는 흡광도를 측정하는 단계를 포함한다. 검출 단계는 정량적 측정을 포함할 수 있으며, 이는 샘플 내의 FokI 폴리펩티드의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. FokI의 존재 또는 강도를 결정하기 위한 측정(들)은 수동 방법에 의해 수행될 수 있거나, 분석기와 같은 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 검출 모이어티는 유색 출력을 생성할 수 있다. 방법은 유색 생성물의 시각적 외관 및/또는 유색 생성물의 검출 또는 정량화에 사용될 수 있는 분석기와 같은 기기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 단계는, 상업적으로 이용 가능한 기기를 사용하여 수행될 수 있는 전기화학발광의 측정을 포함한다.
일부 구현예에서, 검출 모이어티는 형광 표지, 광색소 화합물, 단백질성 형광 표지, 자기 표지, 방사성 표지, 또는 합텐이다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 표지는, Atto 염료, 알렉사 플루오르 염료, 양자 점, 히드록시쿠마린, 아미노쿠라민, 메톡시쿠마린, 캐스케이드 블루, 퍼시픽 블루, 퍼시픽 오렌지, 루시퍼 옐로우, NBD, R-피코에리트린(PE), PE-Cy5 접합체, PE-Cy7 접합체, 적색 613, PerCP, TruRed, FluorX, Fluorescein, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-로다민, 리사민 로카민 B, 텍사스 레드, 알로피코시아닌(APC), APC-Cy7 접합체, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP(Y66H 돌연변이), GFP(Y66F 돌연변이), EBFP, EBFP2, 아주리트, GFPuv, T-사파이어, 세루린, mCFP, mTurquoise2, ECFP, CyPet, GFP(Y66W 돌연변이), mKeima-Red, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP(S65A 돌연변이), 미도리시 시안, 야생형GFP, GFP(S65C 돌연변이), TurboGFP, TagGFP, GFP(S65L 돌연변이), 에머랄드, GFP(S65T 돌연변이), EGFP, 아자미 그린, ZsGreen1, TagYFP, EYFP, 토파즈, 비너스, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsYellow1, Kusabira 오렌지, mOrange, 알로피코시아닌(APC), mKO, TurboRFP, tdTomato, TagRFP, DsRed 단량체, DsRed2, mStrawberry, TurboFP602, AsRed2, mRFP1, J-Red, R-피코에리트린(RPE), B-피코에리트린(BPE), mCherry, HcRed1, Katusha, P3, 페리디닌 엽록소(PerCP), mKate(TagFP635), TurboFP635, mPlum, 및 mRaspberry로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광표지이다.
2형 제한 효소 FokI
FokI는 플라보박테리움 오케아노코이테스에서 자연적으로 발견되는 박테리아 IIS형 제한 엔도뉴클레아제이다. 천연 FokI는 N-말단 DNA-결합 도메인 및 C-말단에서의 비특이적 DNA 절단 도메인으로 구성된다. (UniProt 수탁 번호 P14870) 전장 야생형 FokI 아미노산 서열은 다음과 같다:
MFLSMVSKIRTFGWVQNPGKFENLKRVVQVFDRNSKVHNEVKNIKIPTLVKESKIQKELVAIMNQHDLIYTYKELVGTGTSIRSEAPCDAIIQATIADQGNKKGYIDNWSSDGFLRWAHALGFIEYINKSDSFVITDVGLAYSKSADGSAIEKEILIEAISSYPPAIRILTLLEDGQHLTKFDLGKNLGFSGESGFTSLPEGILLDTLANAMPKDKGEIRNNWEGSSDKYARMIGGWLDKLGLVKQGKKEFIIPTLGKPDNKEFISHAFKITGEGLKVLRRAKGSTKFTRVPKRVYWEMLATNLTDKEYVRTRRALILEILIKAGSLKIEQIQDNLKKLGFDEVIETIENDIKGLINTGIFIEIKGRFYQLKDHILQFVIPNRGVTKQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF (서열번호 2)
FokI DNA 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 대해 독립적으로 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, FokI 폴리펩티드는 FokI 뉴클레아제 도메인으로 구성되거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, FokI 촉매 도메인 폴리펩티드는 서열번호 2의 야생형 아미노산 439 내지 583이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-TALEN 항체는 서열번호 1을 포함하는 분자에 결합한다.
MKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF (서열번호 1)
일부 구현예에서, FokI 단백질은 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 FokI 단백질은 야생형 FokI 촉매 도메인(서열번호 1)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, FokI 단백질은 FokI의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성 단편은 FokI의 촉매 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, FokI 단백질은 FokI의 DNA-절단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, FokI 단백질은 서열번호 1과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20개 또는 그 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
샘플 유형
본 개시의 샘플 유형은 FokI 촉매 도메인을 포함하는 TALEN 단백질 또는 분자를 가지고 있거나, 가지고 있는 것으로 의심되거나, 가지고 있을 가능성이 있거나, 가지고 있는 것으로 확인된 임의의 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 시험관 내 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 생체 내 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 생물학적 기원의 것이다(예를 들어, 생물학적 샘플). 생물학적 샘플은 한때 살아있는 유기체의 일부였던 모든 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 포유동물 유래이다. 포유류는 인간, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 비인간 영장류 및 라마를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 인간은 임의의 연령일 수 있다. 생물학적 샘플은 임의의 형태를 취할 수 있고, 세포, 조직, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 타액, 제대혈, 정자, 수성 또는 유리 체액, 융모막 융모 샘플, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 포르말린 고정 샘플, 생체 외 성장 조직 또는 세포 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 샘플, 예를 들어, 혈청 샘플은 TALEN 또는 FokI 단백질의 존재(또는 부재) 또는 수준에 대해 분석되어야 한다.
키트
또한, 본원에 기술된 바와 같은 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플)에서 FokI를 검출 및/또는 측정하는 데 사용하기 위한 키트가 본원에 제공된다. 이러한 키트는 일반적으로 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 기물, 시약 및/또는 물질을 포함한다. 키트는 이러한 방법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다. FokI를 검출 및/또는 측정하기 위한 키트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 샘플을 분석하는 데 필요한 다양한 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 마이크로플레이트형 분석 키트와 같은 복수의 시료의 동시 또는 거의 동시 분석을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약 및 물질이 일회 사용이고/이거나 분석 수행 후 폐기되도록, 키트는 일회용일 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플에서 FokI를 검출 및/또는 측정하는 데 사용하기 위한 키트는, 본원에 기술되고 선택적으로 검출 모이어티에 접합된 항-TALEN 항체를 포함하거나, 키트의 사용이 이러한 접합을 수행할 수 있게 하는 물질을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 FokI 검출 키트의 기질은 본원에 기술된 항-FokI 항체와 FokI 함유 복합체의 연관을 허용하는 임의의 적절한 형태를 취할 수 있다. 일부 구현예에서, 기질은 마이크로플레이트 내 또는 마이크로플레이트의 일부에 함유된다. 당업계에 공지된 임의의 적절한 검출 모이어티가 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출 모이어티는 ECL 태그(예를 들어, 술포-태그), 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 인산분해효소, FITC, 디곡시게닌, 아크리단, RPE, 루시페린, 형광단, 발색단, 방사성 동위원소, 또는 비오틴을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 임의의 적절한 검출 방법이 본원에 기술된 FokI 검출 키트와 함께 사용될 수 있다. 키트는 신호의 검출 또는 측정을 수행하기 위한 시약, 재료 및/또는 기구를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 키트의 사용은 전기화학발광, 발광, 형광, 또는 흡광도의 측정을 포함하는 신호의 검출을 포함할 수 있다. 항-FokI 검출 분석과 연관된 신호의 검출은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 관련 키트는 특정 검출 방법에 대한 지침을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 표준 검출 방법을 사용자에게 지시할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 사용자에게 검출을 위한 다른 기기와 관련된 지침을 따르도록 지시할 수 있다.
대표적인 용도
일부 구현예에서, 본 개시의 방법 및 키트는 CAR T 요법과 같은 세포 또는 유전자 요법의 평가 및/또는 모니터링에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유전자 요법은 ZFN-기반 유전자 요법이다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유전자 요법은 RFN-기반 유전자 요법이다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 TALEN-기반 유전자 요법이다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유전자 요법은 DNA 작제물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유전자 요법은 mRNA 대체 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유전자 요법은 동종 또는 자가 세포 치환을 포함할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR) 기반 요법과 같은 세포 대체 요법을 포함한다. 세포 대체 요법은 FokI 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 핵산 작제물로 형질도입되거나 형질감염된 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 또는 유전자 요법을 평가 및/또는 모니터링하기 위한 샘플은 요법의 개시 전에 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 최초의 세포 또는 유전자 요법 치료 또는 투여 후에 수득된다. 일부 구현예에서, 샘플은 유전자 치료가 종료된 후에 수득된다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 또는 유전자 요법이 수행되기 전, 수행되는 동안 또는 수행된 후에 특정 시점, 간격, 또는 임의의 다른 시간 척도에서 수득된다. 일부 구현예에서, FokI 검출은 세포 또는 유전자 요법에 대한 가능성을 평가하는 데 사용된다.
치료 방법
일부 구현예에서, 본 개시의 항-TALEN 항체는 CAR 요법과 같은 유전자 요법 또는 세포 대체 요법의 평가 및/또는 모니터링에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 TALEN 단백질로 조작된 세포 집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 면역 세포를 함유하는 CAR은 바이오마커의 암을 포함하는 비정상적인 발현을 포함하는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 면역 세포를 함유하는 CAR은 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)과 같은 비호지킨 림프종, 백혈병(예를 들어, CLL 또는 ALL), 다발성 골수종(MM), 소세포 폐암, 흑색종, 저등급 신경교종, 교아세포종, 갑상선 수질암, 카르시노이드, 췌장, 방광 및 전립선의 분산된 신경내분비 종양, 고환암, 및 신경내분비 특징을 갖는 폐 선암종을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 고형 종양 및 혈액 유래 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 "암"은 방광, 뼈 또는 혈액, 뇌, 유방, 자궁경부, 흉부, 결장, 내막, 식도, 눈, 머리, 신장, 간, 림프절, 폐, 구강, 목, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 위, 고환, 인후 및 자궁의 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 피부 조직, 기관, 혈액 및 혈관의 질환을 지칭한다. 특이적 암은, 진행성 악성종양, 아밀로이드증, 신경 모세포종, 수막종, 혈관 주위 세포종, 다발성 뇌 전이, 교모세포종 다형, 교모세포종,뇌간 신경교종, 악성 뇌종양의 나쁜 예후, 악성 신경아교종, 재발성 악성 골종, 역형성 성상세포종, 역형성 희소돌기아교종, 신경내분비종양, 직장 선암종, Dukes C & D 대장암, 절제 불가능한 대장암, 전이성 간세포 암종, 카포시 육종, 핵형 급성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 피부 T 세포 림프종, 피부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 저등급 여포성 림프종, 악성 흑색종, 악성 중피종, 악성 흉수 중피종 증후군, 복막 암종, 유두 장액 암종, 부인과 육종, 연조직 육종, 경피증, 피부 혈관염, 랑게르한스 세포 조직구증, 평활근육종, 진행성 골화섬유형성이상, 호르몬 불응성 전립선암, 절제된 고위험 연조직 육종, 절제 불가능한 간세포암종, Waldenstrom 거대 글로불린 혈증, 다발성골수종, 지연성 골수종, 나팔관암, 안드로겐 의존성 전립선암, 안드로겐 의존성 IV기 비전이성 전립선암, 호르몬 불감수성 전립선암, 화학요법 치료성 전립선 암, 유두상 갑상선암, 여포성 갑상선암, 갑상선 수질암, 및 평활근종을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 암은 전이성이다. 또 다른 구현예에서, 암은 화학요법 또는 방사선에 불응성이거나 내성이다. 추가의 구현예에서, 암은 목표치보다 적은 것으로 결정된 정도로 감소되었고, 재치료가 적절한 것으로 결정되었다.
실시예
실시예 1: 항-TALEN 항체의 생성
하이브리도마 세포의 생성을 위해, 야생형 Balb/c 마우스를 C-말단 6xHis 태그 및 GSGS 링커를 포함하는 FokI 촉매 도메인 단백질로 면역화하였다. 반복 면역화 다중 부위(RIMMS)를 사용하여, 면역화 12일차의 Balb/c 마우스로부터의 세포를 융합시켜 하이브리도마 융합 #2296을 수득하였다. 생성된 항체를 ELISA 양성에 대해 FokI 촉매 도메인 상에서 스크리닝하고, His-태그 항원을 사용하여 카운터 스크리닝하였다. 샘플을 또한 C-말단 6xHis 태그 및 GSGS 링커를 포함하는 전장 TALEN 단백질에 대해 스크리닝하였다. 웨스턴 블롯으로 항체를 분석하고, 결합 확인 및 동역학을 위해 Biacore®를 사용해 평가하였다.
융합 #2296으로부터 수득된 항체는 FokI 및 전장 TALEN 단백질에 대해 스크리닝된 30개 이상의 ELISA 양성을 생성하였다. 이들 항체는 His-태그 항원에서 음성이었다. 융합 #2296 항체의 Biacore® 분석은 5 nM 내지 100 nM 범위의 kD 값을 생성하였다. 다음의 표 2는 융합 #2296 RIMMS 12일차의 Biacore® 동역학을 나타낸다.
융합 2296의 Biacore® 동역학
리간드 분석물질 k a (1/Ms) k d (1/초) t 1/2 (분) K D (nM) FokI 또는
TALEN 결합(Y/N/A)
A01_1A8 FokI 5.51E+03 3.51E-04 32.9 63.7 Y
A01_1A8 TALEN Y
A02_7E12 FokI 2.72E+03 4.72E-04 24.5 174 Y
A02_7E12 TALEN Y
A03_14H5 FokI 5.47E+04 7.09E-04 16.3 13.0 Y
A03_14H5 TALEN Y
A05_1G2 FokI 7.87E+05 3.16E-02 0.4 40.2 Y
A05_1G2 TALEN Y
B04_22A5 FokI 1.01E+06 4.62E-02 0.3 45.7 Y
B04_22A5 TALEN Y
B05_2G3 FokI 1.18E+04 6.15E-04 18.8 52.1 Y
B05_2G3 TALEN Y
C03_17B5 FokI 2.02E+05 5.01E-03 2.3 24.8 Y
C03_17B5 TALEN Y
C04_22C12 FokI 1.83E+04 4.83E-04 23.9 26.4 Y
C04_22C12 TALEN Y
D02_10B4 FokI 5.86E+05 4.36E-03 2.6 7.4 Y
D02_10B4 TALEN Y
D04_23D1 FokI 2.63E+04 6.20E-04 18.6 23.6 Y
D04_23D1 TALEN Y
E01_2D7 FokI 7.45E+05 1.48E-02 0.8 19.9 Y
E01_2D7 TALEN Y
E02_10D7 FokI 5.15E+05 1.96E-02 0.6 38.1 Y
E02_10D7 TALEN Y
G01_5E11 FokI 5.35E+05 2.01E-02 0.6 37.6 Y
G01_5E11 TALEN Y
G02_11D2 FokI 1.59E+05 8.91E-04 13.0 5.6 Y
G02_11D2 TALEN Y
G03_20F9 FokI 1.49E+06 4.65E-02 0.2 31.2 Y
G03_20F9 TALEN Y
G04_1A1 FokI 5.00E+03 5.15E-04 22.4 103 Y
G04_1A1 TALEN Y
H01_6H4 FokI 2.97E+05 1.87E-03 6.2 6.3 Y
H01_6H4 TALEN Y
H02_13B2 FokI 1.06E+06 3.21E-02 0.4 30.3 Y
H02_13B2 TALEN Y
하이브리도마 융합 #2299 세포를 장기 면역화로부터 94일차에 수득하였다. 항체 역가가 더 높은 Balb/c 마우스 #2299를 융합을 위해 선택하였다. 융합 #2299으로부터 수득된 항체는 FokI 및 전장 TALEN 단백질에 대해 스크리닝된 68개 이상의 ELISA 양성을 생성하였다. 이들 항체는 His-태그 항원에서 음성이었다. 융합 #2299 항체의 Biacore® 분석은 서브 nM 내지 100 nM 범위의 kD 값을 생성하였다. 상위 12개의 ELISA 결합체 중 5개는 상청액과 함께 웨스턴 블롯 분석에서 양성이었다(도 1). 표 3은 융합 #2299로부터의 예시적인 항체의 Biacore® 동역학을 나타낸다.
융합 2299의 Biacore® 동역학
리간드 분석물질 k a (1/Ms) k d (1/초) t 1/2 (분) K D (nM) FokI 또는 TALEN 결합(Y/N/A)
D04_4C7 FokI 3.32E+05 1.26E-04 91.69 0.38 Y
C09_9H1 FokI 5.72E+04 9.38E-05 123.16 1.64 Y
A02_1G2 FokI 3.63E+04 6.12E-05 188.77 1.69 Y
C02_1G12 FokI 5.94E+04 1.16E-04 99.59 1.95 Y
A04_4B10 FokI 1.02E+05 2.33E-04 49.58 2.28 Y
G02_2E5 FokI 1.10E+05 2.73E-04 42.32 2.48 Y
E01_1D1 FokI 7.43E+04 1.91E-04 60.48 2.57 Y
H08_8H12 FokI 2.39E+06 9.98E-03 1.16 4.18 Y
B02_1G6 FokI 1.01E+05 4.36E-04 26.50 4.32 Y
E02_2D12 FokI 7.09E+04 3.29E-04 35.11 4.64 Y
D01_1C10 FokI 7.47E+04 3.96E-04 29.17 5.30 Y
G09_2299.8C5 FokI 1.58E+05 1.21E-03 9.55 7.66 Y
F08_8F3 FokI 2.92E+04 2.59E-04 44.60 8.87 Y
F09_2299.4D4.1 FokI 1.06E+04 1.39E-04 83.11 13.11 Y
G07_7D2 FokI 9.06E+05 1.48E-02 0.78 16.34 Y
B08_7G8 FokI 9.16E+05 1.51E-02 0.77 16.48 Y
H05_6A6 FokI 6.65E+03 1.17E-04 98.74 17.59 Y
F07_7B11 FokI 6.60E+05 1.75E-02 0.66 26.52 Y
A01_1A4 FokI 7.66E+05 2.05E-02 0.56 26.76 Y
A09_9D1 FokI 5.85E+05 2.74E-02 0.42 46.84 Y
G04_4F11 FokI 6.99E+03 3.32E-04 34.80 47.50 Y
H01_1F12 FokI 4.30E+03 2.10E-04 55.01 48.84 Y
E07_7A11 FokI 5.23E+05 2.60E-02 0.44 49.71 Y
H02_2E8 FokI 9.54E+03 4.78E-04 24.17 50.10 Y
C03_3D1 FokI 5.27E+05 3.56E-02 0.32 67.55 Y
E04_4D4 FokI 2.45E+05 < 8.55E-05 > 135 < 0.35 Y
F04_4D12 FokI 2.42E+05 < 8.55E-05 > 135 < 0.35 Y
C04_4C6 FokI 9.12E+04 < 8.55E-05 > 135 < 0.94 Y
A08_7F11 FokI 7.57E+04 < 8.55E-05 > 135 < 1.13 Y
D08_8D2 FokI 7.23E+04 < 8.55E-05 > 135 < 1.18 Y
F05_5G9 FokI 6.45E+04 < 8.55E-05 > 135 < 1.33 Y
E05_5F5 FokI 5.84E+04 < 8.55E-05 > 135 < 1.46 Y
B04_4B11 FokI 4.81E+04 < 8.55E-05 > 135 < 1.78 Y
C08_8C7 FokI 4.81E+04 < 8.55E-05 > 135 < 1.78 Y
추가 분석 및 분석 개발을 위해 다음의 표 4에 나타낸 정제된 항체를 선택하였다.
항체 패널 요약
리간드 분석물질 k a (1/Ms) k d (1/초) t 1/2 (분) K D (nM) FokI 또는 TALEN 결합(Y/N/A) ELISA 웨스턴 블롯
2299.2G3.C6 FokI 1.77E+04 < 8.55E-05 > 135 < 4.83 Y + +
2299.5D4.C8 FokI 1.12E+04 < 8.55E-05 > 135 < 7.63 Y + +
2299.6B3.B8.B6 FokI 9.87E+03 < 8.55E-05 > 135 < 8.66 Y + +
2299.6G5.C7 FokI 5.27E+03 < 8.55E-05 > 135 < 16.2 Y + +
2299.7F11.B4 FokI 7.57E+04 < 8.55E-05 > 135 < 1.13 Y + +
2296.14H5.C10 FokI 1.39E+03 6.81E-04 16.96 489.93 Y +/- -
2296.17B5.A4 FokI 8.33E+04 9.40E-04 12.29 11.28 Y + -
2296.23D1.B2 FokI 2.31E+03 6.31E-04 18.31 273.16 Y +/- -
등가물 및 범위
당업자는 본원에 기술된 바와 같은 본 개시의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 개시의 범위는 전술한 설명에 한정되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 다음의 청구범위에 기재된 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> ALLOGENE THERAPEUTICS, INC. <120> ANTI-TALEN ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> AT-021/02 <140> <141> <150> 62/861,214 <151> 2019-06-13 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 154 <212> PRT <213> Flavobacterium okeanokoites <400> 1 Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys 1 5 10 15 His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly 20 25 30 Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly 35 40 45 Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val 50 55 60 Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp 65 70 75 80 Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser 85 90 95 Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His 100 105 110 Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile 115 120 125 Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg 130 135 140 Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe 145 150 <210> 2 <211> 583 <212> PRT <213> Flavobacterium okeanokoites <400> 2 Met Phe Leu Ser Met Val Ser Lys Ile Arg Thr Phe Gly Trp Val Gln 1 5 10 15 Asn Pro Gly Lys Phe Glu Asn Leu Lys Arg Val Val Gln Val Phe Asp 20 25 30 Arg Asn Ser Lys Val His Asn Glu Val Lys Asn Ile Lys Ile Pro Thr 35 40 45 Leu Val Lys Glu Ser Lys Ile Gln Lys Glu Leu Val Ala Ile Met Asn 50 55 60 Gln His Asp Leu Ile Tyr Thr Tyr Lys Glu Leu Val Gly Thr Gly Thr 65 70 75 80 Ser Ile Arg Ser Glu Ala Pro Cys Asp Ala Ile Ile Gln Ala Thr Ile 85 90 95 Ala Asp Gln Gly Asn Lys Lys Gly Tyr Ile Asp Asn Trp Ser Ser Asp 100 105 110 Gly Phe Leu Arg Trp Ala His Ala Leu Gly Phe Ile Glu Tyr Ile Asn 115 120 125 Lys Ser Asp Ser Phe Val Ile Thr Asp Val Gly Leu Ala Tyr Ser Lys 130 135 140 Ser Ala Asp Gly Ser Ala Ile Glu Lys Glu Ile Leu Ile Glu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Pro Pro Ala Ile Arg Ile Leu Thr Leu Leu Glu Asp Gly 165 170 175 Gln His Leu Thr Lys Phe Asp Leu Gly Lys Asn Leu Gly Phe Ser Gly 180 185 190 Glu Ser Gly Phe Thr Ser Leu Pro Glu Gly Ile Leu Leu Asp Thr Leu 195 200 205 Ala Asn Ala Met Pro Lys Asp Lys Gly Glu Ile Arg Asn Asn Trp Glu 210 215 220 Gly Ser Ser Asp Lys Tyr Ala Arg Met Ile Gly Gly Trp Leu Asp Lys 225 230 235 240 Leu Gly Leu Val Lys Gln Gly Lys Lys Glu Phe Ile Ile Pro Thr Leu 245 250 255 Gly Lys Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ile Ser His Ala Phe Lys Ile Thr 260 265 270 Gly Glu Gly Leu Lys Val Leu Arg Arg Ala Lys Gly Ser Thr Lys Phe 275 280 285 Thr Arg Val Pro Lys Arg Val Tyr Trp Glu Met Leu Ala Thr Asn Leu 290 295 300 Thr Asp Lys Glu Tyr Val Arg Thr Arg Arg Ala Leu Ile Leu Glu Ile 305 310 315 320 Leu Ile Lys Ala Gly Ser Leu Lys Ile Glu Gln Ile Gln Asp Asn Leu 325 330 335 Lys Lys Leu Gly Phe Asp Glu Val Ile Glu Thr Ile Glu Asn Asp Ile 340 345 350 Lys Gly Leu Ile Asn Thr Gly Ile Phe Ile Glu Ile Lys Gly Arg Phe 355 360 365 Tyr Gln Leu Lys Asp His Ile Leu Gln Phe Val Ile Pro Asn Arg Gly 370 375 380 Val Thr Lys Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu 385 390 395 400 Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile 405 410 415 Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val 420 425 430 Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly 435 440 445 Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile 450 455 460 Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn 465 470 475 480 Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn 485 490 495 Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr 500 505 510 Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe 515 520 525 Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn 530 535 540 Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu 545 550 555 560 Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe 565 570 575 Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe 580 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Ala Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Ala Pro Thr Phe Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Leu Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys His Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Met Lys Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Ala Lys Pro Ala Phe Gly Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala His 65 70 75 80 Leu His Ile Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Ala Pro Thr Phe Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Ala Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Glu Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Lys Glu Gly Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Arg Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Lys Met Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Gly Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Phe Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Phe Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Phe Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp Tyr Ser Ile His 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Asn Thr Glu Thr Gly Ala 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Asn Thr Glu Thr Ala Lys 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Asn Thr Glu Thr Gly Asp 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Ala Pro Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Ala Lys Pro Ala Phe Gly Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Glu Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Glu Gly Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Lys Gln Ser Tyr Asn Phe Arg Thr 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Lys Gln Ser Phe Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 29 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ttgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaagcaggct 120 ccaggagagg gtttaaagtg gatggcctgg ataaacactg agactggtgc gccaacattt 180 gcagatgact tcaagggacg gttagccctc tctttggaga cttctgccaa cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa acatgaagac acggctacat atttctgtgc taaagaaggt 300 ggtttctact tttatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 30 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc cgggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc agcagtcgaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccaac agaaaccagg gcaggctcct aaaatgctga tttcctgggc atccactagg 180 gaatttgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatttg ggacagattt cactctcacc 240 attagcagtg tgcagggtga ggacctggca gtttattact gcaaacaatc ttataatttt 300 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 31 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ttgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaagcaggct 120 ccaggagagg gtttaaagtg gatggcctgg ataaacactg agactggtgc gccaacattt 180 gcagatgact tcaagggacg gttagccctc tctttggaga cctctgccaa cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa acatgaagac acggcaacat atttctgtgc taaagaaggt 300 ggtttctact tttatgctat ggactattgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcttca 360 <210> 32 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta tgccttcaca gactattcaa tacactggat gaagcaggct 120 ccaggagagg gtctacagtg gatgggctgg ataaacactg agactgctaa gccagcattt 180 ggagatgact tcaagggacg gtttgccttt tctttggaaa cctctgccaa cactgcccat 240 ttgcacatca acaacctcag aactgaagac acggctacat atttctgtgc taaagaaggt 300 ggtttctact tttatgctat ggactattgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 33 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ttgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtgc gccaacattt 180 gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgccttt 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaagac acggctacat atttctgtgc taaggaaggt 300 ggtttctact tttacgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcgctcac cgtctcctca 360 <210> 34 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cctctggtta taccttcaca gactactcaa tacactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatggcctgg ataaacactg agactggtga cccaacatat 180 gaagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgttc taaagaaggt 300 ggtttctact tttatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 35 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgctc agcagtcgaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccaac agaaaccagg gcaggctcct aaactgctga tctcctgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagaatt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga ggacctggca gtttattact gcaaacaatc ttataatctt 300 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 36 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgaactgca aatccagtca gagtctgctc agcagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc ttccactagg 180 gactctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggcaga ggacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatttt 300 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 37 <211> 336 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Thr Cys Ala Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala 50 55 60 Gly Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr 85 90 95 Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr 100 105 110 Ala Cys Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala 115 120 125 Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly 130 135 140 Gly Cys Thr Cys Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala 145 150 155 160 Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys 165 170 175 Thr Ala Gly Gly Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys 180 185 190 Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly 195 200 205 Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys 210 215 220 Ala Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys 225 230 235 240 Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly 245 250 255 Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr 260 265 270 Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala 275 280 285 Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys 305 310 315 320 Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala 325 330 335 <210> 38 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc agcagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga ttaaatgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

Claims (43)

  1. 서열번호 3과 적어도 85% 동일한 가변 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 7과 적어도 85% 동일한 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간화된, 항-TALEN 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, dAb, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, IgE 항체, IgD 항체, IgM 항체, IgG1 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG1 항체, IgG2 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG2 항체, IgG3 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG3 항체, IgG4 항체, 힌지 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 IgG4 항체, 적어도 하나의 비-자연 발생 아미노산을 포함하는 항체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-TALEN 항체.
  4. 제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄(HC)을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 12 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 15 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2를 포함하는, 항-TALEN 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 21을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3을 포함하되, 각각의 CDR은 상기 표 1c에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  9. 제4항의 항원 결합 분자의 VH와 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항체는 서열 번호 7 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호 22를 포함하는 경쇄 CDR1을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  12. 제10항에 있어서, 서열번호 23 내지 25로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2를 포함하는, 항-TALEN 항체.
  13. 제10항에 있어서, 서열번호 26 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  14. 제10항에 있어서, 상기 경쇄는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하되, 각각의 CDR은 상기 표 1d의 아미노산 서열을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  15. 제10항의 항원 결합 분자의 VL과 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는, 항-TALEN 항체.
  16. 항-TALEN 항체로서,
    (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  17. 제16항에 있어서,
    (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및
    (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  18. 항-TALEN 항체로서,
    (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  19. 제18항에 있어서,
    (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및
    (b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  20. 항-TALEN 항체로서,
    (a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  21. 제20항에 있어서,
    (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및
    (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  22. 항-TALEN 항체로서,
    (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  23. 제22항에 있어서,
    (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및
    (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  24. 항-TALEN 항체로서,
    (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  25. 제24항에 있어서,
    (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및
    (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  26. 항-TALEN 항체로서,
    (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  27. 제24항에 있어서,
    (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및
    (b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  28. 항-TALEN 항체로서,
    (a) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
    (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
    (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
    (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
    (e) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및
    (f) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  29. 제24항에 있어서,
    (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및
    (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는,
    항-TALEN 항체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항체는 검출 가능한 표지를 추가로 포함하는, 항-TALEN 항체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광 표지, 광색소 화합물, 단백질성 형광 표지, 자기 표지, 방사성 표지, 및 합텐으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-TALEN 항체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 형광 표지는, Atto 염료, 알렉사플루오르 염료, 양자 점, 히드록시쿠마린, 아미노쿠라민, 메톡시쿠마린, 캐스케이드 블루, 퍼시픽 블루, 퍼시픽 오렌지, 루시퍼 옐로우, NBD, R-피코에리트린(PE), PE-Cy5 접합체, PE-Cy7 접합체, 적색 613, PerCP, TruRed, FluorX, Fluorescein, BODIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, TRITC, X-로다민, 리사민 로카민 B, 텍사스 레드, 알로피코시아닌(APC), APC-Cy7 접합체, Indo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, SNARF, GFP(Y66H 돌연변이), GFP(Y66F 돌연변이), EBFP, EBFP2, 아주리트, GFPuv, T-사파이어, 세루린, mCFP, mTurquoise2, ECFP, CyPet, GFP(Y66W 돌연변이), mKeima-Red, TagCFP, AmCyan1, mTFP1, GFP(S65A 돌연변이), 미도리시 시안, 야생형GFP, GFP(S65C 돌연변이), TurboGFP, TagGFP, GFP(S65L 돌연변이), 에머랄드, GFP(S65T 돌연변이), EGFP, 아자미 그린, ZsGreen1, TagYFP, EYFP, 토파즈, 비너스, mCitrine, YPet, TurboYFP, ZsYellow1, Kusabira 오렌지, mOrange, 알로피코시아닌(APC), mKO, TurboRFP, tdTomato, TagRFP, DsRed 단량체, DsRed2("RFP"), mStrawberry, TurboFP602, AsRed2, mRFP1, J-Red, R-피코에리트린(RPE), B-피코에리트린(BPE), mCherry, HcRed1, Katusha, P3, 페리디닌 엽록소(PerCP), mKate(TagFP635), TurboFP635, mPlum, 및 mRaspberry로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-TALEN 항체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 형광 표지는 R-피코에리트린(PE) 또는 알로피코시아닌(APC)인, 항-TALEN 항체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항-TALEN 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 운송체를 포함하는, 조성물.
  35. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항-TALEN 항체의 중쇄를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  36. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항-TALEN 항체의 경쇄를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  37. 제35항 또는 제36항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  38. 제37항의 벡터 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포, Sp2/0 세포, 토끼 세포 및 대장균 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포를 포함하는, 세포.
  40. 제1항 내지 제29항의 항-TALEN 항체를 제조하는 방법으로서, 적절한 조건 하에서 제39항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 샘플에서 TALEN 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 검출 가능한 표지에 접합된 항-TALEN 항체와 상기 샘플을 접촉시키는 단계 및 상기 샘플에서 상기 TALEN 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항-TALEN 항체는 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 인간화 형태를 포함하는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 포르말린 고정 샘플, 생체 외 성장 조직 또는 세포 배양 배지인, 방법.
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