KR20220019655A - T 세포 수용체의 선택 - Google Patents

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KR20220019655A
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cell
leu
ser
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매튜 조셉 데이비스
조슈아 마이클 프란시스
아부바카르 잘로
카린 주스
크리스틴 데니스 팔머
모즈카 스코베른
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그릿스톤 바이오, 인코포레이티드
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Abstract

말초 혈액 단핵 세포의 출발 집단으로부터 유래된 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 별도로 분리하고 중복 T 세포 수용체 클로노타입을 식별하는 방법이 제공된다. 항원은 암-정소 항원뿐만 아니라 개인 및 공유 신생항원을 포함한다. T 세포 수용체 클로노타입은 암 치료 요법을 개발하기 위하여 추가로 이용될 수 있다.

Description

T 세포 수용체의 선택
관련 출원
본 출원은 2019년 3월 1일에 출원된 미국 가출원 No. 62/812,572호의 이익을 주장하며, 이 가출원은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 참고로 본원에 통합되는 서열 목록을 함유한다. 2020년 2월 26일에 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 14560-001-228_SEQ_LISTING.txt이고 크기는 106,016 바이트이다.
본 발명은 항원-특이적 T 세포 수용체의 식별에 관한 것이다.
암은 종양으로 성장할 수 있는 형질전환된 세포의 클론을 검출하고 파괴할 수 있는 T 세포를 제공하는 면역 감시의 실패에 관련된다. 연구는 암-특이적 항원을 인식하고 효과적인 기능성 반응을 제공할 수 있는 보조 T 세포를 조작하는 방법을 개발하는 것에 집중되었다. 현재의 접근법은, 그로부터 T 세포 수용체 서열을 식별하고 이용하여 치료적으로 효과적인 T 세포주를 조작할 수 있는, 항원-특이적이고 기능적으로 반응성인 T 세포를 배양하고 단리하는 노력을 포함한다.
그러한 T 세포는 보통 출발 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플에서는 드물며 - 일부 경우에는 10,000,000 중에 1부(part) 미만이다. 그 결과, 현재의 접근법은 종종 집중적인 자극(예를 들어, 인 비트로 프라이밍(priming)), 확장 및 농축 단계를 이용하며 이들 단계는 시간 소모적이며, 비싸고 심지어 그 후 낮은 성공률을 낳을 수 있다. 낮은 성공률에 기여함에 있어서, T 세포 자극은 T 세포 수용체의 발현을 하향조절하여 검출을 더욱 어렵게 만드는 것으로 알려져 있다. 또한, T 세포는 암 세포에 의해 발현된 농도보다 훨씬 더 높은 농도일 수 있는 농도의 표적 항원으로 자극되어, 생리학적으로 관련된 항원 농도에서 기능하지 못하는 T 세포 수용체의 선택을 야기한다.
본 발명은 특히, 인 비트로 프라이밍의 하나 이상의 한계를 피하며 항원의 생리학적 관련 농도에서 치료적으로 효과적인 T 세포주의 개발을 위한 T 세포 수용체 후보의 사전심사(prequalification)를 가능하게 하는 희귀한 항원-특이적 및 기능성 T 세포를 식별하는 방법을 제공함으로써 이들 단점을 극복한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입(clonotype)(예를 들어, PBMC 샘플에서 10,000,000개 T 세포마다 1개 미만의 빈도를 가진 T 세포 수용체 클로노타입과 같은 희귀 T 세포 수용체 클로노타입)을 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 타입의 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원(neoantigen)의 라이브러리로부터 선택된 신생항원 또는 개별 종양 세포로부터 선택된 개인화된 신생항원)에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 하나의 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 분석은 항원-결합 T 세포를 식별하기 위하여 혼합물의 제1 부분을 분석하고, 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 혼합물의 제1 부분의 분석은 P-로딩된 주요 조직적합 복합체(MHC) 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 P는 소정의 타입의 항원이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-로딩된 MHC는 자성 비드에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포의 검출은 자기적 분리를 통해 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-로딩된 MHC 단백질은 형광단에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포는 형광 유세포분석을 통해 검출 및 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포의 검출은 형광 유세포분석 장치를 통해 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포를 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, MHC 단백질은 MHC 클래스 I 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-로딩된 MHC 단백질은 P-로딩된 MHC 단백질 다량체로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것은 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것은 자기적 분리를 통해 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것은 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 형광 유세포분석 장치를 통해 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 인 비트로 프라이밍을 배제할 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 다수의 대상체에 걸쳐 종양에서 관찰된 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망(neural network)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트(set of presentation likelihoods)로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
C. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 T 세포 수용체 클로노타입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 T 세포 수용체 알파쇄, 적어도 하나의 T 세포 수용체 베타쇄, 또는 T 세포 수용체 알파 및 베타 쇄 적어도 한 쌍을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 결합 T 세포를 시퀀싱(sequencing)하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 기능성 T 세포를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 CDR3 서열을 포함할 수 있다.
D. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포는 함께 T 세포의 혼합물에 존재하는 1,000,000개 T 세포 당 1000개 T 세포 미만(예를 들어, 100개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 3개 미만, 또는 2개)일 수 있다.
E. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 및 ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 단계를 포함하는, T 세포 혼합물을 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 2개의 T 세포가 소정의 타입의 항원에 결합할 수 있으며(즉, 적어도 하나의 T 세포가 적어도 2개의 T 세포일 수 있으며), 여기서 확장은 적어도 2개의 T 세포를 다클론성으로 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포는 함께 PBMC 집단에 존재하는 10,000,000개 T 세포 당 1000개 T 세포 미만(예를 들어, 100개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 3개 미만, 또는 2)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포의 혼합물은 인 비트로 프라이밍의 생성물일 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 림프구에서 공유 수용체 서열을 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 타입의 항원에 대한 자극된 림프구 및 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 림프구 혼합물을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 하나의 자극된 림프구와 적어도 하나의 공자극된 림프구에 의해 공유된 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 자극된 림프구와 공자극된 림프구의 혼합물은 T 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 자극된 림프구와 공자극된 림프구의 혼합물은 B 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 자극된 림프구와 공자극된 림프구의 혼합물은 천연 킬러 (natural killer) 세포일 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 분석은 자극된 림프구를 식별하기 위하여 혼합물의 제1 부분을 분석하고, 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 혼합물의 제1 부분을 분석하는 것은 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 단백질은 소정의 타입의 항원을 포함한다(예를 들어, 항원과 통합되거나 복합될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 단백질은 자성 비드에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것은 자기적 분리를 통해 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 단백질은 형광단에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구는 형광 유세포분석을 통해 검출되고 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구의 검출은 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 형광 유세포분석 장치를 통해 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것은 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것은 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 자기적 분리를 통해 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것은 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 형광 유세포분석 장치를 통해 통과시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 전문 항원 제시 세포를 이용한 프라이밍(예를 들어, 인 비트로 프라이밍)을 배제할 수 있다.
C. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
D. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 수용체 클로노타입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 수용체 알파쇄, 적어도 하나의 수용체 베타쇄, 또는 수용체 알파 및 베타 쇄 적어도 한 쌍을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 자극된 림프구를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 공자극된 림프구를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 항원 인식 서열을 포함할 수 있다.
E. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 자극된 림프구 및 적어도 하나의 공자극된 림프구는 함께 림프구의 혼합물에 존재하는 1,000,000개 T 세포 당 1000개 T 세포 미만(예를 들어, 100개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 3개 미만, 또는 2)일 수 있다.
F. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 림프구를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 및 ii) 단리된 적어도 하나의 림프구를 확장시키는 단계를 포함하는, 림프구 혼합물을 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 2개의 림프구가 소정의 타입의 항원에 결합할 수 있으며(즉, 적어도 하나의 림프구가 적어도 2개의 림프구일 수 있으며), 여기서 확장은 적어도 2개의 림프구를 다클론성으로 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 자극된 림프구 및 적어도 하나의 공자극된 림프구가 함께, PBMC 집단에 존재하는 10,000,000개 림프구 당 1000개 T 세포 미만(예를 들어, 100개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 3개 미만, 또는 2)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 림프구의 혼합물은 전문 항원 제시 세포를 이용한 프라이밍(예를 들어, 인 비트로 프라이밍)의 생성물일 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입을 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 기능성 T 세포를 식별하기 위하여 미접촉(naive) T 세포의 혼합물을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 하나의 소정의 타입의 항원에 적어도 제1 항원-결합 T 세포를 결합시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 결합은 제1의 다수의 T 세포(예를 들어, 적어도 제1 항원-결합 T 세포를 함유하는 제1의 다수의 T 세포)를 제1의 하나의 소정의 타입의 항원과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 활성화는 제2의 다수의 T 세포(예를 들어, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 함유하는 제2의 다수의 T 세포)를 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포(예를 들어, 생리학적으로 관련된 농도의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포)와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 소정의 농도 범위(또는 단일 소정 농도 값)내의 다수의 소정의 타입의 항원을 제시할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 다량의 소정의 타입의 항원으로 다수의 세포를 펄싱함으로써 준비될 수 있다(예를 들어, P-로딩된 세포 다수를 형성하기 위하여, 여기서 P는 소정의 타입의 항원). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 소정의 기간동안 소정의 타입의 항원을 함유한 용액으로 다수의 세포를 펄싱함으로써 준비될 수 있으며, 용액은 0.000001μM 내지 100μM의 농도, 예를 들어, 0.000001μM 내지 0.00001μM의 농도, 예를 들어, 0.00001μM 내지 0.0001μM, 0.0001μM 내지 0.001μM, 0.001μM 내지 0.01μM, 0.01μM 내지 0.1μM, 0.0001μM 내지 100μM, 0.001μM 내지 100μM, 0.01μM 내지 10μM, 0.1μM 내지 10μM, 1μM 내지 100μM, 1μM 내지 50μM, 1μM 내지 25μM, 5μM 내지 25μM, 10μM 내지 100μM, 또는 10μM 내지 30μM의 농도의 소정의 타입의 항원을 함유한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 용액은 100 μM 미만의 농도, 예를 들어, 75μM 미만, 50 μM 미만, 25μM 미만, 10μM 미만, 또는 1μM 미만의 농도의 소정의 타입의 항원을 함유할 수 있다. 전술한 실시형태 중 임의의 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 기간은 1 시간 내지 36 시간, 예를 들어 6 시간 내지 24 시간, 6 시간 내지 12 시간, 12 시간 내지 24 시간일 수 있으며, 또는 소정의 기간은 9 시간 내지 18 시간일 수 있다. 전술한 실시형태 중 임의의 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 기간은 적어도 1 시간, 적어도 4 시간, 적어도 8 시간, 적어도 12 시간, 적어도 18 시간일 수 있으며, 또는 소정의 기간은 적어도 24 시간일 수 있다. 전술한 실시형태 중 임의의 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 기간은 168 시간 미만, 72 시간 미만, 36 시간 미만, 24 시간 미만일 수 있으며, 또는 소정의 기간은 12 시간 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 농도 범위(또는 소정의 농도 값)는 종양에서 소정의 타입의 항원의 예상 농도(예를 들어, 종양의 표면상에 발현된 소정의 타입의 항원의 예상 농도)에 기초할 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합은 적어도 제1의 결합 T 세포를 P-로딩된 MHC 단백질에 결합시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 P는 소정의 타입의 항원이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, MHC 단백질은 MHC 클래스 I 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-로딩된 MHC 단백질은 P-로딩된 MHC 단백질 다량체로 존재할 수 있다.
C. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포와 제2의 다수의 T 세포는 PBMC의 공통 집단으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포와 제2의 다수의 T 세포는 한 명 이상의 건강한 공여체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 적어도 부분적으로 HLA-매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 소정의 타입의 항원 제시에 대해 대상체에 적어도 부분적으로 인간 백혈구 항원(HLA)-매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-A에 대해 대상체에 매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-B에 대해 대상체에 매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-C에 대해 대상체에 매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DP에 대해 대상체에 매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DQ에 대해 대상체에 매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DR에 대해 대상체에 매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합에 대해 대상체에 매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 적어도 부분적으로 HLA-미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 완전히 HLA-미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 선택적으로 HLA-미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-B에 대해 대상체에 미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-C에 대해 대상체에 미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DP에 대해 대상체에 미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DQ에 대해 대상체에 미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DR에 대해 대상체에 미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합에 대해 대상체에 미스매치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 소정의 타입의 항원 제시에 대해 예측된 HLA(예를 들어, 소정의 타입의 항원을 제시하기 위해 본 발명에서 또는 통합된 참고문헌 중 하나에서 개시된 머신 러닝 모델 및/또는 방법 중 하나에 의해 소정의 타입의 항원과 조합되어 예측된 HLA, 예를 들어 소정의 타입의 암에 대해 예측됨)에 적어도 부분적으로 HLA-매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 예측된 HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 한 명 이상의 건강한 공여체는 소정의 타입의 항원 제시에 대해 예측된 HLA(예를 들어, 소정의 타입의 항원을 제시하기 위해 본 발명에서 또는 통합된 참고문헌 중 하나에서 개시된 머신 러닝 모델 및/또는 방법 중 하나에 의해 소정의 타입의 항원과 조합되어 예측된 HLA, 예를 들어 소정 타입의 암에 대해 예측됨)에 적어도 부분적으로 HLA-미스매치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 예측된 HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
D. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 미접촉 CD8+ T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 미접촉 T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 기억 T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4+CD8+ T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4-CD8+ T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4+CD8- T 세포일 수 있다(또는 그를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다).
E. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 종양 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 수지상 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 항원 제시 세포(예를 들어, 하나 이상의 전문 항원 제시 세포)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 인공 항원 제시 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 대식세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 단핵구를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 B 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하고 소정의 타입의 항원을 발현하는 하나 이상의 다수의 세포를 포함할 수 있다.
F. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 유세포분석(예를 들어, 형광 유세포분석)을 통해 결합을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 하나의 소정의 타입의 항원은 자성 비드에 연결될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 자기적 분리를 통해 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 유세포분석(예를 들어, 형광 유세포분석)을 통해 활성화를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 자기적 분리를 통해 적어도 제1의 기능성 T 세포를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
G. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 하나 이상의 바이오마커를 검출하는 것을 포함하는, 활성화의 검출을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 바이오마커는 CD137을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 T 세포 활성화를 나타내는 하나 이상의 분자의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 활성화 검출을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 분자는 인터페론 감마를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 T 세포 증식을 검출하는 것을 포함하는, 활성화 검출을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제1의 기능성 T 세포의 활성화는 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 T 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제1의 기능성 T 세포의 활성화는 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 T 세포 중 하나의 증식에 의해 형성된 T 세포일 수 있다.
H. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 포함된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에, 제1의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 결합시키는 것을 포함할 수 있으며, P는 소정의 타입의 항원이며, 상기 결합은 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 활성화는 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체를 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에, 제1의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 결합시키는 것을 포함할 수 있으며, P는 소정의 타입의 항원이며, 상기 결합은 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 활성화는 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법(예를 들어, 본 발명에서 또는 통합된 참고문헌 중 하나에서 개시된 인 비트로 프라이밍 방법 중 임의의 것을 제외한 방법)을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 제1의 T 세포를 다수의 T 세포로부터 단리하는 것을 포함할 수 있으며, P는 소정의 타입의 항원이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 타입의 항원에 의한 활성화를 나타내는 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 제2의 T 세포를 다수의 T 세포로부터 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제1의 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 제2의 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 매치시키는 것을 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 2개의 P-로딩된 MHC 단백질에 별도로 결합되는 적어도 2개의 T 세포로부터 다수의 T 세포를 유도하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 유도는 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포를 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 확장은 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포를 다클론성으로 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포는 확장동안 혼합물내에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포는 확장 전에 서로 분리될 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 기능성 T 세포 수용체 클로노타입을 검출하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 동족(cognate) T 세포 다수를 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 것을 포함할 수 있으며, 활성화는 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 기능성 T 세포가 P-로딩된 MHC 단백질에 결합하도록 구성되는지를 확인하는 것을 포함할 수 있으며, P는 소정의 타입의 항원이다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 형성은 간접 T 세포 수용체 가교를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 형성은 단일 다클론 확장으로 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 형성은 다수의 다클론 확장을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 다클론 확장 중 적어도 하나에 이어서 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 추가 T 세포를 단리하는 것이 이어질 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제1의 기능성 T 세포는 50 μM 미만의 P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제1 기능성 T 세포는 0.01초 내지 100초(예를 들어, 2초 내지 10초)의, P-로딩된 MHC 단백질과의 반감기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있으며, 여기서 적어도 제1의 기능성 T 세포는 : i) 50μM 미만의, P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수 및 ii) 0.01초 내지 100초(예를 들어, 2초 내지 10초)의, P-로딩된 MHC 단백질과의 반감기를 가진다.
C. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포는 음성 선택(negative selection)을 거쳤을 수 있다.
D. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 항원-결합 T 세포를 검출하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 동족 T 세포 다수를 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 결합제에 적어도 제1의 결합 T 세포를 결합시키는 것을 포함할 수 있으며, 결합은 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 다수의 결합제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하며 다수의 결합제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 제1의 결합 T 세포가 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포에 의해 활성화되도록 구성됨을 확인하는 것을 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원을 제시할 수 있는 세포는 항원 제시 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원 제시 세포는 전문 항원 제시 세포일 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있으며, 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 P-로딩된 MHC 단백질에 결합되며, P는 소정의 타입의 항원이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제2의 다수의 T 세포를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 활성화 시그널링 분자를 상향조절(및/또는 하나 이상의 활성화 마커를 발현)하며, 여기서 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부와 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부 둘 모두에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부 및 조합된 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부의 적어도 0.005%에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성일 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있으며, 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 제1의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제1의 활성화 마커를 발현한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제2의 다수의 T 세포를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 제2의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제2의 활성화 마커(및/또는 하나 이상의 활성화 시그널링 분자)를 상향조절한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 a) 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부; 및 b) 역치값 미만인 P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수를 가진 제1의 다수의 T 세포의 일부 중 적어도 하나 및 제2의 T 세포의 일부 중 적어도 하나를 식별하는 것을 포함할 수 있으며, P는 소정의 타입의 항원이다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성일 수 있으며, 및/또는 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성일 수 있으며, 및/또는 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 포함할 수 있으며, 및/또는 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포일 수 있으며, 및/또는 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 P-로딩된 MHC 단백질을 포함할 수 있으며, 및/또는 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 P-로딩된 MHC 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 내인성으로 발현하는 세포일 수 있으며, 및/또는 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 내인성으로 발현하는 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 P-로딩된 MHC 단백질을 포함할 수 있으며, 및/또는 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 내인성으로 발현하는 세포일 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 해리 상수는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 P-로딩된 MHC 단백질 사이의 결합에 상응할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 역치 값은 1000μM 미만(예를 들어, 50μM 미만)일 수 있다.
C. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 제1 타입의 항원에 대한 제1 항원-결합 T 세포 및 제1 항원-활성화된 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원에 대한 제2 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 a) 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며; b) 제2 항원-활성화된 T 세포 중 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원 및/또는 소정의 제2 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제2 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 없다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제2 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 없다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제2 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 없다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 없다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제2 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 없다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제2 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 없다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제2 타입의 항원은 신생항원일 수 없다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 제1 타입의 항원은 제1 펩티드일 수 있고 소정의 제2 타입의 항원은 제2 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 펩티드는 제2 펩티드를 발현하는 유전자의 변이체에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 펩티드는 제2 펩티드를 발현하는 유전자의 대립유전자에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제2 펩티드는 야생형 유전자에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 펩티드는 신생항원일 수 있고 제2 펩티드는 관련된 야생형 유전자에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 적어도 1 아미노산만큼 상이할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 2 아미노산, 적어도 3 아미노산, 적어도 4 아미노산, 적어도 5 아미노산, 적어도 6 아미노산, 적어도 7 아미노산, 적어도 8 아미노산, 적어도 9 아미노산, 적어도 10 아미노산, 적어도 12 아미노산만큼 상이할 수 있거나, 또는 제1 펩티드와 제2 펩티드는 적어도 15 아미노산만큼 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 1 내지 15 아미노산만큼 상이할 수 있으며, 예를 들어 5 내지 10 아미노산만큼 상이할 수 있거나, 또는 제1 펩티드와 제2 펩티드는 5 내지 8 아미노산만큼 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 차이는 보존적 치환을 포함할(구성될) 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 차이는 라디칼 치환을 포함할(구성될) 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 95% 미만, 예를 들어, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있거나, 또는 제1 펩티드와 제2 펩티드는 55% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 55% 내지 95%, 예를 들어, 55% 내지 90%, 55% 내지 85%, 55% 내지 80%, 55% 내지 75%의 서열 동일성을 가질 수 있거나, 또는 제1 펩티드와 제2 펩티드는 55% 내지 70%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제1 타입의 항원을 내인성으로 제시하는(예를 들어, 종양 세포와 같이, 발현에 의해) 세포와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제2 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제2 타입의 항원을 내인성으로 제시하는(예를 들어, 종양 세포와 같이, 발현에 의해) 세포와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제1 타입의 항원으로 로딩된(예를 들어, 전문 항원 제시 세포와 같이, 외인성 공급원으로부터) 세포와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제2 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제2 타입의 항원으로 로딩된(예를 들어, 전문 항원 제시 세포와 같이, 외인성 공급원으로부터) 세포와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 소정의 제1 타입의 항원에 대한 제1 항원-활성화된 T 세포 및 제1 항원-결합 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원에 대한 제2 항원-결합 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 a) 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며; b) 제2 항원-결합 T 세포 중 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 활성화 마커를 식별하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 제1의 다수의 T 세포를 다수의 P-제시(예를 들어, P를 발현하는 세포 또는 P로 펄싱된 세포) 세포(예를 들어, MHC 클래스 I 단백질 및/또는 MHC 클래스 II 단백질을 통해 제시된 P를 포함하는 다수의 P-제시 세포)와 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 제1의 다수의 T 세포는 다수의 P-결합 T 세포를 포함하며, P는 소정의 타입의 항원이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부에 대해 다수의 발현율 프로파일을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부에 존재하는 적어도 2개의 T 세포에서 P에 대한 기능성 반응을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부를 다수의 T 세포 클러스터로 분배하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 2개의 T 세포를 포함하는 다수의 T 세포 클러스터 중 하나를 식별하기 위하여 다수의 T 세포 클러스터에 발현율을 맵핑하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 적어도 2개의 T 세포에 의해 발현되는 활성화 마커(또는 활성화를 나타내는 분비된 분자)를 식별하는 것을 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-결합 T 세포는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 소정의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 비교하는 생물정보학 필터를 이용하여 식별될 수 있다.
B. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함할 수 있으며, 그룹 중 적어도 하나는 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 공통으로 갖는 T 세포로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함할 수 있으며, 그룹 중 적어도 하나는 서로에게 적어도 70%(예를 들어, 적어도 80%, 90%, 95%, 100%)의 서열 동일성을 특징으로 하는 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 갖는 T 세포로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함할 수 있으며, 그룹 중 적어도 하나는 서로간에 최대 1 아미노산만큼 상이한(예를 들어, 최대 1 아미노산의 보존적 치환) T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 가진 T 세포로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함할 수 있으며, 그룹 중 적어도 하나는 보존적 치환에 의해서만 상이한 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 가진 T 세포로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 분배는 파라토프 핫스팟(paratope hotspot)에 의한 림프구 상호작용의 그룹핑(GLIPH)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공통된 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 CDR3 영역의 적어도 일부일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, CDR3 영역의 적어도 일부는 6 내지 35 아미노산의 길이를 가진 선형 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, CDR3 영역의 적어도 일부는 줄기(stem) 영역을 배제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, CDR3 영역의 적어도 일부는 CDR3 베타쇄 부분을 포함할 수 있다.
C. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 분배는 알고리즘(예를 들어, 통계적 알고리즘)을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 알고리즘은 다수의 발현율 프로파일의 유사성 분석을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 발현율 프로파일은 P에 대한 기능성 반응을 나타내는 하나 이상의 활성화 마커에 대한 발현율을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 활성화 마커는 CD137, CD69, CD25, Ki67, CD107, CD122, CD27, CD28, CD95, CD134, KLRG1, CD38, CD154, 또는 전술한 활성화 마커 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 알고리즘은 클러스터 분석 알고리즘일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 알고리즘은 t-분포 확률적 임베딩(t-distributed stochastic neighbor embedding)을 포함할 수 있다.
D. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P에 대한 측정된 기능성 반응은 하나 이상의 활성화 마커 및/또는 하나 이상의 분비된 분자의 검출을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 활성화 마커는 CD137, CD69, CD25, Ki67, CD107, CD122, CD27, CD28, CD95, CD134, KLRG1, CD38, CD154, 또는 전술한 활성화 마커 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 분비된 분자는 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인은 인터페론 감마(IFN-감마), 종양 괴사 인자 알파(TNF알파), 인터루킨-2(IL-2), 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 분비된 분자는 그랜자임(granzyme)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 분비된 분자는 퍼포린(perforin)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P에 대한 측정된 기능성 반응은 T 세포 증식의 검출을 포함할 수 있다.
E. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 공통 출발 PBMC 집단으로부터 유래될 수 있다.
F. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 발현율 프로파일은 단일-세포 전사체(transcriptome) 분석 시리즈로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 T 세포 클러스터 중 하나에서의 T 세포는 제1 발현율 역치(예를 들어, 0.05%보다 큰 제1 발현율 역치(예를 들어, 0.1% 초과, 0.5% 초과, 또는 0.05% 내지 0.5%))를 초과하는 평균 제2 발현율로 소정의 제1 활성화 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 T 세포 클러스터 중 하나에서의 T 세포는 제2 발현율 역치(예를 들어, 0.05%보다 큰 제2 발현율 역치(예를 들어, 0.1% 초과, 0.5% 초과, 또는 0.05% 내지 0.5%))를 초과하는 평균 제2 발현율로 제2 활성화 마커를 발현할 수 있다.
G. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 다수의 P-결합 T 세포의 T 세포 수용체 서열을 소정의 T 세포 수용체 서열에 매칭함으로써 다수의 P-결합 T 세포를 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 T 세포 수용체 서열은 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 제2의 다수의 T 세포를 시퀀싱함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화 마커는 다수의 T 세포 클러스터 중 다른 하나에 존재하는 적어도 2개의 다른 T 세포에서 발현될 수 없거나 하향조절될 수 있으며, 여기서 적어도 2개의 다른 T 세포는 측정될 때 기능성 반응을 나타내지 않는다.
H. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15(예를 들어 8-12) 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원(예를 들어, 공유 종양 신생항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원(예를 들어, HPV E6 및 HPV E7과 같은 발암 바이러스 단백질)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 8-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 12-40 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 치료적으로 효과적인 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포의 개발을 위해 T 세포 수용체를 사전심사하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 개발은 T 세포 수용체를 T 세포주내로 형질감염시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 수용체는 하나 이상의 건강한 HLA-매칭된 공여체 샘플로부터 유래된 T 세포로부터 식별될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별된 T 세포 수용체는 10,000개의 유래된 T 세포중에 1개 미만에서 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 유래된 T 세포는 본 발명에서 또는 통합된 참고문헌 중 하나에서 개시된 전술한 농축 및/또는 확장 단계 중 하나 이상에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별된 T 세포 수용체는 하나 이상의 공여체 샘플에 존재하는 10,000,000개의 T 세포 중 1개 미만에서 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 유래된 T 세포의 적어도 일부의 항원-활성화는 생리학적 농도(예를 들어, 항원이 종양 세포에서 제시될 범위내의 농도)로 항원을 제시하는 세포에 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 항-항원 T 세포 시리즈를 확장(예를 들어, 다클론 확장에 의해)시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 항-항원 T 세포 시리즈 중 하나로부터 T 세포를 수득한 후, 수득한 항-항원 T 세포를 결합제와(예를 들어, 형광 라벨링된 항원-MHC 단백질 다량체 또는 자기적 태깅된 항원-MHC 단백질 다량체와) 복합체로 만든 후, 복합체가 된 항-항원 T 세포를 확장시켜 다음 시리즈의 항-항원 T 세포의 구성원을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 구성원의 동족을 생리학적 관련 농도의 항원을 발현하는 세포에 노출시킨 후, 동족의 활성화를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태는 예를 들어, T 세포의 투여를 포함하는, 암 치료법을 제공할 수 있으며, T 세포는 형질감염된 T 세포 수용체를 포함하고, T 세포 수용체는 동족의 시퀀싱에 의해 결정된 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 항원-특이적 백신을 위한 후보 항원을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 PBMC 집단으로부터 후보 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포 형성을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포의 활성화를 포함할 수 있다.
A. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 후보 항원은 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원-특이적 백신은 암의 치료(예를 들어, 암성 종양의 치료)를 위한 것일 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 면역원성에 대해 후보 신생항원을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 PBMC 집단으로부터 후보 신생항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포 형성을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 신생항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포의 활성화를 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 소정의 타입의 항원(예를 들어, 개인 신생항원 또는 공유 신생항원과 같은 신생항원)에 선택적인 인공 T 세포 수용체를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 a) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 천연 T 세포의 혼합물을 분석하고; b) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별함에 의해 선택된 CDR3 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있으며, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 CDR3 영역의 적어도 일부를 함유한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 상기 방법은 T 세포 수용체 단편(예를 들어, 다수의 상이한 CDR3 서열과 조합되어 다수의 생성물, 예를 들어, 다수의 치료 생성물을 형성할 수 있는 보편적 백본 단편)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입의 선택 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및 ii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 림프구에서 공유 수용체 서열을 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 대한 자극된 림프구 및 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 림프구 혼합물을 분석하는 단계; 및 ii) 적어도 하나의 자극된 림프구와 적어도 하나의 공자극된 림프구에 의해 공유된 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입을 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 기능성 T 세포를 식별하기 위하여 미접촉 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및 ii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 소정의 타입의 항원과 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 하나의 소정의 타입의 항원에 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 결합시키는 단계; ii) 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 iii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통인 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; ii) 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체를 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 iii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; ii) 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 클래스 I P-MHC 단백질을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 iii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 다수의 T 세포로부터, P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 제1 T 세포를 단리하는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; ii) 다수의 T 세포로부터, 소정의 타입의 항원에 의한 활성화를 나타내는 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 제2 T 세포를 추가로 단리하는 단계; 및 iii) 제1 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 제2 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 매칭시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 기능성 T 세포 수용체 클로노타입을 검출하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 iv) 적어도 제1의 기능성 T 세포가 P-로딩된 MHC 단백질로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단백질에 결합하도록 구성됨을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 항원-결합 T 세포를 검출하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를, 소정의 타입의 항원을 포함하는, 다수의 결합제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1 결합 T 세포를 적어도 제1 결합제에 결합시키는 단계; 및 iv) 적어도 제1 결합 T 세포가 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포에 의해 활성화되도록 구성됨을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 P-로딩된 MHC 단백질에 결합되며 P는 소정의 타입의 항원인 단계; ii) 제2의 다수의 T 세포를 추가로 단리하는 단계로서, 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 활성화 시그널링 분자를 상향조절(및/또는 하나 이상의 활성화 마커 또는 활성화의 다른 지표자를 발현)하며, 여기서 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성인 단계; 및 iii) 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부와 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부 둘 모두에 공통인 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 제1 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제1 활성화 마커를 발현하는 단계; ii) 제2의 다수의 T 세포를 추가로 단리하는 단계로서, 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 제2 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제2 활성화 마커(및/또는 하나 이상의 활성화 시그널링 분자)를 상향조절하는 단계; 및 iii) a) 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부; 및 b) 역치 값 미만인, P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수를 가진, 제1의 다수의 T 세포의 일부 중 적어도 하나 및 제2의 T 세포의 일부 중 적어도 하나를 식별하는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i)소정의 제1 타입의 항원에 대한 제1 항원-결합 T 세포 및 제1 항원-활성화된 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원에 대한 제2 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포 혼합물을 분석하는 단계; 및 ii) a) 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며; b) 제2 항원-활성화된 T 세포 중 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i)소정의 제1 타입의 항원에 대한 제1 항원-활성화된 T 세포 및 제1 항원-결합 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원에 대한 제2 항원-결합 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포 혼합물을 분석하는 단계; 및 ii) a) 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며; b) 제2 항원-결합 T 세포 중 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 활성화 마커를 식별하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 제1의 다수의 T 세포를 다수의 P-제시 세포와 접촉시키는 단계로서, 제1의 다수의 T 세포는 다수의 P-결합 T 세포를 포함하며, P가 소정의 타입의 항원인 단계; ii) 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부를 위해 다수의 발현율 프로파일을 측정하는 단계; iii) 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부에 존재하는 적어도 2개의 T 세포에서 소정의 타입의 항원에 대한 기능성 반응을 측정하는 단계; iv) 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부를 다수의 T 세포 클러스터로 분배하는 단계; v) 발현율 프로파일을 다수의 T 세포 클러스터에 맵핑하여 적어도 2개의 T 세포를 포함하는 다수의 T 세포 클러스터 중 하나를 식별하는 단계; 및 vi) 적어도 2개의 T 세포에 의해 발현되는 활성화 마커를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 항원-특이적 백신을 위한 후보 항원을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 후보 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 및 iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 면역원성을 위한 후보 신생항원을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은 i) 후보 신생항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 및 iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 신생항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 소정의 타입의 항원(예를 들어, 개인 신생항원 또는 공유 신생항원과 같은 신생항원)에 선택적인 인공 T 세포 수용체를 제공할 수 있으며, 상기 인공 T 세포 수용체는 i) a) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 천연 T 세포의 혼합물을 분석하고; b) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며 CDR3 영역의 적어도 일부를 함유하는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별함으로써 선택된 CDR3 영역의 적어도 일부(예를 들어, CDR3 베타쇄의 적어도 일부); 및 ii) T 세포 수용체 단편(예를 들어, 다수의 상이한 CDR3 서열과 조합되어 다수의 생성물, 예를 들어, 다수의 치료 생성물을 형성할 수 있는 보편적 백본 단편)을 포함한다.
일부 실시형태는 예를 들어, 본 발명에서 개시된 하나 이상의 T 세포 수용체(또는 T 세포 수용체 클로노타입 또는 공유 수용체 서열) 식별 및/또는 선택 방법을 포함하는, 하나 이상의 바이러스 에피토프를 식별하는 방법을 제공할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 본 발명에서 개시된 하나 이상의 T 세포 수용체(또는 T 세포 수용체 클로노타입 또는 공유 수용체 서열) 식별 및/또는 선택 방법으로부터 결정된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부 하나 이상을 포함하는, 장기 이식 치료법을 위한 조성물을 제공할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 본 발명에서 개시된 하나 이상의 T 세포 수용체(또는 T 세포 수용체 클로노타입 또는 공유 수용체 서열) 식별 및/또는 선택 방법으로부터 결정된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부 하나 이상을 포함하는, 하나 이상의 대상체에서의 세포 치료법을 위한 조성물을 제공할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 본 발명에서 개시된 하나 이상의 T 세포 수용체(또는 T 세포 수용체 클로노타입 또는 공유 수용체 서열) 식별 및/또는 선택 방법으로부터 결정된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부 하나 이상을 포함하는, 하나 이상의 대상체에서 면역계를 향상시키기 위한 조성물을 제공할 수 있다.
전술한 실시형태 중 임의의 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 신생항원(예를 들어, 머신 러닝-기반 모델을 이용하여 식별된 신생항원)일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에서 개시된 방법 중 임의의 방법에 의해 수득된 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 소정의 타입의 항원에 선택적인 인공 T 세포 수용체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 인공 T 세포 수용체는 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 천연 T 세포의 혼합물을 분석하고; 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며 CDR3 영역의 적어도 일부를 함유하는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별함으로써 선택된 CDR3 영역의 적어도 일부; 및 T 세포 수용체 단편을 포함한다.
일부 실시형태는 본 발명에서 개시된 방법 중 임의의 방법에 의해 수득된 인공 T 세포 수용체 또는 그 단편을 포함하는 T 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, T 세포는 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에서 개시된 방법 중 임의의 방법에 의해 수득된 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에서 제공된 방법 중 임의의 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공한다.
도 1: T 세포 수용체의 선택을 위한 접근법의 개략도.
도 2: 음성 선택 단계를 포함하는, T 세포 수용체의 선택을 위한 접근법의 개략도.
도 3: T 세포 수용체 활성화 마커의 식별을 위한 접근법의 개략도.
도 4: 실시예 1에서 ASSLPTTMNY-특이적 T 세포를 위한 T 세포 수용체 서열 빈도("ASSLPTTMNY"는 서열번호 1로 개시됨): 언급된 공유 T 세포 수용체 서열을 가진 CD137+ T 세포(Y-축) 대 항원-결합 T 세포(X-축). "A"는 표 2에 기재된 참조부호 A를 나타낸다.
도 5: 실시예 1에서 ASSLPTTMNY-특이적 T 세포를 위한 T 세포 수용체 서열 빈도("ASSLPTTMNY"는 서열번호 1로 개시됨): 언급된 공유 T 세포 수용체 서열을 가진 인터페론 감마+ T 세포(Y-축) 대 항원-결합 T 세포(X-축). "A"는 표 2에 기재된 참조부호 A를 나타낸다.
도 6: 실시예 1의 복제물에서 ASSLPTTMNY-특이적 T 세포를 위한 T 세포 수용체 서열 빈도("ASSLPTTMNY"는 서열번호 1로 개시됨): 언급된 공유 T 세포 수용체 서열을 가진 CD137+ T 세포(Y-축) 대 항원-결합 T 세포(X-축). "B"는 표 2에 기재된 참조부호 B를 나타낸다.
도 7: 실시예 1의 복제물에서 ASSLPTTMNY-특이적 T 세포를 위한 T 세포 수용체 서열 빈도("ASSLPTTMNY"는 서열번호 1로 개시됨): 언급된 공유 T 세포 수용체 서열을 가진 인터페론 감마+ T 세포(Y-축) 대 항원-결합 T 세포(X-축). "B"는 표 2에 기재된 참조부호 B를 나타낸다.
도 8: 3회의 활성화 마커 측정 중 첫번째에서 HSEVGLPVY-특이적 T 세포를 위한 T 세포 수용체 서열 빈도("HSEVGLPVY"는 서열 번호 2로 개시됨): 언급된 공유 T 세포 수용체 서열을 가진 CD137+ T 세포(Y-축) 대 항원-결합 T 세포(X-축). "I", "J", "K", "L", "N", 및 "O"는 각각 표 3에 기재된 참조부호 I, J, K, L, N, 및 O를 나타낸다.
도 9: 3회의 활성화 마커 측정 중 두번째에서 HSEVGLPVY-특이적 T 세포를 위한 T 세포 수용체 서열 빈도("HSEVGLPVY"는 서열 번호 2로 개시됨): 언급된 공유 T 세포 수용체 서열을 가진 CD137+ T 세포(Y-축) 대 항원-결합 T 세포(X-축). "J", "L", "M", "N", 및 "O"는 각각 표 3에 기재된 참조부호 J, L, M, N, 및 O를 나타낸다.
본 발명은 일반적으로, 면역치료법을 위한 T 세포주를 개발하기 위해 적합한 T 세포 수용체가 T 세포 혼합물(예를 들어, 출발 PBMC 샘플로부터 유래된 미접촉 T 세포의 혼합물)을 항원-결합 및 기능성에 대해 별도로 시험되는 부분들로 분배함으로써 더 빨리 그리고 감소된 수의 단계로 식별될 수 있다는 발견에 기초한다. 각 부분으로부터의 T 세포 수용체는 시퀀싱될 수 있으며 중복 T 세포 수용체는 항원-결합 및 기능성 T 세포 둘 모두에 기초하여, 추가 개발을 위해 식별될 수 있다. 본 발명은 추가로 부분적으로 이 접근법은 출발 샘플의 인 비트로 프라이밍을 반드시 요구하지는 않으며 따라서 T 세포 수용체의 하향조절 및/또는 고농도의 항원에의 노출로 인한 해로운 효과를 감소시킬 수 있다는 발견에 구체적으로 기초한다. 또한, 기능적 시험은 생리학적 농도로 항원을 제시하며 따라서 실제로 기능성 T 세포주를 생성할 T 세포 수용체를 식별할 가능성이 높은 활성화제(예를 들어, 항원 제시 세포 또는 종양 세포)에 T 세포를 노출시킴으로써 수행될 수 있다.
T 세포 수용체는 알파("α") 및 베타("β") 쇄(αβ TCR), 또는 감마 델타("γδ") 쇄(γδ TCR)의 조합으로 이루어지는, 매우 다양한 이종이량체이다. T 세포 수용체 쇄는 항원 인식을 위해 중요한 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어진다. T 세포 수용체 α 및 δ 쇄의 가변 영역은 많은 가변 (V) 및 연결(joining)(J) 유전자에 의해 인코딩되는 한편, T 세포 수용체 β 및 γ 쇄는 다양성(D) 유전자에 의해 부가적으로 인코딩된다. 각각의 TCR 쇄는 그 구조내에 상보성 결정 영역(CDR1-3)으로 불리는 3개의 초가변 루프를 함유한다. CDR1 및 2는 V 유전자에 의해 인코딩되며 TCR과 MHC 복합체의 상호작용을 위해 요구된다. 하지만, CDR3는 V 및 J 또는 D 및 J 유전자 사이의 접합(junctional) 영역에 의해 인코딩되며 따라서 매우 가변적이다. 이것은 펩티드 항원과 직접 접촉하는 TCR의 영역이므로, TCR과 펩티드-MHC 복합체의 상호작용에서 필수적인 역할을 한다. 이러한 이유로, CDR3는 종종 T 세포 수용체 클로노타입을 결정하기 위한 관심 영역으로 사용되며, 이것은 두 T 세포가 동일한 클론 확장 T 세포로부터 유래되지 않았다면 동일한 CDR3 뉴클레오티드 서열을 발현할 가능성은 매우 낮기 때문이다.
따라서, 일부 실시형태는 예를 들어, 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포의 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분을 식별하기 위한 방법, 조성물, 분석, 시스템, 장치 및/또는 키트를 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 T 세포 수용체 클로노타입의 선택 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, T 세포 수용체 클로노타입의 선택 방법은 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, T 세포 수용체 클로노타입의 선택 방법은 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 기능성 T 세포를 식별하기 위하여 미접촉 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 림프구에서 공유 수용체 서열을 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 소정의 타입의 항원에 대한 자극된 림프구 및 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 림프구 혼합물을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 자극된 림프구와 적어도 하나의 공자극된 림프구에 의해 공유된 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, T 세포 수용체를 선택하는 방법은 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 소정의 타입의 항원과 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 하나의 소정의 타입의 항원에 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 결합시키는 단계; 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통인 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, T 세포 수용체를 선택하는 방법은 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포중에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체를 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포증에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, T 세포 수용체를 선택하는 방법은 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포중에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 클래스 I P-MHC 단백질을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포중에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, T 세포 수용체를 선택하는 방법은 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포중에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 클래스 I P-MHC 단백질을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포중에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, T 세포 수용체를 선택하는 방법은 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포중에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체를 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포중에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 그리고 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, T 세포 수용체를 선택하는 방법은 다수의 T 세포로부터, P는 소정의 타입의 항원인 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 제1 T 세포를 단리하는 단계; 다수의 T 세포로부터, 소정의 타입의 항원에 의한 활성화를 나타내는 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 제2 T 세포를 추가로 단리하는 단계; 및 제1 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 제2 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 매칭시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 항원-결합 T 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 T 세포를 검출하는 방법은 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 다수의 결합제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1 결합 T 세포를 적어도 제1 결합제에 결합시키는 단계로서, 다수의 결합제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 포함하는 단계; 및 적어도 제1 결합 T 세포가 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포에 의해 활성화되도록 구성됨을 확인하는 단계를 포함한다. 항원-결합 T 세포는 본 발명에서 또는 통합된 참고문헌 중 하나에서 개시된 대로 결합제를 이용한 분석에 의해 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 기능성 T 세포 수용체 클로노타입을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및 적어도 제1의 기능성 T 세포가, P가 소정의 타입의 항원인 P-로딩된 MHC 단백질에 결합하도록 구성됨을 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 개시된 방법 중 하나 이상을 조합하는 방법을 제공함이 이해된다. 예를 들어, 기능성 T 세포 수용체 클로노타입을 검출하는 방법은 특정 항원에 결합하며 기능성인 T 세포 수용체의 선택을 촉진하기 위하여 항원-결합 T 세포를 검출하는 방법과 조합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 그의 적어도 일부는 P-로딩된 MHC 단백질에 결합되는 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; 그의 적어도 일부는 다수의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 활성화 시그널링 분자를 상향조절하고/하거나 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 제2의 다수의 T 세포를 추가로 단리하고, 여기서 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성이인 단계; 및 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부와 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부 둘 모두에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법은 그의 적어도 일부는 다수의 제1 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제1 활성화 마커를 발현하는 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 단계; 그의 적어도 일부는 다수의 제2 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제2 활성화 마커를 상향조절하고/하거나 하나 이상의 활성화 시그널링 분자를 발현하는 제2의 다수의 T 세포를 추가로 단리하는 단계; 및 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부 및 역치 값 미만의 P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수를 가진 제1의 다수의 T 세포의 일부 중 적어도 하나 및 제2 T 세포의 일부 중 적어도 하나를 식별하는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인 단계를 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 적어도 하나의 T 세포 수용체 클로노타입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 적어도 하나의 T 세포 수용체 알파쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 적어도 하나의 T 세포 수용체 베타쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 수용체 알파 및 베타쇄 적어도 한 쌍을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 결합 T 세포를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 기능성 T 세포를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 적어도 하나의 CDR3 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 CDR3 서열은 16 내지 106 아미노산으로 구성된 아미노산 서열(예를 들어, 선형 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 CDR3 서열은 6 내지 35 아미노산으로 구성된 아미노산 서열(예를 들어, 선형 서열)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 CDR3 서열은 6 내지 12 아미노산으로 구성된 아미노산 서열(예를 들어, 선형 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 CDR3 서열은 줄기 영역을 배제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 CDR3 서열은 CDR3 베타쇄 부분을 포함할 수 있다.
T 세포 수용체의 시퀀싱은 통합된 참고문헌에서 개시된 것과 같은, 당업계에 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 제한없는 예시로서, 시퀀싱은 쿼리(query) DNA의 제한효소 분해 및 이어서 젤 전기영동과 알려진 T 세포 수용체 유전자를 위한 프로브를 이용한 서던 블롯팅; 차세대 시퀀싱(NGS)(예를 들어, 일루미나(Illumina) 시퀀싱 플랫폼, 이온토렌트(IonTorrent), 또는 퍼시픽 바이오사이언시즈(Pacific Biosciences)); 또는 PCR-기반 분석에 의해 수행될 수 있다. 시퀀싱 판독값으로부터 CDR 데이터를 추출하고 클로노타입을 결정하기 위한 여러 접근법이 있다. 예를 들어, CDR3 서열을 특성규명하기 위한 한 가지 예시적인 전략은 T 세포 수용체 프로파일링이며, 이것은 사전설계된 PCR 프라이머를 이용하여 T 세포 수용체 베타-쇄 CDR3(β-CDR3) 유전자좌로부터 cDNA 또는 게놈 DNA를 증폭시킨 후, 딥 시퀀싱(deep sequencing)한다. 다른 예시적인 접근법은 RNA 시퀀싱(RNA-seq)에 기초한 T 세포 수용체 프로파일링에 관련되며, 샘플에 존재하는 모든 전사된 유전자로부터의 데이터를 제공하며, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ의 동시 분석을 가능하게 한다. 하지만, 상기에 개시된 방법은 단지 예시적이며, 당업계에 알려진 임의의 시퀀싱 방법이 T 세포 수용체 서열을 결정하기 위하여 이용될 수 있음이 이해된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포의 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분의 식별은 항원-결합 T 세포(그 중 일부는 항원-활성화될 수 있거나 활성화될 수 없음)를 함유하는 제1 샘플로부터의 T 세포 수용체를 항원-활성화된 T 세포(그 중 일부는 항원-결합일 수 있거나 아닐 수 있음)를 함유한 제2 샘플과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 비교는 제1 샘플로부터의 T 세포와 제2 샘플로부터의 T 세포 사이에 전술한 T 세포 수용체 성분 중 임의의 것을 매칭하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 적어도 8 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 9 아미노산으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 10 아미노산으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 11 아미노산으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 12 아미노산으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 13 아미노산으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 14 아미노산으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 15 아미노산으로 구성된다. 하지만, 펩티드는 또한 15 초과 아미노산으로 구성될 수 있으며 상기 펩티드 길이는 단지 예시적임이 이해된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 8 내지 20 아미노산의 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 펩티드는 8 내지 15 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 8 내지 12 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 펩티드는 적어도 12 아미노산, 예를 들어 13 아미노산, 14 아미노산, 15 아미노산, 16 아미노산, 17 아미노산, 18 아미노산, 19 아미노산, 20 아미노산, 21 아미노산, 22 아미노산, 23 아미노산, 24 아미노산, 25 아미노산, 26 아미노산, 27 아미노산, 28 아미노산, 29 아미노산, 30 아미노산, 31 아미노산, 32 아미노산, 33 아미노산, 34 아미노산, 35 아미노산, 36 아미노산, 37 아미노산, 38 아미노산, 39 아미노산, 또는 40 아미노산으로 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 12 내지 40 아미노산의 펩티드일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 펩티드는 12 내지 30 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 12 내지 20 아미노산으로 구성될 수 있다.
주요 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 및 클래스 II 단백질은 T 세포에 의한 인식을 위해 세포 표면상에 펩티드를 제시하는 일을 공유한다. 면역원성 펩티드-MHC 클래스 I(pMHCI) 복합체는 유핵 세포상에 제시되며 세포독성 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. 한편, 항원-제시 세포[예를 들어, 수지상 세포(DC), 대식세포, 또는 B 세포]에 의한 pMHCII의 제시는 CD4+ T 세포를 활성화시켜, 이펙터 세포의 조정 및 조절로 이끌 수 있다. 모든 경우에, 주어진 pMHC 복합체와 상호작용하며 잠재적으로 지속적인 세포:세포 접촉 형성 및 T 세포 활성화로 이끄는 것은 클로노타입성 T 세포 수용체이다.
따라서, 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원(예를 들어, 펩티드)은 MHC 단백질(예를 들어, MHC 클래스 I 단백질 또는 MHC 클래스 II 단백질)에 대해 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 대해 1000μM 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 대해 100μM 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 대해 50μM 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 대해 10μM 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 대해 1μM 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 대해 0.1μM 미만의 결합 친화성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원은 신생항원(예를 들어, 상응하는 야생형, 모 항원과 구별되게 하는 적어도 하나의 변경을 가진 항원)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 세포에서 돌연변이를 통해 모 항원에 대한 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 프레임시프트(frameshift) 또는 비프레임시프트 삽입결실(indel)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 미스센스(missense) 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 넌센스 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 스플라이스(splice) 부위 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 게놈 재배열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 유전자 융합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 neoORF를 야기하는 게놈 재배열 및/또는 발현 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 게놈 재배열은 하나 이상의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 게놈 재배열은 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 돌연변이는 스플라이스 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 세포에 특이적인 번역후 변형을 통해 모 항원에 대한 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 번역후 변형은 비정상적인 인산화를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 번역후 변형은 프로테아좀-생성된 스플라이스된 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양에서 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양 신생항원은 대상체의 종양 세포 또는 조직에 존재할 수 있으나 대상체의 상응하는 정상 세포 또는 조직에는 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양 신생항원은 대상체의 상응하는 정상 세포 또는 조직에서의 발현에 비하여 대상체의 종양 세포 또는 조직에서 과발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 공유 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 인공 지능 모델은 신경망을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 종양 신생항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양 신생항원은 대상체의 종양 세포 또는 조직에 존재할 수 있으나 대상체의 상응하는 정상 세포 또는 조직에는 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양 신생항원은 대상체의 상응하는 정상 세포 또는 조직에서의 발현에 비하여 대상체의 종양 세포 또는 조직에서 과발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양 신생항원은 통합된 참고문헌에서 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 신생항원은 암의 타입과 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 암은 폐암, 방광암, 위암, 직장암, 자궁내막암, 갑상선암, 신장 유두상 세포, 흑색종, 유방암, 난소암, 전립선암, 신장암, 위암, 결장암, 고환암, 두경부암, 췌장암, 뇌암(예를 들어, 저등급 신경교종, 교모세포종), B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 T 세포 림프구성 백혈병, 비-소세포 폐암(예를 들어, 편평세포 암종(SCC)), 및 소세포 폐암 및 전술한 암 중 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 암은 전술한 군의 서브군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 암은 상피 암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 암은 혈액암일 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 면역원성을 위한 후보 신생항원을 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 후보 신생항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 및 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 신생항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 항원-특이적 백신을 위한 후보 항원을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 후보 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 및 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 VDJdb 데이터베이스(vdjdb.cdr3.net)와 같은, 공지의 항원 특이성을 가진 큐레이트된(curated) T-세포 수용체(TCR) 서열을 함유하는 공중이 이용가능한 데이터베이스로부터 선택된 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 예상된 항원이다. 다른 실시형태에서, 소정의 타입의 항원은 실험적으로 입증된 항원이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 시스템 및 방법을 위한 소스(source) T 세포가 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 PBMC로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 골수로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 흉선으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 조직 생검으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 림프절 조직으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 소화관 연관 림프 조직으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 점막 연관 림프 조직으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 비장 조직으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 림프 조직으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 종양(예를 들어, 본 발명에서 개시된 종양 중 하나)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 T 세포주로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 자가조직 소스로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 동종이계 소스로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 단일 개체로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 단일 개체는 건강할 수 있다(예를 들어, 사전선택된 하나 이상의 질병이 없음). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 단일 개체는 하나 이상의 사전선택 질병(예를 들어, 사전선택 암)을 앓고 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 개체 집단으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 개체 집단은 건강할 수 있다(예를 들어, 사전선택된 하나 이상의 질병이 없음). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 개체 집단은 하나 이상의 사전선택 질병(예를 들어, 사전선택 암)을 앓고 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 개체의 순환 혈액의 백혈구성분채집에 의해 수득된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 개체의 순환 혈액의 성분채집에 의해 수득된 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 수득된 세포는 림프구를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 수득된 림프구는 T 세포 및 선택적으로 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 수득된 세포는 혈장을 제거하고, 소스 T 세포를 수득하기 위한 후속 프로세싱을 위한 적절한 버퍼 또는 배지에 세포를 배치하기 위하여 세척될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 세포는 포스페이트 완충 염수(PBS)로 세척될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 세척액은 칼슘 양이온, 마그네슘 양이온, 또는 모든 2가 양이온이 배제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 세척은 반자동 병류 원심분리기를 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 세척은 액체에서의 재현탁이 이어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 액체는 생체적합성 버퍼를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 생체적합성 버퍼는 무-칼슘 양이온 및 무-마그네슘 양이온 PBS를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 성분채집에 의해 수득된 세포의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있으며 세포는 직접적으로 배양 배지에 재현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 1,000,000개 소스 T 세포에서 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 2,000,000개 소스 T 세포에서 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 5,000,000개 소스 T 세포에서 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 10,000,000개 소스 T 세포에서 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 발명에서 개시된 방법은 T 세포 프라이밍을 배제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 발명에서 개시된 방법은 T 세포 프라이밍의 목적을 위하여 혈액 샘플로부터 항원 제시 세포를 단리할 필요성을 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 프라이밍의 목적을 위하여 혈액 샘플로부터 항원 제시 세포를 단리할 필요성을 제거하는 것은 T 세포 프라이밍을 이용하는 방법에 비하여 필요한 혈액의 총 부피를 적어도 25%(예를 들어, 적어도 50% 또는 30% 내지 70%)만큼 감소시킬 수 있다.
T 세포 단리를 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 단리 방법 중 임의의 방법이 본 발명과 조합되어 이용될 수 있음이 이해된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 적혈구를 용해시키고 퍼콜(PERCOLL)TM 구배를 통해 원심분리하여 말초 혈액 림프구로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 피콜-파크(Ficoll-Paque) 분리에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소스 T 세포는 미세유체역학 장치를 이용하여 말초 혈액 림프구로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 양성 또는 음성 선택은 소스 T 세포로부터 T 세포 혼합물을 수득하기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD28+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 미접촉 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 미접촉 T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 기억 T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD4+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD4+CD8+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD4-CD8+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD4+CD8- T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD45RA+를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD45RO+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 CD3+/CD28+ T 세포를 포함할 수 있다(또는 농축될 수 있다).
상기에 기재한 대로, 양성 선택, 음성 선택 또는 둘의 조합은 소스 T 세포로부터 원하는 T 세포 집단을 수득하기 위하여 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포는 항-마커 작용제(예를 들어, 항체)를 자성 비드에 접합시키고 자기적 분리를 수행함으로써 양으로 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 서브집단은 T 세포 서브집단의 원하지 않는 세포에 고유한 표면 마커에 항체를 접합시킴으로써 음으로 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 음성 선택은 세포 분류를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 음성 선택은 음성 자기적 면역부착을 통한 선택을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 음성 선택은 음성적으로 선택된 세포상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 생성된 단클론 항체의 칵테일을 이용한 유세포분석을 통한 선택을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, CD4+ T 세포에서 농축된 T 세포 혼합물은 소스 T 세포를 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8 중 하나 이상(예를 들어, 전부)에 대한 단클론 항체(예를 들어, 항-비오틴 자성 비드에 연결될 수 있는 비오틴화 단클론 항체)에 노출시킨 후, 농축(예를 들어, 자기적 분리 포함) 및 유세포분석에 의한 특성규명에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, CD8+ T 세포에서 농축된 T 세포 혼합물은 소스 T 세포를 CD45RO, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD57, CD123, 항-HLA-DR, CD235a(글리코포린(Glycophorin) A), CD244, 및 CD4 중 하나 이상(예를 들어, 전부)에 대한 단클론 항체(예를 들어, 항-비오틴 자성 비드에 연결될 수 있는 비오틴화 단클론 항체)에 노출시킨 후, 농축(예를 들어, 자기적 분리 포함) 및 유세포분석에 의한 특성규명에 의해 수득될 수 있다. 양성 선택, 음성 선택 또는 둘의 조합에 대한 상기에 개시된 예는 비제한적이며 원하는 세포 집단에 특이적인 임의의 마커가 양성 선택을 위해 이용될 수 있거나 원치않는 세포 집단에 특이적인 임의의 마커가 음성 선택을 위해 이용될 수 있음이 이해된다.
따라서, 본 발명은 또한 T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 소정의 제1 타입의 항원을 위한 제1 항원-결합 T 세포 및 제1 항원-활성화된 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원을 위한 제2 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포 혼합물을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며 제2 항원-활성화된 T 세포 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법은 소정의 제1 타입의 항원을 위한 제1 항원-활성화된 T 세포 및 제1 항원-결합 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원을 위한 제2 항원-결합 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포 혼합물을 분석하는 단계; 및 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며 제2 항원-결합 T 세포 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 세척된(예를 들어, 본 발명에서 개시된 대로 세척됨) 소스 T 세포를 동결 용액에서 동결시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 동결 용액은 PBS를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, PBS는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(예를 들어, 20% DMSO와 같은 5-40% DMSO)를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, PBS는 인간 혈청 알부민(HSA)(예를 들어, 8% HSA와 같은 1-30% HSA)을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 동결 용액은 다른 적합한 세포 동결 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 동결 용액은 비-희석 동결 용액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 동결 용액은 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 동결 용액은 배지와 1:1 희석된 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA)(또는 다른 적합한 세포 동결 성분)을 함유하는 PBS를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포 혼합물은 -80℃로 동결되고 액화질소 저장 탱크의 증기상에 저장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 1,000개 T 세포중 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 10,000개 T 세포중 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 100,000개 T 세포중 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 1,000,000개 T 세포중 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 10,000,000개 T 세포중 1개 T 세포 미만에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 적어도 0.0005%의 T 세포에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 적어도 0.005%의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 적어도 0.05%의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 적어도 0.5%의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 적어도 5%의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 적어도 10%의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 적어도 15%의 T 세포에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 5% 미만의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 0.5% 미만의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 0.005% 미만의 T 세포에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 성분은 T 세포 혼합물에서 0.0005% 미만의 T 세포에 존재할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 집단으로부터 T 세포의 서브집단을 (예를 들어, 통합된 참고문헌에서 개시된 방법, 분석 또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여) 농축하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 농축은 소정의 타입의 항원에 대해 항원-결합 또는 항원-활성화를 나타내는 T 세포 서브집단을 농축하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 농축은 T 세포 집단을 결합제와 접촉시킨 후, T 세포 집단으로부터 결합제에 결합된 서브집단의 구성원을 분리하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합제는 소정의 타입의 항원(또는 항원의 일부)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합제는 MHC 단백질의 적어도 일부에 결합된 소정의 타입의 항원의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, MHC 단백질은 MHC 클래스 I 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, MHC 단백질은 MHC 클래스 II 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합제는 앱타머(aptamer)에 결합된 소정의 타입의 항원의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합제는 아피머(affimer)에 결합된 소정의 타입의 항원의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합제는 항체에 결합된 소정의 타입의 항원의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합제는 다량체(예를 들어, MHC 단백질의 적어도 일부에 결합된 소정의 타입의 항원의 적어도 일부를 포함하는 사량체)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 결합제는 자기적 분리를 촉진하기 위하여 자성 비드에 또는 형광 유세포분석을 통한 분리를 촉진하기 위하여 형광단에 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 구성원은 0.01μM 내지 1000μM의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 구성원은 0.1μM 내지 100μM의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 0.5μM 내지 50μM의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 1μM 내지 50μM의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 1μM 내지 25μM의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 25μM 내지 75μM의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 10μM 내지 50μM의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다.
추가 실시형태에서, 예를 들어, 구성원은 1000μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 100μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 75μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 50μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 40μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 30μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 20μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 10μM 미만의 해리 상수로 결합제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 구성원은 0.1초 내지 100초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 구성원은 1초 내지 50초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 1초 내지 25초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 1초 내지 10초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 2초 내지 10초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 2초 내지 7초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 2초 내지 5초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 구성원은 적어도 0.1초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 구성원은 적어도 0.5초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 적어도 1초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 적어도 2초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 적어도 5초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성원은 적어도 10초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 구성원은 50μM 미만의 해리 상수와 2초 내지 10초의 반감기로 결합제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, 하나 이상의 T 세포를 (예를 들어, 통합된 참고문헌에서 개시된 방법, 분석 또는 시스템 중 하나 이상을 이용하여) 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 확장은 소정의 타입의 항원에 대해 항원-결합 또는 항원-활성화를 나타내는 것으로 양으로 선택된 다수의 T 세포를 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 확장은 다클론성 확장을 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 예를 들어, T 세포 출발 혼합물을 여러번, 예를 들어, 2번,연속적으로 농축시키고 이어서 확장시킴으로써(즉, 농축→확장→농축 또는 농축→확장→농축→확장) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 집단을 점진적으로 농축시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 출발 혼합물은 적어도 3회 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 출발 혼합물은 적어도 4회 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 출발 혼합물은 적어도 5회 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 출발 혼합물은 5회 초과 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 점진적으로 농축된 집단(즉, 연속 농축 후 생긴 T 세포 집단)의 일부는 항원-활성화에 대해 추가로 선택될 수 있다(예를 들어, 항원-결합 T 세포의 점진적으로 농축된 집단을 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포에 노출시키고 하나 이상의 활성화 마커의 존재에 기초하여 추가 농축시킴에 의해).
일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원-활성화된 T 세포는 T 세포를 활성화제와 접촉시킴으로써 형성될 수 있으며, 생성된 항원-활성화된 T 세포는 하나 이상의 활성화 마커 및/또는 분비된 분자의 발현에 의해 검출함으로써 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원-활성화된 T 세포는 T 세포를 활성화제와 접촉시킴으로써 형성될 수 있으며, 생성된 항원-활성화된 T 세포는 본 발명에서 또는 통합된 참고문헌 중 하나에서 개시된 대로 하나 이상의 활성화 마커의 발현을 검출함으로써 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 활성화 마커는 세포 표면 마커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 활성화 마커는 시그널링 분자(예를 들어, T 세포 활성화에 반응하여 상향조절된 분자)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 하나 이상의 활성화 마커 및/또는 분비된 분자는 CD137(4-1BB, 또는 Tnsfr9로도 알려짐), 인터페론 감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 인터루킨-2(IL-2), CD69, MHC 클래스 I 단백질의 상향조절, MHC 클래스 II 단백질의 상향조절, Ki67, 퍼포린, 그랜자임, CD122, CD27, CD28, CD95, CD134, 킬러-세포 렉틴 유사 수용체 G1(KLRG1), CD38, CD154, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 활성화 마커는 CD137일 수 있다. 다른 실시형태에서, 활성화 마커는 IFN-γ일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 TNFα일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 IL-2일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 CD69일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 MHC 클래스 I 단백질의 상향조절일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 MHC 클래스 II 단백질의 상향조절일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 Ki67일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 CD137 및 IFN-γ일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 마커는 CD137, IFN-γ, 및 IL-2일 수 있다. 상기에 개시된 예시적인 활성화 마커는 비제한적이며, 당업계에 알려진 임의의 T 세포 활성화 마커가 본 발명에서 제공된 내용에서 이용될 수 있음이 이해된다.
본 발명은 또한 T 세포 활성화 마커를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 다수의 P-결합 T 세포를 포함하는 제1의 다수의 T 세포를 다수의 P-제시 세포와 접촉시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계; 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부에 대해 다수의 발현율 프로파일을 측정하는 단계; 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부를 다수의 T 세포 클러스터로 분배하는 단계; 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부에 존재하는 적어도 2개의 T 세포에서 P에 대한 기능성 반응을 측정하는 단계; 발현율 프로파일을 다수의 T 세포 클러스터에 맵핑하여 적어도 2개의 T 세포를 포함하는 다수의 T 세포 클러스터 중 하나를 식별하는 단계; 및 적어도 2개의 T 세포에 의해 발현되는 활성화 마커를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 둘 이상의 활성화 마커 및/또는 분비된 분자는 T 세포의 별도의 부분 및 식별된 동일한 적어도 하나의 T 세포 성분을 공유하는 두 부분 사이의 개별 T 세포에서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 둘 이상의 활성화 마커 및/또는 분비된 분자는 T 세포의 단일 부분에서 함께 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 소정의 타입의 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 추가로 공자극 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공자극 리간드는 CD28, CD80(B7-1), CD86(B7-2), B7-H3, 4-1BBL, 4-1BB, CD27, CD30, CD134(OX-40L), B7h(B7RP-1), CD40, LIGHT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, HVEM에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, CD40L에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드 하나 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공자극 리간드는 단클론 항체, F(ab')2, Fab, scFv, 및 단일쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공자극 리간드는 인간화 단클론 항체 또는 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공자극 리간드는 CD28에 대한 인간화 쥐 단클론 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 공자극 리간드는 인간화 단클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 소정의 타입의 항원(예를 들어, MHC 단백질과 복합된 소정의 타입의 항원) 및 공자극 리간드는 상자성 입자의 표면에 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 세포 표면상의 소정의 타입의 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 하나 이상의 수지상 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 하나 이상의 항원 제시 세포(예를 들어, 하나 이상의 전문 항원 제시 세포)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 하나 이상의 인공 항원 제시 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 하나 이상의 대식세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 하나 이상의 B 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 하나 이상의 암세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암세포는 고형 종양에서 온다. 일부 실시형태에서, 암세포는 혈액 악성종양에서 온다. 다른 추가 실시형태에서, 암세포는 순환 종양 세포이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 암은 폐암, 흑색종, 유방암, 난소암, 전립선암, 신장암, 위암, 결장암, 고환암, 두경부암, 췌장암, 뇌암, B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 T 세포 림프구성 백혈병, 비-소세포 폐암, 및 소세포 폐암 및 전술한 암 중 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 암은 전술한 군의 서브군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 암 종양을 위한 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 폐암, 흑색종, 유방암, 난소암, 전립선암, 신장암, 위암, 결장암, 고환암, 두경부암, 췌장암, 뇌암, B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 T 세포 림프구성 백혈병, 비-소세포 폐암, 및 소세포 폐암 및 전술한 암 중 둘 이상의 조합을 위한 종양으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 종양은 전술한 군의 서브군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전술한 활성화제 중 임의의 것은 다량의 소정의 타입의 항원으로 항원-로딩함으로써 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 항원-로딩은 활성화제상에 소정의 농도의 소정의 타입의 항원을 제시하도록 구성될 수 있다(예를 들어, 각각의 활성화제는 유사한 농도의 소정의 타입의 항원을 가질 수 있다). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 항원-로딩을 배제하고 형성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 생리학적 관련 농도의 소정의 타입의 항원을 제시할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 활성화제는 소정의 기간동안 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액으로 다수의 세포를 펄싱함으로써 결정된 농도의 소정의 타입의 항원을 제시할 수 있으며, 용액은 0.000001 μM 내지 100μM의 농도의 소정의 타입의 항원을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.000001μM 내지 0.00001μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.00001μM 내지 0.0001μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.0001μM 내지 0.001μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.001μM 내지 0.01μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.01μM 내지 0.1μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.0001μM 내지 100μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.001μM 내지 100μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.01μM 내지 10μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 0.1μM 내지 10μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 1μM 내지 100μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 1μM 내지 50μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 1μM 내지 25μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 5μM 내지 25μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 10μM 내지 100μM의 농도이다. 일부 실시형태에서, 소정의 타입의 항원을 함유하는 용액은 10μM 내지 30μM의 농도이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 용액은 100μM 미만의 농도의 소정의 타입의 항원을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용액은 75μM 미만의 농도의 소정의 타입의 항원을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용액은 50μM 미만의 소정의 타입의 항원을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용액은 25μM 미만의 소정의 타입의 항원을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용액은 10μM 미만의 소정의 타입의 항원을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용액은 1μM 미만의 소정의 타입의 항원을 함유할 수 있다.
전술한 실시형태 중 임의의 것에서, 예를 들어, 소정의 기간은 1 시간 내지 36 시간일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 6 시간 내지 24 시간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 6 시간 내지 12 시간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 12 시간 내지 24 시간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 9 시간 내지 18 시간일 수 있다.
전술한 실시형태 중 임의의 것에서, 예를 들어, 소정의 기간은 적어도 1 시간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 적어도 4 시간일 수 있다. 소정의 기간은 적어도 8 시간일 수 있다. 소정의 기간은 적어도 12 시간일 수 있다. 소정의 기간은 적어도 18 시간일 수 있다. 소정의 기간은 적어도 24 시간일 수 있다.
전술한 실시형태 중 임의의 것에서, 예를 들어, 소정의 기간은 168 시간 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 72 시간 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 36 시간 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 24 시간 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 기간은 12 시간 미만일 수 있다.
전술한 실시형태 중 임의의 것에서, 예를 들어, 소정의 기간은 한번 이상 반복될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 활성화제는 본 발명에서 개시된 소정의 기간 중 어느 기간 동안 소정의 타입의 항원을 함유한 용액으로 다수의 세포를 펄싱한 후, 한번 더 재-공격함으로써 본 발명에서 개시된 농도 중 임의의 농도의 소정의 타입의 항원을 제시할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 2번 더 재-공격된다. 추가 실시형태에서, 항원은 3번 더 재-공격된다. 다른 추가 실시형태에서, 항원은 4번 더 재-공격된다. 더 추가의 실시형태에서, 항원은 5번 더 재-공격된다. 다른 실시형태에서, 항원은 5번보다 더 많이 재-공격된다. 일부 실시형태에서, 항원은 10번보다 더 많이 재-공격된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 일부 T 세포는 활성화된 T 세포를 형성하기 위하여 0.01μM 내지 1000μM의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 0.1μM 내지 100μM의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 0.5μM 내지 50μM의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 1μM 내지 50μM의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 1μM 내지 25μM의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 25μM 내지 75μM의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 10μM 내지 50μM의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 일부 T 세포는 1000μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 100μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 75μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 50μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 40μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 30μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 20μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 10μM 미만의 해리 상수로 활성화제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 일부 T 세포는 항원-활성화된 T 세포를 형성하기 위하여 0.1초 내지 100초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 1초 내지 50초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 1초 내지 25초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 1초 내지 10초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 2초 내지 10초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 2초 내지 7초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 2초 내지 5초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 일부 T 세포는 적어도 0.1초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 적어도 0.5초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 적어도 1초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 적어도 2초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 적어도 5초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 T 세포는 적어도 10초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 일부 T 세포는 항원-활성화된 T 세포를 형성하기 위하여 50μM 미만의 해리 상수 및 2초 내지 10초의 반감기로 활성화제와 결합할 수 있다.
소정의 타입의 항원(예를 들어, 머신 러닝을 이용하여 그 파라미터가 조정되는 모델에 의해 선택된 신생항원을 포함하는, 개인화된 신생항원 또는 공유 신생항원과 같은 신생항원)에 대한 항원-결합 T 세포와 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되는 적어도 일부를 가진 T 세포 수용체를 식별하는 방법의 개략도가 도 1에 나타난다. 다수의 상이한 T 세포를 함유하는 혼합물을 수득하기 위하여 샘플을 프로세싱한다(100). 혼합물은 예를 들어, CD45RO, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD57, CD123, 항-HLA-DR, CD235a(글리코포린 A), CD244, 및 CD4 중 하나 이상에 대해 양성인 세포를 제거하기 위하여 건강한 공여체로부터의 백혈구성분채집술 샘플을 프로세싱하여 수득된 PBMC와 같은 PBMC를 포함할 수 있다. 다수의 상이한 T 세포는 예를 들어, 건강한 공여체로부터의 미접촉 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 혼합물은 P-로딩된 MHC 단백질(여기서, P는 소정의 타입의 항원)과 항온처리 후 거기에 결합된 T 세포를 단리함으로써 미접촉 CD8+ T 세포에 대해 농축된다(102). P-로딩된 MHC 단백질은 예를 들어, 자기적-라벨링된 다량체(자기적 분리에 의한 단리를 촉진하기 위함) 또는 형광적-라벨링된 다량체(형광 유세포분석을 통한 단리를 촉진하기 위함)의 형태로 제공될 수 있다. 단리된 T 세포는 예를 들어, 다클론 확장에 의해 확장되고(104), 제1, 제2 및 선택적인 제3 T 세포 집단으로 분배된다. 제1 T 세포 집단은 P-로딩된 MHC 단백질과 항온처리 후 거기에 결합된 P-결합 T 세포를 단리함으로써 P-결합 T 세포에 대해 평가된다(106). 제2 T 세포 집단은 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포에 노출시키고, T 세포 활성화를 나타내는 활성화 마커 또는 분비된 분자를 검출하고, 그리고 활성화된 T 세포를 단리함으로써 P-활성화된 T 세포에 대해 평가된다(108). 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포는 예를 들어, 생리학적 관련 양의 소정의 타입의 항원을 제시할 수 있다. 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포는 예를 들어, 전문 항원 제시 세포일 수 있다. 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포는 예를 들어, 대상체로부터의 종양 세포일 수 있다. 활성화 마커는 예를 들어, CD137을 포함할 수 있다. P-활성화된 T 세포는 자기적으로 라벨링된 항-활성화 마커 항체와 접촉시킨 후 자기적 분리함으로써 단리될 수 있다. 선택적 제3 T 세포 집단은, 존재한다면, 또한 소정의 타입의 항원을 제시하는 추가 세포에 노출시키고, T 세포 활성화를 나타내는 추가의 활성화 마커 또는 추가의 분비된 분자를 검출하고, 그리고 추가의 P-활성화된 T 세포를 단리함으로써 P-활성화된 T 세포에 대해 평가된다(110). 단리된 P-결합 T 세포 및 P-활성화된 T 세포로부터의 T 세포 수용체는 단일 세포 수준에서 시퀀싱되며(112, 114, 116) 생성된 서열은 P-결합 T 세포, P-활성화된 T 세포, 및 선택적으로 추가의 P-활성화된 T 세포 간에 공통되는 서열의 적어도 일부를 가진 T 세포 수용체를 식별하기 위하여 비교된다(118).
도 1은 일부 예시적인 실시형태를 개시하지만, 다른 변형도 본 발명의 범위내에 속한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, PBMC는 전혈 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 상이한 T 세포는 CD-4+ T 세포를 포함할 수 있으며 혼합물은 CD-4+ T 세포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 상이한 T 세포는 기억 T 세포를 포함할 수 있으며 혼합물은 기억 T 세포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 프로세싱은 농축을 위해 바람직한 T 세포의 조성에 따라 나타난 것과 상이한 바이오마커 패널의 제거를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 확장된 T 세포는 제2 및 제3 활성화 마커 및/또는 분비된 분자에 대해 시험하기 위하여 제3 및 제4 T 세포 집단으로 추가 분배될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-활성화된 T 세포는 형광-라벨링된 항-활성화 마커 항체와 접촉하고 형광 유세포분석기를 통과함에 의해 단리될 수 있다.
소정의 타입의 항원(예를 들어, 머신 러닝을 이용하여 그 파라미터가 조정되는 모델에 의해 선택된 신생항원을 포함하는, 개인화된 신생항원 또는 공유 신생항원과 같은 신생항원)에 대한 항원-결합 T 세포와 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되는 적어도 일부를 가진 T 세포 수용체를 식별하는 음성 선택 단계를 포함하는 방법의 개략도가 도 2에 나타난다. 다수의 상이한 T 세포를 함유하는 혼합물을 수득하기 위하여 샘플을 프로세싱한다(200). 혼합물은 예를 들어, CD45RO, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD57, CD123, 항-HLA-DR, CD235a(글리코포린 A), CD244, 및 CD4 중 하나 이상에 대해 양성인 세포를 제거하기 위하여 건강한 공여체로부터의 백혈구성분채집술 샘플을 프로세싱하여 수득된 PBMC와 같은 PBMC를 포함할 수 있다. 다수의 상이한 T 세포는 예를 들어, 건강한 공여체로부터의 미접촉 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 혼합물은 P-로딩된 MHC 단백질(여기서, P는 소정의 타입의 항원)과 항온처리 후 거기에 결합된 T 세포를 단리함으로써 미접촉 CD8+ T 세포에 대해 농축된다(202). P-로딩된 MHC 단백질은 예를 들어, 자기적-라벨링된 다량체(자기적 분리에 의한 단리를 촉진하기 위함) 또는 형광적-라벨링된 다량체(형광 유세포분석을 통한 단리를 촉진하기 위함)의 형태로 제공될 수 있다. 단리된 T 세포는 예를 들어, 다클론 확장에 의해 확장되고(204), 제1, 제2 및 제3 T 세포 집단으로 분배된다. 제1 T 세포 집단은 P-로딩된 MHC 단백질과 항온처리 후 거기에 결합된 P-결합 T 세포를 단리함으로써 P-결합 T 세포에 대해 평가된다(206). 제2 T 세포 집단은 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포에 노출시키고, T 세포 활성화를 나타내는 활성화 마커 또는 분비된 분자를 검출하고, 그리고 활성화된 T 세포를 단리함으로써 P-활성화된 T 세포에 대해 평가된다(208). 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포는 예를 들어, 생리학적 관련 양의 소정의 타입의 항원을 제시할 수 있다. 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포는 예를 들어, 전문 항원 제시 세포일 수 있다. 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포는 예를 들어, 대상체로부터의 종양 세포일 수 있다. 활성화 마커는 예를 들어, CD137을 포함할 수 있다. P-활성화된 T 세포는 자기적으로 라벨링된 항-활성화 마커 항체와 접촉시킨 후 자기적 분리함으로써 단리될 수 있다. 제3 T 세포 집단은 상이한 타입의 항원 Q를(Q는 P와 상이함) 제시하는 추가 세포에 노출시키고, T 세포 활성화를 나타내는 추가의 활성화 마커 또는 추가의 분비된 분자를 검출하고, 그리고 Q-활성화된 T 세포를 단리함으로써 Q-활성화된 T 세포에 대해 평가된다(210). 단리된 P-결합 T 세포, P-활성화된 T 세포 및 Q-활성화된 T 세포로부터의 T 세포 수용체는 단일 세포 수준에서 시퀀싱되며(212, 214, 216) 생성된 서열은 P-결합 T 세포와 P-활성화된 T 세포간에 공통되지만 Q-활성화된 T 세포 간에는 존재하지 않는 서열의 적어도 일부를 가진 T 세포 수용체를 식별하기 위하여 비교된다(218).
도 2는 일부 예시적인 실시형태를 개시하지만, 다른 변형도 본 발명의 범위내에 속한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, PBMC는 전혈 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 상이한 T 세포는 CD-4+ T 세포를 포함할 수 있으며 혼합물은 CD-4+ T 세포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 상이한 T 세포는 기억 T 세포를 포함할 수 있으며 혼합물은 기억 T 세포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 프로세싱은 농축을 위해 바람직한 T 세포의 조성에 따라 나타난 것과 상이한 바이오마커 패널의 제거를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 확장된 T 세포는 추가의 활성화 마커 및/또는 분비된 분자를 이용하여 P-활성화된 및/또는 Q-활성화된 T 세포에 대해 평가하기 위하여 제3 및 제4 T 세포 집단(또는 심지어 추가의 T 세포 집단)으로 추가 분배될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 확장된 T 세포는 추가의 소정의 항원에 의해(즉, Q에 더하여) 활성화된 T 세포에 대해 음성 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, T 세포는 활성화보다는 소정의 항원에의 결합에 기초하여 음성적으로 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, P-활성화된 T 세포는 형광-라벨링된 항-활성화 마커 항체와 접촉하고 형광 유세포분석기를 통과함에 의해 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 제3 T 세포 집단은 항원의 부재하에서 활성화에 대해 거짓-양성 결과를 보여주는 T 세포를 검출하고 단리하기 위하여 Q 없이 배지에서 시험될 수 있다.
소정의 타입의 항원(예를 들어, 머신 러닝을 이용하여 그 파라미터가 조정되는 모델에 의해 선택된 신생항원을 포함하는, 개인화된 신생항원 또는 공유 신생항원과 같은 신생항원)에 대한 T 세포 수용체의 활성화를 나타내는 활성화 마커를 식별하는 방법의 개략도가 도 3에 나타난다. 다수의 상이한 T 세포를 함유하는 혼합물을 수득하기 위하여 샘플을 프로세싱한다(300). 혼합물은 예를 들어, CD45RO, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD57, CD123, 항-HLA-DR, CD235a(글리코포린 A), CD244, 및 CD4 중 하나 이상에 대해 양성인 세포를 제거하기 위하여 건강한 공여체로부터의 백혈구성분채집술 샘플을 프로세싱하여 수득된 PBMC와 같은 PBMC를 포함할 수 있다. 다수의 상이한 T 세포는 예를 들어, 건강한 공여체로부터의 미접촉 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 혼합물은 P-로딩된 MHC 단백질(여기서, P는 소정의 타입의 항원)과 항온처리 후 거기에 결합된 T 세포를 단리함으로써 미접촉 CD8+ T 세포에 대해 농축된다(302). P-로딩된 MHC 단백질은 예를 들어, 자기적-라벨링된 다량체(자기적 분리에 의한 단리를 촉진하기 위함) 또는 형광적-라벨링된 다량체(형광 유세포분석을 통한 단리를 촉진하기 위함)의 형태로 제공될 수 있다. 단리된 T 세포는 예를 들어, 다클론 확장에 의해 확장되고(304), 제1, 및 제2 T 세포 집단으로 분배된다. 제1 T 세포 집단은 P-로딩된 MHC 단백질과 항온처리 후 거기에 결합된 P-결합 T 세포를 단리하고 단일 세포 수준에서 단리된 P-결합 T 세포에 대한 T 세포 수용체를 시퀀싱(308)함으로써 P-결합 T 세포에 대해 평가된다(306). 제2 T 세포 집단은 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포 및 제2 T 세포 집단의 어느 구성원이 활성화되는지 결정하기 위하여 측정된 적어도 제1 활성화 마커(예를 들어, CD137 및/또는 본 발명에서 개시된 것과 같은 활성화를 나타내는 분비된 분자, 예를 들어, 인터페론 감마)와 항온처리되고(310), 이어서 단일 세포 수준에서 제2 T 세포 집단을 위한 T 세포 수용체의 유전적 발현 프로파일(예를 들어, 전사체 분석에 의해) 및 서열을 결정한다(312). 제2 T 세포 집단은 (a) 제2 T 세포 집단을 다수의 T 세포 클러스터로 (비유적으로) 분배하고; 제2 T 세포 집단을 위한 T 세포 수용체의 서열을 제1 T 세포 집단을 위한 P-결합 T 세포의 T 세포 수용체 서열과 비교하여 다수의 T 세포 클러스터내의 P-결합 클러스터를 식별하고; (c) 식별된 P-결합 클러스터중 어느 것이 적어도 제1 활성화 마커를 제시하는 세포의 적어도 역치 수를 함유하는지를 검출함으로써 분석된다(314). 검출된 P-결합 클러스터를 위한 유전적 발현 프로파일은 T 세포의 P-활성화의 특징인 추가 활성화 마커를 식별하기 위해 평가된다(316).
도 3은 일부 예시적인 실시형태를 개시하지만, 다른 변형도 본 발명의 범위내에 속한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, PBMC는 전혈 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 상이한 T 세포는 CD-4+ T 세포를 포함할 수 있으며 혼합물은 CD-4+ T 세포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다수의 상이한 T 세포는 기억 T 세포를 포함할 수 있으며 혼합물은 기억 T 세포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 프로세싱은 농축을 위해 바람직한 T 세포의 조성에 따라 나타난 것과 상이한 바이오마커 패널의 제거를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 적어도 제1 활성화 마커의 검출에 기초하여 클러스터를 형성하기보다는, 클러스터는 T 세포 수용체 서열의 유사성에 기초하여 형성될 수 있다(예를 들어, 소정의 역치보다 높은 서열 동일성을 특징으로 하는 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 가진 T 세포의 클러스터). 일부 실시형태에서, 예를 들어, 선택된 클러스터링 방법은 적어도 제1 활성화 마커에 의존할 수 없으며 적어도 제1 활성화 마커의 측정은 생략된다.
본 발명은 또한 본 발명에서 개시된 방법의 성분 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명은 소정의 타입의 항원에 선택적인 인공 T 세포 수용체, 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 천연 T 세포의 혼합물을 분석하고; 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별함으로써 선택된 CDR3 영역의 적어도 일부 - 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 CDR3 영역의 적어도 일부를 함유함 - ; 및 T 세포 수용체 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성화 마커를 가진 P-결합 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에서 제공된 방법을 이용하여 식별된 T 세포 수용체를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에서 제공된 방법을 이용하여 식별된 T 세포 수용체 클로노타입을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에서 개시된 방법과 조성물의 성분 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 키트는 소정의 타입의 항원을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키트는 활성화 마커를 식별하기 위한 분석물을 포함한다. 추가 실시형태에서, 키트는 소정의 타입의 항원에 선택적인 인공 T 세포 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 T 세포 수용체 클로노타입을 포함한다. 본 발명에서 포괄되는 키트는 본 발명에서 개시된 임의의 방법에서 사용될 수 있음이 추가로 이해된다.
참고로 통합
제한없이, 하기의 문서는 그 전체가 참고로 본원에 통합된다: 미국 특허 출원 공개 Nos. 2017/0212984호; 2017/0192011호; 2017/0003288호; 미국 특허 10,055,540호; 10,066,265호; 국제 특허 출원 공개 Nos. WO 2018/175585호; WO 2018/165475호; WO 2018/085453호; WO 2017/075141호; WO 2015/106151호; 유럽 특허 No. EP 2327763호; 유럽 특허 출원 No. EP 2327763호; Alanio, C. et al., "Enumeration of human-antigen-specific CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies," Blood 115:18 (2010) 3718-3725; Moon, J. J. et al., "Naive CD4+ T cell frequencies varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude," Immunity 27:2 (August 2007) 203-213; Rius, C. et al., "Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail to Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations," J. Immunology 200 (2018) 2263-2279; Aleksic, M. et al., "Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors - implications for therapeutic strategies," European J. Immunology 42:12 (December 2012) 3174-3179; Dimopoulos, N. et al., "Combining MHC tetramer and intracellular cytokine staining for CD8+ T cells to reveal antigenic epitopes naturally presented on tumor cells," J. Immunological Methods 340 (2009) 90-94; Kao H. et al., "A New Strategy for Tumor Antigen Discovery Based on in Vitro Priming of Naive T cells with Dendritic Cells," Clinical Cancer Research 7 (2001) 773s-780s; Glanville, J. et al. "Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire," Nature 547:7661 (2017) 94-98; Bulik-Sullivan, B. et al., "Deep learning using tumor HLA peptide mass spectrometry datasets improves neoantigen identification," Nature Biotechnology, AOP (December 11, 2018) 1-14; De Simone, D., "Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges," Frontiers In Immunology 9 (2018) Article 1638, 7 pages; Bossi, G., et al., "Examining the presentation of tumor-associated antigens on peptide-pulsed T2 cells" OncoImmunology 2:11 (2013) e26840-1 to e26840-6; Purbhoo, M.A., et al., "Quantifying and Imaging NY-ESO-1/LAGE-1-Derived Epitopes on Tumor Cells Using High Affinity T cell receptors" J Immunology 176 (2006) 7308-7316, Rosati et al., "Overview of methodologies for T-cell receptor repertoire analysis" BMC Biotechnology (2017) 17(1):61; Mahe, E. et al., "T cell clonality assessment: past, present and future" J Clin Pathol. (2018) Mar;71(3):195-200; 및 Bagaev DV, et al. "VDJdb in 2019: database extension, new analysis infrastructure and a T-cell receptor motif compendium," Nucleic Acids Res. 2020 Jan 8;48(D1):D1057-D1062(종합하여, "통합된 참고문헌").
실시예
실시예 1. ASSLPTTMNY(서열 번호 1) 특이적 T 세포를 위한 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포 수용체의 식별
본 실시예는 항원 특이적이고 기능성인 T 세포에 존재하는 T 세포 수용체 클로노타입이 예시적 항원으로서 ASSLPTTMNY(서열 번호 1)를 그리고 클래스 I MHC 분자를 인코딩하는 예시적 유전자로서 HLA-A*0101을 이용하여 성공적으로 식별되고 선택될 수 있었음을 보여준다. 본 발명에서 제공된 실시예는 예시적 항원으로서 ASSLPTTMNY(서열 번호 1)를 이용하여 설명되지만, 본 방법은 길이가 50 아미노산 미만인 임의의 항원을 이용하여 수행될 수 있음이 이해된다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 HLA-A*0101-매칭된 건강한 공여체로부터의 백혈구성분채집술 샘플로부터 수득하였다. PBMC를 비오틴화 항체에 노출시켜 CD45RO, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD57, CD123, 항-HLA-DR, CD235a(글리코포린 A), CD244, 및 CD4에 대해 양성인 세포를 제거하고 스트렙타비딘-코팅된 마이크로비드로 자기적 라벨링한 후, 자기적으로 분류하였다. 청정화된 PBMC로부터 수득한 미접촉 CD8+ T 세포를 생/사 및 계통 마커로 염색하고 형광 유세포 분석 세포 분류기를 통과시켜 단리하였다. 미접촉 CD8+ T 세포를 다클론성 확장시켜 T 세포 샘플을 수득하였다. T 세포 샘플을 그 후 항원 결합 및 항원-활성화된 T 세포 수용체의 식별을 위하여 세 부분으로 나누고, 분석을 두벌로 수행하였다.
항원-결합 T 세포에서 나타난 T 세포 수용체 서열을 결정하기 위하여, 항원-MHC 시험을 예시적 항원으로서 ASSLPTTMNY(서열 번호 1)를 이용하여 수행하였다. T 세포 샘플의 제1 부분을 형광 리포터-라벨링된 항원-MHC 단백질 사량체로 염색하고 형광 유세포분석 세포 분류기를 통과시켰다. 형광 리포터에 대해 양성으로 염색된 T 세포는 항원-결합을 나타냈다.
병행하여, 예시적 항원 ASSLPTTMNY(서열 번호 1)에의 노출 후 T 세포 활성화를, 세포의 한 부분에서는 CD137 발현을, 그리고 세포의 다른 부분에서는 IFN-γ 분비를 별도로 측정하여 결정하였다. 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 패밀리의 구성원인 CD137을 CD4+ 및 CD8+ T 세포 구획 둘 모두에서 항원-반응성 세포를 식별하기 위하여 성공적으로 이용하였다. IFN-γ 분비는 T 세포 기능성 반응을 나타내는 예시적인 사이토카인으로서 이용하였다.
CD137 발현을 검출하기 위하여, T 세포 샘플의 일부를 10μM의 예시적 ASSLPTTMNY(서열 번호 1) 항원으로 펄싱된 자가조직 PBMC로 밤새 자극하고, 자기적으로 라벨링된 CD137 항체로 염색하고 자기적 분리에 의해 단리하였다. CD137에 대해 양성으로 염색된 세포는 특정 항원에 대한 반응으로 T 세포 활성화를 나타냈다.
IFN-γ 분비를 검출하기 위하여, T 세포 샘플의 다른 부분을 10μM의 항원으로 펄싱된 자가조직 PBMC로 밤새 자극하고, IFN-γ를 발현하는 세포를 단리하기 위하여 밀테니(Miltenyi) IFN-γ 분비 분석을 이용하여 분석하였다. IFN-γ를 분비한 세포는 특정 항원에 대한 반응으로 T 세포 활성화를 나타냈다.
상이한 분석의 각각 후에, 양성 히트(hit)를 시퀀싱하여 T 세포 수용체 서열을 결정하였다. T 세포를 면역 TCR 프로파일링과 짝을 이룬 10x 게노믹스(Genomics) 단일 세포 분해(resolution)를 이용하여 단일 세포 수준에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 판독값에 크롬 세포 바코드 및 고유 분자 식별자로 태그를 붙이고 완전한 T 세포 수용체 서열의 빈도를 결정하였다.
CD137+ T 세포 항원에 결합한 T 세포의 T 세포 수용체 서열간의 비교(도 4), 및 IFN-γ 분비 T 세포와 항원에 결합한 T 세포의 T 세포 수용체 서열간의 비교(도 5)는 T 세포 수용체 서열이 항원-결합 및 T 세포 활성화 둘 모두의 높은 빈도를 나타낸 T 세포에 대해 식별될 수 있었음을 보여주었다. 또한, 결과는 T 세포 수용체 서열이(참조부호 "A") CD137 분석 및 IFN-γ 분비 분석 둘 모두를 이용하여 식별될 수 있음을 나타냈다(표 2).
참조부호 "A"의 서열은
Figure pct00001
의 펩티드 서열을 가진 알파 가변 영역, 및
Figure pct00002
의 베타 가변 영역을 보여주었다.
TCR 알파 및 베타 쇄는 상보성 결정 영역으로 불리는 3개의 초가변 영역 (CDR1, 2 및 3)을 보유한다. CDR3는 프로세싱된 항원 펩티드를 인식하고 결합하는 데에 관여하며, T 세포의 클론성 확장으로 이끈다. T-세포 수용체 알파쇄 VJ 영역 및 T-세포 수용체 베타쇄 VJ 영역의 시퀀싱은 또한 각각의 TCR 알파 및 베타 쇄를 위한 CDR3를 밝혔다(밑줄친 펩티드). 구체적으로, 참조부호 "A"를 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CASPVDRGSTLGRLYF(서열 번호 21)의 펩티드 서열을 가졌으며, 참조부호 "A"를 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은 CASSQVGTGSYEQYF(서열 번호 22)의 펩티드 서열을 가졌다.
유사하게, 동일한 예시적 항원 ASSLPTTMNY(서열 번호 1)를 이용한 두번째의 독립적인 실험에서, CD137+ T 세포 및 예시적 항원에 결합한 T 세포의 T 세포 수용체 서열간의 비교(도 6), 및 IFN-γ 분비 T 세포와 예시적 항원에 결합한 T 세포의 T 세포 수용체 서열간의 비교(도 7)는, 항원-결합 및 CD137 발현 또는 항원-결합 및 IFN-γ 분비 둘 모두에 대해 최고의 빈도를 가진 T 세포를 위한 T 세포 수용체 서열이 공통의 T 세포 수용체 서열(참조부호 "B")을 공유하였음을 밝혔다(표 2).
T 세포 수용체 서열(참조부호 "B")의 시퀀싱은
Figure pct00003
의 펩티드 서열을 가진 T-세포 수용체 알파쇄 VJ 영역, 및
Figure pct00004
의 펩티드 서열을 가진 T-세포 수용체 베타쇄 VJ 영역을 밝혔다.
참조부호 "B"를 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CALSEARQYSGAGSYQLTF(서열 번호 23)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "B"를 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은CASSLEWGPYEQYF(서열 번호 24)의 펩티드 서열을 가졌다.
함께 고려할 때, 이들 결과는 항원-특이적이고 기능성인 T 세포에 존재하는 T 세포 수용체 클로노타입이 성공적으로 선택될 수 있음을 보여주며, 생리학적 관련 농도의 항원에서 치료적으로 효과적인 T 세포주의 개발을 위한 새로운 접근법을 나타낸다.
실시예 2: HSEVGLPVY(서열 번호 2) 특이적 T 세포를 위한 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포 수용체의 식별.
본 실시예는 항원 특이적이고 기능성인 T 세포에 존재하는 T 세포 수용체 클로노타입이, 예시적인 MHC 클래스 I 인코딩 유전자로서 HLA-A*0101과 조합하여, 다른 예시적 항원으로서 HSEVGLPVY(서열 번호 2)를 이용하여 성공적으로 식별되고 선택될 수 있었음을 보여준다.
상기 실시예 1에서 개시된 대로, T 세포 샘플을 분배하고 CD137 발현 분석을 이용하여 항원 결합 및 T 세포 활성화에 대하여 별도로 시험하였다. 양성 히트를 시퀀싱하여 T 세포 수용체 서열을 결정하였다. 항원-결합 T 세포와 항원-활성화된 T 세포 둘 모두에서 나타나는 T 세포 수용체 서열을 기록하였다(표 3). 도 8 및 도 9는 각각 CD137 시험의 3개의 복제물 중 첫번째와 두번째로부터의 결과를 보여준다.
표 3에 나타난 대로, T-세포 수용체 알파쇄 VJ 영역을 위한 펩티드 서열(서열 번호 7 - 서열 번호 13) 및 T-세포 수용체 베타쇄 VJ 영역을 위한 펩티드 서열(서열 번호 14 - 서열 번호 20)을 T 세포 수용체 서열 참조부호("I" - "I")의 각각에 대해 결정하였다. 흥미롭게도, 참조부호 "H", "I", "J", 및 "L"은 CD137 시험의 복제물 중 적어도 두 개에서 항원-결합 T 세포와 항원-활성화된 T 세포 둘 모두에서 나타나는 T 세포 수용체 서열 중에 있었다(도 8 및 도 9).
또한, 식별된 T 세포 수용체 서열의 각각을 위한 CDR3 영역을 결정하였다(진하고 밑줄쳐진 표 3의 설명 참조). 구체적으로, 참조부호 "I"를 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CAENSGGYQKVTF(서열 번호 25)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "I"를 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은 CASSVGDHTIYF(서열 번호 26)의 펩티드 서열을 가졌다. 참조부호 "J"를 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CAMREGYRDDKIIF(서열 번호 27)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "J"를 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은CASSFSSGGAHEQFF(서열 번호 28)의 펩티드 서열을 가졌다. 참조부호 "K"를 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CAVNDYKLSF(서열 번호 29)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "K"를 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은 CASSIGWNYEQYF(서열 번호 30)의 펩티드 서열을 가졌다. 참조부호 "L"을 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CILPNAGNMLTF(서열 번호 31)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "L"을 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은 CATRGTGTQPQHF(서열 번호 32)의 펩티드 서열을 가졌다. 참조부호 "M"을 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CAGPREYGNKLVF(서열 번호 33)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "M"을 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은 CASSVGGQGEVVQYF(서열 번호 34)의 펩티드 서열을 가졌다. 참조부호 "N"을 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CATDGKRVTGGGNKLTF(서열 번호　35)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "N"을 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은 CASSLWRTGELFF(서열 번호 36)의 펩티드 서열을 가졌다. 참조부호 "O"를 위한 알파 가변 영역의 CDR3 영역은 CADAPGSSYKLIF(서열 번호 37)의 펩티드 서열을 가졌고, 참조부호 "O"를 위한 베타 가변 영역의 CDR3 영역은 CASSQVPHEQYF(서열 번호 38)의 펩티드 서열을 가졌다.
함께 고려할 때, 이들 결과는 항원-특이적이고 기능성인 T 세포에 존재하는 T 세포 수용체 클로노타입이 본 발명에서 제공되는 방법을 이용하여 성공적으로 선택될 수 있음을 보여준다. 또한, 결과는 이 방법에 의해 식별된 T 세포 수용체 서열이 재현가능함을 보여준다.
실시예 3: 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포 수용체의 식별
본 실시예는 본 발명에서 제공되는 방법이 또한 주요 조직적합 복합체(MHC)의 클래스 II 분자에 의해 제시되는 항원을 감지할 수 있는 T 세포 수용체를 식별할 수 있음을 보여준다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 클래스 II HLA, 예를 들어, HLA-DRB*101:01, 매칭된 건강한 공여체로부터의 백혈구성분채집술 샘플로부터 수득할 수 있다. PBMC를 비오틴화 항체에 노출시켜 CD45RO, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD57, CD123, CD235a(글리코포린 A), CD244, 및 CD8에 대해 양성인 세포를 제거하고 스트렙타비딘-코팅된 마이크로비드로 자기적 라벨링한 후, 자기적으로 분류하였다. 청정화된 PBMC로부터 수득한 미접촉 CD4+ T 세포를 생/사 및 계통 마커로 염색하고 형광 유세포 분석 세포 분류기를 통과시켜 단리하였다. 미접촉 CD4+ T 세포를 다클론성 확장시켜 T 세포 샘플을 수득하였다.
상기 실시예 1에서 개시된 대로, T 세포 샘플을 분배하고 CD137 발현 분석을 이용하여 항원 결합 및 T 세포 활성화에 대하여 별도로 시험하였다. 양성 히트를 시퀀싱하여 T 세포 수용체 서열을 결정하였다. 항원-결합 T 세포와 항원-활성화된 T 세포 둘 모두에서 나타나는 T 세포 수용체 서열을 결정할 수 있으며, T-세포 수용체 알파쇄 VJ 영역을 위한 특이적 펩티드 서열 및 T 세포 수용체 베타쇄 VJ 영역을 위한 펩티드 서열을 T 세포 수용체 서열 참조부호의 각각에 대해 결정할 수 있다. 또한, 식별된 T 세포 수용체 서열의 각각을 위한 CDR3 영역이 결정될 수 있다.
본 실시예는 T 세포 수용체 서열이 클래스 II MHC 분자에 의해 제시된 항원과 상호작용할 수 있음을 보여준다.
[표 1]
실험 파라미터
Figure pct00005
1. 실시예 1은 두벌로 수행하였다.
2. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 HLA-A*0101-매칭된 건강한 공여체로부터의 백혈구성분채집술 샘플로부터 수득하였다. PBMC를 비오틴화 항체에 노출시켜 CD45RO, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD57, CD123, 항-HLA-DR, CD235a(글리코포린 A), CD244, 및 CD4에 대해 양성인 세포를 제거하고 스트렙타비딘-코팅된 마이크로비드로 자기적 라벨링한 후, 자기적으로 분류하였다. 청정화된 PBMC로부터 수득한 미접촉 CD8+ T 세포를 생/사 및 계통 마커로 염색하고 형광 유세포 분석 세포 분류기를 통과시켜 단리하였다. 미접촉 CD8+ T 세포를 다클론성 확장시켜 T 세포 샘플을 수득하였다.
3. 항원-MHC 시험: T 세포 샘플의 제1 부분을 형광 리포터-라벨링된 항원-MHC 단백질 사량체로 염색하고 형광 유세포분석 세포 분류기를 통과시켰다.
4. CD137 시험: T 세포 샘플의 제2 부분을 10μM의 항원으로 펄싱된 자가조직 PBMC로 밤새 자극하고, 자기적으로 라벨링된 CD137 항체로 염색하고 자기적 분리에 의해 단리하였다.
5. 인터페론 감마 시험: T 세포 샘플의 제3 부분을 10μM의 항원으로 펄싱된 자가조직 PBMC로 밤새 자극하고 인터페론 감마를 발현하는 세포를 단리하기 위하여 밀테니 IFN-γ 분비 분석을 이용하여 분석하였다.
6. 실시예 2에서, CD137 시험은 제1 부분의 3개의 서브샘플에서 복제하였다. 도 8-9는 처음 두 복제물을 도시한다. 세번째 복제물은 나타나지 않는다.
[표 2]
실시예 1에서 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포 사이에 공유된 T 세포 수용체1
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
1. T 세포를 면역 TCR 프로파일링과 짝을 이룬 10x 게노믹스 단일 세포 분해를 이용하여 단일 세포 수준에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 판독값에 크롬 세포 바코드 및 고유 분자 식별자로 태그를 붙이고 완전한 T 세포 수용체 서열의 빈도를 결정하였다(도 4-7). 적어도 두 항원-결합 T 세포와 적어도 두 항원-활성화된 T 세포에 공통된 알파/베타 쇄 쌍이 보고된다.
2. CDR3 영역은 밑줄그어지고 진하게 기재된다.
[표 3]
실시예 2에서 항원-결합 및 항원-활성화된 T 세포 사이에 공유된 T 세포 수용체1
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
1. T 세포를 면역 TCR 프로파일링과 짝을 이룬 10x 게노믹스 단일 세포 분해를 이용하여 단일 세포 수준에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 판독값에 크롬 세포 바코드 및 고유 분자 식별자로 태그를 붙이고 완전한 T 세포 수용체 서열의 빈도를 결정하였다(도 8-9). 적어도 두 항원-결합 T 세포와 적어도 두 항원-활성화된 T 세포에 공통된 알파/베타 쇄 쌍이 보고된다.
2. CDR3 영역은 밑줄그어지고 진하게 기재된다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌과 특허 출원은 각각의 개별 문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 통합되는 것으로 나타내진 것과 동일한 정도로 참고로 본원에 통합된다.
본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에서 나타나고 개시되었지만, 그러한 실시형태는 단지 예시로서 제공됨이 당업자에게 자명할 것이다. 하기의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하며 이들 청구범위내의 방법과 구조 및 그들의 균등물이 청구범위에 의해 보호된다.
SEQUENCE LISTING <110> GRITSTONE ONCOLOGY, INC. <120> SELECTION OF T CELL RECEPTORS <130> 14560-001-228 <140> <141> <150> 62/812,572 <151> 2019-03-01 <160> 142 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antigen <400> 1 Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antigen <400> 2 His Ser Glu Val Gly Leu Pro Val Tyr 1 5 <210> 3 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Alpha VJ region for Reference A <400> 3 Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Phe His 1 5 10 15 Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser 20 25 30 Leu His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro 35 40 45 Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys 50 55 60 Ser Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys 65 70 75 80 Lys Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu 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Reference Z <400> 93 Met Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Ser Val Phe Ser 1 5 10 15 Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Cys Gln Arg Gly Thr 20 25 30 Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met Phe 35 40 45 Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ala 50 55 60 Asn Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys 65 70 75 80 Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser 85 90 95 Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Glu Asp 100 105 110 Val Pro Gly Gly Trp Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr 115 120 125 Val Val 130 <210> 94 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Beta VJ region for Reference AA <400> 94 Met Gly Thr Arg Leu Leu Cys Trp Ala Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Glu Leu Thr Glu Ala Gly Val Ala Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile 20 25 30 Glu Lys Arg Gln Ser Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 Ala Thr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Ile Leu Gly Gln Gly 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115 120 125 Thr Arg Leu Thr Val Thr 130 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference P <400> 103 Cys Ala Met Arg Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Lys Ile Ile Phe 1 5 10 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference P <400> 104 Cys Ala Ser Ser Phe Ser Ser Gly Gly Ala His Glu Gln Phe Phe 1 5 10 15 <210> 105 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference Q <400> 105 Cys Val Val Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference Q <400> 106 Cys Ala Ser Ser Pro Leu Gly Thr Gly Asp Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 107 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference R <400> 107 Cys Ala Glu Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe 1 5 10 <210> 108 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference R <400> 108 Cys Ala Ser Ser Val Gly Asp His Thr Ile Tyr Phe 1 5 10 <210> 109 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference S <400> 109 Cys Ala Gly Pro Arg Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe 1 5 10 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference S <400> 110 Cys Ala Ser Ser Tyr Gly Gly Gly Ser Leu Val Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 111 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference T <400> 111 Cys Ala Val Arg Ala Gln Gly Asn Ala Arg Leu Met Phe 1 5 10 <210> 112 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference T <400> 112 Cys Ala Asn Ala Trp Gly Arg Asn Glu Gln Phe Phe 1 5 10 <210> 113 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference U <400> 113 Cys Ile Leu Pro Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 114 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference U <400> 114 Cys Ala Thr Arg Gly Thr Gly Thr Gln Pro Gln His Phe 1 5 10 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference V <400> 115 Cys Ala Tyr Arg Pro Tyr Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe 1 5 10 15 <210> 116 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference V <400> 116 Cys Ala Ser Ser Gln Gly Ile Leu Ala Ala Gly Glu Leu Phe Phe 1 5 10 15 <210> 117 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference W <400> 117 Cys Ala Gly Pro Arg Trp Leu Thr Gly Gly Gly Asn Lys Leu Thr Phe 1 5 10 15 <210> 118 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference W <400> 118 Cys Ala Ser Ser Val Gly Gly Gln Gly Glu Val Val Gln Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 119 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference X <400> 119 Cys Ala Ala Pro Pro Pro Gly Tyr Lys Tyr Ile Phe 1 5 10 <210> 120 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference X <400> 120 Cys Ala Ser Gly Glu Gly Asp Ala Tyr Thr Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 121 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference Y <400> 121 Cys Gly Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Gly Gln Asn Phe Val Phe 1 5 10 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference Y <400> 122 Cys Ala Ser Ser Leu Ser Gly Gly Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 123 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference Z <400> 123 Cys Ala Glu Ser Ser Arg Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe 1 5 10 <210> 124 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference Z <400> 124 Cys Ser Val Glu Asp Val Pro Gly Gly Trp Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 125 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AA <400> 125 Cys Ala Tyr Tyr Val Pro Phe Asn Lys Phe Tyr Phe 1 5 10 <210> 126 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AA <400> 126 Cys Ala Ser Ser Thr Thr Ser Gly Gly Gly Gln Glu Thr Gln Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AB <400> 127 Cys Ala Val Thr Ser Gly Arg Leu Met Phe 1 5 10 <210> 128 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AB <400> 128 Cys Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 129 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AC <400> 129 Cys Val Val Asn Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AC <400> 130 Cys Ala Ser Ser Ala Leu Gly Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 131 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AD <400> 131 Cys Ile Val Arg Gly Met Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe 1 5 10 <210> 132 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AD <400> 132 Cys Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gly Gly Ser Glu Ala Phe Phe 1 5 10 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AE <400> 133 Cys Ala Leu Ser Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe 1 5 10 15 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AE <400> 134 Cys Ser Ala Arg Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 135 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AF <400> 135 Cys Ala Val Thr Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe 1 5 10 <210> 136 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AF <400> 136 Cys Ser Val His Arg Gly Val Asn Thr Glu Ala Phe Phe 1 5 10 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AG <400> 137 Cys Ala Ala Ser Ala Gly Asn Asp Met Arg Phe 1 5 10 <210> 138 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AG <400> 138 Cys Ala Ser Ser Leu Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 139 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AH <400> 139 Cys Val Val Thr Tyr Asn Asp Met Arg Phe 1 5 10 <210> 140 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AH <400> 140 Cys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 141 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the alpha variable region for Reference AI <400> 141 Cys Ala Leu Ile Pro Ser Asn Asp Tyr Lys Leu Ser Phe 1 5 10 <210> 142 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CDR3 region of the beta variable region for Reference AI <400> 142 Cys Ala Ser Ser Tyr Ser Met Gly Glu Trp Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 15

Claims (241)

  1. i) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및
    ii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체 클로노타입을 선택하는 방법.
  2. i) 소정의 타입의 항원에 대한 자극된 림프구 및 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 림프구의 혼합물을 분석하는 단계; 및
    ii) 적어도 하나의 자극된 림프구와 적어도 하나의 공자극된 림프구에 의해 공유된 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, 림프구에서 공유 수용체 서열을 선택하는 방법.
  3. i) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 기능성 T 세포를 식별하기 위하여 미접촉 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및
    ii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 의해 공유된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체 클로노타입을 선택하는 방법.
  4. i) 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 소정의 타입의 항원과 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 하나의 소정의 타입의 항원에 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 결합시키는 단계;
    ii) 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및
    iii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체를 선택하는 방법.
  5. i) 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계;
    ii) 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 II P-MHC 단백질 다량체를 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및
    iii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체를 선택하는 방법.
  6. i) 제1의 다수의 T 세포를 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체와 접촉시키는 것을 포함하는, 제1의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 적어도 제1의 하나의 클래스 I P-MHC 단백질 다량체에 결합시키는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계;
    ii) 제2의 다수의 T 세포를 적어도 제1의 클래스 I P-MHC 단백질을 제시하는 다수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 제2의 다수의 T 세포에 존재하는 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및
    iii) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 기능성 T 세포에 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체를 선택하는 방법.
  7. i) P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 제1의 T 세포를 다수의 T 세포로부터 단리하는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계;
    ii) 소정의 타입의 항원에 의한 활성화를 나타내는 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 제2의 T 세포를 다수의 T 세포로부터 추가로 단리하는 단계; 및
    iii) 제1의 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 제2의 T 세포의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 매치시키는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체를 선택하는 방법.
  8. i)소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계;
    ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하여는 동족 T 세포 다수를 형성하는 단계;
    iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계; 및
    iv) 적어도 제1의 기능성 T 세포가 P-로딩된 MHC 단백질에 결합하도록 구성됨을 확인하는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계
    를 포함하는, 기능성 T 세포 수용체 클로노타입을 검출하는 방법.
  9. i)소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계;
    ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 동족 T 세포 다수를 형성하는 단계;
    iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 다수의 결합제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 결합제에 적어도 제1의 결합 T 세포를 결합시키는 단계로서, 다수의 결합제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 포함하는 것인, 단계; 및
    iv) 적어도 제1의 결합 T 세포가 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포에 의해 활성화되도록 구성됨을 확인하는 단계
    를 포함하는, 항원-결합 T 세포를 검출하는 방법.
  10. i) 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 P-로딩된 MHC 단백질에 결합되고, P는 소정의 타입의 항원인 단계;
    ii) 제2의 다수의 T 세포를 추가로 단리하는 단계로서, 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 활성화 시그널링 분자를 상향조절하고/하거나 하나 이상의 활성화 마커를 발현하며, 여기서 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성인, 단계; 및
    iii) 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부와 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부 둘 모두에 공통되는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법.
  11. i) 제1의 다수의 T 세포를 단리하는 단계로서, 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 제1의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제1의 활성화 마커를 발현하는 것인, 단계;
    ii) 제2의 다수의 T 세포를 추가로 단리하는 단계로서, 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부는 다수의 제2의 활성화제의 존재하에서 하나 이상의 제2의 활성화 마커를 상향조절하고/하거나 하나 이상의 활성화 시그널링 분자를 발현하는 것인, 단계; 및
    iii) a) 공통된 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부; 및
    b) 역치값 미만인 P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수
    를 가진 제1의 다수의 T 세포의 일부 중 적어도 하나 및 제2의 T 세포의 일부 중 적어도 하나를 식별하는 단계로서, P는 소정의 타입의 항원인, 단계
    를 포함하는, 소정의 타입의 항원에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 선택하는 방법.
  12. i) 소정의 제1 타입의 항원에 대한 제1 항원-결합 T 세포 및 제1 항원-활성화된 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원에 대한 제2 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및
    ii) a) 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며; b) 제2 항원-활성화된 T 세포 중 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법.
  13. i) 소정의 제1 타입의 항원에 대한 제1 항원-활성화된 T 세포 및 제1 항원-결합 T 세포 및 소정의 제2 타입의 항원에 대한 제2 항원-결합 T 세포를 식별하기 위하여 T 세포의 혼합물을 분석하는 단계; 및
    ii) a) 적어도 하나의 제1 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 제1 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며; b) 제2 항원-결합 T 세포 중 어느 것과도 공유되지 않는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 수용체 클로노타입의 음성 선택 방법.
  14. i) 제1의 다수의 T 세포를 다수의 P-제시 세포와 접촉시키는 단계로서, 제1의 다수의 T 세포는 다수의 P-결합 T 세포를 포함하며, P는 소정의 타입의 항원인, 단계;
    ii) 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부에 대해 다수의 발현율 프로파일을 측정하는 단계;
    iii) 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부를 다수의 T 세포 클러스터로 분배하는 단계;
    iv) 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부에 존재하는 적어도 2개의 T 세포에서 P에 대한 기능성 반응을 측정하는 단계;
    v) 적어도 2개의 T 세포를 포함하는 다수의 T 세포 클러스터 중 하나를 식별하기 위하여 다수의 T 세포 클러스터에 발현율을 맵핑하는 단계; 및
    vi) 적어도 2개의 T 세포에 의해 발현되는 활성화 마커를 식별하는 단계
    를 포함하는, T 세포 활성화 마커를 식별하는 방법.
  15. i) 후보 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계;
    ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 및
    iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계
    를 포함하는, 항원-특이적 백신을 위한 후보 항원을 스크리닝하는 방법.
  16. i) 후보 신생항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계;
    ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 다수의 동족 T 세포를 형성하는 단계; 및
    iii) 다수의 동족 T 세포로부터 유래된 T 세포를 후보 신생항원을 위해 면역원성인 다수의 활성화제 중 적어도 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 적어도 제1의 기능성 T 세포를 활성화시키는 단계
    를 포함하는, 면역원성에 대해 후보 신생항원을 스크리닝하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 분석은 항원-결합 T 세포를 식별하기 위하여 혼합물의 제1 부분을 분석하고, 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물의 제1 부분의 분석은 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 P는 소정의 타입의 항원인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, P-로딩된 MHC 단백질은 자성 비드에 연결되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포의 검출은 자기적 분리를 통해 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포를 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, P-로딩된 MHC 단백질은 형광단에 연결되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포는 형광 유세포분석을 통해 검출 및 단리되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포의 검출은 형광 유세포분석 장치를 통해 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 하나 이상의 T 세포를 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 단백질은 MHC 클래스 I 단백질인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, P-로딩된 MHC 단백질은 P-로딩된 MHC 단백질 다량체로 존재하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것은 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것은 자기적 분리를 통해 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 검출하는 것은 하나 이상의 활성화 마커를 발현하는 하나 이상의 T 세포를 형광 유세포분석 장치를 통해 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인 비트로 프라이밍을 배제하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 펩티드인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 8-15 아미노산으로 이루어지는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 12-40 아미노산으로 이루어지는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양(예를 들어, 고형 종양)으로부터 유래되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시되는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양에서 유래된 신생항원인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 종양 항원은 암/정소 항원인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 T 세포 수용체 클로노타입을 포함하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 T 세포 수용체 알파쇄, 적어도 하나의 T 세포 수용체 베타쇄, 또는 T 세포 수용체 알파 및 베타 쇄 적어도 한 쌍을 포함하는 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 결합 T 세포를 시퀀싱하는 것을 포함하는 것인 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 기능성 T 세포를 시퀀싱하는 것을 포함하는 것인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 CDR3 서열을 포함하는 것인 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포는 함께 T 세포의 혼합물에 존재하는 1,000,000개 T 세포 당 1000개 T 세포 미만인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 T 세포를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 및 ii) 단리된 적어도 하나의 T 세포를 확장시키는 단계를 포함하는, T 세포 혼합물을 준비하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포가 적어도 2개의 T 세포이며, 확장은 적어도 2개의 T 세포를 다클론성으로 확장시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원-결합 T 세포 및 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포는 함께 PBMC 집단에 존재하는 10,000,000개 T 세포 당 1000개 T 세포 미만인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 림프구와 공자극된 림프구의 혼합물은 T 세포인 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 림프구와 공자극된 림프구의 혼합물은 B 세포인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 림프구와 공자극된 림프구의 혼합물은 천연 킬러 (natural killer) 세포인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 분석은 자극된 림프구를 식별하기 위하여 혼합물의 제1 부분을 분석하고, 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물의 제1 부분을 분석하는 것은 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 단백질은 소정의 타입의 항원을 포함하는 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 자성 비드에 연결되는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것은 자기적 분리를 통해 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 형광단에 연결되는 것인 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구는 형광 유세포분석을 통해 검출되고 단리되는 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구의 검출은 단백질에 결합된 하나 이상의 자극된 림프구를 형광 유세포분석 장치를 통해 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극된 림프구를 식별하기 위하여 혼합물의 제2 부분을 별도로 분석하는 것은 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것은 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 자기적 분리를 통해 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 검출하는 것은 하나 이상의 마커를 발현하는 하나 이상의 자극된 림프구를 형광 유세포분석 장치를 통해 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 전문 항원 제시 세포를 이용한 프라이밍을 배제하는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 펩티드인 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 8-15 아미노산으로 이루어지는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 12-40 아미노산으로 이루어지는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양으로부터 유래되는 것인 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양에서 제시되는 것인 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양에서 유래된 신생항원인 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 개인화된 항원인 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 개인화된 항원은 모델에 기초하여 선택된 개인화된 신생항원인 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 공유 종양 항원인 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 종양 항원은 암/정소 항원인 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 종양 항원은 암/정소-유사 항원인 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 종양 항원은 종양 연관 펩티드 항원인 방법.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 특정 타입의 종양의 특징인 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원인 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 수용체 클로노타입을 포함하는 것인 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 수용체 알파쇄, 적어도 하나의 수용체 베타쇄, 또는 수용체 알파 및 베타 쇄 적어도 한 쌍을 포함하는 것인 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 자극된 림프구를 시퀀싱하는 것을 포함하는 것인 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 식별은 단일 세포 수준에서 적어도 하나의 공자극된 림프구를 시퀀싱하는 것을 포함하는 것인 방법.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 수용체 서열의 적어도 일부는 적어도 하나의 항원 인식 서열을 포함하는 것인 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자극된 림프구 및 적어도 하나의 공자극된 림프구는 함께 림프구의 혼합물에 존재하는 1,000,000개 T 세포 당 1000개 T 세포 미만인 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 i) 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 림프구를 PBMC 집단으로부터 단리하는 단계; 및 ii) 단리된 적어도 하나의 림프구를 확장시키는 단계를 포함하는, 림프구 혼합물을 준비하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 림프구가 소정의 타입의 항원에 결합할 수 있으며, 확장은 적어도 2개의 림프구를 다클론성으로 확장시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자극된 림프구 및 적어도 하나의 공자극된 림프구가 함께, PBMC 집단에 존재하는 10,000,000개 림프구 당 1000개 T 세포 미만인 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구의 혼합물은 전문 항원 제시 세포를 이용한 프라이밍의 생성물인 방법.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 소정의 농도 범위내의 다수의 소정의 타입의 항원을 제시하는 것인 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 다량의 소정의 타입의 항원으로 다수의 세포를 펄싱함으로써 준비되는 것인 방법.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 농도 범위는 종양에서 소정의 타입의 항원의 예상 농도에 기초하는 것인 방법.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 결합은 적어도 제1의 결합 T 세포를 P-로딩된 MHC 단백질에 결합시키는 것을 포함하며, 여기서 P는 소정의 타입의 항원인 방법.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 단백질은 MHC 클래스 I 단백질인 방법.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, P-로딩된 MHC 단백질은 P-로딩된 MHC 단백질 다량체로 존재하는 것인 방법.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포와 제2의 다수의 T 세포는 PBMC의 공통 집단으로부터 유래되는 것인 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포와 제2의 다수의 T 세포는 한 명 이상의 건강한 공여체로부터 유래되는 것인 방법.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 적어도 부분적으로 인간 백혈구 항원(HLA)-매치되는 것인 방법.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 소정의 타입의 항원 제시에 대해 대상체에 적어도 부분적으로 HLA-매치되는 것인 방법.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 완전히 HLA-매치되는 것인 방법.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 선택적으로 HLA-매치되는 것인 방법.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-A에 대해 대상체에 매치되는 것인 방법.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-B에 대해 대상체에 매치되는 것인 방법.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-C에 대해 대상체에 매치되는 것인 방법.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DP에 대해 대상체에 매치되는 것인 방법.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DQ에 대해 대상체에 매치되는 것인 방법.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DR에 대해 대상체에 매치되는 것인 방법.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 적어도 부분적으로 HLA-미스매치되는 것인 방법.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 완전히 HLA-미스매치되는 것인 방법.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 대상체에 선택적으로 HLA-미스매치되는 것인 방법.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-A에 대해 대상체에 미스매치되는 것인 방법.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-B에 대해 대상체에 미스매치되는 것인 방법.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-C에 대해 대상체에 미스매치되는 것인 방법.
  114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DP에 대해 대상체에 미스매치되는 것인 방법.
  115. 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DQ에 대해 대상체에 미스매치되는 것인 방법.
  116. 제1항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-DR에 대해 대상체에 미스매치되는 것인 방법.
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 한 명 이상의 건강한 공여체는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합에 대해 대상체에 미스매치되는 것인 방법.
  118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 미접촉 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
  119. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 미접촉 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  120. 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 기억 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  121. 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
  122. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
  123. 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4+CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
  124. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4-CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
  125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 CD4+CD8- T 세포를 포함하는 것인 방법.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 종양 세포를 포함하는 것인 방법.
  127. 제1항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 수지상 세포를 포함하는 것인 방법.
  128. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 대식세포를 포함하는 것인 방법.
  129. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 단핵구를 포함하는 것인 방법.
  130. 제1항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 하나 이상의 B 세포를 포함하는 것인 방법.
  131. 제1항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하는 다수의 세포는 적어도 제2의 하나의 소정의 타입의 항원을 제시하고 소정의 타입의 항원을 발현하는 하나 이상의 다수의 세포를 포함하는 것인 방법.
  132. 제1항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 유세포분석을 통해 결합을 검출하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  133. 제1항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 하나의 소정의 타입의 항원은 자성 비드에 연결되며, 자기적 분리를 통해 적어도 제1의 항원-결합 T 세포를 검출하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  134. 제1항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 유세포분석을 통해 활성화를 검출하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  135. 제1항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자기적 분리를 통해 적어도 제1의 기능성 T 세포를 검출하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  136. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 바이오마커를 검출하는 것을 포함하는, 활성화의 검출을 추가로 포함하는 것인 방법.
  137. 제1항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커는 CD137을 포함하는 것인 방법.
  138. 제1항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 T 세포 활성화를 나타내는 하나 이상의 분자의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 활성화 검출을 추가로 포함하는 것인 방법.
  139. 제1항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 분자는 인터페론 감마를 포함하는 것인 방법.
  140. 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 T 세포 증식을 검출하는 것을 포함하는, 활성화 검출을 추가로 포함하는 것인 방법.
  141. 제1항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 2개의 P-로딩된 MHC 단백질에 별도로 결합되는 적어도 2개의 T 세포로부터 다수의 T 세포를 유도하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  142. 제1항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 유도는 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포를 확장시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  143. 제1항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 확장은 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포를 다클론성으로 확장시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  144. 제1항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포는 확장동안 혼합물내에 있는 방법.
  145. 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1의 T 세포와 적어도 제2의 T 세포는 확장 전에 서로 분리되는 것인 방법.
  146. 제1항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 형성은 간접 T 세포 수용체 가교를 포함하는 것인 방법.
  147. 제1항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 형성은 단일 다클론 확장으로 제한되는 것인 방법.
  148. 제1항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 형성은 다수의 다클론 확장을 포함하는 것인 방법.
  149. 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 다클론 확장 중 적어도 하나에 이어서 소정의 타입의 항원에 결합하는 적어도 하나의 추가 T 세포를 단리하는 것이 이어지는 것인 방법.
  150. 제1항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1의 기능성 T 세포는 50 μM 미만의 P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수를 가지는 것인 방법.
  151. 제1항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 기능성 T 세포는 2초 내지 10초의 P-로딩된 MHC 단백질과의 반감기를 가지는 것인 방법.
  152. 제1항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 종양 연관 펩티드 항원이며, 여기서 적어도 제1의 기능성 T 세포는 i) 50μM 미만의 P-로딩된 MHC 단백질과의 해리 상수 및 ii) 2초 내지 10초 범위의 P-로딩된 MHC 단백질과의 반감기를 가지는 것인 방법.
  153. 제1항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성인 방법.
  154. 제1항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포는 항원 제시 세포인 방법.
  155. 제1항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포는 전문 항원 제시 세포인 방법.
  156. 제1항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 제1의 다수의 T 세포의 적어도 일부 및 조합된 제2의 다수의 T 세포의 적어도 일부의 적어도 0.005%에 존재하는 것인 방법.
  157. 제1항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성인 방법.
  158. 제1항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성이고/이거나 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 면역원성인 방법.
  159. 제1항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성이고/이거나 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 위해 항원성인 방법.
  160. 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 포함하고/하거나 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 포함하는 것인 방법.
  161. 제1항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포이고/이거나 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 제시하는 세포인 방법.
  162. 제1항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 P-로딩된 MHC 단백질을 포함하고/하거나 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 P-로딩된 MHC 단백질을 포함하는 것인 방법.
  163. 제1항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 내인성으로 발현하는 세포이고/이거나 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 내인성으로 발현하는 세포인 방법.
  164. 제1항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 제1의 활성화제 중 적어도 하나는 P-로딩된 MHC 단백질을 포함하고/하거나 다수의 제2의 활성화제 중 적어도 하나는 소정의 타입의 항원을 내인성으로 발현하는 세포인 방법.
  165. 제1항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 해리 상수는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 P-로딩된 MHC 단백질 사이의 결합에 상응하는 방법.
  166. 제1항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 역치 값은 1000μM 미만인 방법.
  167. 제1항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 제1 타입의 항원은 제1 펩티드이고 소정의 제2 타입의 항원은 제2 펩티드인 방법.
  168. 제1항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드는 제2 펩티드를 발현하는 유전자의 변이체에 의해 발현되는 것인 방법.
  169. 제1항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드는 제2 펩티드를 발현하는 유전자의 대립유전자에 의해 발현되는 것인 방법.
  170. 제1항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 펩티드는 야생형 유전자에 의해 발현되는 것인 방법.
  171. 제1항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드는 신생항원이고 제2 펩티드는 관련된 야생형 유전자에 의해 발현되는 것인 방법.
  172. 제1항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 적어도 5 아미노산만큼 상이한 방법.
  173. 제1항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 5 내지 15 아미노산만큼 상이한 방법.
  174. 제1항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 75% 미만의 서열 동일성을 가지는 것인 방법.
  175. 제1항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 펩티드와 제2 펩티드는 55% 내지 80%의 서열 동일성을 가지는 것인 방법.
  176. 제1항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제1 타입의 항원을 내인성으로 제시하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  177. 제1항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제2 타입의 항원을 내인성으로 제시하는세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  178. 제1항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제1 타입의 항원으로 로딩된 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  179. 제1항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-활성화된 T 세포의 식별은 T 세포의 혼합물의 일부를 소정의 제2 타입의 항원으로 로딩된 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  180. 제1항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, P-결합 T 세포는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포의 적어도 일부의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 소정의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부와 비교하는 생물정보학 필터를 이용하여 식별되는 것인 방법.
  181. 제1항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함하며, 그룹 중 적어도 하나는 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 공통으로 갖는 T 세포로 이루어지는 것인 방법.
  182. 제1항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함하며, 그룹 중 적어도 하나는 서로에게 적어도 70%의 서열 동일성을 특징으로 하는 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 갖는 T 세포로 이루어지는 것인 방법.
  183. 제1항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함하며, 그룹 중 적어도 하나는 서로간에 최대 1 아미노산만큼 상이한 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 가진 T 세포로 이루어지는 것인 방법.
  184. 제1항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 분배는 접촉된 다수의 P-결합 T 세포를 그룹으로 분배하는 것을 포함하며, 그룹 중 적어도 하나는 보존적 치환에 의해서만 상이한 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 가진 T 세포로 이루어지는 것인 방법.
  185. 제1항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 분배는 파라토프 핫스팟에 의한 림프구 상호작용의 그룹핑(GLIPH)을 포함하는 것인 방법.
  186. 제1항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 공통된 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부는 CDR3 영역의 적어도 일부인 방법.
  187. 제1항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, CDR3 영역의 적어도 일부는 6 내지 35 아미노산의 길이를 가진 선형 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  188. 제1항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, CDR3 영역의 적어도 일부는 줄기 영역을 배제하는 것인 방법.
  189. 제1항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, CDR3 영역의 적어도 일부는 CDR3 베타쇄 부분을 포함하는 것인 방법.
  190. 제1항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 분배는 알고리즘을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  191. 제1항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 알고리즘은 다수의 발현율 프로파일의 유사성 분석을 포함하는 것인 방법.
  192. 제1항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 발현율 프로파일은 P에 대한 기능성 반응을 나타내는 하나 이상의 활성화 마커에 대한 발현율을 포함하는 것인 방법.
  193. 제1항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 활성화 마커는 CD137, CD69, CD25, Ki67, CD107, CD122, CD27, CD28, CD95, CD134, 킬러-세포 렉틴 유사 수용체 G1(KLRG1), CD38, 또는 CD154를 포함하는 것인 방법.
  194. 제1항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 활성화 마커는 CD137, CD69, CD25, Ki67, 및 CD107 또는 그 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  195. 제1항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 알고리즘은 클러스터 분석 알고리즘인 방법.
  196. 제1항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 알고리즘은 t-분포 확률적 임베딩을 포함하는 것인 방법.
  197. 제1항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, P에 대한 측정된 기능성 반응은 하나 이상의 활성화 마커 및/또는 하나 이상의 분비된 분자의 검출을 포함하는 것인 방법.
  198. 제1항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 활성화 마커는 CD137, CD69, CD25, Ki67, CD107, CD122, CD27, CD28, CD95, CD134, 킬러-세포 렉틴 유사 수용체 G1(KLRG1), CD38, 또는 CD154를 포함하는 것인 방법.
  199. 제1항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 활성화 마커는 CD137, CD69, CD25, Ki67, 및 CD107, 또는 그 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  200. 제1항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 분비된 분자는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 것인 방법.
  201. 제1항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 사이토카인은 인터페론 감마(IFN-감마), 종양 괴사 인자 알파(TNF알파), 인터루킨-2(IL-2), 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합인 방법.
  202. 제1항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 분비된 분자는 그랜자임을 포함하는 것인 방법.
  203. 제1항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 분비된 분자는 퍼포린을 포함하는 것인 방법.
  204. 제1항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, P에 대한 측정된 기능성 반응은 T 세포 증식의 검출을 포함하는 것인 방법.
  205. 제1항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 다수의 T 세포 및 제2의 다수의 T 세포는 공통 출발 PBMC 집단으로부터 유래되는 것인 방법.
  206. 제1항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 발현율 프로파일은 단일 세포 전사체 분석 시리즈로부터 수득되는 것인 방법.
  207. 제1항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 T 세포 클러스터 중 하나에서의 T 세포는 제1 발현율 역치를 초과하는 평균 제2 발현율로 소정의 제1 활성화 마커를 발현하는 것인 방법.
  208. 제1항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 T 세포 클러스터 중 하나에서의 T 세포는 제2 발현율 역치를 초과하는 평균 제2 발현율로 제2 활성화 마커를 발현하는 것인 방법.
  209. 제1항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다수의 P-결합 T 세포의 T 세포 수용체 서열을 소정의 T 세포 수용체 서열에 매칭함으로써 다수의 P-결합 T 세포를 식별하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  210. 제1항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 T 세포 수용체 서열은 P-로딩된 MHC 단백질에 결합된 제2의 다수의 T 세포를 시퀀싱함으로써 결정되는 것인 방법.
  211. 제1항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 마커는 다수의 T 세포 클러스터 중 다른 하나에 존재하는 적어도 2개의 다른 T 세포에서 발현되지 않거나 하향조절되며, 여기서 적어도 2개의 다른 T 세포는 측정될 때 기능성 반응을 나타내지 않는 것인 방법.
  212. 제1항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 항원은 신생항원인 방법.
  213. 제1항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-특이적 백신은 암의 치료를 위한 것인 방법.
  214. 제1항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 신생항원인 방법.
  215. 제1항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 펩티드인 방법.
  216. 제1항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 8-15 아미노산으로 이루어지는 것인 방법.
  217. 제1항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 12-40 아미노산으로 이루어지는 것인 방법.
  218. 제1항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 종양으로부터 유래되는 것인 방법.
  219. 제1항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 고형 종양인 방법.
  220. 제1항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 종양에서 제시되는 것인 방법.
  221. 제1항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 개인화된 신생항원인 방법.
  222. 제1항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 공유 종양 신생항원인 방법.
  223. 제1항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 종양 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원인 방법.
  224. 제1항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 특정 타입의 종양의 특징인 방법.
  225. 제1항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 종양 연관 펩티드 신생항원인 방법.
  226. 제1항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택되는 것인 방법.
  227. 제1항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 모델은 머신 러닝을 이용하여 보정되는 것인 방법.
  228. 제1항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 신생항원은 개인화된 신생항원인 방법.
  229. 제1항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 신생항원은 공유 신생항원의 목록에 존재하는 것인 방법.
  230. 제1항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 인공 지능 모델에 의해 식별된 하나 이상의 신생항원으로부터 선택되는 것인 방법.
  231. 제1항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 지능 모델은 신경망을 포함하는 것인 방법.
  232. 제1항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 신생항원은 제시 가능성 세트로부터 선택되는 것인 방법.
  233. 제1항 내지 제232항 중 어느 한 항에 있어서, 개인화된 신생항원은 통합된 참고문헌에 개시된 머신 러닝 방법, 소프트웨어, 및/또는 시스템 중 하나 이상에 기초하여 선택되는 것인 방법.
  234. 제1항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 타입의 항원은 바이러스 항원인 방법.
  235. 제1항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 인 비트로 프라이밍을 배제하는 것인 방법.
  236. 제1항 내지 제235항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 조성물.
  237. i) a) 소정의 타입의 항원에 대한 항원-결합 T 세포 및 항원-활성화된 T 세포를 식별하기 위하여 천연 T 세포의 혼합물을 분석하고; b) 적어도 하나의 항원-결합 T 세포와 적어도 하나의 항원-활성화된 T 세포에 의해 공유되며 CDR3 영역의 적어도 일부를 함유하는 적어도 하나의 T 세포 수용체 서열의 적어도 일부를 식별함으로써 선택된 CDR3 영역의 적어도 일부; 및
    ii) T 세포 수용체 단편
    을 포함하는, 소정의 타입의 항원에 선택적인 인공 T 세포 수용체를 포함하는 조성물.
  238. 제1항 내지 제235항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 인공 T 세포 수용체 또는 그 단편을 포함하는 T 세포.
  239. 제238항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 T 세포.
  240. 제236항 또는 제237항의 조성물을 포함하는 키트.
  241. 제1항 내지 제235항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 키트.
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