KR20220016809A - 추간판 퇴행의 치료 - Google Patents

Abstract

본 출원은, 포유동물 결합 조직 세포를 추간판 결손 부위에 주사하는 단계를 포함하는, 추간판의 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법을 개시한다.

Description

추간판 퇴행의 치료

본 발명은 추간판(intervertebral disc) 퇴행의 예방 또는 지연에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추간판 퇴행을 예방하거나 또는 지연시킴으로써 디스크의 퇴행을 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 손상된 추간판 부위로의 도입 및 추간판의 퇴행의 예방 또는 지연을 위해 연골세포(chondrocyte)를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 숙주에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는데 사용하기 위한 형질도입 성장 인자 β(transforming growth factor β) 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 적어도 하나의 포유동물 세포에 도입하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 연골세포 및 형질도입 성장 인자 β 수퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자를 함유하는 포유동물 세포의 혼합물을 손상된 추간판 부위에 사용하여 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 포유동물 세포를 추간판 결손 부위(intervertebral disc defect site)에 주사하는 단계를 포함하는 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 바람직하게는 세포를 위한 스캐폴딩(scaffolding) 또는 임의의 지지 구조를 사용하지 않는다. 바람직하게는, 형질감염되지 않은 연골세포 또는 섬유아세포(fibroblast)가 사용되며, 대상체는 바람직하게는 인간이다. 연골세포가 사용되는 경우, 연골세포는 바람직하게는 비-디스크 연골세포(non-disc chondrocyte) 또는 연소성 연골세포(juvenile chondrocyte)이며, 이는 세포가 2세 미만의 어린이로부터 단리됨을 의미한다. 다른 양태에서, 연골세포는 프라이밍된(primed) 연골세포일 수 있다. 특히, 결합 조직 세포는 치료하고자 하는 포유동물 대상체에 대해 동종이계(allogeneic)일 수 있다.

위에 논의된 바와 같은 형질감염된 포유동물 세포는 상피 세포, 바람직하게는 인간 상피 세포, 또는 HEK 293,　HEK-293 또는 293 세포로도 지칭되는 인간 배아 신장 293 세포를 포함할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 손상된 추간판 부위로의 도입을 위해 동종이계 연소성 연골세포 또는 동종이계 비-디스크 연골세포를 사용하여 추간판 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 손상, 파열 또는 탈장된 추간판 부위의 추가 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는데 사용된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에 관한 것으로, 방법은 a) 추간판 재생 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포유동물 세포에 삽입하는 단계 및 b) 포유동물 세포를 추간판 결손 부위에 이식하는 단계를 포함한다. 방법은 바람직하게는 세포를 위한 스캐폴딩 또는 임의의 지지 구조를 사용하지 않는다. 이 방법에서, 유전자는 TGF-β와 같은 TGF-β 슈퍼패밀리(TGF-β superfamily)에 속할 수 있으며, 바람직하게는 TGF-β1일 수 있다.

위에 논의된 바와 같은 형질감염된 포유동물 세포는 상피 세포, 바람직하게는 인간 상피 세포, 또는 HEK 293,　HEK-293 또는 293 세포로도 지칭되는 인간 배아 신장 293 세포를 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에 관한 것으로, 이는 a) 추간판 재생 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 제1 포유동물 세포에 삽입하는 단계 및 b) a)의 포유동물 세포와 변형되지 않은 제2 포유동물 결합 조직 세포의 혼합물을 추간판 결손 부위에 이식하는 단계를 포함한다. 방법은 바람직하게는 세포를 위한 스캐폴딩 또는 임의의 지지 구조를 사용하지 않는다. 이 방법에서, 유전자는 TGF-β와 같은 TGF-β 슈퍼패밀리에 속할 수 있으며, 바람직하게는 TGF-β1일 수 있다.

위에 논의된 바와 같은 제1 형질감염된 포유동물 세포는 상피 세포, 바람직하게는 인간 상피 세포, 또는 HEK 293,　HEK-293 또는 293 세포로도 지칭되는 인간 배아 신장 293 세포를 포함할 수 있다.

제2 포유동물 결합 조직 세포는 연골세포 또는 섬유아세포일 수 있다. 연결세포의 경우, 연결세포는 비-디스크 연골세포 또는 연소성 연골세포일 수 있다. 특히, 제2 포유동물 결합 조직 세포에 대한 연골세포는 프라이밍된 연골세포일 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 또는 제2 결합 조직 세포 중 하나 또는 둘 다는 포유동물 대상체에 대해 또는 서로에 대해 동종이계일 수 있다.

도 1a 내지 도 1f는 손상된 디스크 퇴행의 둔화(slowing), 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자(puncture) 및 치료도 보이지 않았고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포와 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 보이지 않았고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수(disc height index)를 얻는데 사용된다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. 혼합 세포 치료는 특히 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 2a 내지 도 2f는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 척추 수술 전 토끼의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4)주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 보이지 않았고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. 혼합 세포 치료는 특히 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 3a 내지 도 3d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. 혼합 세포 치료는 특히 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 4a 내지 도 4d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. TGF-β1-생산 293 세포 치료는 특히 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 5a 내지 도 5d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. TGF-β1-생산 293 세포 치료 및 혼합 세포 치료는 특히 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 6a 내지 도 6d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. 형질도입되지 않은 연골세포 치료는 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 7a 내지 도 7f는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. 형질도입되지 않은 연골세포 치료는 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 8a 내지 도 8f는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) T12/L1의 디스크가 바늘 천자(needle puncture)에 의해 손상되었고 주사는 없었으며, (ii) L1/2의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L2/3의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) T12/L1의 디스크가 바늘 천자에 의해 손상되었고 주사는 없었으며, (ii) L1/2의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L2/3의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. 형질도입되지 않은 연골세포 치료는 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.
도 9a 내지 도 9d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L2/3의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L3/4의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L4/5의 디스크가 손상되었고 프라이밍된 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L2/3 및 L4/5 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용된다. 프라이밍된 연골세포 치료는 척추간 항-퇴행 효과를 갖는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산, 단백질, 단백질 단편 또는 이의 유도체와 관련하여 사용되는 용어 "생물학적 활성"은 야생형 형태의 핵산 또는 단백질에 의해 유도되는 공지된 생물학적 기능을 모방하는 핵산 또는 아미노산 서열의 능력으로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 형질감염 또는 형질도입된 세포와 관련하여 용어 "포유동물 세포"는 모든 유형의 포유동물 세포, 특히 섬유아세포 또는 연골세포와 같은 결합 조직 세포 또는 줄기세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 인간 세포, 특히 인간 배아 신장 세포, 추가로 특히 인간 배아 신장 293 세포 또는 상피 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 조직"은 다른 조직 또는 기관을 연결하고 지지하는 임의의 조직이며, 포유동물 숙주의 인대, 연골, 힘줄, 뼈 및 활막을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 조직 세포" 및 "결합 조직의 세포"는 콜라겐성 세포외 매트릭스를 분비하는 섬유아세포, 연골세포(cartilage cell)(연골세포(chondrocyte)) 및 골 세포(bone cell)(골아세포/골세포(osteocyte))뿐만 아니라 지방 세포(fat cell)(지방세포(adipocyte)) 및 평활근 세포와 같은 결합 조직에서 발견되는 세포를 포함한다. 바람직하게는, 결합 조직 세포는 섬유아세포, 연골세포 및 골 세포이다. 보다 바람직하게는, 결합 조직 세포는 연골세포이다. 본 발명은 단일 유형의 세포뿐만 아니라 결합 조직 세포의 혼합 배양물을 이용하여 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 바람직하게는, 결합 조직 세포는 숙주 유기체에 주사될 때, 부정적인 면역 반응을 유발하지 않는다. 이와 관련하여, 동종이계 세포뿐만 아니라 세포-매개성 유전자 요법 또는 체세포 요법용 자가 세포가 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 "결합 조직 세포주"는 공통의 모 세포로부터 유래하는 다수의 결합 조직 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "유리질 연골"은 관절 표면을 덮고 있는 결합 조직을 지칭한다. 단지 예로써, 유리질 연골은 관절 연골, 늑골 연골 및 코 연골을 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.

특히, 유리질 연골은 자가 재생이 가능하고(self-renewing), 변화에 반응하며, 마찰이 적고 안정적인 움직임을 제공하는 것으로 알려져 있다. 심지어 같은 관절 내 또는 관절 사이에서 발견되는 유리질 연골은 두께, 세포 밀도, 매트릭스 구성 및 기계적 특성이 다르지만, 일반적인 구조 및 기능은 동일하게 유지한다. 유리질 연골의 기능 중 일부는 압축에 대한 놀라운 강성, 탄성 및 중량 하중을 분산시키는 탁월한 능력, 연골하 뼈에 대한 피크 응력을 최소화하는 능력 및 우수한 내구성을 포함한다.

전체적으로 그리고 조직학적으로, 유리질 연골은 변형에 저항하는 매끄럽고 단단한 표면처럼 보인다. 연골의 세포외 매트릭스는 연골세포를 포함하지만, 혈관, 림프관 또는 신경이 없다. 연골세포와 매트릭스 사이의 상호작용을 유지하는 정교하고 매우 질서 정연한 구조는 낮은 수준의 대사 활성을 유지하면서 유리질 연골의 구조와 기능은 유지하는 역할을 한다. 참조 문헌[O'Driscoll, J. Bone Joint Surg., 80A: 1795-1812, 1998]은 유리질 연골의 구조와 기능을 상세히 기술하고 있으며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

본 명세서에서 사용되는 "주사 가능한" 조성물은 세포가 조성물에 부착될 수 있게 하고, 세포가 하나 이상의 층에서 성장할 수 있게 하는 임의의 물질 또는 모양으로 만들어질 수 있으며, 그 구조가 주사되는 것이 아니라 일반적으로 이식되는, 다양한 3차원 스캐폴드, 프레임워크, 메쉬 또는 펠트 구조를 배제한 조성물을 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 주사 방법은 전형적으로 주사기에 의해 수행된다. 그러나, 관심 있는 조성물의 어떠한 주사 방식도 사용될 수 있다. 예를 들어, 카테터, 스프레이 또는 온도 의존성 중합체 겔이 또한 사용될 수도 있다.

본 명세서에서 사용되는 "연소성 연골세포"는 2세 미만의 인간으로부터 수득되는 연골세포를 지칭한다. 전형적으로, 연골세포는 바람직하게는 손가락, 코, 귓불 등과 같은 신체 말단의 유리질 연골 부위로부터 수득된다. 연소성 연골세포는 결손 또는 손상된 추간판의 동종이계 치료를 위한 공여체(donor) 연골세포로서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "포유동물 숙주"는 인간을 포함하지만 이로 제한되지 않는 동물계의 구성원을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "혼합 세포", "세포의 혼합물" 또는 "세포 혼합물"은 관심 있는 유전자로 형질감염 또는 형질도입된 세포의 제1 집단 및 형질도입되지 않은 세포의 제2 집단의을 포함하는 복수의 세포의 조합물을 지칭한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 혼합 세포는 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자 또는 DNA로 형질감염 또는 형질도입된 세포 및 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자로 형질감염 또는 형질도입되지 않은 세포를 포함하는 복수의 세포의 조합물을 지칭할 수 있다. 전형적으로, 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자로 형질감염 또는 형질도입되지 않은 세포 대 TFG 슈퍼패밀리 유전자로 형질감염 또는 형질도입된 세포의 비는 약 3 내지 20 대 1의 범위일 수 있다. 범위는 약 3 내지 10 대 1의 범위일 수 있다. 특히, 범위는 세포 수의 측면에서 약 10 대 1일 수 있다. 그러나, 이들 세포의 조합물이 결손된 추간판의 퇴행을 둔화 또는 지연시킴으로써 손상된 추간판을 치료하는데 효과가 있는 한, 이들 세포의 비가 반드시 임의의 특정 범위로 고정되어야 하는 것은 아닌 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 "비-디스크 연골세포"는 추간판 연골 조직을 제외한 신체의 임의의 부위로부터 단리된 연골세포를 지칭한다. 본 발명의 비-디스크 연골세포는 결손 또는 손상된 추간판을 치료하기 위해 환자에게 동종이계 이식 또는 주사하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 인간을 포함하지만 이로 제한되지 않은 동물계의 구성원을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이밍된" 세포는 소정의 유전자를 발현하도록 활성화되거나 또는 변경된 세포를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 추간판 퇴행의 "둔화" 또는 "예방"은 주어진 시간 동안 정상적인 퇴행을 유발하는 손상 부위에서 정상적으로 발견되는 부피 또는 높이 수준과 비교하여, 시간 경과에 따른 추간판의 부피 또는 디스크의 높이의 유지를 지칭한다. 이는 주어진 시간에서의 정상적인 예상 퇴행 수준과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%와 같은 부피 또는 높이의 백분율의 증가를 의미할 수 있거나, 또는 해당 위치에서 추간판의 부피 또는 높이의 손상 또는 고갈의 감소를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 슈퍼패밀리"는 배아 발달 동안 광범위한 분화 과정에 영향을 미치는, 구조적으로 관련된 단백질 그룹을 포함한다. 패밀리는 정상적인 남성의 성 발달에 필요한 뮐레리안 저해 물질(M

llerian inhibiting substance: MIS)(문헌[Behringer, et al., Nature, 345: 167, 1990]); 성충판(imaginal disk)의 등-배 축(dorsal-ventral axis) 형성과 형태형성에 필요한 드로소필라 데카펜타플레긱(Drosophila decapentaplegic: DPP) 유전자 산물(문헌[Padgett, et al., Nature, 325: 81-84, 1987]); 충란의 난황극에 국재하는 제노푸스(Xenopus) Vg-1 유전자 산물(문헌[Weeks, et al., Cell, 51: 861-867, 1987]); 제노푸스 배아에서 중배엽 및 전방 구조의 형성을 유도할 수 있는(문헌[Thomsen, et al., Cell, 63: 485, 1990]) 액티빈(문헌[Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135: 957-964, 1986]); 및 데노보(de novo) 연골 및 골형성을 유도할 수 있는 골형성 단백질(BMP, 예컨대, BMP-2, 3, 4, 5, 6 및 7, 오스테오제닌 OP-1)(문헌[Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265: 13198, 1990])을 포함한다. TGF-β 유전자 산물은 지방 형성, 근육 형성, 연골 형성, 조혈 및 상피 세포 분화를 포함한 다양한 분화 과정에 영향을 미칠 수 있다(검토를 위해, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Massague, Cell 49: 437, 1987]을 참조).

TGF-β 패밀리의 단백질은 초기에 큰 전구체 단백질로서 합성되고, 이는 후속적으로 C-말단으로부터 대략 110개 내지 140개 아미노산의 염기성 잔기의 클러스터에서 단백질 분해 절단을 겪는다. 단백질의 C-말단 영역은 모두 구조적으로 관련되어 있으며, 상이한 패밀리 구성원은 이들의 상동성에 기초하여 별개의 하위 그룹으로 분류될 수 있다. 특정한 하위 그룹 내의 상동성은 70% 내지 90%의 아미노산 서열 동일성의 범위이지만, 하위 그룹 간의 상동성은 일반적으로 20% 내지 50%의 범위로 상당히 더 낮다. 각 경우에 있어서, 활성 종은 C-말단 단편의 다이설파이드-연결된 이량체인 것으로 보인다. 연구되어 온 대부분의 패밀리 구성원에 대해, 동종이량체(homodimeric) 종은 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌지만, 인히빈(inhibin)(문헌[Ung, et al., Nature, 321: 779, 1986]) 및 TGF-β(문헌[Cheifetz, et al., Cell, 48: 409, 1987])와 같은 기타 패밀리 구성원에 대해서는 이종이량체도 검출되었으며, 이들은 각각의 동종이량체와 생물학적 특성이 다른 것으로 보인다.

TGF-β 유전자의 슈퍼패밀리 구성원은 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4(닭), TGF-β1, TGF-β5(제노푸스), BMP-2, BMP-4, 드로소필라 DPP, BMP-5, BMP-6, Vgr1, OP-1/BMP-7, 드로소필라 60A, GDF-1, 제노푸스 Vgf, BMP-3, 인히빈-βA, 인히빈-βB, 인히빈-α 및 MIS를 포함한다. 이들 유전자는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌(문헌[Massague, Ann. Rev. Biochem. 67: 753-791, 1998])에 논의되어 있다.

바람직하게는, 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7이다.

추간판

추간판은 척추 길이의 4분의 1을 차지한다. 고리뼈(Atlas)(C1), 중쇠뼈(Axis)(C2) 및 미골(Coccyx) 사이에는 디스크가 없다. 디스크는 혈관이 아니므로, 필요한 영양소를 확산시키기 위해 종판(end plate)에 의존한다. 종판의 연골 층은 디스크를 제자리에 고정한다.

추간판은 척추의 충격 흡수 시스템(shock absorbing system)의 역할을 하는 섬유연골성 쿠션(fibrocartilaginous cushion)으로, 이는 척추, 뇌 및 기타 구조들(즉, 신경)을 보호한다. 디스크는 일부 척추 운동: 신전(extension) 및 굴곡(flexion)을 허용한다. 개별 디스크의 움직임은 매우 제한적이지만 - 여러 디스크가 힘을 결합하면 상당한 움직임이 가능하다.

추간판은 섬유륜(annulus fibrosus) 및 수핵(nucleus pulposus)으로 구성된다. 섬유륜은 라멜라; 척추 종판에 연결된 콜라겐 섬유의 동심원상 시트로 만들어진 강력한 방사형 타이어-유사 구조이다. 시트는 다양한 각도로 배향된다. 섬유륜은 수핵을 둘러싸고 있다.

섬유륜과 수핵은 모두 물, 콜라겐 및 프로테오글리칸(PG)으로 구성되어 있지만, 액체(물과 PG)의 양은 수핵에서 가장 많다. PG 분자는 물은 끌어당기고 보유하기 때문에 중요하다. 수핵은 압축에 저항하는 수화된 겔-유사 물질을 함유한다. 핵에 있는 물의 양은 활동에 따라 하루 종일 달라진다. 사람이 나이가 들면서, 수핵은 탈수되기 시작하여, 충격을 흡수하는 능력이 제한된다. 섬유륜은 나이가 들면서 약해지고 찢어지기 시작한다. 이는 일부 사람에서는 통증을 유발하지 않을 수 있지만, 다른 사람에게는 이들 중 하나 또는 둘 모두가 만성적 통증을 유발할 수 있다.

탈수되는 수핵이 충격을 흡수하지 못하여 생기는 통증은 축성 통증(axial pain) 또는 디스크 공간 통증(disc space pain)이라고 한다. 하나는 일반적으로 수핵의 점진적인 탈수를 퇴행성 디스크 질환으로 지칭한다. 섬유륜이 손상 또는 노화 과정으로 인해 찢어지면, 수핵은 찢어진 곳을 통해 돌출되기 시작할 수 있다. 이를 추간판 탈출증(disc herniation)이라고 한다. 모든 척추를 따라 각 디스크의 뒤쪽 근처에는, 척추를 따라 주요 척추 신경이 다른 장기, 조직, 사지 등으로 뻗어 있다. 탈장된 디스크가 이러한 신경을 압박하여(눌린 신경) 방사통, 무감각, 따끔거림 및 힘 및/또는 운동 범위의 감소를 유발하는 것은 매우 일반적이다. 또한, 염증성 단백질을 함유하는 내부 핵 겔이 신경과 접촉하는 경우에도 상당한 통증을 유발할 수 있다. 신경-관련 통증을 신경근 통증(radicular pain)이라고 한다.

탈장된 디스크는 여러 이름으로 불리며, 이는 의료 전문가마다 의미가 다를 수 있다. 미끄러진 디스크(slipped disc), 파열된 디스크(ruptured disc) 또는 팽륜 디스크(bulging disc)는 모두 동일한 의학적 병태를 지칭한다. 인접한 척추로의 디스크의 돌출은 쉬모를 결절(Schmorl's nodes)로 알려져 있다.

프라이밍된 세포 요법

본 발명은 프라이밍된 세포를 포유동물의 추간판 부위에 투여하여 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시킴으로써 손상된 추간판을 치료하는 것을 포함한다. 프라이밍된 세포는 전형적으로 결합 조직 세포이며, 연골세포 또는 섬유아세포를 포함한다.

예로서, 일차 연골세포의 집단이 약 3회 또는 4회 계대될 때, 이들의 형태는 전형적으로 섬유아세포성 연골세포(fibroblastic chondrocyte)로 변한다. 일차 연골세포가 계대됨에 따라, 이들은 연골세포의 특성의 일부를 상실하기 시작하고 섬유아세포성 연골세포의 특성을 취하기 시작한다. 이들 섬유아세포성 연골세포가 배양되거나 TGF-β 슈퍼패밀리로부터의 단백질과 같은 사이토카인과 함께 배양되거나 또는 이로 "프라이밍"될 때, 세포는 콜라겐의 생성을 포함하는 연골세포 특성을 회복한다.

이러한 프라이밍된 세포는 섬유아세포성 연골세포를 포함하며, 이는 TGFβ1과 함께 배양되어, 결과적으로 콜라겐 생성 연골세포로 되돌아간다. 추간판 퇴행의 지연에 프라이밍된 세포를 사용하는 것의 이점은 콜라겐의 생성 및 그렇지 않으면 연골 기질의 유지를 위해 추간판으로 도입하기 위한 사용 가능한 연골세포를 쉽게 생성할 수 있다는 것이다.

세포는 제한 없이 일차 세포 또는 약 1회 내지 20회 계대를 거친 세포를 포함할 수 있다. 세포는 결합 조직 세포일 수 있다. 세포는 형태적 변화를 겪은 세포를 포함할 수 있되, 프라이밍(priming)은 원래 세포의 특성으로의 복귀를 유발한다. 세포는 제한 없이 연골세포, 섬유아세포 또는 섬유아세포성 연골세포를 포함할 수 있다. 프라이밍은 세포를 사이토카인과 함께 적어도 40시간, 또는 1시간 내지 40시간, 2시간 내지 30시간, 3시간 내지 25시간, 4시간 내지 20시간, 5시간 내지 20시간, 6시간 내지 18시간, 7시간 내지 17시간, 8시간 내지 15시간 또는 9시간 내지 14시간의 기간 동안 인큐베이션함으로써 일어날 수 있고, 이어서 선택적으로 세포로부터 사이토카인을 분리하고, 연골, 바람직하게는 유리질 연골을 재생시키기 위해 프라이밍된 세포를 관심 있는 연골 결손 부위에 주사한다. 일 양태에서, 사이토카인은 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원일 수 있다. 특히, 사이토카인은 TGF-β, 특히 TGF-β1일 수 있다.

사이토카인은 추간판 치료 방법에 유용하도록 연골세포를 충분히 "프라이밍"시키는 양으로 프라이밍 인큐베이션 믹스(priming incubation mix)에 존재할 수 있다. 이 양태에서, 프라이밍 인큐베이션 믹스는 적어도 약 1 ng/㎖의 사이토카인을 포함할 수 있다. 특히, 믹스는 약 1 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 750 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖, 약 10 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖, 약 15 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖, 약 25 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖, 약 35 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 300 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖, 약 40 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖ 또는 약 40 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖를 포함할 수 있다.

본 발명을 실시하는 한 가지 방법은 프라이밍된 세포를 생성하기 위해 소정의 시간 동안 사이토카인과 함께 세포를 인큐베이션하고, 선택적으로 세포로부터 사이토카인을 분리하고, 프라이밍된 세포를 추간판 또는 그 근처의 관심 있는 부위에 주사하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포는 관심 있는 사이토카인과 함께 일정 시간 동안 인큐베이션될 수 있고, 조합물은 사이토카인을 분리하지 않고 결손 부위에 투여될 수 있다.

스캐폴딩 또는 프레임워크와 같은 물질뿐만 아니라 다양한 외부 조직이 본 발명의 프라이밍된 세포 요법 프로토콜에서 함께 이식될 수 있지만, 이러한 스캐폴딩 또는 조직이 본 발명의 주사 시스템에 포함되지 않을 수도 있음을 이해하여야 한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 체세포 요법에서, 본 발명은 프라이밍된 결합 조직 세포의 집단을 추간판 공간에 주사하는 간단한 방법에 관한 것이다.

당업자는 인간 환자를 치료하기 위한 세포의 공급원이 환자 자신의 세포일 수 있지만, 동종이계 세포뿐만 아니라 이종계 세포도 또한 세포의 조직적합성(histocompatibility)에 관계없이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 대안적으로, 본 발명의 일 실시형태에서, 포유동물 숙주에 대해 일치하는 조직적합성을 갖는 동종이계 세포가 사용될 수 있다. 좀 더 상세히 설명하면, 공여체와 환자의 조직적합성은 조직적합성 세포가 포유동물 숙주에 투여되도록 결정된다. 또한, 연소성 연골세포는 또한 공여체와 환자의 조직적합성을 반드시 결정하지 않더라도 동종이계로 사용될 수도 있다.

유전자 전달

일 양태에서, 본 발명은 관심 있는 DNA 서열을 포유동물 숙주의 결합 조직 세포에 전달하기 위한 생체외 및 생체내 기법을 개시한다. 생체외 기법은 표적 포유동물 세포의 배양, DNA 서열의 시험관내 형질감염, DNA 벡터 또는 관심 있는 다른 전달 비히클을 포유동물 세포에 삽입한 후, 관심 있는 유전자 산물의 생체내 발현에 영향을 미치도록 변형된 포유동물 세포를 포유동물 숙주의 표적 부위에 이식하는 것을 포함한다.

스캐폴딩 또는 프레임워크와 같은 물질뿐만 아니라 다양한 외부 조직이 본 발명의 프로토콜에서 함께 이식될 수 있지만, 이러한 스캐폴딩 또는 조직이 본 발명의 주사 시스템에 포함되지 않을 수도 있음을 이해하여야 한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 TGF 슈퍼패밀리 단백질 또는 배양된, 형질감염되지 않은/형질도입되지 않은 결합 조직 세포, 또는 형질감염된/형질도입된 포유동물 세포, 또는 이들의 혼합물을 추간판 공간에 주사하여 외인성 TGF 슈퍼패밀리 단백질이 해당 공간에서 발현되거나 활성을 갖도록 하는 간단한 방법에 관한 것이다.

당업자는 인간 환자를 치료하기 위한 세포의 공급원이 환자 자신의 세포일 수 있음을 이해할 것이다. 세포의 또 다른 공급원은 치료하고자 하는 환자에 대한 세포의 조직적합성과 관계없이 동종이계 세포를 포함한다.

보다 구체적으로, 이 방법은 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편인 유전자 산물, 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, TGF-β 슈퍼패밀리 단백질 및 적합한 약제학적 담체를 함유하는, 치료적 유효량으로 환자에게 비경구 투여하기 위한 화합물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질 및 적합한 약제학적 담체를 포함하는, 예방적 유효량으로 환자에게 비경구 투여하기 위한 화합물을 제공한다.

치료적 적용에서, TGF-β 단백질은 국부 투여를 위해 제형화될 수 있다. 기법 및 제형화는 일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판]에서 찾을 수 있다. TGF 단백질인 활성 성분은 일반적으로 투여 방식 및 투여 형태의 특성에 따라, 충전제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 부식성 폴리머 또는 윤활제를 포함할 수 있는 부형제의 희석제와 같은 담체와 함께 조합된다. 전형적인 투여 형태는 분말, 현탁액, 에멀젼 및 용액을 포함하는 액체 제제, 과립 및 캡슐을 포함한다.

본 발명의 TGF 단백질은 또한 대상체에 투여하기 위해 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 조합될 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 N-(1-2,3-다이올레일옥시)프로필)-n,n,n-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 다이올레오일포스포티딜 에탄올아민(DOPE)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 양이온성 지질이다. 리포솜이 또한 본 발명의 TGF β 단백질 분자에 적합한 담체이다. 또 다른 적합한 담체는 TGF β 단백질 분자를 포함하는 지효성(slow-release) 겔 또는 중합체이다.

TGF β 단백질은 일정량의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 또는 식염수 또는 기타 적합한 액체와 같은 희석제와 혼합될 수 있다. TGF 단백질 분자는 또한 TGF 단백질 및 이의 생물학적 활성 형태가 표적에 도달할 때까지 분해로부터 보호하고/하거나 조직 장벽을 가로질러 TGF 단백질 또는 이의 생물학적 활성 형태의 이동을 촉진하기 위해 다른 담체 수단과 조합될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시형태는 세포를 옮기기 전에 세포를 보관하는 것을 포함한다. 당업자는 세포가 액체 질소 중 10% DMSO에서 냉동 보관될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 출원에서, BMP-2 및 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자로 형질감염 또는 형질도입된 적절한 포유동물 세포를 주사함으로써 추간판을 재생시키거나 또는 이의 퇴행을 예방하는 방법이 제공된다.

본 출원의 또 다른 실시형태에서, 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자로 형질감염 또는 형질도입되지 않거나 또는 임의의 다른 유전자로 형질감염 또는 형질도입되지 않은 적절한 결합 조직 세포를 주사함으로써 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 위에 기재된 방법을 사용하여 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시킴으로써 손상 또는 퇴행된 추간판을 치료하는 것을 지향한다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자로 형질감염 또는 형질도입된 적절한 포유동물 세포를 주사하는 것에 의한 추간판의 퇴행 예방 또는 지연 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 상술된 방법을 사용하여 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시킴에 의해 손상 또는 퇴행된 추간판을 치료하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자로 형질감염 또는 형질도입된 적절한 포유동물 세포 및 형질전환 성장 인자(TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자로 형질감염 또는 형질도입되지 않거나 또는 임의의 다른 유전자로 형질감염 또는 형질도입되지 않은 적절한 결합 조직 세포의 조합물 또는 혼합물을 주사함으로써 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 위에 기재된 방법을 사용하여 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시킴으로써 손상 또는 퇴행된 추간판을 치료하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 실시형태에서, 세포는 스캐폴딩 물질, 또는 외인성 세포 또는 다른 생체적합성 담체와 같은 임의의 보조 물질을 사용하거나 사용하지 않고 위에 기재된 세포 조성물을 이용하여 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키고자 하는 부위에 주사될 수 있는 것으로 이해된다. 즉, 변형된 세포 단독, 변형되지 않은 세포 단독, 또는 이들의 혼합물 또는 조합물이 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키기 위한 부위로 주사될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 예시하기 위해 제공되는 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

실시예 I - 재료 및 방법

플라스미드 구축

TGF-β1 코딩 서열 및 3' 말단의 성장 호르몬 폴리 A 부위를 함유하는 1.2-kb Bgl II 단편을 pMTMLV의 BamHI 부위 내로 서브클로닝함으로써 플라스미드 pMTMLVβ1을 생성하였다. pMTMLV 벡터는 완전한 gag 및 env 서열뿐만 아니라 Ψ 패키징 서열의 일부를 결실시켜 레트로바이러스 벡터 MFG로부터 유래되었다.

세포 배양 및 형질도입 - 레트로바이러스 벡터에 클로닝된 TGF-β cDNA를 293 세포(293-TGF-β1)에 개별적으로 형질도입하였다. 이들을 10% 농도의 소 태아 혈청을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(깁코-비알엘(GIBCO-BRL), 메릴랜드주 록빌 소재)에서 배양하였다.

형질도입된 유전자 서열을 갖는 세포를 선별하기 위해, 네오마이신(300㎍/㎖)을 배지에 첨가하였다. TGF-β1을 발현하는 세포는 때때로 액체 질소에 보관하고, 주사 직전에 배양하였다.

디스크 높이의 방사선 사진 분석

천자 후 다양한 주 간격으로 케타민 하이드로클로라이드(25 ㎎/㎏) 및 럼푼(Rompun, 1 ㎎/㎏)을 투여한 이후에 방사선 사진을 촬영하였다. 각 동물의 방사선 촬영 중 일정한 마취 수준을 유지하고, 디스크 높이에 영향을 미칠 수 있는 유사한 정도의 근육 이완을 얻기 위해 각 시간에 극도의 주의를 기울였다. 따라서, 수술 전(preoperative) 방사선 사진은 항상 기준 측정(baseline measurement)으로 사용하였다. 또한, 척추가 약간 구부러진 자세를 유지하도록 노력하였다. 척추의 축 회전(axial rotation) 및 빔 발산(beam divergence)으로 인한 오류를 줄이기 위해, 방사선 사진이 각 동물 상에서 옆으로 누운 자세로 토끼의 장골능(iliac crest)으로부터 4㎝의 중심에 빔을 두고 옆으로 누운 자세에서 각 동물에 대해 방사선 사진 촬영을 적어도 2회 반복하였다. 이미지 캡쳐 소프트웨어(Image Capture software)를 사용하여 디지털 방식으로 스캔하고 디지털 방식으로 저장하였다.

이미지 분석

디지털화된 방사선 사진을 사용하여, 척추체(vertebral body) 높이 및 IVD 높이를 포함한 측정값을 공공 도메인 이미지 분석을 사용하여 분석하였다. 데이터를 엑셀 소프트웨어로 전송하고, IVD 높이를 문헌[Lu et al. "Effects of chondroitinase ABC and chymopapain on spinal motion segment biomechanics. An in vivo biomechanical, radiologic, and histologic canine study", Spine 1997;22:1828-34]의 방법을 사용하여 DHI로 나타내었다. 평균 IVD 높이(DHI)를 IVD의 전방, 중앙 및 후방으로부터 얻은 측정값을 평균화하고, 이를 인접한 척추체 높이의 평균으로 나누어 계산하였다. 주사된 디스크의 DHI의 변화는 DHI 퍼센트로 나타내고, 측정된 수술 전 IVD 높이에 대해 정규화하였다(DHI 퍼센트=수술 후 DHI/수술 전 DHI×100). 대상체 내 표준 편차(Sw)는 다음 방정식을 사용하여 계산하였다:

여기에서, X₁은 첫 번째 측정값이고, X₂는 두 번째 측정값이며, n=450이다. 변동계수 퍼센트(percent coefficient of variance: CV 퍼센트)를 (Sw/모든 측정값의 평균×100)으로 계산하였다. DHI 측정값의 관찰자내 오차(intraobserver error)는 최소인 것으로 추정하였다(Sw: 0.001800316; CV 퍼센트: 3.13). 관찰자간 오차(interobserver error)도 또한 작은 것으로 보고되었다(Sw: 0.003227; CV 퍼센트: 9.6).

MRI 평가

직교 코일 수신기(quadrature extremity coil receiver)가 장착된 0.3-T imager(Airis II, 버전 4.0 A; 히타치 메디칼 시스템 아메리카 인코포레이션(Hitachi Medical System America, Inc.))를 사용하여 이 연구의 모든 토끼에 대해 MRI 검사를 수행하였다. 희생 후, 주변 연조직이 있는 척추를 분리하고, MRI 분석을 거쳤다. 시상면(sagittal plane)의 T2-강조 절편(T2-weighted section)을 다음 설정에서 얻었다: TR(반복까지의 시간)이 4000 밀리초(millisecond)이고 TE(에코까지의 시간)가 120 밀리초인 고속 스핀 에코 연쇄(fast spin echo sequence); 256(h)×128(v) 행렬; 260의 시야; 및 4개의 여기(excitation). 절편 두께는 0㎜ 간격으로 2㎜였다. 1등급에서 4 등급(1=정상, 2=신호 강도의 최소 감소이지만 고신호 영역의 명백한 감소, 3=신호 강도의 보통의 감소, 및 4=신호 강도의 심각한 감소)까지의 신호 강도의 정도 및 면적의 변화를 기반으로 수정된 톰슨(Thompson) 분류를 사용하여 맹검 관찰자(blinded observer)가 MRI를 평가하였다. 코헨 카파 상관 계수(Cohen kappa correlation coefficient)에 의해 결정된 바와 같이, 2가지 평가에 기초한 MRI 등급의 관찰자내 및 관찰자간 신뢰도 상관 계수(reliability correlation coefficient)는 우수하였다(각각 K=0.98, 0.90).

실시예 II - 실험 방법 및 결과

손상된 추간판의 퇴행 예방

뉴질랜드 흰 수컷 토끼를 사용하였다. 개복 수술 기법을 사용하였다. 각 동물에서 요추의 3개의 추간판 수준(L2-3, L3-4, L4-5)을 실험적으로 처리하거나 또는 대조군으로서 관찰하였다. 치료제는 관찰된 토끼당 여러 부위/디스크를 사용하여 균형 잡힌 방식으로 수준에 대해 할당하였다. 대상체내 실험(subject design)에서, 수술 전-후 비교, 디스크 수준에 따른 변화를 대조군으로 사용하였다.

실시예 III

형질도입되지 않은 연골세포 단독, TGF-β1-생산 293 세포 단독, 또는 혼합 세포(인간 연골세포 및 TGF-β1-생산 293 세포)를 토끼에 주사하여 손상된 추간판의 퇴행 예방

실시예 I 내지 V에서 사용된 연골세포는 모두 비-디스크 연골세포로, 2세 미만 어린이의 손가락의 유리질 연골 부위로부터 얻은 연소성 연골세포이다.

요추의 추간판에 바늘 천자를 생성하였다. 이러한 바늘 천자 후, TGF-β1-생산 293 세포, 일차의 형질도입되지 않은 인간 연골세포, TGF-β1-생산 293 세포와 일차의 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물, 프라이밍된 형질도입되지 않은 인간 연골세포 또는 담체/배지를 주사하였다. 여러 대조군을 사용하였다. 실험 조건은 표 1에 열거되어 있다.

간략하게는, 바늘 천자 손상을 토끼 또는 돼지의 요추의 추간판에 생성하였다. 이러한 바늘 천자 후, 토끼를 4주 동안 회복시켰다. 그런 다음, 두 번째 수술 절차에서, TGF-β1-생산 293 세포 및/또는 일차의 형질도입되지 않은 인간 연골세포(약 5×10⁵개 세포)를 포함하는 실험적 치료 조성물을 주사하거나, 또는 대조군 병태를 관찰하였다(표 1).

케타민 하이드로클로라이드 및 Rompun^®의 투여와 같은 기관내 삽관(endotrachial intubation) 및 전신 마취 후, 동물을 앙와위로 눕혔다. 유산 링거(lactated ringer)를 약 (5 ㎖/㎏/시간)으로 사용하였다. 절개 부위를 면도하여 준비하고, 베타딘 스크럽과 및 알코올 와이프스를 교대로 사용하여 일반적인 멸균 방식으로 드레이프하였다(3회 초과). 눈에는 순한 안과 연고를 발라주었다. L2 내지 L5(토끼는 6개 내지 7개의 요추를 가짐)에서 디스크의 오른쪽 전방을 노출시키기 위해 왼쪽 후복막 접근법(retroperitoneal approach)을 사용하였다. 다양한 준비 체계를 사용하고, 각 디스크 수준에 대한 치료 체계를 적용하였다. 디스크의 '바늘 천자' 준비를 위해, 18-게이지 바늘을 사용하여 디스크에 5㎜ 깊이로 구멍을 뚫었다(문헌[Aoki et al., "Nerve fiber ingrowth into scar tissue formed following nucleus pulposus extrusion in the rabbit anular-puncture disc degeneration model: effects of depth of puncture". Spine. 2006;31(21):E774-80]). 천자 후, 표 1에 열거된 테스트 물질을 주사하였다. 치료 조성물은 각 토끼의 L1-2, L2-3, L3-4, L4-5 부위 중 어느 하나에 적용하였다.

디스크 변화를 모니터링하기 위해 매달 방사선 사진을 촬영하였다. 동물은 수술 후 2주, 8주 및 24주에 희생시켰다.

방사선 사진/MRI. 치유(healing)는 다른 디스크 수준의 디스크와 비교하여 기준선(수술 전)에서 동일한 디스크에서의 증가된 디스크 높이의 검출 가능한 방사선 변화로 표시된다. 다른 디스크를 바늘 천자만을 하기 전과 후에 비교하고, 바늘 천자를 하지 않은 전과 후의 디스크에 대해 시간 경과에 따른 정상적인 퇴행 지수를 산출하였다.

역-전사 PCR(Retro-Transcription PCR). 살아 있는 형질감염된 연골세포의 상대적인 양을 분석하기 위해 역-전사 PCR을 수행하였다.

조직학. 또한, 조직학을 사용하여 타입 I 및 타입 II 콜라겐의 특성화, 데노보(de novo) 연골세포의 육안적 외관 및 평가를 확인하였다.

웨스턴 블롯 분석 및 ELISA. 타입 I 및 타입 II 콜라겐 및 프로테오글리칸 농도, Smads 2/3, Sox-9의 정량적 발현. 사용 가능한 항체가 있는 경우, TGF-β1, BMP2, BMP7, GDF5 및 기타 관련 성장인자를 평가하기 위해 추가적인 ELISA를 사용하였다.

캐스페이스-3(caspase-3)의 발현을 관찰함으로써 추간판의 다른 조직 구조에서 아폽토시스를 조사하였다.

실시예 IV

결과

결과는 본 출원의 도면 및 도면의 설명에 나타난 바와 같다. 형질도입되지 않은 연골세포 단독, 형질도입된 293 세포 단독, 프라이밍된 연골세포 단독, 또는 형질도입된 293 세포와 형질도입되지 않은 연골세포의 혼합물로 처리된 천자된 추간판은 비히클 대조군과 비교하여 디스크 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는데 유익한 효과를 나타낸다.

실시예 IV-1 - 토끼에서 천자된 추간판의 혼합-세포(형질도입된 293 세포 및 형질도입되지 않은 연골세포) 처리

혼합 세포 처리는 토끼에서 테스트될 때 추간판 항-퇴행 효과가 있다. 효과는 도 1 내지 도 4의 다양한 실험에서 보여진다. 도 1a 내지 도 1f는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 보이지 않았고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

도 2a 내지 도 2f는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 보이지 않았고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

도 3a 내지 도 3d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

실시예 IV-2 - 토끼에서 천자된 추간판의 형질도입된 293 세포 치료

TGF-β1-생산 293 세포 치료는 추간판 항-퇴행 효과가 있다. 효과는 도 4a 내지 도 4d에서 볼 수 있으며, 이는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

실시예 IV-3 - 토끼에서 천자된 추간판의 형질도입된 293 세포 치료 및 혼합-세포 치료

TGF-β1-생산 293 세포 치료 및 혼합 세포 치료는 추간판 항-퇴행 효과가 있다. 효과는 도 5a 내지 도 5d에서 볼 수 있으며, 이는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 나타낸다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포 및 형질도입되지 않은 인간 연골세포의 혼합물이 1:3의 비로 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 TGF-β1-생산 293 세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

실시예 IV-4 - 토끼에서 천자된 추간판의 형질도입되지 않은 연골세포 치료

형질도입되지 않은 연골세포 치료는 추간판 항-퇴행 효과가 있다. 효과는 도 6 내지 도 8의 다양한 실험에서 볼 수 있다. 도 6a 내지 도 6d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

도 7a 내지 도 7f는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L1/2의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L2/3의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L3/4의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L1/2 및 L3/4 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

도 8a 내지 도 8f는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 넷째(4) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) T12/L1의 디스크가 바늘 천자에 의해 손상되었고 주사는 없었으며, (ii) L1/2의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L2/3의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) T12/L1의 디스크가 바늘 천자에 의해 손상되었고 주사는 없었으며, (ii) L1/2의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L2/3의 디스크가 손상되었고 형질도입되지 않은 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 T12/L1 및 L2/3 디스크 부위를 가리킨다. (d)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (e)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (f)는 위의 (c)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

실시예 IV-5 - 토끼에서 천자된 추간판의 형질도입되지 않은 프라이밍된 연골세포 치료

프라이밍된 연골세포 치료는 추간판 항-퇴행 효과가 있다. 효과는 도 9a 내지 도 9d에서 볼 수 있다. 도 9a 내지 도 9d는 손상된 디스크의 퇴행의 둔화, 지연 또는 예방을 보여준다. (a)는 수술 전 토끼 척추의 MRI 방사선 사진을 보여주고; (b)는 수술 후 여덟째(8) 주에 토끼 척수의 MRI 방사선 사진을 보여주며, 여기에서 (i) L2/3의 디스크가 손상되었고 세포 배양 배지 DMEM이 주사되었으며, (ii) L3/4의 척추 위치에서는 어떠한 천자 및 치료 제어도 없고, (iii) L4/5의 디스크가 손상되었고 프라이밍된 연골세포가 주사되었으며; 화살표는 L2/3 및 L4/5 디스크 부위를 가리킨다. (c)는 위의 (a)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 형태, 퇴행 또는 재생의 수준을 측정하기 위해 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다. (d)는 위의 (b)에 기술된 토끼의 X-선 방사선 사진을 보여주며, 이는 추간판의 디스크 높이 지수를 얻는데 사용하였다.

실시예 V

인간 연골세포의 공급원

일차 인간 연골세포를 1세의 여아 인간 공여자로부터의 다지증 손가락을 외과적으로 절제하여 얻은 연골 조직으로부터 성장시켰다. 다지증 조직은 수술실에서 채취하였다. 연골세포 분리를 위한 다음의 절차를 생물안전 캐비닛에서 수행하였다. 연골 조직이 들어 있는 플라스틱 병을 알코올로 문지르고, 연골 조직을 피펫을 사용하여 멸균 PBS(1×)로 세척하였다. 7㎎의 콜라게네이스(깁코 비알엘)를 10mℓ의 DMEM(10% FBS 함유)에 용해시키고, 0.2㎛의 주사기 필터(코닝(Corning))를 통해 여과하여 콜라게네이스 용액을 제조하였다. 세척된 연골 조직은 콜라게네이스 용액을 사용하여 37℃ 진탕 배양기에서 17시간 내지 18시간 동안 처리하였다. 다음 날, 알코올로 병을 소독하였다. 콜라게네이스 처리한 물질을 상하로 여러 번 피펫팅하여 조직 덩어리로부터 느슨한 세포를 분리하였다. 피펫팅 후, 상청액을 70㎛의 나일론 세포 여과기(팔콘(Falcon))를 통해 여과하였다. 온전성(integrity)을 상실한 콜라게네이스를 처리한 조직(예를 들어, 느슨한 세포)은 필터를 통과할 수 있었다. 세포 여과액을 50mℓ의 튜브(팔콘)에 수집한 다음, 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액의 2/3를 버리고, 펠릿을 10㎖의 멸균 PBS(1×)로 세척하였다. 재현탁된 세포를 다시 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액의 2/3를 제거한 후, 10㎖의 멸균 PBS(1×)로 세척하였다. 세포를 다시 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, DMEM(10% FBS 함유)에 재현탁시켰다. 그런 다음, 재현탁된 세포를 4개의 코팅되지 않은 25㎠ 플라스크로 옮기고, 5% CO₂ 하에서 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 2개의 코팅되지 않은 185㎠ 플라스크로 옮겼다. 세포를 2주 동안 배양한 후 수집하고, 세척하고, 5:4:1의 비의 DMEM, FBS 및 DMSO의 동결보존 배지에 재현탁시켰다. 세포를 4×10⁵개 세포/㎖의 농도로 1㎖의 세포 현탁액을 함유하는 냉동 바이알에 분취하였다. 세포를 증기상 액체 질소 저장고에 보관하였다.

Claims (21)

1. 추간판 결손 부위(intervertebral disc defect site)에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법으로서,
   포유동물 결합 조직 세포를 상기 추간판 결손 부위에 주사하는 단계를 포함하는, 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 결합 조직 세포는 상기 포유동물에 대해 동종이계(allogeneic)인, 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 연골세포인, 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 연골세포는 비-디스크 연골세포(non-disc chondrocyte) 또는 연소성 연골세포(non-disc chondrocyte)인, 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 연골세포는 프라이밍된(primed) 연골세포인, 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
7. 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법으로서,
   a) 추간판 재생 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포유동물 세포에 삽입하는 단계, 및
   b) 상기 포유동물 세포를 상기 추간판 결손 부위에 이식하는 단계
   를 포함하는, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 유전자는 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 유전자는 TGF-β1을 암호화하는, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 상기 포유동물에 대해 동종이계인, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포인, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
12. 제7항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
13. 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법으로서,
    a) 추간판 재생 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 제1 포유동물 세포에 삽입하는 단계, 및
    b) 상기 a)의 포유동물 세포 및 변형되지 않은 제2 포유동물 결합 조직 세포의 혼합물을 상기 추간판 결손 부위에 이식하는 단계
    를 포함하는, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 유전자는 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 제1 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포이고; 제2 포유동물 결합 조직 세포는 연골세포인, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 연골세포는 비-디스크 연골세포 또는 연소성 연골세포인, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
17. 제13항에 있어서, 상기 제2 포유동물 결합 조직을 위한 연골세포는 프라이밍된 연골세포인, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
18. 제13항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 세포는 상기 포유동물에 대해 동종이계인, 포유동물의 추간판 결손 부위에서 추간판의 퇴행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법.
19. 제1항에 따른 방법을 이를 필요로 하는 대상체에 사용하는 단계를 포함하는, 환자의 퇴행된 또는 손상된 추간판을 치료하는 방법.
20. 제7항에 따른 방법을 이를 필요로 하는 대상체에 사용하는 단계를 포함하는, 환자의 퇴행된 또는 손상된 추간판을 치료하는 방법.
21. 제13항에 따른 방법을 이를 필요로 하는 대상체에 사용하는 단계를 포함하는, 환자의 퇴행된 또는 손상된 추간판을 치료하는 방법.

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