KR20220016119A - 생물학적 매트릭스에서 석회화 침착물의 형성을 방지하고 이종항원을 불활성화시키는 방법 - Google Patents

생물학적 매트릭스에서 석회화 침착물의 형성을 방지하고 이종항원을 불활성화시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단리된 생물학적 매트릭스를 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 단리된 생물학적 매트릭스에서 또는 그 내부에서 석회화 침착물의 형성을 방지하는 방법을 개시한다.

Description

생물학적 매트릭스에서 석회화 침착물의 형성을 방지하고 이종항원을 불활성화시키는 방법
본 발명은 의학, 바이오의학, 또는 수의학 분야에 적용되고, 구체적으로, 인간 및 동물의 신체에 이식될 생물학적 및 생체적합성 매트릭스의 제조에 적용된다.
생체인공 대체물(bioprosthetic substitutes)의 생산이 현재 중대한 시장 확장을 진행하고 있다. 이식물과 숙주 간 상호작용 메카니즘의 보다 심층적인 지식과 결합된, 수술 절차의 임상적 개선, 수술-후 합병증의 감소, 새로운 면역조절 의약품의 개발 및 관리가 모두 동물 또는 동종 조직으로 구성된 생물학적 보형물(protheses)의 사용을 촉진하는데 기여한다. 이러한 점에서, 대표적인 섹터가 심혈관 섹터이고, 특히, 심장 판막 치환술의 확립된 시술이 유발할 수 있는 사회 및 보건 영향의 측면에서 그러하다.
생물의학적(biomedical) 기술은 기능부전성 자연 판막의 개방 및 폐쇄 기능을 모방할 수 있는 치환을 위한 판막 보형물을 개발하고 수술에 의해 적용할 수 있다. 바람직한 생체인공 심장 판막 대체물(BHV)은 긴 수명을 보장하고 용혈 또는 혈전형성 효과를 생성하지 않기 위해 유사한 원래의 건강한 판막의 경-판막 흐름(trans-valve flow)과 중첩될 수 있는 경-판막 흐름을 가능하게 할 수 있어야 한다.
가장 빈번하게 사용되는 판막 대체물은 이종 조직, 특히, 돼지 판막으로부터 유래된 생물학적 보형물 또는 소, 말, 또는 돼지 심장막으로 제조된 판막이다.
그러한 판막 보형물 및 대체물은 그들의 임상적 적용을 크게 제한하는 다수의 위험상황(criticality)을 겪는다.
국제특허출원 WO 2017/093147은 생체보형물(bioprotheses)의 제조를 위한 생물학적 조직에서 이종항원(xenoantigen), 특히, 알파-Gal의 불활성화 방법을 개시한다. 석회화(calcification)와 관련된 양태는 그의 효과를 뒷받침하는 실험 기재의 부재에 의해 입증된 바와 같이 간접적으로 언급된다.
미국특허출원 US 2014/018909는 심혈관 분야에서의 적용을 위해 의도된 조직을 당뇨병 환자에서 축적되는 반응의 산물, 특히, 지질 성분의 산화로부터 초래된 산물로부터 보존하는 방법을 개시한다. 이러한 이화대사 산물은 AGE로 명명되며, 당뇨병 환자에서 혈관 및 심장 판막과 같은 생체보형적 대체물(bioprothetic substitute)의 분해 메카니즘을 가속시킨다. 상기 방법은 펜타갈포일글루코오스(Pentagalfoylglucose) - PGG와 관련해서만 개시되며, 돼지 심장 판막을 탈세포화시켜서 수득된 콜라겐 매트릭스 및 이전에 탈세포화된 돼지 경동맥을 알칼리로 처리하는 것에 의해 수득된 엘라스틴 매트릭스에 대해 수행된다.
국제특허출원 WO 01/21228은 심장 판막 대체물의 제조를 위해 사용될 수 있는 생물학적 조직 또는 합성 조직의 석회화를 완화시키기 위한 갈로탄산(gallotanic acid)의 용도를 개시한다.
발명의 요약
본 특허 출원의 발명자들은 놀랍게도, 보형물, 특히, 심장 보형물의 생체적합성(biocompatibility)을 증가시키는 방법을 발견했다. 구체적으로, 증가된 생체적합성은 하기 중 하나 이상의 증가를 포함한다: 석회화된 침착물(calcified deposit)의 형성의 방지, 생물학적 매트릭스에서 이종 항원의 불활성화, 생물학적 매트릭스에서 혈전 형성의 방지, 생물학적 매트릭스로의 지질 침윤의 방지, 세포 성분에 의해 매개되는 염증 과정의 발병(onset)의 방지, 생물학적 매트릭스 상의 생물부착(biofouling) 과정의 방지.
발명의 목적
제1 목적에서, 본 발명은 생물학적 매트릭스에서 석회화 침착물의 형성을 방지하는 방법을 개시한다.
바람직한 구체예에서, 상기 방법은 35±2℃의 온도 및 암 조건에서(in the dark) 2시간 미만의 기간 동안 상기 생물학적 매트릭스를 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 개시된 방법은 또한 생물학적 매트릭스에서 이종항원을 불활성화시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 개시된 방법은 생물학적 매트릭스 상에서 혈전 형성을 방지한다.
본 발명의 추가적 양태에 따르면, 개시된 방법은 생물학적 매트릭스로의 지질 침윤을 방지한다.
본 발명의 추가적 양태에 따르면, 개시된 방법은 세포 성분에 의해 매개되는 염증 과정의 발병을 방지한다.
본 발명의 또 다른 추가적 양태에 따르면, 개시된 방법은 생물학적 매트릭스 상에서 미생물 바이오필름의 형성(생물부착)을 방지한다.
바람직한 구체예에서, 개시된 방법은 하기 중 하나 이상을 제공한다: 석회화 침착물의 형성의 방지, 생물학적 매트릭스에서 이종 항원의 불활성화, 생물학적 매트릭스에서 혈전 형성의 방지, 생물학적 매트릭스로의 지질 침윤의 방지, 세포 성분에 의해 매개되는 염증 과정의 개시의 방지, 생물학적 매트릭스 상의 생물부착 과정의 방지.
보다 바람직한 구체예에서, 개시된 방법은 석회화 침착물의 형성의 방지, 생물학적 매트릭스에서 이종 항원의 불활성화, 생물학적 매트릭스에서 혈전 형성의 방지, 생물학적 매트릭스로의 지질 침윤의 방지, 세포 성분에 의해 매개되는 염증 과정의 개시의 방지, 생물학적 매트릭스 상의 생물부착 과정의 방지를 제공한다.
본 발명의 방법으로 수득된 생물학적 매트릭스가 본 출원의 또 다른 목적이다.
의학, 생물의학, 및/또는 수의학 분야에서 심장 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 방법으로 수득된 생물학적 매트릭스가 본 출원의 제2 목적을 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 생물학적 매트릭스의 이용을 포함하는, 인간 또는 동물에서 심장 질환의 치료를 위한 방법이 개시된다.
본 특허 출원의 방법에서 사용되는 페놀 화합물 또는 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액이 본 발명의 또 다른 목적을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는, 본 발명의 용액을 제조하는 방법이 개시된다.
추가적 목적에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 개시한다.
제1 목적에 따라, 본 발명은 생물학적 매트릭스에서 석회화 침착물의 형성을 방지하는 방법을 개시한다.
본 발명의 목적을 위해, 석회화는 생물학적 매트릭스의 표면 상에서 또는 생물학적 매트릭스의 내부에서 일어날 수 있다.
본 설명의 목적으로, 본 발명에 따른 방법은 FACTA™로 지칭된다.
구체적으로, 상기 방법은 상기 생물학적 매트릭스를 페놀 화합물(phenolic compound)의 혼합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 생물학적 매트릭스는 이종매트릭스(xenomatrices)이고, 즉, 그들은 인간 기원(human origin)이 아니다.
구체적으로, 그들은 말, 돼지 또는 소 기원을 가질 수 있다.
바람직한 구체예에서, 생물학적 매트릭스는 혈관, 심장 판막, 힘줄(tendon), 인대, 심장막(pericardium), 안구 근막, 경질막, 고막, 장 점막하층(intestinal submucosa), 연골, 지방 조직, 및 골 조직, 골반, 복부 및 유방 조직으로 의도될 것이다.
보다 바람직한 구체예에서, 생물학적 매트릭스는 심혈관 보형물(심장 판막) 및 심장막 조직 패치(pericardial tissue patch)를 포함하는 군에서 선택된다.
그러한 심장 판막의 예는 Glide™ Technology에 의한 Trifecta™ Valve(Trifecta™ Valve with Glide™ Technology) 및 Epic™ Mitral Valve (Abbott/St. Jude Medical, St. Paul, MN, USA)에 의해 대표된다.
단순한 설명적 목적을 위한 다른 예들은 Sapien 3, Sapien 3 Ultra 및 Sapien XT THV(transcatheter heart valve) (Edwards Lifesciences, Irvine, CA, USA), Inspiris Resilia, Intuity Valve System, Magna Easy, Perimount RSR 및 Perimount Valve (Edwards Lifesciences, Irvine, CA, USA), Avalus™, Contegra Valved Conduit, Freestyle™, Hancock II™, Mosaic™ 및 Mosaic™ Ultra, Melody™ 및 CoreValve TVR(transcatheter valve replacement) 플랫폼 (Medtronic, Minneapolis, MN, USA), Acurate Neo™ 및 Lotu Edge™ Aortic Valve System (Boston Scientific, Marlborough, MA, USA), Accufit® Transapical Mitral Valve (Sinomed, Tianjin, China), Xinli® (KingstronBio, Jiangsu, China), Bioconduit™, Biomitral™, Biopulmonic™ Conduit 및 Injectable Biopulmonic™ (BioIntegral, Mississauga, ON, Canada)일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따라 처리될 수 있는 심장 판막은 TAVI(trans-catheter implantable heart valves)에 의해 대표되고; 상기 판막은 카테터를 통해 이식되어야 하고, 따라서, 카테터 내부에 수용되도록 유연해야 한다.
본 발명의 목적을 위해, 전술된 폐놀 화합물 혼합물 내 페놀 화합물은 단순 페놀(simple phenols), 페놀 알데히드(phenolic aldehyde), 페놀산, 페닐아민, 페놀 화합물(phenol compound), 플라보노이드, 페닐프로파노이드 및 탄닌을 포함하는 군으로부터 선택된, 페놀(phenolic) 또는 폴리페놀(polyphenolic) 화합물(일부 경우에, 동의어로 사용됨)로 의도될 것이다.
구체적으로, 페놀 화합물은 바닐린, 신남산, 페날알라닌, 쿠마린, 크산톤(xanthones), 카테킨, 플라보노이드, 플라본, 칼콘(chalcone), 플라바노놀(flavanonols), 플라바놀(flavanols), 류코안토시아니딘(leucoanthocyanidin), 안토시아니딘, 히드록시신남산(hydroxycinnamic acids), 페닐프로파노이드를 포함하는 군에서 선택된다.
보다 구체적으로, 페놀 화합물은 레스베라트롤, 알로인, 시아나린(cyanarin), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 탄닌산(tannic acid), 카페산(caffeic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid), 히드록시티로솔(hydroxytyrosol), 로즈마린산(rosmarinic acid), 나리게닌(narigenin), 갈산(gallic acid), 헤스페리딘(hesperidin), 퀸산(quinic acid), 엘레오놀산(eleonolic acid), 피노레시놀(pinoresinol), 루테올린(luteolin), 아피게닌(apigenin), 탄게리틴(tangeritin), 이소람네틴(isorhamnetin), 캠페롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin), 에리오딕티올(eriodictyol), 헤스페레틴(hesperetin), 나린게닌(naringenin), 테아플라빈(theaflavin), 테아루비긴스(thearubigins), 다이드제인(daidzein), 게니스테인(genistein), 글리시테인(glycitein), 프테로스틸벤(pterostilbene), 델피니딘(delphinidin), 말비딘(malvidin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페오니딘(peonidin), 치코르산(chicoric acid), 페룰산(ferulic acid), 살리실산(salicylic acid)을 포함하는 군에서 선택된 페닐프로파노이드의 혼합물을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 커큐민(curcumin)이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 전술된 페놀 또는 폴리페놀 화합물의 유도체가 또한 포함된다; 예를 들면, 염 또는 에스테르가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 용액은 전술된 페닐프로파노이드 중 2종 이상의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 용액 내에서, 각 페닐프로파노이드는 약 0.2-5 mg/ml ± 0.5 mg/ml (용액의 총 부피 당 중량(w/v)) 내에 포함된 농도로 존재할 수 있다.
전술된 개시에 따른 일부 용액이 하기에 보고된다:
Figure pct00001
구체적으로, 본 발명의 방법에서, 접촉시키는 단계는 2시간 미만의 기간 동안 수행된다.
바람직하게는, 상기 접촉시키는 단계는 약 1시간의 기간 동안 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 접촉시키는 단계는 약 30분의 기간 동안 지속된다.
보다 바람직한 구체예에서, 제1 접촉 단계는 추가적인 30분 동안 반복된다.
선택적으로, 2개의 접촉 단계 사이에, 세정(rinsing) 단계가 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법은 완전히 암 조건에서, 즉, 빛으로의 노출을 피하면서 수행된다.
상기 접촉 단계의 온도에 따라, 바람직하게는 약 +35℃ ± 2℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 접촉 단계 후에, 상기 매트릭스는 1회 이상의 세척 단계에 적용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 세척 단계는 적합한 완충액으로 수행된다; 예를 들면, 적합한 완충액은 포스페이트 완충액으로 대표될 수 있다.
각각의 세척 단계는 약 15분의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 방법은 원형의(native) 생물학적 매트릭스 및 이전에 다른 목적을 위해, 예를 들면, 단백질, 지질 및 세포 구조를 안정화시키고, 및 숙주의 잠재적 항원성 작용을 저하시키기 위해 처리되었던 생물학적 매트릭스 상에서 수행될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 생물학적 매트릭스는 탈세포화 세포외 매트릭스(decellularized matrix), 부분적으로 분해된(partially digested) 매트릭스, 및 동물 기원의 젤라틴을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 방법에 따라 생물학적 매트릭스를 처리하기 전에, 생물학적 매트릭스를 글루타르알데히드, 포름알데히드 및 퀘르세틴에 의한 처리에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 개시된 방법은 또한 생물학적 매트릭스 중 이종항원을 불활성화시킨다.
용어 "이종항원(xenoantigen)"은 인간 숙주 개체에서 면역계에 의해 인식될 수 있고 항체/면역-매개/염증 반응을 유도할 수 있는 동물 기원의 이종항원으로 의도되고; 본 발명의 설명에서, 용어 "이종항원", "항원(antigen)", "이종성 항원(xenogeneic antigen)", "에피토프(epitope)", 및 "핵심 항원(crucial antigen)"은 동일한 의미를 가질 수 있고, 함께 또는 상호 간에 대체어로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, "이종항원"은 알파-Gal 에피토프를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 개시된 방법은 생물학적 매트릭스 위 또는 그 내부에서 혈전 형성 및 혈병을 방지한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 개시된 방법은 생물학적 매트릭스로의 지질 침윤을 방지한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 개시된 방법은 세포 성분에 의해 매개되는 염증 프로세스의 개시를 방지한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 개시된 방법은 생물학적 매트릭스 상에 미생물 바이오필름의 형성(생물부착(biofouling))을 방지한다.
구체적으로, 본 발명의 방법은 보형물 표면 상으로의 점착 능력을 감소시키는 것에 의해 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 형성되는 바이오필름의 형성을 방지하는 것으로 입증되었다.
본 발명의 방법은 그람- 및 그람+ 박테리아 모두에 효과적이다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 생물학적 매트릭스가 본 발명의 또 다른 목적이다.
구체적으로, 상기 생물학적 매트릭스는 개시된 방법에 의해 수득된 심혈관 생체보형물에 의해 대표되고, 이는 석회화 침착물, 구조화 혈전, 지질단백질(lipoprotein) 침윤의 유의성 있는 감소 및 박테리아 부착 및 결과적으로 수득되는 조직 상재화(colonization)에 대한 유의성 있는 저항력을 갖는다.
제2 목적에 따르면, 본 발명은 의학 또는 수의학 분야에서 심장 질환의 치료에서 사용하기 위한, 전술된 방법에 의해 수득된 생물학적 매트릭스를 개시한다.
본 발명의 추가적인 목적으로서, 본 특허 출원의 발명의 방법에서 사용되는 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액이 개시된다.
구체적으로, 상기 용액은 앞서 개시된 바와 같은 2종 이상의 페놀 화합물을 혼합하는 것에 의해 제조된다.
보다 상세하게, 상기 용액은 적합한 완충액 중에 제조될 수 있다.
예를 들면, 소듐 포스페이트 완충액이 사용될 수 있다.
대안적으로, 상기 페놀 화합물의 혼합물은 NaOH의 용액 중에 제조될 수 있다.
본 발명의 용액은 옥시다아제 활성을 갖는 적합한 효소와 함께 첨가될 수 있다; 예를 들면, 티로시나아제, L-굴로노락톤 옥시다아제(L-gulonolactone oxidase), 락카아제(laccase) 등이 사용될 수 있다.
상기 용액은 바람직하게는 암소에서, 즉, 빛으로의 노출을 피하여 제조된다.
본 발명의 제3 목표에 따라, 전술된 발명을 수행하기 위한 키트가 개시된다.
구체적으로, 상기 키트는:
- 적합한 완충액을 담은 용기,
- 용해될, 페놀 화합물의 혼합물의 적합한 양을 담은 용기,
- 세척용 완충액을 담은 1개 이상의 용기;
- 상기 방법을 수행하기 위한 시간(timing) 및 모드의 설명을 담은 설명서 소책자를 포함하다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 페놀 화합물은 상기 완충액에 용해될 산제 제형으로 존재할 수 있다.
본 발명은 하기 실험 섹션과 관련하여 더 기술될 것이다.
도 1: 페놀 화합물 방출에 대한 분석의 결과.
도 2: 인-비트로 석회화 분석의 결과.
도 3: 맞춤-제작된(custom-fabricated) 실리콘 홀더에 배치된 판막.
도 4: 미처리 (A) 및 FACTA™ 처리 (B) 시판(commerical) BHV의 MPD-QRMS 프로파일; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다(평균한 심장 주기의 횟수, n=10).
도 5: 테스트된 각 유동 조건에서 미처리 (n=2) 및 FACTA™ 처리 (n=3) 판막 그룹의 평균 EOA; 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. 별표(asterisk)는 처리 그룹과 미처리 그룹 간의 유의성 차이를 표시한다.
도 6: 미처리 (A) 및 FACTA™ 처리 (B) 시판 BHV의 PPD - QPEAK 프로파일. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다(평균한 심장 주기의 횟수, n=10).
도 7: 테스트된 각 유동 조건에서 미처리 (n=2) 및 FACTA™ 처리 (n=3) 판막 그룹의 평균 역류(regurgitation) (평균±SD).
도 8: 테스트된 각 유동 조건에서 미처리 (n=2) 및 FACTA™ 처리 (n=3) 판막 그룹의 평균 에너지 손실 (평균±SD).
도 9: 미처리 (n=2) 및 FACTA™ 처리 (n=3) 판막 그룹에 대한 평균 생체역학적 파라미터 (평균±SD). A: 탄성기 기울기(Elastic phase slope); B: 콜라겐기(collagen phase) 기울기; C: 전이 변형률(Transition strain); D: 전이 변형력(Transition stress); E: 파단 변형률(Failure strain); F: 극한 인장 강도(Ultimate tensile strength). 별표는 표시된 특정한 파라미터에 대한 미처리 그룹과 처리 그룹간 유의성 있는 차이를 표시한다.
도 10: 추적(follow-up) 1개월 후 돼지로부터 체외 이식된(explanted) 가장 유의한 시판 BHV 중 일부. FACTA™ 처리 BHV (D, E, 및 F), 미처리 BHV (B 및 C), 미-이식(non-implanted) BHV (A).
도 11: 일반 돼지 모델(common swine model)에서 추적의 1개월 후 미처리 시판 BHV의 거시적 양태. 혈전 (A) 및 섬유화 판누스(fibrotic pannus)의 형성이 보형물의 교두(cusp)(A, C, 및 D) 및 봉합 링(suture ring) (B)에 영향을 미친다는 것이 명확하다.
도 12: 돼지에서 1개월의 추적 후 미처리 시판 BHV의 헤마톡실린 & 에오신 염색. 흑색 화살표(박스 A 및 E)는 판막엽(leaflet)의 심실 표면 위 및 심실 표면에서 밀집하고 균일한 섬유증 층(fibrotic layer)의 존재를 강조한다. 이물(foreign body) 반응이 염증 세포 침투(박스 D 및 H)이 있는 판막엽의 나머지 면에 존재한다(박스 C 및 G). 박스 A 및 E 확대 배율 4X. 박스 B, C, F 및 G 확대 배율 10X. 박스 D 및 H 확대 배율 40X.
도 13: 돼지에서 1개월의 추적 후 FACTA™ 처리 시판 BHV의 헤마톡실린 & 에오신 염색. 이물 반응이 일어나는 경우 (박스 A), 뚜렷한 세포 침투는 없다 (박스 C). 박스 A, D 및 F 확대 배율 4X. 박스 B, E 및 G 확대 배율 10X. 박스 C 확대 배율 40X.확대 배율
도 14: 돼지에서 1개월의 추적 후 FACTA™ 처리 (E, F, G 및 H) 및 미처리 (A, B, C 및 D) 시판 BHV의 지질 확인을 위한 오일 레드 "O"(Oil Red "O") 염색. 적색은 지질 침윤의 존재를 보여준다. 박스 A, C, E 및 G 확대 배율 4X. 박스 B, D, F 및 H 확대 배율 10X.
도 15: 돼지에서 1개월 추적 후 미처리 시판 BHV의 폰 코사(Von Kossa) 염색. 명확한 칼슘 침착, 특히, 판막엽의 외부 인터페이스의 수준에서 명확한 칼슘 침착이 보고되었다. 기질(stroma)의 내부 부분에 영향을 미치는 미세 석회화(microcalcification)의 광범위한 확산이 관찰된다. 박스 A, D 및 G 확대 배율 4X. 박스 B, E 및 H 확대 배율 10X.
도 16: 돼지에서 1개월 추적 후 FACTA™ 처리 시판 BHV의 폰 코사 염색. 칼슘 침착물은 관찰되지 않았다. 미세-석회화의 완전한 부재. 박스 A, C 및 E 확대 배율 4X. 박스 B, D 및 F 확대 배율 10X;
도 17: 돼지에서 1개월 추적 후 미처리 시판 BHV의 말로리 삼색(Mallory Trichromic) 염색. 콜라겐 매트릭스(collagenic matrix)는 청색으로, 구조화된 혈전(structured thrombi)은 적색/황색으로 인식가능하다. 박스 A, C, E 및 G 확대 배율 4X. 박스 B, D, F 및 H 확대 배율 10X.
도 18: 돼지에서 1개월 추적 후 미처리 시판 BHV의 말로리 삼색 염색. 판막엽의 심실 표면에서 혈전에 축적되는 섬유화 판누스의 존재가 적색/황색으로 명확하게 존재한다. 박스 A, 확대 배율 4X, 복수의 패널 확대 배율 10X.
도 19: 돼지에서 1개월 추적 후 FACTA™ 처리 시판 BHV의 말로리 삼색 염색. 판누스 또는 구조화 혈전과 같은 비정상적 섬유 형성의 유의한 존재는 없다. 일부 시료에서, 탄성 성분(elastic component)의 보존이 명확하게 관찰된다(박스 E 및 F, G 및 H). 박스 A, C, E 및 G 확대 배율 4X. 박스 B, D, F 및 H 확대 배율 10X.
도 20: (돼지에 이식되지 않은) 기준 시판 BHV의 염색. H&E 박스 A 및 B; 오일 레드 "O", 박스 C 및 D; 말로리 삼색 염색, 박스 E 및 F; 폰 코사, 박스 G 및 H. 박스 A, C, E 및 G 확대 배율 4X. 박스 B, D, F 및 H 확대 배율 10X.
도 21: 돼지에서 1개월 추적 후 FACTA™ 처리 시판 BHV의 다중 염색. H&E 박스 A 및 B; 말로리 삼색 염색, 박스 C 및 D; 오일 레드 "O", 박스 E; 폰 코사, 박스, F. 박스 A, C, E 및 F 확대 배율 4X. 박스 B 및 D, 확대 배율 40X.
도 22: 미처리 판막엽 대비 FACTA™ 처리 시판 BHV 판막엽의 스태필로코커스 아우레우스(S. aureuss) 부착(adhesiveness)의 비율을 보여준다(시료의 각 타입에 대해 n=5).
도 23: 야생형(WT) 마우스에서 1, 2, 및 4개월 추적 후 시판 생체보형물(bioprosthetic) 심장 판막으로부터의 FACTA™ 처리 (F) 및 미처리 (C) 판막엽에서 (ICP 분석에 의한) Ca2+ 정량화 비교의 결과.
도 24: WT 마우스에서 4개월 추적 후 FACTA™ 처리 (F) 및 미처리 (C) 시료 분석의 폰 코사 조직학적 염색 후 Ca2+ 정량화의 결과.
도 25: 알파-Gal KO 마우스에서 1개월 및 2개월 추적 후 시판 생체보형물 심장 판막 판막엽으로부터의 FACTA™ 처리 (F) 및 미처리 (C) 판막엽에서 (ICP 분석에 의한) Ca2+ 정량화 비교의 결과.
실험 섹션
하기 실험 섹션에서, 용어 "알파-Gal 항원에 대한 넉아웃 동물(knockout animal for the alpha-Gal antigen)"은 알파-갈락토실트랜스퍼라아제 효소를 코딩하는 유전자가 침묵화된 것인 동물을 의미한다. 그러한 효소는 알파-Gal 에피토프의 막 당단백질 및 지질단백질(lipoprotein)을 공격하는 것을 담당한다. 그러한 효소의 부재는 해당하는 에피토프가 완전히 결실되고, 이러한 점에서 인체의 조직에 전적으로 유사한 조직의 생성을 유발한다. 본 발명에서, 알파-Gal 항원에 대한 넉아웃 동물 혈관 조직을 절대적 음성 대조군으로 사용했다.
이종 항원 불활성화
시판 Trifecta GT™ 생체보형 대동맥 판막을 포장으로부터 꺼내고 각각 15분 동안 포스페이트 완충액으로 2회 세척 단계에 적용했다. 전술된 페놀 화합물의 혼합물(phenolic mixture)에 기반한 상이한 용액을 준비하고 0.2 ㎛ 멸균 막을 통해 여과시켰다. Trifecta GT™ 판막을 암소에서 중간 강도이나(moderate) 지속적인 교반하에 실온에서, 각각 25 ± 5분의 2 단계 동안 각각의 단일 용액과 인큐베이션시켰다.
인큐베이션의 완료 시에, 처리된 생체보형 심장 판막을 포스페이트 완충액으로 각각 15분씩 2회 세척했다.
일 세트의 원래의 Trifecta GT™ 판막을 대조군으로 무처리 기성품 상태로 채택했다.
처리된 시료의 표면에서 여전히 활성인 에피토프의 존재의 평가는 이탈리아 특허 제0001409783호 및 EP 2.626.701에서 발명자에 의해 예시되고 기재된 방법의 변형에 기반한다.
요약하면, 처리 및 미처리 Trifecta™ 판막으로부터의 조직 시료를 테스트 튜브에 넣고 1000 ㎕ 내지 1500 ㎕의 최종 부피까지 포스페이트 완충액을 첨가한다.
그 후, 알파-Gal 에피토프에 대한 단일클론 마우스 항체를 (본 실시예에서, 이는 M86으로 지칭되는 IgM 클론임)[1:50] v/v의 바람직한(preferable) 농도로 첨가하고 전체를 지속적이나, 중간 강도의 교반 하에 37±2℃에서 120±10 분 동안 인큐베이션한다.
완료 시에, 시료를 주변 온도에서 30±5 분 동안 14,750 x g에서의 원심분리에 적용시켰다.
M86 항체와의 인큐베이션 동안, 96-웰 플레이트에서 웰의 바닥에 포스페이트 완충액 중 5 ㎍/ml의 알파-Gal/혈청 알부민을 웰당 100 ㎕로 채웠다. 모든 것을 37℃에서 안정화시키는 것이 유리하나, 이렇게 준비된 플레이를 30℃ 내지 40℃의 온도에서 60±10분 동안 인큐베이션시켰다.
그 후, 3회 세척을 주변 온도에서 웰당 300 ㎕의 포스페이트 완충액으로 수행했다. 제1 세척은 5분 동안 수행되도록 하고, 2회의 후속 세척은 3분 동안 수행했다.
웰당 300 ㎕의 혈청 알부민으로 블록킹(blocking)을 수행하고, 그 후 암 조건으로 주변 온도에서 60±10분 동안 인큐베이션시켰다. 뒤이어, 전술된 바와 같은 3회의 세척을 수행했다.
각 웰에 대해, 각각의 처리된 시료로부터 원심분리에 의해 채취된 100 ㎕의 상층액을 첨가했다.
시료를 플레이트에 로딩했고, 각 타입의 시료가 전체 열의 웰을 차지했다. 모든 것을 37℃에서 안정화시키는 것이 바람직하나, 이렇게 준비된 플레이를 30℃ 내지 40℃의 온도에서 60±10분 동안 인큐베이션시켰다.
그 후, 전술된 바와 같이 3회의 세척을 수행했고, 웰당 100 ㎕의 퍼옥시다아제 효소에 접합된 제2 항체(토끼 다중클론 항-마우스 항체)의 용액을 첨가했다(그러한 항체의 이상적 용액은 [1:1000], [1:500] 및 [1:100]으로 확인되었고, 바람직하게 중간 [1:500]을 채택했다).
상기 플레이트를 30℃ 내지 40℃의 온도에서 60±10분 동안 다시 인큐베이션시키나, 모든 것을 37℃에서 안정화시키는 것이 바람직하다.
그 후, 전술된 바와 같이 3회 세척을 수행했다. 각 웰에 퍼옥시다아제 효소에 대한 현상 용액(development solution) 100 ㎕를 첨가하고, 뒤이어 상기 플레이트를 암 조건에서 5±1분 동안 인큐베이션시켰다.
이어서, H2SO4 2M로 구성된 종결 용액(stop solution) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고 플레이트 판독기에서 450 nm에서 플레이트를 판독했다.
다양한 채택된 폴리페놀 혼합물의 전체 분석은 미처리 시료 대비 처리된 Trifecta™ 판막에서 80±2% 내지 95±0.8%의 알파-Gal 항원의 불활성화를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
처리 및 미-처리된 동일한 종류의 판막을 하기 인-비트로 및 인-비보 분석에 적용했다.
구체적으로, 처리는 본 발명에 따른 용액으로 수행했다.
시간에 따른 FACTA™ 처리 안정성의 평가
FACTA™ 처리는 본 발명에 따른 특정한 폴리페놀을 포함하는 혼합물의 작용에 기반한다. 그러나, 일부 용량에서 폴리페놀은 간 및 신장에 축적되어 유독할 수 있다 (LD50 5 g/Kg). FACTA™ 처리의 안정성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 시간의 경과에 따른 페놀 잔기의 방출을 평가했다. FACTA™ 처리 후에, 시판 BHV 판막엽을 제조사에 의해 공급된 보관 용액 중에 두었다. 7일과 14일, 및 1개월, 3개월 및 9개월의 상이한 시점에, 조직으로부터 방출된 페놀 화합물의 양을 결정했다(각 시점에 대해 n=9개의 시료). 대조군으로서, 일 세트의 미처리 시판 BHV 판막엽을 동일산 시점에 분석했다. 용액에 존재하는 총 폴리페놀 함량은 알칼리 pH 조건 하에 상기 보관 용액에 최종적으로 존재하는 페놀 화합물과 디아조늄 염 간의 반응에 기반한 프로토콜을 이용하여 평가했다. 반응 산물은 480 nm의 파장에서 흡광도 분석에 의해 검출되고 정량될 수 있는 안정적인 발색단(chromophore)이다. 시료에 존재하는 페놀의 농도는 카테킨을 표준으로 이용한 외부 보정(external calibration) 방법에 의해 정량하고 따라서, 카테킨 등가(catechin equivalent)의 밀리몰 농도(mM)로 표현된다.
결과가 도 1에 도시된다.
모두, 처리 조직으로부터 9개월 동안 160 ppm의 페놀 화합물이 방출되었다. 방출은 거의 처리 후 최초 14일에 일어난다. 독성 잠재력(toxic potential)과 관련하여, 처리된 조직으로부터의 폴리페놀 누출(leakage)의 총량은 건강 위험을 초래하지 않는 것으로 확증할 수 있다; 실제로, 이는 식이에 의한 섭취 후 인간 혈장에 존재하는 폴리페놀의 농도보다 더 낮다.
인 비트로 석회화 분석
미처리 (B) 및 FACTA™ 처리 (BT) 시판 BHV로부터의 판막엽, 원형 (WT) 및 FACTA™ 처리 원형 돼지 대동맥 판막엽 (WT T) 및 알파-Gal 넉아웃 돼지 대동맥 판막엽 (KO)을 2% 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 합쳐진(pooled) 정상 인간 혈청(Innovative Research, Peary Court Novi, MI)에서 37℃에서 14일 동안 인큐베이션시켰다. 대조군으로서, 일 세트의 시료를 동일한 조건에서 PBS에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 시료를 PBS로 10분 동안 2회 세척하고, 110℃에서 12시간 동안 HNO3에서 산 가수분해(acid hydrolysis)에 적용시켰다. EPA6010D 방법의 지시서에 따라 유도 결합 플라즈마(inductively coupled plasma)에 의해 가수분해된 시료에서 칼슘 평가를 수행하고, ㎍ Ca2+/mg 건조 탈지 중량(dry defatted weight)(d.d.w.)으로 표현된다.
결과가 도 2에 보고된다.
FACTA™ 처리 BHV (BT)는 각각 미처리 BHV (B) 및 알파-Gal 넉아웃 조직 (KO) 대비 90% (B vs BT p<0.05) 및 44.4% (BT vs KO, p<0.05)의 석회화 성향(calcific propensity) 감소를 보인다. 넉아웃 조직은 가장 적게 석회화되는(least calcifying) 생물학적 지지체로 간주되고, 이종이식물-유도(xenotransplant-induced) 석회화 연구에서 절대적 음성 대조군으로 이용된다. FACTA™ 처리 BHV는 KO 표준보다 거의 50% 더 적게 석회화되는 것으로 확인되었다. FACTA™ 방법이 원형 조직(WT T, 글루타르알데히드로 고정되지 않음)에 적용되는 경우, 기준 조직 KO 대비 항-석회화 효과는 85%로 증가되었다 (WT T vs KO p<0.05).
수력학적 평가(Hydrodynamic Assessment)
판막의 수력학적 성능을 Vivitro® Pulse Duplicator System (Vivitro Labs lnc., Victoria, BC, Canada)에서 모사된 박동성 유동(simulated pulsatile flow) 하에 평가했다. 심장의 좌측을 모델링하기 위해 유동 시뮬레이터(flow simulator)를 이용했다. 테스트 판막을 맞춤-제작된 실리콘 홀더(custom-fabricated silicon holder)에 끼우고(도 3) 박동성 유동 시스템의 대동맥 위치(aortic position)에 배치했다. 25 mm Bjork-Shiley 경사 디스크형 판막(tilting disc valve)을 기준 판막으로 승모판(mitral) 위치에 사용했다. 실온에서 0.9% (w/v) NaCl에서 테스트를 수행했다. ISO 5840-3에 따라, 5개의 박동성 유동 조건 하에 판막을 테스트했다(표 1). 유동 조건은 2.5-9 l/분의 심박출량에 해당했다. 테스트 동안, 확장기/수축기 압력은 80/120 mm Hg로 설정했고, 수축기 지속기간이 심장 주기(cardiac cycle)의 35%를 차지했다. 각각의 유동 조건에서, 판막을 5분 동안 예비조건화시키고(preconditioned), 각 판막 그룹 (FACTA™ 처리 BHV, n=3; 미처리 BHV, n=2)에 대해 각 유동 조건에서 10회의 사이클 동안 압력 및 유동 신호를 기록했다.
유동 조건 심박수 (cycle rate) (bpm) 1회 박출량 (ml)
60/60 60 60
72/70 72 70
80/70 80 70
100/80 100 80
120/80 120 80
표 1 - 수력학적 평가에서 사용된 박동성 유동 조건.
판막의 수력학적 성능을 판막을 통한 평균 압력 강하(MPD) 및 최고 압력 강하(peak pressure drop, PPD), 판막을 통한 정상 혈류 실효값(root mean square forward flow through the valve) (QRMS), 판막을 통한 최고 정상 혈류(peak forward flow through the valve) (QPEAK), 유효 판구 면적(valve effective orifice area) (EOA), 판막 폐쇄 동안 및 판막이 완전히 폐쇄된 동안 판막을 통한 역류(reverse flow through the valve during valve closure and while the valve was fully closed) 및 판막 에너지 손실(valve energy losses)의 측면에서 평가했다. ISO 5840-3에 정의된 바와 같이, 정상 혈류기(forward flow phase)의 양의 압력 구간(positive pressure interval) 동안 판막을 통한 압력차 및 체적 유량(volumetric flow rate) 만을 이용하여 EOA를 측정했다. 각 테스트에 대한 결과를 기록된 주기의 회수(n=10)로 나누어 평균했다. 데이터를 Windows용 Microsoft Excel® 및 Prism® 7 (v7.03, GraphPad Software lnc., California)에서 분석하고 평균 ± 표준편차 (SD)로 표현했다. 양측 독립 t-검정(Two-sided unpaired I-test)을 이용하여 처리된 그룹과 미처리 그룹간 유의성있는 차이를 0.05 신뢰 수준에서 평가했다.
각 유동 조건에서 10회의 주기에 대해 평균된, 미처리 및 처리 판막의 MPD - QRMS 프로파일이 도 4의 A 및 B에 각각 도시된다. 두 판막 그룹은 모두 탁월한 재현성(repeatability) 및 그들 간에 유사한 QRMS ­ PD 프로파일을 보였다.
각 유동 조건에 대해 계산된 처리 및 미처리 판막의 평균 EOA가 도 5에 도시된다. 처리 그룹이 미처리 그룹에 비해 유의성있게 더 작은 (p<0.05) EOA를 보이는 유동 조건 100/80 (bpm/sv)를 제외하고는, 미처리 그룹과 처리 그룹 간에 EOA에서 통계적으로 유의성 있는 차이가 없었다.
각 유동 조건에서 10회의 주기에 대해 평균된, 미처리 및 처리 판막의 PPD-QPEAK 프로파일이 각각 도 6의 A 및 B에 도시된다. 두 그룹은 모두 유사한 PPD-QPEAK 프로파일을 보였다.
각 유동 조건에서 미처리 및 처리 그룹의 평균 동적 및 정적 역류량(regurgitation volume)이 도 7에 도시된다. 두 그룹에 대한 동적 역류량(폐쇄 진행(closing) 체적) 및 정적 역류량(폐쇄된(closed) 체적)이 판막을 통한 역류를 나타내는 음성이다. 일반적으로, 역류량은 더 낮은 유동 조건에서 보다 유의하고, 유속의 증가에 따라 증가되었다. 미처리 및 처리 그룹 간 역류량에서 통계적으로 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다.
처리 및 미처리 그룹에 대한 평균 에너지 손실이 도 8에 도시된다. 증가하는 유동 조건에서, 정상 혈류 및 폐쇄기(closed phase)에서 에너지 손실에 대해 상반되는 패턴이 관찰되었다. 정상 혈류기 동안 최저 에너지 손실이 저-유동 조건(60/60)에 대해 관찰되고, 유속 증가에 따라 증가했다. 대조적으로, 폐쇄기 동안 최고 에너지 손실이 저-유동 조건에서 관찰되고, 유속 증가에 따라 감소했다. 테스트된 모든 유동 조건에서, 미처리 그룹과 처리 그룹 간에 에너지 손실에 있어서 유의성 있는 차이가 없었다.
생체역학적 평가(Biomechanical Assessment)
파단(failure)으로의 저-변형률 단축 장력 로딩(low-strain rate uniaxial tensile loading)을 100N 로드 셀(load cell)을 갖춘 lnstron® 장력 테스터(5967 Dual Column Series)에서 수행했다. 각 판막으로부터 하나의 판막엽을 절제하고 테스트 크기 6x3 mm (길이 x 폭)의 시료(specimen)를 단리하기 위해 사용했다. 시료의 두께를 Mitutoyo® 두께 측정기를 이용하여 길이를 따라 3개의 지점에서 측정하고 평균했다. 테스트 동안, 각 시료를 20 mm/min의 변형률에서 0.01N에 예비로딩시키고, 동일한 변형률에서 파단에 로딩했다. 각 시료의 기록된 로드-신장 반응(load-extension response)을 엔지니어링 응력-엔지니어링 변형력(engineering stress-engineering strain)으로 전환시켰다. 응력-변형력(stress-strain) 곡선을 이용하여 탄성기 및 콜라겐기 기울기, 전이(transition) 응력 및 변형력, 파단 변형력(failure strain) 및 최종 인장 강도(ultimate tensile strength)를 계산했다. 데이터를 Excel에서 분석하고 평균 ± SD로 표현했다. 양측 독립 t-검정을 이용하여 0.05 신뢰 수준에서 처리 및 미처리 그룹간 유의성 있는 차이를 평가했다.
FACTA™ 처리 및 미처리 그룹의 평균 생체역학적 파라미터가 도 9에 도시된다. 처리 그룹과 미처리 그룹 간 유의성 있는 차이가 파단 변형력의 경우에 확인되었다(p<0.05). FACTA™ 처리 그룹과 미처리 그룹 간에 나머지 파라미터에서는 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다. 두 그룹간에 탄성기 기울기(도 9의 A) 및 전이 변형력(도 9의 C)에서 통계적 유의성이 관찰되지 않았으나, 이 파라미터들은 미처리 그룹 대비 처리 그룹에서 증가되거나(탄성기 기울기) 또는 감소되는(전이 변형력) 것으로 확인되었다. 저 변형력 하에서, 더 높은 탄성기 및 더 낮은 전이 변형력이 각각 더 단단하고 덜 신장되는 물질을 나타낼 것이다.
돼지 동물 모델에서 인 비보 조사
FACTA™ 처리 (n=5) 및 미처리 (n=3) 시판 Trifecta GT BHV (St.Jude Medical, USA)를 돼지 동물 모델에 폐 위치에 이식했다. 1개월의 추적(follow-up) 후에, 조사를 위해 BHV를 제거했다. 외부로 분리된(explanted) BHV를 4℃에서 멸균 PBS로 2개의 15-분 단계로 세척하고, 육안 평가(macroscopic evaluation)를 위해 즉시 사진촬영했다 (도 10). 뒤이어, 각 판막으로부터 판막엽을 개별적으로 절제했다. 조직학적 및 면역-조직화학적 검사를 위한 교두(cusp)를 즉시 OCT (Optimal Cutting Temperature) 화합물에 포함시키고, 남은 판막엽을 ELISA 테스트에 의한 알파-Gal 정량화에 적용했다. 비-이식 Trifecta BHV를 참조 대조군으로 이용했다.
거시적 육안 검사(Macroscopic visual examination)
도 10에서 알 수 있는 바와 같이, As can be seen from Figure 10, FACTA™ 처리 시판 BHV 대비, 미처리 시판 BHV는 심실 표면 상에서 결정적인 섬유성 침착물(critical fibrous deposit) 및 혈전의 존재를 보인다. 교두의 대동맥 표면 및 봉합 링 주위에서 균일하고 짙은 판누스의 형성과 함께, 미처리 BHV의 이러한 특유한 특징이 도 11에서 보다 잘 검출될 수 있다.
조직학적 분석
조직을 OTC 화합물(Tissue Tek; Sakura Finetek, Tokyo, Japan)에 포매시키고(embedded), 액체 질소로 동결-냉각시키고, 6-mm 동결-절편(cryo-section)으로 절단했다. Bio-Optica (Milan, Italy)의 시판 키트를 이용하여 제조사에 의해 제공된 설명서에 따라 조직학적 분석을 수행했다. 사용된 조직학-키트가 표 2에 열거된다.
조직학 키트 검출되는 성분 - 의미
Hematoxylin & Eosin 결합 조직의 일반적 양태의 평가/ 세포 성분의 검출
Von Kossa 석회화 침착물의 존재의 평가
Picro Mallory Trichromic 결합 조직, 특히 콜라겐 및 엘라스틴 성분으로 지칭되는 결합 조직의 일반적 양태의 평가. 피브린 침착 및 구조화 혈전의 존재의 평가.
Oil Red O 지질 침윤물의 존재의 평가
표 2 - 사용된 조직학 키트 및 그들의 실험적 의의.
일반적으로, 미처리 판막으로부터의 판막엽은 도 12(박스 A 및 E)에서 흑색 화살표에 의해 표시된 바와 같이 심실 표면에 균질한 섬유성 판누스의 존재를 보고한다. 미처리 (도 12) 및 FACTA™ 처리 시판 BHV (도 13) 모두의 외식된 교두(explanted cusp)에서 외물 반응이 명확하게 관찰가능하다. 미처리 시판 판막에서, 세포 성분이 매트릭스에 침투할 수 있다는 것에 주목해야 한다(도 12, 박스 D 및 H).
FACTA™ 처리는 세포외 매트릭스(extracellular matrix)의 후속 분해를 담당하는 염증성 세포 성분의 내부 기질(inner stroma)로의 침투를 방해하는 장벽 효과를 발휘할 수 있는 것으로 보인다(도 13, 박스 C).
도 14(박스 A, B, C 및 D)에 보고된 바와 같이, 미처리 판막에서, 세포층에 인접하고 섬유성 판누스에 끼인(subtended) 영역에서, 풍부한 지질 침윤물의 존재를 관찰하는 것이 가능하고, 이는 아마도 LDL을 처리할 수 없는 단핵구의 작용 때문이다. 단핵구는 지질 액적(lipid drop)을 통합시킬 수 있으나, 그들을 분해할 수 없고, 포말 세포(foam cell)가 되어 뒤이어 칼슘 침착을 위한 탈핵(enucleation) 부위로 작용한다. FACTA™ 처리는 이러한 위태로운(critical) 상태로부터 조직의 보존을 보장한다 (도 14, 박스 E, F, G 및 H, 지질 침윤은 존재하지 않음).
지질 침윤물의 대량 존재로부터 예측될 수 있는 바와 같이, 돼지에서 1개월의 추적 후 미처리 시판 BHV는 현저하게 석회화되고, 칼슘 축적이 특히 판막엽의 외부 인터페이스의 수준에서 명백하다 (도 15). 그러나, 칼슘의 큰 침착물이 명백하지 않은 경우, 기질의 내부에 영향을 미치는 미세-석회화(micro-calcification)의 광범위한 확산이 보고된다(도 15, 박스 D, E, G, 및 H).
FACTA™ 처리 시판 BHV는 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 칼슘 침착으로부터 최적으로 보존된다.
섬유성 판누스의 발달 외에, 도 17에 도시된 바와 같이, 미처리 시판 판막은 판막엽의 심실 표면에 구조화된 혈전의 발달에 대한 매우 강한 성향을 보였다.
구체적으로, 도 18에 구조화 혈전 형성으로 이어지는 섬유성 판누스의 존재를 보여주는 패널이 보고된다.
말로리 삼색 염색(Mallory Trichromic staining)에서, FACTA™ 처리 시판 BHV는 판누스 또는 구조화 혈전과 같은 비정상적 섬유 형성의 존재를 보고하지 않는다 (도 19). 일부 외식된 시료에서, 콜라겐 매트릭스의 내부에 탄성 섬유에 해당하는, 핑크/퍼플 층(streaks)의 존재를 주목하는 것이 중요하다(도 19, 박스 E 및 F, G, 및 H). 흥미롭게도, 그러한 탄성 섬유는 미처리 시판 BHV의 외식편에서는 볼 수 없다.
동물 모델에 이식되지 않은, 시판 BHV는 참조 대조군으로서 조직학적으로 처리했다. 조사로부터, 이 조직이 어떠한 이물 반응도 보이지 않는 것으로 나타나고 (도 20, 박스 A 및 B), 결론적으로, 섬유성 판누스 또는 혈전의 발달에 의해 영향을 받지 않는다 (도 20, 박스 E 및 F). 또한, 지질 침윤이나 석회화 침착물도 없다 (도 20, 각각 박스 C 및 D, 및 G 및 H). 탄성 섬유는 말로리 염색에 의해 잘 나타나고 (도 20, 박스 E 및 F), FACTA™ 처리 시판 BHV에 대해 확인된 것과 유사하다 (도 19, 박스 E 및 F, G 및 H).
도 21은 FACTA™ 처리 시판 BHV의 상이한 조직학적 염색의 패널을 보여준다. 이 패널은 FACTA™ 처리가 생체보형용 조직에 제공하는 모든 개선을 요약한다. 이 처리에 의해 발휘된 장벽 효과가 분명하게 명확하고; 실제로, 숙주 세포 집단은 매트릭스 내로 침투할 수 없다(박스 B 및 D). 이러한 장벽 효과는 박스 E에 도시된 바와 같이 지질 침윤의 부재에 의해 더 확인된다. 마지막으로, 조직은 석회성 침착이 없다 (박스 F).
박테리아 부착에 대한 저항력
FACTA™ 처리 및 미처리 시판 판막에서 항-부착성 박테리아 활성을 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 6538 (그람-양성)의 박테리아 종을 이용하여 테스트하였다. 상기 박테리아를 37℃에서 TSB(Tryptic Soy Broth)에서 밤새 배양시켰다. 총 박테리아 로드(total bacterial load)를 TSB에 의한 10-배 연속 희석(10-factor serial dilution)(10-1 내지 10-7)에 의해 평가하고, 적절한 선택 배지(MSA-Mannitol Selective Agar)를 포함하는 페트리 디쉬에 접종하고, 밤새 인큐베이터에서 유지시켰다. 인큐베이션의 종료 시에, 미생물의 유효 농도를 결정하기 위해 UFC(units forming colony)를 계수했다. 또한, 후자와 배양액(broth)의 유효 미생물 로드(effective microbial load)의 선형성(linearity)을 확인하기 위해, 각각의 연속 희석물(tiled dilution)로부터 600 nm에서의 광학 밀도의 값(OD600)을 결정하였다. 박테리아 부착을 위한 동일한 유용한 표면을 수득하기 위해, 시판 FACTA™ 처리 및 미처리 BHV 판막엽을 생검용 펀치로 절단하였다(직경 3 mm). 그에 의해 수득된 조직 펀치물을 PBS로 세척하고, 중간 강도이나 지속적인 교반 하에, PBS + 겐타마이신 (300 ㎍/mL) 중에서 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다.
밤샘 인큐베이션 후에, 시판 BHV 조직 펀치물을 잔류 항생제를 제거하기 위해 PBS로 철저하게 세척했다. 이어서, FACTA™ 처리 및 미처리 시료를 실온에서 중간 강도이나 지속적인 교반 하에 스태필로코커스 아우레우스 박테리아 현탁액(박테리아 로드 1 X 107 CFU/mL)에 90분 동안 노출시켰다. 인큐베이션의 종료 시에, 조직 시료를 느슨하게 결합된 박테리아의 탈착을 촉진하기 위해 3회의 중간 강도(moderate) 볼텍싱 혼합에 적용시켰다.
이어서, 상이한 조직 펀치물을 Ultraturrax에 의해 균질화시키고, 수득된 균질물(homogenate)의 연속 희석을 수행하고, 적절한 선택성 증식 배지를 포함하는 페트리 디쉬에 플레이팅하였다. 최종적으로, 37℃에서 24시간의 인큐베이션 후에, 각 타입의 시료에 대해 콜로니 형성 유닛(colony-forming unit)을 계수하였다. 하기 식을 이용하여 박테리아 항-부착 활성을 계산하였다:
Figure pct00002
식 중에서, CT는 FACTA™ 기술로 처리된 시판 BHV로부터 수득된 조직 시료의 박테리아 양(bacterial charge)이고, CNT는 시판 BHV (미처리)로부터의 조직 펀치물에서 달성된 박테리아 양이다.
도 22에 도시된 바와 같이, FACTA™ 처리는 조직 표면에서 스태필로코커스 아우레우스의 부착능(adhesive capacity)을 유의성있게 제한한다(96±4%의 감소).
야생형 마우스 동물 모델에서 석회화 완화 특성
FACTA™ 기술의 석회화 완화 특성을 평가하기 위해, Trifecta GT™ 모델(Abbott/St. Jude)로부터의 처리 (F) 및 미처리 (C) 심막 BHV(bioprosthetic heart valve)를 C57Bl/6 야생형 마우스의 등에 피하에 이식했다. 총 30마리의 마우스를 등록시켰고, 각각의 동물은 단일 표본(specimen)을 받았다. 추적의 1개월, 2개월 및 4개월 후에 조직 시료를 체외 이식했다. 대조군 시료로서, UN(unimplanted)으로 표시된, 기성품인 원래의 Trifecta GT™ 판막 판막엽에서 칼슘 정량화를 수행했다. 칼슘 함량은 Inductive Coupled Plasma (ICP - 0.048 ㎍/조직 mg의 칼슘 정량화 역치(calcium quantification threshold)를 갖는 특정한 타입의 질량 분광분석법)에 의해 평가하고 d.d.w.(dry defatted weight)의 mg당 ㎍으로 표현했다.
ICP 분석에 의해 수행된 칼슘 정량화를 더 확인하기 위해, 4개월의 추적 후에 FACTA™ 처리 (F) 및 미처리 (C) 시료의 조직학적 제작(histological preparatoin)을 수행했다. 조직학적 제작물을 생물학적 조직 중 칼슘 침착을 표시하는 특정한 기법인 폰 코사(Von Kossa) 염색에 의해 분석했다.
ICP 분석에 의한 칼슘 정량화의 결과가 도 23에 도시된다.
미처리 원래(original) 시료 (C)는 이식의 최초 1개월 후 상당한 석회화 경향을 보였다. 경향은 추척 동안 유의성있게 지속되어, 이식물의 4개월차 종료시 정량화에서 7.17 ㎍/mg d.d.w.의 칼슘 침착을 초래했다 (표 3). 반대로, FACTA™ 처리 시료 (F)는 4개월의 추적 후에도 미량의 칼슘을 보고한다. 주목할 것은, F 시료 중 칼슘 함량은 UN에서 검출된 총 칼슘을 유의성있게 초과하지 않아서, 시간의 경과에 따라 칼슘 흡수가 없었다는 것을 확인한다 (표 3).
시료 타입 1 개월 2 개월 4 개월
FACTA™ 처리 0.0246 ± 0.02 0.1378 ± 0.04 0.0425 ± 0.01
미처리 0.8623 ± 1.501 6.166 ± 0.01 7.1787 ± 0.23
미이식(Unimplanted) 0.1192 ± 0.05
표 3 - 상이한 추적 기간 후에 FACTA™ 처리 (F) 및 미처리 (C) 시료에서 ㎍/mg d.d.w.로 표현된 칼슘 함량의 평균.
폰 코사 조직학적 염색의 결과가 도 24에 도시된다.
칼슘 침착물은 (존재하는 경우, 화살표에 의해 표시된) 흑색 스팟으로 알아볼 수 있다. ICP 분석에 따르면, FACTA™ 처리 시료 (F)는 마우스 피하(sub-cutis)에서 4개월의 추적 후에 칼슘 침착의 유의성 있는 존재를 보이지 않는다. 반면에, 원래의 미처리 대조군 시료 (C)는 상이한 칼슘 응집물의 존재를 보고하고, 일부는 심지어 상당한 크기이다 (C4 박스).
알파-Gal 넉아웃 마우스 동물 모델에서 석회화 완화 특성
테스트의 목적은 알파-Gal 넉아웃 (KO) 마우스 동물 모델에 이식되었던, 시판 Trifecta GT™ BHV 및 그의 FACTA™ 처리 대응물로부터 절제된 판막엽에서 칼슘 흡수(calcium uptake)를 평가하는 것이었다. KO 마우스는 알파-Gal 이종항원의 발현을 침묵시키기 위해 유전적으로 변형된, 특수하게 개발된 BCI-소유 마우스 모델이다. 알파-Gal KO 마우스는 알파-Gal 항원이 특이적 항-Gal 항체의 생산을 촉진하는 것인 인간에 유사한 면역 반응 메카니즘을 갖는 것을 특징으로 한다. 판막엽을 C57BI/6 알파-Gal KO 마우스의 등에 피하로 이식했다.
칼슘 함량은 Inductive Coupled Plasma (ICP - 특정한 타입의 질량 분광분석법)에 의해 평가하고 d.d.w.(dry defatted weight)의 mg당 ㎍으로 표현했다. 시판 Trifecta GT 판막 (Abbott/St.Jude)으로부터 절제된 FACTA™ 처리 (F) 및 원래의 판막엽 (C)을 야생형 (WT) 및 알파-Gal에 대한 넉-아웃 (KO) 마우스의 등에 피하로 이식했다. 각 동물은 단일 표본을 이식받았다.
대조군 시료로서, UN (unimplanted)으로 표기된, 기성품인 원래의 TRIFECTA GT™ 판막 판막엽에서 칼슘 정량화를 또한 수행하였다.
결과가 도 25에 도시된다.
추적 1개월 및 2개월에 F 시료에서 결정된 칼슘의 양은 ICP 정량화 역치(0.048 ㎍/mg)보다 더 낮아서 미량이었다. F 시료에서 칼슘 함량은 UN에서 검출된 총 칼슘을 초과하지 않아서, 1개월 및 2개월 추적에서 칼슘 흡수가 없었다는 것을 확인했다. 반대로, KO에 이식된 C 표본은 유의하고 균질한 칼슘의 존재를 보고하여, 석회화-촉진(pro-calcific) 효과를 보인다. 결과는 사람에서 일어나는 것처럼 KO 마우스에서 칼슘 침착을 촉진하는데 있어서 알파-Gal의 명확한 역할을 입증한다.
FACTA™ 처리는 알파-Gal KO 모델과 같은 위태로운 생리학적 시스템(critical physiological system)에서도 석회화를 상쇄시키는데 효과적인 것으로 입증된다.
전술된 개시로부터, 본 발명에 의해 제공되는 장점들이 당업자에게 즉시 명확할 것이다.
예를 들면, 본 발명의 방법은 칼슘 염의 침착을 제한할 수 있고, 따라서, 판막의 석회화 이영양증(calcific dystrophy)의 에피소드의 형성을 예방할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 처리된 심혈관 생체-보형물을 혈병 및 구조화 혈전의 형성으로부터 보호하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 방법은 처리된 심혈관 생체-보형물에서 혈액 순환으로부터 지질단백질 침윤 및 결과적인 세포-매개 염증성 조직 반응의 개시를 회피할 수 있게 한다.
마지막으로, 본 발명에 의해, 박테리아에 의한 상재화(colonization)를 방지하고, 심혈관 조직을 심내막염의 발병으로부터 보존하는 방법이 개발되었다.
본 발명에서 개시된 방법은 매우 안정하고 안전한 것으로 입증되었다.
수집된 증거는 본 발명이 처리된 판막의 수력학적 및 생체역학적 온전성을 유의하게 변화시키지 않았다는 것을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 처리된 판막에 대해 수득된 수력학적 파라미터의 값들은 ISO 5840-3 표준에 표시된 값들 내에 속하는 범위에 있다.
또한, 본 발명의 방법은 인 비트로 및 인 비보 조사에서 모두 석회화 침착물의 형성을 억제할 수 있는 것으로 입증되었다. FACTA™으로 처리된 BHV는 명확하게 비-혈전형성성이고, 세포 및 지질 침윤으로부터 보호되었다.
마지막으로 중요한 것은, 본 발명에 의해, 기존의 장치 및 기계에 의해 수행될 수 있는 방법이 고안되었다.
본 발명의 키트와 관련하여, 이미 제조된 생체보형 대체물(bioprosthetic substitute)의 자발적인 처리를 목표로 하고, 전술된 본 발명에 따른 방법은 클리닉 및 종합병원과 같은 의료 기관에서 유용하다.
본 발명은 다수의 수정 및 변형이 가능하고, 이들 모두는 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
또한, 모든 요소들은 다른, 기술적으로 균등한 요소에 의해 치환될 수 있다.

Claims (23)

  1. 단리된 생물학적 매트릭스에서 또는 그 내부에서 석회화 침착물의 형성을 방지하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 생물학적 매트릭스를 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 선행하는 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 암 조건에서 35±2℃의 온도에서 2시간 미만의 기간 동안 수행되는 것인 방법.
  3. 선행하는 항에 있어서, 상기 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액은 단순 페놀(simple phenol), 페놀 알데히드, 페놀산, 페닐아민, 페놀 화합물(phenol compound), 플라보노이드, 페닐프로파노이드, 및 탄닌을 포함하는 군에서 선택된 페닐프로파노이드의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액은 레스베라트롤(resveratrol), 알로인(aloin), 시아나린(cyanarin), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 탄닌산(tannic acid), 카페산(caffeic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid), 히드록시티로솔(hydroxytyrosol), 로즈마린산(rosmarinic acid), 나리게닌(narigenin), 갈산(gallic acid), 헤스페리딘(hesperidin), 퀸산(quinic acid), 엘레오놀산(eleonolic acid), 피노레시놀(pinoresinol), 루테올린(luteolin), 아피게닌(apigenin), 탄게리틴(tangeritin), 이소람네틴(isorhamnetin), 캠페롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin), 에리오딕티올(eriodictyol), 헤스페레틴(hesperetin), 나린게닌(naringenin), 테아플라빈(theaflavin), 테아루비긴스(thearubigins), 다이드제인(daidzein), 게니스테인(genistein), 글리시테인(glycitein), 프테로스틸벤(pterostilbene), 델피니딘(delphinidin), 말비딘(malvidin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페오니딘(peonidin), 치코르산(chicoric acid), 페룰산(ferulic acid), 살리실산(salicylic acid)을 포함하는 군에서 선택된 페닐프로파노이드의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  5. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페놀 화합물의 용액은 적합한 완충액을 더 포함하는 것인 방법.
  6. 선행하는 항에 있어서, 상기 용액에 각각의 페닐프로파노이드는 약 0.2-5 mg/ml ± 0.5 mg/ml의 농도로 포함되는 것인 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 페닐프로파노이드의 하기 조합을 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00003
  8. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 생물학적 매트릭스는 혈관, 심장 판막, 힘줄, 인대, 심장막, 안구 근막, 경질막, 고막, 장 점막하층(intestinal submucosa), 연골, 지방 조직, 및 골 조직, 골반, 복부 및 유방 조직, 심장 판막 및 심장막 조직 패치와 같은 심혈관 보형물(prostheses)에 의해 대표되는 것인 방법.
  9. 선행하는 항에 있어서, 상기 단리된 생물학적 매트릭스는 TAVI(trans-catheter valve implantation) 보형물 또는 수술용 판막 보형물(surgical valve protheses)에 의해 대표되는 것인 방법.
  10. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 제공하는 것인 방법: 생물학적 매트릭스에서 이종 항원의 불활성화, 생물학적 매트릭스 위 또는 내부에서 혈전 형성의 방지, 생물학적 매트릭스로의 지질 침윤의 방지, 세포 성분에 의해 매개되는 염증 과정의 발병의 방지, 생물학적 매트릭스 상의 생물부착(biofouling) 과정의 방지.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된, 단리된 생물학적 매트릭스.
  12. 의학, 생물의학 및/또는 수의학 분야에서 심장 질환의 치료에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된, 단리된 생물학적 매트릭스.
  13. 단리된 생물학적 매트릭스에서 석회화 침착물의 형성을 방지하기 위해 사용되는, 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액.
  14. 선행하는 항에 있어서, 상기 용액은 단순 페놀, 페놀 알데히드, 페놀산, 페닐아민, 페놀 화합물, 플라보노이드, 페닐프로파노이드, 및 탄닌을 포함하는 군에서 선택된 페닐프로파노이드의 혼합물을 포함하는 것인 단리된 생물학적 매트릭스에서 석회화 침착물의 형성을 방지하기 위해 사용되는 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 용액.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 레스베라트롤, 알로인, 시아나린, 에피갈로카테킨, 탄닌산, 카페산, 클로로겐산, 히드록시티로솔, 로즈마린산, 나리게닌, 갈산, 헤스페리딘, 퀸산, 엘레오놀산, 피노레시놀, 루테올린, 아피게닌, 탄게리틴, 이소람네틴, 캠페롤, 미리세틴, 에리오딕티올, 헤스페레틴, 나린게닌, 테아플라빈, 테아루비긴스, 다이드제인, 게니스테인, 글리시테인, 프테로스틸벤, 델피니딘, 말비딘, 펠라르고니딘, 페오니딘, 치코르산, 페룰산, 살리실산을 포함하는 군에서 선택된 페닐프로파노이드의 혼합물을 포함하는 페놀 화합물의 혼합물을 포함하는 것인 용액.
  16. 청구항 13 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페놀 화합물의 용액은 적합한 완충액을 더 포함하는 것인 용액.
  17. 선행하는 항에 있어서, 상기 용액에 각각의 페닐프로파노이드는 약 0.2-5 mg/ml ± 0.5 mg/ml의 농도로 포함되는 것인 용액.
  18. 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 페닐프로파노이드의 하기 조합을 포함하는 것인 용액:
    Figure pct00004
  19. 의학, 생물의학 및/또는 수의학 분야에서 심장 질환의 치료에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된, 단리된 생물학적 매트릭스.
  20. 선행하는 항에 있어서, TAVI(trans-catheter valve implantation) 보형물 또는 수술용 판막 보형물에 의해 대표되는 것인 단리된 생물학적 매트릭스.
  21. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된, 단리된 생물학적 매트릭스의 사용을 포함하는, 인간 또는 동물에서 심장 질환을 치료하는 방법.
  22. 선행하는 항에 있어서, 상기 생물학적 매트릭스는 TAVI(trans-catheter valve implantation) 보형물 또는 수술용 판막 보형물에 의해 대표되는 것인 인간 또는 동물에서 심장 질환을 치료하는 방법.
  23. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서:
    - 적합한 완충액을 담은 용기,
    - 상기 완충액에 용해될, 청구항 13 내지 18 중 어느 한 항에 따른 용액의 적합한 양을 담은 용기,
    - 세척용 완충액을 담은 1개 이상의 용기;
    - 상기 방법을 수행하기 위한 시간 및 모드의 설명을 담은 설명서 소책자를 포함하는 것인 키트.
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