KR20220016104A - 암 치료를 위한 프로카스파아제-3 활성화 및 면역요법 - Google Patents

암 치료를 위한 프로카스파아제-3 활성화 및 면역요법 Download PDF

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KR20220016104A
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이명렬
다이애나 라노아
이향연
말리스 헤이거
윌리엄 몽고메리
폴 제이. 허젠로더
티모시 엠. 팬
매튜 부드로
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더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈
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Abstract

혈뇌장벽 침투성 프로카스파제-3 활성화 약물인 PAC-1은 암세포의 면역 자극 파괴를 유도하는 효과적인 접근 방식으로 확인되었다. PAC-1은 암세포에서 MLH1의 절단을 유도하며, 본 발명에서는 MLH1의 비활성화가 MHC(주요 조직적합성 복합체) 생성물에 의한 돌연변이 부담 및 신생항원 제시를 증가시키는 것으로 나타났다. 여기에 암 치료에 효과적인 방식으로 면역 요법의 힘을 가져오는 기작 기반 전략이 설명되어 있다.

Description

암 치료를 위한 프로카스파아제-3 활성화 및 면역요법
우선권
본 출원은 2019년 5월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/854,823호 및 2019년 12월 6일에 출월된 62/944,404호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 우선권 출원은 모두 본 출원에 참고로 인용된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원에 의하여 지원된 인가 번호. R01 CA120439에 의하여 지원된 정부 지원에 의하여 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.
면역 요법의 성공적인 적용은 흑색종, 폐암 및 방광암의 치료를 변화시켰고 여러 다른 종양 유형에 대해 상당한 가능성을 갖고 있다. 일부 환자에서 나타난 극적인 결과(예: 말기 질병에서도 지속적인 반응)는 이러한 치료법이 다른 난치성 암에 성공적일 수 있다는 희망을 불러일으켰다. 종양의 돌연변이 부하와 면역 관문 억제제의 성공 사이에는 명백한 상관 관계가 있다. 이 관찰은 DNA 불일치 수선 결핍증 또는 미세위성 불안정성(MSI)이 있는 환자를 위한 펨브롤리주맙(PD-1에 대한 항체, 키트루다)의 승인으로 성공적으로 번역되었다. 불행히도, 돌연변이 부하가 낮은 많은 암에 대해 면역 요법 시도는 대체로 실망스러웠으며 암의 10% 미만이 MSI 표현형을 갖는다는 사실은 면역 요법 성공을 광범위하게 확장하는 데 어려움을 보여준다. 교모세포종(GBM)에 대한 면역요법의 챌린지는 낮은 신생항원 발현, 종양으로의 T 세포 침윤 부족, 대부분의 약물이 혈액뇌장벽(BBB)을 통과하는 데 어려움을 감안할 때 훨씬 더 중요하다.
최근의 중요한 진전은 종양 형성의 기원에 관계없이 PD-1 억제(펨브롤리주맙 사용)의 임상 효능에 대한 바이오마커로서 DNA 미세위성 불안정성(microsatellite instability; 이하, 'MSI'라고도 함)의 임상 승인이었다. 이 승인은 dMMR/MSI가 있는 종양이 100~1000개의 체세포 돌연변이를 갖고 있는 것으로 알려져 있기 때문에 불일치 복구 결핍(dMMR)이 PD-1 차단에 대한 고형 종양의 반응을 예측한다는 것을 보여주는 상당한 전임상 및 임상 데이터를 기반으로 하고(MMR proficient 암보다 10배 더 높은, 도 1A), 아마도 신생항원 수준의 상승으로 이어진다. 그러나 dMMR/MSI는 GBM의 5% 미만을 포함하여 10% 미만의 낮은 비율의 암에만 존재한다. 산발적인 MSI는 MLH1 프로모터의 후성 유전학적 침묵에 의해 구동되며, MLH1 침묵은 일반적으로 MMR 결핍의 마커로 사용된다. MLH1 침묵과 체세포 돌연변이 수 사이의 상관관계는 여러 연구에서 입증되었으며 도 1에 강력하게 표시되어 있다.
중요하게도, 최근 보고(Germano, G., et al., Nature 2017, 552, 116)는 MLH1의 비활성화(CRISPR/Cas9 녹아웃을 통해)가 더 높은 돌연변이 부담과 증가된 신생항원 프로필로 이어진다는 것을 검증했다. 이 MLH1-넉아웃 유도 표현형은 마우스에서 동계 종양을 최소한으로 설정하는 암 세포로 이어지며, 이는 dMMR이 면역 반응을 향상시키기에 충분함을 시사한다. 또한, 게놈 MLH1 녹아웃은 면역 체크포인트 억제제(즉, 항-PD-1 + 항-CTLA-4)에 대한 반응에서 극적인 증가를 초래한다. 이러한 결과는 MLH1 기능의 손실이 증가된 돌연변이 부하에 의해 구동되는 표현형 변화를 유도하여 궁극적으로 더 높은 신생항원 발현, 면역 인식 및 생체내 면역 체크포인트 차단에 대한 민감도 증가로 이어진다는 것을 시사한다.
MLH1 기능 상실이 암세포에서 선택적으로 유도될 수 있다면 이는 체크포인트 억제제 및 신생항원 펩티드 백신을 포함한 면역 요법에 대한 환자 반응을 상당히 높일 수 있다. 도발적으로, 여러 대규모 proteomic 연구에서 MLH1이 caspase-3의 상위 기질이며 6시간 후에 단백질의 0%가 남아 있음이 밝혀졌다. 또한, MLH1은 다른 활성 카스파아제(즉, 카스파아제-1,2,6,7,8)에서 단백질 분해가 관찰되지 않는 활성 카스파아제-3의 기질일 뿐이다.
프로카스파제-3(PC-3)에서 카스파제-3으로의 절단은 이 집행자 카스파제가 수백 개의 단백질 기질의 가수분해를 촉매하여 세포 사멸을 초래하기 때문에 세포자멸사에서 중요한 노드를 나타낸다. 암의 특징은 돌연변이 및 세포자멸사 단백질의 조절장애를 통해 세포자멸사를 회피하는 종양 세포의 능력이며, 여러 항암 약물 발견 전략은 이러한 돌연변이된 단백질의 억제에 초점을 맞추었다. 보완적인 접근법은 PC-3와 같은 세포자멸사 단백질의 소분자 매개 활성화를 포함한다. 빈번하게 돌연변이되는 단백질에 비해 세포자멸사 캐스케이드에서 PC-3의 다운스트림 위치, 암에서 PC-3 돌연변이의 낮은 빈도, 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 교모세포종(GBM), 췌장암, 간암, 비소세포폐암(NSCLC), 유방암, 난소암 결장암, 골육종 및 수막종을 포함한 여러 암 유형에서 프로카스파제-3 효소의 강력한 발현에 기초하여, PC-3의 소분자 매개 활성화는 항암 전략으로 활발히 연구되고 있다.
문제점은 암을 치료하기 위한 기존의 면역 요법 접근 방식이 신생항원 발현이 낮을 때 효능이 부족할 수 있다는 것이다. 따라서 면역치료를 통해 암세포를 근절시킬 수 있는 암세포를 선택적으로 표적화하여 신생항원 발현을 증가시킬 수 있는 약물이 필요하다.
요약
종양에서 프로카스파제-3가 카스파제-3로 선택적으로 활성화되면 MLH1이 정량적으로 절단되어 dMMR/MSI가 생성되어 면역 요법의 효능이 현저하게 증가한다. PAC-1은 여기서 MSS 종양을 dMMR/MSI 종양으로 전환시키는 MLH1 절단을 포함하여 암에서 면역 자극을 선택적으로 유도하여 종양을 면역 요법으로 치료하기 더 쉽게 만드는 데 사용된다. 결과는 PAC-1을 사용한 면역 자극이 스트레스 반응의 유도를 촉진하여 종양 미세 환경을 변경하여 면역 염증의 정도를 증가시킨다는 것을 시사했다. 이러한 결과는 더 많은 암 환자에게 면역 요법의 힘(극적이고 지속적인 반응)을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 조성물을 제공한다:
(a) 프로카스파제-3 활성화제;
(b) 체크포인트 억제제, 암 백신, 대사 조절제, 대식세포 억제제, 또는 면역 자극제 또는 조절제인 적어도 하나의 제2 활성제; 그리고
(c) 선택적으로 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체.
다양한 구현예에서, 프로카스파제-3 활성화제는 PAC-1:
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(PAC-1).
본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 프로카스파제-3 활성화제 및 유효량의 제2 활성제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 제공하며, 여기서 제2 활성제는 면역치료제; 여기서 제2 활성제의 효과는 프로카스파제-3 활성화제의 투여에 의해 향상된다.
암을 치료하는 방법의 한 특정 실시양태는 PAC-1 및 항-PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 PAC-1의 일단 총 투여 용량은 약 100 mg/kg 내지 약 125 mg/kg이고, 연속 21일 이상 동안 매일 투여되고 항-PD-1 항체는 21일 이상 연속적으로 2회 또는 4회 투여되고, 여기서 항-PD-1 항체의 용량은 약 10 mg/kg이고, 항-PD-1 항체의 각각의 용량은 별도의 날에 투여된다.
본 발명은 또한 의료 요법에 사용하기 위한 본원에 기재된 조성물의 용도를 제공한다. 그 의료 요법은 암, 예를 들어 유방암, 삼중 음성 유방암, 난소암, 폐암, 자궁내막암, 췌장암, 전립선암, 림프종, 흑색종, 백혈병, 다발성 골수종, 교모세포종, 간암, 소세포 폐암, 골육종, 수막종, 신장암, 전이성 신장 세포 암종, 갑상선암 또는 결장암을 치료할 수 있다. 본 발명의 실시양태는 또한 포유동물의 질환, 예를 들어 인간의 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다. 그 약제는 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
낮은 돌연변이 부하 종양을 높은 돌연변이 부하를 갖는 종양으로 선택적으로 전환하여 면역요법 치료를 위한 이상적인 후보가 되도록 하는 새로운 메커니즘 기반 전략의 개발이 본 발명에 개시되어 있다. 이 전략은 종양 억제인자 MLH1의 표적 불활성화를 전제로 한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, MLH1 침묵과 항-PD-1 항체에 대한 반응 사이에는 강한 상관관계가 있다: MLH1의 유전적 침묵과 종양의 체세포 돌연변이 수 사이의 연관성이 확실하게 입증되었으며, MLH1 기능 상실로 인한 DNA 손상은 높은 면역원성 스트레스 반응을 유발한다. 목표는 MLH1의 약물 매개된, 종양 선택적 비활성화를 통해 GBM에 면역 요법의 힘과 잠재력을 가져오는 것이었다. MLH1은 카스파제-3의 주요 세포 기질이며, 그 개시된 방법은 종양 세포에서 프로카스파제-3을 카스파제-3으로 선택적으로 활성화하는 PAC-1이라는 소분자를 사용하여 암세포에서 선택적 MLH1 절단을 유도할 수 있다.
PAC-1은 경구로 이용 가능한 BBB 침투 실험적 치료제로 인간 암 환자에게 안전한 것으로 입증되었으며 현재 GBM에 대해 임상적으로(방사선 및 테모졸로마이드와 함께) 평가되고 있다. 이 출원의 전반적인 목표는 GBM의 정교한 모델에서 면역 요법과 함께 약물 유도 MLH1 절단의 메커니즘 기반 시너지 효과를 달성하는 것이다. 중심 가설은 약물 매개 MLH1 절단이 종양 선택적 DNA 손상 및 MSI를 유도하여 잠재적인 신생항원의 양(및 면역원성)을 증가시킬 것이라는 것이다. 또한, PAC-1의 caspase-3 유도 활성은 염증성 종양 내 환경을 촉진하여 '차가운(cold)' GBM 종양을 다양한 면역 요법 양식에 취약한 '뜨거운(hot)' 종양으로 전환한다(도 2).
정의
다음의 정의는 명세서 및 청구 범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해 포함된다. 본원에서 사용된, 인용된 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다. 이 명세서에서 사용된 다른 모든 용어 및 문구는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 그들의 통상적인 의미를 갖는다. 이러한 통상적인 의미는 Hawley 's Condensed Chemical Dictionary 제 14 판, R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001와 같은 기술 사전을 참고하여 얻을 수 있다.
명세서에서 "일 실시예", "실시 예" 등은 기술된 실시 예가 특정 양상, 특징, 구조, 부분 또는 특성을 포함할 수 있음을 나타내지만, 모든 실시 예는 반드시 그 양태, 특징, 구조, 모이어티 또는 특성을 포함하는 것은 아니다. 또한, 이러한 문구는 본 명세서의 다른 부분에서 언급된 동일한 실시 예를 의미할 수 있는 것은 아니다. 또한, 특정한 양상, 특징, 구조, 모이어티 또는 특성이 일 실시 예와 관련하여 설명될 때, 당업자의 지식 범위 내에서 명시적 또는 비 명시적으로 기재되던지 다른 실시예와 이러한 양상, 특징, 구조, 모이어티 또는 특성과 영향을 미치거나 연결시킬 수 있다.
단수 형태인 "일", "그(the)"는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 기준을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 다수의 이러한 화합물을 포함하므로, 화합물 X는 다수의 화합물 X를 포함한다. 또한 청구 범위는 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음에 주목한다. 이와 같이,이 기재는 본 명세서에 기술된 요소 및/또는 본원에 기술된 모든 요소와 관련하여 "단독으로", "유일한", "아닌" 및 이 명세서에 기재된 일부 요소 및/또는 청구항 요소의 인용 또는 "부정적인" 제한의 사용 등과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기준으로 제공하기 위한 것이다.
"및/또는"이라는 용어는 항목들의 어느 하나, 항목들의 어느 조합, 또는 이 용어가 관련된 항목들의 모두를 의미한다. "하나 이상의" 및 "적어도 하나"라는 표현은 통상의 기술자에게 손쉽게 이해되는데, 특히 이 표현의 맥락에서 읽혀질 때 그러하다. 예를 들어, 이 표현은 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 열, 100, 또는 기재된 하한치보다 대략 10, 100 또는 1000배가 더 큰 어떠한 상한치를 의미할 수 있다.
통상의 기술자에게 이해될 것처럼, 성분의 양, 분자량과 같은 성질, 반응 조건 및 이와 같은 것을 표현하는 것들을 포함한 모든 숫자는 근사값이며, 모든 경우에서 용어 "약"에 의하여 선택적으로 변경될 수 있는 것으로 이해된다. 이들 수치는 본 명세서의 기재를 활용하는 통상의 기술자가 얻고자 하는 바람직한 성질에 따라 달라질 수 있다. 또한, 이러한 수치는 이들 각각의 시험 측정에서 확인되는 표준 편차에 기인하는 필연적인 변동성을 본질적으로 포함하는 것으로 이해된다.
"약" 및 "대략"이라는 용어는 호환적으로 사용된다. 두 단어 모두 특정된 값의 ± 5 %, ± 10 %, ± 20 % 또는 ± 25 %의 변동을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서 "약 50"퍼센트는 45 내지 55 퍼센트의 변형을 가질 수 있거나, 또는 특정 범위에 의해 달리 정의될 수 있다. 정수 범위의 경우, 용어 "약"은 범위의 각 끝에서 인용된 정수보다 하나 또는 두 정수 크거나 및/또는 작은 정수를 포함할 수 있다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 용어 "약" 및 "대략"은 개별 성분, 조성물 또는 실시 양태의 기능성 측면에서 동등한 언급된 범위에 근접한 값, 예를 들어 중량 백분율을 포함하는 것으로 의도된다. "약" 및 "대략"이라는 용어는 또한 이 단락에서 상술한 바와 같이 인용된 범위의 끝-점을 수정할 수 있다.
당업자가 이해할 수있는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적, 특히 기재된 설명을 제공하는 관점에서, 본원에 언급된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 그것의 하위 범위의 조합뿐만 아니라 범위를 구성하는 개별 값, 특히 정수 값 따라서, 2 개의 특정 유닛 사이의 각각의 유닛이 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 내지 15가 개시되면, 11, 12, 13 및 14도 개별적으로 그리고 범위의 일부로서 개시된다. 기재된 범위 (예 : 중량 백분율 또는 탄소 그룹수)에는 범위 내의 각 특정 값, 정수, 소수 또는 동일성이 포함된다. 열거된 범위는 동일한 범위가 적어도 동일한 반쪽, 3 분의 1, 4 분의 1, 5 분의 1 또는 10 분의 1로 세분화되도록 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비 한정적인 예로서, 본 명세서에서 논의된 각각의 범위는 더 낮은 3번째 , 중간 3번째, 더 높은 3번째 등으로 쉽게 분해될 수 있다. 또한 당업자는 "최대"와 같은 모든 언어, "적어도", "보다 큼", "보다 큼", "보다 낮은", "이상"등은 언급된 수를 포함하며, 이러한 용어는 상기에서 언급된 것과 같은 하위 범위로 세분될 수 있는 범위를 지칭한다. 동일한 방식으로, 본원에 인용된 모든 비율은 또한 더 넓은 비율 내에 속하는 모든 하위 비율을 포함한다. 따라서, 라디칼, 치환기 및 범위에 대해 언급된 특정 값은 단지 예시를 위한 것이며; 이들은 라디칼 및 치환기에 대해 정의된 범위 내의 다른 정의된 값 또는 다른 값을 배제하지 않는다. 각각의 범위의 종말점은 다른 종말점과 관련하여 그리고 다른 종말점과 무관하게 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다.
당업자는 또한 Markush 그룹에서와 같이 공통의 방식으로 멤버들이 함께 그룹화되는 경우, 본 발명은 전체 그룹으로 나열될 뿐만 아니라 그룹의 각 구성원을 개별적이고 모든 가능한 것으로 포함한다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 메인 그룹의 하위 그룹. 또한, 모든 목적을 위해, 본 발명은 주 그룹뿐만 아니라 하나 이상의 그룹 구성원이 없는 주 그룹을 포함한다. 따라서, 본 발명은 언급된 그룹의 구성원 중 임의의 하나 이상을 명시적으로 배제하는 것을 고려한다. 따라서, 단서는 언급 된 요소, 종 또는 실시 예 중 어느 하나 이상이 예를 들어 명백한 부정적 제한에 사용하기 위해 이러한 카테고리 또는 실시 예에서 제외될 수 있는 개시된 카테고리 또는 실시 예 중 어느 것에 적용될 수 있다.
"접촉"이란 용어는 터치, 접촉하기, 또는 바로 옆의 또는 가까운 근접지로 다가가는 행위를 의미하는데, 예를 들어, 용액에서, 반응 혼합물에서, 시험관 내에서(in vitro) 또는 생체 내에서(in vivo), 생리학적 반응, 화학적 반응, 또는 물리적 변화를 일으키는 세포 또는 분자적 수준에서의 것을 포함한다.
치료적 응용에 있어서, "유효량"은 질병, 장애 및/또는 질환을 치료하거나 또는 기재된 효과를 달성하기에 효과적인 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 치료될 장애 또는 증상의 진행 또는 심각도를 감소시키기에 효과적인 양일 수 있다. 치료적으로 유효한 양의 결정은 통상의 기술자의 능력 내에 있다. "유효량"이란 용어는 여기에 기재된 화합물의 양, 또는 여기서 기재된 화합물들의 조합의 양을 포함하는 것으로 의도되며, 예를 들어, 개체에서, 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 또는 질병 또는 장애의 증상을 치료하기에 효과적인 양을 포함한다. 따라서, "유효량"은 목적으로 하는 효과를 제공하는 양을 일반적으로 의미한다.
대안적으로, 본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 투여되는 제제 또는 조성물 또는 조성물의 조합의 충분한 양을 지칭하며, 이는 하나 이상의 치료 중인 질병이나 상태, 증상을 어느 정도 완화시킬 것이다. 그 결과 질병의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 다른 원하는 변경이 있을 수 있다. 예를 들어, 치료 용도를 위한 "유효량"은 질병 증상의 임상적으로 유의한 감소를 제공하는 데 필요한 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 조성물의 양이다. 개별 경우에 적절한 "유효"량은 용량 증량 연구와 같은 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 용량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 그러나 유효 용량으로 간주되는 정확한 결정은 환자의 연령, 질병의 크기, 유형 또는 정도, 질병의 단계, 조성물의 투여 경로, 사용된 보충 요법의 유형 또는 정도, 진행 중인 질병 과정 및 원하는 치료 유형(예: 공격적 치료 대 기존 치료)를 포함하되 이에 국한되지 않는 각 환자의 개별 요인을 기반으로 할 수 있다. .
용어 "치료하는", "치료하다" 및 "치료"는 (i) 질병, 병리학적 또는 의학적 상태가 발생하는 것을 방지하는 것(예를 들어, 예방); (ii) 질병, 병리학적 또는 의학적 상태를 억제하거나 그 진행을 정지시키는 것; (iii) 질병, 병리학적 또는 의학적 상태를 완화시키는 것; 및/또는 (iv) 질병, 병리학적 또는 의학적 상태와 관련된 증상 감소를 포함한다. 따라서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 예방으로 확장될 수 있고, 치료되는 상태 또는 증상의 진행 또는 중증도의 '예방', '예방하다', '예방하는', 낮추는, 중지하는 또는 역전하는 것을 포함할 수 있다. 이와 같이, 용어 "치료"는 적절하게 의료, 치료 및/또는 예방 투여를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "대상체"또는 "환자"는 질환 또는 다른 악성 종양의 증상을 갖거나 또는 위험에 처한 개체를 의미한다. 환자는 인간 또는 비인간일 수 있으며, 예를 들어 본원에 기술된 마우스 모델과 같은 연구 목적으로 "모델 시스템"으로 사용되는 동물 균주 또는 종을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 환자는 성인 또는 청소년(예를 들어, 어린이)을 포함할 수 있다. 더욱이, 환자는 본원에서 고려되는 조성물의 투여로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 살아있는 유기체, 바람직하게는 포유 동물 (예를 들어, 인간 또는 비인간)을 의미할 수 있다. 포유 동물의 예는 포유 동물 부류의 임의의 구성원 : 인간, 침팬지와 같은 비인간 영장류 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 농장 동물; 토끼, 개 및 고양이와 같은 가축; 쥐, 생쥐 및 기니피그 등과 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 비 포유류의 예는 조류, 어류 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공된 방법의 한 실시 양태에서, 포유 동물은 인간이다.
본원에 사용된 용어 "제공하는", "투여하는", "도입하는"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 원하는 부위에 본 발명의 조성물을 적어도 부분적으로 국소화시키는 방법 또는 경로에 의해 대상체에 본 발명의 조성물을 배치하는 것을 지칭한다. 그. 조성물은 대상체에서 원하는 위치로 전달되는 임의의 적절한 경로로 투여 될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 조성물의 안정성 및 활성을 연장시키기 위해, 또는 다른 치료 약물과 조합하여 추가의 조성물과 함께 투여될 수 있다
"억제하다", "억제하는" 및 "억제"라는 용어는 질병, 감염, 상태 또는 세포 그룹의 성장 또는 진행의 둔화, 정지 또는 역전을 지칭한다. 그 억제는 예를 들어 치료 또는 접촉이 없을 때 발생하는 성장 또는 진행과 비교하여 약 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 % 또는 99 %보다 클 수 있다.
본 명세서에 사용된 "실질적으로"라는 용어는 광범위한 용어이며, 제한 없이 주로 명시된 것을 포함하지만 반드시 전체적으로는 그렇지 않은 것을 포함하는 일반적인 의미로 사용된다. 예를 들어, 이 용어는 100% 전체 숫자 값이 아닐 수 있는 숫자 값을 나타낼 수 있다. 전체 수치는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 또는 약 20% 미만일 수 있다.
용어 "면역요법"은 예를 들어 "면역치료제"를 사용하여 면역계를 활성화 또는 억제함으로써 질병을 치료하는 것을 의미한다. 면역 반응을 유도하거나 증폭시키기 위해 고안된 면역 요법은 활성화 면역 요법으로 분류되며, 감소 또는 억제하는 면역 요법은 억제 면역 요법으로 분류된다. 면역 요법은 면역 체계를 활성화하거나 억제하여 질병을 치료하는 것이다. 이러한 면역반응을 유도하거나 증폭시키는 면역요법을 활성화 면역요법으로 분류하고, 감소시키거나 억제하는 면역요법을 억제 면역요법으로 분류한다. 암 면역 요법은 면역 체계를 자극하여 종양을 파괴하려고 시도한다.
용어 "아이소타입"은 표적에 대한 특이성은 없지만 애플리케이션에 사용된 1차 항체의 클래스 및 유형과 일치하는 1차 항체인 대조군을 의미한다. 이소타입 컨트롤은 특정 항체 신호와 비특이적 배경 신호를 구별하는 데 도움이 되는 음성 컨트롤로 사용된다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 실시 양태 또는 다양한 측면을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 일부 예에서, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 제시된 상세한 설명과 함께 첨부된 도면을 참조함으로써 가장 잘 이해 될 수 있다. 설명 및 첨부 도면은 어떤 특정 예 또는 본 발명의 특정 측면을 강조 할 수 있다. 그러나, 당업자는 예 또는 측면의 일부가 본 발명의 다른 예 또는 측면과 조합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
도 1 A) Microsatellite Instability(MSI) 및 B) MLH1-silencing은 Vogelstein and co.(Proc Natl Acad Sci U S A 2015, 112, 118)의 데이터에서 결장암에 대해 표시된 것처럼 증가된 수의 체세포 돌연변이와 강한 상관 관계가 있다는 것을 나타낸 그림. MSS, Microsatellite Stable.
도 2는 PAC-1과 면역요법의 시너지 효과를 나타낸 그림으로, PAC-1에 의해 유도된 카스파제-3은 암을 다양한 면역치료법에 민감하게 만드는 특정 단백질을 절단.
도 3은 PAC-1 처리는 Apoptotic Death Markers가 없을 때 MLH1 절단으로 이어지는 것을 나타낸 그림, 세포주를 표시된 농도의 PAC-1로 72시간 동안 인큐베이션한 후 MLH1 단백질 수준 및 PARP-1, 절단된 PARP-1(c-PARP-1은 세포자멸사 메이커임) 및 베타-액틴(로딩 대조군)에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행. 세포주의 유형은 정상 세포주로 표시되며, 특히 HFF-1이 강조 표시되어 암세포 특이적 MLH1 절단을 입증.
도 4는 동계 종양(syngeneic tumors)이 있는 마우스의 PAC-1 처리는 종양 침윤 림프구의 수를 증가시키는 것을 나타낸 그림으로, A) GL261 신경구의 동소 이식이 있는 C57BL/6 마우스. 종양이 10일 동안 확립되도록 한 다음, 마우스(n=3/그룹)를 PAC-1(100 mg/kg PO x 10일)의 존재 또는 부재하에 처리한 다음 희생시켰다. T 세포 TIL을 확인하기 위해 종양을 CD3(갈색)으로 염색했다. 데이터는 4 HPF/마우스당 평균 CD3+로 표시됨. 배율 l00x. B) B16F10 세포를 피하 이식한 C57BL/6 마우스. 종양이 7일 동안 확립되도록 한 다음, 마우스(n=8/그룹)를 PAC-1(100 mg/kg IP x 2 x 14일)의 존재 또는 부재하에 처리한 다음 희생시켰다. T 세포 TIL을 확인하기 위해 종양을 CD3(갈색)으로 염색했다. 데이터는 10 HPF/마우스당 평균 CD3+로 표시됨. 배율 l00x.
도 5는 IHC 연구를 위한 PD-L1 및 MLH1의 검증. (A) 인간 편도선 및 (B) 개 림프절에서 양성 PD-L1 발현. 개 신경교종(C) H&E 및 (D) PD-L1 IHC. (E) 인간 U87 및 (F-H) 3 개 신경아교종 세포주에 대한 핵 MLH1 IHC.
도 6은 면역 요법과 병용에서 PAC-1의 효능을 보여주는 그래프. PAC-1 투여량은 1일 1회 100mg/kg. 1 = 비히클 + 동위원소; 2 = 비히클 + 항-PD-1 + 및 -CTLA-4; 3 = PAC-1 + 동위원소; 4 = PAC-1 + 항-PD-1 + 항-CTLA-4.
도 7은 항-PD-1 항체와 병용에서 PAC-1이 후기 K7M2 전이성 모델에서 연장된 생존을 유도하는 그래프를 보여주는 그림으로, MST = 중앙 생존 시간. 그림에서 αPD1 = anti-PD-1.
도 8은 BALB/c 마우스에서 CT-26_WT 피하 모델의 개발.
도 9는 2회 투여(A) 대 4회 투여(B) 후 BALB/c 마우스에서 CT-26_WT의 성장. 열린 원 = 비히클 + 항-IgG2A 항체; 정사각형 = PAC-1(100mg/kg) + 항-IgG2a 항체; 삼각형 = 비히클 + 항-PD-1 mAb; 역삼각형 = PAC-1(100mg/kg) + 항-PD-1 mAb.
도 10은 PAC-1 및 항-PDL1 mAb를 사용한 BALB/c 마우스 치료 분석. 열린 원 = 비히클 + 항-IgG2A 항체; 정사각형 = PAC-1(100mg/kg) + 항-IgG2a 항체; 삼각형 = 비히클 + 항-PD-1 mAb; 역삼각형 = PAC-1(100mg/kg) + 항-PD-1 mAb.
도 11은 BALB/C 마우스에서 CT-26_TdTomato 피하 종양 모델의 개발.
도 12 A) 실시예 처리 프로토콜. B) PAC-1로 처리된 BALB/c 마우스의 혈장 사이토카인 어레이.
도 13은 폐, PBMC 및 비장에서 종양 공격 14일 후 PAC-1 처리 후 호중구 및 대식세포 집단 분석. 열린 원 = 비히클 + 항-IgG2A 항체; 정사각형 = PAC-1 + 항-IgG2a 항체; 삼각형 = 비히클 + 항-PD-1 mAb; 역삼각형 = PAC-1 + 항 PD-1 mAb.
도 14는 병용 PAC-1 및 항PD-1 처리 26일 후 BALB/c 마우스의 폐, PBMC 및 비장에서 T 세포, B 세포 및 NK 세포 집단의 분석. 열린 원 = 비히클 + 항-IgG2A 항체; 정사각형 = PAC-1 + 항-IgG2a 항체; 삼각형 = 비히클 + 항-PD-1 mAb; 역삼각형 = PAC-1 + 항 PD-1 mAb.
도 15는 BALB/c 마우스의 폐, PBMC 및 비장에서 종양 공격 26일 후 수지상 세포 및 CD45-종양 세포의 표면 상의 PD-L1 발현. 열린 원 = 비히클 + 항-IgG2A 항체; 정사각형 = PAC-1 + 항-IgG2a 항체; 삼각형 = 비히클 + 항-PD-1 mAb; 역삼각형 = PAC-1 + 항 PD-1 mAb.
도 16은 C57BL/6 마우스에서 MC38 폐 전이 모델의 개발. 1 = 비히클; 2 = PAC-1; 3 = 항 PD-1; 4 = PAC-1 + 항PD-1. PAC-1은 100mg/kg 용량의 복강내 주사를 통해 전달되었고 항-PD-1은 10mg/kg의 복강내 주사를 통해 전달.
도 17은 MC38 폐 전이 모델에 따른 생존 곡선. 1 = 비히클; 2 = PAC-1; 3 = 항 PD-1; 4 = PAC-1 + 항PD-1. PAC-1은 100mg/kg 용량의 복강내 주사를 통해 전달되었고 항-PD-1은 10mg/kg의 복강내 주사를 통해 전달됨.
본 발명의 구체예
본 발명은 하기를 포함하는 조성물을 제공한다:
(a) 프로카스파제-3 활성화제;
(b) 적어도 하나의 제2 활성제, 여기서 상기 제2 활성제는 체크포인트 억제제, 암 백신, 대사 조절제, 대식세포 억제제, 또는 면역 자극제 또는 조절제; 및
(c) 선택적으로 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체.
다양한 구현예에서, 상기 프로카스파제-3 활성화제는 PAC-1:
Figure pct00002
(PAC-1).
다양한 추가 구현예에서, 프로카스파제-3 활성화제는 미국 특허 번호 8,592,584; 8,778,945; 8,916,705; 또는 9,249,116; 화학식 및 화합물이 본원에 참고로 포함된다.
추가 실시양태에서, 제2 활성제는 암세포에서 세포자멸사를 유도하는 효과를 갖고 PAC-1은 상가(additive) 효과보다 더 큰 양만큼 제2 활성제의 효과를 향상시키며, 여기서 PAC-1은 두 번째 활성화제에 대한 암세포의 취약성을 프라이밍한다.
다른 실시양태에서, 상기 조성물(예를 들어, 프로카스파제-3 활성화제)은 미스매치-수리(mismatch-repair;MMR) 단백질을 억제한다. 추가 실시양태에서, 상기 조성물은 MutL 상동체(MutL homolog) 1(MLH1) 단백질의 카스파제-3 분해의 매개체이다. 추가 실시양태에서, 그 조성물은 DNA 미세위성 불안정성(MSI)을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 그 조성물은 암 세포를 선택적으로 표적화한다.
일부 추가 실시양태에서, MMR 단백질은 MutL 상동체 1(MLH1) 단백질을 포함하고, 여기서 프로카스파제-3 활성화제를 통한 카스파제-3 활성화에 의해 매개되는 MMR 단백질(예: MLH1 단백질)의 분해는 MMR 단백질의 결핍(즉, dMMR)을 초래하고, DNA 미세부수체 불안정성(MSI) 및 신생항원 발현을 추가로 유도하여 면역치료제의 효과를 향상시킬 수 있으며, 여기서 프로카스파제-3 활성화제는 암에서 종양 침윤 림프구를 증가시킨다.
다른 추가 실시양태에서, 하나 이상의 제2 활성제는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3), 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4) 또는 OX40), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리-구성원 9(TNFRSF9 또는 4-1BB), 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련 단백질(GITR), 유도성 T-세포 공동자극제(ICOS), 또는 이들의 조합를 통해 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 체크포인트 억제제이다.
다양한 추가 실시양태에서, 제2 활성제는 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제(IDO), 아데노신 A2A 수용체(A2AR), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR-4), CC 케모카인 수용체 유형 4(CCR4), 종양 괴사 인자 수용체(CD27), 인터루킨-2 수용체 서브유닛 베타(CD122), 사멸 수용체 5(DR5), 세포자멸사 단백질 억제제(IAP), 글루타미나제, 집락 자극 인자 1 수용체( CSF1R), 톨-유사 수용체(TLR), 수지상 세포(DC), 또는 이들의 조합을 조절한다.
또 다른 실시양태에서, 제2 활성제는 상기 제2 활성제는 ADXS11-001, ADXS31-142, AMP-224, AMP-514, 아테졸리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 베바시주맙, 세미플리맙, BLZ945, BMS-9365559,66156, BMS9365598, BMS968, CB839, CIMAvax, CMP001, CP870893, CPI-444, CRS207, CV301, DC 백신, DNX2401, DS-8273a, 두르바루맙, 에파카도스타트, FAZ053, FPA008, GDC0919, GSK3174998, GVAX, GWN323, IMCgp100, IMP321, 임프라임 PGG, 인도시미드, 이필리무맙, JTX-2011, LAG525, LCL161, LK-301, LY2157299, LY2510924, LY3022855, MBG453, MEDI0562, MEDI0680, MEDI6469, MEDI9447, MGN1703, 모가물리주맙, MOXR0916, 신생항원 백신, NEO-PV-01, NIS793, 니볼루맙, NKTR-214, PBF509, PDR001, 펨브롤리주맙, 펩타이드 백신, 펙시다르티닙(PLX3397), PF-04518600, PF-3512676, REGN2810, REGN3767, RO7009789, SD101, 타리모겐, 라헤르파렙벡, TPIV200/huFR-1, 트레메리무맙, TroVax, TSR022, 우로컵루맙-1, 우렐루맙, 우토밀루맙, 바르릴루맙, 비아젠푸마투셀-L(HS-110), 또는 이들의 조합이다.
다른 실시양태에서, 체크포인트 억제제는 항-PD-1, 항-CTLA-4, 또는 이들의 조합이고; 여기서 항-PD-1은 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이고, 항-CTLA-4는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 제약상 허용되는 희석제, 부형제, 담체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 개시된 조성물의 다른 실시양태에서, a) 담체는 물, 완충액, 당, 셀룰로오스, 시클로덱스트린, 디메틸술폭시드, 폴리에틸렌 글리콜, 토코페롤, 리포솜, 미셀, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 또는 b) 부형제는 결합제, 윤활제, 흡착제, 비히클, 붕해제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다양한 다른 구체 예에서, PAC-1의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 50 μM이다. 추가의 구체 예에서, PAC-1의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 2 μM 내지 약 15 μM, 약 3 μM 내지 약 20 μM, 약 4 μM 내지 약 25 μM, 약 5 μM 내지 약 30 μM, 약 10 μM 내지 약 40 μM, 약 15 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 0.01 μM 내지 약 100 μM이다.
추가의 구체 예에서, 제 2 활성제의 농도는 약 1 nM 내지 약 100 μM이다. 일부 추가의 구체 예에서, 제 2 활성제의 농도는 약 1 nM 내지 약 100 nM, 약 10 nM 내지 약 1 μM, 약 100 nM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 5 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 5 μM 내지 약 15 μM, 약 10 μM 내지 약 20 μM, 약 10 μM 내지 약 30 μM, 약 15 μ M 내지 약 40 μM, 약 20 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 50 μM 내지 약 100 μM이다.
추가 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 암 세포를 선택적으로 표적화하고, 여기서 암세포는 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 교모세포종, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 수막종, 다발성 골수종, 난소암, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 또는 갑상선암; 여기서 유방암은 선택적으로 삼중 음성 유방암이고, 폐암은 선택적으로 비-소세포 폐암이고, 신장암은 선택적으로 전이성 신세포 암종이다,
본 발명은 또한 암세포를 유효량의 개시된 조성물과 접촉시켜 암세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것을 포함하는, 암세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 암 세포의 성장 또는 증식은 미스매치-수리(MMR) 단백질을 억제함으로써 저해된다. 추가 실시양태에서, 암 세포의 성장 또는 증식은 MutL 상동체 1(MLH1) 단백질의 카스파제-3 활성화 매개 분해에 의해 억제된다. 또 다른 실시양태에서, DNA 미세위성 불안정성(MSI)이 유도된다.
본 발명은 암세포를 유효량의 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 암세포에서 세포자멸사를 유도하는 방법을 추가로 제공하고, 여기서 세포자멸사는 암 세포에서 미스매치-수리(MMR) 단백질을 억제함으로써 유도된다. 다른 실시양태에서, MutL 상동체 1(MLH1) 단백질의 분해는 프로카스파제-3 활성화제를 통한 카스파제-3 활성화에 의해 매개되어 암 세포에서 세포자멸사를 유도한다.
추가로, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 프로카스파제-3 활성화제 및 유효량의 제2 활성제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 제공하며, 여기서 제2 활성제는 면역치료제이고; 여기서 제2 활성제의 효과는 프로카스파제-3 활성화제의 투여에 의해 향상된다.
또 다른 추가 실시양태에서, 프로카스파제-3 활성화제는 PAC-1이거나, 또는 여기서 프로카스파제-3 활성화제는 약 200 내지 약 800, 약 250 내지 약 550, 약 300 내지 약 600, 약 350 내지 약 350 내지 약 550, 또는 약 350 내지 약 450의 분자량을 가지고, 여기서 프로카스파제-3 활성화제는 프로카스파제-3을 카스파제-3으로 직접 활성화한다.
추가 실시양태에서, 제2 활성제는 체크포인트 억제제, 암 백신, 대사 조절제, 대식세포 억제제, 면역 자극제 또는 조절제를 또는 이들의 조합을 포함한다.
다양한 실시양태에서, MutL 상동체 1(MLH1) 단백질의 카스파제-3 분해는 DNA 미세부수체 불안정성(MSI) 및 신생항원 발현을 유도하여 암 치료의 효과를 증가시킨다. 다른 구체예에서, 미스매치-수리(MMR) 단백질은 프로카스파제-3 활성화제에 의해 억제된다. 추가 실시양태에서, 프로카제파제-3 활성화제, 예를 들어 PAC-1은 암(또는 암세포)에서 종양 침윤 림프구(TIL)를 증가시킨다.
다양한 다른 실시양태에서, 면역치료제는 체크포인트 억제제이고, 체크포인트 억제제는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1), 세포독성 T- 림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3), 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4 또는 OX40), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFRSF9 또는 4-1BB), 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련 단백질(GITR), 유도성 T-세포 공동자극제(ICOS), 또는 이들의 조합을 통해 면역 반응을 조절한다.
또 다른 다양한 실시양태에서, 제2 활성제는 아테졸리무맙, 아벨루맙, 베바시주맙, BMS986016, BMS986156, CP870893, 더발루맙, FAZ053, GSK3174998, GSK3174998, GWN323, IMP321, 이필리무맙, JTX-2011, LAG525, MBG453, MEDI0562, MEDI0680, MEDI6469, MOXR0916, 니볼루맙, PDR001, 펨브롤리주맙, PF-04518600, REGN2810, REGN3767, RO7009789, 트레멜리무맙, TSR022, 우렐루맙, 우토밀루맙, 또는 이들의 조합이다.
다양한 추가 실시양태에서, PAC-1의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 50 μM이고 제2 활성제의 농도는 약 1 nM 내지 약 100 μM이다. 추가 실시양태에서, PAC-1의 농도는 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 다른 실시양태에서, 제2 활성제의 농도는 약 1nM 내지 약 1μM이다.
다양한 실시양태에서, 당업자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 본 발명 전체에 걸쳐 인용된 PAC-1 및 제2 활성제(들)의 농도는 또한 인용되고 예를 들어, 본 명세서에 언급된 농도를 제2 활성제(들)에 대한 PAC-1의 상응하는 몰비로 전환함으로써 제2 활성제에 대한 PAC-1의 비(ratio)로서 해석될 수 있다.
여러 다른 실시양태에서, 상기 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 교모세포종, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 수막종, 다발성 골수종, 난소암, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 또는 갑상선암; 여기서 유방암은 선택적으로 삼중 음성 유방암이고, 폐암은 선택적으로 비-소세포 폐암이고, 신장암은 선택적으로 전이성 신세포 암종이다,
일부 다양한 실시양태에서, 화합물 PAC-1 및 제2 활성제는 대상체에게 동시에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 화합물 PAC-1 및 제2 활성제는 대상체에게 순차적으로 투여된다. 추가 실시양태에서, 화합물 PAC-1은 제2 활성제 전에 대상체에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 화합물 PAC-1은 제2 활성제 후에 대상체에게 투여된다.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 의약을 제조하기 위한 조성물을 제공한다:
(a) 화합물 PAC-1;
(b) 체크포인트 억제제, 암 백신, 대사 조절제, 대식세포 억제제, 또는 면역 자극제 또는 조절제인 적어도 하나의 제2 활성제; 및
(c) 임의로 제약상 허용되는 희석제, 부형제, 담체 또는 이들의 조합; 이로써 암이 치료된다.
추가 실시양태에서, PAC-1의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 500 μM이고 제2 활성제의 농도는 약 1 nM 내지 약 1000 μM이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 제2 활성제는 아테졸리무맙, 아벨루맙, 베바시주맙, 더발루맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 트레멜리무맙, 우레루맙, 우토밀루맙, 또는 이들의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 림프종, 흑색종, 백혈병, 다발성 골수종, 교모세포종, 췌장암, 간암, 비-소세포 폐암, 유방암, 난소암, 결장암, 골육종 또는 수막종이다.
다양한 실시양태에서, 화합물 PAC-1 및 제2 활성제는 1일 1회(q.d), 1일 2회(b.i.d), 1일 3회(t.i.d), 또는 1일 4회(q.i.d) 대상체에게 투여되고, 여기서 PAC-1의 1일 총 투여 용량은 약 1 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 125 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 250 mg/kg이다. 다른 실시양태에서, PAC-1(또는 제2 활성제)의 각각의 투여 용량은 약 10 mg, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 60 mg, 약 70 mg, 약 75 mg, 약 175 mg, 약 250 mg, 약 375 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 625 mg, 약 750 mg, 약 1000 mg, 또는 약 10 mg 내지 약 2000 mg이다. 추가 실시양태에서, PAC-1(또는 제2 활성제)의 각각의 투여 용량은 약 50 mg/m2 내지 약 250 mg/m2, 또는 약 10 mg/m2 내지 약 500 mg/m2이다. 일부 다른 실시양태에서, 제2 활성제의 1일 총 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 5 mg/kg 내지 약 150 mg/kg이다.
일부 실시양태에서, 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여되는 조성물은 PAC-1 및 알파-PD-1을 포함하며, 여기서 투여되는 PAC-1의 양은 약 100 mg/kg 내지 약 150 mg/kg(또는 약 125 mg/kg)이고, 투여되는 알파-PD-1의 양은 약 150마이크로그램 내지 약 250마이크로그램(또는 약 200마이크로그램)이고; 다양한 실시양태에서, 환자의 생존은 대조군과 비교하여 연장된다.
본 개시는 부피, 질량, 백분율, 비율 등과 같은 변수에 대한 범위, 한계 및 편차를 제공한다. "숫자1" 내지 "숫자2"와 같은 범위가 정수와 분수를 포함하는 숫자의 연속 범위. 예를 들어, 1에서 10은 1, 2, 3, 4, 5, … 9, 10을 의미하고, 또한 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, …, 9.8, 9.9, 10.0 및 1.01, 1.02, 1.03 등도 의미한다. 공개된 변수가 "숫자 10"보다 작은 숫자인 경우 위에서 논의한 바와 같이 숫자 10 미만의 정수 및 소수를 포함하는 연속 범위를 의미한다. 마찬가지로 공개된 변수가 "숫자 10"보다 큰 숫자인 경우 숫자 10보다 큰 정수 및 분수를 포함하는 연속 범위를 의미한다. 이러한 범위는 "약"이라는 용어에 의해 수정될 수 있으며, 그 의미는 위에 설명되어 있다.
결과 및 논의
체크포인트 억제제를 포함하는 면역요법은 일부 암 환자에서 지속적인 반응을 유도할 수 있는 능력으로 특정 암(예: 흑색종, NSCLC, 요로상피)에 대한 효과적인 치료법이 되었다. 현재 면역 관문 억제제와 소분자 약물과 관련된 수십 가지의 복합 시험이 진행 중이다. 직접적인 프로카스파제-3 활성화가 핵심 DNA 불일치 복구 단백질 MLH1의 절단을 향상시켜 T 세포에 의해 표적화된 잠재적인 신생항원의 증가를 초래함으로써 면역 체크포인트 억제제의 효능을 극적으로 향상시킨다는 기계론적 가설이 본 발명에 기재된 바와 같이 탐구되었다.
접근의 배경. 면역 관문 억제제와 관련된 면역 요법의 상당한 가능성은 낮은 비율의 응답자와 많은 임상 시험의 실패로 인해 누그러졌다. 최근의 중요한 진전은 종양 형성의 기원에 관계없이 PD-1 억제(펨브롤리주맙 사용)의 임상 효능에 대한 바이오마커로서 DNA 미세위성 불안정성(MSI)의 임상 승인이었다. 이 승인은 dMMR/MSI가 있는 종양이 100~1000개의 체세포 돌연변이(MMR 능숙 암보다 10배 높으며, 도 1A), 아마도 신생항원의 수준을 높이고 T 세포 침윤을 향상시킨다. 그러나 dMMR/MSI는 모든 암의 낮은 비율, 아마도 10% 미만에서만 존재한다. 산발적인 MSI는 MLH1 프로모터의 후성 유전적 침묵에 의해 구동되며, MLH1 침묵은 일반적으로 MMR 결핍의 마커로 사용된다. MLH1 침묵과 체세포 돌연변이 수 사이의 상관관계는 여러 연구에서 입증되었으며 도 1에 강력하게 표시되어 있다.
암세포에서 선택적으로 유도된 MSI는 면역 관문 억제제(예: PD-1 및 CTLA-4를 표적으로 함)에 대한 환자의 반응을 상당히 높임. 도발적으로, 여러 대규모 proteomic 연구에서 MLH1이 카스파제-3의 상위 기질이며 6시간 후에 0%의 단백질이 남아 있음이 밝혀졌다(동일 시점에 70%가 남아 있는 MEK1/2와 비교). 또한, MLH1은 다른 활성 카스파아제(즉, 카스파아제-1,2,6,7,8)에서 단백질 분해가 관찰되지 않는 활성 카스파아제-3의 기질일 뿐이다. 이 데이터는 종양에서 PC-3의 선택적 활성화가 MLH1의 정량적 절단을 유도하여 dMMR/MSI를 생성하여 면역 관문 억제제의 효능을 현저하게 증가시킬 수 있음을 시사하고, 도 2에 개략적으로 설명되어 있다.
작동의 메커니즘. 본 발명은 PAC-1이 암에서 MLH1 절단을 선택적으로 유도하여 면역 체크포인트 억제제를 사용한 치료에 더 민감하게 만드는 데 사용될 수 있음을 보여준다(도 2). 또한, PAC-1 처리는 스트레스 반응을 유도하여 종양 미세 환경을 변경하여 면역 염증의 정도를 증가시킨다. 이러한 결과는 훨씬 더 많은 암 환자에게 면역 요법의 힘(극적이고 지속적인 반응)을 가져온다. 요약하면, 카스파제-3에 의한 MLH1 절단 및 불활성화는 선천적 면역계를 작동시키고 면역원성이 될 점 돌연변이 및 삽입결실(신규 오픈 리딩 프레임에서 유래된 신행항원으로)을 유도한다. 따라서 이 화학적으로 유도된 MLH1 분해는 항암 면역 반응을 향상시킨다.
결과. 결장암 세포주의 MSS/MSI 상태가 보고되어(Ahmed, D., et al., Oncogenesis 2013, 2, e71), MSS 결장암 세포주인 HT-29를 선택할 수 있다. 지금까지 MLH1의 절단에 초점을 맞춘 연구는 높은 수준의 세포자멸사 세포사를 광범위하게 유도하는 전략을 활용했다(즉, 스타우로스포린 사용). HT-29 세포를 준치사 수준의 PAC-1로 처리하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, HT-29 세포의 PAC-1 처리는 PC-3 활성화 및 MLH1 절단을 유도했지만 이러한 시간 및 농도에서 PARP-1 절단은 거의 또는 전혀 유도하지 않았다. 이 결과는 MLH1이 카스파제-3의 뛰어난 기질임을 더욱 입증한다. 중요한 것은 이 실험에 사용된 PAC-1의 농도가 몇 주 동안 인간 암 환자에서 지속 가능하다는 것이다(450mg에서, Cmin=3.2μM, Cmax=7.8μM).
또한 단일 제제 PAC-1이 TIL(CD3+ 세포)의 수를 증가시킨다는 것을 보여주는 동계 GL261 및 B16F10 마우스 모델에서의 실험을 수행했다(도 4).
PAC-1에 대한 많은 데이터는 생체 내에서 암을 유발하지 않는다는 것을 시사한다. 이것은 a) 암에 걸린 애완견의 치료, 그 중 일부는 PAC-1로 6개월 이상 치료를 받았고 치료 완료 후 12개월 이상 2차 악성 종양이 없는 상태로 남아 있음, b) 84일 연속 치료견 연구를 포함하여 쥐와 연구견에서 상세한 IND 독성 연구, c) 인간 임상 시험의 데이터를 통해 확인되었다. 여러 환자가 2개월 시험 기간을 초과하여 PAC-1을 복용했으며 2명은 10개월 이상(한 명은 매일 450mg) 복용했지만 부작용은 없었다. 암 약물은 2차 암을 유발할 수 있다. 예를 들어, 단일 제제 vemurafenib으로 치료받은 환자의 거의 1/3에서 2차 악성 종양이 발생한다. 그러나 현재까지 이것은 PAC-1에서 관찰되지 않았다. PAC-1이 암세포에서 선택적으로 PC-3 절단을 유도하는 것처럼, 결과적인 카스파제-3 활성은 암세포에서 선택적 MLH1 절단을 유도해야 한다. 체질적 불일치 복구 결핍(constitutional mismatch repair deficiency, CMMRD) 암 경향이 있는 증후군인 Turcot 증후군은 MMR 유전자의 이대립형 생식계열 돌연변이와 상관관계가 있어 어린 나이에 GBM이 발병한다는 점은 주목할 가치가 있다. Turcot 증후군 및 기타 CMMRD 증후군(즉, 린치 증후군)은 MMR 단백질 기능 유지의 중요성을 지적하며, 이는 비표적, 범유기체 방식으로 MLH1 절단/손실을 유도하는 것이 실행 가능한 치료 전략이 아님을 의미한다. 그러나 PAC-1을 사용한 전략은 암세포(GBM 포함)에서 PC-3의 잘 알려진 과발현을 활용하여 종양에서 표적화된 MLH1 절단을 일으켜 정상 세포의 MMR 단백질이 교란되지 않고 작동하도록 한다.
약학적 제형
본원에 기재된 화합물은 예를 들어, 화합물을 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체와 배합함으로써 치료용 약학 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 화합물은 염 또는 용매화물 형태로 담체에 첨가될 수있다. 예를 들어, 화합물이 안정한 비독성 산 또는 염기 염을 형성하기에 충분히 염기성 또는 산성인 경우, 화합물을 염으로서 투여하는 것이 적절할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 생리적으로 허용 가능한 음이온, 예를 들어 토실레이트, 메탄설포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트 및 β-글리세로포스페이트를 형성하는 산으로 형성된 유기산 부가 염이다. 히드로클로라이드, 할라이드, 설페이트, 질산염, 중탄산염 및 카보네이트 염을 포함하는 적합한 무기 염이 또한 형성될 수 있다.
제약상 허용되는 염은 당업계에 잘 알려진 표준 절차, 예를 들어 아민과 같은 충분히 염기성인 화합물을 적합한 산과 반응시켜 생리학적으로 허용되는 이온 성 화합물을 제공함으로써 얻을 수 있다. 카르복실산의 알칼리 금속(예를 들어, 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속(예를 들어, 칼슘) 염도 유사한 방법에 의해 제조될 수있다.
본원에 기재된 화학식의 화합물은 약제학적 조성물로서 제형화되고 다양한 형태로 인간 환자와 같은 포유 동물 숙주에 투여될 수있다. 상기 형태는 정맥 내, 근육 내, 국소 또는 피하 경로에 의해 선택된 투여 경로, 예를 들어 경구 또는 비경구 투여에 특히 적합할 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 약제학적으로 허용되는 비히클, 예컨대 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 전신 투여될 수 있다. 경구 투여를 위해, 화합물은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입되거나, 정제로 압축되거나, 또는 환자의식이의 음식에 직접 혼입될 수 있다. 화합물은 또한 하나 이상의 부형제와 조합되어 섭취 가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁액제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 전형적으로 0.1 % 이상의 활성 화합물을 함유한다. 조성물 및 제제의 백분율은 다양할 수 있으며, 주어진 단위 투여 형태의 중량의 약 0.5 % 내지 약 60 %, 약 1 % 내지 약 25 %, 또는 약 2 % 내지 약 10 %일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물의 양은 효과적인 투여량 수준을 얻을 수 있는 양일 수 있다.
정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 또한 다음 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 트라가칸스 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 및 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제. 자당, 과당, 락토스 또는 아스파탐과 같은 감미제; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일, 또는 체리 향료가 첨가될 수 있다. 단위 투여 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로 존재할 수 있거나 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 달리 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 셸락 또는 설탕 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물과, 감미제로서 자당 또는 과당, 방부제로서 메틸 및 프로필 파라벤, 염료 및 향미제, 예컨대 체리 또는 오렌지 향료를 함유할 수 있다. 임의의 단위 투여 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 사용되는 양으로 약제학적으로 허용되고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및 장치에 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 주입 또는 주사에 의해 정맥 내 또는 복강 내 투여될 수 있다. 활성 화합물 또는 이의 염의 용액은 물에서 제조될 수 있고, 임의로 비독성 계면 활성제와 혼합될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 또는 이들의 혼합물 또는 제약상 허용되는 오일로 제 될 수 있다. 통상적 인 저장 및 사용 조건 하에서, 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유할 수 있다.
주사 또는 주입에 적합한 제약 투여 형태는 임의로 멸균된 주사용 또는 불용성 용액 또는 분산액, 즉 리포좀에 캡슐화된 분산액의 즉시 제조에 적합한 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액, 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 최종 투약 형태는 제조 및 보관 조건 하에서 멸균되고 유동적이어야 하며 안정해야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 리포좀의 형성, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 또는 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및/또는 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직 할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및/또는 젤라틴에 의해 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입시키고,이어서 임의로 필터 멸균함으로써 제조할 수 있다. 멸균 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술을 포함할 수 있으며, 이는 활성 성분의 분말 및 용액에 존재하는 임의의 추가의 원하는 성분을 생성한다.
국소 투여를 위해, 화합물은 예를 들어 액체일 때 순수한 형태로 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 활성제를 예를 들어 피부학적으로 허용되는 담체와 조합하여 조성물 또는 제제로서 피부에 고체, 액체, 겔 등일 수 있는 것이 바람직하다.
유용한 고체 담체는 활석, 점토, 미세결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등과 같은 미분된 고체를 포함한다. 유용한 액체 담체는 물, 디메틸설폭사이드 (DMSO), 알코올, 글리콜 또는 수-알코올/글리콜 블렌드를 포함하고, 여기서 화합물은 임의로 비독성 계면 활성제의 도움으로 효과적인 수준으로 용해 또는 분산될 수 있다. 향료 및 추가의 항균제와 같은 보조제를 첨가하여 주어진 용도에 대한 특성을 최적화할 수 있다. 생성된 액체 조성물은 흡수성 패드로부터 도포될 수 있고, 붕대 및 다른 드레싱을 함침시키는데 사용되거나, 펌프형 또는 에어로졸 분무기를 사용하여 영향을 받는 영역에 분무될 수 있다.
합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알코올, 변성 셀룰로오스 또는 변성 미네랄 물질과 같은 증점제가 액체 담체와 함께 사용되어 사용자의 피부에 직접 도포할 수 있는 확산성 페이스트, 겔, 연고, 비누 등을 형성할 수도 있다.
활성제를 피부에 전달하기 위한 피부학적 조성물의 예는 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 미국 특허 번호 4,992,478(Geria), 4,820,508 (Wortzman), 4,608,392 (Jacquet 등) 및 4,559,157 (Smith 등)을 참조. 이러한 피부학적 조성물은 본원에 기재된 화합물과 조합하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물의 성분은 임의로 본원에 기재된 화합물로 대체될 수 있거나, 본원에 기재된 화합물이 조성물에 첨가될 수있다.
본원에 기재된 조성물의 유용한 투여량은 동물 모델에서 이들의 시험 관내 활성 및 생체 내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 동물에서 유효량을 인간에게 외삽하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 미국 특허 제 4,938,949 호 (Borch et al.)를 참조한다. 치료에 사용하기 위해 요구되는 화합물 또는 그의 활성 염 또는 유도체의 양은 선택된 특정 화합물 또는 염뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 질병의 성질, 및 연령 및 환자의 상태, 그리고 궁극적으로 참여 의사 또는 임상의의 재량에 따른다.
그러나, 일반적으로, 적절한 투여 량은 일일 체중 약 0.5 내지 약 100 mg/kg, 예를 들어 약 kg 당 3 내지 약 50 mg/일일 수용자의 체중과 같은 약 10 내지 약 75 mg /kg/일의 범위일 것이다. 바람직하게는 6 내지 90 mg/kg/일, 가장 바람직하게는 15 내지 60 mg/kg/일일 것이다.
화합물은 단위 투여 형태로 편리하게 제제화되고; 예를 들어, 단위 투여 형태 당 5 내지 1000 mg, 편리하게 10 내지 750 mg, 가장 편리하게는 50 내지 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 일 구현 예에서, 본 발명은 이러한 단위 투여 형태로 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 화합물은 예를 들어 단위 투여 형태 당 5 내지 1000 mg/m2, 편리하게 10 내지 750 mg/m2, 가장 편리하게는 50 내지 500 mg/m2의 활성 성분을 함유하는 단위 투여 형태로 편리하게 투여될 수 있다. 원하는 용량은 단일 간격으로 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 하루에 2, 3, 4 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여되는 분할 용량으로 편리하게 제공될 수 있다. 서브-투여량 자체는 예를 들어, 다수의 분리된 느슨하게 이격된 투여로 추가로 분할될 수 있다.
원하는 용량은 단일 용량으로 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 하루에 2, 3, 4 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여되는 분할 용량으로 편리하게 제공될 수 있다. 하위 용량 자체는 예를 들어 여러 개의 개별적인 느슨한 간격의 투여로 더 나눌 수 있다;예를 들어 취입기에서 여러 번 흡입하거나 눈에 여러 방울을 떨어뜨림.
본원에 기재된 화합물은 효과적인 항종양제일 수 있고 면역요법 단독 또는 다른 암 치료와 비교하여 더 높은 효능 및/또는 감소된 독성을 가질 수 있다.
본 발명은 포유 동물에서 암을 치료하기 위한 본원에 기재된 치료 방법을 제공하는데, 이는 암을 갖는 포유 동물에게 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 포유 동물은 영장류, 인간, 설치류, 개, 고양이, 소, 양, 말, 돼지, 염소, 소 등을 포함한다. 암은 임의의 다양한 유형의 악성 종양, 예를 들어 폐암, 유방암, 흑색종 및 백혈병을 지칭하고, 일반적으로 바람직하지 않은 세포 증식, 예를 들어 조절되지 않은 성장, 분화 부족, 국소 조직 침습 및 전이를 특징으로 한다.
암을 치료하는 본 발명의 화합물의 능력은 당업계에 잘 알려진 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 치료 프로토콜의 설계, 독성 평가, 데이터 분석, 종양 세포 사멸의 정량화 및 이식 가능한 종양 스크린 사용의 생물학적 중요성이 알려져 있다. 또한 암을 치료하는 화합물의 능력은 하기 기재된 테스트를 사용하여 결정될 수 있다.
하기 실시 예는 상기 발명을 설명하기 위한 것이며 그 범위를 좁히는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 실시 예가 본 발명이 실시될 수 있는 많은 다른 방식을 제안한다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 본 발명의 범위 내에서 수많은 변형 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1. 4T1 효능 모델에 대한 실험 절차.
시약. 다음 항체는 Bio X Cell에서 구입했다: 항-마우스 CTLA-4 단일클론 항체(9H10), 항-마우스 PD-1 단일클론 항체(RMP1-14), 랫트 IgG2a 이소타입 대조군(2A3) 및 다클론 시리아 햄스터 IgG.
세포주. 4T1 뮤린 유방암 세포주는 ATCC에서 얻었고 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 10% FBS, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 완전한 RPMI1640에서 배양했다.
4T1 동소(orthotopic) 종양 모델. 모든 실험 절차는 일리노이 대학교 어바나 샴페인의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River에서 구입하여 7일 동안 적응시켰다. 마우스는 자일라진(16mg/kg) 및 케타민(100mg/kg) i.p.로 가볍게 진정되었다. 진정 후, 냉각된 HBSS(1천만 세포/mL)의 100μL 4T1 세포를 마우스의 오른쪽 두 번째 유선에 주입했다. 일주일 후에 동소 성장 종양이 확립되었니다. 4T1 세포 접종 12일 후, 종양 보유 마우스를 4개의 처리 그룹으로 무작위화하였다: 비히클 + 이소타입, 비히클 + 항-PD-1/항-CTLA-4, PAC-1 + 이소타입, PAC-1 + 항-PD-1 /항-CTLA-4(n=6). PAC-1은 HPβCD(pH 5.5에서 200mg/mL HPβCD 중 10mg/mL)로 제형화되었다.
모든 항체를 멸균 PBS(pH 7.0)에서 적절한 농도로 희석하였다. 비히클 또는 100 mg/kg PAC-1을 3주 동안 연속 5일 동안 복강 내 투여했다. 이소타입 또는 10mg/kg 항-PD-1 + 10mg/kg 항-CTLA-4 항체를 종양 이식 후 13일, 16일, 20일 및 23일에 PAC-1 후 4시간에 복강내 투여했다. 종양 측정은 캘리퍼스를 사용하여 2일 또는 3일마다 수행하고 방정식(0.5 x l x w 2 )을 사용하여 종양 부피를 계산했다. 4T1 세포 접종 후 30일째에 마우스를 희생시켰다. 그런 다음 종양을 절제하고 질량을 측정했다. 모든 통계 분석은 p 값 < 0.05인 쌍을 이루지 않은 양측 학생 t 테스트를 사용하여 수행되었으며 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다(도 6 참조).
실시예 2. 종양 연구.
PAC-1 처리된 GL261 종양에서 증가된 면역 세포 침윤. PAC-1이 암세포에서 MLH1의 카스파제-3 매개 절단을 유도한다는 것을 보여주는 데이터 외에도 PAC-1과 면역치료 전략(관문 억제제 및 신생항원 백신 포함)의 상승적 조합을 뒷받침하는 많은 다른 증거가 있다.: 1) PAC-1을 처리한 암세포의 전사체 프로파일은 TNFα, 선천면역 작용제 IL-1β, 및 IL-8을 포함한 주요 유전자의 상향조절을 보여주며, 항PD-1 치료에 대한 내성과 관련된 마커(IPRES: 예를 들어 CCL2, CCL7, CCL8, CCL13 및 기타)의 상향조절은 없다는 것을 보여준다 . 2) 다른 그룹의 연구는 PAC-1이 면역 사이토카인 TRAIL과의 조합 연구를 통해 배양에서 외부 세포 사멸을 향상시킬 수 있음을 보여준다. 3) PAC-1은 동계 마우스(EL4, K7M2, GL261)(그림 7) 및 쥐(9L) 모델 및 개 암 환자를 포함하여 온전한 면역 시스템이 있는 생체 내 설정에서 효과적이다. 4) MD Anderson의 Gandhi 그룹(Blood 2015, 125, 1126)은 PAC-1과 그 유도체가 PMBC에 대해 최소한의 독성을 가지고 있음을 보여주었다. 5) PAC-1은 IND를 가능하게 하는 쥐 및 개 연구에서 매우 높은 용량으로 사용된 경우에도 골수억제(쥐, 쥐, 개 또는 인간에서)를 유도하는 것으로 관찰되지 않았다. 6) PAC-1은 암세포에서 선택적으로 DNA 손상을 일으키며, 카스파제-3 활성화를 보여주는 추가 검증 연구는 상당한 게놈 불안정성을 유발할 수 있다. 면역 반응을 자극하기 위한 PAC-1의 잠재력을 탐색하기 위한 시작으로, 단일 제제 PAC-1이 TIL(CD3+ 세포)의 수를 증가시킨다는 것을 보여주는 동계 GL261 마우스 모델 실험이 수행되었다(도 4).
개 신경교종에서 면역 체크포인트의 관련성. 최근 조사에서 다양한 개 종양 유형에서 PD-L1의 발현이 확인되었다. 그러나 개 신경교 종양에서 PD-L1을 기술한 발표된 연구는 없다. 보관된 개 신경교종 종양을 사용하여 상업용 마우스 단일클론 항-인간 PD-L1 항체(Abcam, 클론 ABM4E54)의 교차 반응성이 검증되었으며(도 5), PD-L1이 종양의 75%에서 발현된다는 것이 입증되었다.; 이 빈도는 PD-L1이 원발성 및 재발성 샘플의 각각 88% 및 72%에서 확인된 인간 GBM과 유사하다. PD-L1 외에도 항체는 인간 및 개 신경아교종 세포주에서 핵 표적인 MLH1과 교차 반응하는 것으로 검증되었으며 PAC-1 요법을 수반하는 MLH1 절단을 정량적으로 평가할 수 있다.
실시예 3. 동계 결장암 모델(CT-26 세포)에서 PAC-1 및 면역요법.
도 8은 BALB/c 마우스에서 CT-26 WT 피하 질환 모델의 발달을 예시한다. 0일에 BALB/c 마우스에 1x106 CT-26_WT 세포를 피하 주사했다. 다양한 날짜 간격으로 선택된 마우스에 표 1에 나타낸 바와 같이 빈 비히클, PAC-1(100mg/kg), 항-PD-1 항체(10mg/kg; 2회 용량), 항-PD-1 항체( 10 mg/kg; 4회 용량), 또는 PAC-1(100 mg/kg) 및 항-PD-1 항체(10 mg/kg;)의 조합을 주사(i.p.)하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
표 1은 BALB/c 마우스의 치료 프로토콜.
도 9는 단일 제제인 PAC-1이 BALB/c 마우스에서 sc CT-26_WT 성장을 제어하는 곳에서 큰 변동을 나타냄을 보여준다. 또한, PAC-1 및 항-PD-1 mAb의 조합은 비히클 + 항-IgG 대조군과 비교하여 BALB/c 마우스에서 CT-26_WT의 성장을 유의하게 감소시켰다. 도 10은 대조군 마우스(빈 비히클 + 항-IgG 항체로 주사됨)와 비교하여 BALB/c 마우스에서 PAC-1 및 항-PD-1 단일클론 항체(mAb)의 조합은 CT-26_WT 세포의 성장을 감소신 것을 예시한다. 이 병용 요법에서 PAC-1의 상대적 기여는 항-PD-1 mAb의 용량이 4회 용량에서 2회 용량으로 감소될 때 훨씬 더 두드러진다. 이 실험은 14일과 21일이 TIL 분석을 수행하기에 좋은 시점임을 나타낸다.
도 11은 BALB/c mince에서 CT-26_TdTomato 피하 종양 모델의 개발을 예시한다. 마우스의 뒷 옆구리에 1x106 CT-26_TdTomato 세포를 피하 접종했다. 접종 후 10일(종양 부피 ~150mm3), 마우스에 다음 처리를 제공했다.
그룹 1: 3마리의 마우스 - 비히클 + 쥐 IgG 이소타입 mAb(10mg/kg)
그룹 2: 마우스 3마리 - PAC-1(125mg/kg) + 쥐 IgG 이소타입 mAb(10mg/kg)
그룹 3: 마우스 3마리 - 비히클 + 항-PD1 mAb(10mg/kg)
그룹 4: 마우스 3마리 - PAC-1(125mg/kg) + 항-PD1 mAb(10mg/kg)
그룹 4의 BALB/C 마우스(PAC-1 + 항-PD1 mAb)는 5일의 연속 PAC-1 처리 및 항-PD1의 2x 투여 후에 CT-26-TdT를 거부할 수 있었다. 47일째에 쥐는 여전히 종양이 없는 것처럼 보인다. 항-PD1 처리군은 항-PD1 mAb를 3회 주사한 후 종양을 제거할 수 있었다. 47일째에 마우스는 여전히 종양이 없는 것처럼 보인다. 47일에 여전히 종양이 없는 마우스에 1x106 CT-26_TdTomato 세포로 재공격했다. 재시험처리 후 종양 부피의 유의한 증가는 관찰되지 않았다.
도 12A는 PAC-1이 면역원성이라는 것을 나타내고 대식세포 분화 뿐만 아니라 B-세포 및 T-세포 증식을 촉진하는 사이토카인의 증가를 유도함을 나타내는 사이토카인 어레이를 예시한다. 도 12B에 도시된 바와 같이, ~100ul 혈액이 헤파린 처리된 바이알에서 안와후 혈액 추출을 통해 수집되었다. 백혈구를 8000g에서 10분 동안 원심분리하고 혈장/섭취물을 새 튜브로 옮겼다. 사이토카인 어레이는 2-3마리의 마우스에서 수집된 샘플을 사용하여 4개 그룹에서 수행되었다.
비종양성 + 비히클
비종양성 + PAC-1(x5회 투여)
종양 보유 + 비히클
종양 보유 + PAC-1(x5 용량)
ImageJ를 사용하여 신호를 정량화했다. 플롯에 표시된 대로 PAC-1/비히클 평균 픽셀 밀도의 비율을 계산하여 데이터를 정규화했다.
도 13은 종양 공격 후 14일째에 호중구 및 대식세포가 PAC-1 처리 후 폐 종양 미세환경에서 증가하는 것으로 보인다는 것을 예시한다. 26일째에 종양 미세 환경에서 대식세포와 수지상 세포의 개체수가 감소했다.
도 14는 PAC-1 및 항-PD-1 병용 처리 후 26일째에 폐 종양 미세환경에서 CD4+ Th 세포 증가를 예시한다. 폐에서 FoxP3+ Tregs의 비율은 병용 치료 그룹에서 가장 낮았다.
도 15는 수지상 세포 및 CD45-(종양) 세포에서의 PD-L1 발현이 종양 공격 후 26일에 증가하고 T 세포 고갈에 기여했을 수 있음을 보여준다.
실시예 4. 동계 결장암 모델(MC-38 세포)에서 PAC-1 및 면역요법.
도 16은 C57BL/6 마우스에서의 MC-38 전이 모델의 발달 및 항-PD-1 항체와 조합된 PAC-1로의 치료를 예시한다. MC-38 세포를 꼬리 정맥을 통해 1x106 세포/마우스로 주사했다. PAC-1은 MC38 주사 후 23일 동안 100mg/kg을 주사하고(i.p.) 항PD-1을 10mg/kg으로 주사했다(i.p.). PAC-1/항-PD-1 치료의 조합으로 주사된 마우스의 체중은 약 24일째에 시작하여 32일째까지 상당한 체중 회복을 나타내었다.
도 17은 MC-38 세포로 챌린지된 후 빈 비히클 대조군, PAC-1, 항-PD-1 항체, 또는 PAC-1 및 항-PD-1 항체의 조합으로 주사된 후 마우스의 생존 곡선을 예시한다. 이들 결과는 PAC-1 및 항-PD-1 항체 모두를 주사한 마우스에 대해 약 32일 후 꾸준한 생존 확률을 입증한다.
실시예 5. 약제학적 투여 형태.
하기 제제는 본원에 기재된 조합 화합물, 예를 들어 PAC-1 및 제 2 활성제의 치료 또는 예방 투여에 사용될 수 있는 대표적인 제약 투여 형태, 또는 그의 제약 상 허용되는 염 또는 용매화물(이하, 하나의 활성제 또는 두 개의 활성제의 조합일 수 있는 '조성물 X') :
(i) 정제 1 mg / 정
'조성물 X' 100.0
유당 77.5
포비돈 15.0
크로스카르멜로스 나트륨 12.0
미정질 셀룰로오스 92.5
스테아르산 마그네슘 3.0
300.0
(ii) 정제 2 mg/정
'조성물 X' 20.0
미정질 셀룰로오스 410.0
전분 50.0
나트륨 전분 글리콜레이트 15.0
스테아르산 마그네슘 5.0
500.0
(iii) 캡슐 mg/캡슐
'조성물 X' 10.0
콜로이드 이산화 규소 1.5
유당 465.5
전호화된 전분 120.0
스테아르산 마그네슘 3.0
600.0
(iv) 주사제 1(1 mg/mL) mg/mL
'조성물 X'(유리 산 형태) 1.0
이염기성 인산 나트륨 12.0
일 염기성 인산 나트륨 0.7
염화나트륨 4.5
1.0 N 수산화 나트륨 용액 q.s.
(7.0-7.5로 pH 조정)
주사제용 물 1 mL로 맞추는 양
(v) 주사제 2(10 mg/mL) mg/mL
'조성물 X'(유리 산 형태) 10.0
일 염기성 인산 나트륨 0.3
이염기성 인산 나트륨 1.1
폴리에틸렌 글리콜 400 200.0
0.1N 수산화 나트륨 용액 q.s.
(7.0-7.5로 pH 조정)
주사제용 물 1 mL로 맞추는 양
(vi) 에어로졸 mg/캔
'조성물 X' 20
올레산 10
트리클로로모노플루오로메탄 5,000
디클로로디플루오로메탄 10,000
디클로로테트라플루오로에탄 5,000
(vii) 국소용 겔 1 중량 %
'조성물 X' 5 %
카보머 934 1.25 %
트리에탄올아민 q.s.
(5-7 로의 pH 조정)
메틸 파라벤 0.2 %
정제수 100g까지
(viii) 국소용 겔 2 중량 %
'조성물 X' 5 %
메틸셀룰로오스 2 %
메틸 파라벤 0.2 %
프로필 파라벤 0.02 %
정제수 100g까지
(ix) 국소용 연고 중량 %
'조성물 X' 5 %
프로필렌 글리콜 1 %
무수 연고베이스 40 %
폴리소르베이트 80 2 %
메틸 파라벤 0.2 %
정제수 100g까지
(x) 국소용 크림 1 중량 %
'조성물 X' 5 %
흰 꿀벌 왁스 10 %
액체 파라핀 30 %
벤질 알코올 5 %
정제수 100g까지
(xi) 국소용 크림 2 중량 %
'조성물 X' 5 %
스테아르 산 10 %
글리세릴 모노스테아레이트 3 %
폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르 3 %
소르비톨 5 %
이소프로필 팔미테이트 2 %
메틸 파라벤 0.2 %
정제수 100g까지
이들 제형는 약학 분야에 잘 알려진 통상적인 절차에 의해 제조될 수 있다. 상기 제약 조성물은 상이한 양 및 유형의 활성 성분 '화합물 X'를 수용하기 위해 공지된 제약 기술에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 에어로졸 제제 (vi)는 표준 계량량 에어로졸 분배기와 함께 사용될 수 있다. 또한, 특정 성분 및 비율은 예시 목적을 위한 것이다. 성분은 적합한 당량으로 교환될 수 있고, 관심있는 투여 형태의 원하는 특성에 따라 비율이 변할 수 있다.
특정 실시 예가 개시된 실시 예 및 예를 참조하여 위에서 설명되었지만, 이러한 실시 예는 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 다음의 청구 범위에 정의된 바와 같이 보다 넓은 측면에서 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에 따라 변경 및 수정이 이루어질 수 있다.
모든 간행물, 특허 및 특허 문헌은 개별적으로 참조로 포함된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 본 개시 내용과 일치하지 않는 제한은 이로부터 이해되지 않아야한다. 본 발명은 다양한 구체적이고 바람직한 실시 예 및 기술을 참조하여 설명되었다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 많은 변형 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.

Claims (26)

  1. (a) 프로카스파제-3 활성화제;
    (b) 하나 이상의 제2 활성제, 여기서 상기 제2 활성제는 체크포인트 억제제, 암 백신, 대사 조절제, 대식세포 억제제, 또는 면역 자극제 또는 조절제; 및
    (c) 선택적으로 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로카스파제-3 활성화제는 PAC-1인 조성물:
    Figure pct00005

    (PAC-1).
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 활성제가 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 효과를 갖고 PAC-1이 상가(additive) 효과보다 더 큰 양만큼 제2 활성제의 효과를 향상시키고, 여기서 PAC-1이 두 번째 활성제에 대한 암 세포의 취약성을 프라이밍하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 활성제가 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제(IDO), 아데노신 A2A 수용체(A2AR), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR-4), C-C 케모카인 수용체 유형 4(CCR4), 종양 괴사 인자 수용체(CD27), 인터루킨-2 수용체 서브유닛 베타(CD122), 사멸 수용체 5(DR5), 세포자멸사 단백질 억제제(IAP), 글루타미나제, 집락 자극 인자 1 수용체(CSF1R), 톨 유사 수용체(TLR), 수지상 세포(DC), 또는 이들의 조합을 조절하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 활성제는 ADXS11-001, ADXS31-142, AMP-224, AMP-514, 아테졸리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 베바시주맙, 세미플리맙, BLZ945, BMS-9365559,66156, BMS9365598, BMS968, CB839, CIMAvax, CMP001, CP870893, CPI-444, CRS207, CV301, DC 백신, DNX2401, DS-8273a, 두르바루맙, 에파카도스타트, FAZ053, FPA008, GDC0919, GSK3174998, GVAX, GWN323, IMCgp100, IMP321, 임프라임 PGG, 인도시미드, 이필리무맙, JTX-2011, LAG525, LCL161, LK-301, LY2157299, LY2510924, LY3022855, MBG453, MEDI0562, MEDI0680, MEDI6469, MEDI9447, MGN1703, 모가물리주맙, MOXR0916, 신생항원 백신, NEO-PV-01, NIS793, 니볼루맙, NKTR-214, PBF509, PDR001, 펨브롤리주맙, 펩타이드 백신, 펙시다르티닙(PLX3397), PF-04518600, PF-3512676, REGN2810, REGN3767, RO7009789, SD101, 타리모겐 라헤르파렙벡, TPIV200/huFR-1, 트레메리무맙, TroVax, TSR022, 우로컵루맙, 우렐루맙, 우토밀루맙, 바르릴루맙, 비아젠푸마투셀-L(HS-110), 또는 이들의 조합인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 활성제가 계획된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 계획된 사멸-리간드 1(PD-L1), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3), 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4 또는 OX40), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리-구성원 9(TNFRSF9 또는 4-1BB), 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련 단백질(GITR), 유도성 T-세포 공동자극제(ICOS), 또는 이들의 조합을 통해 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 체크포인트 억제제인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 체크포인트 억제제가 항-PD-1, 항-CTLA-4, 또는 이들의 조합이고; 여기서 상기 항-PD-1은 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이고, 상기 항-CTLA-4는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙, 또는 이들의 조합인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, PAC-1의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 50 μM이고 제2 활성제의 농도가 약 1 nM 내지 약 100 μM인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하고, 여기서 a) 상기 담체는 물, 완충제, 당, 셀룰로오스, 시클로덱스트린, 디메틸술폭시드, 폴리에틸렌 글리콜, 토코페롤, 리포솜, 미셀, 또는 이들의 조합, 또는 b) 상기 부형제는 결합제, 윤활제, 흡착제, 비히클, 붕해제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 암세포를 선택적으로 표적화하고, 여기서 암세포는 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 교모세포종, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 수막종, 다발성 골수종, 난소암, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 또는 갑상선암의 세포이고;여기서 유방암은 선택적으로 삼중 음성 유방암이고, 폐암은 선택적으로 비-소세포 폐암이고, 신장암은 선택적으로 전이성 신세포 암종인 조성물.
  11. 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물과 암세포를 접촉시켜 암세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것을 포함하는, 암세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 암 세포의 성장 또는 증식이 미스매치-리페어(MMR) 단백질의 억제, 또는 MutL 상동체 1(MLH1) 단백질의 카스파제-3 활성화 매개 분해에 의하여 저해되고;여기서 DNA 미세위성 불안정성(MSI)이 유도되는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 암세포에 접촉시키는 것을 포함하고, 암세포에서 미스매치-리페어(MMR) 단백질을 억제함으로써 아폽토시스를 유도하는 것을 포함하는, 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 MMR 단백질이 MutL 상동체 1(MLH1) 단백질이고, 여기서 프로카스파제-3 활성화제를 통한 카스파제-3 활성화에 의해 매개되는 MLH1 단백질의 분해는 암세포에서 세포자멸사를 유도하는 것인 방법.
  15. 암의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료적 유효량의 프로카스파제-3 활성화제 및 유효량의 제2 활성제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법에서, 여기서 제2 활성제는 면역치료제이고, 여기서 면역치료제의 효과는 프로카스파제-3 활성화제의 투여에 의해 강화되는 치료방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 프로카스파제-3 활성화제는 PAC-1인 방법:
    Figure pct00006

    (PAC-1).
  17. 제16항에 있어서, PAC-1의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 50 μM이고 제2 활성제의 농도가 약 1 nM 내지 약 100 μM인 방법.
  18. 제16항에 있어서, PAC-1의 농도가 약 1 μM 내지 약 10 μM이고, 제2 활성제의 농도가 약 1 nM 내지 약 1 μM이고; 또는 여기서 PAC-1의 1일 총 투여량은 약 10 mg/kg 내지 약 125 mg/kg이고, 제2 활성제의 1일 총 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 제2 활성제가 체크포인트 억제제, 암 백신, 대사 조절제, 대식세포 억제제, 면역 자극제, 또는 조절제; 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 제2 활성제가 아테졸리무맙, 아벨루맙, 베바시주맙, BMS986016, BMS986156, CP870893, 더발루맙, FAZ053, GSK3174998, GWN323, IMP321, 이피리무맙, JTX-2011, LAG525, MBG453, MEDI0562, MEDI0680, MEDI6469, MOXR0916, 니볼루맙, PDR001, 펨브롤리주맙, PF-04518600, REGN2810, REGN3767, RO7009789, 트레멜리무맙, TSR022, 우렐루맙, 우토밀루맙, 또는 이들의 조합인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 면역치료제가 체크포인트 억제제이고, 상기 체크포인트 억제제가 프로그램된 세포사멸 단백질 1(PD-1), 프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3), 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4) 또는 OX40), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리-구성원 9(TNFRSF9 또는 4-1BB), 글루코코르티코이드 유도 TNFR 관련 단백질(GITR), 유도성 T-세포 공동자극제(ICOS), 또는 이들의 조합을 통해 면역 반응을 조절하는 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 프로카스파제-3 활성화제가 미스매치-리페어(MMR) 단백질을 억제하고;
    여기서 상기 MMR 단백질은 MutL 상동체 1(MLH1) 단백질을 포함하고, 여기서 프로카스파제-3 활성화제를 통한 카스파제-3 활성화에 의해 매개되는 MMR 단백질의 분해는 MMR 단백질의 결핍, DNA 미세부수체 불안정성(MSI), 신생항원 발현, 또는 이들의 조합을 통해 유도되어 면역치료제의 효과를 향상시키고, 여기서 프로카스파제-3 활성화제는 암에서 종양-침윤성 림프구를 증가시키는 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 교모세포종, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 수막종, 다발성 골수종, 난소암, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 또는 갑상선암이고;여기서 유방암은 선택적으로 삼중 음성 유방암이고, 폐암은 선택적으로 비-소세포 폐암이고, 신장암은 선택적으로 전이성 신세포 암종인 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물 PAC-1 및 상기 제2 활성제는 대상체에게 동시에 투여되고; 또는
    상기 화합물 PAC-1 및 상기 제2 활성제는 대상에게 순차적으로 투여되고, 여기서 화합물 PAC-1은 제2 활성제 전에 대상에게 투여되거나 화합물 PAC-1은 제2 활성제 후에 대상에게 투여되는 방법.
  25. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 PAC-1 및 상기 제2 활성제가 1일 1회(q.d.), 1일 2회(b.i.d.), 1일 3회(t.i.d.), 또는 1일 4회(q.i.d.) 대상에 투여되고, 여기서 PAC-1의 1일 총 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 150 mg/kg이고; 또는
    PAC-1의 각각의 투여 용량은 약 70 mg, 약 175 mg, 약 250 mg, 약 375 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 625 mg, 약 750 mg, 또는 약 1000 mg이고; 또는 PAC-1의 각각의 투여 용량은 약 50 mg/m2 내지 약 250 mg/m2인 방법.
  26. 암의 치료가 필요한 대상체에게 PAC-1 및 항-PD-1 항체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법으로서, 상기 PAC-1은 1일 총 투여 용량이 PAC-1은 약 100mg/kg 내지 약 125mg/kg이 되도록 연속 21일 이상 동안 매일 투여되고, 상기 항-PD-1 항체는 21일 이상 연속적으로 2회 또는 4회 투여되며, 여기서 상기 항-PD-1의 용량은 항체는 약 10 mg/kg이고 항-PD-1 항체의 각 용량은 별도의 날에 투여되는 방법.
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