KR20220015376A - Hbv 외피 단백질에 특이적인 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HBV 외피 단백질로부터 유래된 HLA-A*02 제한 펩타이드 GLSPTVWLSV (서열번호 1)에 결합하는 특이적 결합 분자에 관한 것이다. 특이적 결합 분자는 알파 및/또는 베타 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있고, 고유 TCR에 비해 알파 및/또는 베타 가변 도메인 내의 비-천연 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 분자는 감염성 또는 악성 질환의 치료를 위한 신규 면역치료 시약으로서 사용하기에 특히 적합하다.

Description

HBV 외피 단백질에 특이적인 결합 분자
본 발명은 HBV 외피 단백질로부터 유래된 HLA-A*02 제한 펩타이드 GLSPTVWLSV (서열번호 1)에 결합하는 특이적 결합 분자에 관한 것이다. 상기 특이적 결합 분자는 알파 및/또는 베타 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 특이적 결합 분자는 고유 TCR에 비해 알파 및/또는 베타 가변 도메인 내의 비-천연 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 분자 및/또는 알파 및/또는 베타 가변 도메인은 감염성 또는 악성 질환의 치료를 위한 신규 면역치료 시약으로서 사용하기에 특히 적합하다.
전 세계적으로 대략 2억 5,700만 명의 사람들이 HBV에 감염되어 있고, 이는 전체 인구의 3.5%에 해당한다. 유병률은 세계 보건 기구 (World Health Organisation)에서 규정된 서태평양 지역과 성인의 약 6%가 감염되어 있는 아프리카 지역에서 가장 높다. 급성 HBV 감염은 해결되거나 만성 감염으로 발전할 수 있지만, 감염이 만성화될 가능성은 사람의 나이에 따라 다르다. 1세 미만 영아의 80 내지 90%에서 만성 감염이 발생하고; 6세 미만 어린이의 30 내지 50%에서 만성 감염이 발생하고; 성인의 5% 미만에서 만성 감염이 발생한다. 만성 B형 간염은 이질적이고 불응성인 질환으로 예후가 좋지 않아, 감염된 성인의 20 내지 30%에서 간경변(간의 흉터) 또는 암을 유발한다. HBV 감염을 예방하기 위한 효과적이고 안전한 백신은 1980년대 이후로 사용 가능했다. 그러나, HBV에 감염된 많은 사람들은 HBV 백신이 도입되고 조기 예방 접종 일정이 시행되기 전에 태어났고; 세계 보건 기구는 만성적으로 감염된 성인 중 6,500만 명이 자녀에게 감염을 전염시킬 위험이 있는 가임기 여성일 수 있다고 추정한다. TB 및 HIV와 달리, 바이러스로 인한 사망률은 특히 진단되지 않은 사람들에서 간경변 및 간세포 암종(HCC)의 합병증으로 인해 증가할 것으로 예상된다.
HBV 감염의 제거는 이펙터 T 세포에 의한 지속적인 바이러스 제어와 관련이 있는 반면, 만성 감염으로의 진행은 충분히 강력하고 광범위한 바이러스 특이적 T 세포 반응의 결핍으로 인한 것으로 여겨진다. 만성 감염에서 HBV-특이적 T 세포는 일반적으로, 불량한 세포독성 활성 및 손상된 사이토카인 생산을 특징으로 하는 고갈된 표현형을 나타내므로 바이러스의 제거를 방지한다 (Ye et al., Cell Death Dis. 2015 Mar; 6(3): e1694; Park et al., Gastroenterology. 2016 Mar;150(3):684-695.e5). 현재 만성 HBV의 관리에는 테노포비르 또는 엔테카비르와 같은 경구용 항바이러스제를 사용한 치료가 포함된다; 그러나, 항바이러스제는 영구적이고 치명적인 간 손상의 진행을 늦추는 데 도움을 줄 수 있는 바이러스 복제를 억제하지만, 바이러스를 제거하지는 않고, 바이러스 감각 (viral flair)의 위험을 피하기 위해 무기한 사용해야 한다. 또한, 항바이러스제의 장기간 사용은 바이러스 내성 및 독성과 관련이 있다. 따라서, 현재 치료의 한계를 극복하고, 바이러스 감염 세포에 대한 T 세포 매개 반응을 회복시키고, 기능적 치료를 제공할 수 있는 만성 HBV 감염에 대한 새로운 치료법을 제공할 필요가 있다.
T 세포 수용체 (TCR)는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 자연적으로 발현된다. TCR은 주요 조직 적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex: MHC) 분자(인간에서, MHC 분자는 인간 백혈구 항원 또는 HLA로도 공지되어 있음)와 함께 복합체로 항원 제시 세포의 표면에 표시(display)되는 짧은 펩타이드 항원을 인식하도록 설계된다 (Davis et al., Annu Rev Immunol. 1998;16:523-44). 세포독성(cytotoxic) T 세포로도 불리는 CD8+ T 세포는 MHC 부류 I 분자에 결합된 펩타이드를 특이적으로 인식하는 TCR을 갖는다. CD8+ T 세포는 일반적으로 암 및 바이러스에 감염된 세포를 포함하여, 병든 세포를 찾아 이의 파괴를 매개하는 역할을 한다.
펩타이드 GLSPTVWLSV (서열번호 1)는 전장 HBV 외피 단백질의 아미노산 348-357에 상응하고, HLA-A*02와 함께 복합체로 감염된 세포의 표면 상에 제시된다. 이 펩타이드-HLA 복합체를 인식하는 T 세포가 보고되었다 (Webster et al., J Virol. 2004 Jun; 78(11): 5707-5719). GLSPTVWLSV 펩타이드는, 위치 10에서만 약간 가변적일 뿐, 모든 HBV 유전자형에 걸쳐 높은 수준의 서열 보존을 나타낸다 (천연 변이체 GLSPTVWLSA (서열번호 17)는 유전자형 A의 서열의 약 78%에 존재함). 따라서, GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체는 만성 질환을 해결하기 위한 TCR-기반 면역치료 개입에 이상적인 표적을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 HLA-A*02와 함께 복합체로 GLSPTVWLSV (서열번호 1)에 결합하고/하거나 HLA-A*02와 함께 복합체로 GLSPTVWLSA (서열번호 17)에 결합하는 특성을 갖고, TCR 알파 사슬 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 사슬 가변 도메인을 포함하는 특이적 결합 분자를 제공하고, 이들 각각은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하며, 여기서 FR은 프레임워크 영역이고, CDR은 상보성 결정 영역이며, 여기서
(a) 알파 사슬 CDR은 선택적으로 그 내부에 하나 이상의 돌연변이가 있는 하기 서열:
CDR1 - DRGSQS (서열번호 18)
CDR2 - IYSNGD (서열번호 19)
CDR3 - CAVRNYNTDKLIF (서열번호 20),
을 갖고/갖거나,
(b) 베타 사슬 CDR은 선택적으로 그 내부에 하나 이상의 돌연변이가 있는 하기 서열을 갖는다:
CDR1 - MNHEY (서열번호 21)
CDR2 - SVGAGI (서열번호 22)
CDR3 - CASSYATGGTGELFF (서열번호 23).
본 발명은, 최초로, GLSPTVWLSV-HLA 복합체에 결합하는 CDR 및 가변 도메인을 포함하는 특이적 결합 분자를 제공한다. 특이적 결합 분자 또는 이의 결합 단편은 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있고, TCR 가변 도메인은 고유 TCR의 가변 도메인에 상응할 수 있거나, 보다 바람직하게는 TCR 가변 도메인은 조작될 수 있다. 고유 TCR 가변 도메인은 또한 야생형, 천연, 모계, 돌연변이되지 않은 또는 스캐폴드 도메인으로서 지칭될 수 있다. 특이적 결합 분자 또는 결합 단편은 표적에 대한 초생리학적 (supra-physiological) 친화도, 긴 결합 반감기, 표적에 대한 높은 특이성 및 우수한 안정성과 같은 이상적인 치료 특성을 갖는 분자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 특이적 결합 분자 또는 이의 결합 단편 및 T 세포 리디렉팅 모이어티 (T cell redirecting moiety)를 포함하는 이중특이성 또는 이작용성 또는 융합 분자를 포함한다. 그러한 분자는 고갈되지 않은 비-HBV T 세포를 리디렉팅하고 활성화함으로써 HBV 감염 세포에 대한 강력하고 특이적인 반응을 매개할 수 있다. 또한, 초생리학적 친화도를 갖는 특이적 결합 분자의 사용은 낮은 수준의 펩타이드-HLA를 제시하는 바이러스 감염 세포의 인식 및 제거를 용이하게 한다. 대안적으로, 특이적 결합 분자 또는 결합 단편은 입양 요법(adoptive therapy)을 위해 조작된 T 세포 내에 포함될 수 있다.
본 명세서에 정의된 TCR 도메인 서열은 TCR 분야에서 일하는 사람들에게 널리 공지되어 있고, 접근 가능한 IMGT 명명법을 참조하여 기재된다. 예를 들어, 문헌[LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10O; and Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266]을 참조한다. 간략하게, αβ TCR은 2개의 디설파이드 연결 사슬로 이루어진다. 각 사슬 (알파 및 베타)은 일반적으로 2개의 도메인, 즉 가변 및 불변 도메인(constant domain)을 갖는 것으로 간주된다. 짧은 결합 영역은 가변 및 불변 도메인을 연결하고, 일반적으로 알파 가변 영역의 일부로 간주된다. 또한, 베타 사슬은 일반적으로 결합 영역 옆에 짧은 다양성 영역을 포함하는 데, 이는 또한 일반적으로 베타 가변 영역의 일부로 간주된다. 각 사슬의 가변 도메인은 N-말단에 위치되고, 프레임워크 서열 (FR)에 내장된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. CDR은 펩타이드-MHC 결합에 대한 인식 부위를 포함한다. 알파 사슬 가변 (Vα) 영역을 코딩하는 몇몇 유전자와 베타 사슬 가변 (Vβ) 영역을 코딩하는 몇몇 유전자가 있고, 이들은 그들의 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열, 그리고 부분적으로 정의된 CDR3 서열에 의해 구별된다. Vα 및 Vβ 유전자는 IMGT 명명법에서 각각 접두사 TRAV 및 TRBV로 지칭된다 (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). 마찬가지로, 알파 및 베타 사슬 각각에 대해, TRAJ 또는 TRBJ로 명명되는 몇몇 결합 또는 J 유전자가 존재하고, 베타 사슬에 대해, TRBD로 명명되는 다양성 또는 D 유전자가 존재한다 (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). T 세포 수용체 사슬의 큰 다양성은, 대립형질 변이체 및 접합 다양성을 포함하는, 다양한 V, J 및 D 유전자 사이의 조합 재배열로 인해 발생한다 (Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107.). TCR 알파 및 베타 사슬의 불변 또는 C 영역은 각각 TRAC 및 TRBC로 지칭된다 (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10).
제1 양태의 특이적 결합 분자에서, 알파 사슬 가변 도메인 프레임워크 영역은 하기 프레임워크 서열:
FR1 - 서열번호 2의 아미노산 1-26
FR2 - 서열번호 2의 아미노산 33-49
FR3 - 서열번호 2의 아미노산 56-88
FR4 - 서열번호 2의 아미노산 102-111
또는 상기 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 각각의 서열을 포함할 수 있고/있거나,
베타 사슬 가변 도메인 프레임워크 영역은 하기 서열:
FR1 - 서열번호 3의 아미노산 1-26
FR2 - 서열번호 3의 아미노산 32-48
FR3 - 서열번호 3의 아미노산 55-90
FR4 - 서열번호 3의 아미노산 106-114
또는 상기 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 각각의 서열을 포함할 수 있다.
GLSPTVWLSA (서열번호 17) 펩타이드는 GLSPTVWLSV의 자연 발생 변이체로, 환자 아집단에서 나타나는 변이체일 것이다. 이중 결합 프로파일을 나타내는 특이적 결합 분자는 본 발명의 특이적 결합 분자가 치료에 사용될 때 유리할 수 있는 데, 이는 변종 펩타이드를 자연적으로 나타내는 환자의 커버리지 (coverage)를 제공하기 때문이다. 따라서, 더 많은 환자 집단을 다룰 수 있다. 따라서, GLSPTVWLSV (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하고, GLSPTVWLSA (서열번호 17) HLA-A*02 복합체에 결합하는 특이적 결합 분자가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "특이적 결합 분자"는 표적 항원에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 그러한 분자는 본 명세서에 논의된 바와 같은 다수의 상이한 포맷을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 특이적 결합 분자의 단편도 고려된다. 단편은 표적 항원에 대한 결합을 유지하는 특이적 결합 분자의 일부를 지칭한다.
용어 '돌연변이'는 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 고유한 (모계, 천연, 돌연변이되지 않은 야생형 또는 스캐폴드로도 지칭됨) 특이적 결합 분자에 대한 돌연변이에는 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 특이적인 결합 분자의 결합 친화도 (kD 및/또는 결합 반감기)를 증가시키는 돌연변이가 포함될 수 있다.
알파 사슬 프레임워크 영역 FR1, FR2 및 FR3은 TRAV12-2*02 사슬에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있고/있거나, 베타 사슬 프레임워크 영역 FR1, FR2 및 FR3은 TRBV6-5*01 사슬의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FR4 영역은 알파 및 베타 가변 사슬 (각각 TRAJ 및 TRBJ)의 결합 영역을 포함할 수 있다. TRAJ 영역은 TRAJ34의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TRBJ 영역은 TRBJ2-2의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
TCR 알파 사슬 가변 영역에는, 적어도 하나의 돌연변이가 존재할 수 있다. 알파 사슬 CDR에는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 돌연변이가 존재할 수 있다. 상기 돌연변이 중 하나 이상은 서열번호 2의 넘버링을 참조하여 하기 돌연변이로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00001
따라서, 상기 표에 있는 임의의 또는 모든 돌연변이가 선택적으로 다른 돌연변이와 조합하여 존재할 수 있다.
알파 사슬 CDR은 하기 그룹의 돌연변이 중 하나를 포함할 수 있다 (서열번호 2의 넘버링 참조):
Figure pct00002
알파 사슬 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00003
바람직한 알파 사슬에서, CDR1은 DRGSQS이고, CDR2는 IYSNGD이고, CDR3은 CAARNYKTDLLIF이다. 또 다른 바람직한 알파 사슬에서, CDR1은 DRGSQS이고, CDR2는 IYSDGD이고, CDR3은 CAARNYKTDLLIF이다.
TCR 베타 사슬 가변 영역에는, 적어도 하나의 돌연변이가 존재할 수 있다. 베타 사슬 CDR에는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 돌연변이가 존재할 수 있다. 상기 돌연변이 중 하나 이상은 서열번호 3의 넘버링을 참조하여 하기 돌연변이로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00004
따라서, 상기 표에 있는 임의의 또는 모든 돌연변이가 선택적으로 다른 돌연변이와 조합하여 존재할 수 있다.
베타 사슬 CDR은 하기 그룹의 돌연변이 중 하나를 포함할 수 있다 (서열번호 3의 넘버링 참조):
Figure pct00005
베타 사슬 CDR1, CDR2 및 CDR3은 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00006
바람직한 베타 사슬에서, CDR1은 MSHGY이고, CDR2는 SVGAGI이고, CDR3은 CASSYATGGTGDLFF이다. 또 다른 바람직한 베타 사슬에서, CDR1은 LNHGY이고, CDR2는 SVGAGI이고, CDR3은 CASSYATGGTGVLFF이다.
또 다른 바람직한 베타 사슬에서, CDR1은 MNHEY이고, CDR2는 SVGAGI이고, CDR3은 CASSYATGGTGLLFF이다.
또 다른 바람직한 베타 사슬에서, CDR1은 MNHEY이고, CDR2는 SLGAGI이고, CDR3은 CASSYATGGTGDLFF이다.
또 다른 바람직한 베타 사슬에서, CDR1은 LSHGY이고, CDR2는 SVGAGI이고, CDR3은 CASSYATGGTGDLFF이다.
TCR 알파 및 베타 CDR의 바람직한 쌍은 아래 표에 나타나 있다:
Figure pct00007
특히, 바람직한 쌍은 조합 6이다. 특히, 또 다른 바람직한 쌍은 조합 2이다.
CDR 내의 돌연변이(들)는 바람직하게는 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 특이적인 결합 분자의 결합 친화도를 개선하지만, 추가로 또는 대안적으로 단리된 형태의 개선된 안정성 및 개선된 특이성과 같은 다른 이점을 부여할 수 있다. 하나 이상의 위치에서의 돌연변이는 추가로 또는 대안적으로, 예를 들어 상호작용에 보다 유리한 각도를 제공함으로써, 인접 위치와 동족 pMHC 복합체와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 돌연변이는 비-특이적 결합의 양을 감소시킬 수 있는, 즉 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02에 비해 대체 항원에 대한 결합을 감소시킬 수 있는 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이에는 폴딩 및/또는 제조의 효능을 증가시키는 돌연변이가 포함될 수 있다. 일부 돌연변이는 이러한 특징 각각에 기여할 수 있고; 다른 돌연변이는 예를 들어, 친화도에 기여하지만 특이성에 기여하지 않거나, 특이성에 기여하지만 친화도 등에 기여하지 않을 수 있다.
일반적으로, 표적 항원에 대한 pM 친화도를 갖는 특이적 결합 분자를 수득하기 위해서는 총 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개 이상의 CDR 돌연변이가 필요하다. 표적 항원에 대한 pM 친화도를 갖는 특이적 결합 분자를 수득하기 위해서는 총 적어도 5개, 적어도 10개 또는 적어도 15개의 CDR 돌연변이가 필요할 수 있다. 표적 항원에 대한 pM 친화도를 갖는 특이적 결합 분자는 특히 가용성 치료제로서 적합하다. 입양 요법 적용에 사용되는 특이적 결합 분자는 표적 항원에 대해 더 낮은 친화도를 가질 수 있으므로, 더 적은 CDR 돌연변이, 예를 들어 총 최대 1개, 최대 2개, 최대 5개 이상의 CDR 돌연변이를 가질 수 있다. 입양 요법 적용에 사용되는 특이적 결합 분자는 표적 항원에 대해 더 낮은 친화도를 가질 수 있으므로, 더 적은 CDR 돌연변이, 예를 들어 총 0개의 돌연변이 또는 최대 1개, 최대 2개, 또는 최대 5개의 CDR 돌연변이를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 고유한 (돌연변이되지 않은 것으로도 지칭됨) 특이적 결합 분자는 돌연변이 없이도 표적 항원에 대해 충분히 높은 친화도를 가질 수 있다. 고유 형태의 본 발명의 특이적 결합 분자는, 특히 HLA와 함께 복합체로 암 펩타이드에 결합하는 결합 분자와 비교할 때, 유리하게 높은 친화도를 갖는다는 것이 주목되었다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 이러한 더 높은 친화도가, GLSPTVWLSV 펩타이드가 바이러스, 즉 비-자기 공급원(non-self source)으로부터 유래된다는 사실에 기인할 수 있다고 생각한다.
돌연변이는 추가로 또는 대안적으로, 프레임워크 영역 내, CDR 외부에서 만들어질 수 있고; 그러한 돌연변이는 결합, 및/또는 특이성, 및/또는 안정성, 및/또는 특이적 결합 분자의 정제된 가용성 형태의 수율을 개선할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특이적 결합 분자는 추가로 또는 대안적으로, 알파 사슬 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 알파 사슬 가변 영역 FR2는 서열번호 2의 넘버링을 사용하여 위치 43에서 S에서 G로의 돌연변이를 갖는다. 이 돌연변이는 수율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 서열번호 2의 넘버링(numbering)을 사용하여, 알파 사슬의 위치 1에서 Q에서 A로의 돌연변이는 대장균 (E. coli)에서 생산되는 동안 N-말단 메티오닌 절단의 효율성을 향상시키는 것으로 밝혀됐다. 비효율적인 절단은 이종 단백질 생성물을 초래할 수 있고/있거나 개시 메티오닌의 존재가 인간의 면역원성일 수 있기 때문에, 치료용으로 불리할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 특이적 결합 분자의 α 사슬 가변 도메인은 서열번호 2의 프레임워크 아미노산 잔기 1-26, 33-49, 56-88, 102-111과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 각각의 프레임워크 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 분자의 베타 사슬 가변 도메인은 서열번호 3의 프레임워크 아미노산 잔기 1-26, 32-48, 55-90, 106-114와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 각각의 프레임워크 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 언급된 백분율 동일성은 전체로서 고려될 때 프레임워크 서열을 초과할 수 있다.
알파 사슬 가변 도메인은 서열번호 4 내지 6 (도 2에 나타냄)의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 베타 사슬 가변 도메인은 서열번호 7 내지 11 (도 3에 나타냄)의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, 특이적 결합 분자는 하기 알파 및 베타 사슬 쌍을 포함할 수 있다.
Figure pct00008
바람직한 TCR 사슬 쌍은 서열번호 6 및 서열번호 8이다. 바람직한 TCR 사슬 쌍은 서열번호 4 및 서열번호 8이다.
본 발명의 범위 내에는 본 명세서에 개시된 본 발명의 임의의 특이적 결합 분자의 표현형 침묵 변이체가 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "표현형 침묵 변이체(phenotypically silent varient)"는 상기 기재된 것 이외에, 치환, 삽입 및 결실을 포함하는, 하나 이상의 추가 아미노산 변화를 포함하는 TCR 가변 도메인을 갖는 특이적 결합 분자를 지칭하는 것으로 이해되고, 여기서 특이적 결합 분자는 상기 변화(들)가 없는 상응하는 특이적 결합 분자와 유사한 표현형을 갖는다. 본 출원의 목적을 위해, 특이적 결합 분자 표현형은 결합 친화도 (KD 및/또는 결합 반감기) 및 특이성을 포함한다. 바람직하게는, 면역 이펙터와 회합된 가용성 특이적 결합 분자에 대한 표현형은 결합 친화도 및 특이성 이외에 면역 활성화 및 정제 수율의 효능을 포함한다. 표현형 침묵 변이체는, 동일한 조건 하에서 (예를 들어 25℃에서 및/또는 동일한 SPR 칩 상에서) 측정되는 경우, 상기 변화(들)가 없는 상응하는 특이적 결합 분자에 대해 측정된 KD 및/또는 결합 반감기의 50% 이내, 또는 보다 바람직하게는 30%, 25% 또는 20% 이내의 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 대한 KD 및/또는 결합 반감기를 가질 수 있다. 적합한 조건은 실시예 3에 추가로 제공된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체와의 상호작용의 친화도 및/또는 다른 기능적 특징을 변경하지 않고 상기 상세히 설명된 것과 비교하여 그 가변 도메인의 변화를 포함하는 특이적 결합 분자를 생성하는 것이 가능할 수 있다. 특히, 그러한 침묵 돌연변이(silent mutation)는 항원 결합 (예를 들어 프레임워크 영역 및/또는 항원과 접촉하지 않는 CDR의 부분)에 직접적으로 관여하지 않는 것으로 공지된 서열의 부분 내에 포함될 수 있다. 그러한 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
표현형 침묵 변이체는 하나 이상의 보존적 치환 및/또는 하나 이상의 허용된 (tolerated) 치환을 포함할 수 있다. 허용된 치환이란 아래에 제공된 바와 같은 보존적의 정의에 속하지 않지만 그럼에도 불구하고 표현형적으로 침묵하는 치환을 의미한다. 당업자는 다양한 아미노산이 유사한 특성을 가지고 있고, 따라서 '보존적'이라는 것을 알고 있다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 하나 이상의 그러한 아미노산은 종종 해당 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 원하는 활성을 제거하지 않으면서 하나 이상의 다른 그러한 아미노산으로 치환될 수 있다.
따라서 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 종종 서로 (지방족 측쇄를 갖는 아미노산) 치환될 수 있다. 이러한 가능한 치환 중에서, 글리신 및 알라닌이 (상대적으로 짧은 측쇄를 가지고 있기 때문에) 서로 치환하는 데 사용되고, 발린, 류신 및 이소류신이 (소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 가지고 있기 때문에) 서로 치환하는 데 사용되는 것이 바람직하다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산에는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌 (황 함유 측쇄를 갖는 아미노산)이 포함된다. 본 발명의 범위 내의 아미노산 치환은 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 알라닌 상의 메틸 기가 에틸 기로 대체될 수 있고/있거나 펩타이드 백본 (backbone)에 약간의 변화가 이루어질 수 있다는 것이 본 명세서에서 고려된다. 천연 또는 합성 아미노산이 사용되는지 여부에 관계없이, L-아미노산만이 존재하는 것이 바람직하다.
이러한 성질(nature)의 치환은 종종 "보존적(conservative)" 또는 "반-보존적(semi-conservative)" 아미노산 치환으로서 지칭된다. 따라서, 본 발명은, 특이적 결합 분자의 아미노산 서열이 서열번호 2, 4 내지 6의 아미노산 1-111, 및/또는 서열번호 3, 7 내지 11의 아미노산 1-114를 포함하는 특이적 결합 분자와 적어도 90%의 동일성, 예컨대 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖도록 상기 기재된 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함하지만 서열 내에 하나 이상의 보존적 치환 및/또는 하나 이상의 허용된 치환을 갖는 특이적 결합 분자의 사용으로 확장된다.
당업계에 공지된 바와 같은 "동일성(identity)"은 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 관계이다. 당해 기술분야에서, 동일성은 또한, 경우에 따라, 그러한 서열의 스트링(string)들 사이의 매칭에 의해 결정되기 때문에, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재하지만, 동일성을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은, 비제한적으로, GCG 프로그램 패키지를 포함한다 (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).
CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용하여 아미노산 서열을 비교할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고, 적절한 경우 두 서열 중 하나에 공백을 삽입하여 최적의 정렬을 찾는다. 최적의 정렬을 위해 아미노산 동일성 또는 유사성 (아미노산 유형의 동일성 + 보존성)을 계산할 수 있다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열의 가장 긴 스트레치를 정렬시키고, 값을 피트 (fit)에 할당할 것이다. 따라서, 각각 점수가 상이한, 몇몇 유사성 영역을 찾는 비교가 얻어질 수 있다. 두 동일성 분석 유형 모두 본 발명에 고려된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트는 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬시키고 (예를 들어, 갭(gap)은 서열과의 최상의 정렬을 위해 제1 서열에 도입될 수 있음), 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교함으로써 결정된다. "최상의 정렬"은 가장 높은 동일성 퍼센트를 야기하는 2개의 서열의 정렬이다. 동일성 퍼센트는 비교되는 서열 내의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 수에 의해 결정된다 (즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100).
2개의 서열들 간의 동일성 퍼센트의 결정은 당업자에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열을 비교하기 위한 수학적 알고리즘의 예는 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 수정된, 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이다. 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램은 그러한 알고리즘을 포함했다. 2개의 뉴클레오타이드 서열들 간의 동일성 퍼센트의 결정은 BLASTn 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 2개의 단백질 서열들 간의 동일성 퍼센트의 결정은 BLASTp 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭핑된 (gapped) 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST가 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast는 분자들(Id.)간의 거리 관계를 탐지하는 반복 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, BLASTp 및 BLASTp)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다. 디폴트 일반 파라미터는 예를 들어, 워드 크기 = 3, 예상 역치 = 10을 포함할 수 있다. 파라미터는 짧은 입력 서열을 자동으로 조정하기 위해 선택될 수 있다. 서열 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 예는 문헌[Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이다. CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)은 그러한 알고리즘을 포함한다. 당업계에 공지된 서열 분석을 위한 다른 알고리즘은 문헌[Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5; and FASTA described in Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8]에 기재된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM을 포함한다. FASTA 내에서, ktup는 검색의 민감도와 속도를 설정하는 제어 옵션이다. 본 개시내용에서 동일성 퍼센트를 평가하기 위해, 디폴트 파라미터를 갖는 BLASTp가 비교 방법론으로서 사용된다. 또한, 열거된 동일성 퍼센트가 아미노산에 대해 비-정수 값(non-whole number value)을 제공하는 경우 (즉, 90% 서열 동일성을 갖는 25개 아미노산의 서열이 "22.5"의 값을 제공하는 경우, 수득된 값은 다음 정수, 따라서 "22"로 반내림을 적용한다). 따라서, 제공된 예에서, 25개의 아미노산 중 22개의 일치를 갖는 서열은 90% 서열 동일성 내에 있다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 특이적 결합 분자의 기능적 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서, 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열을 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 잔기만큼 절단하거나 연장하는 것이 가능할 수 있다. 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 잔기만큼 절단되거나 연장될 수 있다. 그러한 모든 변이체도 본 발명에 포함된다.
보존적 및 허용된 치환, 삽입 및 결실을 포함하는 돌연변이는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 제한 효소-기반 클로닝 또는 결찰 독립적 클로닝 (ligation independent cloning; LIC) 절차를 기반으로 하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 방법을 사용하여 제공된 서열 내에 도입될 수 있다. 이들 방법은 많은 표준 분자 생물학 텍스트에 상세히 설명되어 있다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 제한 효소-기반 클로닝에 관한 더 상세한 설명을 위해, 문헌[Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press]을 참조한다. 결찰 독립적 클로닝 (LIC) 절차에 대한 추가 정보는 문헌[Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6]에서 찾을 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 TCR 서열은 고체 상태 합성, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 방법으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체와 결합하는 특성을 갖는다. 본 발명의 특이적 결합 분자는 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 대해 고도의 특이성을 나타내므로, 치료 용도에 특히 적합하다. 본 발명의 특이적 결합 분자의 맥락에서 특이성은 항원 음성인 HLA-A*02 표적 세포를 인식하는 최소 능력을 가지면서, 항원 양성인 HLA-A*02 표적 세포를 인식하는 능력에 관한 것이다. 일부 경우에, 본 발명의 특이적 결합 분자는 HLA-A*0201, HLA-A*0206 또는 HLA-A*0207을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 특정 HLA-A*02 아형을 갖는 표적 펩타이드 (GLSPTVWLSV 또는 변이체 GLSPTVWLSA)의 복합체와 결합할 수 있다.
특이성은 시험관내, 예를 들어 실시예 6에 기재된 것과 같은 세포 검정에서 측정될 수 있다. 특이성을 시험하기 위해, 특이적 결합 분자는 가용성 형태일 수 있고, 면역 이펙터와 회합될 수 있고/있거나 T 세포와 같은 세포 표면 상에서 발현될 수 있다. 특이성은 항원 양성 및 항원 음성 표적 세포의 존재 하에 T 세포 활성화의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 항원 음성 표적 세포의 최소 인식은, 동일한 조건 하에서 그리고 치료적으로 적절한 TCR 농도에서 측정될 때, 항원 양성 표적 세포의 존재 하에 생성된 수준의 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만의 T 세포 활성화 수준으로서 정의된다. 면역 이펙터와 회합된 가용성 TCR의 경우, 치료적으로 적절한 농도는 10-9 M 이하의 TCR 농도, 및/또는 상응하는 EC50 값보다 최대 100배, 바람직하게는 최대 1000배 더 큰 농도로서 정의될 수 있다. 바람직하게는, 면역 이펙터와 회합된 가용성 특이적 결합 분자의 경우, 항원 음성 세포에 비해 항원 양성 세포에 대한 T 세포 활성화에 필요한 농도의 차이가 적어도 100배이다. 항원 양성 세포는 암 세포 또는 감염 세포에 필적하는 수준의 항원 제시를 수득하기 위해 적절한 펩타이드 농도를 사용하여 펩타이드-펄싱에 의해 수득될 수 있거나 (예를 들어, 문헌[Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840]에 기재된 바와 같은 10-9 M 펩타이드) 자연적으로 상기 펩타이드를 제시할 수 있다. 바람직하게는, 항원 양성 및 항원 음성 세포 둘 다는 인간 세포이다. 바람직하게는 항원 양성 세포는 HBV 게놈이 통합된 인간 암 세포 또는 HBV 감염 세포이다. 항원 음성 세포는 바람직하게는 건강한 인간 조직으로부터 유래된 세포를 포함한다.
특이성은 추가로 또는 대안적으로, GLSPTVWLSV (서열번호 1) HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 결합하고, 대체 펩타이드-HLA 복합체의 패널에는 결합하지 않는 특이적 결합 분자의 능력과 관련될 수 있다. 이는 예를 들어, 실시예 3의 Biacore 방법에 의해 측정될 수 있다. 상기 패널은 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 10개의 대체 펩타이드-HLA-A*02 복합체를 함유할 수 있다. 대체 펩타이드는 서열번호 1과 낮은 수준의 서열 동일성을 공유할 수 있고, 자연적으로 제시될 수 있다. 대체 펩타이드는 바람직하게는 건강한 인간 조직에서 발현되는 단백질로부터 유래된다. GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 대한 특이적 결합 분자의 결합은 다른 자연적으로 제시되는 펩타이드 HLA 복합체보다 적어도 2배, 보다 바람직하게는 적어도 10배, 또는 적어도 50배 더 크거나 적어도 100배 더 크거나, 보다 더 바람직하게는 적어도 400배 더 클 수 있다. 대체 HLA는 GLSPTVWLSV 펩타이드, 예컨대 서열, GLSPIVWLSV 및 GLSPTVWLLV의 다른 천연 변이체를 포함하지 않는다.
특이적 결합 분자 특이성을 측정하기 위한 대안적 또는 추가적 접근법은 순차적 돌연변이 유발, 예를 들어, 표적 펩타이드의 알라닌 스캐닝을 사용하여 특이적 결합 분자의 펩타이드 인식 모티프를 동정하는 것일 수 있다. 결합 모티프의 일부를 형성하는 잔기는 치환이 허용되지 않는 잔기이다. 허용되지 않는 치환은 특이적 결합 분자의 결합 친화도가 비-돌연변이된 펩타이드에 대한 결합 친화도에 비해 적어도 50%, 또는 바람직하게는 적어도 80%만큼 감소되는 펩타이드 위치의 치환으로서 정의될 수 있다. 그러한 접근법이 TCR과 관련하여 문헌[Cameron et al., (2013), Sci Transl Med. 2013 Aug 7; 5 (197): 197ra103] 및 WO2014096803에 추가로 기재되어 있지만, 그러한 방법이 본 발명의 특이적 결합 분자에도 적용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이 경우에 특이적 결합 분자 특이성은 펩타이드를 함유하는 대체 모티프, 특히 인간 프로테옴 (proteome)의 펩타이드를 함유하는 대체 모티프를 동정하고, 이들 펩타이드가 특이적 결합 분자에 결합하는지 시험함으로써 측정될 수 있다. 하나 이상의 대체 펩타이드에 대한 특이적 결합 분자의 결합은 특이성의 결여를 나타낼 수 있다. 이 경우에 세포 검정을 통한 특이적 결합 분자 특이성의 추가 테스트가 필요할 수 있다. 펩타이드의 중앙 부분에서 (알라닌) 치환에 대한 낮은 허용 (tolerance)은 TCR이 높은 특이성을 가지며, 따라서 대체 펩타이드와의 교차 반응 위험이 낮음을 나타낸다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 치료 시약으로서 사용하기에 이상적인 안전성 프로파일을 가질 수 있다. 이 경우에 특이적 결합 분자는 가용성 형태일 수 있고, 바람직하게는 면역 이펙터에 융합될 수 있다. 적합한 면역 이펙터는 비제한적으로, 사이토카인, 예컨대 IL-2 및 IFN-γ; 초항원 (superantigen) 및 이의 돌연변이체; 케모카인, 예컨대 IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질; 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포 (예를 들어, 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16) 상의 항원에 결합하는 이의 단편, 유도체 및 변이체를 포함하는 항체; 및 보체 활성제(complement activator)를 포함한다. 이상적인 안전성 프로파일은 우수한 특이성을 입증하는 것 외에도, 본 발명의 특이적 결합 분자가 추가의 전임상 안전성 시험을 통과했을 수 있다는 것을 의미한다. 그러한 시험의 예로는 전혈의 존재 하에 최소 사이토카인 방출을 확인하여 생체 내에서 잠재적인 사이토카인 방출 증후군을 유발하는 위험이 낮음을 확인하기 위한 전혈 검정 및 대체 HLA 유형의 인식에 대한 낮은 잠재성을 확인하기 위한 동종이계반응성 (alloreactivity) 시험이 포함된다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 고수율 정제, 특히 가용성 포맷의 특이적 결합 분자에 적용될 수 있다. 수율은 원래 배양 부피에 대한 정제 공정의 마지막에서 수득된 정확하게 줄어든 물질의 양을 기준으로 결정될 수 있다. 고수율은 일반적으로 1 mg/L 초과, 또는 2 mg/L 초과, 또는 보다 바람직하게는 3 mg/L 초과, 또는 4 mg/L 초과 또는 5 mg/L 초과, 또는 더 높은 수율을 의미한다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 바람직하게는 고유 TCR (비-돌연변이된, 또는 스캐폴드 TCR로도 지칭됨)보다 더 큰 (즉, 보다 더 강력한), 예를 들어 1 pM 내지 1 μM의 범위에 있는 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 대한 KD를 갖는다. 일 양태에서, 본 발명의 특이적 결합 분자는 약 (즉 +/- 10%) 1 pM 내지 약 400 nM, 약 1 pM 내지 약 1000 pM, 약 1 pM 내지 약 500 pM, 약 1 pM 내지 약 100 pM의 복합체에 대한 KD를 갖는다. 상기 특이적 결합 분자는 추가로 또는 대안적으로, 약 1분 내지 약 60시간, 약 20분 내지 약 50시간, 또는 약 2시간 내지 약 35시간, 또는 약 4시간 내지 약 20시간의 범위에 있는 복합체에 대한 결합 반감기(T½)를 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 특이적 결합 분자는 약 1 pM 내지 약 100 pM의 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 대한 KD 및/또는 약 4시간 내지 약 20시간의 결합 반감기를 갖는다. 그러한 고-친화도는 치료제 및/또는 검출 가능한 표지와 회합될 때 가용성 포맷의 특이적 결합 분자에 대해 바람직하다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 특이적 결합 분자는 약 50 nM 내지 약 200 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 2 μM의 복합체에 대한 KD 및/또는 약 3초 내지 약 12분의 복합체에 대한 결합 반감기를 가질 수 있다. 그러한 특이적 결합 분자는 입양 요법 적용에 바람직할 수 있다.
결합 친화도 (평형 상수 KD에 반비례함) 및 결합 반감기 (T½로서 표시됨)를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 결합 친화도 및 결합 반감기는 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance; SPR) 또는 바이오층 간섭계 (Bio-Layer Interferometry; BLI)를 사용하여, 예를 들어 BIAcore 기기 또는 Octet 기기를 각각 사용하여 측정된다. 바람직한 방법은 실시예 3에 제공된다. 특이적 결합 분자의 친화도를 두 배로 하면 KD가 반감된다는 것을 알 수 있을 것이다. T½은 ln2를 오프율 (off-rate)(koff)로 나눈 것으로서 계산된다. 따라서, T½을 두 배로 하면 koff가 반감된다. TCR에 대한 KD 및 koff 값은 일반적으로 TCR의 가용성 형태, 즉 세포질 및 막관통 도메인 잔기를 제거하도록 절단된 형태에 대해 측정된다. 독립적인 측정들 간의 편차, 및 특히 20시간이 넘는 해리 시간과의 상호 작용을 설명하기 위해, 수득된 특이적 결합 분자의 결합 친화도 및/또는 결합 반감기는 동일한 검정 프로토콜 및 얻어진 결과의 평균을 사용하여 여러 번, 예를 들어 3회 이상 측정될 수 있다. 2개의 샘플들 (즉, 2개의 상이한 특이적 결합 분자 및/또는 특이적 결합 분자가 동일한 2개의 제제) 간의 결합 데이터를 비교하기 위해, 실시예 3에 기재된 것과 같은 동일한 검정 조건 (예를 들어, 온도)을 사용하여 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 바람직한 특이적 결합 분자는 고유 TCR의 복합체보다 실질적으로 더 높은 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 대한 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 갖는다. 고유 TCR의 결합 친화도를 증가시키는 것은 종종 그 펩타이드-MHC 리간드에 대한 TCR의 특이성을 감소시키고, 이는 문헌[Zhao et al., (2007) J.Immunol, 179:9, 5845-5854]에서 입증된다. 그러나, 본 발명의 그러한 TCR은 고유 TCR보다 실질적으로 더 높은 결합 친화도를 가짐에도 불구하고, GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA-HLA-A*02 복합체에 대해 여전히 특이적이다. 특정 바람직한 특이적 결합 분자는 항원 양성 세포, 특히 낮은 수준의 항원 (즉, 대략 5 내지 100)을 나타내는 그 세포에 대해 시험관내에서 매우 강력한 T 세포 반응을 생성할 수 있다. 그러한 특이적 결합 분자는 가용성 형태일 수 있고, 면역 이펙터, 예컨대 항-CD3 항체에 연결될 수 있다. 측정되는 T 세포 반응은 T 세포 활성화 마커, 예컨대 인터페론 γ 또는 그랜자임 B의 방출, 또는 표적 세포 사멸, 또는 T 세포 활성화, 예컨대 T 세포 증식의 다른 측정일 수 있다. 바람직하게는, 매우 강력한 반응은 pM 범위, 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 EC50 값을 갖는 것이다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 αβ 이종이량체(heterodimers)일 수 있는 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있다. 특정한 경우에, 본 발명의 특이적 결합 분자는 γδ 이종이량체일 수 있는 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 본 발명의 특이적 결합 분자는 αα 또는 ββ 동종이량체 (또는 γγ 또는 δδ 동종이량체)일 수 있는 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 알파-베타 이종이량체 특이적 결합 분자는 알파 사슬 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 사슬 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 불변 도메인은 세포외, 막관통 및 세포질 도메인이 존재하는 것을 의미하는 전장일 수 있거나 가용성 포맷 (즉, 막관통 또는 세포질 도메인이 없음)일 수 있다. 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 고유한 TRAC 및/또는 TRBC1/2 서열에 대해 돌연변이, 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 용어 TRAC 및 TRBC1/2는 또한 천연 다형성 변이체, 예를 들어 TRAC의 위치 4에서 N에서 K로의 변이체를 포함한다 (Bragado et al International immunology. 1994 Feb;6(2):223-30).
본 발명의 가용성 특이적 결합 분자의 경우, 알파 및 베타 사슬 불변 도메인 서열은 절단 또는 치환에 의해 변형되어 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 고유 디설파이드 결합을 결실시킬 수 있다. 알파 및/또는 베타 사슬 불변 도메인 서열(들)은 예를 들어 WO 03/020763에 기재된 바와 같은 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 알파 및 베타 불변 도메인은 TRAC의 위치 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 위치 Ser 57에서 시스테인 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있고, 상기 시스테인은 TCR의 알파와 베타 불변 도메인 사이에 디설파이드 결합을 형성한다. TRBC1 또는 TRBC2는 불변 도메인의 위치 75에서 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이 및 불변 도메인의 위치 89에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 αβ 이종이량체 내에 존재하는 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 C 말단 또는 C 말단들에서, 예를 들어 최대 15개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 이하의 아미노산에 의해 절단될 수 있다. 본 발명의 αβ 이종이량체 내에 존재하는 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 C 말단 또는 C 말단들에서, 예를 들어 최대 15개, 또는 최대 10개 또는 최대 8개의 아미노산에 의해 절단될 수 있다. 알파 사슬 세포외 불변 도메인의 C 말단은 8개의 아미노산에 의해 절단될 수 있다. 가용성 특이적 결합 분자는 바람직하게는 치료제 및/또는 검출 가능한 표지와 회합(associate)된다.
αβ 이종이량체 TCR의 불변 도메인은 막관통 및 세포질 도메인을 둘 다 갖는 전장(full length)일 수 있다. 그러한 TCR은 각각의 알파 및 베타 불변 도메인들 사이의 자연에서 발견되는 것과 상응하는 디설파이드 결합을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 비-고유 디설파이드 결합이 세포외 불변 도메인들 사이에 존재할 수 있다. 상기 비-고유 디설파이드 결합은 WO03020763 및 WO06000830에 추가로 기재되어 있다. 비-고유 디설파이드 결합은 TRAC의 위치 Thr 48과 TRBC1 또는 TRBC2의 위치 Ser 57 사이에 있을 수 있다. 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 고유 TRAC 및/또는 TRBC1/2 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 전장 불변 도메인을 가진 TCR을 입양 요법에 사용하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 전장 또는 절단된 불변 도메인이 아닌 TCR 불변 도메인이 없을 수 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 결합 분자는 TCR 알파 및 베타 사슬의 가변 도메인으로 구성될 수 있고, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가 도메인을 가질 수 있다. 추가 도메인은 비제한적으로, 면역 이펙터 도메인(예컨대 항체 도메인), Fc 도메인 또는 알부민 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 단일 사슬 포맷일 수 있다. 단일 사슬 포맷은 비제한적으로, Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, 또는 Vα-Cα-L-Vβ-Cβ 유형의 αβ TCR 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이고, L은 링커 서열이다 (Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). 링커 서열은 일반적으로, 가요성을 제한할 수 있는 벌키한 (bulky) 측쇄를 갖지 않는 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌 및 세린으로 주로 이루어진다는 점에서 가요성이다. 대안적으로, 더 큰 강성을 가진 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 종종 링커 서열의 길이는 약 12개 미만, 예컨대 10개 미만, 또는 2 내지 10개의 아미노산일 것이다. 링커의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산일 수 있다. 본 발명의 다중-도메인 결합 분자에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예에는, 비제한적으로: GGGGS (서열번호 33), GGGSG (서열번호 34), GGSGG (서열번호 35), GSGGG (서열번호 36), GSGGGP (서열번호 37), GGEPS (서열번호 38), GGEGGGP (서열번호 39), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 40) (WO2010/133828에 기재된 바와 같음) 및 GGGSGGGG (서열번호 41)가 포함된다. 추가의 링커는 하기 서열 모티프 중 하나 이상을 갖는 서열을 포함할 수 있다: GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS 및 TVLSSAS. 존재하는 경우, 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 전장일 수 있거나, 절단될 수 있고/있거나 상기 기재된 바와 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단일 사슬 TCR은 가용성이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 단일 사슬 TCR은 WO 2004/033685에 기재된 바와 같이, 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 단일 사슬 TCR은 문헌[WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829]에 추가로 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 특이적 결합 분자를 표시하는 입자 및 입자의 라이브러리 내에 상기 입자를 포함하는 것을 포함한다. 그러한 입자는 비제한적으로, 파지, 효모 세포, 리보솜, 또는 포유류 세포를 포함한다. 그러한 입자 및 라이브러리를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[WO2004/044004; WO01/48145, Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184] 참조).
본 발명의 가용성 특이적 결합 분자는 검출 가능한 표지 또는 치료제를 항원 제시 세포 및 항원 제시 세포를 함유하는 조직에 전달하는 데 유용하다. 따라서, 이들은 검출 가능한 표지 (특이적 결합 분자가 동족 항원을 제시하는 세포의 존재를 검출하기 위해 사용되는 진단 목적을 위해); 및/또는 치료제; 및/또는 약물동력학 (PK) 변형 모이어티와 (공유적으로 또는 다른 방식으로) 회합될 수 있다.
PK 변형 모이어티의 예에는 비제한적으로, PEG (Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64 and Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28), PASylation (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501), 알부민 및 알부민 결합 도메인, (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43), 및/또는 비정형 폴리펩타이드 (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec;27(12):1186-90)가 포함된다. 추가의 PK 변형 모이어티는 항체 Fc 단편을 포함한다. PK 변형 모이어티는 생체내 반감기를 연장시키는 역할을 할 수 있다.
면역글로불린 Fc 도메인이 사용되는 경우, 이는 임의의 항체 Fc 영역일 수 있다. Fc 영역은 세포 표면 Fc 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 항체의 테일 영역이다. Fc 영역은 일반적으로 2개 또는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH2, CH3 및 CH4로 지칭됨) 및 힌지 영역을 둘 다 갖는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 2개의 사슬은 힌지 영역 내에서 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 면역글로불린 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터의 Fc 도메인은 FcRn에 결합하고, RcRn 매개 재순환을 거쳐 긴 순환 반감기 (3 내지 4주)를 제공한다. IgG와 FcRn과의 상호작용은 CH2 및 CH3 도메인의 일부를 커버하는 Fc 영역에 국한되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 면역글로불린 Fc는 비제한적으로, IgG1 또는 IgG4로부터의 Fc 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fc 도메인은 인간 서열로부터 유래된다. Fc 영역은 또한 바람직하게는 이량체화를 용이하게 하는 KiH 돌연변이뿐만 아니라 활성화 수용체, 즉 기능적 침묵 분자와의 상호작용을 방지하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 면역글로불린 Fc 도메인은 임의의 적합한 순서 또는 구성으로 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 및/또는 면역 이펙터)의 C 또는 N 말단에 융합될 수 있다. 면역글로불린 Fc는 링커를 통해 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 및/또는 면역 이펙터)에 융합될 수 있다. 링커 서열은 일반적으로 가요성을 제한할 수 있는 벌키한 측쇄를 갖지 않는 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌 및 세린으로 주로 이루어진다는 점에서 가요성이다. 대안적으로, 더 큰 강성을 가진 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 종종 링커 서열의 길이는 약 12개 미만, 예컨대 10개 미만, 또는 2 내지 10개의 아미노산일 것이다. 링커의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산일 수 있다. 본 발명의 다중-도메인 결합 분자에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예에는, 비제한적으로, GGGGS (서열번호 33), GGGSG (서열번호 34), GGSGG (서열번호 35), GSGGG (서열번호 36), GSGGGP (서열번호 37), GGEPS (서열번호 38), GGEGGGP (서열번호 39), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 40) (WO2010/133828에 기재된 바와 같음) 및 GGGSGGGG (서열번호 41)가 포함된다. 추가의 링커는 하기 서열 모티프 중 하나 이상을 갖는 서열을 포함할 수 있다: GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS 및 TVLSSAS. 면역글로불린 Fc가 TCR에 융합되는 경우, 링커의 유무에 관계없이, 알파 또는 베타 사슬에 융합될 수 있다. 또한, Fc의 개별 사슬은 TCR의 개별 사슬에 융합될 수 있다.
바람직하게는, Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 서브클래스로부터 유래될 수 있다. 2개의 사슬은 CH2 및 CH3 불변 도메인 및 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역에 실질적으로 또는 부분적으로 상응할 수 있다. 힌지는 코어 힌지 도메인의 전부 또는 일부 및 하부 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 2개의 사슬을 연결하는 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함한다.
Fc 영역은 WT 서열에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 그러한 돌연변이는 바람직한 치료 특성을 도입할 목적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 이종이량체화를 용이하게 하기 위해, KiH (knobs into holes) 돌연변이가 CH3 도메인으로 조작될 수 있다. 이 경우에, 하나의 사슬은 Y와 같은 벌키한 돌출 잔류물 (즉, 노브 (knob))을 포함하도록 조작되고, 다른 하나는 상보적인 포켓 (즉, 홀 (hole))을 포함하도록 조작된 사슬이다. KiH 돌연변이에 적합한 위치는 당업계에 공지되어 있다. 추가로 또는 대안적으로, Fcy 수용체에 대한 결합을 폐지하거나 감소시키고/시키거나 FcRn에 대한 결합을 증가시키고/시키거나 Fab 아암 (arm) 교환을 방지하거나 프로테아제 부위를 제거하는 돌연변이가 도입될 수 있다.
PK 변형 모이어티는 또한 알부민-결합 도메인일 수 있고, 이는 또한 반감기를 연장하도록 작용할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 알부민은 부분적으로 그의 크기, 신장 역치 (renal threshold) 이상, 및 FcRn을 통한 특이적 상호작용 및 재순환으로 인해, 19일의 긴 순환 반감기를 갖는다. 알부민에 대한 부착은 생체내 치료 분자의 순환 반감기를 개선하기 위한 널리 공지된 전략이다. 알부민은 특이적 알부민 결합 도메인의 사용을 통해 비-공유적으로 부착되거나 컨주게이션 (conjugation) 또는 직접적인 유전적 융합에 의해 공유적으로 부착될 수 있다. 개선된 반감기를 위해 알부민에 대한 부착을 이용한 치료 분자의 예는 문헌[Sleep et al., Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34]에 나와 있다.
알부민-결합 도메인은 임의의 공지된 알부민-결합 모이어티를 포함하여, 알부민에 결합할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 알부민 결합 도메인은 알부민에 특이적으로 결합하는 내인성(endogenous) 또는 외인성(exogenous) 리간드, 작은 유기 분자, 지방산, 펩타이드 및 단백질로부터 선택될 수 있다. 바람직한 알부민 결합 도메인의 예는 문헌[Dennis et al., J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43]에 기재된 것과 같은 짧은 펩타이드 (예를 들어, 펩타이드 QRLMEDICPLPRWGCLWEDDF); 항체, 항체 단편 및 항체 유사 스캐폴드와 같은 알부민에 결합하도록 조작된 단백질, 예를 들어 GSK에 의해 상업적으로 제공되는 Albudab® (O'Connor-Semmes et al., Clin Pharmacol Ther. 2014 Dec;96(6):704-12) 및 Ablynx에 의해 상업적으로 제공되는 Nanobody® (Van Roy et al., Arthritis Res Ther. 2015 May 20;17:135); 및 연쇄상구균 단백질 G (Streptococcal protein G; SPG) 단백질 (Stork et al., Eng Des Sel. 2007 Nov;20(11):569-76)과 같은 자연에서 발견되는 알부민 결합 도메인을 기반으로 하는 단백질, 예를 들어 Affibody에 의해 상업적으로 제공되는 Albumod®를 포함한다. 바람직하게는, 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 인간 알부민에 대한 알부민 결합 도메인의 친화도는 피코몰 내지 마이크로몰의 범위에 있을 수 있다. 인간 혈청 (35 내지 50 mg/ml, 대략 0.6 mM)에서 알부민의 매우 높은 농도를 감안하면, 실질적으로 모든 알부민 결합 도메인이 생체내 알부민에 결합될 것으로 추정된다.
알부민-결합 모이어티는 임의의 적합한 순서 또는 구성으로 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 및/또는 면역 이펙터)의 C 또는 N 말단에 연결될 수 있다. 알부민-결합 모이어티는 링커를 통해 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 및/또는 면역 이펙터)에 연결될 수 있다. 링커 서열은 일반적으로 가요성을 제한할 수 있는 벌키한 측쇄를 갖지 않는 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌 및 세린으로 주로 이루어진다는 점에서 가요성이다. 대안적으로, 더 큰 강성을 가진 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 종종 링커 서열의 길이는 약 12개 미만, 예컨대 10개 미만, 또는 2 내지 10개의 아미노산일 것이다. 링커의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산일 수 있다. 본 발명의 다중-도메인 결합 분자에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예에는, 비제한적으로, GGGGS (서열번호 33), GGGSG (서열번호 34), GGSGG (서열번호 35), GSGGG (서열번호 36), GSGGGP (서열번호 37), GGEPS (서열번호 38), GGEGGGP (서열번호 39), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 40) (WO2010/133828에 기재된 바와 같음) 및 GGGSGGGG (서열번호 41)가 포함된다. 추가의 링커는 하기 서열 모티프 중 하나 이상을 갖는 서열을 포함할 수 있다: GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS 및 TVLSSAS. 알부민-결합 모이어티가 TCR에 연결된 경우, 링커의 유무에 관계없이, 알파 또는 베타 사슬에 연결될 수 있다.
진단 목적을 위한 검출 가능한 표지에는 예를 들어 형광 표지, 방사성 표지, 효소, 핵산 프로브 및 조영제가 포함된다.
일부 목적을 위해, 본 발명의 특이적 결합 분자는 다가 특이적 결합 분자 복합체를 형성하기 위해 몇몇 특이적 결합 분자를 포함하는 복합체로 응집될 수 있다. 다가 특이적 결합 분자 복합체의 생성에 사용될 수 있는 다량체화 도메인(multimerization domain)을 포함하는 다수의 인간 단백질이 존재한다. 예를 들어, 증가된 혈청 지속성 및 단량체성 scFv 단편에 비해 현저히 감소된 오프율(off-rate)을 나타내는 scFv 항체 단편의 사량체를 생성하는 데 사용된 p53의 사량체화 도메인 (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). 헤모글로빈은 또한 이러한 종류의 적용에 사용될 수 있는 사량체화 도메인을 가지고 있다. 본 발명의 다가 특이적 결합 분자 복합체는 본 발명의 비-다량체성 고유 (모계, 천연, 비돌연변이된 야생형 또는 스캐폴드로도 지칭됨) T 세포 수용체 이종이량체와 비교하여 복합체에 대해 향상된 결합 능력을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 결합 분자의 다가 복합체가 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 그러한 다가 특이적 결합 분자 복합체는 특히 시험관내 또는 생체내 특정 항원을 제시하는 세포를 추적하거나 표적화하는 데 유용하고, 또한 그러한 용도를 갖는 추가의 다가 특이적 결합 분자 복합체의 생성을 위한 중간체로서 유용하다.
본 발명의 특이적 결합 분자와 회합될 수 있는 치료제에는 면역 조절제 및 이펙터, 방사성 화합물, 효소 (예를 들어 퍼포린) 또는 화학 치료제 (예를 들어 시스-플라틴)가 포함된다. 독성 효과가 원하는 위치에서 실행되도록 하기 위해, 독소는 화합물이 서서히 방출되도록 특이적 결합 분자에 연결된 리포솜 내부에 있을 수 있다. 이는 체내 수송 동안 손상 효과를 방지하고, 특이적 결합 분자가 관련 항원 제시 세포에 결합한 후 독소가 최대 효과를 갖는다는 것을 보장할 것이다.
적합한 치료제의 예에는 비제한적으로, 하기를 포함한다:
ㆍ저분자 세포독성제, 즉 700 달톤 미만의 분자량를 갖는 포유류 세포를 사멸시키는 능력이 있는 화합물. 그러한 화합물은 또한 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 함유할 수 있음. 또한, 이러한 저분자 세포독성제도 전구약물(pro-drugs), 즉 생리학적 조건 하에서 붕괴되거나 전환되어 세포독성제를 방출하는 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 함. 그러한 제제의 예로는 시스-플라틴, 메이탄신 유도체, 라헬마이신, 칼리키아미신, 도세탁셀, 에토포시드, 젬시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미토산트론, 소르피머 나트륨포토프린 II, 테모졸로마이드, 토포테칸, 트리메트리에이트 20아버20에이트 (trimetreate 20arbour20ate), 아우리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신이 포함됨;
ㆍ펩타이드 세포 독소, 즉 포유류 세포를 사멸시키는 능력이 있는 단백질 또는 이의 단편.
예를 들어, 리신(ricin), 디프테리아 독소, 슈도모나스 (pseudomonas) 박테리아 외독소(exotoxin) A, DNA 분해효소 (Dnase) 및 RNA 분해효소 (Rnase);
ㆍ방사성 핵종, 즉 하나 이상의 α 또는 β 입자, 또는 γ선의 동시 방출로 붕괴하는 불안정한 원소의 동위원소. 예를 들어, 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213; 킬레이트제는 이들 방사성 핵종의 고친화도 TCR 또는 이의 다량체에 대한 회합(association)을 용이하게 하는 데 사용될 수 있음;
ㆍ면역 자극제, 즉 면역 반응을 자극하는 면역 이펙터 분자. 예를 들어, IL-2 및 IFN-γ와 같은 사이토카인,
ㆍ초항원(superantigens) 및 이의 돌연변이체;
ㆍTCR-HLA 융합물(fusion), 예를 들어 펩타이드-HLA 복합체에 대한 융합물로서, 상기 펩타이드는 일반적인 인간 병원체, 예컨대 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV)로부터 유래됨;
ㆍ케모카인, 예컨대 IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등;
ㆍ항-T 세포 또는 NK 세포 결정인자 항체 (예를 들어 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 포함하는, 항체 또는 이의 단편;
ㆍ항체 유사 결합 특징을 가진 대체 단백질 스캐폴드
ㆍ보체 활성제;
ㆍ이종(xenogeneic) 단백질 도메인, 동종(allogeneic) 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 펩타이드.
하나의 바람직한 구현예는 면역 이펙터와 회합된 (일반적으로 알파 또는 베타 사슬 또는 둘 다의 N- 또는 C-말단에 대한 융합에 의해, 임의의 적합한 구성으로) 본 발명의 가용성 특이적 결합 분자에 의해 제공된다. 특히 바람직한 면역 이펙터는 항-CD3 항체, 또는 상기 항-CD3 항체의 기능적 단편 또는 변이체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 그러한 단편 및 변이체를 포함한다. 항-CD3 항체의 예에는 비제한적으로, OKT3, UCHT-1, BMA-031 및 12F6이 포함된다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체 단편 및 변이체/유사체에는, 몇 가지만 예로 들면, 미니바디 (minibody), Fab 단편, F(ab')2 단편, dsFv 및 scFv 단편, Nanobodies™ (Ablynx (벨기에)에 의해 시판되는 이러한 작제물은 낙타과 (예를 들어 낙타 또는 라마) 항체로부터 유래된 합성 단일 면역글로불린 가변 무거운 도메인을 포함) 및 도메인 항체 (친화도 성숙된 단일 면역글로불린 가변 무거운 도메인 또는 면역글로불린 가변 가벼운 도메인 포함하는, Domantis (벨기에)) 또는 항체 유사 결합 특징을 나타내는 대체 단백질 스캐폴드, 예컨대 Affibodies (조작된 단백질 A 스캐폴드를 포함하는, Affibody (스웨덴)) 또는 Anticalins (조작된 안티칼린을 포함하는, Pieris (독일))가 포함된다.
특이적 결합 분자의 또 다른 바람직한 포맷에서, TCR 가변 도메인 및 면역 이펙터 도메인은 별도의 폴리펩타이드 사슬에서 교호되어(alternated) 이량체화를 유도할 수 있다. 그러한 포맷은 WO2019012138에 기재되어 있다. 요약하면, 제1 폴리펩타이드 사슬은 (N 말단에서 C 말단으로) 제1 항체 가변 도메인, 이어서 TCR 가변 도메인을 포함하고, 이어서 선택적으로 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 제2 사슬은 (N 말단에서 C 말단으로) TCR 가변 도메인, 이어서 제2 항체 가변 도메인을 포함하고, 이어서 선택적으로 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 적절한 길이의 링커를 고려해 볼 때, 사슬은 선택적으로 Fc 도메인을 포함하는 다중-특이적 분자로 이량체화될 것이다. 도메인이 이러한 방식으로 상이한 사슬 상에 위치되는 분자는 또한 본 명세서에서 고려되는 디아바디 (diabody)로도 지칭될 수 있다. 추가의 사슬 및 도메인이 첨가되어 예를 들어, 트리아바디 (triabody)를 형성할 수 있다.
따라서, 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 분자의 군으로부터 선택되는 이중 특이성 폴리펩타이드 분자가 또한 본 명세서에 제공되고, 여기서: 제1 폴리펩타이드 사슬은 인간 면역 이펙터 세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 가변 도메인 (VD1)의 제1 결합 영역, 및
MHC-회합 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 TCR의 가변 도메인 (VR1)의 제1 결합 영역, 및
상기 도메인을 연결하는 제1 링커 (LINK1)를 포함하고;
제2 폴리펩타이드 사슬은 MHC-회합 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 TCR의 가변 도메인 (VR2)의 제2 결합 영역, 및
인간 면역 이펙터 세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 가변 도메인 (VD2)의 제2 결합 영역, 및
상기 도메인을 연결하는 제2 링커 (LINK2)를 포함하고;
상기 제1 결합 영역 (VD1) 및 상기 제2 결합 영역 (VD2)은 회합하여 인간 면역 이펙터 세포의 세포 표면 항원에 결합하는 제1 결합 부위 (VD1)(VD2)를 형성하고;
상기 제1 결합 영역 (VR1) 및 상기 제2 결합 영역 (VR2)은 회합하여 상기 MHC-회합 펩타이드 에피토프에 결합하는 제2 결합 부위 (VR1)(VR2)를 형성하고;
상기 2개의 폴리펩타이드 사슬은 인간 IgG 힌지 도메인 및/또는 인간 IgG Fc 도메인 또는 이의 이량체화 부분에 융합되고;
상기 2개의 폴리펩타이드 사슬은 상기 힌지 도메인 및/또는 Fc-도메인 사이의 공유 결합 및/또는 비-공유 결합에 의해 연결되고;
상기 이중 특이성 폴리펩타이드 분자는 세포 표면 분자 및 MHC-회합 펩타이드 에피토프, 및 이중 특이성 폴리펩타이드 분자와 동시에 결합할 수 있고, 2개의 폴리펩타이드 사슬에서 결합 영역의 순서는 VD1-VR1 및 VR2-VD2 또는 VD1-VR2 및 VR1-VD2, 또는 VD2-VR1 및 VR2-VD1 또는 VD2-VR2 및 VR1-VD1로부터 선택되고, 상기 도메인은 LINK1 또는 LINK2에 의해 연결되고, MHC-회합 펩타이드 에피토프는 GLSPTVWLSV 또는 GLSPTVWLSA이고 MHC는 HLA-A*02이다.
특이적 결합 분자와 항-CD3 항체의 연결은 공유적 또는 비-공유적 부착을 통해 이루어질 수 있다. 공유적 부착은 직접적 부착이거나 링커 서열을 통한 간접적 부착일 수 있다. 링커 서열은 일반적으로 가요성을 제한할 수 있는 벌키한 측쇄를 갖지 않는 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌 및 세린으로 주로 이루어진다는 점에서 가요성이다. 대안적으로, 더 큰 강성을 가진 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 종종 링커 서열의 길이는 약 12개 미만, 예컨대 10개 미만, 또는 2 내지 10개의 아미노산일 것이다. 본 발명의 특이적 결합 분자에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예에는, 비제한적으로, GGGGS (서열번호 33), GGGSG (서열번호 34), GGSGG (서열번호 35), GSGGG (서열번호 36), GSGGGP (서열번호 37), GGEPS (서열번호 38), GGEGGGP (서열번호 39), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 40) (WO2010/133828에 기재된 바와 같음) 및 GGGSGGGG (서열번호 41)가 포함된다. 추가의 링커는 하기 서열 모티프 중 하나 이상을 갖는 서열을 포함할 수 있다: GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS 및 TVLSSAS.
본 발명의 항-CD3-특이적 결합 분자 융합 작제물의 특정 구현예는 알파 사슬이 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 가변 도메인으로 구성되고/되거나 베타 사슬이 서열번호 7 내지 11의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 가변 도메인으로 구성되는 이들 알파 및 베타 사슬 쌍을 포함한다. 상기 알파 및 베타 사슬은 비-고유 디설파이드 결합을 포함하는 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 알파 사슬의 불변 도메인은 8개의 아미노산에 의해 절단될 수 있다. 알파 및/또는 베타 사슬의 N 또는 C 말단은 서열번호 33 내지 41로부터 선택된 링커를 통해 항-CD3 scFv 항체 단편에 융합될 수 있다. 그러한 항-CD3-특이적 결합 분자 융합 작제물의 특정 바람직한 구현예는 하기 도 4에 제공된다:
Figure pct00009
또한, 상기 항-CD3-TCR 융합 작제물의 기능적 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 기능적 변이체는 바람직하게는 기준 서열과 적어도 90%의 동일성, 예컨대 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖지만, 그럼에도 불구하고 기능적으로 동등하다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 특이적 결합 분자, 또는 특이적 결합 분자 항-CD3 융합물을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 cDNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 α 사슬 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 특이적 결합 분자의 β 사슬 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 핵산은 비-천연(non-naturally) 발생 핵산이고/이거나 정제 및/또는 조작될 수 있다. 핵산 서열은 이용되는 발현 시스템에 따라, 코돈 최적화될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 발현 시스템은 박테리아 세포, 예컨대 대장균 (E. coli), 또는 효모 세포, 또는 포유류 세포, 또는 곤충 세포를 포함할 수 있거나, 무세포 발현 시스템일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 벡터는 TCR 발현 벡터이다. 적합한 TCR 발현 벡터는 예를 들어, 감마-레트로바이러스 벡터 또는 보다 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 추가 세부사항은 문헌[Zhang 2012] 및 문헌 내 참고문헌에서 확인할 수 있다 (Zhang et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Jun 1; 64(8): 756-762).
본 발명은 또한 본 발명의 벡터, 바람직하게는 TCR 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 적합한 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 면역 세포, 보다 더 바람직하게는 T 세포를 포함한다. 벡터는 알파 사슬 및 베타 사슬을 각각 인코딩하는, 단일 개방 판독 프레임, 또는 2개의 별개의 개방 판독 프레임(open reading frame; ORF)에서 인코딩하는 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 양태는 본 발명의 특이적 결합 분자의 알파 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 발명의 특이적 결합 분자의 베타 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 그러한 세포는 특히 입양 요법에 유용하다. 본 발명의 세포는 단리 및/또는 재조합 및/또는 비-천연 발생 및/또는 조작된 세포일 수 있다.
본 발명의 특이적 결합 분자가 입양 요법에 유용성을 갖기 때문에, 본 발명은 본 발명의 특이적 결합 분자를 제시하는 비-천연 발생 및/또는 정제 및/또는 조작된 세포, 특히 T-세포를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 특이적 결합 분자를 제시하는 확장된 T 세포의 집단을 제공한다. 본 발명의 특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 (예컨대 DNA, cDNA 또는 RNA)으로 T 세포를 형질감염시키기에 적합한 다수의 방법이 존재한다 (예를 들어 문헌[Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131] 참조). 본 발명의 특이적 결합 분자를 발현하는 T 세포는 암 또는 만성 바이러스 감염의 입양 요법-기반 치료에 사용하기에 적합할 것이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 입양 요법이 수행될 수 있는 다수의 적합한 방법이 존재한다 (예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308] 참조).
당업계에 널리 공지된 바와 같이, 단백질 (TCR 포함)은 번역 후 변형의 대상이 될 수 있다. 글리코실화는 폴리펩타이드 또는 TCR 사슬 내의 정의된 아미노산에 대한 올리고당 모이어티의 공유결합 부착을 포함하는, 그러한 변형 중 하나이다. 예를 들어, 아스파라긴 잔기 또는 세린/트레오닌 잔기는 올리고당 부착을 위한 널리 공지된 위치이다. 특정 단백질의 글리코실화 상태는 단백질 서열, 단백질 구조 및 특정 효소의 가용성을 포함하는 다수의 요인에 따라 달라진다. 또한, 글리코실화 상태 (즉, 올리고당 유형, 공유 결합 및 총 부착 수)가 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 재조합 단백질을 생산할 때, 글리코실화를 제어하는 것이 보통 바람직하다. 제어된 글리코실화는 항체 기반 치료제를 개선하는 데 사용되었다 (Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.). 본 발명의 가용성 TCR의 경우, 글리코실화는 특정 세포주 (예를 들어 비제한적으로, 포유류 세포주, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 (HEK) 세포를 포함함)를 사용하거나 화학적 변형에 의해 조절될 수 있다. 글리코실화가 약물동력학을 개선하고, 면역원성을 감소시키고, 고유 인간 단백질을 보다 가깝게 모방할 수 있기 때문에 그러한 변형이 바람직할 수 있다 (Sinclair and Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35).
환자에게 투여하기 위해, 본 발명의 특이적 결합 분자 (바람직하게는 검출 가능한 표지 또는 치료제와 회합되거나 형질감염된 T 세포 상에서 발현됨), 본 발명의 특이적 결합 분자-항 CD3 융합 분자, 핵산, 발현 벡터 또는 세포는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 멸균 약제학적 조성물의 일부로서 제공될 수 있다. 이 약제학적 조성물은 (이를 환자에게 투여하는 원하는 방법에 따라) 임의의 적합한 형태일 수 있다. 이는 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉된 용기 내에 제공될 것이고, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 그러한 키트에는 일반적으로 (필수적인 것은 아니지만) 사용 지침이 포함될 것이다. 이는 복수의 상기 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 임의의 적절한 경로, 예컨대 비경구 (피하, 근육내, 경막내 또는 정맥내 포함), 장관 (경구 또는 직장 포함), 흡입 또는 비강내 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 그러한 조성물은 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 멸균 조건 하에서 활성 성분을 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 물질의 투여량은 치료될 질환 또는 장애, 치료될 개체의 연령 및 병태 등에 의해 결정되는 광범위한 제한에 따라 달라질 수 있고, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자에 대한 적합한 용량 범위는 25 ng/kg 내지 50 μg/kg 또는 1 μg 내지 1 g의 범위일 수 있다. 의사는 궁극적으로 사용될 적절한 복용량을 결정할 것이다.
본 발명의 특이적 결합 분자, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 약제학적 조성물, 벡터, 핵산 및 세포는 실질적으로 순수한 형태, 예를 들어 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순도로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기를 제공한다:
ㆍ의약에 사용하기 위한, 바람직하게는 만성 HBV 감염으로 인한 만성 HBV 또는 간세포 암종 (HCC)을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 특이적 결합 분자, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포;
ㆍ만성 HBV 감염으로 인한 만성 HBV 또는 간세포 암종 (HCC)을 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 특이적 결합 분자, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포의 용도;
ㆍ본 발명의 특이적 결합 분자, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 암 또는 종양을 치료하는 방법;
ㆍ본 발명의 특이적 결합 분자, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포를 포함하는 인간 대상체에 투여하기 위한 주사 가능한 제형.
본 발명의 특이적 결합 분자, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포는 주사, 예컨대 정맥내, 피하 또는 직접적인 종양내 주사에 의해 투여될 수 있다. 인간 대상체는 HLA-A*02 아형일 수 있다. 종양의 치료가 고려되는 경우, 종양은 고형 또는 액체 종양일 수 있다.
치료 방법은 하나 이상의 추가의 항-바이러스제 및/또는 항-신생물제(anti-neoplastic agent)를 개별적으로, 조합하여, 또는 순차적으로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 각 양태의 바람직한 특징은 다른 양태 각각에 대해 준용된다. 본 명세서에 언급된 선행 기술 문서는 법률이 허용하는 최대 범위까지 참조로 포함된다.
도 1은 스캐폴드 TCR 알파 및 베타 사슬의 가용성 버전의 세포외 영역 아미노산 서열을 제공한다.
도 2는 돌연변이된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
도 3은 돌연변이된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
도 4는 도 2 및 도 3에 기재된 바와 같은 특정 돌연변이된 TCR 가변 도메인을 포함하는 TCR-항CD3 융합물의 아미노산 서열을 제공한다.
도 5는 알라닌 치환 펩타이드에 대한 가용성 WT TCR의 비교 결합 데이터를 제공한다.
도 6은 도 2 및 도 3에 기재된 바와 같은 돌연변이된 TCR 가변 도메인을 포함하는 TCR-항CD3 융합 분자의 효능 및 특이성을 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
도 7은 도 2 및 도 3에 기재된 바와 같은 돌연변이된 TCR 가변 도메인을 포함하는 TCR-항CD3 융합 분자에 의한 항원 위치 세포의 사멸을 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
도 8은 도 2 및 도 3에 기재된 바와 같은 돌연변이된 TCR 가변 도메인을 포함하는 TCR-항CD3 융합 분자의 특이성을 추가로 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
도 9는 도 2 및 도 3에 기재된 바와 같은 돌연변이된 TCR 가변 도메인을 포함하는 TCR-항CD3 융합 분자가 감염된 세포의 백분율 감소를 매개함을 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에서 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1 - 가용성 포맷의 WT TCR의 발현, 리폴딩 (refolding) 및 정제
방법
가용성 TCR의 알파 및 베타 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열 (도 1의 아미노산 서열에 상응함)은 표준 방법을 이용하여 pGMT7-기반 발현 플라스미드에 별도로 클로닝했다 (문헌[Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbour laboratory press]에 기재된 바와 같음). 발현 플라스미드를 대장균 균주 로제타 (Rosetta)(BL21pLysS)에 별도로 형질전환시켰다. 발현을 위해, 세포를 37℃에서 2시간 동안 1%의 글리세롤 (+ 암피실린 100 μg/ml 및 클로람페니콜 34 μg/ml)이 보충된 자가-유도(auto-induction) 배지에서 230 rpm으로 성장시킨 후 온도를 밤새 30℃로 낮췄다. 이후에 세포를 원심분리로 수거했다. 제조사의 지침에 따라 세포 펠렛을 BugBuster 단백질 추출 시약 (Merck Millipore)으로 용해시켰다. 봉입체 펠렛을 원심분리로 회수했다. 펠렛을 트리톤 (Triton) 완충액 (50 mM의 트리스 (Tris)-HCl pH 8.1, 0.5%의 트리톤-X100, 100 mM의 NaCl, 10 mM의 NaEDTA)으로 2회 세척하고, 최종적으로 무세제 완충액 (50 mM의 트리스-HCl pH 8.1, 100 mM의 NaCl, 10 mM의 NaEDTA)에 재현탁시켰다. 봉입체 단백질 수율은 6 M 구아니딘-HCl로 가용화시키고 OD280을 측정하여 정량화했다. 이어서 흡광 계수를 사용하여 단백질 농도를 계산했다. 봉입체 순도는 8 M 우레아로 가용화시키고 환원 조건 하에서 4 내지 20%의 SDS-PAGE에 약 2 μg을 로딩하여 측정했다. 이어서 순도를 농도 측정 소프트웨어 (Chemidoc, Biorad)를 사용하여 추정하거나 계산했다. 봉입체는 단기 보관의 경우 +4℃에서 보관하고, 장기 보관의 경우 -20℃ 또는 -70℃에서 보관했다.
가용성 TCR 리폴딩을 위해, α 및 β 사슬-함유 봉입체를 먼저 혼합하고, 가용화/변성 완충액 (6 M 구아니딘-하이드로클로라이드, 50 mM의 트리스 HCl pH 8.1, 100 mM의 NaCl, 10 mM의 EDTA, 20 mM의 DTT)으로 희석한 다음 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 이어서 리폴드 (refold) 완충액 (100 mM의 트리스 pH 8.1, 800 또는 400 mM의 L-아르기닌 HCL, 2 mM의 EDTA, 4 M 우레아, 6.5 mM의 시스테아민 하이드로클로라이드 및 1.9 mM의 시스타민 디하이드로클로라이드)으로 추가로 희석하여 리폴딩을 개시하고, 용액을 잘 혼합했다. 리폴딩된 혼합물을 5℃ ± 3℃에서 18 내지 20시간 동안 리폴드 1 L당 10 L H2O로 투석했다. 이 기간 후, 투석 완충액을 10 mM의 트리스 pH 8.1 (10 L)로 2회 교체하고, 투석을 추가로 15시간 동안 계속했다. 이어서 리폴딩 혼합물을 0.45 μm의 셀룰로스 필터를 통해 여과했다.
가용성 TCR의 정제는 투석된 리폴드를 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼에 적용하고, Akta® Pure(GE Healthcare)를 사용하여 6 컬럼 부피에 걸쳐 20 mM의 트리스 pH 8.1에서 0 내지 500 mM의 NaCl의 구배로 결합 단백질을 용출함으로써 개시됐다. 피크 TCR 분획을 SDS PAGE로 동정한 후, 풀링(pooling) 및 농축했다. 이어서 농축된 샘플을 Dulbecco의 PBS 완충액으로 사전-평형화된 Superdex® 200 Increase 10/300 GL 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare)에 적용했다. 피크 TCR 분획을 풀링 및 농축하고, 정제된 물질의 최종 수율을 계산했다.
실시예 2 - 가용성 TCR-항CD3 융합 분자의 발현, 리폴딩 및 정제
방법
TCR 베타 사슬이 링커를 통해 항-CD3 단일 사슬 항체에 융합된 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 가용성 TCR-항CD3 융합 분자의 제조를 수행했다. 또한 리폴딩 단계에서 산화 환원 시약의 농도는 1 mM의 시스타민 디하이드로클로라이드, 10 mM의 시스테아민 하이드로클로라이드였다). 최종적으로, 음이온 교환 단계 후에 양이온 교환 단계를 추가했다. 이 경우에, 음이온 교환으로부터의 피크 분획을 40 mM의 MES로 20배 희석하고, POROS® 50HS 양이온 교환 컬럼에 적용했다. 결합된 단백질을 40 mM의 MES에서 0 내지 500 mM NaCl의 구배로 용출시켰다. 피크 분획을 풀링하고, 200 mM의 트리스 pH 8.1로 조정한 후 농축시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 겔 여과 매트릭스에 직접 적용했다.
실시예 3 - 결합 특징화
펩타이드-HLA 복합체에 대한 정제된 가용성 TCR 및 융합 분자의 결합 분석은 BIAcore 8K, BIAcore 3000 또는 BIAcore T200 기기 중 하나를 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행됐다. 비오틴화된 클래스 I HLA-A*02 분자를 관심 펩타이드로 리폴딩하고, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 정제했다 (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). 모든 측정은 0.005%의 P20이 보충된 둘베코의 PBS 완충액으로 25℃에서 수행했다.
비아코어( BIAcore) 방법
비오틴화된 펩타이드-HLA 단량체를 비오틴 CAPture 센서 칩(Biotin CAPture sensor chip)의 스트렙타비딘-결합 CM-5에 고정시켰다. 평형 결합 상수는 펩타이드-HLA-A*02 복합체의 약 500 반응 단위 (RU)로 코팅된 유동 세포 상에 10 내지 30 μl min-1의 일정한 유속으로 주입된 가용성 TCR 또는 융합 분자의 연속 희석법을 이용하여 측정됐다. 평형 반응은 펩타이드-HLA를 함유하지 않는 대조군 유동 세포에 대한 벌크 완충 반응 (bulk buffer response)을 빼서 각 TCR 농도에 대해 정규화됐다. KD 값을 Prism 소프트웨어와 Langmuir 결합 등온선을 사용하여 비-선형 곡선 피팅, 결합 = C*Max/(C + KD)로 수득했고, 상기 식에서 "결합(bound)"은 주입된 TCR 농도 C에서 RU의 평형 결합이고, Max는 최대 결합이다.
고친화성 상호작용을 위해, 결합 파라미터를 단일 주기 동역학 분석으로 결정했다. 5개의 상이한 농도의 가용성 TCR 또는 융합 단백질을 50 내지 60 μl min-1의 유속을 사용하여 약 50 내지 200 RU의 펩타이드-HLA 복합체로 코팅된 유동 세포 상에 주입했다. 일반적으로, 60 내지 200 μl의 가용성 TCR 또는 융합 분자를 2 내지 100 nM의 최고 농도로 주입했고, 연속 2배 희석액을 다른 4회 주사에 사용했다. 가장 낮은 농도를 먼저 주입했다. 해리 상 (dissociation phase)을 측정하기 위해, 완충액을 일반적으로 1 내지 3시간 후에 10% 이상의 해리가 발생할 때까지 주입했다. 동력학적 파라미터는 제조사의 소프트웨어를 사용하여 계산했다. 해리 상을 단일 지수 감쇠 방정식에 피팅하여 반감기를 계산할 수 있다. 평형 상수 KD를 koff/kon으로부터 계산했다.
실시예 4 - 가용성 WT TCR의 결합 특징화
도 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 가용성 WT TCR을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조했다. 정제된 단백질의 수율은 9.1 mg/L였다. 결합 파라미터를 실시예 3에 따른 평형 결합 상수를 기반으로 계산했다. pHLA 복합체를 동족 펩타이드, 펩타이드의 공지된 바이러스 변이체, 또는 무관한 펩타이드를 포함하여 제조했다.
결과
동족 펩타이드 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체에 결합된 가용성 WT TCR은 1.44 μM +/- 0.076 μM의 KD를 갖는다 (Bmax = 303; R2 = 0.997). 변이체 펩타이드 GLSPTVWLSA-HLA-A*02에 결합된 동일한 TCR은 1.23 μM +/- 0.07 μM의 KD를 갖는다 (Bmax = 152; R2 = 0.996). 이들 데이터는 가용성 WT TCR을 사용하여 천연 및 변종 펩타이드 둘 다를 표적화할 수 있음을 나타낸다.
가용성 WT TCR의 특이성을 자연적으로 존재하는 24개의 무관한 펩타이드 HLA-A*02 복합체의 패널에 대해 평가했다. 무관한 pHLA를 3개의 그룹으로 나누고 3개의 유동 세포 중 하나에 로딩했다. 가용성 야생형 TCR을 모든 유동 세포에 대해 68.3 및 6.8 μM의 농도로 주입했다. 가용성 WT TCR이 -HLA-A*02 복합체에 특이적이라는 것을 나타내는 두 농도 모두에서 어떠한 유의미한 결합도 검출되지 않았다.
추가의 특이성 평가는 GLSPTVWLSV 펩타이드의 각 잔기가 순차적으로 알라닌으로 대체된 펩타이드의 패널을 사용하여 수행됐다. 알라닌 치환된 펩타이드 각각에 대한 상대적 결합을 측정하고, 결과 데이터를 도 5에 나타냈다. 펩타이드의 중앙 부분에서의 알라닌 치환은 TCR 결합의 손실을 초래한다. 펩타이드의 중앙 부분에서의 치환에 대한 낮은 허용은 TCR이 높은 특이성을 가지므로, 대체 펩타이드와의 교차 반응성 위험이 낮음을 나타낸다.
실시예 5 - 항-CD3에 융합된 돌연변이된 가용성 TCR의 결합 특징화
도 2 및 도 3에 각각 제공된 돌연변이된 TCR 알파 및 베타 가변 도메인 아미노산 서열 (서열번호 4 내지 11)을 사용하여 TCR-항CD3 융합 분자를 제조했다. 제조는 실시예 2에 따라 수행됐다. 도 4는 하기에 나타낸 이들 TCR-항CD3 융합 분자 중 4개의 전체 아미노산 서열을 제공한다. 이들 4개의 융합 분자 각각의 수율은 괄호 안에 나타낸다
ㆍa19b03 (6.02 mg/L)
ㆍa13b03 (4.13 mg/L)
ㆍa01b03 (3.78) mg/L)
ㆍa13b09 (3.46 mg/L)
펩타이드-HLA-A*02 복합체에 대한 결합은 실시예 3에 따라 측정됐다.
결과
하기 표에 나타낸 데이터는 표시된 TCR 가변 도메인 서열을 포함하는 융합 분자가 초-생리학적 결합 친화도 및 반감기를 갖는 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체를 인식했음을 나타낸다.
Figure pct00010
실시예 6 - 항-CD3에 융합된 돌연변이된 가용성 TCR의 효능 및 특이성 특징화
T 세포 활성화
도 2 및 도 3에 기재된 바와 같은 TCR 가변 도메인 서열을 포함하는 융합 분자는 GLSPTVWLSV-HLA-A*02 복합체를 제시하는 세포에 대한 CD3+ T 세포의 강력하고 특이적 활성화를 매개하는 능력에 대해 평가했다. 인터페론-γ (IFN-γ) 방출을 T 세포 활성화를 위한 판독값으로서 사용했다.
방법
제조사의 지침에 따라 인간 IFN-γ ELISPOT 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 검정을 수행했다. 간략하게, 표적 세포를 검정 배지 (10%의 열 불활성화 FBS 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640)에서 1x106/ml의 밀도로 제조하고, 50 μl의 부피에 웰당 50,000개의 세포로 플레이팅했다. 신선한 공여자 혈액으로부터 단리된, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하고, 50 μl의 부피에 웰당 50,000개의 세포로 플레이팅했다 (각 실험에 사용된 정확한 세포 수는 공여자에 따라 다르고, 검정에 적합한 범위 내에서 반응을 초래하도록 조정될 수 있음). 융합 분자를 적정하여 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 및 0.0001 nM의 최종 농도 (임상적으로 예상되는 관련 범위에 걸쳐 있음)를 수득하고, 50 μl의 부피로 웰에 첨가했다.
플레이트를 제조사의 지침에 따라 준비했다. 표적 세포, 이펙터 세포 및 융합 분자를 관련 웰에 첨가하고, 검정 배지를 사용하여 200 μl의 최종 부피로 만들었다. 모든 반응을 삼중으로 수행했다. 대조군 웰도 융합 분자를 생략하여 제조했다. 이어서 플레이트를 밤새 인큐베이션했다 (37℃/5% CO2). 다음날 플레이트를 세척 완충액 (탈이온수로 구성된 0.05% Tween-20을 함유한 1xPBS 사셰(sachet))으로 3회 세척했다. 이어서 1차 검출 항체를 50 μl의 부피로 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 다시 3회 세척했다. 2차 검출은 희석된 50 μl의 스트렙타비딘-HRP를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 단계를 반복하여 수행됐다. 사용 전 15분 이내에, AEC 크로모겐 1방울 (20 μl)을 1 ml의 AEC 기질 각각에 첨가하고, 혼합하고, 각 웰에 50 μl를 첨가했다. 스폿 전개를 정기적으로 모니터링하고, 플레이트를 수돗물로 세척하여 전개 반응을 종료했다. 이어서 플레이트를 실온에서 적어도 2시간 동안 건조되도록 한 후 Immunospot 소프트웨어 (Cellular Technology Limited)가 있는 CTL 분석기를 사용하여 스폿을 계수했다.
이 실시예에서는 하기 세포주를 표적 세포로서 사용했다:
ㆍPLC/PRF/5 (항원 양성)
PLC/PRF/5는 통합된 HBV 게놈을 갖는 인간 간세포 암종 세포주이다. GLSPTVWLSV 펩타이드는 이들 세포에 의해 자연적으로 제시된다 (질량 분석법에 의해 결정됨).
ㆍHepG2 (항원 음성)
HepG2는 간 간세포 암종으로부터 유래된 인간 세포주이다.
두 세포주 모두 HLA-A*02 β2M 복합체를 인코딩하는 유전자로 형질도입됐다.
결과
시험된 각각의 융합 분자는 항원 양성 세포의 존재 하에 T 세포의 강력한 활성화를 입증했다. Ec50 값을 데이터로부터 계산했고, 아래 표에 나타냈다. 융합 분자는 항원 음성 HLA-A*02 양성 세포를 인식하지 못하는 것으로 나타났다. 도 6은 아래 표에 나열된 4개의 융합 분자의 대표적인 데이터를 나타낸다 (표시된 값은 상이한 이펙터 공여자 (즉, 모두에게 공통적인 하나의 공여자가 아님)를 이용하여 수득한 것에 주목함).
Figure pct00011
이들 데이터는 본 발명의 돌연변이된 TCR 가변 도메인 서열을 포함하는 융합 분자가 항원 양성 세포에 대해 강력하고 (낮은 pM 범위의 Ec50) 특이적인 T 세포 활성화를 매개할 수 있다는 것을 입증한다.
표적 세포 사멸
돌연변이된 TCR 서열을 포함하는 융합 분자가 항원 양성 종양 세포의 강력한 T 세포 매개 사멸을 매개하는 능력을 IncuCyte 플랫폼 (Essen BioScience)을 사용하여 조사했다. 이 검정은 아폽토시스에 대한 마커인, 카스파제-3/7의 방출을 현미경으로 실시간 탐지할 수 있게 한다.
방법
CellPlayer 96-웰 카스파제-3/7 아폽토시스 검정 키트 (Essen BioScience, Cat. No.4440)를 사용하여 검정을 수행했고, 제조사의 프로토콜에 따라 수행했다. 간략하게, PLC/PRF/5 세포를 플레이팅 전에 CellTracker DeepRed로 염색하여 2-색상 분석을 가능하게 하고, 이후에 웰당 10,000개의 세포로 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하여 이들이 부착되도록 했다. 융합 분자를 다양한 농도로 제조하고, 최종 농도가 100 fM 내지 10 nM이 되도록 각각 25 μl를 관련 웰에 첨가했다. 이펙터 세포를 10:1 (웰당 100,000개의 세포)의 이펙터 표적 세포 비율로 사용했다. 융합물이 없는 대조군 샘플도 이펙터 세포 단독 또는 표적 세포 단독을 함유하는 샘플과 함께 준비했다. NucView 검정 시약을 30 μM로 제조했고, 모든 웰에 25 μl를 첨가했고, 최종 부피를 150 μl (1.25 μM의 최종 농도 수득)로 만들었다. 플레이트를 IncuCyte 기기 내에 넣고, 이미지를 5일 동안 3시간마다 (웰당 1개의 이미지) 촬영했다. 각 이미지의 아폽토시스 세포 수를 mm2당 아폽토시스 세포로서 결정하고 기록했다. 검정을 3회 수행했다.
결과
도 7에 나타낸 데이터는 각 그래프 상에 표시된 돌연변이된 TCR 가변 사슬 서열을 포함하는 융합 분자의 존재 하에 항원 양성 세포의 실시간 사멸을 나타낸다 (명확성을 위해 3개의 농도만 나타냄). 각각의 경우에, 표적 세포 사멸을 100 pM 이하의 농도에서 관찰했다. 융합 분자의 부재 시에는 어떠한 사멸도 관찰되지 않았다.
고위험 정상 조직에 대한 안전성 스크리닝
돌연변이된 TCR 서열을 포함하는 융합 분자의 특이성을 추가로 입증하기 위해, 추가 시험을 건강한 인간 조직으로부터 유래된 정상 세포의 패널을 표적으로서 사용하여, 상기 기재된 바와 같은 동일한 ELISPOT 방법론을 사용하여 수행했다.
제1 실험에서, a19b03 돌연변이된 TCR 가변 도메인을 포함하는 TCR-항CD3 융합물을 3개의 상이한 농도 (2 nm, 1 nM 및 0.1 nM)에서 시험했다. 각각의 정상 조직으로부터 2개의 로트의 세포를 표적으로서 사용했고, 이펙터 T 세포를 3개의 상이한 공여자로부터 수득했다. 대조군 측정은 융합 분자가 없는 샘플 및 정상 세포가 융합 분자의 단일 농도 (1 nM)에서 PLC/PRF/5 (항원 양성) 세포로 대체된 샘플을 사용하여 이루어졌다.
제2 실험에서, 다음의 돌연변이된 사슬 (a01b03, a01b02, a01b04, a01b05)을 포함하는 4개의 상이한 TCR-항CD3 융합물을 사용했다. 3개의 동일한 농도의 융합 분자를 사용했다 (2 nm, 1 nM 및 0.1 nM). 각각의 정상 조직으로부터 단일 로트의 세포를 표적으로서 사용했고, 이펙터 T 세포를 단일 공여자로부터 수득했다. 대조군 측정은 융합 분자가 없는 샘플 및 정상 세포가 10 μM 펩타이드 (항원 양성)와 0.1 nM의 단일 농도로 포함된 융합 분자로 펄스화된 샘플을 사용하여 이루어졌다.
결과
두 실험 모두에서, 정상 세포에 대한 T 세포 활성화는 배경 (즉, 융합 분자가 없는 샘플로서 취함)과 유사한 수준에서 관찰됐다 .
도 8a는 2개의 상이한 조직으로부터 1개의 로트의 정상 세포와 3개의 상이한 공여자 (공여자 1 내지 3으로 표지됨)에 대한 제1 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 8b는 2개의 상이한 조직에 대한 제2 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 각 그래프의 점선은 배경 수준을 나타낸다.
이들 데이터는 도 2 및 도 3에 나타낸 TCR 가변 도메인을 포함하는 융합 분자가 정상 조직으로부터 유래된 세포 패널에 대해 어떠한 실질적인 교차 반응도 나타내지 않는다는 것을 나타낸다.
기재된 TCR-항CD3 융합물은 치료 용도에 특히 적합한 특성을 가지고 있다.
실시예 7 - 항-CD3에 융합된 가용성 TCR에 의한 HBV 감염 세포에 대한 강력한 T 세포 활성화
본 발명의 TCR-항CD3 융합물이 T 세포 활성을 HBV 감염된 세포로 리디렉팅할 수 있음을 입증하기 위해, HBV 감염 모델을 확립했다.
간략하게, HLA-A*02:01 양성 간세포 암종 (HCC) 세포주인, HepG2를 수용체 NTCP로 형질감염시켰다. 이후에 세포를 200 MOI의 HBV, 유전자형 D (로트 03072018의 1x108 게놈 카피, ImQuest BioSciences)로 감염시켰다. 이어서 감염된 세포를 TCR-항CD3 융합물의 존재 또는 부재 하에 공여자 혈액으로부터 수득된 팬 T 세포 (pan T cell)와 공동 배양했다. 남아 있는 감염된 세포의 백분율은 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) RNA를 검출하기 위해 PrimeFlow (Invitrogen)를 사용하여 정량화됐다.
a19b03 및 a01b03을 포함하는 TCR-항CD3 융합물을 본 실시예에서 사용했다. 또한, 대안적인 비-HBV 펩타이드에 대해 특이적인 TCR-항CD3을 음성 대조군으로서 사용했다.
방법
감염 7일째에, 상청액을 감염된 HepG2-NTCP 세포를 함유하는 웰로부터 제거한 후, TCR-항CD3 융합물 유무에 관계없이 팬 T 세포를 공동-배양을 위해 첨가했다. 이펙터 T 세포를 감염을 위해 플레이팅된 HepG2-NTCP의 초기 수에 따라 10:1의 비율로 첨가했고, TCR-항CD3 융합물을 1 nM 또는 0.1 nM의 최종 농도로 첨가했다. 세포를 5일 동안 배양했다. 공동-배양 종료 시, 배양 플레이트로부터 감염된 세포를 트립신으로 제거하고, 표면을 CD45 및 고정 가능한 생존성 염료(eFluor 780)로 염색했다. 이에 이어, 세포를 고정시키고, PrimeFlow 프로브세트 (probeset) VF1-6000704를 사용하여 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) RNA의 염색을 위해 투과시켰다. 하우스키핑 유전자 RPL13A의 염색은 염색 절차를 위한 양성 대조군으로 사용됐다 (프로브세트 VA4-13187). 염색된 세포를 MACSQuant X 유세포 분석기 상에서 실행시키고, FlowJov10으로 분석하여 HBsAg 발현 세포의 백분율을 정량화했다.
결과
도 9는 a19b03 및 a01b03 TCR-항CD3 융합물이 둘 다 1 nM 융합물에서 감염된 세포의 %를 대략 60% 감소시킨다는 것을 나타낸다. 효과는 34% 감소를 제공하는 0.1 nM으로 적정 가능하다.
이들 데이터는 도 2 및 도 3에 나타낸 TCR 가변 도메인을 포함하는 융합 분자가 감염된 세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 나타낸다.
<110> Immunocore Limited <120> Specific binding molecules <130> P123152WO <160> 41 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val 1 5 10 <210> 2 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the scaffold alpha chain extracellular region <400> 2 Ala Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Asn Tyr Asn Thr 85 90 95 Asp Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln Val Phe Pro Asn 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 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Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn 180 185 190 Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe 225 230 235 240 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys 260 265 270 Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Leu Ser His Gly 275 280 285 Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile 290 295 300 His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn 305 310 315 320 Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu 325 330 335 Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser 340 345 350 Tyr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Asp Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg 355 360 365 Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 370 375 380 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 385 390 395 400 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 405 410 415 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 420 425 430 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 435 440 445 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn 450 455 460 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 465 470 475 480 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 485 490 495 Ala Trp Gly Arg Ala Asp 500 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> alpha chain CDR1 <400> 18 Asp Arg Gly Ser Gln Ser 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> alpha chain CDR2 <400> 19 Ile Tyr Ser Asn Gly Asp 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> alpha chain CDR3 <400> 20 Cys Ala Val Arg Asn Tyr Asn Thr Asp Lys Leu Ile Phe 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> beta chain CDR1 <400> 21 Met Asn His Glu Tyr 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> beta chain CDR2 <400> 22 Ser Val Gly Ala Gly Ile 1 5 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> beta chain CDR3 <400> 23 Cys Ala Ser Ser Tyr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Glu Leu Phe Phe 1 5 10 15 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> alpha chain CDR2 <400> 24 Ile Tyr Ser Asp Gly Asp 1 5 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> alpha chain CDR3 <400> 25 Cys Ala Ala Arg Asn Tyr Lys Thr Asp Leu Leu Ile Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> beta chain CDR1 <400> 26 Leu Asn His Gly Tyr 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> beta chain CDR1 <400> 27 Met Ser His Gly Tyr 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> beta chain CDR1 <400> 28 Leu Ser His Gly Tyr 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> beta chain CDR2 <400> 29 Ser Leu Gly Ala Gly Ile 1 5 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> beta chain CDR3 <400> 30 Cys Ala Ser Ser Tyr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Val Leu Phe Phe 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> beta chain CDR3 <400> 31 Cys Ala Ser Ser Tyr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Asp Leu Phe Phe 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> beta chain CDR3 <400> 32 Cys Ala Ser Ser Tyr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Leu Leu Phe Phe 1 5 10 15 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Linker <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Linker <400> 34 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Linker <400> 35 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Linker <400> 36 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Linker <400> 37 Gly Ser Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Linker <400> 38 Gly Gly Glu Pro Ser 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Linker <400> 39 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Linker <400> 40 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Linker <400> 41 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5

Claims (30)

  1. GLSPTVWLSV (서열번호 1) HLA-A*02 복합체 및/또는 GLSPTVWLSA (서열번호 17) HLA-A*02 복합체에 결합하는 특성을 갖고, TCR 알파 사슬 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 사슬 가변 도메인을 포함하는 특이적 결합 분자로서, 이들 각각은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, 여기서 FR은 프레임워크 영역이고, CDR은 상보성 결정 영역이며, 여기서
    (a) 알파 사슬 CDR은 선택적으로 그 내부에 하나 이상의 돌연변이가 있는 하기 서열:
    CDR1 - DRGSQS (서열번호 18)
    CDR2 - IYSNGD (서열번호 19)
    CDR3 - CAVRNYNTDKLIF (서열번호 20)
    을 갖고/갖거나,
    (b) 베타 사슬 CDR은 선택적으로 그 내부에 하나 이상의 돌연변이가 있는 하기 서열:
    CDR1 - MNHEY (서열번호 21)
    CDR2 - SVGAGI (서열번호 22)
    CDR3 - CASSYATGGTGELFF (서열번호 23)
    을 갖는, 특이적 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알파 사슬 가변 도메인 프레임워크 영역은 하기 서열:
    FR1 - 서열번호 2의 아미노산 1-26
    FR2 - 서열번호 2의 아미노산 33-49
    FR3 - 서열번호 2의 아미노산 56-88
    FR4 - 서열번호 2의 아미노산 102-111
    또는 상기 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 각각의 서열을 포함하고/하거나,
    상기 베타 사슬 가변 도메인 프레임워크 영역은 하기 서열:
    FR1 - 서열번호 3의 아미노산 1-26
    FR2 - 서열번호 3의 아미노산 32-48
    FR3 - 서열번호 3의 아미노산 55-90
    FR4 - 서열번호 3의 아미노산 106-114
    또는 상기 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 각각의 서열을 포함하는, 특이적 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 알파 사슬 CDR의 돌연변이 중 하나 이상은 (서열번호 2의 넘버링을 참조하여) 하기로부터 선택되는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00012
  4. 제3항에 있어서, 상기 알파 사슬 CDR은 (서열번호 2의 넘버링을 참조하여) 하기 그룹의 돌연변이 중 하나를 갖는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00013
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 알파 사슬은 하기로부터 선택된 CDR 서열을 갖는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00014
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베타 사슬 CDR의 돌연변이 중 하나 이상은 (서열번호 3의 넘버링을 참조하여) 하기로부터 선택되는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00015
  7. 제6항에 있어서, 상기 베타 사슬 CDR은 (서열번호 3의 넘버링을 참조하여) 하기 그룹의 돌연변이 중 하나를 갖는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00016
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 베타 사슬은 하기로부터 선택된 CDR 서열을 갖는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00017
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 사슬 및 베타 사슬 CDR의 하기 조합 중 하나를 갖는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00018
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 사슬 가변 도메인이 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, 상기 베타 사슬 가변 도메인이 서열번호 7 내지 11의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 특이적 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 사슬 가변 도메인 및 상기 베타 사슬 가변 도메인이 하기의 아미노산 서열로부터 선택되는, 특이적 결합 분자:
    Figure pct00019
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 사슬 TRAC 불변 도메인 서열 및 베타 사슬 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 알파-베타 이종이량체인, 특이적 결합 분자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 알파 및 베타 사슬 불변 도메인 서열이 절단 또는 치환에 의해 변형되어 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 고유 디설파이드 결합을 결실시키는, 특이적 결합 분자.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 알파 및/또는 베타 사슬 불변 도메인 서열(들)이 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57을 시스테인 잔기로 치환함으로써 변형되고, 상기 시스테인은 TCR의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 비-고유 디설파이드 결합을 형성하는, 특이적 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ 유형의 단일 사슬 포맷인 특이적 결합 분자로서, 상기 Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이고, L은 링커 서열인, 특이적 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지, 치료제 또는 PK 변형 모이어티와 회합되는, 특이적 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서, 항-CD3 항체가 선택적으로 링커 서열을 통해 TCR의 알파 또는 베타 사슬의 C- 또는 N-말단에 공유 결합되는, 특이적 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 링커 서열이 GGGGS (서열번호 33), GGGSG (서열번호 34), GGSGG (서열번호 35), GSGGG (서열번호 36), GSGGGP (서열번호 37), GGEPS (서열번호 38), GGEGGGP (서열번호 39), GGEGGGSEGGGS (서열번호 40) 및 GGGSGGGG (서열번호 41)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 특이적 결합 분자.
  19. 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자로서, 알파 사슬 가변 도메인이 서열번호 4 내지 6으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 베타 사슬 가변 도메인이 서열번호 7 내지 11로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 항-CD3 항체가 서열번호 33 내지 41로부터 선택되는 링커 서열을 통해 TCR 베타 사슬의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합되는, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자.
  20. 제19항에 있어서,
    서열번호 12, 14, 및 15로부터 선택되는 알파 사슬 아미노산 서열, 또는 서열번호 12, 14 및 16에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성, 예컨대 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 알파 사슬 아미노산 서열,
    및 서열번호 13 및 16으로부터 선택되는 베타 사슬 아미노산 서열, 또는 서열번호 13 및 16에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성, 예컨대 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 베타 사슬 아미노산 서열
    을 포함하는, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자.
  21. 제20항에 있어서,
    (a) 서열번호 12에 상응하는 알파 사슬 아미노산 서열 및 서열번호 13에 상응하는 베타 사슬 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 14에 상응하는 알파 사슬 아미노산 서열 및 서열번호 13에 상응하는 베타 사슬 아미노산 서열; 또는
    (c) 서열번호 15에 상응하는 알파 사슬 아미노산 서열 및 서열번호 13에 상응하는 베타 사슬 아미노산 서열.
    (d) 서열번호 14에 상응하는 알파 사슬 아미노산 서열 및 서열번호 16에 상응하는 베타 사슬 아미노산 서열
    을 포함하는, 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 TCR 알파 사슬 및/또는 TCR 베타 사슬을 인코딩하는 핵산.
  23. 제22항의 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  24. 세포로서,
    (a) 단일 개방 판독 프레임 또는 2개의 별개의 개방 판독 프레임 내에, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 TCR 알파 및 베타 가변 사슬을 인코딩하는 제23항에 따른 발현 벡터; 또는
    (b) 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 TCR의 알파 가변 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 TCR의 베타 가변 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터
    를 보유하는, 세포.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 분자를 제시하는, 비-천연 발생 및/또는 정제 및/또는 조작된 세포, 특히 T-세포.
  26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 분자, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 분자-항 CD3 융합 분자, 또는 제24항 또는 제25항에 따른 세포를 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 바람직하게는 인간 대상체의 의약에 사용하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 특이적 결합 분자, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 또는 제22항의 핵산, 제26항의 약제학적 조성물 또는 제24항 또는 제25항의 세포.
  28. 바람직하게는 인간 대상체의 만성 HBV 감염 또는 만성 HBV 감염으로 인한 암 또는 종양을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 특이적 결합 분자, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자, 또는 제22항의 핵산, 제26항의 약제학적 조성물 또는 제24항 또는 제25항의 세포.
  29. 만성 HBV 감염 또는 만성 HBV 감염으로 인한 암 또는 종양을 갖는 인간 대상체를 치료는 방법으로서, 이를 필요로 하는 상기 대상체에 제26항에 따른 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 분자, 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 특이적 결합 분자-항-CD3 융합 분자를 생성하는 방법으로서, a) 제24항 또는 제25항에 따른 세포를 특이적 결합 분자 사슬의 발현을 위한 최적의 조건 하에서 유지하는 단계 및 b) 특이적 결합 분자 사슬을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
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