JP2022526786A - Ｈｂｖエンベロープタンパク質に特異的な結合性分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、HBVエンベロープタンパク質に由来するHLA-A*02制限ペプチドGLSPTVWLSV(配列番号１)に結合する特異的結合性分子に関する。特異的結合性分子は、α及び/又はβ TCR可変ドメインを含んでなり得、α及び/又はβ可変ドメイン内に、天然型TCRに関して非天然変異を含んでいてもよい。本発明の特異的結合性分子は、感染性又は悪性疾患治療用の新規な免疫療法剤としての使用に特に適切である。【選択図】図１

Description

本発明は、HBVエンベロープタンパク質に由来するHLA-A*02制限ペプチドGLSPTVWLSV(配列番号１)に結合する特異的結合性分子に関する。前記特異的結合性分子はα及び/又はβ TCR可変ドメインを含んでなり得る。さらに、前記特異的結合性分子、α及び/又はβ可変ドメイン内に、天然型TCRに関して非天然変異を含んでいてもよい。本発明の特異的結合性分子並びに/又はα及び/若しくはβ可変ドメインは、感染性又は悪性疾患の治療用の新規免疫療法剤としての使用に特に適切である。
発明の背景
世界中で推定257百万人がHBVに感染し、これは全人口の3.5％に相当する。世界保健機関によれば、有病率は西太平洋地域及びアフリカ地域で最も高く、成人の約６％が感染する。急性HBV感染は治癒することも、慢性感染に進展する可能性もあり、感染が慢性化する確率は年齢に依存する。１歳未満の幼児のうち80～90％が慢性感染に進展し；６歳未満の小児のうち30～50％が慢性感染に進展し；成人では５％未満が慢性感染に進展する。慢性Ｂ型肝炎は、異質性及び難治性疾患であり、予後が良くなく、感染成人の20～30％で肝硬変(肝臓の瘢痕化)又はガンを生じる。1980年代以来、HBV感染の予防に有効で安全なワクチンが入手可能となっている。しかし、HBVを有して生きている人々の多くは、HBVワクチンの導入及び早期ワクチン接種スケジュールの実践前に生まれた；世界保健機関は、慢性感染成人のうち65百万人が、感染が赤ん坊に伝播するリスクのある妊娠可能年齢の女性であると推定している。TB及びHIVとは異なり、死亡率は、未診断の人々で特に、肝硬変からの合併症及び肝細胞ガン(HCC)に起因して増加すると予測されている。
HBV感染のクリアランスは、エフェクターＴ細胞による持続的なウイルス抑制に関係付けられている一方、慢性感染への進展は、十分に強力で広範なウイルス特異的Ｔ細胞応答の欠如に起因すると考えられている。慢性感染において、HBV特異的Ｔ細胞は、代表的には、貧弱な細胞傷害活性及び損傷したサイトカイン産生により特徴付けられる消耗した表現型を有し、当該ウイルスのクリアランスが防止される(Yeら，Cell Death Dis. 2015 Mar；6(3)：e1694；Parkら，Gastroenterology. 2016 Mar；150(3)：684-695.e5)。慢性HBVの現行の管理には、テノホビル又はエンテカビルのような経口抗ウイルス剤での治療が含まれる；しかし、抗ウイルス剤は、ウイルス再生を抑制する(このことは、永続的で致命的な肝臓損傷の進行の緩徐化を助けることができる)一方、当該ウイルスを排除せず、ウイルス再発リスクを回避するために無期限に使用しなければならない。さらに、抗ウイルス剤の長期使用はウイルス耐性及び毒性と関係する。したがって、現行治療法の制限を克服し、ウイルス感染細胞に対するＴ細胞媒介応答を回復させ、機能的治癒を提供することができる慢性HBV感染の新たな治療法に対する必要性が存在する。
Ｔ細胞レセプター(TCR)は、CD4+及びCD8+ Ｔ細胞により天然に発現される。TCRは、主要組織適合性複合体(MHC)分子(ヒトでは、MHC分子はヒト白血球抗原又はHLAとしても知られる)と複合体化して抗原提示細胞の表面にディスプレイされる短いペプチド抗原を認識するように設計される(Davisら，Annu Rev Immunol. 1998；16：523-44)。CD8+ Ｔ細胞(これは細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる)は、MHCクラスＩ分子に結合したペプチドを特異的に認識するTCRを有する。CD8+ Ｔ細胞は、一般に、罹患細胞(ガン性細胞及びウイルス感染細胞を含む)の発見及び破壊の媒介を担っている。
ペプチドGLSPTVWLSV(配列番号１)は、完全長HBVエンベロープタンパク質のアミノ酸348～357に相当し、HLA-A*02と複合体化して感染細胞の表面に提示される。このペプチド－HLA複合体を認識するＴ細胞が報告されている(Websterら，J Virol. 2004 Jun；78(11)：5707-5719)。GLSPTVWLSVペプチドは、全てのHBV遺伝子型間で高レベルの配列保存を示す(10位に僅かな変動を有する；天然バリアントGLSPTVWLSA(配列番号17)は、遺伝子型Ａにおいて配列の～78％に存在する)。したがって、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体は、慢性疾患に取り組むためのTCRベースの免疫療法介入の理想的な標的を提供する。
本発明は、HLA-A*02と複合体化したGLSPTVWLSV(配列番号１)及び/又はHLA-A*02と複合体化したGLSPTVWLSA(配列番号17)に対する結合特性を有し、各々がFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(ここで、FRはフレームワーク領域であり、CDRは相補性決定領域である)を含むTCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなる特異的結合性分子であって、
(ａ)α鎖CDRは次の配列：
CDR1－DRGSQS(配列番号18)
CDR2－IYSNGD(配列番号19)
CDR3－CAVRNYNTDKLIF(配列番号20)
を有し、該配列中に１若しくは２以上の変異を有していてもよく、及び/又は
(ｂ)β鎖CDRは次の配列：
CDR1－MNHEY(配列番号21)
CDR2－SVGAGI(配列番号22)
CDR3－CASSYATGGTGELFF(配列番号23)
を有し、該配列中に１若しくは２以上の変異を有していてもよい、特異的結合性分子を提供する。
可溶形態の足場TCR α及びβ鎖の細胞外領域のアミノ酸配列を提供する。 変異TCR α鎖可変領域のアミノ酸配列の例を提供する。 変異TCR β鎖可変領域のアミノ酸配列の例を提供する。 図２及び３に示す特定の変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合体のアミノ酸配列を提供する。 図２及び３に示す特定の変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合体のアミノ酸配列を提供する。 アラニン置換ペプチドに対する可溶性WT TCRの比較結合性データを提供する。 図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子の効力及び特異性を示す細胞データを提供する。 図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子による抗原陽性細胞の殺傷を示す細胞データを提供する。 図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子の特異性を更に示す細胞データを提供する。 図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子が感染細胞の減少(パーセンテージ)を媒介することを証明する細胞データを提供する。
発明の説明
第１の観点において、本発明は、HLA-A*02と複合体化したGLSPTVWLSV(配列番号１)及び/又はHLA-A*02と複合体化したGLSPTVWLSA(配列番号17)に対する結合特性を有し、各々がFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(FRはフレームワーク領域であり、CDRは相補性決定領域である)を含むTCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなる特異的結合性分子であって、
(ａ)α鎖CDRは次の配列：
CDR1－DRGSQS(配列番号18)
CDR2－IYSNGD(配列番号19)
CDR3－CAVRNYNTDKLIF(配列番号20)
を有し、該配列中に１若しくは２以上の変異を有していてもよく、及び/又は
(ｂ)β鎖CDRは次の配列：
CDR1－MNHEY(配列番号21)
CDR2－SVGAGI(配列番号22)
CDR3－CASSYATGGTGELFF(配列番号23)
を有し、該配列中に１若しくは２以上の変異を有していてもよい、特異的結合性分子を提供する。
本発明は、CDR及び可変ドメインを含み、GLSPTVWLSV－HLA複合体に結合する特異的結合性分子を最初に提供する。特異的結合性分子又はその結合性フラグメントは、TCR可変ドメインを含み得、該TCR可変ドメインは天然型TCRのものに相当してもよいし、より好ましくは該TCR可変ドメインは操作されていてもよい。天然型TCR可変ドメインは野生型、天然、親、非変異又は足場ドメインとも呼ばれ得る。特異的結合性分子又は結合性フラグメントは、理想的な治療特性、例えば超生理学的な、標的に対する親和性、長い結合半減期、標的に対する高特異性及び良好な安定性を有する分子を製造するために用いることができる。本発明また、特異的結合性分子又はその結合性フラグメントと、Ｔ細胞再指向化部分とが組み込まれた二重特異性又は二機能性又は融合分子を含む。このような分子は、(使い尽くすことのない)非HBV Ｔ細胞を再指向化させて活性化させることによりHBV感染細胞に対する強力で特異的な応答を媒介することができる。さらに、超生理的親和性を有する特異的結合性分子の使用は、低レベルのペプチド－HLAを提示するウイルス感染細胞の認識及びクリアランスを容易にする。或いは、特異的結合性分子又は結合性フラグメントは、養子療法用の操作されたＴ細胞に組み込まれてもよい。
本明細書に規定するTCRドメイン配列は、TCR分野の当業者に広く知られアクセス可能であるIMGT命名法を参照して記載される。例えば、LeFranc and LeFranc(2001)，「T cell Receptor Factsbook」，Academic Press；Lefranc(2011)，Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603；Lefranc(2001)，Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10O；及びLefranc(2003)，Leukemia 17(1): 260-266を参照。簡潔には、αβTCRは２つのジスルフィド連結鎖からなる。各鎖(α及びβ)は、一般に、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン及び定常ドメインを有すると考えられる。短い連結領域が可変ドメインと定常ドメインとを連結し、これは、代表的には、α可変領域の一部とみなされる。加えて、β鎖は、通常、連結領域の次の短い多様性領域を含有する。この領域も、代表的には、β可変領域の一部とみなされる。各鎖の可変ドメインはＮ末端側に位置し、フレームワーク配列(FR)に埋め込まれた３つの相補性決定領域(CDR)を含んでなる。CDRはペプチド－MHCへの結合のための認識部位を含む。α鎖可変(Vα)領域をコードする幾つかの遺伝子及びβ鎖可変(Vβ)領域をコードする幾つかの遺伝子が存在し、これらは、フレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに部分的に規定されるCDR3配列により区別される。Vα及びVβ遺伝子は、IMGT命名法では、それぞれ接頭語「TRAV」及び「TRBV」を用いて称呼される(Folch and Lefranc(2000)、Exp Clin Immunogenet 17(1)：42-54；Scaviner and Lefranc(2000)、Exp Clin Immunogenet 17(2)：83-96；LeFranc and LeFranc(2001)、「T cell Receptor Factsbook」，Academic Press)。同様に、α鎖及びβ鎖について、それぞれ「TRAJ」又は「TRBJ」と呼ばれる幾つかの連結又はＪ遺伝子が存在し、β鎖については「TRBD」と呼ばれる多様性又はＤ遺伝子が存在する(Folch and Lefranc(2000)，Exp Clin Immunogenet 17(2)：107-114；Scaviner and Lefranc(2000)，Exp Clin Immunogenet 17(2)：97-106；LeFranc and LeFranc(2001)，「T cell Receptor Factsbook」，Academic Press)。Ｔ細胞レセプター鎖の非常に大きな多様性は、種々のＶ、Ｊ及びＤ遺伝子(対立遺伝子バリアントを含む)の間での再配置の組合せ、更には連結多様性に起因する(Arstilaら(1999)，Science 286(5441)：958-961；Robinsら(2009)，Blood 114(19)：4099-4107)。TCR α及びβ鎖の定常又はＣ領域は、それぞれ「TRAC」及び「TRBC」と呼ばれる(Lefranc(2001)，Curr Protoc Immunol Appendix 1：Appendix 10)。
第１の観点の特異的結合性分子において、α鎖可変ドメインフレームワーク領域は、次のフレームワーク配列：
FR1－配列番号２のアミノ酸１～26
FR2－配列番号２のアミノ酸33～49
FR3－配列番号２のアミノ酸56～88
FR4－配列番号２のアミノ酸102～111
を含んでいてもよいし、若しくはそれぞれの配列が前記配列と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有していてもよく、及び/又はβ鎖可変ドメインフレームワーク領域は次の配列：
FR1－配列番号３のアミノ酸１～26
FR2－配列番号３のアミノ酸32～48
FR3－配列番号３のアミノ酸55～90
FR4－配列番号３のアミノ酸106～114
を含んでいてもよいし、若しくはそれぞれの配列が前記配列と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98若しくは99％の同一性を有していてもよい。
GLSPTVWLSA(配列番号17)ペプチドは、GLSPTVWLSVの天然に存在するバリアントであり、患者サブセットにおいて提示されるバリアントである。二重結合プロフィールを有する特異的結合性分子は、本発明の特異的結合性分子が処置に使用されるとき、有利であり得る。なぜならば、それは、バリアントペプチドを天然に提示する患者をカバーするからである。よって、より大きな患者集団に対処することができる。したがって、GLSPTVWLSV(配列番号１)－HLA-A*02複合体に結合し、GLSPTVWLSA(配列番号17)－HLA-A*02複合体に結合する特異的結合性分子が本明細書で提供される。
本明細書に用いる場合、用語「特異的結合性分子」とは、標的抗原に結合することができる分子をいう。このような分子は、本明細書に記載する幾つかの異なる形式を採用し得る。さらに、本発明の特異的結合性分子のフラグメントもまた想定される。フラグメントとは、標的抗原への結合を保持する、特異的結合性分子の部分をいう。
用語「変異」は置換、挿入及び欠失を包含する。天然型(親、天然、非変異、野生型又は足場の、とも呼ばれる)特異的結合性分子に対する変異として、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に対する特異的結合性分子の結合親和性(kD及び/又は結合半減期)を増大させるものが挙げられ得る。
α鎖フレームワーク領域FR1、FR2及びFR3は、TRAV12-2*02鎖に対応するアミノ酸配列を含み得、及び/又はβ鎖フレームワーク領域FR1、FR2及びFR3は、TRBV6-5*01鎖のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。
FR4領域は、α及びβ可変鎖の連結領域(それぞれTRAJ及びTRBJ)を含んでなり得る。TRAJ領域は、TRAJ34のものに対応するアミノ酸配列を含んでなり得る。TRBJ領域は、TRBJ2-2のものに対応するアミノ酸配列を含んでなり得る。
TCR α鎖可変領域には、少なくとも１つの変異が存在してもよい。α鎖CDRには、１、２、３、４、５又は６以上の変異が存在してもよい。前記変異の１又は２以上は、配列番号２の番号付けを参照して、次の変異：
Figure 2022526786000002
 から選択され得る。
よって、上記表には、必要に応じて他の変異と組み合わせ得る、任意又は全ての変異が存在し得る。
α鎖CDRは、次の変異群(配列番号２の番号付けを参照して)：
Figure 2022526786000003
 の１つの変異群を含んでいてもよい。
α鎖CDR1、CDR2及びCDR3は、下記表：
Figure 2022526786000004
 から選択されてもよい。
１つの好適なα鎖において、CDR1はDRGSQSであり、CDR2はIYSNGDであり、CDR3はCAARNYKTDLLIFである。別の１つの好適なα鎖において、CDR1はDRGSQSであり、CDR2はIYSDGDであり、CDR3はCAARNYKTDLLIFである。
TCR β鎖可変領域には、少なくとも１つの変異が存在してもよい。β鎖CDRには、１、２、３、４、５又は６以上の変異が存在してもよい。前記変異の１又は２以上は、配列番号３の番号付けを参照して、次の変異：
Figure 2022526786000005
 から選択され得る。
よって、上記表には、必要に応じて他の変異と組み合わせ得る、任意又は全ての変異が存在し得る。
β鎖CDRは、次の変異群(配列番号３の番号付けを参照して)：
Figure 2022526786000006
 の１つの変異群を含んでいてもよい。
β鎖CDR1、CDR2及びCDR3は、下記表：
Figure 2022526786000007
 から選択されてもよい。
１つの好適なβ鎖において、CDR1はMSHGYであり、CDR2はSVGAGIであり、CDR3はCASSYATGGTGDLFFである。別の１つの好適なβ鎖において、CDR1はLNHGYであり、CDR2はSVGAGIであり、CDR3はCASSYATGGTGVLFFである。
別の１つの好適なβ鎖において、CDR1はMNHEYであり、CDR2はSVGAGIであり、CDR3はCASSYATGGTGLLFFである。
別の１つの好適なβ鎖において、CDR1はMNHEYであり、CDR2はSLGAGIであり、CDR3はCASSYATGGTGDLFFである。
別の１つの好適なβ鎖において、CDR1はLSHGYであり、CDR2はSVGAGIであり、CDR3はCASSYATGGTGDLFFである。
TCR α及びβ CDRの好適な対は、下記表に示される：
Figure 2022526786000008
 特に好適な対は組合せ６である。別の特に好適な対は組合せ２である。
CDR内の変異は、好ましくは、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に対する特異的結合性分子の結合親和性を改善するが、追加的又は代替的に、他の利点、例えば単離形態での向上した安定性及び向上した特異性を付与し得る。１又は２以上の位置での変異は、追加的に又は代替的に、例えば相互作用のためのより好ましい角度を提供することにより、隣接する位置の同族pMHC複合体との相互作用に影響を及ぼし得る。変異は、非特異的結合の量を低減させることができるもの、すなわちGLSPTVWLSV－HLA-A*02及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02への結合と比較して代替の抗原への結合を低減させることができるものを含んでいてもよい。変異は、フォールディング及び/又は製造の効力を増大させるものを含んでいてもよい。これら特性の各々に寄与し得る変異もあれば、例えば、親和性に寄与し得るが特異性には寄与し得ない変異や、特異性に寄与し得るが親和性には寄与し得ない変異などもあり得る。
代表的には、合計で少なくとも５、少なくとも10、少なくとも15又はそれ以上のCDR変異が、標的抗原に関してpM親和性を有する特異的結合性分子を得るために必要とされる。合計で少なくとも５、少なくとも10又は少なくとも15のCDR変異が、標的抗原に関してpM親和性を有する特異的結合性分子を得るために必要とされ得る。標的抗原に関してpM親和性を有する特異的結合性分子は、可溶性治療剤として特に適切である。養子療法適用に用いる特異的結合性分子は、標的抗原に関してより低い親和性を有していてもよく、よってより少ないCDR変異、例えば合計で１まで、２まで、５まで又はそれ以上のCDR変異を有していてもよい。養子療法適用に用いる特異的結合性分子は、標的抗原に関してより低い親和性を有していてもよく、よってより少ないCDR変異、例えば合計で０まで、１まで、２まで、５までのCDR変異を有していてもよい。幾つかの場合では、天然型(非変異の、とも呼ばれる)特異的結合性分子は、変異の必要なく、標的抗原に関して十分に高い親和性を有していてもよい。天然型形態の本発明の特異的結合性分子は、HLAと複合体化したガンペプチドに結合する結合性分子と比較したとき特に、有利には、高い親和性を有することに留意されたい。特定の理論による拘束は望まないが、本発明者らは、このより高い親和性は、GLSPTVWLSVペプチドがウイルス性供給源、すなわち非自己供給源に由来する事実に起因し得ると考える。
変異は、追加的に又は代替的に、CDRの外側にフレームワーク領域内でなされ得る；このような変異は、特異的結合性分子の結合及び/又は特異性及び/又は安定性及び/又は精製可溶形態の収率を改善し得る。例えば、本発明の特異的結合性分子は、追加的に又は代替的に、α鎖可変領域FR2が配列番号２の番号付けを使用して43位にS→G残基を有するα鎖可変ドメインを含んでなり得る。この変異は収率を増大させることが判明した。
加えて、配列番号２の番号付けを使用して、α鎖の１位でのQ→A変異は、E. coliにおける製造の間のＮ末端メチオニン切断の効率を改善することが判明した。不十分な切断は治療剤に関しては有害であり得る。なぜならば、そのことは不均一なタンパク質産物をもたらし得、及び/又は開始メチオニンの存在はヒトにおいて免疫原性であり得るからである。
好ましくは、本発明の特異的結合性分子のα鎖可変ドメインは、配列番号２のフレームワークアミノ酸残基１～26、33～49、56～88、102～111に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するそれぞれのフレームワークアミノ酸配列を含んでなり得る。本発明の特異的結合性分子のβ鎖可変ドメインは、配列番号３のフレームワークアミノ酸残基１～26、32～48、55～90、106～114に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するそれぞれのフレームワークアミノ酸配列を含んでなり得る。或いは、言及したパーセンテージ同一性は、全体として考慮する場合、フレームワーク配列を超えてもよい。
α鎖可変ドメインは、配列番号４～６のアミノ酸配列(図２に示される)の任意の１つを含んでなり得、β鎖可変ドメインは、配列番号７～11のアミノ酸配列(図３に示される)の任意の１つを含んでなり得る。
例えば、特異的結合性分子は、次のα鎖及びβ鎖の対：
Figure 2022526786000009
 を含んでなり得る。
好適なTCR鎖対は配列番号６と配列番号８とである。好適なTCR鎖対は、配列番号４と配列番号８とである。
本明細書に開示するいずれの本発明の特異的結合性分子の表現型上サイレントなバリアントも、本発明の範囲内である。本明細書で用いる場合、用語「表現型上サイレントなバリアント」は、上記の変異に加えて、１又は２以上の更なるアミノ酸変化(置換、挿入及び欠失を含む)が組み込まれたTCR可変ドメインを有する特異的結合性分子であって、前記変化を有しない対応の特異的結合性分子に類似する表現型を有する特異的結合性分子をいうと理解される。本願の目的のためには、特異的結合性分子の表現型は、結合親和性(KD及び/又は結合半減期)及び特異性を含む。好ましくは、免疫エフェクターと結合した可溶性特異的結合性分子の表現型は、結合親和性及び特異性に加えて、免疫活性化の効力及び精製収率を含む。表現型上サイレントなバリアントは、同一条件下で(例えば25℃にて及び/又は同じSPRチップ上で)測定されたとき、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に関して、前記変化を有しない対応の特異的結合性分子で測定されたKD及び/又は結合半減期の50％以内、より好ましくは30％以内、より好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内のKD及び/又は結合半減期を有していてもよい。適切な条件は実施例３で更に説明する。当業者に公知であるように、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体との相互作用の親和性及び/又は他の機能的特性を変更することなく、可変ドメインに、上記のものからの変化が組み込まれた特異的結合性分子を製造することは可能であり得る。具体的には、このようなサイレント変異は、抗原結合に直接関与しないことが知られている配列の部分(例えば、抗原と接触しないフレームワーク領域及び/又はCDRの部分)に組み込まれてもよい。このようなバリアントも本発明の範囲に含まれる。
表現型上サイレントなバリアントは、１若しくは２以上の保存的置換及び/又は１若しくは２以上の寛容される置換を含んでいてもよい。寛容される置換は、下記に示される保存的置換の定義に該当しないにもかかわらず、表現型上サイレントである置換を意味する。当業者は、種々のアミノ酸が類似する特性を有し、よって「保存的」であることを理解する。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのそのような１又は２以上のアミノ酸は、該タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの所望の活性を消失させないで１又は２以上の他のそのようなアミノ酸で置換し得る場合が多い。
よって、アミノ酸 グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン(脂肪族側鎖を有するアミノ酸)は、互いに置換され得る場合が多い。これら可能な置換のうち、(相対的に短い側鎖を有するので)グリシン及びアラニンを互いに置換するために用い、(疎水性である、より長い脂肪族側鎖を有するので)バリン、ロイシン及びイソロイシンを互いに置換するために用いることが好ましい。互いに置換され得る場合が多い他のアミノ酸として：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸)；リジン、アルギニン及びヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン酸及びグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン及びグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)；並びにシステイン及びメチオニン(イオウ含有側鎖を有するアミノ酸)が挙げられる。本発明の範囲内のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸を用いて行い得ることを理解すべきである。例えば、本明細書では、アラニンのメチル基はエチル基で置換されてもよく及び/又は軽微な変化がペプチド骨格になされてもよいことが企図されている。天然又は合成のアミノ酸が用いられているか否かにかかわらず、L-アミノ酸のみが存在することが好ましい。
この性質の置換は、「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と呼ばれる場合が多い。したがって、本発明は、上記アミノ酸配列のいずれかにおいて１若しくは２以上の保存的置換及び/又は１若しくは２以上の寛容される置換を有するアミノ酸配列を含んでなる特異的結合性分子であって、該アミノ酸配列が、配列番号２、４～６のアミノ酸１～111及び/又は配列番号３、７～11のアミノ酸１～114を含む特異的結合性分子と少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％の同一性を有する特異的結合性分子の使用にまで拡張される。
「同一性」は、当該分野において公知のように、配列比較により決定される、２若しくは３以上のポリペプチド配列間又は２若しくは３以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、同一性はまた、妥当な場合、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間の、配列の並びの一致性によって決定される配列関連性の程度を意味する。２つのポリペプチド配列間又は２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する方法は幾つか存在するが、同一性の決定に一般に用いられる方法は、コンピュータプログラム化されている。２つの配列間の同一性を決定する好適なコンピュータプログラムとしては、GCGプログラムパッケージ(Devereuxら，Nucleic Acids Research，12, 387 (1984))、BLASTP、BLASTN及びFASTA(Atschulら，J. Molec. Biol. 215, 403 (1990))が挙げられるが、これに限定されない。
CLUSTALプログラムのようなプログラムを用いてアミノ酸配列を比較することができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、必要な場合にはいずれかの配列にスペースを挿入して最適な整列を見つけ出す。最適な整列についてアミノ酸の同一性又は類似性(同一性＋アミノ酸タイプの保存)を算出することができる。BLASTxのようなプログラムは、類似する配列を最も長く整列させ、その適合度に対して値を割り当てる。よって、各々が異なるスコアを有する幾つかの類似領域を見出す比較を得ることができる。両タイプの同一性分析が本発明において企図されている。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適比較を目的として配列を整列させ(例えば、最良整列のために第１の配列にギャップを導入することができる)、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することにより決定される。「最良整列」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列の整列である。パーセント同一性は、比較する配列中の同一アミノ酸残基又はヌクレオチドの数により決定される(すなわち、％同一性 = 同一位置の数/位置の総数×100)。
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較する数学的アルゴリズムの例は、Karlin及びAltschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されるように改変されたKarlin及びAltschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。Altschulら(1990)，J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTn及びBLASTpプログラムには、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性の決定は、BLASTnプログラムを用いて行うことができる。２つのタンパク質配列間のパーセント同一性の決定は、BLASTpプログラムを用いて行うことができる。比較目的でギャップを有する整列を得るためには、Altschulら(1997)，Nucleic acid Res. 25:3389-3402に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。或いは、PSI-Blastを用いて、分子間の遠い関連性を検出する累次サーチを行うことができる(前出)。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-Blastプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる(例えば、BLASTp及びBLASTp)。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。デフォルトの一般的パラメータとしては、例えば、Word Size = 3、Expect Threshold = 10を挙げ得る。パラメータは短い入力配列について自動的に調節されるように選択され得る。配列比較に利用される数学的アルゴリズムの別の例は、Myers及びMiller，CABIOS(1989)のアルゴリズムである。CGC配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。当該分野において公知の他の配列分析アルゴリズムとしては、Torellis及びRobotti(1994)，Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5に記載されるADVANCE及びADAM；並びにPearson及びLipman(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されるFASTAが挙げられる。FASTAにおいて、ktupは、サーチの感度及び速度を設定するコントロールオプションである。本開示においてパーセント同一性を評価する目的には、デフォルトパラメータを用いるBLASTpを比較法として使用する。加えて、記載したパーセント同一性がアミノ酸について非整数値である場合、得られた値は小数点以下を切り捨てて整数とする(すなわち、25アミノ酸の配列が90％配列同一性を有すると「22.5」となるが、「22」とする)。したがって、提供する実施例では、25アミノ酸のうち22がマッチする配列は、90％以内の配列同一性である。
当業者に自明であるように、Ｃ末端及び/又はＮ末端に提供される配列は、特異的結合性分子の機能的特性に実質的に影響を及ぼすことなく、１、２、３、４、５又は６以上の残基を短縮化又は延長することができる。Ｃ末端及び/又はＮ末端に提供される配列は、１、２、３、４又は５残基が短縮化又は延長され得る。このような全てのバリアントは本発明に包含される。
任意の適切な方法を用いることを条件に、変異(保存的及び寛容される置換、挿入及び欠失を含む)を配列に導入してもよい。このような方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにする方法、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順が挙げられるが、これらに限定されない。これら方法は、多くの標準的な分子生物学の教科書に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素ベースのクローニングに関する更なる詳細については、Sambrook及びRussell(2001)，Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第３版) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995)，Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6に見出すことができる。本発明により提供されるTCR配列は、固相合成又は当該分野において公知の任意の他の適切な方法から得てもよい。
本発明の特異的結合性分子は、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に結合する性質を有する。本発明の特異的結合性分子は、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に関して高度の特異性が証明されており、よって治療用途に特に適切である。特異性は、本発明の特異的結合性分子に関して、抗原陽性であるHLA-A*02標的細胞を認識できる一方で、抗原陰性であるHLA-A*02標的細胞を認識する能力が極めて小さいことに関する。幾つかの場合では、本発明の特異的結合性分子は、標的ペプチド(GLSPTVWLSV又はバリアントGLSPTVWLSA)と特定のHLA-A*02サブタイプ(HLA-A*0201、HLA-A*0206又はHLA-A*0207を含むがこれらに限定されない)との複合体に結合し得る。
特異性は、インビトロで、例えば細胞アッセイ(例えば実施例６に記載されるもの)において測定することができる。特異性を試験するため、特異的結合性分子は可溶形態で、免疫エフェクターと結合されていてもよく、及び/又は細胞(例えばＴ細胞)の表面に発現されていてもよい。特異性は、抗原陽性標的細胞及び抗原陰性標的細胞の存在下でのＴ細胞活性化レベルを測定することによって決定してもよい。抗原陰性標的細胞の極めて小さい認識は、同一条件下でかつ治療上妥当なTCR濃度にて測定したとき、抗原陽性標的細胞の存在下で生じるＴ細胞活性化レベルの20％未満、好ましくは10％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満のレベルとして規定される。免疫エフェクターと結合した可溶性TCRについて、治療上妥当な濃度は、10-9Ｍ以下のTCR濃度及び/又は対応するEC50値より100倍まで、好ましくは1000倍まで大きい濃度と規定されてもよい。好ましくは、免疫エフェクターと組み合わせた可溶性特異的結合性分子について、抗原陰性細胞に対するＴ細胞活性化に要する濃度に比する抗原陽性細胞に対するＴ細胞活性化に要する濃度に少なくとも100倍の差が存在する。抗原陽性細胞は、ガン細胞又は感染細胞に匹敵するレベルの抗原提示を得るために適切なペプチド濃度を用いるペプチド-パルスにより得られてもよく(例えば、Bossiら(2013)，Oncoimmunol. 1;2(11):e26840に記載されているように10-9Ｍペプチド)、又は当該ペプチドを天然に提示するものであってもよい。好ましくは、抗原陽性細胞及び抗原陰性細胞は共にヒト細胞である。好ましくは、抗原陽性細胞は、HBVゲノムが組み込まれたヒトガン細胞又はHBV感染細胞である。抗原陰性細胞は、好ましくは、健常ヒト組織に由来するものを含む。
特異性は、追加的に又は代替的に、GLSPTVWLSV(配列番号１)－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に結合し、代替ペプチド－HLA複合体のパネルに結合しない特異的結合性分子の能力に関してもよい。これは、例えば、実施例３のBiacore法により決定されてもよい。前記パネルは、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも10の代替ペプチド－HLA-A*02複合体を含んでいてもよい。代替ペプチドは、配列番号１と低レベルの配列同一性を有していてもよく、天然に提示されるものであってもよい。代替ペプチドは、好ましくは、健常ヒト組織で発現するタンパク質に由来する。GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体への特異的結合性分子の結合は、他の天然に提示されるペプチド－HLA複合体への結合より少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも10倍又は少なくとも50倍又は少なくとも100倍、なおより好ましくは少なくとも400倍大きくてもよい。代替のHLAは、GLSPTVWLSVペプチドの他の天然バリアント、例えば配列GLSPIVWLSV及びGLSPTVWLLVを含まない。
特異的結合性分子の特異性を決定する代替又は追加のアプローチは、標的ペプチドのシーケンシャル変異誘発(例えば、アラニンスキャニング)を用いて特異的結合性分子のペプチド認識モチーフを同定することであり得る。結合モチーフの部分を形成する残基は、置換が許容されない残基である。非許容置換は、特異的結合性分子の結合親和性が、非変異ペプチドに関する結合親和性に比して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも80％減少するペプチド位置として定義され得る。このようなアプローチは、Cameronら(2013)，Sci Transl Med. 2013 Aug 7; 5(197):197ra103及びWO2014096803にTCRに関して更に記載されているが、これら方法は本発明の特異的結合性分子にも適用可能であることが理解される。この場合の特異的結合性分子の特異性は、代替モチーフ含有ペプチド、特にヒトプロテオーム中の代替モチーフ含有ペプチドを同定し、これらペプチドを特異的結合性分子に対する結合に関して試験することにより決定されてもよい。１又は２以上の代替ペプチドに対する特異的結合性分の結合は特異性の欠如を示し得る。この場合、細胞アッセイによる特異的結合性分子の特異性の更なる試験が必要とされ得る。ペプチドの中央部分における(アラニン)置換に関する低い許容性は、TCRが高い特異性を有し、したがって代替ペプチドとの交差反応性のリスクが低いことを表すことを示す。
本発明の特異的結合性分子は、治療用薬剤としての使用に関して理想的な安全性プロフィールを有し得る。この場合、特異的結合性分子は可溶性形態であり得、好ましくは免疫エフェクターに融合されていてもよい。適切な免疫エフェクターとしては、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)；スーパー抗原及びその変異体；ケモカイン(例えばIL-8、血小板因子４、メラノーマ増殖刺激タンパク質；免疫細胞(例えばＴ細胞又はNK細胞)上の抗原(例えば抗CD3、抗CD28若しくは抗CD16)に結合する抗体(そのフラグメント、誘導体及びバリアントを含む)；及び補体アクチベータが挙げられるが、これらに限定されない。理想的な安全性プロフィールは、本発明の特異的結合性分子が、良好な特異性を証明されていることに加えて、更なる前臨床安全性試験に合格している可能性があることを意味する。このような試験の例としては、全血存在下でのサイトカイン遊離が少ないこと(よって、インビボで可能性のあるサイトカイン遊離症候群を引き起こすリスクが低いこと)を確証する全血アッセイ、及び代替のHLAタイプを認識する可能性が低いことを確証するアロ反応性試験が挙げられる。
本発明の特異的結合性分子、特に可溶形式の特異的結合性分子は、高収率精製が可能であり得る。収率は、元の培養体積に対する、精製プロセスの終時に得られる正確にフォールディングした物質の量に基づいて決定し得る。高収率は、代表的には、１mg/L以上若しくは２mg/L以上、より好ましくは３mg/L以上若しくは４mg/L以上若しくは５mg/L以上、又はより高い収率を意味する。
本発明の特異的結合性分子は、好ましくは、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に関して、天然型TCR(非変異又は足場TCRとも呼ぶ)より大きい(すなわち、より強い)KD、例えば１pM～１μMの範囲内のKDを有する。１つの観点では、本発明の特異的結合性分子は、該複合体に関して約１pM～約400nM、約１pM～約1000pM、約１pM～約500pM、約１pM～約100pMのKDを有する(ここで、約は±10％を意味する)。前記特異的結合性分子は、追加的に又は代替的に、該複合体に関して約１分～約60時間、約20分～約50時間又は約２時間～約35時間又は約４時間～約20時間の範囲内の結合半減期(T1/2)を有してもよい。好ましくは、本発明の特異的結合性分子は、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に関して、約１pM～約100pMのKD及び/又は約４時間～約20時間の結合半減期を有する。このような高親和性は、治療薬剤及び/又は検出可能な標識と組み合わせたときの、可溶形式の特異的結合性分子に関して好ましい。
別の１つの観点では、本発明の特異的結合性分子は、当該複合体に関して約50nM～約200μM若しくは約100nM～約２μMのKD及び/又は該複合体に関して約３秒～約12分の結合半減期を有し得る。このような特異的結合性分子は、養子療法適用に好ましくあり得る。
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)を決定する方法は当業者に公知である。好適な実施形態において、結合親和性及び結合半減期は、(例えばそれぞれBIAcore装置又はOctet装置を使用する)表面プラズモン共鳴(SPR)又はBio-Layer Interferometry(BLI)を用いて測定する。好適な方法は実施例３に提供される。特異的結合性分子の親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解される。T1/2はln2/解離速度(koff)として算出する。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち細胞質及び膜貫通ドメイン残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。個々の測定値間の変動、特に20時間を超える解離時間を有する相互作用についての変動を説明するため、所与の特異的結合性分子の結合親和性及び/又は結合半減期は、数回、例えば３回又は４回以上、同じアッセイプロトコルを用いて測定して、結果の平均をとり得る。２つのサンプル(すなわち、２つの異なる特異的結合性分子及び/又は同じ特異的結合性分子の２つの調製物)間の結合データを比較するため、測定値は同じアッセイ条件(例えば温度)、例えば実施例３に記載の条件を用いて測定することが好ましい。
本発明の特定の好適な特異的結合性分子は、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に関して、天然型TCRのものより実質的に高い結合親和性及び/又は結合半減期を有する。天然型TCRの結合親和性を増大させると、そのペプチド－MHCリガンドに関するTCRの特異性は低下することが多く、このことは、Zhaoら(2007)，J.Immunol, 179:9, 5845-5854において証明されている。しかし、本発明のTCRは、天然型TCRより実質的に高い結合親和性を有するにもかかわらず、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA－HLA-A*02複合体に特異的なままである。
特定の好適な特異的結合性分子は、抗原陽性細胞、具体的には、低レベルの抗原(すなわち５～100のオーダー)を提示する細胞に対して、インビトロで高度に強力なＴ細胞応答を生じることができる。このような特異的結合性分子は、可溶形態であってもよく、免疫エフェクター(例えば、抗CD3抗体)に連結されていてもよい。測定されるＴ細胞応答は、Ｔ細胞活性化マーカー(例えば、インターフェロンγ又はグランザイムＢ)の放出若しくは標的細胞殺傷又は他のＴ細胞活性化の尺度(Ｔ細胞増殖)であってもよい。好ましくは、高度に強力な応答は、pM範囲のEC50値、最も好ましくは100pM以下のEC50値を有するものである。
本発明の特異的結合性分子は、αβヘテロ二量体であり得るTCR可変ドメインを含んでいてもよい。特定の場合には、本発明の特異的結合性分子は、γδヘテロ二量体であり得るTCR可変ドメインを含んでいてもよい。他の場合には、本発明の特異的結合性分子は、αα又はββホモ二量体(又はγγ若しくはδδホモ二量体)であり得るTCR可変ドメインを含んでいてもよい。本発明の特異的結合性分子のα-βヘテロ二量体は、α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を含んでなり得る。定常ドメインは、完全長(これは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが存在することを意味する)であってもよく、又は可溶形式(すなわち、膜貫通ドメインも細胞質ドメインも有しない形式)であり得る。一方又は両方の定常ドメインは、天然型TRAC及び/又はTRBC1/2配列に関して変異、置換又は欠失を含有し得る。用語TRAC及びTRBC1/2はまた、天然の多形バリアント、例えばTRACの４位でのＮ→Ｋを包含する(Bragadoら，International immunology. 1994 Feb;6(2):223-30)。
本発明の可溶性の特異的結合性分子に関して、α及びβ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失させるように短縮化又は置換により改変されていてもよい。α及び/又はβ鎖定常ドメイン配列は、例えばWO 03/020763に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。１つの好適な実施形態において、α及びβ定常ドメインは、TRACのThr 48の位置及びTRBC1又はTRBC2のSer 57の位置でのシステイン残基の置換により改変され、該システインがTCRのα定常ドメインとβ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成していてもよい。TRBC1又はTRBC2は、追加的に、定常ドメインの75位でのシステイン→アラニン変異及び定常ドメイン89位でのアスパラギン→アスパラギン酸変異を含んでいてもよい。本発明のαβヘテロ二量体に存在する細胞外定常ドメインの一方又は両方は、一方又は両方のＣ末端で、例えば15まで又は10まで又は８まで又は７以下のアミノ酸が欠失されていてもよい(すなわち短縮化されていてもよい)。本発明のαβヘテロ二量体に存在する細胞外定常ドメインの一方又は両方は、一方又は両方のＣ末端で、例えば15まで又は10まで又は８までのアミノ酸が欠失されていてもよい(すなわち短縮化されていてもよい)。α鎖細胞外定常ドメインのＣ末端は、８アミノ酸が欠失されていてもよい(すなわち短縮化されていてもよい)。可溶性特異的結合性分子は、好ましくは、治療薬剤及び/又は検出可能な標識と結合されていてもよい。
αβヘテロ二量体TCRの定常ドメインは、膜貫通及び細胞質ドメインの両方を有する全長であり得る。これらTCRは、それぞれのα及びβ定常ドメイン間に天然に見出されるものに対応するジスルフィド結合を含有し得る。追加的に又は代替的に、非天然型ジスルフィド結合が細胞外定常ドメイン間に存在し得る。前記非天然型ジスルフィド結合はWO03020763及びWO06000830に更に説明されている。非天然型ジスルフィド結合は、TRACの位置Thr 48とTRBC1又はTRBC2の位置Ser 57との間にあり得る。定常ドメインの一方又は両方は、天然型TRAC及び/又はTRBC1/2配列に対して１又は２以上の変異 置換又は欠失を含有し得る。完全長定常ドメインを有するTCRは、養子療法における使用に好適である。
或いは、完全長又は短縮型定常ドメインではなく、TCR定常ドメインが存在しなくてもよい。したがって、本発明の特異的結合性分子は、TCR α及びβ鎖の可変ドメインと、任意に、上記の追加のドメインとから構成されてもよい。追加のドメインとしては、免疫エフェクタードメイン(例えば、抗体ドメイン)、Fcドメイン又はアルブミン結合性ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の特異的結合性分子は単鎖形式であってもよい。単鎖形式としては、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ又はVα-Cα-L-Vβ-Cβタイプ(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)のαβTCRポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない(Weidanzら(1998)，J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76；Epelら(2002)，Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73；WO 2004/033685；WO9918129)。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号33)、GGGSG(配列番号34)、GGSGG(配列番号35)、GSGGG(配列番号36)、GSGGGP(配列番号37)、GGEPS(配列番号38)、GGEGGGP(配列番号39)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号40)(WO2010/133828に記載のもの)並びにGGGSGGGG(配列番号41)が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリンカーは、次の配列モチーフ：GGGS、GGGGS、TVLRT、TVSSAS及びTVLSSASの１又は２以上を有する配列を含み得る。存在する場合、１つ又は両方の定常ドメインは完全長であり得、又は上記のとおり、短縮化され及び/又は変異を含有し得る。好ましくは、単鎖TCRは可溶性である。特定の実施形態では、本発明の単鎖TCRは、WO 2004/033685に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有してもよい。単鎖TCRは、WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanzら(1998)，J Immunol Methods 221(1-2): 59-76；Hooら(1992)，Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763；Schodin(1996)，Mol Immunol 33(9): 819-829)に更に記載されている。
本発明はまた、本発明の特異的結合性分子をディスプレイする粒子を含み、粒子は粒子ライブラリに含まれていてもよい。このような粒子は、ファージ、酵母細胞、リボソーム又は哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない。このような粒子及びライブラリを製造する方法は当該分野において公知である(例えば、WO2004/044004；WO01/48145；Chervinら(2008)，J. Immuno. Methods 339.2:175-184を参照)。
本発明の可溶性特異的結合性分子は、抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織への検出可能な標識又は治療薬剤の送達に有用である。したがって、これらは、(特異的結合性分子を用いて同族抗原を提示する細胞の存在を検出する診断目的のための)検出可能な標識；治療薬剤；及び/又は薬物動態(PK)改変成分と(共有結合又はその他の様式で)結合していてもよい。
PK改変成分の例としては、PEG(Dozierら(2015)，Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64及びJevsevarら(2010)，Biotechnol J.Jan;5(1):113-28)、PAS化(Schlapschyら(2013)，Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501)、アルブミン及びアルブミン結合性ドメイン(Dennisら(2002)，J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43)及び/又は非構造化ポリペプチド(Schellenbergerら(2009)，Nat Biotechnol. Dec;27(12):1186-90)が挙げられるが、これらに限定されない。更なるPK改変成分として、抗体Fcフラグメントが挙げられる。PK改変成分はインビボ半減期を延長するために働き得る。
免疫グロブリンFcドメインは、使用される場合、任意の抗体Fc領域であり得る。Fc領域は、細胞表面のFcレセプター及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する抗体テイル領域である。Fc領域は、代表的には、共に２つ又は３つの重鎖定常ドメイン(CH2、CH3及びCH4と呼ぶ)及びヒンジ領域を有する２つのポリペプチド鎖を含んでなる。２つの鎖はヒンジ領域内でのジスルフィド結合により連結されている。免疫グロブリンサブクラスIgG1、IgG2及びIgG4のFcドメインは、FcRnに結合して、FcRn媒介リサイクリングを受け、長い循環半減期(３～４週間)を提供する。IgGとFcRnとの相互作用は、CH2及びCH3ドメインの部分をカバーするFc領域に局在化されている。本発明における使用に好適な免疫グロブリンFcは、IgG1又はIgG4のFcドメインを含むがこれらに限定されない。好ましくは、Fcドメインはヒト配列に由来する。Fc領域はまた、好ましくは、二量体化を容易にするKiH変異を含んでいてもよいし、活性化しているレセプターとの相互作用を防止する変異を含んでいてもよい(すなわち、機能的にサイレントな分子であってもよい)。免疫グロブリンFcドメインは、その他のドメイン(すなわち、TCRの可変ドメイン及び/若しくは定常ドメイン並びに/又は免疫エフェクター)のＣ又はＮ末端に、任意の適切な順序又は形態で融合されていてもよい。免疫グロブリンFcは、その他のドメイン(すなわち、TCRの可変ドメイン及び/若しくは定常ドメイン並びに/又は免疫エフェクター)にリンカーを介して融合されていてもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号33)、GGGSG(配列番号34)、GGSGG(配列番号35)、GSGGG(配列番号36)、GSGGGP(配列番号37)、GGEPS(配列番号38)、GGEGGGP(配列番号39)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号40)(WO2010/133828に記載のもの)並びにGGGSGGGG(配列番号41)が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリンカーは、次の配列モチーフ：GGGS、GGGGS、TVLRT、TVSSAS及びTVLSSASの１又は２以上を有する配列を含み得る。免疫グロブリンFcは、TCRに融合される場合、α又はβ鎖のいずれかに、リンカー有り又は無しで融合され得る。さらに、Fcの個々の鎖がTCRの個々の鎖に融合され得る。
好ましくは、Fc領域はIgG1又はIgG4サブクラスに由来し得る。２つの鎖は、CH2及びCH3定常ドメインとヒンジ領域の全て又は一部とを含んでなってもよい。ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のヒンジ領域に実質的に又は部分的に相当してもよい。ヒンジは、コアヒンジドメインの全て又は一部及び低位ヒンジ領域の全て又は一部を含んでなってもよい。好ましくは、ヒンジ領域は、２つの鎖を連結する少なくとも１つのジスルフィド結合を含有する。
Fc領域は、WT配列に関して変異を含んでいてもよい。変異には、置換、挿入及び欠失が含まれる。このような変異は、望ましい治療特性の導入を目的としてなされたものであってもよい。例えば、ヘテロ二量体化を容易にするために、ノブ・インツー・ホール(KiH)変異がCH3ドメイン中に工学的操作により導入されていてもよい。この場合、一方の鎖が嵩高い突出残基(すなわちノブ)、例えばYを含有するように操作され、他方の鎖が相補ポケット(すなわちホール)を含有するように操作されている。KiH変異の適切な位置は当該分野において公知である。追加的に又は代替的に、Fcyレセプターへの結合を消失させるか若しくは低減させる及び/又はFcRnへの結合を増大させる変異、及び/又はFabアーム交換を防止するか又はプロテアーゼ部位を除去する変異が導入されていてもよい。
PK改変成分はまた、アルブミン結合性ドメイン(これまた、半減期を延長するように作用し得る)であり得る。当該分野において公知であるように、アルブミンは、(腎閾値を超える)そのサイズに一部起因し、その特異的相互作用及びFcRnを介するリサイクリングにより、19日の長い循環半減期を有する。アルブミンへの付着は、インビボで治療分子の循環半減期を向上させる周知のストラテジである。アルブミンは、特異的アルブミン結合性ドメインの使用により非共有結合的に、又は接合若しくは直接遺伝子融合により共有結合的に付着されてもよい。半減期を向上させるために、アルブミンへの付着が利用されている治療分子の例は、Sleepら，Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34に見出される。
アルブミン結合性ドメインは、アルブミンに結合することができる任意の部分(任意の既知のアルブミン結合性部分を含む)であり得る。アルブミン結合性ドメインは、アルブミンに特異的に結合する内因性又は外因性リガンド、小さな有機分子、脂肪酸、ペプチド及びタンパク質から選択され得る。好適なアルブミン結合性ドメインの例としては、短いペプチド、例えばDennisら，J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43に記載のもの(例えばペプチドQRLMEDICLPRWGCLWEDDF)；アルブミンに結合するよう操作されたタンパク質、例えば抗体、抗体フラグメント及び抗体様足場、例えばGSKが市場に提供するAlbudab(登録商標)(O'Connor-Semmesら，Clin Pharmacol Ther. 2014 Dec;96(6):704-12)及びAblynxが市場に提供するナノボディ(登録商標)(Van Royら，Arthritis Res Ther. 2015 May 20;17:135)；及び天然に見出されるアルブミン結合性ドメインをベースにするタンパク質、例えばStreptococcalタンパク質であるＧタンパク質(Storkら，Eng Des Sel. 2007 Nov;20(11):569-76)、例えばAffibodyが市場に提供するAlbumod(登録商標)が挙げられる。
好ましくは、アルブミンはヒト血清アルブミン(HSA)である。アルブミン結合性ドメインのヒトアルブミンに関する親和性は、ピコモル～マイクロモルの範囲内であり得る。ヒト血清におけるアルブミンの極端に高い濃度(35～50mg/ml、約0.6mM)を考慮すれば、アルブミン結合性ドメインの実質的に全てがインビボでアルブミンに結合すると計算される。
アルブミン結合性部分は、その他のドメイン(すなわち、TCRの可変ドメイン及び/若しくは定常ドメイン並びに/又は免疫エフェクター)のＣ又はＮ末端に、任意の適切な順序又は形態で連結されていてもよい。アルブミン結合性部分は、その他のドメイン(すなわち、TCRの可変ドメイン及び/若しくは定常ドメイン並びに/又は免疫エフェクター)にリンカーを介して連結されていてもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号36)、GGGSG(配列番号37)、GGSGG(配列番号38)、GSGGG(配列番号39)、GSGGGP(配列番号40)、GGEPS(配列番号41)、GGEGGGP(配列番号42)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号43)(WO2010/133828に記載のもの)並びにGGGSGGGG(配列番号44)が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリンカーは、次の配列モチーフ：GGGS、GGGGS、TVLRT、TVSSAS及びTVLSSASの１又は２以上を有する配列を含み得る。アルブミン結合性部分は、TCRに連結される場合、α又はβ鎖のいずれかに、リンカー有り又は無しで連結され得る。
診断目的の検出可能な標識には、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ及び造影剤が含まれる。
幾つかの目的のために、本発明の特異的結合性分子は、幾つかの特異的結合性分子を含んでなる複合体に凝集して、多価特異的結合性分子複合体を形成していてもよい。多価特異的結合性分子複合体の製造に使用し得る多量体化ドメインを含むヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して増大した血清残留性及び顕著に低減した解離速度を示す四量体のscFv抗体フラグメントを作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用に使用することができる四量体化ドメインを有する。本発明の多価特異的結合性分子複合体は、本発明の非多量体野生型(或いは次のようにも呼ぶ：親、天然、非変異、野生型又は足場)のＴ細胞レセプターヘテロ二量体と比較して、当該複合体に関する結合能力が増強されていてもよい。よって、本発明の特異的結合性分子の多価複合体もまた本発明に含まれる。本発明に従うこのような多価特異的結合性分子複合体は、インビトロ又はインビボにおける、特定の抗原を提示する細胞の追跡又は標的化に特に有用であり、また、そのような用途を有する更なる多価特異的結合性分子複合体の製造用の中間体としても有用である。
本発明の特異的結合性分子と組み合わされ得る治療薬剤としては、免疫モジュレーター及びエフェクター、放射性化合物、酵素(例えば、パーフォリン)又は化学療法剤(例えば、シスプラチン)が挙げられる。毒性効果が確実に所望の位置で発揮されるために、毒物は、緩徐に放出されるように特異的結合性分子に連結されたリポソームの内部に存在し得る。このことにより、体内輸送の間の損傷効果が防止され、該当する抗原提示細胞への特異的結合性分子の結合後に、毒物が最大効果を有することが保証される。
適切な治療薬剤の例として、次のものが挙げられるがそれらに限定されない：
・小分子細胞傷害性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。さらに、これら小分子細胞傷害性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞傷害性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例として、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、ラルブーレート(larbourlate)、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが挙げられる；
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼ；
・放射性核種、すなわち、１又は２以上のα粒子若しくはβ粒子又はγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225及びアスタチン213；高親和性TCR又はその多量体へのこれら放射性核種の結合を容易にするために、キレート化剤が使用されてもよい；
・免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)、
・スーパー抗原及びその変異体；
・TCR-HLA融合体、例えば、ペプチドが一般的なヒト病原体、例えばエプスタインバーウイルス(EBV)に由来するペプチド－HLA複合体との融合体；
・ケモカイン、例えばIL-8、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント。抗Ｔ細胞又はNK細胞決定基抗体(例えば、抗CD3、抗CD28又は抗CD16)が挙げられる；
・抗体様結合特性を有するオルターナティブタンパク質足場
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド。
１つの好適な実施形態は、免疫エフェクターと(通常、α鎖若しくはβ鎖又は両方のＮ末端又はＣ末端への、任意の適切な形態での融合により)結合した本発明の可溶性特異的結合性分子により提供される。特に好適な免疫エフェクターは、抗CD3抗体又は該抗CD3抗体の機能的フラグメント若しくはバリアントである。本明細書で用いる場合、用語「抗体」は前記のようなフラグメント及びバリアントを包含する。抗CD3抗体の例としては、OKT3、UCHT-1、BMA-031及び12F6が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適切な抗体フラグメント及びバリアント/アナログとしては、数例挙げるとすれば、ミニボディ、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、dsFv及びscFvフラグメント、ナノボディTM(Ablynx(ベルギー)から市販され、ラクダ科動物(例えば、ラクダ又はラマ)抗体に由来する合成の単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む構築物)及びドメイン抗体(Domantis(ベルギー)；これは、親和性成熟単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含む)又は抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、例えばアフィボディ(Affibody(スウェーデン)；工学的に操作されたプロテインＡ足場を含む)若しくはアンチカリン(Anticalins)(Pieris(ドイツ))；工学的に操作されたアンチカリンを含む)が挙げられる。
特異的結合性分子の別の１つの好適な形式では、TCR可変ドメイン及び免疫エフェクタードメインは、二量体化する別々のポリペプチド鎖上で互い違いに配置されてもよい。このような形式はWO2019012138に記載されている。簡潔には、第１のポリペプチド鎖は、(Ｎ末端からＣ末端へ)第１の抗体可変ドメイン、続いてTCR可変ドメイン、必要に応じて、続くFcドメインを含み得る。第２の鎖は、(Ｎ末端からＣ末端へ)TCR可変ドメイン、続いて第２の抗体可変ドメイン、必要に応じて、続くFcドメインを含み得る。適切な長さのリンカーがあれば、これら鎖は二量体化して、必要に応じてFcドメインを含む多重特異性分子を形成する。このように複数のドメインが異なる鎖に位置する分子もまた、ダイアボディと呼ばれ得、これもまた本明細書中で企図されている。追加の鎖及びドメインが付加されて、例えばトリアボディが形成されてもよい。
したがって、本明細書には、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含んでなる分子からなる群より選択される二重特異性ポリペプチド分子もまた提供される。ここで、
第１のポリペプチド鎖は、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第１の結合領域(VD1)と、MHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変ドメインの第１の結合領域(VR1)と、前記両ドメインを接続する第１のリンカー(LINK1)とを含んでなり、
第２のポリペプチド鎖は、MHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変ドメインの第２の結合領域(VR2)と、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第２の結合領域(VD2)と、前記両ドメインを接続する第２のリンカー(LINK2)とを含んでなり、ここで、
前記第１の結合領域(VD1)及び前記第２の結合領域(VD2)は会合して、前記ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に結合する第１の結合性部位(VD1)(VD2)を形成し、
前記第１の結合領域(VR1)及び前記第２の結合領域(VR2)は会合して、前記MHC結合ペプチドエピトープに結合する第２の結合性部位(VR1)(VR2)を形成し、ここで、
前記２つのポリペプチド鎖は、ヒトIgGヒンジドメイン及び/又はヒトIgG Fcドメイン又はその二量体化部分と融合されおり、ここで、
前記２つのポリペプチド鎖は、前記ヒンジドメイン及び/又はFcドメイン間の共有及び/又は非共有結合により接続されており、ここで、
前記二重特異性ポリペプチド分子は、前記細胞表面分子及び前記MHC結合ペプチドエピトープに同時に結合することができるか、
２つのポリペプチド鎖中の前記結合領域の順序がVD1-VR1及びVR2-VD2、又はVD1-VR2及びVR1-VD2、又はVD2-VR1及びVR2-VD1、又はVD2-VR2及びVR1-VD1から選択され、ドメインはLINK1又はLINK2のいずれかにより接続され、MHC結合ペプチドエピトープはGLSPTVWLSV又はGLSPTVWLSAであり、MHCはHLA-A*02である二重特異性ポリペプチド分子。
特異的結合性分子と抗CD3抗体との連結は、共有結合によってもよいし、非共有結合によってもよい。共有結合は直接であってもよいし、リンカー配列を介する間接的であってもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。本発明の特異的結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGGS(配列番号33)、GGGSG(配列番号34)、GGSGG(配列番号35)、GSGGG(配列番号36)、GSGGGP(配列番号37)、GGEPS(配列番号38)、GGEGGGP(配列番号39)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号40)(WO2010/133828に記載のもの)並びにGGGSGGGG(配列番号41)が挙げられるが、これらに限定されない。追加のリンカーは、次の配列モチーフ：GGGS、GGGGS、TVLRT、TVSSAS及びTVLSSASの１又は２以上を有する配列を含み得る。
本発明の抗CD3－特異的結合性分子融合構築物の具体的実施形態として、α鎖が配列番号４～６のアミノ酸配列を含むTCR可変ドメインから構成され、及び/又はβ鎖が配列番号７～11のアミノ酸配列を含むTCR可変ドメインから構成されるα鎖とβ鎖との対が挙げられる。前記α鎖及びβ鎖は、非天然型ジスルフィド結合を含む定常領域を更に含んでいてもよい。α鎖の定常ドメインは８アミノ酸が短縮化されていてもよい。α鎖及び/又はβ鎖のＮ又はＣ末端は、抗CD3 scFv抗体フラグメントに、配列番号33～41から選択されるリンカーを介して融合されていてもよい。このような抗CD3－特異的結合性分子融合構築物の特定の好適な実施形態は下記の図４に提供される：
Figure 2022526786000010
前記抗CD3－TCR融合構築物の機能的バリアントもまた、本発明の範囲に含まれる。前記機能的バリアントは、好ましくは、参照配列に対して、少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％の同一性を有するが、機能的に等価である。
１つの更なる観点では、本発明は、本発明の特異的結合性分子又は特異的結合性分子－抗CD3融合体をコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態では、核酸はcDNAである。幾つかの実施形態では、核酸はmRNAであり得る。幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の特異的結合性分子のα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の特異的結合性分子のβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸は、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は操作されたものであり得る。核酸配列は、用いる発現系に応じてコドン最適化されていてもよい。当業者に公知であるように、発現系は、細菌細胞、例えばE. coli又は酵母細胞又は哺乳動物細胞又は昆虫細胞を含み得、或いは、発現系は細胞フリー発現系であり得る。
別の１つの観点では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、ベクターはTCR発現ベクターである。適切なTCR発現ベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクターを含む。更なる詳細は、Zhang(2012)及びその引用文献中に見出すことができる(Zhangら，Adv Drug Deliv Rev. 2012 Jun 1；64(8)：756-762)。
本発明はまた、本発明のベクター、好ましくはTCR発現ベクターを有する細胞を提供する。適切な細胞として、哺乳動物細胞、好ましくは免疫細胞、尚より好ましくはＴ細胞が挙げられる。ベクターは、α鎖及びβ鎖を単一オープンリーディングフレームにコードするか、又は２つの別個のオープンリーディングフレームにそれぞれをコードする本発明の核酸を含んでなってもよい。別の１つの観点は、本発明の特異的結合性分子のα鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター及び本発明の特異的結合性分子のβ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターを有する細胞を提供する。この細胞は養子療法に特に有用である。本発明の細胞は、単離され及び/又は組み換えられ及び/又は天然に存在しない及び/又は工学的に操作されていてもよい。
本発明の特異的結合性分子は養子療法に有用であるので、本発明は、本発明の特異的結合性分子を提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は工学的に操作された細胞、特にＴ細胞を包含する。本発明はまた、本発明の特異的結合性分子を提示するＴ細胞の拡大された集団を提供する。本発明の特異的結合性分子をコードする核酸(例えば、DNA、cDNA又はRNA)でのＴ細胞のトランスフェクションに適切な幾つかの方法が存在する(例えば、Robbinsら(2008) J Immunol. 180:6116-6131を参照)。本発明の特異的結合性分子を発現するＴ細胞は、養子療法ベースのガン又は慢性ウイルス感染の治療における使用に適切である。当業者に公知であるように、養子療法の実施を可能にする適切な幾つかの方法が存在する(例えば、Rosenbergら(2008)，Nat Rev Cancer 8(4):299-308を参照)。
当該分野において周知であるように、タンパク質(TCRを含む)は翻訳後修飾に付されていてもよい。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、ポリペプチド又はTCR鎖中の規定されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基又はセリン/スレオニン残基は、周知のオリゴ糖付加位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状況は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び特定の酵素の利用可能性を含む幾つかの因子に依存する。さらに、グリコシル化状況(すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び付加の総数)は、タンパク質の機能に影響することがある。したがって、組換えタンパク質を製造するときには、グリコシル化の制御が望ましい場合が多い。制御されたグリコシル化は、抗体ベースの治療薬を改善するために用いられている(Jefferisら(2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34)。本発明の可溶性TCRについて、グリコシル化は、例えば特定の細胞株(哺乳動物細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はヒト胎児腎(HEK)細胞を含むが、これらに限定されない)を用いることにより、又は化学的修飾により制御されてもよい。このような修飾は、グリコシル化が薬物動態を改善し、免疫原性を低減させ及び天然型ヒトタンパク質をより厳密に模擬することができるので、望ましくあり得る(Sinclair及びElliott(2005)，Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35)。
患者への投与のために、本発明の特異的結合性分子(好ましくは、検出可能な標識若しくは治療薬剤と結合しているか、又はトランスフェクトされたＴ細胞に発現しているもの)又は本発明の特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、発現ベクター若しくは細胞は、滅菌医薬組成物の一部として、１又は２以上の薬学的に許容され得るキャリア又は賦形剤と共に提供されてもよい。この医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。医薬組成物は、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封容器内で提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、(必須ではないが)通常、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含み得る。
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば非経口経路(皮下、筋内、髄腔内又は静脈内経路を含む)、経腸(経口又は直腸経路を含む)、吸入又は鼻内経路による投与に適合していてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分をキャリア又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾患又は異常、治療すべき個体の年齢及び状態などに依存して広範に変化し得る。特異的結合性分子－抗CD3融合分子に適切な用量範囲は、25ng/kg～50μg/kg又は１μg～１gであり得る。医師が、使用すべき適切な投薬量を最終的には決定する。
本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％純粋で提供されてもよい。
本発明はまた、次のものを提供する：
・医薬における使用のため、好ましくは慢性HBV又は慢性HBV感染に起因する肝細胞ガン(HCC)の治療法における使用のための、本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞；
・慢性HBV又は慢性HBV感染に起因する肝細胞ガン(HCC)の治療用医薬の製造における、本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞の使用；
・本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を患者に投与することを含んでなる、患者におけるガン又は腫瘍の治療法；
・本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を含む、ヒト対象に投与するための注射可能製剤。
本発明の特異的結合性分子、特異的結合性分子－抗CD3融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞は、注射により、例えば静脈内、皮下に、又は直接腫瘍内注射により投与され得る。ヒト対象はHLA-A*02サブタイプであり得る。腫瘍の処置が企図される場合、腫瘍は充実腫瘍又は液性腫瘍であり得る。
治療方法は、１又は２以上の追加の抗ウイルス薬又は抗新生物薬を、別々に、組合せで又は逐次に投与することを更に含み得る。
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についても同様である(ただし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した先行技術文献は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。
図面の説明
図１－可溶形態の足場TCR α及びβ鎖の細胞外領域のアミノ酸配列を提供する。
図２－変異TCR α鎖可変領域のアミノ酸配列の例を提供する。
図３－変異TCR β鎖可変領域のアミノ酸配列の例を提供する。
図４－図２及び３に示す特定の変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合体のアミノ酸配列を提供する。
図５－アラニン置換ペプチドに対する可溶性WT TCRの比較結合性データを提供する。
図６－図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子の効力及び特異性を示す細胞データを提供する。
図７－図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子による抗原陽性細胞の殺傷を示す細胞データを提供する。
図８－図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子の特異性を更に示す細胞データを提供する。
図９－図２及び３に示す変異TCR可変ドメインを含むTCR－抗CD3融合分子が感染細胞の減少(パーセンテージ)を媒介することを証明する細胞データを提供する。
下記の非限定的実施例において本発明を更に説明する。
実施例
実施例１－可溶形式のWT TCRの発現、リフォールディング及び精製
方法
可溶性TCRのα及びβ細胞外領域(図１のアミノ酸配列に相当)をコードするDNA配列を、(Sambrookら，Molecular cloning. Vol. 2(1989) New York: Cold spring harbour laboratory pressに記載のような)標準的方法を用いて、別々にpGMT7ベースの発現プラスミドにクローニングした。この発現プラスミドを別々にE. coli株Rosetta(BL21pLysS)に形質転換した。発現のために、細胞を、１％グリセロール(＋アンピシリン100μg/ml及び34μg/mlクロラムフェニコール)を補充した自己誘導培地中230rpmで37℃にて２時間、その後温度を30℃に低下させて一晩増殖させた。その後、細胞を遠心分離により採集した。BugBusterタンパク質抽出試薬(Merck Millipore)を製造業者の指示に従って用いて細胞ペレットを溶解させた。封入体ペレットを遠心分離により回収した。ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、0.5％ Triton-X100、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中で２回洗浄し、最後に界面活性剤フリーの緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中に再懸濁した。６Ｍグアニジン-HClで可溶化し、OD280を測定することによって、封入体タンパク質の収量を定量した。次いで、消光係数を用いてタンパク質濃度を算出した。８Ｍ尿素で可溶化し、約２μgを還元条件下の４～20％ SDS-PAGEにロードして封入体の純度を測定した。次いで、デンシトメトリーソフトウェア(Chemidoc, Biorad)を用いて純度を推定又は算出した。封入体を、短期保存については＋４℃にて、長期保存については－20℃又は－70℃にて保存した。
可溶性TCRのリフォールディングについては、α鎖含有封入体及びβ鎖含有封入体を先ず混合し、可溶化/変性緩衝液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、20mM DTT)中に希釈し、続いて30分間37℃にてインキュベートした。次いで、リフォールド緩衝液(100mM Tris pH8.1、800又は400mM L-アルギニンHCL、２mM EDTA、４Ｍ尿素、6.5mMシステアミン塩酸及び1.9mMシスタミン二塩酸)中に更に希釈し、溶液を十分に混合することによりリフォールディングを開始した。リフォールドした混合物を、１Ｌあたり10ＬのH2Oに対して18～20時間５℃±３℃にて透析した。その後、透析緩衝液を10mM Tris pH8.1(10Ｌ)と２回交換し、透析を更に15時間継続した。次いで、リフォールド混合物を0.45μmセルロースフィルターで濾過した。
透析したリフォールド物をPOROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムに適用し、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を用いて６カラム容量にわたり20mM Tris pH8.1中０～500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させることにより可溶性TCRの精製を開始した。ピークTCR画分をSDS PAGEにより同定した後、プールし、濃縮した。次いで、濃縮サンプルを、ダルベッコPBS緩衝液で予め平衡化させたSuperdex(登録商標)200 Increase 10/300 GLゲル濾過カラム(GE Healthcare)に適用した。ピークTCR画分をプールし、濃縮し、精製物質の最終収量を算出した。
実施例２－可溶性TCR-抗CD3融合分子の発現、リフォールディング及び精製
方法
可溶性TCR－抗CD3融合分子の製造は、TCR β鎖を抗CD3単鎖抗体にリンカーを介して融合させたことを除き、実施例１に記載のとおり行った。加えて、リフォールディング工程のレドックス試薬の濃度は、１mMシスタミン二塩酸、10mMシステアミン塩酸であった。最後に、カチオン交換工程を、アニオン交換工程後に付加した。この場合、アニオン交換のピーク画分を40mM MES中に20倍希釈し、POROS(登録商標) 50HSカチオン交換カラムに適用した。結合タンパク質を、40mM MES中０～500mM NaClのグラジエントを用いて溶出させた。ピーク画分をプールし、200mM Tris pH8.1に調整後、濃縮し、実施例１に記載のようにゲル濾過マトリクスに直接適用した。
実施例３－結合特性決定
当該ペプチド－HLA複合体に対する精製済み可溶性TCR及び融合分子の結合分析を、BIAcore 8K、BIAcore 3000又はBIAcore T200装置のいずれかを用いる表面プラズモン共鳴により行った。当業者に公知の方法を用いて、ビオチン化クラスＩ HLA-A*02分子を目的のペプチドと共にリフォールドさせて精製した(O'Callaghanら(1999)，Anal Biochem 266(1):9-15；Garbocziら(1992)，Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3429-3433)。全ての測定は、0.005％ P20を補充したダルベッコPBS緩衝液中で25℃にて行った。
BIAcore法
ビオチン化ペプチド－HLAモノマーをストレプトアビジン結合CM-5ビオチン捕捉センサチップに固定した。平衡結合定数は、約500応答単位(RU)のペプチド－HLA-A*02複合体を被覆したフローセル上に10～30μl/分の定流量で注入した可溶性TCR又は融合分子の系列希釈物を用いて決定した。平衡応答は、各TCR濃度について、ペプチド－HLAを含まないコントロールフローセルでのバルク緩衝液応答を減算して規格化した。KD値は、Prismソフトウェア及びLangmuir結合等温式 結合 = Ｃ×Max/(Ｃ+KD) (式中、「結合」は注入したTCRの濃度Ｃでの平衡結合(RU)であり、Maxは最大結合である)を用いる非線形曲線フィッティングにより得た。
高親和性相互作用については、結合パラメータは、単一サイクル速度論分析により決定した。５つの異なる濃度の可溶性TCR又は融合体タンパク質を、約50～200RUのペプチド－HLA複合体を被覆したフローセル上に50～60μl/分の流速で注入した。代表的には、60～200μlの可溶性TCR又は融合分子を２～100nMの最高濃度で注入し、他の４つの注入については２倍系列希釈物を用いた。最低濃度を先ず注入した。その後、解離相を測定するため、≧10％の解離が生じるまで、典型的には１～３時間後まで、緩衝液を注入した。速度論パラメータは製造業者のソフトウェアを用いて算出した。半減期の算出を可能とするため、解離相を一次指数関数的減衰式にフィッティングした。平衡定数KDはkoff/konから算出した。
実施例４－可溶性WT TCRの結合特徴決定
可溶性WT TCR(図１に示すアミノ酸配列を有する)を実施例１に記載した方法に従って製造した。精製タンパク質の収量は9.1mg/Lであった。結合パラメータを、実施例３に従って平衡結合定数に基づいて算出した。同族ペプチド、ペプチドの既知のウイルス性バリアント又は無関係のペプチドのいずれかを含むpHLA複合体を製造した。
結果
可溶性WT TCRは、同族ペプチドGLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体に1.44μM±0.076μMのKD(Bmax=303；R2=0.997)で結合した。同じTCRがバリアントペプチドGLSPTVWLSA－HLA-A*02に1.23μM±0.07μMのKD(Bmax=152；R2=0.996)で結合した。これらデータは、可溶性WT TCRを用いて天然及びバリアントの両方のペプチドを標的することができることを示す。
可溶性WT TCRの特異性を、天然に提示される24の無関係ペプチド－HLA-A*02複合体のパネルに対して評価した。無関係pHLAを３群に分割し、３つのフローセルの１つにロードした。可溶性野生型TCRを、全てのフローセルに68.3及び6.8μMの濃度で注入した。いずれの濃度でも有意な結合は検出されなかった。このことは可溶性WT TCRがHLA-A*02複合体に特異的であることを示す。
追加の特異性評価を、GLSPTVWLSVペプチドの各残基を逐次にアラニンで置換したペプチドのパネルを用いて行った。アラニン置換ペプチドの各々に対する相対的結合を決定し、得られたデータを図５に示す。ペプチドの中央部分でのアラニン置換はTCR結合の喪失をもたらす。ペプチドの中央部分における低い置換寛容性は、TCRが高特異性を有し、したがって代替ペプチドとの交差反応性に関して低リスクであることを示す。
実施例５－抗CD3に融合させた変異可溶性TCRの結合特徴決定
変異TCR α及びβ可変ドメイン(図２及び３にそれぞれ提供するアミノ酸配列(配列番号４～11))を用いてTCR-抗CD3融合分子を製造した。製造は実施例２に従って行った。図４は、下記の４つのTCR-抗CD3融合分子の完全長アミノ酸配列を提供する。これら４つの融合分子の各々の収量を括弧内に示す。
・ a19b03 (6.02mg/L)
・ a13b03 (4.13mg/L)
・ a01b03 (3.78mg/L)
・ a13b09 (3.46mg/L)
ペプチド－HLA-A*02複合体への結合を実施例３に従って決定した。
結果
下記表に示すデータは、記載されたTCR可変ドメイン配列を含む融合分子がGLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体を超生理的結合親和性及び半減期で認識したことを示している。
Figure 2022526786000011
実施例６－抗CD3に融合させた変異可溶性TCRの効力及び特異性特徴決定
Ｔ細胞活性化
図２及び３に示すTCR可変ドメイン配列を含んでなる融合体分子を、GLSPTVWLSV－HLA-A*02複合体を提示する細胞に対してCD3+ Ｔ細胞の強力で特異的な活性化を媒介する能力について評価した。インターフェロン-γ(IFN-γ)放出をＴ細胞活性化の読取値として用いた。
方法
ヒトIFN-γ ELISPOTキット(BD Biosciences)を製造業者の指示に従って用いてアッセイを行った。簡潔には、標的細胞をアッセイ培地(10％熱不活化FBS及び１％ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン含有RPMI 1640)中１×106/mlの密度で準備し、50μlの体積中50,000細胞/ウェルにてプレートした。新鮮なドナー血から単離した末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として用いて、50μlの体積中50,000細胞/ウェルにてプレートした(各実験に用いた細胞の正確な数は、ドナー依存性であり、当該アッセイに適切な範囲内で応答を生じるように調整され得る)。融合分子を滴定して、10nM、１nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM及び0.0001nMの最終濃度(予期される臨床的に妥当な範囲にわたる)として、ウェルに50μlの体積で加えた。
製造業者の指示に従ってプレートを準備した。標的細胞、エフェクター細胞及び融合分子を該当するウェルに加え、アッセイ培地で最終体積200μlとした。全ての反応を三連で行った。融合分子を省略したコントロールウェルもまた準備した。次いで、プレートを一晩インキュベートした(37℃/５％ CO2)。翌日、プレートを洗浄緩衝液(脱イオン水で作製した、0.05％ Tween-20含有１×PBSサシェ)で３回洗浄した。次いで、一次検出抗体を各ウェルに50μlの体積で加えた。プレートを室温にて２時間インキュベートした後、再び３回洗浄した。50μlの希釈ストレプトアビジン-HRPを各ウェルに加えて、室温にて１時間インキュベートすることにより二次検出を行い、洗浄工程を繰り返した。使用前15分以内に、一滴(20μl)のAEC色原体を各１mlのAEC基質に加えて混合し、50μlを各ウェルに添加した。スポット発色を定期的にモニターし、プレートを水道水で洗浄して発色反応を終止させた。次いで、プレートを室温にて少なくとも２時間乾燥させた後、Immunospotソフトウェア(Cellular Technology Limited)を備えるCTL分析装置を用いてスポットを計数した。
本実施例では、下記の細胞株を標的細胞として用いた：
・ PLC/PRF/5 (抗原陽性)
PLC/PRF/5は、HBVゲノムが組み込まれたヒト肝細胞ガン細胞株である。GLSPTVWLSVペプチドは、(質量分析装置により決定されたように)これら細胞により天然に提示される。
・ HepG2 (抗原陰性)
HepG2は、肝臓の肝細胞ガンに由来するヒト細胞株である。
両細胞株とも、HLA-A*02 β2M複合体をコードする遺伝子を形質導入された。
結果
試験した融合分子の各々は、抗原陽性細胞の存在下でＴ細胞の強力な活性化を示した。Ec50値をデータから算出して下記表に示す。融合分子は、抗原陰性HLA-A*02陽性細胞を認識しないことが示された。図６は、下記表に列挙する４つの融合分子の代表的データを示す(示された値は異なるエフェクタードナーを用いて得られたことに留意すべきである(すなわち全てに共通するドナーは１人ではない)。
Figure 2022526786000012
 これらデータは、本発明の変異TCR可変ドメイン配列を含む融合分子が、抗原陽性細胞に対して強力(低pM範囲のEc50)で特異的なＴ細胞活性化を媒介できることを示している。
標的細胞殺傷
変異TCR配列を含む融合分子が抗原陽性腫瘍細胞の強力なＴ細胞媒介殺傷を媒介する能力を、IncuCyteプラットフォーム(Essen BioScience)を用いて調べた。このアッセイにより、ポトーシスのマーカーであるカスパーゼ-3/7の放出の顕微鏡によるリアルタイム検出が可能になる。
方法
アッセイを、CellPlayer 96ウェルカスパーゼ-3/7アポトーシスアッセイキット(Essen BioScience, Cat. No.4440)を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。簡潔には、PLC/PRF/5細胞をCellTracker DeepRedで染色した後、二色分析が可能なようにプレートし、その後10,000細胞/ウェルにてプレートし、一晩インキュベートして接着させた。融合分子を種々の濃度で調製し、各25μlを、最終濃度が100fM～10nMとなるように、該当するウェルに加えた。エフェクター細胞をエフェクター：標的細胞比10：１にて用いた(100,000細胞/ウェル)。また、融合体を含まないコントロールサンプルを、エフェクター細胞又は標的細胞のいずれかを単独で含むサンプルと共に調製した。NucViewアッセイ試薬を30μMで調製し、25μlを全ウェルに加え、最終体積を150μlとした(最終濃度は1.25μMとなる)。プレートをIncuCyte装置内に置き、５日間にわたって３時間ごとに撮像した(１画像/ウェル)。各画像中のアポトーシス細胞の数を決定し、１mm2あたりのアポトーシス細胞として記録した。アッセイは３連で行った。
結果
図７に示したデータは、各グラフに示した変異TCR可変鎖配列を含んでなる融合分子の存在下での抗原陽性細胞のリアルタイム殺傷を示す(明瞭化のため、３濃度のみを示す)。各場合で、100pM以下の濃度にて標的細胞殺傷が観察された。融合分子の不在下では殺傷は観察されなかった。
正常組織に対する高リスクに関する安全性スクリーニング
変異TCR配列を含んでなる融合分子の特異性を更に証明するため、更なる試験を、上記と同じELISPOT法を用い、標的として健常ヒト組織に由来する正常細胞のパネルを用いて行った。
第１の実験では、a19b03変異TCR可変ドメインを含んでなるTCR－抗CD3融合体を異なる３濃度(２nM、１nM及び0.1nM)にて試験した。各正常組織からの２ロットの細胞を標的として用い、エフェクターＴ細胞を異なる３ドナーから得た。コントロール測定を、融合分子を含まないサンプル及び正常細胞をPLC/PRF/5(抗原陽性)細胞に置き換え、単一濃度の融合分子(１nM)を含ませたサンプルを用いて行った。
第２の実験では、変異鎖(a01b03、a01b02、a01b04、a01b05)を含んでなる異なる４つのTCR－抗CD3融合体を用いた。同じ３濃度の融合分子を用いた(２nM、１nM及び0.1nM)。各正常組織からの単一ロットの細胞を標的として用い、エフェクターＴ細胞を単一ドナーから得た。コントロール測定を、融合分子を含まないサンプル及び正常細胞を10μMペプチドでパルスし(抗原陽性)、0.1nMの単一濃度の融合分子を含ませたサンプルを用いて行った。
結果
両実験で、正常細胞に対するＴ細胞活性化が、バックグランド(すなわち、融合分子を含まないサンプルとして)に類似するレベルで観察された。
図8aは、異なる２つの組織からの１ロットの正常細胞及び異なる３ドナー(ドナー１～３と標識)に関する第１の実験からのデータを示す。図8bは、異なる２つの組織に関する第２の実験からのデータを示す。各グラフ中の点線はバックグランドレベルを示す。
これらデータは、図２及び３に示すTCR可変ドメインを含んでなる融合分子が、正常組織に由来する細胞パネルに対して、重大な交差反応性を示さないことを示している。
上記のTCR－抗CD3融合体は、治療用途に特に適切とする性質を有する。
実施例７－抗CD3に融合された可溶性TCRによるHBV感染細胞に対する強力なＴ細胞活性化
本発明のTCR－抗CD3融合体はＴ細胞活性をHBV感染細胞に再指向化させることができることを証明するため、HBV感染モデルを樹立した。
簡潔には、HLA-A*02:01陽性肝細胞ガン(HCC)細胞株HepG2にレセプターNTCPをトランスフェクトした。その後、細胞を200MOIのHBV(遺伝子型Ｄ；１×108ゲノムコピーのロット03072018, ImQuest BioSciences)に感染させた。次いで、感染細胞を、TCR－抗CD3融合体の存在下又は不在下に、ドナー血から得た汎Ｔ細胞と共培養した。PrimeFlow(Invitrogen)を用いて、残る感染細胞のパーセンテージを定量してＢ型肝炎表面抗原(HBsAg)RNAを検出した。
a19b03及びa01b03を含んでなるTCR－抗CD3融合体を本実施例に用いた。加えて、代替の非HBVペプチドに特異的なTCR－抗CD3を陰性コントロールとして用いた。
方法
感染７日目に、感染HepG2-NTCP細胞を含むウェルから上清を取り出した後、共培養のために、汎Ｔ細胞をTCR－抗CD3融合体有り又は無しで加えた。エフェクターＴ細胞は、感染のためにプレートしたHepG2-NTCPの当初数に応じて10:1の比で加え、TCR－抗CD3融合体は、１nM又は0.1nMのいずれかの最終濃度で加えた。細胞を５日間培養した。共培養の終時に、感染細胞を培養プレートからトリプシンにより取り出し、表面をCD45及び固定可能な生存率色素(eFluor 780)について染色した。その後、細胞を固定し、PrimeFlowプローブセットVF1-6000704を用いるＢ型肝炎表面抗原(HBsAg)RNAの染色のために透過化した。ハウスキーピング遺伝子RPL13Aの染色を、染色手順(プローブセットVA4-13187)の陽性コントロールとして用いた。染色細胞をMACSQuant Xフローサイトメータに流し、FlowJov10により分析してHBsAg発現細胞のパーセンテージを定量した。
結果
図９は、a19b03及びa01b03 TCR－抗CD3融合体が共に、１nMにて感染細胞の％の約60％減少を導くことを示す。この効果は0.1nMでも測定可能であり、34％減少をもたらす。
これらデータは、図２及び３に示すTCR可変ドメインを含んでなる融合分子が、感染細胞を効果的に除去することができることを示す。

Claims (30)

  1. GLSPTVWLSV(配列番号１)－HLA-A*02複合体及び/又はGLSPTVWLSA(配列番号17)－HLA-A*02複合体に対する結合特性を有し、各々がFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(FRはフレームワーク領域であり、CDRは相補性決定領域である)を含むTCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなる特異的結合性分子であって、
    (ａ)α鎖CDRは次の配列：
    CDR1－DRGSQS(配列番号18)
    CDR2－IYSNGD(配列番号19)
    CDR3－CAVRNYNTDKLIF(配列番号20)
    を有し、該配列中に１若しくは２以上の変異を有していてもよく、及び/又は
    (ｂ)β鎖CDRは次の配列：
    CDR1－MNHEY(配列番号21)
    CDR2－SVGAGI(配列番号22)
    CDR3－CASSYATGGTGELFF(配列番号23)
    を有し、該配列中に１若しくは２以上の変異を有していてもよい、特異的結合性分子。
  2. α鎖可変ドメインフレームワーク領域が次の配列：
    FR1－配列番号２のアミノ酸１～26
    FR2－配列番号２のアミノ酸33～49
    FR3－配列番号２のアミノ酸56～88
    FR4－配列番号２のアミノ酸102～111
    を含むか若しくはそれぞれの配列が前記配列と少なくとも90％の同一性を有し、及び/又は
    β鎖可変ドメインフレームワーク領域が次の配列：
    FR1－配列番号３のアミノ酸１～26
    FR2－配列番号３のアミノ酸32～48
    FR3－配列番号３のアミノ酸55～90
    FR4－配列番号３のアミノ酸106～114
    を含むか若しくはそれぞれの配列が前記配列と少なくとも90％の同一性を有する、請求項１に記載の特異的結合性分子。
  3. α鎖CDR中の変異の１又は２以上が下記(配列番号２の番号付けを参照して)：
    Figure 2022526786000013
     から選択される、請求項１又は２に記載の特異的結合性分子。
  4. α鎖CDRが次の変異群(配列番号２の番号付けを参照して)：
    Figure 2022526786000014
     の１つの変異群を有する、請求項３に記載の特異的結合性分子。
  5. α鎖が下記：
    Figure 2022526786000015
     から選択されるCDR配列を有する、請求項２又は３に記載の特異的結合性分子。
  6. β鎖CDR中の変異の１又は２以上が下記(配列番号３の番号付けを参照して)：
    Figure 2022526786000016
     から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
  7. β鎖CDRが次の変異群(配列番号３の番号付けを参照して)：
    Figure 2022526786000017
     の１つの変異群を有する、請求項６に記載の特異的結合性分子。
  8. β鎖が下記：
    Figure 2022526786000018
     から選択されるCDR配列を有する、請求項６又は７に記載の特異的結合性分子。
  9. 下記のα鎖CDR及びβ鎖CDRの組合せ：
    Figure 2022526786000019
     の１つを有する請求項１～８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
  10. α鎖可変ドメインが配列番号４～６のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、β鎖可変ドメインが配列番号７～11のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
  11. α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインが下記のアミノ酸配列：
    Figure 2022526786000020
     から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
  12. α鎖TRAC定常ドメイン配列及びβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列を有するα-βヘテロ二量体である請求項１～１１のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
  13. α鎖及びβ鎖の定常ドメイン配列がTRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失させる短縮化又は置換により改変されている、請求項１２に記載の特異的結合性分子。
  14. α鎖及び/又はβ鎖の定常ドメイン配列が、TRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57からシステイン残基への置換により改変され、前記システイン同士がα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間の非天然型ジスルフィド結合を形成している、請求項１２又は１３に記載の特異的結合性分子。
  15. Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ又はVα-L-Vβ-Cβ型(Vα及びVβはそれぞれTCR α鎖及びβ鎖可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α鎖及びβ鎖定常領域であり、Lはリンカー配列である)の単鎖形式である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
  16. 検出可能な標識、治療薬剤又はPK改変部分と結合した請求項１～１５のいずれか１項に記載の特異的結合性分子。
  17. TCRのα又はβ鎖のＣ又はＮ末端に抗CD3抗体が、リンカー配列を介して又は介さずに共有結合している、請求項１６に記載の特異的結合性分子。
  18. リンカー配列がGGGGS(配列番号33)、GGGSG(配列番号34)、GGSGG(配列番号35)、GSGGG(配列番号36)、GSGGGP(配列番号37)、GGEPS(配列番号38)、GGEGGGP(配列番号39)、GGEGGGSEGGGS(配列番号40)及びGGGSGGGG(配列番号41)からなる群より選択される、請求項１７に記載の特異的結合性分子。
  19. α鎖可変ドメインが配列番号４～６から選択されるアミノ酸配列を含み、β鎖可変ドメインが配列番号７～11から選択されるアミノ酸配列を含む特異的結合性分子－抗CD3融合分子であって、抗CD3抗体がTCR β鎖のＮ末端又はＣ末端に配列番号33～41から選択されるリンカー配列を介して共有結合している、特異的結合性分子－抗CD3融合分子。
  20. 配列番号12、14及び15から選択されるα鎖アミノ酸配列、又は配列番号12、14及び15に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％若しくは100％の同一性を有するα鎖アミノ酸配列と、
    配列番号13及び16から選択されるβ鎖アミノ酸配列、又は配列番号13及び16に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％若しくは100％の同一性を有するβ鎖アミノ酸配列と
    を含んでなる請求項１９に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子。
  21. (ａ)配列番号12に対応するα鎖アミノ酸配列及び配列番号13に対応するβ鎖アミノ酸配列；
    (ｂ)配列番号14に対応するα鎖アミノ酸配列及び配列番号13に対応するβ鎖アミノ酸配列；
    (ｃ)配列番号15に対応するα鎖アミノ酸配列及び配列番号13に対応するβ鎖アミノ酸配列；又は
    (ｄ)配列番号14に対応するα鎖アミノ酸配列及び配列番号16に対応するβ鎖アミノ酸配列
    を含んでなる請求項２０に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子。
  22. 請求項１～２１のいずれか１項に規定されるTCR α鎖及び/又はTCR β鎖をコードする核酸。
  23. 請求項２２に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
  24. (ａ)請求項１～２１のいずれか１項に規定されるTCR α及びβ可変鎖を、単一オープンリーディングフレーム又は２つの異なるオープンリーディングフレームにコードする請求項２３に記載の発現ベクター；又は
    (ｂ)請求項１～２１のいずれか１項に規定されるTCR α可変鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクターと、請求項１～２１のいずれか１項に規定されるTCR β可変鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターと
    を有する細胞。
  25. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子を提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は操作された細胞、特にＴ細胞。
  26. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子又は請求項１９～２１のいずれか１項に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子又は請求項２４若しくは２５に記載の細胞を、１又は２以上の薬学的に許容され得るキャリア又は賦形剤と共に含んでなる医薬組成物。
  27. 医薬、好ましくはヒト対象における医薬に使用する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子、請求項２２に記載の核酸、請求項２６に記載の医薬組成物又は請求項２４若しくは２５に記載の細胞。
  28. 慢性HBV感染又は慢性HBV感染に起因するガン若しくは腫瘍の治療方法に、好ましくはヒト対象において使用する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子、請求項２２に記載の核酸、請求項２６に記載の医薬組成物又は請求項２４若しくは２５に記載の細胞。
  29. 慢性HBV感染又は慢性HBV感染に起因するガン若しくは腫瘍を有するヒト対象を治療する方法であって、薬学的に有効な用量の請求項２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含んでなる方法。
  30. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の特異的結合性分子又は請求項１９～２１のいずれか１項に記載の特異的結合性分子－抗CD3融合分子を製造する方法であって、
    ａ)請求項２４又は２５に記載の細胞を、特異的結合性分子鎖の発現に最適な条件下で維持し、
    ｂ)特異的結合性分子鎖を単離する
    ことを含んでなる方法。
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Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6417324B1 (en) * 2000-04-21 2002-07-09 Tripep Ab Synthetic peptides that bind to the hepatitis B virus core and e antigens
EP0977886A4 (en) 1997-03-07 2002-10-23 Sunol Molecular Corp FUSION PROTEINS, WHICH CONTAIN A BACTERIOPHAGE ENVELOPE PROTEIN AND A SINGLE CHAIN T-CELL RECEPTOR
ATE533784T1 (de) 1997-10-02 2011-12-15 Altor Bioscience Corp Lösliche, einzelkettige proteine des t- zellrezeptors
EP2336775A3 (en) 1999-12-06 2013-03-20 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
EP1259601A2 (en) 2000-02-22 2002-11-27 Ahuva Nissim Chimeric and tcr phage display libraries, chimeric and tcr reagents and methods of use thereof
CA2457652C (en) 2001-08-31 2012-08-07 Avidex Limited Soluble t cell receptor
AU2002349727B2 (en) * 2001-11-08 2008-10-16 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd Hepatitis E virus monoclonal antibodies or the binding fragments of it and the use thereof
JP4436319B2 (ja) 2002-10-09 2010-03-24 メディジーン リミテッド 単鎖組換えｔ細胞レセプター
EP2048159B1 (en) 2002-11-09 2014-01-01 Immunocore Ltd. T cell receptor display
WO2006000830A2 (en) 2004-06-29 2006-01-05 Avidex Ltd Cells expressing a modified t cell receptor
GB0908613D0 (en) 2009-05-20 2009-06-24 Immunocore Ltd T Cell Reseptors
SG177025A1 (en) * 2010-06-21 2012-01-30 Agency Science Tech & Res Hepatitis b virus specific antibody and uses thereof
WO2012017003A1 (en) * 2010-08-05 2012-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-mhc antibody anti-viral cytokine fusion protein
CN102786592A (zh) * 2011-05-17 2012-11-21 傅阳心 Hbv特异性抗体
BR122020023349B1 (pt) * 2012-06-11 2023-02-07 Xiamen University Anticorpo monoclonal, linha de célula de hibridoma, kit e uso do anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo
GB201223172D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Immunocore Ltd Method
GB201314404D0 (en) * 2013-08-12 2013-09-25 Immunocore Ltd T Cell Receptors
CN105636982B (zh) * 2013-09-16 2020-06-23 健康与环境慕尼黑德国研究中心赫姆霍茨中心（有限责任公司） 用于治疗hbv感染和相关病症的结合免疫效应细胞表面抗原和hbv抗原的双或多特异性多肽
GB201322430D0 (en) * 2013-12-18 2014-02-05 Immunocore Ltd T cell receptors
US20190031759A1 (en) * 2015-04-30 2019-01-31 Technion Research & Development Foundation Limited Chimeric antigen receptors and methods of their use
GB201604468D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201522592D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Immunocore Ltd T cell receptors
US11186624B2 (en) * 2016-09-23 2021-11-30 Lion Tcr Pte. Ltd. HBV antigen specific binding molecules and fragments thereof
US20190016804A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Dual specificity polypeptide molecule
CA3074839A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptide with conjugation sites and methods of use thereof

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