KR20220010855A - 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 디설피람 또는 그 유도체를 포함하여 이루어진다.
상기의 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 디설피람 또는 그 유도체가 포함되어 세포독성이 낮고, 지방세포의 분화억제 효과를 나타내어 우수한 비만 개선 및 치료효과를 나타낸다.
상기의 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 디설피람 또는 그 유도체가 포함되어 세포독성이 낮고, 지방세포의 분화억제 효과를 나타내어 우수한 비만 개선 및 치료효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포독성이 낮고, 지방세포의 분화억제 효과를 나타내는 디설피람 또는 그 유도체가 함유되어 우수한 비만 개선 및 치료효과를 나타내는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
ALDH2(aldehyde dehydrogenase2) 유전자는 미토콘드리아에서 에탄올 대사에서 아세트 알데히드가 아세트산으로 산화될 뿐만 아니라 lipid peroxidation의해 발생된 4-HNE(4-hydrpxynonenal)를 HNA(4-hydroxynonenoic acid)로 전환시키며, ALDH2 활성은 protein kinase C(PKCε)에 의한 직접 인산화를 통해 증가한다.
마우스 모델에서 ALDH2 발현은 adipogenesis와 매우 밀접한 관계가 있다고 보고 되고 있다(Nadler et al 2000). 또한, 4-HNE 축적은 비만과 양의 연관성이 있으며 말단 지방세포 분화에서 증가된다(Zhang et al 2013).
최근에는 PKCε-ALDH2 조절 축이 4-HNE의 대사를 촉진하여 지방세포 분화 및 생성을 촉진한다고 보고되고 있다(Yu et al., 2016).
한편, 디설피람(DSF, Disulfiram or tetraethylthiuram disulphide)은 화학식이 C10H20N2S4 또는 ((C2H5)2NCS)2S2로 표기되며, lipophilic한 성질을 가지고 있어 세포막 투과가 매우 용이한 특성을 나타낸다.
상기의 특성을 나타내는 디설피람은 경구 생체 이용 가능한 카바 모일 (carbamoyl)유도체로서 종래에는 알코올 중독 치료제나 항종양(antineoplastic)과 chemosensitizing 활성을 갖는 프로테아좀 억제제로 사용되고 있었다.
구체적으로, 알코올 중독과 관련해서 디설피람은 에탄올의 대사 산물인 아세트알데히드(acetaldehyde)를 아세트산(acetic acid)으로 산화시키는 효소인 ALDH2(acetaldehyde dehydrogease2)에 불가역적으로 결합하고 효소활성을 억제한다. 아세트알데히드의 탈수소효소의 억제는 아세트알데히드의 축적을 초래하고 다양한 불쾌증상을 생성하는데, 이를 다이 설피람-에탄올반응(DER)이라고 한다.
또한, 항종양과 Chemosensitizer과 관련해서는 디설피람은 금속을 킬레이트하는 강력한 능력을 가지고 있는데, 항종양활성은 암세포에 선택적으로 축적되는 금속인 구리(Cu)에 결합하는 것에 크게 의존한다. 디설피람과 구리는 반응성 산소 종(ROS)을 생성하고 프로테아좀 활성을 억제하여 유비퀴틴화된 단백질의 축적을 초래하고 이 두 가지 과정 모두 세포자연사(apoptosis)를 유도하며, 다양한 암 특이 적 경로를 억제하여 종양 세포 성장 억제로 이어진다.
즉, 종래에는 디설피람이 알코올 중독치료제나 항암제 등으로 사용되었을 뿐, 지방세포분화 억제효과를 나타내기 때문에, 본 발명과 같이 비만 개선 및 치료용도로 사용되는 것에 대해서는 전혀 인지하지 못하고 있었다.
본 발명의 목적은 세포독성이 낮고, 지방세포의 분화억제 효과를 나타내는 디설피람 또는 그 유도체가 함유되어 우수한 비만 개선 및 치료효과를 나타내는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 디설피람 또는 그 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제공함에 의해 달성된다.
본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 상기 디설피람 또는 그 유도체는 2 내지 8 마이크로몰의 농도로 포함되는 것으로 한다.
본 발명의 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 디설피람 유도체는 DDTC, Me-DDTC(DETC), Me-DDTC-SO(DETC-SO) 및 Me-DDTC-SO2(DETC-SO2)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 바람직한 특징에 따르면, 상기 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 지방세포의 분화관련 유전자의 발현을 억제하며, 상기 지방세포의 분화관련 유전자는 PPAR-r, C/EBP-a, aP2, SCD, ACC 단백질 및 mRNA인 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 PPAR-r의 타겟유전자와 ALDH2의 발현을 억제하며, 상기 PPAR-r의 타겟유전자는 AQP7, PCK1 및 OLR1 mRNA인 것으로 한다.
또한, 본 발명의 목적은 디설피람 또는 그 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물을 제공함에 의해서도 달성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 상기 디설피람 또는 그 유도체는 2 내지 8 마이크로몰의 농도로 포함되는 것으로 한다.
본 발명의 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 디설피람 유도체는 DDTC, Me-DDTC(DETC), Me-DDTC-SO(DETC-SO) 및 Me-DDTC-SO2(DETC-SO2)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 바람직한 특징에 따르면, 상기 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물은 지방세포의 분화관련 유전자의 발현을 억제하며, 상기 지방세포의 분화관련 유전자는 PPAR-r, C/EBP-a, aP2, SCD, ACC 단백질 및 mRNA인 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물은 PPAR-r의 타겟유전자와 ALDH2의 발현을 억제하며, 상기 PPAR-r의 타겟유전자는 AQP7, PCK1 및 OLR1 mRNA인 것으로 한다.
본 발명에 따른 디설피람 또는 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 세포독성이 낮고, 지방세포의 분화억제 효과로 인해 우수한 비만 개선 및 치료효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명에 사용되는 디설피람 및 디설피람 유도체의 구조를 나타낸 구조식이다.
도 2는 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방세포 분화억제 기작을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1을 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 6은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1을 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방구 형성억제, Total lipid 및 TG 억제효과를 측정하여 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 adipogenesis 조절인자 억제효과를 측정하여 나타낸 사진이다.
도 8 내지 14는 본 발명의 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방세포분화 관련 유전자 mRNA 발현 억제 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 ALDH mRNA 발현 억제효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방세포 분화억제 기작을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1을 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 6은 본 발명의 실시예 1 내지 4 및 비교예 1을 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방구 형성억제, Total lipid 및 TG 억제효과를 측정하여 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 adipogenesis 조절인자 억제효과를 측정하여 나타낸 사진이다.
도 8 내지 14는 본 발명의 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방세포분화 관련 유전자 mRNA 발현 억제 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 ALDH mRNA 발현 억제효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하에는, 본 발명의 바람직한 실시예와 각 성분의 물성을 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.
본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 디설피람 또는 그 유도체를 포함하며, 상기 디설피람 또는 그 유도체는 2 내지 8 마이크로몰의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
상기 디설피람 또는 그 유도체의 함량이 2 마이크로몰 농도 미만이면 비만 개선 및 치료효과가 미미하며, 상기 디설피람 또는 그 유도체의 함량이 8 마이크로몰 농도를 초과하게 되면 세포독성이 증가하기 때문에 바람직하지 못하다.
또한, 상기 디설피람 유도체는 DDTC, Me-DDTC(DETC), Me-DDTC-SO(DETC-SO) 및 Me-DDTC-SO2(DETC-SO2)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 지방세포의 분화관련 유전자의 발현을 억제하여 비만 개선 및 치료 효과를 나타내는데, 이때, 상기 지방세포의 분화관련 유전자는 PPAR-r, C/EBP-a, aP2, SCD, ACC 단백질 및 mRNA이다.
또한, 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 상기에 나열된 지방세포의 분화관련 유전제 외에, PPAR-r의 타겟유전자와 ALDH2의 발현을 억제하여 우수한 비만개선 및 치료효과를 나타내는데, 이때, 상기 PPAR-r의 타겟유전자는 AQP7, PCK1 및 OLR1 mRNA이다.
또한, 본 발명에 따른 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물은 디설피람 또는 그 유도체를 포함하며, 상기 디설피람 또는 그 유도체는 2 내지 8 마이크로몰의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
상기 디설피람 또는 그 유도체의 함량이 2 마이크로몰 농도 미만이면 비만 개선효과가 미미하며, 상기 디설피람 또는 그 유도체의 함량이 8 마이크로몰 농도를 초과하게 되면 세포독성이 증가하기 때문에 바람직하지 못하다.
또한, 상기 디설피람 유도체는 DDTC, Me-DDTC(DETC), Me-DDTC-SO(DETC-SO) 및 Me-DDTC-SO2(DETC-SO2)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물은 지방세포의 분화관련 유전자의 발현을 억제하여 비만 개선 및 치료 효과를 나타내는데, 이때, 상기 지방세포의 분화관련 유전자는 PPAR-r, C/EBP-a, aP2, SCD, ACC 단백질 및 mRNA이다.
또한, 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물은 상기에 나열된 지방세포의 분화관련 유전제 외에, PPAR-r의 타겟유전자와 ALDH2의 발현을 억제하여 우수한 비만 개선 효과를 나타내는데, 이때, 상기 PPAR-r의 타겟유전자는 AQP7, PCK1 및 OLR1 mRNA이다.
상기 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물과 상기 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물에 포함되는 디설피람 및 디설피람 유도체의 구조를 아래 도 1에 나타내었다.
이때, 상기 DDTC는 diethyldithiocarbamate의 약어이며, 상기 Me-DDTC(DETC)는 Diethyldithiocarbamic-acid-methyl ester의 약어이고, 상기 Me-DDTC-SO(DETC-SO)는 S-methyl-N,N-diethylthiocarbamate-sulfoxide의 약어이며, 상기 Me-DDTC-SO2(DETC-SO2)는 S-methyl-N,N-diethylthiocarbamate-sulfone의 약어이다.
또한, 본 발명에 따른 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방세포 분화억제 기작을 아래 도 2에 모식도로 나타내었다.
또한, 본 발명에서 용어 "지방세포"는 전지방세포에서 분화된 지방세포로 생체 내 지방을 생성하는 세포를 의미한다. 본 발명에서 용어 "비만"이란 과도한 지방생성으로 기인하여 발생되는 질환 또는 질병의 원인을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 (i) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ⅱ) 질환 또는 질병의 경감; 및 (ⅲ) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 디설피람 또는 그 유도체와 같은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
상기 담체는 약제학적으로 허용되는 성분의 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
또한, 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있는데, 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제,과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 담체 및 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스 또는 양모지 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제, 주사제 또는 활성 화합물의 서방출제형의 제제형태일 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 약학분야에서 통상 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
이하에서는, 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 물성을 실시예를 들어 설명하기로 한다.
<실시예 1>
디설피람이 2 마이크로몰 함유된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제조하였다.
<실시예 2>
디설피람이 4 마이크로몰 함유된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제조하였다.
<실시예 3>
디설피람이 6 마이크로몰 함유된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제조하였다.
<실시예 4>
디설피람이 8 마이크로몰 함유된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제조하였다.
<비교예 1>
디설피람이 16 마이크로몰 함유된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1을 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 세포독성을 측정하여 아래 도 3에 나타내었다.
{단, 디설피람은 씨그마알드리치로부터 구입하였으며, 세포독성 측정에 사용된 마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 구입하여, 항생제(Penicillin &Streptomycin 100U/ml, GIBCO Inc.)와 10% Bovine Serum(BS, GIBCO™, USA)이 첨가된 Dulbeccos Modified Eagles Medium(DMEM, GIBCO™, USA) 배지에서 37 ℃, 5% CO₂incubator에 적응시켜 배양하였으며, 계대배양은 3, 4일 간격으로 진행되었다.
또한, 세포독성은 MTT assay를 사용하였으며, 3T3-L1 세포를 48well plate(5×10⁴cells/ml)에 24시간 배양하여, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1을 통해 제조된 약학적 조성물을 처리한 후, 48시간 뒤, MTT(500㎍/ml)시약을 넣고 37℃에서 4시간 배양한 후, 배지를 제거하고 DMSO로 formazan을 녹여 shaker에 1시간 반응시킨 후에 microplate reader(Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하는 방법을 이용하였다.}
아래 도 3에 나타낸 것처럼, 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 약학적 조성물이 처리된 세포에서는 성장률에 유의미한 차이가 없었다. 그러나, 비교예 1을 통해 제조된 약학적 조성물이 처리된 세포에서는 현저하게 높은 성장억제율이 나타난 것을 알 수 있다.
또한, 상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1을 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방구 형성억제, Total lipid 및 TG 억제효과를 측정하여 아래 도 4 내지 6에 나타내었다.
{단, Total lipid 및 TG 억제효과는 3T3-L1 전구지방세포를 24well(1×105 cells/ml)에 분주한 후, 100% confluency 시점이 되면 2일 동안 더 유지시킨 후에 전구지방세포를 분화유도물질 0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)(Sigma-Aldrich, USA), 1uM Dexamethasone(Sigma-Aldrich, USA), 10㎍/ml Insulin(Sigma-Aldrich, USA)이 함유된 10% FBS(fetal bovine serum, GIBCO™, USA)DMEM 배지로 교환하여 2일 동안 분화유도를 촉진시키고, 2일 후 기존 배지를 제거하여 10㎍/ml Insulin이 함유된 10% FBS DMEM 배지로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 2일마다 4일 동안 10% FBS DMEM 배양액으로 교체하는 방식으로 총 분화유도는 7일 동안 실시하였으며, 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 분화유도물질과 함께 처리하였다.}
아래 도 4 내지 6에 나타낸 것처럼, 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 ORO 염색한 후에 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물이 3T3-L1 세포내 지방구의 수와 크기에 미치는 영향을 알아보기 위하여 현미경 관찰을 실시하였다.(도 4)
분화시키지 않은 3T3-L1 전지방세포는 지방구가 형성되지 않았으며, MDI처리하여 분화를 유도한 양성대조군은 많은 수의 지방구가 형성되어 적절한 연구모델을 확립하였다.
3T3-L1 세포에서 DSF의 adipogenesis 억제활성을 평가하기 위하여 세포 독성이 나타나지 않은 DSF을 Day 8까지 다양한 농도로 처리한 후 Day 8에 ORO 염색법을 통하여 adipogenesis 억제활성을 확인하였다. 그리고 관찰 후 isoprophanol에 lipid droplet를 녹인 후 520nm에서 흡광도를 축정하였다.(도 5)
MDI를 처리하여 지방세포로 분화된 양성대조군에서는 미분화된 세포에서보다 흡광도가 5배가량 높게 나타났다.
또한, DSF 처리군이 양성대조군(OD값 1.0)과 비교하였을 때 2, 4, 6, 8uM 처리시 점차적으로 lipid 합성 억제활성을 나타내는 것을 알 수 있다.
또한, Trigyceride(TG) 분석 결과에서는 DSF 2, 4, 6 그리고 8 uM 처리에서 TG함량은 농도의존적으로 현저하게 감소된 것을 알 수 있다.(도 6)
따라서, 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 비만개선 및 치료효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
또한, 상기 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 adipogenesis 조절인자 억제효과를 측정하여 아래 도 7에 나타내었다.
{단, adipogenesis 조절인자 억제효과는 전기영동(electrophoresis) 및 Western blot 분석법을 이용하여 측정하였는데,
구체적으로는 분화유도물질(MDI)과 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물로 처리된 세포를 PBS로 2 내지 3회 세척한 후에 RIPA buffer(150mM Sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% Sodium deoxycholate, 50mM Tris-HCI pH 7.5, 2mM EDTA)를 첨가하여 1시간, 4℃에서 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin(BSA, Amersco, USA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. Cell extract 단백질 30 내지 35 ㎍을 loading하여 4 내지 12% mini gel SDS-PAGE로 200mA, 1시간 동안 전기영동하였다. 이를 iBlot® Transfer Stack, Regular(PVDF)를 이용하여 8분 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (0.05% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 1시간 동안 실시하였다. 지방대사 관련 단백질 발현양을 검토하기 위한 항체로는 PPARγ(#2435, Cell Signaling Technology, USA, 1:1,000), C/EBPα(SC-61, Cell Signaling Technology, USA, 1:1,000), ap2(SC-18661, Santa Cruz Biotechnology, USA, 1:1000), p-AMPK α(#2531, Cell Signaling Technology, USA, 1:500), AMPKα(#2532, Cell Signaling Technology, USA, 1:1,000), β-actin(Sigma-aldrich, USA, 1:5000)를 TTBS 용액(3% BSA, 5% skim milk)에서 희석하여 4℃, 16시간 반응하였다. TTBS로 4회 세정하고, 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology, USA), anti-rabbit IgG (Cell Signaling Technology, USA), donkey anti-goat IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 TTBS 용액(5% skim milk)에서 1:2,000 내지 5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, TTBS로 4회 세정하여 ECL 기질 (Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare Life Sciences, USA)과 1 내지 5분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하는 방법을 이용하였다.}
아래 도 7에 나타낸 것처럼, 지방세포로 완전히 분화된 지방세포 분화후기(8-day)에서 C/EBP-α, PPAR-γ, aP2 단백질 발현을 western blot으로 분석 하였다. 분석결과 DSF은 8-day모두에서 C/EBP-α, PPAR-γ, aP2 단백질 발현은 농도 의존적으로 감소하였다.
상기의 결과로부터 DSF의 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 3T3-L1 세포 adipogenesis를 효과적으로 억제하는 것을 total lipid 분석, TG분석, 전사인자및 단백질 발현분석을 통해 확인하였다. 따라서 DSF이 adipogenesis를 조절하는 전사인자(C/EBP-α, PPAR-γ), 관련유전자(SCD1, aP2), PPAR-r 타겟유전자(AQP7, PCK1, OLR1) 그리고 ALDH2 mRNA 발현에 어떠한 영향을 미치는지 3T3-L1 분화(day-6)에 DSF을 각각 처리하여 실시간 RT-PCR을 통해 mRNA 발현을 분석하였다.
MDI의해서 유도된 분화 8day에서는 미유도된 처리구보다 약 15배 정도 높게발혀되어 지방세포로 분화된 결과와 일치하였다. 그리고 DSF 6, 8uM 처리구에서 현저하게 억제되었다. C/EBPα, mRNA발현은 농도의존적으로 억제되었다.
SREBP-1c(sterol regulatory element binding protein-1) 유전자는 지방세포분화에 관여하는 전사인자로서 지방산대사와 lipid생합성에 관여한다. 표적유전자로서는 LPL, GPAT, SCD1, ACC등이 있으며 대부분 지방산 대사조절에 중요한 역할을 담당한다(Rangwala & Lazar, 2000).
따라서 DSF은 SCD1, ACC mRNA 발현을 전사수준에서 억제하면 지방세포분화 억제와 지방산 대사 및 lipid합성 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 사료 된다.
DSF처리구에서 SCD, ACC mRNA 발현은 농도의존적으로 억제 되었다.
SCD1(stearoyl-CoA desaturase) mRNA 발현은 분화미분화세포에서보다 80배 정도 강하게 발현이 이루어지고 있으며, DSF처리구에서는 2uM에서부터 강하게 억제되었다. 그리고 6, 8uM처리구에서는 미분화세포 수준으로 억제됨을 확인 하였다.
지방세포로 분화된 세포에서 ACC mRNA발현은 약 2.5배정도 높게 발현되었다. DSF처리에 억제효과는 저농도와 고농도 모두에서 억제하였다.
또한, 상기 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 지방세포분화 관련 유전자 mRNA 발현 억제 효과를 측정하여 아래 도 8 내지 14에 나타내었다.
{단, 지방세포분화 관련 유전자 mRNA 발현 억제 효과는 cDNA합성과 quantitative real-time PCR 분석을 통해 유전자 발현을 분석하는 방법을 이용하였는데,
구체적으로는, 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물을 Day-2에서 Day6까지 처리하여 분화시킨 지방세포의 total RNA는 NucleoSpin RNA reagent(Macherey-Nagel, Germany)을 사용하여 분리하였다. cDNA합성은 ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit(Toyobo, Japan)을 이용하였으며, Real-time PCR은 cDNA(0.5ul), FastStart Universal SYBR Green Master (BioRed)(4ul), primer(2ul)를 각각 혼합하고, DEPC water을 넣어 최종 volumm 20ul되게 한 후 PCR를 수행 하였다. Quantitative RT-PCR수행은 Fluorescence quantitative PCR detection system(BIOER Technology, Japan)이용하여 실시하였으며, detection system은 FastStart Universal SYBR Green Master(BioRed, USA)를 사용하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분 동안 preheating 후, denaturation 95℃(30초), annealing 61℃(20초), extension 72℃(30초)에서 40cycle을 수행하였다. 본 실험에 사용된 primer sequences는 아래 표 1(Nakao 등, 2016, Yang et al 2019)에 나타낸 바와 같다.}
<표 1>
아래 도 8 내지 14에 나타낸 것처럼, DSF는 지방세포 분화에 중추적인 역할을 하는 전사인자인 C/EBPβ와 PPAR-g 전사수준에서 억제함으로 adipocyte terminal marker 유전자(ACC, FAS, SCD1, aP2) mRNA 발현을 억제시키는 것으로 나타났다.
전지방세포에서 지방세포로 분화하는데 가장 핵심적인 역할을 하는 C/EBPα와 PPAR-γ발현은 다양한 유도인자 또는 복합 조절인자로 작용한다(Ntambi, 2000).
따라서, PPAR-γ 유전자는 지방세포 분화에 강력한 인자이며 C/EBP family와 함께 지방세포 분화를 촉진한다. 위 결과에서 DSF는 PPAR-r 단백질 수준, mRNA수준 모두 감소함을 확인하였다. 따라서 PPAR-r pathway downstream 기능도 억제되는지를 확인하였다. PPAR-r 전사인자의 주요 표적유전자로는 Aquaporin7 (AQP7), Acyl-coenzyme A oxidase 2(Acox2), Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1(PCK1), nuclear receptor subfamily1(NR1H3), Oxidised low density lipoprotein receptor 1(OLR1) 등이 있다. 여기에서 AQP7, PCK1, OLR1 mRNA 발현 억제 여부를 확인 하였다. DSF처리시 AQP7과 PCK1 유전자 발현은 농도의존적으로 억제효과를 보였다. 그러나 OLR1 mRNA발현은 6, 8uM에서 현저하게 억제효과를 보였다. 따라서 DSF는 지방세포 분화에 직접적으로 관여하는 PPAR-r 유전 발현를 억제하여 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물의 ALDH mRNA 발현 억제효과를 측정하여 아래 도 15에 나타내었다.
아래 도 15에 나타낸 것처럼, 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물이 ALDH2와 PPAR-r, C/EBP-a를 억제하여 지방세포 분화 및 지방구 형성를 억제하는 것을 알 수 있다.
따라서, 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물이 지방세포 분화 동안 ALDH2 발현에 어떤영향을 미치는지 qPCR를 통해 조사 하였다. 그 결과 지방세포로 분화된 세포에서는 ALDH가 미분화세포보다 1.5배 증가하였다. 그러나 ALDH2 억제약물인 실시예 1 내지 4를 통해 제조된 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물 6, 8uM 처리시에는 유의적으로 ALDH2 유전자 발현이 억제됨이 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 세포독성이 낮고, 지방세포의 분화억제 효과로 인해 우수한 비만 개선 및 치료효과를 나타낸다.
Claims (10)
- 디설피람 또는 그 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 디설피람 또는 그 유도체는 2 내지 8 마이크로몰의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 디설피람 유도체는 DDTC, Me-DDTC(DETC), Me-DDTC-SO(DETC-SO) 및 Me-DDTC-SO2(DETC-SO2)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 지방세포의 분화관련 유전자의 발현을 억제하며,
상기 지방세포의 분화관련 유전자는 PPAR-r, C/EBP-a, aP2, SCD, ACC 단백질 및 mRNA인 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물은 PPAR-r의 타겟유전자와 ALDH2의 발현을 억제하며,
상기 PPAR-r의 타겟유전자는 AQP7, PCK1 및 OLR1 mRNA인 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선 및 치료용 약학적 조성물.
- 디설피람 또는 그 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물.
- 청구항 6에 있어서,
상기 디설피람 또는 그 유도체는 2 내지 8 마이크로몰의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물.
- 청구항 6 또는 7에 있어서,
상기 디설피람 유도체는 DDTC, Me-DDTC(DETC), Me-DDTC-SO(DETC-SO) 및 Me-DDTC-SO2(DETC-SO2)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물.
- 청구항 6 또는 7에 있어서,
상기 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물은 지방세포의 분화관련 유전자의 발현을 억제하며,
상기 지방세포의 분화관련 유전자는 PPAR-r, C/EBP-a, aP2, SCD, ACC 단백질 및 mRNA인 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물.
- 청구항 6 또는 7에 있어서,
상기 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물은 PPAR-r의 타겟유전자와 ALDH2의 발현을 억제하며,
상기 PPAR-r의 타겟유전자는 AQP7, PCK1 및 OLR1 mRNA인 것을 특징으로 하는 디설피람 및 그 유도체를 이용한 지방세포의 분화억제 효과를 갖는 비만 개선용 건강기능식품 조성물.
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