KR20220009928A - Fl118 약물을 포함하는 면역접합체 - Google Patents

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KR20220009928A
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이진수
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최신혜
이병성
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Abstract

본 발명은 FL118 약물을 포함하는 면역접합체에 관한 것으로, 구체적으로 FL118-링커 접합체, 상기 접합체 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체, 및 상기 면역접합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약물-링커 접합체는 면역접합체를 제조하는데 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 약물-링커 접합체와 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 결합하여 제조한 면역접합체는 암 세포에 대해 뛰어난 세포 독성을 나타냄은 물론 생체 내에서 특별한 부작용을 나타내지 않아 우수한 치료 효과를 가진다.

Description

FL118 약물을 포함하는 면역접합체 {Immunoconjugates containing FL118 drug}
본 발명은 FL118 약물을 포함하는 면역접합체에 관한 것으로, 구체적으로 FL118-링커 접합체, 상기 접합체 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체, 및 상기 면역접합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
항체-약물 접합체 (Antibody-Drug Conjugate, ADC)와 같은 면역접합체 (Immunoconjugate)는 항원 표적 치료제로서, 항체의 특성을 이용하여 약물이 원하는 표적에 특이적으로 작용하도록 하기 위한 목적으로 제조된 것이다. 면역접합체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약물, 그리고 항체와 약물을 연결하는 링커 (linker)의 3 가지 구성요소로 되어 있다.
면역접합체에서 발생 가능한 가장 큰 문제로 세포 독성 약물과 링커가 조기에 끊어지면 원하지 않는 독성이 나타날 수 있다는 점이 있다. 일례로, 미국 시장의 첫 번째 ADC인 Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, Pfizer)는 산성 환경에서 분해되는 링커의 불안정성에 의한 부작용 때문에 (Lo-Coco, F. et al., Blood, 2004, 104: 1995; Parigger, J. et al., Expert Rev Anticancer Ther., 2016, 16:137), 2010년 자발적으로 미국 시장에서 철회한 것으로 알려져 있다. 따라서 면역접합체를 설계함에 있어서, 표적 항원 뿐만 아니라 어떠한 링커와 약물을 선택하는지가 면역접합체의 약리효과 및 부작용에 있어서 대단히 중요하다.
한편, FL118은 토포아이소머라제 I의 억제제로 개발되었으나, 현재까지 보고된 면역접합체 중 FL118을 세포 독성 약물로 사용한 예는 전혀 존재하지 않는다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 우수한 항암 활성을 가지면서도 부작용을 최소화할 수 있는 신규 면역접합체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 놀랍게도 FL118을 특정 링커와 결합하여 면역접합체를 제조할 경우 특별한 부작용 없이 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Lo-Coco, F. et al., Blood, 2004, 104: 1995 Parigger, J. et al., Expert Rev Anticancer Ther., 2016, 16:137
본 발명의 하나의 목적은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 링커 및 세포 독성 약물 모이어티인 FL118이 결합된 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, FL118 및 링커가 결합된 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 하기 화학식 (I)로 표시되는, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
[화학식 I]
Figure pat00001
상기 식에서,
D는 하기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티이고;
[화학식 1]
Figure pat00002
L은 하기 화학식 2의 링커이며;
[화학식 2]
Figure pat00003
(여기서, n은 5 내지 9의 정수임),
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 및
p는 1 내지 10의 정수이다.
혁신 항체의약품은 다양한 질병의 치료 수단으로 사용된 항체 의약품의 단점들을 극복하기 위해 개발된 항체 기반 의약품을 말하며, 항체 유사 단백질 (antibody like protein), 이중 특이적 항체 (bispecific antibody), 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate), 항체 절편 (antibody fragment) 등이 개발되었다. 이 중, 항체-약물 접합체와 같은 면역접합체의 경우, 현재 전체 혁신 항체의약품 시장에서 가장 많은 비중 (2015년 기준 전체 혁신 항체의약품 시장 매출의 57 %)을 차지하는 것으로 알려져 있다.
면역접합체는 기존 항체의약품이 가지고 있었던 단점을 보완하여 더 나은 약효와 부작용 감소 등의 이점으로 주목받고 있으나, 현재까지 극히 일부의 면역접합체만이 개발에 성공하여 상업적으로 시판되고 있는 상황이어서 새로운 표적, 링커, 약물을 기반으로 한 후속 연구 개발 가능성이 무궁무진하다. 본 발명자들은 신규 면역접합체를 개발하고자 링커와 세포 독성 약물을 다양한 조합으로 하여 실험을 수행한 결과, 종래 ADC의 약물로서 전혀 채택된바 없는 FL118을 특정 링커와 결합하여 약물-링커 접합체를 제조하고, 여기에 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 결합하여 제조한 면역접합체가 놀랍게도 우수한 항암 활성을 보이고 이와 함께 부작용을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
본 발명에서, 용어 "면역접합체"는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 세포 독성 약물-링커 접합체가 연결된 복합체를 의미한다. 본 발명에서, 용어 "약물-링커 접합체"는 면역접합체의 제조를 위한 물질로서 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 연결되지 않은 것을 의미하며, 목적하는 바에 따라 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합하여 면역접합체로 사용될 수 있다. 상기 면역접합체는 생체 내 투여될 경우 그 일 구성인 항체 또는 이의 항원 결합단편이 표적하는 항원에 결합한 후 약물을 방출함으로써 표적 세포 및/또는 주변세포들에 약물이 작용할 수 있도록 하여, 표적 약물로서 우수한 약효와 감소된 부작용을 기대할 수 있다.
면역접합체의 효과에 중요한 영향을 미치는 요소는 특히, (1) 약물 효능 (drug potency), (2) 약물 링커 안정성 (drug linker stability), (3) 효율적인 표적 약물 방출 (efficient on-target drug release) 등이 있다. 효과에 여러 요소가 복합적으로 영향을 미치기 때문에 각각의 요소에 대해 알려진 사실만을 바탕으로 이들의 조합인 면역접합체의 효과를 예측하는 것은 대단히 곤란하다.
본 발명에서, 상기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티(D)에 상기 화학식 2의 링커(L)는, 이에 제한되는 것은 아니나 산 민감성 (acid sensitive) 결합으로 연결된 것일 수 있다. 내재화 (internalization)된 후 약물을 방출하도록 설계된 면역접합체는 내재화 과정이 비효율적인 경우 충분한 농도의 활성 약물이 세포 내부로 전달되지 못하는 문제점이 있고, 소수성 약물을 세포 독성 약물로 채택하더라도 주변 세포에 대한 바이스탠더 효과(by-stander cell-killing) 현상을 기대하기 어렵다는 단점을 가진다. 따라서 본 발명의 면역접합체는 약물 모이어티와 링커를 산 민감성 결합으로 연결함으로써 약물 전달 과정에서는 약물이 면역접합체에 결합되어 있다가 암 세포 주변의 산성 분위기에서 약물이 방출될 수 있도록 설계될 수 있다.
이러한 산 민감성 결합은 투여된 면역접합체가 표적 부위까지 전달되는 과정에서 이미 약물이 방출되어 약물의 효과가 충분하지 않을 수 있다는 점과 방출된 약물이 정상 세포에 독성을 나타냄으로써 원치 않는 부작용이 발생할 수 있다는 점이 문제된다. 대표적인 사례로 미국 화이자 사의 Mylotarg의 시험이 부작용으로 중단되었던 것을 들 수 있다. 그러나 놀랍게도 본 발명자들은 산 민감성 결합을 채택한 본 발명의 면역접합체를 생체 내 투여한 경우, 트라스투주맙 또는 세툭시맙 단독 투여 대비 우수한 항암 활성을 나타내는 한편, 체중 감소 등 부작용이 전혀 나타나지 않는다는 것을 확인하였다 (도 17 내지 도 20).
상기 산 민감성 결합은 이에 제한되는 것은 아니나 카보네이트 또는 에스테르 결합일 수 있다. 구체예로서, 본 발명에서 상기 산 민감성 결합은 상기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티(D)의 히드록시기(-OH)와 상기 화학식 2의 링커(L)의 히드록시기(-OH)로부터 형성된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 화학식 I의 L-D는 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 3]
Figure pat00004
본 발명에서, 링커의 길이, 즉 상기 화학식 3에서 n은 5 내지 9의 정수일 수 있고, 구체적으로 n은 6 내지 8의 정수일 수 있으며, 더욱 구체적으로 n은 7일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 위 범위를 벗어나는 경우라도, 링커 길이 변화에 따른 별 다른 효과 차이가 없는 경우에는 당연히 모두 본 발명의 균등 범위 내에 포함된다.
본 발명에서 세포 독성 약물 모이어티는 구체적으로 하기 화학식 1의 FL118을 의미하며, (4S)-4-에틸-4-하이드록시-8,9-메틸렌디옥시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온으로도 명명 (PubChem CID 72403)된다.
[화학식 1]
Figure pat00005
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 화학식 1의 화합물에 C1-3알킬, 히드록시, 할로젠, 아민기 등의 간단한 작용기를 부가하거나 혹은 이미 존재하는 히드록시, 에틸, 옥소 작용기를 다른 작용기로 치환하거나 제거하더라도, 본 발명의 면역접합체와 동등한 효능을 나타내는 한 본 발명의 균등범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 세포 독성 약물 모이어티인 FL118은 토포아이소머라제 I 억제제로서 암 세포에 대한 세포 독성을 나타낼 수 있으나, 이를 이용하여 면역접합체를 제조한 예는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 놀랍게도 시험관 내 실험 결과, 본 발명의 면역접합체는 FL118과 마찬가지로 토포아이소머라제 I 억제제인 데룩스테칸, 및 동일한 항체인 트라스투주맙을 포함하고, 우수한 항암 효과가 이미 확인된 ADC인 DS8201에 비해 현저히 우수한 암 세포에 대한 세포 독성을 나타내는 것으로 확인하였다 (표 4, 표 5, 및 도 11 내지 도 14).
FL118은 소수성 약물로서 약물이 방출된 후 표적 항원을 발현하지 않는 주변 세포에도 세포 독성을 나타낼 수 있는 점 (by-strander 효과)과 링커와 약물간 강한 결합이 아닌 상대적으로 약한 산 민감성 링커를 채택하여 면역접합체가 내재화된 후 약물이 방출되거나 혹은 암 세포 주변에서 스스로 방출되는 두 가지 경로가 모두 존재하는 점에서 DS8201과의 구성 및 기능적 차이를 가지므로 위와 같은 효과가 나타났을 것으로 추론해볼 수 있으나, 이는 실험에 의해 결과를 확인하기 전까지는 예측할 수 없었던 놀라운 결과이다.
본 발명에 있어서, 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체, 전체 (whole) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체 및 이가 (bivalent) 또는 이중특이성 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형 (subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어 "항원 결합 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭한다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv 또는 scFv를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv (variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv (dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv (scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명은 면역접합체를 제조하기 위한, 세포 독성 약물 FL118과 특정 링커를 포함하는 신규 접합체를 개발한 것에 기술적 특징이 있으므로, 원하는 목적에 따라 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 결합하여 면역접합체를 제조할 수 있으며, 이는 모두 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명에서는 구체적인 일 실시예로서, 본 발명의 FL118-링커 접합체에 트라스투주맙 또는 세툭시맙을 결합시켜 면역접합체를 제조하였으며, 이들의 항암 효과를 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함된 티올기가 상기 화학식 2의 링커의 말레이미드기에 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 발명의 링커는 말레이미드 (maleimide)기를 함유하므로 티올-말레이미드 "click" 반응을 통해 항체의 티올기에 결합시켜 면역접합체가 제조될 수 있다 (반응식 1).
[반응식 1]
Figure pat00006
본 발명에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 항체는 암 세포 특이적 항원을 표적으로 하는 것일 수 있다. 이를 통해 생체 내 투여된 면역접합체가 암 세포 주변으로 이동하여 암 세포에 내재화된 후 약물이 방출되거나, 혹은 암 세포 주변의 산성 환경에 의해 스스로 약물이 방출될 수 있다.
상기 암 세포 특이적 항원은 예컨대, 5T4, ABL, ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, ADORA2A, AFP, Aggrecan, AGR2, AICDA, AIF1, AIGI, AKAP1, AKAP2, ALCAM, ALK, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOCl, AR, 아로마타제 (aromatase), ASPH, ATX, AX1, AXL, AZGP1 (zinc-a-glycoprotein), B4GALNT1, B7, B7.1, B7.2, B7-H1, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BAD, BAFF, BAG1, BAI1, BCR, BCL2, BCL6, BCMA, BDNF, BLNK, BLR1 (MDR15), BIyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, BMP10, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1 (플렉틴), BRCA1, C19orflO (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CA6, CA9, CANT1, CAPRIN-1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCL1 (1-309), CCLI1 (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, exodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIPIb), CCL5(RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 또는 CDw198 (CMKBR8/TERI/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), CD13, CD164, CD19, CDH6, CDIC, CD2, CD20, CD21, CD200, CD22, CD23, CD24, CD27, CD28, CD29, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD47, CD52, CD56, CD69, CD70, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD97, CD99, CD117, CD125, CD137, CD147, CD179b, CD223, CD279, CD152, CD274, CDH1 (E-카드헤린), CDH1O, CDH12, CDH13, CDH18, CDH19, CDH2O, CDH3, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDH17, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CDKN1B (p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A (p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEA, CEACAM5, CEACAM6, CEBPB, CERI, CFC1B, CHGA, CHGB, 키티나제 (Chitinase), CHST1O, CIK, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN6, CLDN7 (클라우딘-7), CLDN18, CLEC5A, CLEC6A, CLEC11A, CLEC14A, CLN3, CLU (클러스테린), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, C-MET, COL18A1, COLIA1, COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTAG1B (NY-ESO-1), CTLA4, CTL8, CTNNB1 (b-카테닌), CTSB (카텝신 B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCL1 (GRO1), CXCL1O (IP-IO), CXCLI1 (1-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), CYB5, CYC1, CYSLTR1, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DLK1, DNCL1, DPP4, E2F1, Engel, Edge, Fennel, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, Enola, ENO2, ENO3, EpCAM, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EPHRIN-A1, EPHRIN-A2, EPHRINA3, EPHRIN-A4, EPHRIN-A5, EPHRIN-A6, EPHRIN-B1, EPHRIN-B2, EPHRIN-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (HER-2), ERBB3, ERBB4, EREG, ERK8, 에스 트로겐 수용체, Earl, ESR2, F3 (TF), FADD, FAP, 파르네실트란스퍼라제, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF1 1, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FIGF (VEGFD), FIL1(EPSILON), FBL1 (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRT1 (피브로넥틴), FLT1, FLT-3, FOLR1, FOS, FOSL1(FRA-1), FR-알파, FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GD3, GDF5, GFI1, GFRA1, GGT1, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPC1, GPC3, GPNB, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC1O (C1O), GRP, GSN (Gelsolin), GSTP1, GUCY2C, HAVCR1, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HER3, HGF, HIF1A, HIP1, 히스타민 및 히스 타민 수용체, HLA-A, HLA-DR, HLA-DRA, HLA-E, HM74, HMOXI, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFN감마, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGFIR, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, DL-1, ILIO, ILIORA, ILIORB, IL-1, IL1R1 (CD121a), IL1R2(CD121b), IL-IRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB(CD122), IL2RG(CD132), IL-4, IL-4R(CD123), IL-5, IL5RA(CD125), IL3RB(CD131), IL-6, IL6RA, (CD126), IR6RB(CD130), IL-7, IL7RA(CD127), IL-8, CXCR1 (IL8RA), CXCR2, (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R(CD129), IL-10, IL10RA(CD210), IL10RB(CDW210B), IL-11, IL11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, ILIA, ILIB, ILIF10, ILIF5, IL1F6, ILIF7, IL1F8, DL1F9, ILIHYI, ILIR1, IL1R2, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRL1, IL1RL2, ILIRN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, 1L4, IL6ST (당단백질 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (α6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (β4 인테그린), JAG1, JAK1, JAK3, JTB, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KIT, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (케라틴 19), KRT2A, KRTHB6 (헤어 (hair)-특이적 타입 II 케라틴), L1CAM, LAG3, LAMA5, LAMP1, LEP (렙틴), Lewis Y 항원 ("LeY"), LILRB1, Lingo-p75, Lingo-Troy, LGALS3BP, LRRC15, LPS, LTA (TNF-b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, LY75, LYPD3, MACMARCKS, MAG 또는 OMgp, MAGEA3, MAGEA6, MAP2K7 (c-Jun), MCP-1, MDK, MIB1, midkine, MIF, MISRII, MJP-2, MLSN, MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (메탈로티오넥틴-UI), mTOR, MTSS1, MUC1 (mucin), MUC16, MYC, MYD88, NCK2, NCR3LG1, 뉴로칸 (neurocan), NFKBI, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgRNogo66, (Nogo), NgR-p75, NgR-Troy, NMEI (NM23A), NOTCH, NOTCH1, NOTCH3, NOX5, NPPB, NROB1, NROB2, NRID1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR112, NR113, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NT5E, NTN4, NY-ESO1, ODZI, OPRDI, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, P-카드헤린, PCA3, PCD1, PD-L1, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, L1-CAM, peg-아스파라기나제, PF4 (CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸 (phosphacan), PIAS2, PI3 키나제, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG, PLXDCI, PKC, PKC-베타, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRAME, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PSMA, PTAFR, PTEN, PTHR2, PTGS2 (COX-2), PTN, PVRIG, RAC2 (P21Rac2), RANK, RANK 리간드, RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFI1O (ZNF144), Ron, ROBO2, ROR1, RXR, S100A2, SCGB 1D2 (리포필린 B), SCGB2A1 (맘마글로빈 2), SCGB2A2 (맘마글 로빈 1), SCYE1 (내피 단핵구-활성화 사이토카인), SDF2, SERPENA1, SERPINA3, SERPINB5 (마스핀), SERPINEI (PAI-I), SERPINFI, SHIP-1, SHIP-2, SHB1, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLAMF7, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLC44A4, SLC34A2, SLIT2, SPP1, SPRR1B (Spr1), ST6GAL1, ST8SIA1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TB4R2, TBX21, TCP1O, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, THIL, THBS1 (트롬보스폰딘-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, 조직 인자 (tissue factor), TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFI1A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF1O (TRAIL), TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF12A, TNFRSF17, TNFSF1 1 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFRSF14 (HVEM), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TOLLIP, Toll-유사 수용체, TOP2A (토포이소머라제 Iia), TP53, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TRKA, TREM1, TREM2, TROP2, TRPC6, TSLP, TWEAK, 티로시나제 (Tyrosinase), uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, 베르시칸 (versican), VHL C5, VLA-4, WT1, Wnt-1, XCL1 (림포탁틴), XCL2 (SCM-Ib), XCRI (GPR5/CCXCR1), YY1, ZFPM2, CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CDH6, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (덱틴-2), CLEC5A (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1), CLEC7A (덱틴-1), CLEC11A, PDGFRa, SLAMF7, GP6 (GPVI), LILRA1 (CD85I), LILRA2 (CD85H, ILT1), LILRA4 (CD85G, ILT7), LILRA5 (CD85F, ILT11), LILRA6 (CD85b, ILT8), LILRB1, NCR1 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD337, NKp30), OSCAR, TARM1, CD30, CD300C, CD300E, CD300LB (CD300B), CD300LD (CD300D), KIR2DL4 (CD158D), KIR2DS, KLRC2 (CD159C, NKG2C), KLRK1 (CD314, NKG2D), NCR2 (CD336, NKp44), PILRB, SIGLEC1 (CD169, SN), SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC7, SIGLEC8, SIGLEC9, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC14, SIGLEC15 (CD33L3), SIGLEC16, SIRPA, SIRPB1 (CD172B), TREM1 (CD354), TREM2, KLRF1 (NKp80), 17-1A, SLAM7, MSLN, CTAG1B/NY-ESO-1, MAGEA3/A6, ATP5I (Q06185), OAT (P29758), AIFM1 (Q9Z0X1), AOFA (Q64133), MTDC (P18155), CMC1 (Q8BH59), PREP (Q8K411), YMEL1 (O88967), LPPRC (Q6PB66), LONM (Q8CGK3), ACON (Q99KI0), ODO1 (Q60597), IDHP (P54071), ALDH2 (P47738), ATPB (P56480), AATM (P05202), TMM93 (Q9CQW0), ERGI3 (Q9CQE7), RTN4 (Q99P72), CL041 (Q8BQR4), ERLN2 (Q8BFZ9), TERA (Q01853), DAD1 (P61804), CALX (P35564), CALU (O35887), VAPA (Q9WV55), MOGS (Q80UM7), GANAB (Q8BHN3), ERO1A (Q8R180), UGGG1 (Q6P5E4), P4HA1 (Q60715), HYEP (Q9D379), CALR (P14211), AT2A2 (O55143), PDIA4 (P08003), PDIA1 (P09103), PDIA3 (P27773), PDIA6 (Q922R8), CLH (Q68FD5), PPIB (P24369), TCPG (P80318), MOT4 (P57787), NICA (P57716), BASI (P18572), VAPA (Q9WV55), ENV2 (P11370), VAT1 (Q62465), 4F2 (P10852), ENOA (P17182), ILK (O55222), GPNMB (Q99P91), ENV1 (P10404), ERO1A (Q8R180), CLH (Q68FD5), DSG1A (Q61495), AT1A1 (Q8VDN2), HYOU1 (Q9JKR6), TRAP1 (Q9CQN1), GRP75 (P38647), ENPL (P08113), CH60 (P63038), 또는 CH10 (Q64433)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 면역접합체는 평균 약물/항체 비 (Drug-to-antibody ratio, DAR)가 2 내지 10인 것일 수 있고, 구체적으로 3 내지 9, 더 구체적으로 4 내지 8인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 트라스투주맙을 항체로 사용하여 약 4 또는 8의 DAR 값을 갖도록 제조한 면역접합체를 시험한 결과, 모두 우수한 세포 독성을 나타내는 것으로 확인되었다 (표 4, 표 5, 및 도 11 내지 도 14).
본 발명에서, 약학적으로 허용 가능한 염은 제약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 리튬, 구리, 망간, 아연, 철 등을 비롯한 무기이온의 염과 염산, 인산, 황산과 같은 무기산의 염이 있으며, 그 외에 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산, 프로피온산, 아세트산, 오로테이트산, 아세틸살리실산과 같은 유기산의 염 등과 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염이 있다. 또한 약학적인 반응, 정제 및 분리과정에서 사용될 수 있는 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 테트라프로필 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 벤질 트리메틸 암모늄, 벤제토늄 등의 유기이온의 염이 있다. 다만, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 하기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티와 하기 화학식 2의 링커가 결합된, 약물-링커 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
[화학식 1]
Figure pat00007
[화학식 2]
Figure pat00008
(여기서, n은 5 내지 9의 정수임).
본 발명에 있어서, 약물-링커 접합체는 상기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티에 상기 화학식 2의 링커가 산 민감성 (acid sensitive) 결합으로 연결된 것일 수 있고, 상기 약물-링커 접합체는 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 3]
Figure pat00009
(여기서, n은 5 내지 9의 정수임).
본 발명의 약물-링커 접합체, 약학적으로 허용 가능한 염에 대한 구체적인 사항은 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명의 면역접합체는 암 세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하고 암 세포 내외에서 약물을 방출하여 세포 독성을 나타내므로, 암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 면역접합체가 갖는 항암 활성은 상술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 토포아이소머라제 I의 억제로 치료 가능한 모든　암을 포함하며, 고형암　또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기　암은 원발성　암뿐 아니라 전이성　암도 포함한다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 면역접합체의 치료학적으로 유효한 양을, 이를 필요로 하는 대상 (subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 대상 (subject)은 인간을 포함하는 포유류일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 암의 치료 또는 예방에 유효한 상기 면역접합체의 양을 나타낸다. 구체적으로, "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 시판되는 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 본 발명의 면역접합체는 용량 의존적인 효과를 나타내므로 투여 용량은 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분은 안전성이 우수하므로, 결정된 투여 용량 이상으로도 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제 (medicament)의 제조에 사용하기 위한, 상기 면역접합체의 용도 (use)를 제공한다. 약제의 제조를 위한 상기 면역접합체는 허용되는 보조제, 희석제, 담체 등을 혼합할 수 있으며, 기타 활성제제와 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.
본 발명의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 약물-링커 접합체는 면역접합체를 제조하는데 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 약물-링커 접합체와 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 결합하여 제조한 면역접합체는 암 세포에 대해 뛰어난 세포 독성을 나타냄은 물론 생체 내에서 특별한 부작용을 나타내지 않아 우수한 치료 효과를 가진다.
도 1은 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 8)의 LCMS file이다.
도 2는 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 8)의 SEC file이다.
도 3은 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 8)의 HIC file이다.
도 4는 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 4)의 LCMS file이다.
도 5는 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 4)의 SEC file이다.
도 6은 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 4)의 HIC file이다.
도 7은 세툭시맙-링커-FL118 (DAR 8)의 LCMS file이다.
도 8은 세툭시맙-링커-FL118 (DAR 8)의 LCMS file-Deglycosylation이다.
도 9는 세툭시맙-링커-FL118 (DAR 8)의 SEC file이다.
도 10은 세툭시맙-링커-FL118 (DAR 8)의 HIC file이다.
도 11은 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 8)로 3 일 배양한 시험관 내 세포 독성 그래프이다.
도 12는 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 8)로 6 일 배양한 시험관 내 세포 독성 그래프이다.
도 13은 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 4)로 3 일 배양한 시험관 내 세포 독성 그래프이다.
도 14는 트라스투주맙-링커-FL118 (DAR 4)로 6 일 배양한 시험관 내 세포 독성 그래프이다.
도 15는 세툭시맙-링커-FL118 (DAR 8)로 3 일 배양한 시험관 내 세포 독성 그래프이다.
도 16은 세툭시맙-링커-FL118 (DAR 8)로 6 일 배양한 시험관 내 세포 독성 그래프이다.
도 17은 JIMT-1 종양 모델의 종양 성장 곡선이다. 여기서, 데이터 포인트는 그룹 평균을 나타내고 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 18은 JIMT-1 종양 모델의 체중 변화를 도시한 그래프이다.
도 19는 MDA-MB-468 종양 모델의 종양 성장 곡선이다. 여기서, 데이터 포인트는 그룹 평균을 나타내고 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 20은 MDA-MB-468 종양 모델의 체중 변화를 도시한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: FL118-링커 접합체의 제조
Figure pat00010
단계 1: (9H-플루오렌-9-일)메틸(S)-(1-((4-(히드록시 메틸)페닐)아미노)-6-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)카바메이트의 합성
Figure pat00011
디클로로메탄 (10 mL) 중의 4-아미노벤질 알코올 (0.202 g, 1.639 mmol) 및 Fmoc-Lys(Mmt)-OH (1.00 g, 1.561 mmol)의 현탁액에 EEDQ (0.405 g, 1.623 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 (10 mL)으로 희석하고 물 (2 x 5 mL)로 세척하였다. 유기층을 염수 (brine)로 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 황색 폼 (yellowish foam)을 수득하고, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피 (24 g Si, 헵탄 / 에틸아세테이트 0 - 100 %, 디클로로메탄 로딩)로 정제 하였다. 생성물 분획을 합하고 감압 하에 농축시켜 백색 폼의 표제 화합물 (928 mg, 80 %)을 수득하였다.
LCMS (sc_basic): 522 [M-Fmoc-H]-
단계 2: (S)-2-아미노-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)헥산아미드의 합성
Figure pat00012
(9H-플루오렌-9-일)메틸(S)-(1-((4-(히드록시메틸)페닐)아미노)-6-(((4- 메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)카바메이트 (928 mg, 1.244 mmol)를 디에틸아민 (10 mL, 97 mmol)에 용해시키고 실온에서 교반하였다. 2 시간 후, 용매를 감압 하에 농축시키고 끈적한 잔류물을 헵탄으로 2 회 세척하였다. 그 다음 잔류 물을 디클로로메탄에 용해시키고 헵탄으로 침전시켰다. 용매를 따라내고 절차를 반복하였다. 증발 결과, 백색 폼의 생성물을 수득하였다 (Yd: 677 mg, 순도 < 90 %).
상기 생성물을 5 mL 디클로로메탄에 용해시키고, 20 mL 헵탄으로 침전시킨 다음 용매를 따라내었다. 증발 건조하여 627 mg, 96 %의 백색 폼의 표제 화합물을 얻었다.
LCMS (sc_acid): 522 [M-H]-
단계 3: (S)-2-(32-아지도-5-옥소-3,9,12,15,18,21,24,27,30-노나옥사-6-아자도트리아콘탄아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)헥산아미드의 합성
Figure pat00013
디클로로메탄 (10 ml) 중 O-(2-아지도에틸)-O'-(N-디글리콜릴-2-아미노에틸)-헵타에틸렌글리콜 (662 mg, 1.193 mmol) 및 (S)-2-아미노-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)헥산아미드 (625 mg, 1.193 mmol)의 담황색 용액에 EEDQ (300 mg, 1.203 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 조 생성물 (1.68 g)을 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 에틸아세테이트 / 메탄올 0 - 10 %)로 정제하여 진한 무색 오일의 표제 화합물을 수득하였다.
Yd: 1.02 g
LCMS: purity > 95 %. m/z 1082 M+Na, 1058 M-H
1H NMR (d6-DMSO): 구조와 일치함. 잔류 에틸아세테이트를 포함함.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.06 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.08 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.58 - 7.49 (m, 2H), 7.37 (m, 4H), 7.25 (m, 8H), 7.15 (m, 2H), 6.86 - 6.76 (m, 2H), 5.11 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.43 (m, 3H), 4.00 (s, 2H), 3.96 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.59 (m, 2H), 3.57 - 3.44 (m, 30H), 3.40 (m, 5H), 3.25 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.43 (m, 1H), 1.93 (m, 2H), 1.64 (m, 2H), 1.54 - 1.22 (m, 4H)
진공 하에서 더 건조하여 0.968 g의 무색 오일이 생성되었다.
수율: 76 %. 추가 분석없이 사용됨.
단계 4: 4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-N-(프로프-2-인-1-일)시클로헥산-1-카복사미드의 합성
Figure pat00014
숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산카복실레이트 (1.01 g, 3.02 mmol)를 디클로로메탄 20 mL에 용해시키고, 프로파길아민 (0.213 mL, 3.32 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.528 mL, 3.02 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 100 mL 디클로로메탄으로 희석하고, 100 mL 1N HCl로 세척한 다음 100 mL 염수로 세척하였다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고 진공에서 증발시켰다. 조 생성물 (흰색 고체, 950 mg)을 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 24 g, 디클로로메탄 / 메탄올 0 - 2 %)를 통해 정제하였다. 생성물 분획을 합하고 진공에서 농축시켜 백색 고체를 생성한 다음 차가운 디클로로메탄으로부터 분쇄하였다. 여과하여 백색 고체의 표제 화합물을 얻었다. 수율 : 577 mg, 73 %
LCMS (sc_acid): 275 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.47 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.09 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.41 - 7.20 (m, 12H), 7.14 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 6.94 (s, 1H), 6.81 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.28 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 5.50 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 5.17 - 5.01 (m, 2H), 4.49 - 4.40 (m, 1H), 4.01 (s, 2H), 3.99 - 3.91 (m, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.62 - 3.45 (m, 30H), 3.45 - 3.37 (m, 4H), 3.28 - 3.21 (m, 2H), 2.46 - 2.40 (m, 1H), 2.25 - 2.02 (m, 2H), 2.01 - 1.81 (m, 2H), 1.74 - 1.54 (m, 2H), 1.53 - 1.41 (m, 2H), 1.40 - 1.19 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
단계 5: 4-((S)-35-아지도-2-(4-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)부틸)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도벤질 ((S)-7-에틸-8,11-디옥소-7,8,11,13-테트라하이드로-10H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-7-일) 카보네이트의 합성
Figure pat00015
FL118 (50 mg, 0.127 mmol)과 4-디메틸아미노피리딘 (DAMP)(58.4 mg, 0.478 mmol)을 디클로로메탄 8 mL에 용해시키고 트라이포스겐 (11.4 mg, 0.038 mmol)을 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 빠르게 첨가하였다. 노란색 반응 혼합물을 30 분 동안 교반하였다. 1 시간 후 (S)-2-(32-아지도-5-옥소-3,9,12,15,18,21,24,27,30-노나옥사-6-자도트리아콘탄아미도)-N-(4-(히드록시메틸)페닐)-6-(((4-메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)헥산아미드 (81 mg, 0.076 mmol)를 디클로로메탄 2 mL에 용해시켜 첨가하고 30 분 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 DMSO에 취하고 염기성 조제용 HPLC로 정제하였다. 생성물 분획을 합하고 동결 건조하여 64 mg, 57 %의 노란색 고체의 표제 화합물을 얻었다.
LCMS (sc_base): 1206 [M-MMT+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.47 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.09 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.41 - 7.20 (m, 12H), 7.14 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 6.94 (s, 1H), 6.81 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.28 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 5.50 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 5.17 - 5.01 (m, 2H), 4.49 - 4.40 (m, 1H), 4.01 (s, 2H), 3.99 - 3.91 (m, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.62 - 3.45 (m, 30H), 3.45 - 3.37 (m, 4H), 3.28 - 3.21 (m, 2H), 2.46 - 2.40 (m, 1H), 2.25 - 2.02 (m, 2H), 2.01 - 1.81 (m, 2H), 1.74 - 1.54 (m, 2H), 1.53 - 1.41 (m, 2H), 1.40 - 1.19 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
단계 6: 4-((S)-35-(4-((4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카복스아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(((4- 메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)부틸)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나 옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질 ((S)-7-에틸-8,11-디옥소-7,8,11,13-테트라하이드로-10H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-7-일) 카보네이트의 합성
Figure pat00016
4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)-N-(프로프-2-인-1-일)시클로헥산-1-카복사미드 (25 mg, 91 μmol) 및 4-((S)-35-아지도-2-(4-(((4-메 톡시페닐)디페닐메틸)아미노)부틸)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나 옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질 ((S)-7-에틸-8,11-디옥소-7,8,11,13-테트라하이드로-10H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-7-일) 카보네이트 (65 mg, 44.0 μmol), 구리(I) 브로마이드 (2.5 mg, 17.43 μmol) 및 트리페닐포스핀 (2.3 mg, 8.77 μmol)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 용해시키고, N,N-디이소프로필메틸아민 (0.023 mL, 132 μmol)를 첨가하였다.
반응 혼합물이 빠르게 밝은 황색 현탁액으로 바뀌는 것을 확인하였고, 28 시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 DMSO에 취하고 염기성 조제용 HPLC로 정제하였다. 생성물 분획을 합하고 동결 건조하여 62 mg, 80 %의 백색 고체의 표제 화합물을 얻었다.
LCMS (sc_base): 1480 [M-MMT+H]+
단계 7: 4-((S)-2-(4-아미노부틸)-35-(4-((4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카복스아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질 ((S)-7-에틸-8,11-디옥소-7,8,11,13-테트라하이드로-10H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-7-일) 카보네이트의 합성
Figure pat00017
4-((S)-35-(4-((4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카복스아미도)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(((4- 메톡시페닐)디페닐메틸)아미노)부틸)-4,8-디옥소-6,12,15,18,21,24,27,30,33-노나 옥사-3,9-디아자펜타트리아콘탄아미도)벤질 ((S)-7-에틸-8,11-디옥소-7,8,11,13-테트라하이드로-10H-[1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b] 퀴놀린-7-일) 카보네이트 (65 mg, 0.037 mmol)를 0.7 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 아니솔 (15 μl, 0.137 mmol) 및 디클로로아세트산 (32 μl, 0.387 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 교반하였다. MTBE (5 mL)를 첨가하고 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 고체를 가라 앉히고 용매를 따라 내었다. 잔류물을 MTBE 중 5 % 디클로로메탄으로 2 회 및 MTBE로 1 회 세척하였다. 이어서 고체를 실온에서 감압하에 건조시켰다. 담황색 고체의 표제 화합물 (FL118-링커 화합물)을 얻었고, -20 ℃에서 보관하였다.
Yd: 53 mg, 97 %
LCMS (an_acid): 1480 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.18 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.24 - 8.17 (m, 2H), 8.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.68 (s, 3H), 7.62 - 7.57 (m, 2H), 7.53 (s, 2H), 7.31 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.01 (s, 2H), 6.94 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 6.01 (s, 1H), 5.50 (s, 2H), 5.25 (s, 2H), 5.17 - 5.01 (m, 2H), 4.47 (m, 3H), 4.25 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.08 - 3.95 (m, 4H), 3.77 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.54 - 3.41 (m, 34H), 3.28 - 3.20 (m, 4H), 2.78 (s, 2H), 2.18 - 1.99 (m, 3H), 1.83 - 1.67 (m, 4H), 1.65 - 1.45 (m, 6H), 1.42 - 1.19 (m, 5H), 0.94 - 0.84 (m, 5H).
실시예 2: 항-HER2 항체-링커-FL118 면역접합체 (DAR 8)의 제조
오리지널 버퍼 (20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0) 중 항-HER2 항체 (트라스투주맙)를 5 mM TCEP로 환원시키고, 반응 바이알을 6 시간 동안 60 rpm 회전 속도로 22 ℃에서 인큐베이터 쉐이커에 두었다. 환원 후, 스핀 탈염 컬럼 (40 K, 2 mL)을 통해 TCEP를 제거하였다.
DMSO 및 FL118-링커 화합물 용액 (DMSO 중 10 mg/mL 스톡, 항체에 대한 12 eq.)을 최종 DMSO 농도가 10 %인 환원된 항체 용액에 첨가했다. 반응 혼합물을 적절히 혼합하고 반응 바이알을 4 ℃에서 2 시간 동안 방치하였다.
접합 후, 반응 혼합물을 스핀 탈염 컬럼 (40 K, 5 mL)을 통해 18 mM MES (pH 6.5)로 교환 버퍼에 넣었다. 이어서 생성물을 0.2 μm PVDF 일회용 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 결과물인 면역접합체를 특성화하였으며, 0.07 mM PS80 및 20 mM 트레할로스 탈수물을 첨가한 후 생성된 면역접합체를 동결 건조시켰다.
HIC 및 MS를 이용하여 실시예 2의 면역접합체의 DAR을 결정하였으며, 평균 MS-DAR 값은 7.14, HIC-DAR 값은 8.00으로 확인되었다 (표 1 및 도 1).
scale aggregate
(%) 		recovery
(%) 		D0 (%) MS-DAR HIC-DAR
실시예 2 8 mg 3.44 73 0.00 7.14 8.00
실시예 3: 항-HER2 항체-링커-FL118 접합체 (DAR 4)의 제조
오리지널 버퍼 (20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0) 중 항-HER2 항체 (트라스투주맙)를 5 mM TCEP로 환원시키고 반응 바이알을 3 시간 동안 60 rpm 회전 속도로 22 ℃에서 인큐베이터 쉐이커에 두었다. 환원 후, 스핀 탈염 컬럼 (40 K, 2 mL)을 통해 TCEP를 제거하였다.
DMSO 및 FL118-링커 화합물 용액 (DMSO 중 10 mg/mL 스톡, 항체에 대한 10 eq.)을 최종 DMSO 농도가 10 %인 환원된 항체 용액에 첨가했다. 반응 혼합물을 적절히 혼합하고 반응 바이알을 4 ℃에서 2 시간 동안 방치하였다.
접합 후, 반응 혼합물을 스핀 탈염 컬럼 (40 K, 5 mL)을 통해 18 mM MES (pH 6.5)로 교환 버퍼에 넣었다. 이어서 생성물을 0.2 μm PVDF 일회용 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 결과물인 면역접합체를 특성화하였으며, 0.07 mM PS80 및 20 mM 트레할로스 탈수물을 첨가한 후 생성된 면역접합체를 동결 건조시켰다.
HIC 및 MS를 이용하여 실시예 3의 면역접합체의 DAR을 결정하였으며, 평균 MS-DAR 값은 4.02로 확인되었다 (표 2 및 도 4).
scale aggregate
(%) 		recovery
(%) 		D0 (%) MS-DAR HIC-DAR
실시예 3 8 mg 2.24 68 7.21 4.02 NA
실시예 4: 항-EGFR 항체-링커-FL118 접합체 (DAR 8)의 제조
오리지널 버퍼 (20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.0) 중 항-EGFR 항체 (세툭시맙)를 5 mM TCEP로 환원시키고 반응 바이알을 3 시간 동안 60 rpm 회전 속도로 22 ℃에서 인큐베이터 쉐이커에 두었다. 환원 후, 스핀 탈염 컬럼 (40 K, 2 mL x 2)을 통해 TCEP를 제거했다.
DMSO 및 FL118-링커 화합물 용액 (DMSO의 10 mg/mL 스톡, 항체에 대한 12 eq.)을 최종 DMSO 농도가 10 %인 환원된 항체 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 적절히 혼합하고 반응 바이알을 4 ℃에서 2 시간 동안 방치하였다.
접합 후, 반응 혼합물을 스핀 탈염 컬럼 (40 K, 10 mL)을 통해 18 mM MES (pH 6.5)로 교환 버퍼에 넣었다. 이어서 생성물을 0.2 μm PVDF 일회용 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 결과물인 면역접합체를 특성화하였으며, 0.07 mM PS80 및 20 mM 트레할로스 탈수물을 첨가한 후 생성된 면역접합체를 동결 건조시켰다.
HIC 및 MS를 이용하여 실시예 4의 면역접합체의 DAR을 결정하였으며, 평균 MS-DAR 값은 8.00으로 확인되었다 (표 3 및 도 7).
scale aggregate
(%) 		recovery
(%) 		D0 (%) MS-DAR HIC-DAR
실시예 4 9 mg 0.95 60 0.88 8.00 NA
실시예 5: 시험관 내 ( in vitro ) 세포 독성 및 생체 내 ( in vivo ) 약효를 평가하기 위해 사용되는 동물 모델 및 재료 준비
본 연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 지침에 따라 Shanghai Model Organisms Center, Inc.의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인한 지침에 따라 수행하였다. 체중이 16 - 18 g인 9 ~ 11 주령 암컷 마우스 30 마리를 각각의 케이지 (300 mm x 180 mm x 150 mm)에 3 ~ 5 마리씩 수용하고, 일정한 온도 (18 ~ 26 ℃) 및 습도 (40 ~ 70 %)로 관리하였고, 개별 환기 케이지에서 방사선 살균된 건조 과립 사료 및 멸균 식수에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다.
실시예 2 (분자량 159 kDa, 순도 97 %), 실시예 3 (분자량 154 kDa, 순도 98%) 및 실시예 4 (분자량 160 kDa, 순도 99 %)의 면역접합체는 각각 -80 ℃에서 저장된 동결 건조 분말 상태로 준비된 것을 사용하였다.
-80 ℃에서 저장된 용액 상태로 BCD에서 공급받은 트라스투주맙 (분자량 148 kDa, 순도 97 %)은 완충액 (20 mM Histidine, 150 mM NaCl, pH 6.0)에 용해된 상태 (농도 10.09 mg/mL)로 대조군으로 사용하였으며, 세툭시맙 (분자량 148 kDa, 순도 100 %)은 완충액 (20 mM Histidine, 150 mM NaCl, pH 6.0)에 용해된 상태 (농도 10.47 mg/ml)로 사용하였다.
-80 ℃에서 저장된 용액 상태의 BCD에서 공급받은 DS8201 (분자량 156 kDa, 순도 99 %)은 완충액 (25 mM Histidine, pH 5.5)에 용해된 상태 (농도 2.87 mg/mL)로 대조군으로 사용하였다. DS8201은 트라스투주맙과 데룩스테칸 (deruxtecan)의 면역접합체로서, 실시예 2 및 3의 면역접합체와 항-HER2 표적화 항체는 트라스투주맙으로 동일하고 세포 독성 약물 (payload)인 데룩스테칸은 토포아이소머라제 I 억제제로서 실시예의 FL118과 구조 및 기능적 측면에서 유사한 점이 있다. 그러나 DS8201은 테트라펩타이드-기반 절단 가능 링커 (cleavable tetrapeptide-based linker)를 사용하여 링커의 구조 및 특성에서 실시예 2 및 3의 면역접합체와 차이가 있다. DS8201은 내재화된 다음 절단되어 약물이 방출되는 특성을 가지며, 방출된 약물은 세포막 투과성이 높아 표적 발현에 관계 없이 주변 암 세포들에까지 세포 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Cancer Sci 2016; 107: 1039-1046). 또한, 최근 HER2 양성 전이성 유방암 환자를 대상으로 한 임상 2상 시험에서 우수한 효과가 보고된 바 있으며 (N Engl J Med 2020; 382: 610-621), 미국 FDA로부터 2017년 및 2020년에 각각 HER2 양성 재발전이성 유방암 및 HER2 양성 재발전이성 위암에 대해 획기적치료제로 지정받은 바 있다.
Figure pat00018
대조군 DS8201 (Enhertu)
실시예 6: 시험관 내 ( in vitro ) 세포 독성 평가
실시예 2 내지 4의 면역접합체 및 대조군으로 DS8201에 대해 HER2 과발현 JIMT-1 유방암 세포주 또는 EGFR 과발현 MDA-MB-468 유방암 세포주에 대한 세포 독성 분석을 하기와 같은 공정으로 수행하였다.
JIMT-1 세포 또는 MDA-MB-468 세포에 대한 면역접합체 매개 세포 독성은 세포 생존력 측정으로 결정하였다. 0 일에 10 % FBS (HyClone, SV30087.03)를 포함하는 50 μL DMEM (Gibco, # 11995-065)을 분주한 96-웰 플레이트 (Greinier, # 655090)에 JIMT-1를 웰당 6 x 103 개 세포 (3 일 배양 경우) 또는 웰당 3 x 103 개 세포 (6 일 배양 경우)로 플레이팅했다. MDA-MB-468 세포의 경우에는 0 일에 10 % FBS (HyClone, SV30087.03)를 포함하는 50 μL RPMI (Gibco, #11875-093)를 분주한 96-웰 플레이트 (Greinier, #655090)에 웰당 6 x 103 개 세포 (3 일 배양 경우) 또는 웰당 3 x 103 개 세포 (6 일 배양 경우)로 플레이팅했다. 다음날, 면역접합체 샘플을 연속적으로 3 배 희석 (2000, 666.667, 222.222, 74.074, 24.6914, 8.2305, 2.7435, 0.9145, 0.3048, 0.1016 및 0 nM)한 다음 50 μL/웰로 플레이팅된 세포에 각각 추가했다. 세포를 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 3 일 또는 6 일 동안 배양하였다.
4 일 또는 7 일에 제조업체의 지시에 따라 CellTiter-Glo (Promega, # G7573)를 사용하여 세포 생존력을 검출하였다. 플레이트를 거의 15 분 동안 실온과 평형화시킨 후, 50 μL/웰의 CellTiter-Glo 용액을 첨가하였다. 플레이트를 약 1 분 동안 부드럽게 진탕시킨 다음 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 이후 Envision (PerkinElmer)을 사용하여 발광을 판독하였다.
각 면역접합체로 얻은 세포 독성 효과는 하기 식으로 대조군 웰 (cell only)에서 얻은 발광 값과 비교하여 계산하였다.
세포 독성 % = 100 x (Vcell only-Vsample) / Vcell only
GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 세포 독성에 대한 IC50 값을 얻기 위해 4 개 매개 변수 비선형 회귀 분석을 사용하였다.
결과
실험예 2의 면역접합체를 첨가하여 3 일 또는 6 일 동안 JIMT-1 세포를 배양한 경우 모두 세포 독성 효과를 보이며 세포사를 유발하였다. 놀랍게도, 본 발명의 면역접합체는 DS8201 (양성 대조군)보다 현저히 우수한 세포 독성 효과를 나타냈다. 3 일간 배양한 경우, DS8201은 불과 27.2 %의 세포 독성을 나타낸 반면 본 발명의 면역접합체는 88.6 %의 세포 독성을 나타내 3 배 이상의 우수한 효과를 보였다. 또한, 6 일간 배양한 경우, 본 발명의 면역접합체는 양성 대조군인 DS8201에 비해 IC50 값에서 100 배 이상 우수한 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다 (표 4, 도 11 및 도 12).
Abs 3 days 6 days
IC50 (nM) Max Cytotoxicity (%) IC50 (nM) Max Cytotoxicity (%)
트라스투주맙-링커-FL118 (DAR8) 31.32 88.6 0.35 99.5
DS8201 NA 27.2 433.60 77.2
실시예 3의 면역접합체의 경우에도 JIMT-1 세포에 첨가하여 3 일 또는 6 일간 배양하였을 때, 모두 세포 독성 효과를 보이며 세포사를 유발하였다. 실시예 2와 마찬가지로, 실시예 3의 면역접합체 역시 DS8201 (양성 대조군)보다 현저히 우수한 세포 독성 효과를 나타냈다 (표 5, 도 13 및 14).
Abs 3 days 6 days
IC50 (nM) Max Cytotoxicity (%) IC50 (nM) Max Cytotoxicity (%)
트라스투주맙-링커-FL118 (DAR4) 100.4 90 0.39 99.6
DS8201 447.4 40 335.9 77.9
또한, 실시예 4의 면역접합체의 경우에도 MDA-MB-468 세포에 첨가하여 3 일 또는 6 일간 배양하였을 때, 모두 세포 독성 효과를 보이며 세포사를 유발하였다. 즉, 실시예 2 및 3과 마찬가지로, 실시예 4의 면역접합체 역시 상당히 높은 수준의 세포 독성 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (표 6, 도 15 및 16).
Abs 3 days 6 days
IC50 (nM) Max Cytotoxicity (%) IC50 (nM) Max Cytotoxicity (%)
세툭시맙-링커-FL118 (DAR8) 0.4546 97 NA 100
실시예 7: 생체 내 ( in vivo ) 약효 평가
7-1. 세포 배양
JIMT-1 유방암 세포는 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 10 % FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 함유 DMEM으로 배양하고, 트립신-EDTA 처리에 의해 주 2 회 일상적인 방법으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다. MDA-MB-468 유방암 세포는 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 10 % FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 함유 RPMI로 배양하고, 트립신-EDTA 처리에 의해 주 2 회 일상적인 방법으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
7-2. 종양 접종
마트리겔이 있는 0.2 mL의 DPBS 내 JIMT-1 종양 세포 (1 x 107) 또는 MDA-MB-468 세포 (1 x 107)를 각 마우스 오른쪽 앞 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 215 mm3에 도달했을 때 동물을 무작위로 그룹화 (표 7 및 표 8)한 다음, 약물 효능 연구를 위한 치료를 시작하였다.
JIMT-1 처리 투여량 (mg/kg) 투여 경로 마리 수 (n)
그룹 1(음성 대조군) 식염수 - I.V. 3
그룹 2(양성 대조군) 트라스투주맙 10 I.V. 3
그룹 3 실시예 2의 면역접합체 1 I.V. 3
그룹 4 실시예 2의 면역접합체 5 I.V. 3
그룹 5 실시예 2의 면역접합체 10 I.V. 3
MDA-MB-468 처리 투여량 (mg/kg) 투여 경로 마리 수 (n)
그룹 1(음성 대조군) 식염수 - I.V. 3
그룹 2(양성 대조군) 세툭시맙 10 I.V. 3
그룹 3 실시예 4의 면역접합체 1 I.V. 3
그룹 4 실시예 4의 면역접합체 5 I.V. 3
그룹 5 실시예 4의 면역접합체 10 I.V. 3
7-3. 관찰
일상적인 모니터링시, 이동성 (mobility)과 같은 정상적인 행동, 음식 및 물 소비 (관찰만 해당), 체중 변화 (주 2 회 체중 측정), 눈 / 모발 윤기 (matting), 종양 성장 및 치료의 효과를 동물에서 매일 확인하였다. 사망 및 관찰된 임상 징후는 각 하위 집합 내의 동물 수를 기준으로 기록하였다.
7-4. 종양 측정 및 종료점
종양 성장이 지연될 수 있는지 또는 마우스가 치료될 수 있는지 확인할 수 있는 시점을 주요 종료점으로 삼았다. 종양의 2 차원적 크기는 캘리퍼 (caliper)를 사용하여 매주 두 번 측정하였고, 부피는 공식 (V = 0.5 a x b2, 여기서 a와 b는 각각 종양의 긴 지름과 짧은 지름)을 사용하여 mm3로 표시하였다.
각 그룹에 대해 TGI (Tumor growth inhibition)를 계산하였다.
TGI (%) = [1 - (Ti / T0) / (Vi / V0)] × 100
(Ti는 주어진 날짜에 치료군의 평균 종양 부피, T0은 치료 첫날 치료군의 평균 종양 부피, Vi는 Ti와 같은 날 비히클 대조군의 평균 종양 부피, V0는 치료 첫날에 비히클 그룹의 평균 종양 부피임).
체중 감소가 15 % 이상이거나 종양 부피가 3000 mm3 이상인 동물은 인도적 종료점으로 안락사하였다.
7-5. 통계 분석
결과는 평균 및 표준 오차 (평균 ± SEM)로 표시하였다. 데이터는 Graphpad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 양방향 RM ANOVA Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석되었으며 p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
7-6. JIMT-1 또는 MDA-MB-468 종양 모델의 체중
JIMT-1 또는 MDA-MB-468 종양 모델 마우스의 체중을 정기적으로 모니터링하였다. 표 9, 표 10, 도 18 및 도 20에 나타낸 바와 같이, 모든 처리 군에서 명백한 체중 감소는 관찰되지 않았다.
체중 (g)
(day 0) 		체중 (g)
(day 21) 		체중 변화 (g)
그룹 1 16.97 ± 0.37 18.94 ± 0.50 + 1.97
그룹 2 17.49 ± 0.67 19.05 ± 0.84 + 1.56
그룹 3 16.97 ± 0.12 17.62 ± 0.45 + 0.65
그룹 4 16.89 ± 0.12 16.65 ± 0.41 - 0.24
그룹 5 17.16 ± 0.50 16.73 ± 0.52 - 0.43
체중 (g)
(day 0) 		체중 (g)
(day 21) 		체중 변화 (g)
그룹 1 16.29 ± 0.37 16.93 ± 0.33 + 0.64
그룹 2 16.52 ± 0.35 17.42 ± 0.61 + 0.9
그룹 3 16.81 ± 0.41 17.90 ± 0.06 + 1.09
그룹 4 17.04 ± 0.27 18.23 ± 0.22 + 1.19
그룹 5 16.31 ± 0.29 16.84 ± 0.39 + 0.53
인간과 달리 마우스 혈장은 높은 수준의 에스테라제 활성 (esterase activity)을 가져 에스테르나 카보네이트 작용기와 같은 산 민감성 결합을 쉽게 절단할 수 있기 때문에, 본 발명의 면역접합체를 종양 모델 마우스에 투여할 경우 체중 감소 등 부작용이 발생할 수 있을 것으로 예측하였으나, 놀랍게도 이러한 부작용이 전혀 관찰되지 않았다. 위 결과로부터 본 발명의 면역접합체는 혈중에서 FL118을 분리 방출하더라도 정상 세포에 대해서는 독성을 보이지 않는 것을 알 수 있었다.
7-7. JIMT-1 또는 MDA-MB-468 종양 모델 마우스에서 종양 성장 억제 분석
각 그룹에서 JIMT-1 또는 MDA-MB-468 종양 모델 마우스 (n = 3)의 평균 종양 부피를 표 11 및 표 12에 각각 나타내었다.
Day * 종양 부피 (mm 3 )
그룹 1 그룹 2 그룹 3 그룹 4 그룹 5
0 217.07 ± 2.79 216.90 ± 5.63 216.88 ± 6.84 216.71 ± 10.87 216.32 ± 12.67
4 401.98 ± 2.43 394.05 ± 24.62 355.15 ± 18.97 277.37 ± 34.46 260.58 ± 13.63
7 689.82 ± 50.65 628.63 ± 91.39 469.39 ± 93.29 315.61 ± 77.97 222.38 ± 56.72
11 948.32 ± 134.39 828.63 ± 152.73 423.47 ± 85.89 216.46 ± 56.19 154.95 ± 66.67
14 1066.95 ± 183.23 857.34 ± 174.86 337.93 ± 47.95 135.60 ± 31.90 112.48 ± 55.46
18 1177.47 ± 197.18 775.02 ± 141.84 317.85 ± 45.01 107.02 ± 23.21 70.20 ± 14.39
21 1336.32 ± 361.41 671.06 ± 92.85 370.14 ± 71.86 102.20 ± 18.12 73.87 ± 12.01
* : 처리 시작 후 날짜
Day * 종양 부피 (mm 3 )
그룹 1 그룹 2 그룹 3 그룹 4 그룹 5
0 214.67 ± 37.46 215.45 ± 17.45 212.05 ± 28.35 212.77 ± 16.17 212.28 ± 42.78
4 247.97 ± 30.89 237.94 ± 11.05 226.22 ± 17.07 175.37 ± 16.02 155.83 ± 26.88
7 282.55 ± 42.21 293.12 ± 23.39 225.91 ± 17.31 94.29 ± 6.31 61.23 ± 6.83
11 319.38 ± 39.33 318.07 ± 23.97 231.65 ± 15.17 48.37 ± 1.79 38.29 ± 8.03
14 349.00 ± 46.54 327.41 ± 30.50 252.72 ± 13.96 41.37 ± 5.48 23.16 ± 13.32
18 367.57 ± 51.24 340.95 ± 34.19 281.69 ± 20.40 24.77 ± 12.4 16.21 ± 8.12
21 390.24 ± 45.45 363.07 ± 44.38 361.79 ± 28.44 24.59 ± 12.8 7.56 ± 7.56
* : 처리 시작 후 날짜
다음으로, 치료 후 21 일째에 종양 크기 (n = 3)를 기준으로 JIMT-1 또는 MDA-MB-468 종양 모델 마우스 (n = 3)의 TGI 값을 계산하였다. 결과는 표 13 및 표 14에 각각 나타냈다.
종양 크기 (mm 3 )
(day 0) 		종양 크기 (mm 3 )
(day 21) 		TGI (%)
(day 21) 		유의성 a
그룹 1 217.07 ± 2.79 1336.32 ± 361.41 NA NA
그룹 2 216.90 ± 5.63 671.06 ± 92.85 59.41 NS
그룹 3 216.88 ± 6.84 370.14 ± 71.86 86.31 **
그룹 4 216.71 ± 10.87 102.20 ± 18.12 110.23 ***
그룹 5 216.32 ± 12.67 73.87 ± 12.01 112.73 ***
a. 유의성은 그룹 1의 종양 크기와 비교하여 two-way ANOVA로 계산하였다.* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001
종양 크기 (mm 3 )
(day 0) 		종양 크기 (mm 3 )
(day 21) 		TGI (%)
(day 21) 		유의성 a
그룹 1 214.67 ± 37.46 390.24 ±45.45 NA NA
그룹 2 215.45 ± 17.45 363.07 ± 44.38 15.92 NS
그룹 3 212.05 ± 28.35 361.79 ± 28.44 14.71 NS
그룹 4 212.77 ± 16.17 24.59 ± 12.8 207.18 ***
그룹 5 212.28 ± 42.78 7.56 ± 7.56 216.60 ****
a. 유의성은 그룹 1의 종양 크기와 비교하여 two-way ANOVA로 계산하였다.* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001
JIMT-1 또는 MDA-MB-468 종양 모델 마우스 (n = 3)의 종양 성장 곡선의 결과는 도 17 및 도 19에 각각 도시하였다. 시험 결과, 식염수 대조군인 그룹 1의 평균 종양 크기는 처리 후 21 일에 각각 1336.32 ± 361.41 mm3 및 390.24 ± 45.45 mm3였다. 트라스투주맙 또는 세툭시맙 치료는 모두 식염수 대조군과 비교하여 통계적 유의성없이 단지 부분적인 항종양 효과를 보였으며 (p > 0.05), 평균 종양 부피는 각각 671.06 ± 92.85 mm3 (TGI = 59.41 %) 및 363.07 ± 44.38 mm3 (TGI = 15.92 %)이었다. 그러나 실시예 2의 면역접합체는 투여량 1 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg (그룹 3, 4 및 5)에서 각각 370.14 ± 71.86, 102.20 ± 18.12 및 73.87 ± 12.01 mm3의 평균 종양 부피, 실시예 4의 면역접합체는 투여량 5 mg/kg 및 10 mg/kg (그룹 4 및 5)에서 각각 24.59 ± 12.8 및 7.56 ± 7.56 mm3의 평균 종양 부피로 현저히 우수한 항종양 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (실시예 2의 면역접합체의 TGI = 86.31, 110.23, 112.73 %, p < 0.01, 0.001, 0.001; 실시예 4의 면역접합체의 TGI = 207.18, 216.60 %, p < 0.001, 0.0001). 이는 본 발명의 면역접합체가 그 자체로도 이미 뛰어난 항종양 효과를 보이는 것으로 알려져 있는 트라스투주맙 및 세툭시맙에 비해 더욱 우수한 효과를 가진다는 것을 입증하는 것이다. 또한, 본 발명의 면역접합체들은 모두 용량 의존 반응을 나타내는 것으로 확인되었으므로, 각 환자 별로 최대 효능 및 최소 독성을 나타낼 수 있도록 환자 맞춤형 용법/용량으로 투여될 수 있다.
정리하면, 본 발명의 FL118-링커 접합체는 목적하는 항원에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합하여 면역접합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 일 실시예로 제조된 실시예 2 및 3의 면역접합체는 공지의 면역접합체인 DS8201과 동일한 항체 (트라스투주맙)를 포함하고 구조와 기능이 유사한 약물 (payload)을 포함함에도 시험관 내에서 DS8201 대비 암 세포에 대한 압도적으로 뛰어난 세포 독성을 나타내는 것으로 확인되었다. 본 발명의 일 실시예로 제조된 세툭시맙을 포함하는 실시예 4의 면역접합체 역시 시험관 내에서 강력한 세포 독성을 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, 실시예 2의 면역접합체와 트라스투주맙 및 실시예 4의 면역접합체와 세툭시맙의 항암 활성을 종양 모델 마우스에서 시험한 결과, 트라스투주맙과 세툭시맙도 일부 항암 효과를 나타내긴 하였으나 본 발명의 면역접합체는 투여된 모든 용량에서 현저히 우수한 항암 활성을 보이고 체중 감소 등의 부작용도 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명의 면역접합체는 암의 예방 또는 치료 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 본 발명의 FL118-링커 접합체는 상기 면역접합체의 제조를 위한 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 (I)로 표시되는 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure pat00019

    상기 식에서,
    D는 하기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티이고;
    [화학식 1]
    Figure pat00020

    L은 하기 화학식 2의 링커이며;
    [화학식 2]
    Figure pat00021

    (여기서, n은 5 내지 9의 정수임),
    Ab는 암 세포 특이적 항원을 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    p는 1 내지 10의 정수이고;
    상기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티(D)에 상기 화학식 2의 링커(L)가 산 민감성(acid sensitive) 결합으로 연결되고, 상기 산 민감성 결합은 카보네이트 또는 에스테르 결합이며;
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(Ab)은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(Ab)에 포함된 티올기(-SH)가 상기 화학식 2의 링커(L)의 말레이미드기에 결합한다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 산 민감성 결합은 상기 화학식 1의 세포 독성 약물 모이어티(D)의 히드록시기(-OH)와 상기 화학식 2의 링커(L)의 히드록시기(-OH)로부터 형성된 것인, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 I의 L-D는 하기 화학식 3으로 표시되는, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 3]
    Figure pat00022

    (여기서, n은 5 내지 9의 정수임).
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 암 세포 특이적 항원은 5T4, ABL, ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, ADORA2A, AFP, Aggrecan, AGR2, AICDA, AIF1, AIGI, AKAP1, AKAP2, ALCAM, ALK, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOCl, AR, 아로마타제 (aromatase), ASPH, ATX, AX1, AXL, AZGP1 (zinc-a-glycoprotein), B4GALNT1, B7, B7.1, B7.2, B7-H1, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BAD, BAFF, BAG1, BAI1, BCR, BCL2, BCL6, BCMA, BDNF, BLNK, BLR1 (MDR15), BIyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, BMP10, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1 (플렉틴), BRCA1, C19orflO (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CA6, CA9, CANT1, CAPRIN-1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCL1 (1-309), CCLI1 (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, exodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIPIb), CCL5(RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 또는 CDw198 (CMKBR8/TERI/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), CD13, CD164, CD19, CDH6, CDIC, CD2, CD20, CD21, CD200, CD22, CD23, CD24, CD27, CD28, CD29, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD47, CD52, CD56, CD69, CD70, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD97, CD99, CD117, CD125, CD137, CD147, CD179b, CD223, CD279, CD152, CD274, CDH1 (E-카드헤린), CDH1O, CDH12, CDH13, CDH18, CDH19, CDH2O, CDH3, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDH17, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CDKN1B (p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A (p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEA, CEACAM5, CEACAM6, CEBPB, CERI, CFC1B, CHGA, CHGB, 키티나제 (Chitinase), CHST1O, CIK, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN6, CLDN7 (클라우딘-7), CLDN18, CLEC5A, CLEC6A, CLEC11A, CLEC14A, CLN3, CLU (클러스테린), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, C-MET, COL18A1, COLIA1, COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTAG1B (NY-ESO-1), CTLA4, CTL8, CTNNB1 (b-카테닌), CTSB (카텝신 B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCL1 (GRO1), CXCL1O (IP-IO), CXCLI1 (1-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), CYB5, CYC1, CYSLTR1, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DLK1, DNCL1, DPP4, E2F1, Engel, Edge, Fennel, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, Enola, ENO2, ENO3, EpCAM, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EPHRIN-A1, EPHRIN-A2, EPHRINA3, EPHRIN-A4, EPHRIN-A5, EPHRIN-A6, EPHRIN-B1, EPHRIN-B2, EPHRIN-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (HER-2), ERBB3, ERBB4, EREG, ERK8, 에스 트로겐 수용체, Earl, ESR2, F3 (TF), FADD, FAP, 파르네실트란스퍼라제, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF1 1, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FIGF (VEGFD), FIL1(EPSILON), FBL1 (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRT1 (피브로넥틴), FLT1, FLT-3, FOLR1, FOS, FOSL1(FRA-1), FR-알파, FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GD3, GDF5, GFI1, GFRA1, GGT1, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPC1, GPC3, GPNB, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC1O (C1O), GRP, GSN (Gelsolin), GSTP1, GUCY2C, HAVCR1, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HER3, HGF, HIF1A, HIP1, 히스타민 및 히스 타민 수용체, HLA-A, HLA-DR, HLA-DRA, HLA-E, HM74, HMOXI, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFN감마, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGFIR, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, DL-1, ILIO, ILIORA, ILIORB, IL-1, IL1R1 (CD121a), IL1R2(CD121b), IL-IRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB(CD122), IL2RG(CD132), IL-4, IL-4R(CD123), IL-5, IL5RA(CD125), IL3RB(CD131), IL-6, IL6RA, (CD126), IR6RB(CD130), IL-7, IL7RA(CD127), IL-8, CXCR1 (IL8RA), CXCR2, (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R(CD129), IL-10, IL10RA(CD210), IL10RB(CDW210B), IL-11, IL11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, ILIA, ILIB, ILIF10, ILIF5, IL1F6, ILIF7, IL1F8, DL1F9, ILIHYI, ILIR1, IL1R2, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRL1, IL1RL2, ILIRN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, 1L4, IL6ST (당단백질 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (α6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (β4 인테그린), JAG1, JAK1, JAK3, JTB, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KIT, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (케라틴 19), KRT2A, KRTHB6 (헤어 (hair)-특이적 타입 II 케라틴), L1CAM, LAG3, LAMA5, LAMP1, LEP (렙틴), Lewis Y 항원 ("LeY"), LILRB1, Lingo-p75, Lingo-Troy, LGALS3BP, LRRC15, LPS, LTA (TNF-b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, LY75, LYPD3, MACMARCKS, MAG 또는 OMgp, MAGEA3, MAGEA6, MAP2K7 (c-Jun), MCP-1, MDK, MIB1, midkine, MIF, MISRII, MJP-2, MLSN, MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (메탈로티오넥틴-UI), mTOR, MTSS1, MUC1 (mucin), MUC16, MYC, MYD88, NCK2, NCR3LG1, 뉴로칸 (neurocan), NFKBI, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgRNogo66, (Nogo), NgR-p75, NgR-Troy, NMEI (NM23A), NOTCH, NOTCH1, NOTCH3, NOX5, NPPB, NROB1, NROB2, NRID1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR112, NR113, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NT5E, NTN4, NY-ESO1, ODZI, OPRDI, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, P-카드헤린, PCA3, PCD1, PD-L1, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, L1-CAM, peg-아스파라기나제, PF4 (CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸 (phosphacan), PIAS2, PI3 키나제, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG, PLXDCI, PKC, PKC-베타, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRAME, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PSMA, PTAFR, PTEN, PTHR2, PTGS2 (COX-2), PTN, PVRIG, RAC2 (P21Rac2), RANK, RANK 리간드, RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFI1O (ZNF144), Ron, ROBO2, ROR1, RXR, S100A2, SCGB 1D2 (리포필린 B), SCGB2A1 (맘마글로빈 2), SCGB2A2 (맘마글로빈 1), SCYE1 (내피 단핵구-활성화 사이토카인), SDF2, SERPENA1, SERPINA3, SERPINB5 (마스핀), SERPINEI (PAI-I), SERPINFI, SHIP-1, SHIP-2, SHB1, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLAMF7, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLC44A4, SLC34A2, SLIT2, SPP1, SPRR1B (Spr1), ST6GAL1, ST8SIA1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TB4R2, TBX21, TCP1O, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, THIL, THBS1 (트롬보스폰딘-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, 조직 인자 (tissue factor), TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFI1A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF1O (TRAIL), TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF12A, TNFRSF17, TNFSF1 1 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFRSF14 (HVEM), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TOLLIP, Toll-유사 수용체, TOP2A (토포이소머라제 Iia), TP53, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TRKA, TREM1, TREM2, TROP2, TRPC6, TSLP, TWEAK, 티로시나제 (Tyrosinase), uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, 베르시칸 (versican), VHL C5, VLA-4, WT1, Wnt-1, XCL1 (림포탁틴), XCL2 (SCM-Ib), XCRI (GPR5/CCXCR1), YY1, ZFPM2, CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CDH6, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (덱틴-2), CLEC5A (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1), CLEC7A (덱틴-1), CLEC11A, PDGFRa, SLAMF7, GP6 (GPVI), LILRA1 (CD85I), LILRA2 (CD85H, ILT1), LILRA4 (CD85G, ILT7), LILRA5 (CD85F, ILT11), LILRA6 (CD85b, ILT8), LILRB1, NCR1 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD337, NKp30), OSCAR, TARM1, CD30, CD300C, CD300E, CD300LB (CD300B), CD300LD (CD300D), KIR2DL4 (CD158D), KIR2DS, KLRC2 (CD159C, NKG2C), KLRK1 (CD314, NKG2D), NCR2 (CD336, NKp44), PILRB, SIGLEC1 (CD169, SN), SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC7, SIGLEC8, SIGLEC9, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC14, SIGLEC15 (CD33L3), SIGLEC16, SIRPA, SIRPB1 (CD172B), TREM1 (CD354), TREM2, KLRF1 (NKp80), 17-1A, SLAM7, MSLN, CTAG1B/NY-ESO-1, MAGEA3/A6, ATP5I (Q06185), OAT (P29758), AIFM1 (Q9Z0X1), AOFA (Q64133), MTDC (P18155), CMC1 (Q8BH59), PREP (Q8K411), YMEL1 (O88967), LPPRC (Q6PB66), LONM (Q8CGK3), ACON (Q99KI0), ODO1 (Q60597), IDHP (P54071), ALDH2 (P47738), ATPB (P56480), AATM (P05202), TMM93 (Q9CQW0), ERGI3 (Q9CQE7), RTN4 (Q99P72), CL041 (Q8BQR4), ERLN2 (Q8BFZ9), TERA (Q01853), DAD1 (P61804), CALX (P35564), CALU (O35887), VAPA (Q9WV55), MOGS (Q80UM7), GANAB (Q8BHN3), ERO1A (Q8R180), UGGG1 (Q6P5E4), P4HA1 (Q60715), HYEP (Q9D379), CALR (P14211), AT2A2 (O55143), PDIA4 (P08003), PDIA1 (P09103), PDIA3 (P27773), PDIA6 (Q922R8), CLH (Q68FD5), PPIB (P24369), TCPG (P80318), MOT4 (P57787), NICA (P57716), BASI (P18572), VAPA (Q9WV55), ENV2 (P11370), VAT1 (Q62465), 4F2 (P10852), ENOA (P17182), ILK (O55222), GPNMB (Q99P91), ENV1 (P10404), ERO1A (Q8R180), CLH (Q68FD5), DSG1A (Q61495), AT1A1 (Q8VDN2), HYOU1 (Q9JKR6), TRAP1 (Q9CQN1), GRP75 (P38647), ENPL (P08113), CH60 (P63038), 및 CH10 (Q64433)로 구성된 군으로부터 선택된, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역접합체는 평균 약물/항체 비 (Drug-to-antibody ratio, DAR)가 2 내지 10인, 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나의 항에 따른 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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