KR102630719B1 - Ddx5 단백질에 결합하는 캄토테신 유도체 및 이의 프로드럭 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 이의 항체-약물 접합체(ADC); 또는 (c) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 화학식 2의 FL118 화합물에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 따라 설계된 활성형 캄토테신 유도체는 세포 내에서 DDX5 단백질에 결합하여 DDX5 단백질 분해를 통해 세포사멸(cell death)을 유도할 수 있다.

Description

DDX5 단백질에 결합하는 캄토테신 유도체 및 이의 프로드럭 {Camptothecin Derivatives that bind to DDX5 protein and Prodrugs thereof}
본 발명은 (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 하기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 이의 운반체-약물-접합체(CDC), 특히 이의 항체-약물 접합체(ADC); 또는 (c) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 화학식 2의 FL118 화합물에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 따라 설계된 활성형 캄토테신 유도체는 세포 내에서 DDX5 단백질에 결합하여 DDX5 단백질 분해를 통해 세포사멸(cell death)을 유도할 수 있다.
암 조절 유전자(Cancer Genes)는 원래는 세포의 정상적인 기능을 조절하기 위하여 존재하지만, 변이가 일어나거나 비 정상적으로 조절되면 암이 발생할 수 있는 유전자를 의미한다. 정상적인 세포 기능의 하나로 세포사멸 기능이 있으며, 이와 관련하여 사멸 촉진인자와 사멸 억제인자가 있다.
예컨대, 암 조절 유전자(Cancer Genes)에는 (i) 돌연변이가 발생했을 때 세포 분열을 활발하게 촉진하는 종양유전자(Oncogenes) 및 (ii) 돌연변이가 일어나면 세포 분열을 억제하지 못하는 종양 억제 유전자(Tumor suppressor genes)가 있다. 종양유전자(Oncogenes)의 일례로, Src, EGFR, HER2, RAS, APC, BCL-2 등이 있고, 종양 억제 유전자(Tumor suppressor genes)의 일례로 p53, BRCA, Rb, PTEN, BAX 등이 있다.
암은 성장과 분열의 세포주기가 조절되지 않는 질병 그룹이다. 도 30에 도시된 바와 같이, 프로그램된 세포 사멸(예, 아폽토시스) 메커니즘이 손상되면 암이 발생할 수 있다.
암은 단백질 생성물이 세포 주기 조절에 관여하는 유전자의 돌연변이 발생으로 인해 발생한다. 많은 암은 특정 유전자의 과발현 또는 돌연변이 단백질 산물의 비정상적인 활동과 관련이 있다(Oncogenes).
단일 돌연변이는 일반적으로 암을 유발하지 않는다. 일반적으로 세포 성장을 조절하는 여러 유전자들이 암 상태가 발생하기 전에 돌연변이된다.
유방 상피세포에 HER2가 비정상적으로 많이 발현하는 HER2 양성 유방암은 유방암 환자 전체의 ¼ 정도이고, 여성호르몬 관련 유방암에 비해 화학 항암제 치료 시 재발율이 높고 예후가 나쁘다. HER2 표적치료제인 허셉틴(Herceptin, 성분명: Trastuzumab)은 세포 표면의 HER2의 수를 줄이고, 면역세포가 HER2 양성 유방암 세포를 죽이도록 도와 줌으로써, 유방암을 치료한다.
HER2 양성 유방암은 ErbB 수용체의 멤버인 HER2 (ErbB2) 암유전자의 증폭(amplification) 또는 과발현(overexpression)을 보유한 유방암이다. 트라스투주맙(허셉틴)은 HER2 양성유방암의 치료효과를 증대시켰으나, HER2 양성 유방암은 다른 유방암에 비해 공격적인 양상을 나타내며 환자의 과반수 이상이 기존 표적치료에 저항성을 갖거나 치료 중 내성이 생긴다.
세포막에 부착된 ErbB 수용체의 리간드들로는 NRG1, HB-EGF가 있으며, 활성화된 ErbB 리간드들은 이들의 수용체(EGFR, HER3)에 결합하여, 수용체들 간의 결합(EGFR-HER2, HER2-HER3)에 의한 인산화(phosphorylation, P)를 촉매하여, 세포 내 성장증식 신호를 유도한다. 이러한 과도한 ErbB 수용체의 활성화에 의해 항HER2 치료제에 내성을 나타내게 된다.
한편, 조절되지 않은 전사 인자는 화학 요법이나 방사선 요법에 대한 암 세포의 민감도를 감소시킬 수 있다. 암 치료에서 약물 내성은 내인성 또는 후천성 약물 내성일 수 있다. 암 치료에서 본질적인 약물 내성은 세포 증식과 세포 사멸의 결정적인 조절자인 비정상적으로 발현된 전사 인자에 의해 야기될 수 있다. 종양 조직에서 NF-κB, STAT3, HIF-1, AR 또는 ER의 비정상적인 과발현과 p53 및 FOXO3a의 불활성화는 항암제에 의한 사멸로부터 암 세포를 보호하여, 본질적인 약물 내성을 나타낸다.
그러나, 화학요법이나 방사선요법도 조절되지 않은 전사 인자의 활성화를 통해 후천적 약물 내성을 유도한다. 전리 방사선이 STAT3, NF-κB 및 HIF-1을 포함한 여러 가지 다른 전사 인자의 활성화 및 유도를 자극할 수 있다는 것이 밝혀졌다. NF-κB와 STAT3의 상향조절은 암세포에서 항세포사멸 유전자(anti-apoptotic genes)의 전사를 유도하고 암세포의 세포주기 진입과 증식을 촉진하여 방사선 저항성을 발생시킨다. 또한, 방사선에 의한 전사 인자 NF-κB 및 HIF-1의 상향 조절은 암 치료에 내성이 있는 EMT 세포 및 암 줄기 세포의 유지를 담당하는 유전자를 유도할 수 있다. 또한, 전사 인자 STAT3의 활성화는 암 치료에 대한 약물 내성도 촉진했다. 화학 요법이나 방사선 요법에 의한 STAT3의 피드백 활성화는 암 치료 저항성의 분자 메커니즘인 것으로 밝혀졌다. 따라서 함께 표적화하는, 조절되지 않는 전사 인자와 그 주요 표적은 암 치료에서 약물 내성을 극복하기 위한 유망한 접근법이 될 수 있다.
STAT(signal transducer 및 activator of transcription의 약자) 전사 인자 패밀리에는 STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 및 STAT6이 포함된다. STAT 단백질은 성장 인자, 사이토카인, 인터페론 또는 발암 유전자로 자극 시 JAK 키나아제에 의해 활성화되어 인터페론 신호 전달을 조절할 수 있다. STAT의 DNA 결합 도메인은 특정 DNA 표적 서열에 대한 결합을 매개하는 면역글로빈 유사 구조이다. 활성화 동안 JAK 키나아제에 의한 STAT3의 인산화는 이합체화를 활성화한다. 그런 다음 이합체는 핵 구획으로 이동하고 표적 프로모터의 서열에 결합하여 표적 유전자의 발현을 유도한다. STAT3 표적 유전자에는 서바이빈(Survivin), bcl-xl, mcl-1, 사이클린 D1, MMP2, MMP9, VEGF, Myc, Sox2 등이 포함된다. STAT 단백질은 세포 성장, 세포 사멸, 분화 및 면역을 포함한 많은 생물학적 과정을 조절한다. STAT 계열 내에서 STAT3 및 STAT5는 암 진행에 관여했다.
조절되지 않은 STAT3 및 활성화된 STAT5는 발암유전자로 간주되어 혈관신생을 증가시키고 암세포의 생존을 향상시킨다. cBioPortal 데이터베이스의 많은 샘플을 사용한 연구에서 STAT3는 정상 조직에 비해 폐암, 난소암, 위암, 조혈암 및 뇌암에서 더 자주 과발현되는 것으로 나타났으며, STAT3의 과발현은 낮은 전체 생존율과 관련이 있었다. JAK 키나아제에 의한 STAT3의 인산화는 STAT3 활성화의 첫 번째 단계이다. 교모세포종 환자 90명을 대상으로 한 또 다른 연구에서는 높은 p-STAT3 수치가 무진행 생존율 및 전체 생존율 저하와 유의한 관련이 있음을 발견했다. 다변량 생존 분석은 높은 p-STAT3 수준이 불량한 무진행 생존 및 전체 생존에 대한 중요한 예후 지표 역할을 할 수 있음을 보여주었다.
제1형 토포이소머라아제(Topoisomerase I)의 저해제(Irinotecan, Topotecan 등)는 임상에서 효능/안전성이 검증된 항암기전이며, 임상에서 대장암, 폐암, 유방암, 난소암 등 다양한 난치성 고형암에서 뛰어난 항암 효능이 검증되었다.
이와 관련하여, 제1형 토포이소머라제(topoisomerase-1)를 저해하여 항종양 작용을 발현하는 저분자 화합물인 캄토테신 유도체가 알려져 있다.
캄토테신(CPT)은 물에 대한 낮은 용해도를 가지며, 임상 시험을 준비하기 위해서 국립 암 연구소(NCI)는 수용성인 나트륨 염(NSC100880)을 제조하였다. I 기 및 II 기의 임상 시험은 상기 화합물에 의해 나타난 높은 독성(출혈 방광염, 위장 독성, 예를들어 오심, 구토, 설사, 및 골수 억제, 특히 백혈구 감소증 및 저혈소판증)으로 인해 완료되지 못했다.
후속적으로, 다수의 CPT 동족체들이 보다 낮은 독성과 보다 높은 수 용해도를 갖는 화합물을 수득하기 위해 합성되었다. 2 개의 약물, 이리노테칸(CPT-11)과 토포테칸이 있다.
일본의 Dallchi 및 Yakult에 의해 공동개발된 이리노테칸(irinotecan, CPT-11)이 1994년 세계 최초의 캄토테신계 항암제로서, 폐암(소세포, 비소세포성 폐암)에 유효성을 입증받아 유럽과 일본에서 발매되었으며, 1995년에는 대장암, 유방암에 대한 유효성을 추가로 입증받은 바 있다. 또한, Glaxo Smith Kline사에서 개발된 토포테칸(topotecan)이 1995년 4월에 미국 FDA에서 전이성 난소암에 대한 유효성을 승인받아 발매되었다. 최근 국내에서 개발된 새로운 캄토테신 유도체인 CKD-602(belotecan)는 강력한 제1형 토포이소머라제 억제제 효과와 더불어 수용성으로서 기존의 난용성으로 인한 독성을 성공적으로 극복하였다.
지금까지 확인된 모든 캄토테신 유도체들은 세포독성에 필수적인 5 개의 고리를 갖는 모 구조를 함유한다(도 1). 분자구조상 E-고리와 A-, B-고리 부위가 중요부위로 확인되었다. 캄토테신은 세포독성에 필수적인 E-고리에 펜타사이클릭 락톤구조를 포함한다. 이중 E-고리의 20번 탄소에 위치한 락톤기와 알파수산화기는 제1형 토포이소머라제-DNA 부산물의 안정을 위해 중요하며, A- 및 B-고리의 변형이 수용성과 활성도를 증가시킬 수 있다는 사실이 증명되었다. 첫 번째 고리상의 변경은, 예를 들어 상기 언급한 약물의 경우에 물에 대한 용해도를 증가시키고 보다 큰 허용성을 허용하는 것으로 입증되었다.
CKD-602 역시 수용성 및 항암효과의 증가를 위해 7번 탄소의 B-고리 부위의 치환을 시도하였다. Lee 등은 CKD-602가 광범위한 암세포주에서 캄토테신(camptothecin)과 토포테칸(topotecan)에 비해 우수한 항암효과가 있다고 하였다. 또한 L1210 백혈병 누드마우스 모델에서 최대내약용량(maximum tolerated dose, MTD)이 25mg/kg로 비교적 안전한 약물임을 확인하였다. 일반적으로 알려진 캄토테신계 약물의 부작용은 크게 혈액학적 부작용과 비혈액학적 부작용으로 분류할 수 있다. 혈액학적 부작용으로는 발열을 동반한 호중구감소증, 패혈증, 출혈 등이 있으며, 비혈액학적 부작용으로는 구역, 구토, 탈모 등 피부계 부작용 및 위장관, 신장, 신경계에 대한 독성을 들 수 있다. Kim 등은 CKD-602의 동물 연구에서 이러한 캄토테신계 약물의 부작용 중 임상적용이 가능한 용량보다 10배 이상의 고용량의 투여시에도 위액분비 증가를 제외한 이상약물반응은 발견되지 않았다. 또한 최근 국내 임상 연구들에서도 심각한 전신적인 독성 보다는 호중구감소증 및 백혈구감소증의 가역적이며 조절가능한 수준의 부작용만이 보고되는 등 비교적 안정성이 입증되고 있다. 하지만 현재까지는 표준 화학요법에 실패하거나 표준 화학요법을 시행할 수 없는 환자, 즉 표준치료 후에 재발 또는 악화되어 더 이상의 항암화학요법, 수술로 효과를 보기 어려울 것으로 판단되는 저항성(refractory) 또는 재발성(recurrent) 난소암 및 대장암의 치료, 1차화학요법에 실패한 저항성 또는 재발성 제한병기(limited disease) 소세포성 폐암의 치료, 진행병기(extensive disease) 소세포성 폐암의 치료에 주된 적응증을 두고 제한적으로 사용되고 있다.
SN-38은 여러 세포주에서 나노몰 범위의 IC50 값을 갖는 강력한 토포이소머라제-I 억제제이다. 결장직장암 치료에 사용되는 전구약물인 이리노테칸의 활성 형태이며 폐암, 유방암 및 뇌암에서도 활성을 나타낸다. Trop-2-SN-38 ADC의 경우 현재 TNBC, 방광암, 위암 등 다수의 암종에서 성공적으로 개발되고 있으나, 여전히 Drug efflux transporter 과발현, epigenetic silencing of Top1, anti-apoptotic protein 증가 등으로 인한 내성 문제는 남아 있다.
한편, 다이이치산쿄(Daiichi Sankyo)는 엔허투(Enhertu®)의 개발에 SN-38보다 암세포에서 10배 정도 활성이 높은 세포독성약물인 DXD (exatecan)를 사용하였다. DXD는 용해성이 좋고 비교적 안전하며 주변세포살상효과가 높아서 비균질종양의 치료에 이점이 있다. 그러나, 오프타겟 효과를 줄일 수 있는 반감기는 짧다. DXD는 항-HER2 항체의 시스테인 잔기에 maleimide 링커로 생접합되었는데 균질 DAR 값이 8에 달한다. 높은 DAR 값에도 불구하고 DXD가 혈장에서 21일 동안 단 2.1%만 방출되었을 정도로 안정성이 높다(Ogitani et al., 2016). 엔허투는 2019년 US FDA에서 허가를 받았는데 대상 환자는 과거 2번 이상 HER2 표적치료를 받은 전력이 있는 절제 불가능한 전이성 Her2 양성 유방암 성인 환자이다.
SN-38 및 Dxd(임상 단계 토포이소머라제 I 억제제 Exatecan의 유도체)와 같은 캄토테신계 유도체는 최근 항체-약물 접합체(ADC)의 새로운 페이로드로 성공적으로 개발되었다. 그 결과, 캄토테신계 페이로드를 사용하는 ADC 2개(SN-38 페이로드 포함 Trodelvy(Sacituzumab Govitecan) 및 Dxd 페이로드 포함 Enhertu(Trastuzumab Deruxtecan))가 최근 FDA 승인을 받았다. 이러한 캄토테신계 페이로드는 MMAE, MMAF와 같은 기존의 초독성(ultra-toxic) 페이로드의 ADC (DAR = 2개 또는 4개)에 비해 중간 정도의 세포 독성을 가지고 있으나, 우수한 안전성 프로필로 인해, 8과 같은 더 높은 약물 대 항체 비율(DAR)을 사용할 수 있다. 또한 이러한 캄토테신계 페이로드를 통해 CL-2A 또는 GGFG 링커 시스템과 같은 더 빠른 약물 방출 프로필을 가진 링커 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 구성 요소의 조합으로 치료 범위가 더 넓은 새로운 ADC가 개발되었다.
Trodelvy, Enhertu 등 캄토테신 유도체를 Payload로 사용하는 항체-약물 접합체 (ADC)들은 암세포에만 선택적으로 강력한 항암 효능을 보이는 캄토테신 화합물을 전달하여 심한 전신 부작용 없이도 우수한 항암 효능을 가져오는데 성공하고 있으나, 아직 여러 부족한 부분을 보이고 있으며, 가장 대표적으로는 ABCG2 Drug Efflux Pump의 과발현에 의한 저항성 발생을 들 수 있다. 많은 캄토테신 유도체들은 ABCG2에 의하여 세포 밖으로 빠르게 배출되며, 이로 인하여 ABCG2를 발현하지 않거나 정상 수준으로 낮게 발현하고 있는 암 세포에 비하여, ABCG2를 과발현하는 암세포에서는 치료 효능이 심각하게 낮아지는 문제를 보인다. 이러한 ABCG2의 과발현은 Irinotecan, Topotecan 등 small molecule 캄토테신 화합물뿐아니라, 캄토테신 화합물을 payload로 사용하는 Trodelvy, Enhertu 등의 ADC에서도 치료 효능을 떨어뜨리는 주된 원인이 되고는 한다.
본 발명은 표적 세포를 사멸시키는 약물 후보로, DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 캄토테신 유도체를 제공하고자 한다.
본 발명자들은 탁월한 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5(p68)를 분해하는 dual MoA를 갖는 Camptothecin계 약물인 FL118 화합물(도 2)을 합성하여, 이의 물리화학적 특성에 대한 다양한 연구를 계속 수행하고 있었다. 그러나, FL118 화합물은 물리화학적 특성의 제한으로 인해 제형 개발의 한계가 있었다.
이에 본 발명자들은 SN38 약물과 차별화되는 FL118의 구조를 바탕으로 FL118의 장점인 제1형 토포이소머라제 저해 및 DDX5 분해 측면에서 이중 작용기전(dual MoA)를 발휘하는 새로운 구조의 Camptothecin 유도체를 설계 및 합성하고자 한다.
따라서, 본 발명은 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 이중 작용기전(dual MoA)을 가지는 활성형 캄토테신 유도체 및/또는 상기 활성형 캄토테신 유도체를 생체내에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭인 운반체-약물 접합체(CDC), 특히 항체-약물 접합체(ADC)를 새롭게 설계 및 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 활성형 캄토테신 유도체가 방관자 효과(bystander effect)와 함께, 세포 내에서 DDX5 단백질에 결합하여 DDX5 단백질 분해를 통해 세포사멸(cell death)을 유도하게 함으로써, 내인성 또는 후천성 약물 내성 이전에 암세포 및/또는 주변세포를 사멸시키는 새로운 모달리티로서 항암기전을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1양태는 (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 하기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC); 또는 (c) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 화학식 2의 FL118 화합물에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체를 제공한다.
[화학식 1]
X1 및 X3는 각각 독립적으로 탄소, 산소, 질소, 또는 황이고, X1 및 X3는 동일 또는 상이할 수 있으며,
X2는 탄소, 산소, 질소, 황, 단일결합 또는 이중결합이고,
X1, (X2)n 및 X3는 6각 또는 7각 고리를 형성할 수 있으며(n=1~2의 값),
Y1, Y2 및 Y3는 각각 독립적으로 수소이거나, 또는 산소, 질소, 인 또는 황을 포함하는 작용기일 수 있음.
DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체에서, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드는 DDX5 단백질에 결합하는 리간드일 수 있다.
활성형 캄토테신 유도체는 화학식 1에서 X1, (X2)n, X3, Y1, Y2 및/또는 Y3 변형을 통해 이의 소수성 또는 세포막 투과도를 원하는 대로 조절하여, 암조직에서 주변세포 살상 효과(bystander effect)가 발휘 또는 그 효과의 정도가 제어가 발휘되도록 설계할 수 있다.
바람직하게는, DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 활성형 캄토테신 유도체(a)는 분자접착제(molecular glue degrader)로 E3 리가아제에 결합하는 리간드(binder) 역할을 수행할 수 있고/있거나; 분자접착제(molecular glue degrader) 기전(MoA)을 통해 DDX5 단백질을 발현하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있고/있거나; 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 작용기전(MoA)를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 제2양태는 제1양태의 활성형 캄토테신 유도체(a), 이의 프로드럭(b), 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC) 또는 DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체(c)를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 암 진단 조성물을 제공한다.
예컨대, HER2 양성 암, 유방암, 폐암, 대장암을 치료하기 위해 투여하는 것일 수 있다.
바람직하게는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암 진단 후 1차 치료제로 사용하거나 또는 암 조직에서 DDX5을 (과)발현하는 개체에 투여할 수 있다.
본 발명의 제3양태는 (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 활성형 캄토테신 유도체, (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC), 또는 (c) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 화학식 2의 FL118 화합물에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체의 제조방법으로서, 활성형 캄토테신 유도체(a)가 상기 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 골격을 모핵으로 포함하도록 설계하거나, 이렇게 설계된 화합물을 선택하거나, 이렇게 설계된 화합물을 합성하는 단계를 포함하는 것이 특징인 제조방법을 제공한다.
예컨대, 활성형 캄토테신 유도체(a)가 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 골격을 모핵으로 포함하도록 설계하거나, 이렇게 설계된 화합물을 선택하는 단계는
(1) 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 골격을 모핵으로 포함한 화합물 라이브러리에서 제1형 토포이소머라제를 저해하는 작용기전(MoA) 및/또는 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 작용기전(MoA)을 갖도록 설계된 활성형 캄토테신 유도체를 선택하고/하거나,
(2) 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 골격을 모핵으로 포함한 화합물이 제1형 토포이소머라제 저해 및/또는 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해시키는지 인비트로(in vitro) 실험 및/또는 인비보(in vivo) 실험을 통해 확인하는 단계일 수 있다.
본 발명의 제4양태는 (a) 세포 내에서 종양단백질(oncoprotein)로 작동하는 DDX5에 결합하여 DDX5 단백질 분해를 통해 세포사멸(cell death)을 유도하는 활성형 캄토테신 유도체, (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC), 또는 (c) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체의 제조방법으로서, 하기 화학식 3의 화합물, 화학식 4의 화합물, 화학식 5의 화합물, 화학식 6의 화합물, 화학식 7의 화합물, 화학식 8의 화합물, 화학식 9의 화합물 및 이의 이성질체들로 구성된 군에서 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 선택하는 제1단계; 및 임의적으로(optionally), 제1단계에서 선택된 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭(b)을 선택하는 제2단계를 포함하는 것이 특징인 제조방법을 제공한다.
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
제3양태 또는 제4양태의 제조방법은, 조직생검 또는 액체생검에서 화학식 2의 FL118 화합물 또는 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 비절단성 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체(c)를 사용하여 세포내 DDX5 단백질을 정량 또는 정성분석함으로써, 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b)의 투여 대상인 환자군을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제5양태는 하기 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적 허용염을 제공한다.
본 발명의 제6양태는 하기 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물, 이의 약제학적 허용염, 이의 용매화물, 또는 이의 프로드럭(prodrug), 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)을 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 3]
[화학식 3-1]
[화학식 4]
[화학식 4-1]
[화학식 5]
[화학식 5-1]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
본 발명의 제7양태는 (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 하기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)을 함유하는 것이 특징인 세포 사멸용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제8양태는 (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 하기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)을 암세포의 세포사멸을 통해 항원제시세포(APC)를 자극하여 항종양 면역 반응을 유도할 수 있는 용법(dosage)으로 투여하는 것이 특징인 항암 제형을 제공한다.
본 발명의 제9양태는 만성 항원 노출(chronic antigen exposure)로 인해 T 세포 고갈(T cell exhaustion)이 발생하지 않도록 또는 원하는 정도의 소수성 제공 및/또는 응집을 제어함으로써 림프 배출(drainage)을 통해 빠르게 또는 천천히 제거되도록 활성형 캄토테신 유도체(a)의 주변세포 살상 효과 (bystander effect) 및/또는 ADME 프로필이 제어된 활성형 캄토테신 유도체(a) 기반 항암제의 제조방법으로서, 활성형 캄토테신 유도체(a) 기반 항암제는 (a) 분자접착제(molecular glue degrader)로 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC);을 함유하는 항암 제형이고, 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b)가 하기 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 골격을 모핵으로 포함하도록 설계하거나, 이렇게 설계된 화합물을 선택하거나, 이렇게 설계된 화합물을 합성하는 단계를 포함하는 것이 특징인 항암제 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 명세서에서, 약물이란 질병의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방을 위해 사용하거나(식품 또는 기기 제외) 신체 구조 또는 기능에 영향을 미치기 위해 사용하는 모든 물질이다. 예컨대, 신체 및 신체 대사에 영향을 미치는 모든 화학적 또는 생물학적 물질이다. 바람직하게는, DDX5 단백질에 결합하는 한, 약물의 범주에 속한다.
예컨대, 본 발명의 약물은 활성형 캄토테신 유도체 자체 또는 이의 프로드럭, targeted drug delivery (예, Carrier-drug Conjugate)와 같은 프로드럭의 페이로드(payload)로서 활성형 캄토테신 유도체, 진단제로서 캄토테신 유도체 또는 이의 프로드럭일 수 있다.
약물이 생체 내에서 효과적으로 작용하기 위해서는 약물의 체내 표적부위에서의 농도가 일정 기간 이상 치료효과범위(therapeutic range) 내에 유지되어야 한다(실시예 8, 표 6, 도 23). 약물이 체내에 과량 존재하면 독성을 나타내게 되고 표적부위에서 너무 적은 양의 경우에는 치료 효과가 나타나지 않는다.
약물 효능이란 대상 적응증에 효과를 나타내는 기대 시간 동안 분해되지 않고 체내에 남아 있는 것을 의미한다(실시예 8, 표 6, 도 23). 대사 속도가 낮으면 혈중 농도 유지 시간이 길어지기 때문에 효능 지속 시간이 길어진다.
한편, 항암제의 생체 내 효능(in vivo efficacy) 및 생체 내 부작용(in vivo side effects)은 항암제의 흡수, 분포, 대사 및 배설(ADME) 특성과 밀접한 관련이 있다. 약물의 ADME는 약물이 신체(body)를 통해 이동하고 조직 및 기관과 상호 작용하는 방식을 설명하는 약동학을 결정한다.
약물의 흡수(Absorption)는 효능과 부작용에 영향을 미칠 수 있다. 잘 흡수되지 않는 약물은 표적 조직(target tissue)에서 치료 농도에 도달하지 못하여 효능이 감소될 수 있다. 반면에 흡수가 잘 되는 약물은 전신노출을 증가시켜 비표적 부작용을 일으킬 수 있다.
약물의 분포(Distribution)도 효능과 부작용에 영향을 미칠 수 있다. 표적 조직에 잘 분포되지 않는 약물은 효과가 없을 수 있고, 비표적 조직(non-target tissues)에 광범위하게 분포하는 약물은 해당 조직에서 독성을 유발할 수 있다. 또한 혈장 단백질과 결합력이 높은 약물은 표적 조직으로의 분포가 감소하여 효능이 감소할 수 있다.
신체 내 약물 분포는 크기, 전하 및 친유성을 포함한 물리화학적 특성에 의해 영향을 받을 수 있다. 종양 조직에 침투하는 약물의 능력은 혈류 및 세포 밀도를 포함한 종양의 미세 환경과 같은 요인에 의해 영향을 받을 수도 있다. 일부 항암제는 특정 조직에 축적되어 독성 효과를 유발할 수 있다.
약물의 대사(Metabolism)도 효능과 부작용 모두에 영향을 미칠 수 있다. 빠르게 대사되는 약물은 짧은 반감기로 인해 약효가 감소할 수 있으며, 느린 대사 약물은 축적으로 인해 독성이 증가할 수 있다. 또한 일부 대사산물은 모약물보다 독성이 강해 부작용을 일으킬 수 있다.
배설 속도와 경로(The rate and route of excretion)도 약물의 효능과 부작용 모두에 영향을 미칠 수 있다. 빠르게 제거되는 약물은 반감기가 짧아 약효가 떨어질 수 있고, 천천히 제거되는 약물은 축적되어 독성을 유발할 수 있다. 또한 일부 약물은 변화되지 않은 상태로 또는 활성 대사체로 배설되어 장기간 노출되거나 노출이 증가하고 부작용 위험이 증가할 수 있다.
따라서, 항암제의 ADME 특성을 분석하여 생체 내에서 효능을 최적화하고 부작용을 최소화하는 것이 필수적이다. 즉, ADME 프로필을 평가하고 최적화하면 이러한 약물의 치료 지수를 개선하여 암 환자에게 더 나은 결과를 가져올 수 있다.
항암 제형(anti-cancer formulation) 또는 항암 조성물은 암을 치료하거나 체내에서 암 세포의 성장 및 확산을 방지하기 위해 설계된 약물(medication) 또는 요법(therapy)을 의미한다. 항암 제형은 암 세포의 성장 및 분열 능력을 방해함으로써 암 세포를 표적으로 하는 약물, 화학적 화합물 및/또는 생물학적 제제의 조합을 포함할 수 있다.
항암제(anti-cancer drug)의 제형은 약물 발견(drug discovery), 전임상 개발(pre-clinical development), 임상 시험(clinical trials) 및 규제 승인(regulatory approval)을 포함한 여러 단계를 포함하는 복잡한 프로세스가 반영될 수 있다. 목표는 최소한의 부작용으로 환자에게 투여할 수 있는 안전하고 효과적인 치료법을 개발하는 것이다.
항암 제형의 개발에는 건강한 세포는 살리면서 표적 암세포를 식별하고 이러한 세포를 선택적으로 표적으로 삼을 수 있는 약물 또는 약물 조합을 설계하는 것이 포함된다. 이는 암세포에서 과발현되는 특정 단백질이나 효소를 표적으로 삼거나 암세포 성장과 생존에 필수적인 세포 주기, DNA 복제 또는 기타 세포 과정을 방해함으로써 달성될 수 있다.
유망한 약물 후보가 확인되면 실험실 및 동물 모델에서 약물을 테스트하여 안전성과 유효성을 평가하는 전임상 개발을 거친다. 약물이 전임상 연구에서 가능성을 보이면 안전성, 용량 및 효과를 결정하기 위해 인간에게 테스트되는 임상 시험으로 진행될 수 있다.
임상 시험 중에 약물 제형은 환자에게 안전하게 투여되고 원하는 치료 효과를 달성할 수 있도록 최적화된다. 여기에는 효능을 개선하고 부작용을 최소화하기 위해 약물의 용량, 투여 경로 또는 제형을 조정하는 것이 포함될 수 있다.
본 발명은 표적 세포를 사멸시키는 약물 후보로, (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 하기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)을 제공한다.
[화학식 1]
X1 및 X3는 각각 독립적으로 탄소, 산소, 질소, 또는 황이고, X1 및 X3는 동일 또는 상이할 수 있으며,
X2는 탄소, 산소, 질소, 황, 단일결합 또는 이중결합이고,
X1, (X2)n 및 X3는 6각 또는 7각 고리를 형성할 수 있으며(n=1~2의 값),
Y1, Y2 및 Y3는 각각 독립적으로 수소이거나, 또는 산소, 질소, 인 또는 황을 포함하는 작용기일 수 있음.
여기서, 산소, 질소, 인 또는 황을 포함하는 작용기(functional group)의 비제한적인 예들은 -CHO, -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H2, -OPO4H, -PO2(OR1)(OR2)(R1, R2=CsHtNuOwSxPyXz, X = -F, -Cl, -Br 또는 -I, 0≤s≤20, 0≤t≤2(s+u)+1, 0≤u≤2s, 0≤w≤2s, 0≤x≤2s, 0≤y≤2s, 0≤z≤2s), -SO3H, -OSO3H, -NO2, -N3, -NR3OH(R=CnH2n+1, 0≤n≤16), 　-NR3 +X-(R= CnHm, 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl 또는 Br), NR4 +X-(R= CnHm, 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl 또는 Br), 　-COSH, -COOCO-, -CORCO- (R = ClHm, 0≤l≤3, 0≤m≤2l+1), -COOR, -CN, -N3, -N2, -NROH(R = CsHtNuOwSxPyXz, X = -F, -Cl, -Br 또는 -I, 0≤s≤20, 0≤t≤2(s+u)+1, 0≤u≤2s, 0≤w≤2s, 0≤x≤2s, 0≤y≤2s, 0≤z≤2s), -NR1NR2R3(R1, R2, R3　= CsHtNuOwSxPyXz, X = -F, -Cl, -Br 또는 -I, 0≤s≤20, 0≤t≤2(s+u)+1, 0≤u≤2s, 0≤w≤2s, 0≤x≤2s, 0≤y≤2s, 0≤z≤2s), -CONHNR1R2(R1, R2　= CsHtNuOwSxPyXz, X = -F, -Cl, -Br 또는 -I, 0≤s≤20, 0≤t≤2(s+u)+1, 0≤u≤2s, 0≤w≤2s, 0≤x≤2s, 0≤y≤2s, 0≤z≤2s), -NR1R2R3X’(R1, R2, R3　= CsHtNuOwSxPyXz, X = -F, -Cl, -Br 또는 -I, X’= F-,Cl-,Br-,또는 I-, 0≤s≤20, 0≤t≤2(s+u)+1, 0≤u≤2s, 0≤w≤2s, 0≤x≤2s, 0≤y≤2s, 0≤z≤2s),　-OH, -O-, >C=O, -SS-, -SO-, -NO2, -COX(X = F, Cl, Br 또는 I), -COOCO-, -CONH-, -CN, -SCOCH3, -SCN, -NCS, -NCO, -OCN, -CN, -F, -Cl, -I, -Br, 에폭시기, -하이드라존, -ONO2, -PO(OH)2, -C=NNH2, -HC=CH-, -C=C-, -C≡C- 및 탄소 수 2개 이상의 탄화수소로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따라 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 활성형 캄토테신 유도체(a)는 분자접착제(molecular glue degrader) 기전(MoA)을 통해 DDX5 단백질을 발현하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있다.
표적 세포는 암세포 또는 노화세포일 수 있다. 노화세포에는 장기 고유의 특징적인 기능을 수행하지 않는 세포도 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 활성형 캄토테신 유도체(a)는 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 다중 작용기전(MoA)를 갖는 것일 수 있다.
예컨대, 본 발명은 종양조직에서 암세포의 세포사멸을 통해 종양 항원(tumor antigen)을 노출시켜, 수지상세포와 대식세포과 같은 항원제시세포(APC) 자극을 통해 항종양 면역 반응을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은, 암세포를 사멸시키는 약물 후보로, (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭을 다양하게 제공함으로써, 만성 항원 노출(chronic antigen exposure)로 인해 T 세포 고갈(T cell exhaustion)이 발생하지 않도록 또는 원하는 정도의 소수성 제공 및/또는 응집을 제어함으로써 림프 배출(drainage)을 통해 빠르게 또는 천천히 제거되도록 활성형 캄토테신 유도체(a)의 주변세포 살상 효과 (bystander effect) 및/또는 ADME 프로필을 제어하기 위해, 활성형 캄토테신 유도체(a) 기반 항암제형, 이의 용량(dose) 및 용법(dosage)을 다양하게 설계할 수 있다.
제1형 토포이소머라제 억제제 효과를 발휘하는 캄토테신 유도체를 응용하여, 일반식 1과 같이 캄토테신계 약물 설계시 보다 큰 허용성을 허용하는 것으로 입증된 A고리상의 R1 및 R2 변경(Group A)과 관련하여, 본 발명의 활성형 캄토테신 유도체는 화학식 2의 FL118 화합물과 동일하게 설계함으로써(실시예 1), 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 항암기전을 발휘시키는 것이 특징이다(실시예 2).
[일반식 1]
[화학식 2]
이는 일반식 1에서 R1 및 R2 가 FL118 화합물과 동일하게 설계된 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체, 예컨대 하기 화학식 3, 화학식 4, 또는 화학식 5의 화합물 역시 전사보조인자이면서 종양단백질(oncoprotein)인 DDX5를 분해하고, 이로인해 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)(Survivin, cIAP2, XIAP 등)의 발현을 농도 의존적으로 강하게 억제할 뿐만 아니라(도 11 내지 도 14), Cell viability 실험으로 통해 상기 화합물들이 세포 안으로 도입된 해당 세포들을 사멸시킨다(도 15 및 도 16)는 것을 발견한 것에 기초한 것이다.
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
일반식 1 또는 화학식 2에서 Group C 부위는 제1형 토포이소머라제에 결합하고 Group A 부위는 DNA에 결합하여 토포이소머라제-DNA 복합체의 공유결합을 안정화시켜 절단된 DNA 조각들이 다시 연결되는 것을 방해하고/하거나(실시예 1), 일반식 1 또는 화학식 2에서 Group A 부위는 DDX5에 결합하고 Group C 부위는 E3 리가아제에 결합하여 DDX5 분해를 유도하는 것일 수 있다(도 11 내지 도 14).
제1형 토포이소머라아제(Topoisomerase I)의 저해제는 임상에서 효능/안전성이 검증된 항암기전으로, 캄토테신계 약물로 Exatecan, Exatecan 유도체인 Dxd, SN-38 등이 ADC 용 Payload로 개발되어 있다.
엑사테칸(Exatecan) 약물은 SN-38 약물보다 5~10배 강력한 세포독성(cytotoxicity)이 확인된 물질이다. 엑사테칸은 이리노테칸과는 상이하고, 효소에 의한 활성화가 불필요하다. 또, 이리노테칸의 약효 본체인 SN-38이나, 동 임상에서 사용되고 있는 토포테칸보다 제1형 토포이소머라아제 저해 활성이 강하고, in vitro에서 여러 가지의 암 세포에 대해, 보다 강한 세포독성 활성을 가지고 있다. 특히 P-glycoprotein의 발현에 의해 SN-38 등에 내성을 나타내는 암 세포에 대해서도 효과를 나타냈다. 또, 마우스의 인간 종양 피하 이식 모델에서도 강한 항종양 효과를 나타내어, 임상 시험이 실시되었다.
화학식 2의 FL118 약물은 세포막을 투과할 수 있는 소수성 저분자이다. FL118 약물은 강력한 제1형 토포이소머라제 저해제로서 기존 상용화된 Top 1 저해제인 SN-38, Topotecan, Exatecan 등과 동일한 Camptothecin 모핵 구조를 가지나(도 1 및 도 2), 단독 투여 시에도 다양한 암세포 및 동물 모델에서 SN-38 대비 차별화된 항암 효능과 우수한 안전성을 갖추어 넓은 치료 윈도우(therapeutic window)를 확보한 항암제이다.
본 발명자들은 Camptothecin계 화합물인 FL118 약물을 합성하여 이의 물리화학적 특성에 대한 다양한 연구를 계속 수행하고 있었으나, FL118은 물리화학적 특성의 제한으로 인해 제형 개발의 한계가 있었다.
본 발명자들은 FL118 약물의 경우 항체-약물 접합체(ADC)의 페이로드(payload)로 사용시 SN-38를 페이로드로 사용한 ADC보다 강한 세포 독성(cytotoxicity)를 가지며, Exatecan 약물과 동등 수준의 세포 독성(cytotoxicity)를 갖는 것을 확인하였다.
한편, FL118 약물의 경우 탁월한 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께, 종양단백질(oncoprotein) DDX5(p68)를 분해하는 dual MoA를 갖는 Camptothecin계 화합물이다.
놀랍게도, 엑사테칸(Exatecan) 약물은 FL118 약물과 같이, 또 다른 항암제 내성의 주원인인 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)(Survivin, cIAP2, XIAP 등)의 발현을 낮은 농도에서 강하게 억제할 뿐만 아니라, 이로인해 약물 내성 기전을 차단할 수 있다는 것을 발견하였다(도 10).
따라서, 이에 기초하여, 본 발명은 도 1에 도시된 바와 같이, FL118 화합물로부터 (a) 탁월한 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5(p68)를 분해하는 dual MoA를 갖는 신규한 활성형 캄토테신 유도체, (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC) 및 (c) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체를 설계하는 것이 특징이다.
구체적으로, 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 이중 작용기전(dual MoA)을 가지는 활성형 캄토테신 유도체(a)의 합성 설계 개념(synthetic design concept)은, 도 1에 도시된 바와 같이 SAR(Structure Activity Relationship)을 기준으로 제1형 토포이소머라제 저해 영역인 Group C의 구조를 유지하고, DDX5 분해를 위한 결합 부위인 Group A 역시 FL118과 동일한 구조를 유지하되, 일반식 1 중 Group B의 구조(R3 및 R4)를 화학식 1과 같이 조절함으로써 약물의 물리화학적 특성을 개선할 뿐만 아니라, 약물의 세포독성(cytotoxicity) 및/또는 약물의 세포막 투과도를 조절하여 주변세포 살상 효과 (bystander effect)를 조절할 수 있는 구조로 디자인할 수 있다(실시예 9, 도 25 및 도 26; 실시예 10, 도 27b). 또한, 경우에 따라서는 사멸된 암세포에서 방출된 활성형 캄토테신 유도체(a)가 림프 배출(drainage)을 통해 빠르게 또는 천천히 제거되도록 원하는 정도의 소수성 제공 및/또는 응집을 제어할 수 있는 구조로 디자인할 수 있다.
Cell viability를 단순 비교하였을 때, 본 발명에 따라 새롭게 설계 및 합성된 PBX-7016(화학식 5)은 Dxd 약물에 비하여 1.5~2배 수준의 IC50값을 보이고 있으나, 놀랍게도 ADC payload로 사용되었을 때, PBX-7016을 포함하는 ADC가 Dxd를 포함하는 ADC(Enhertu)에 비하여 약 5배 정도 우수한 cell viability 관련 세포 독성 효과를 발휘하였다(실시예 7, 도 22). 화학식 5로 표시되는 화합물(PBX-7016)과 이의 이성질체인 화학식 5-1로 표시되는 화합물(PBX-7017)는 서로 부분입체 이성질체(isomer) 관계이다.
따라서, 본 발명은 일반식 1 중 R3 및/또는 R4 변형(예, PBX-7014, PBX-7016, PBX-7018, PBX-7020, PBX-7022, PBX-7024)을 통해 세포막 투과도를 원하는 대로 조절하여 암조직에서 적절한 주변세포 살상 효과 (bystander effect)가 발휘되도록 활성형 캄토테신 유도체를 설계하는 것이 바람직하다.
도 1에 예시된 바와 같이, 본 발명은 일반식 1에서 Group B의 R3 및 R4를 변형하여 엑사테칸(Exatecan)의 구조와 유사한 PBX-7011와 같은 새로운 구조의 화합물을 설계 및 합성하였다(제조예 1). 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따라 새롭게 설계한 화학식 3의 PBX-7011은 계산된 LogP(또는 cLogP) 및 tPSA값을 통하여 화학식 2의 FL118에 비하여 상대적으로 높은 hydrophilicity를 갖는 것을 확인하였다.
나아가, 새롭게 설계한 PBX-7011 구조에, 일반식 1의 Group B를 조절함으로써 새로운 구조의 화합물 PBX-7014 및 PBX-7016을 설계 및 합성하였으며(제조예 2 및 제조예 3). PBX-7014와 PBX-7016은 Exatecan으로부터 파생된 Dxd의 hydrophilicity와 유사한 값을 보이는 것으로 계산되었다(도 1 및 도 2, 도 28).
도 28는 FL118, Exatecan, SN-38, Dxd, Exatecan-Lactic acid, PBX-7011/PBX-7012, PBX-7014/PBX-7015, PBX-7016/PBX-7017의 용해도 및 tPSA(topological polar surface area)를 비교한 것이다.
약물의 상대적인 친수성/소수성 성질은 약물의 용해도, 흡수, 분포, 대사, 배설 (ADME), 특히 림프 배출(drainage)에 중요한 영향을 미친다. 약물이 세포막을 얼마나 쉽게 통과하는지, 그리고 수용체와 같은 약물 표적과의 상호 작용에서 중요하다.
약물의 소수성은 분배계수(partition coefficient, p)로 나타낸다.
소수성은 p값이 크고, 친수성(극성)인 경우 p값이 작다. 실제로 그 log P 값은 소수성을 평가하는 척도로 사용한다. Clog P는 적절한 소프트웨어를 통하여 주어진 화합물의 log P 값을 구한 것을 의미한다. cLogP 값이 작아질수록 극성이 높다.
분자의 극성 표면적(PSA) 또는 위상 극성 표면적(TPSA)은 부착된 수소 원자를 포함하여 주로 산소와 질소인 모든 극성 원자 또는 분자에 대한 표면 합으로 정의된다. tPSA는 약물의 세포 투과 능력을 최적화하기 위해 일반적으로 사용되는 의약 화학 측정법이다. 140 Å2보다 큰 극성 표면적을 가진 분자는 세포막을 투과하지 못하는 경향이 있다. 분자가 혈액-뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계의 수용체에 작용하려면 일반적으로 90Å2 미만의 tPSA가 필요하다.
본 발명의 PBX-7016/PBX-7017(화학식 5 및 화학식 5-1)는 PBX-7014/PBX-7015(화학식 4 및 화학식 4-1)에 약물의 수명을 줄이기 위해 대사에 불안정한 작용기인 메틸기를 도입한 것이다. 대사에 극도로 안정적이어서 아주 느리게 대사되는 약물은 축적으로 독성과 심각한 부작용 우려가 있으므로 적절한 머무름시간을 확보하기 위하여 필요하다.
본 발명에 따라 새롭게 설계된 활성형 캄토테신 유도체(a)는 세포막을 투과할 수 있도록 일반식 1의 R3 및 R4를 변형하여 설계된 소수성 저분자이므로, 암조직으로 전달되면 암조직 심부까지 침투하면서 높은 농도로 축적 가능하고, 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b)인 ADC이 세포막을 관통한 후 활성형 캄토테신 유도체(a)이 세포 내부에서 세포독성을 발휘하여 세포 사멸시키면서 세포 외액으로 방출되어 연속적으로 주변 세포에도 세포막을 관통해 세포내로 이동하여 세포사멸 기전을 발휘할 수 있다(실시예 9, 도 25 및 도 26; 실시예 10, 도 27b). 따라서, 본 발명의 활성형 캄토테신 유도체는 세포 밀도가 높아 뭉친 고형암을 세포 밀도가 낮은 흩어진 암로 전환시키고/시키거나 면역활성이 낮은 cold tumor를 면역활성이 높은 hot tumor로 전환시킬 수 있다. 또한, 주변세포살상효과가 높아서 비균질종양의 치료에 이점이 있다.
요컨대, 본 발명은, 도 1, 도 2, 도 28 및 도 29에 예시된 바와 같이, 제1형 토포이소머라제 저해 및 DDX5 단백질 분해 측면에서 이중 작용기전(dual MoA)를 발휘하는 새로운 구조의 다양한 Camptothecin 유도체 및 이의 프로드럭(도 3)을 다양하게 설계가능할 뿐만 아니라, Camptothecin 유도체 설계시 hydrophilicity을 다양하게 제어함으로써 세포막 투과도, 림프 배출(drainage) 및/또는 주변세포 살상 효과 (bystander effect)를 조절할 수 있다.
[FL118 약물]
화학식 2의 FL118은 DDX5와 유비퀴틴화 조절자를 직접 접착하여 DDX5를 분해하는 분자 접착 분해제(molecular glue degrader) 역할을 할 수 있다.
분자 접착제(molecular glue) 역할을 하는 FL118은, DDX5 mRNA를 감소시키지 않고 프로테아좀 분해 경로를 통해 다기능 마스터 조절인자(multifunctional master regulator)인 종양단백질 DDX5에 직접 결합하고 이를 탈인산화 및 분해하는 기능을 가지고 있으며, DDX5의 사일런싱은, DDX5가 서바이빈, Mcl-1, XIAP, cIAP2, c-Myc 및 돌연변이 Kras를 비롯한 여러 발암성 단백질의 발현을 조절하는 마스터 조절인자임을 나타낸다.
FL118은 DDX5 다운스트림 표적들을 간접적으로 제어하여 인간 결장 직장암/췌관 선암종 세포 및 종양 모델을 사용한 연구에서 입증된 바와 같이 높은 효능으로 암 개시, 발달, 전이, 재발 및 치료 내성(cancer initiation, development, metastasis, recurrence and treatment resistance)을 억제한다.
PDAC 세포에서 DDX5의 유전적 조작은 종양 성장에 영향을 미친다. DDX5 KO가 있는 PDAC 세포는 FL118 처리에 내성이 있다. 인간 종양 동물 모델 연구에서 FL118이 DDX5 발현이 높은 인간 PDAC 및 CRC 종양을 제거하는 데 높은 효능을 나타내는 반면, FL118은 DDX5 발현이 낮은 PDAC 및 CRC 종양에서 덜 효과적인 것으로 나타났다.
DDX5 단백질은 FL118 약물의 직접 표적이며 FL118에 대한 PDAC 및 CRC 종양 감수성(tumour sensitivity)을 예측하기 위한 바이오마커 역할을 할 수 있다.
한편, FL118 약물은 암세포에서 SN-38과 동등 이상 수준의 Top1 저해 효능을 가지고 있으며, 다양한 암 세포주에서 SN-38에 비하여 5 - 20배 강력한, 즉 낮은 수준의 IC50 수치로 세포독성(Cytotoxicity)를 보이며, 다양한 암종에서 기원한 140개의 세포주에 대한 평가 결과에서도 대다수의 암세포에 대하여 < 100nM의 IC50를 보이는 매우 강력한 항암 효능을 보였다. FL118 약물은 쥐와 비글견에서의 GLP-독성 시험을 통하여 우수한 안전성이 확보되었으며, 다양한 암 세포주 Xenograft 모델에서 SN-38 대비 탁월한 효능을 보였다. 한편, Camptothecin계 항암제의 경우 환자에 사용 시 초기에는 우수한 항암 반응을 보이나 Top1 유전자의 Epigenetic Silencing과 암세포의 Top2 Dependence를 통하여 이들 약물에 대한 강력한 내성이 나타난다. 반면, FL118 약물은 Top1이 Epigenetic Silencing 또는 Knock-out을 통하여 발현되지 않는 암 세포주의 Xenograft 모델에서도 강력한 효능을 보였다.
또한, FL118 약물은 잘 확립된 항암 타깃인 제1형 토포이소머라제를 직접 표적으로 하면서, 내성 기전에 관여하는 내성 단백질인 Survivin 등 Bcl family를 동시에 억제하고, 유출펌프(efflux pump)의 작용을 억제하는 삼중 표적 항암제이다.
구체적으로, SN-38 등 Camptothecin 계열 항암제들은 ABCG2 Transporter의 과발현에 의해서 약물이 세포 밖으로 배출되는 방식의 내성을 보이게 되는데, FL118 약물은 ABCG2 Transporter에 영향을 받지 않기 때문에 이에 의한 내성 극복이 가능하다. FL118 약물은 또 다른 항암제 내성의 주원인인 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)(Survivin, cIAP2, XIAP 등)의 발현을 낮은 농도에서 강하게 억제함으로써 내성의 발현을 차단할 수 있다(도 10).
따라서, FL118 약물은 유출펌프(efflux pump)인 ABCG2에 의해 세포 밖으로 배출되지 않으며, 다양한 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)에 의한 내성을 차단할 수 있다. 그 결과, FL118 약물은 SN-38/Exatecan의 다양한 내성 작용 기전을 극복할 수 있다.
FL118 약물은 SN-38과 동일한 양으로 in vivo 투여 시 대장암/두경부암/췌장암 등에서 SN-38 대비 강력한 tumor regression 효능을 보였다.
FL118 약물은 tumor xenograft에서 SN-38 내성 유도 후 FL118 투여 시에도 강력한 항암 효능을 보유하였다. FL118 약물의 SN-38/Exatecan에 대한 다양한 내성 기전 극복 가능성이 in vivo에서 확인되었다.
더욱이, FL118 약물은 targeted drug delivery (예, Carrier-drug Conjugate) 적용에 최적인 PK/safety profile을 가지고 있다. FL118 약물을 단독으로 전신투여 시 혈액에서 빠르게 대사/배출되어 낮은 농도만을 보이나 암 조직에는 투여 직후부터 빠르게 축적되어 장시간 높은 농도를 유지한다. 예컨대, ADC 적용시 종양 조직과 정상 조직 사이의 최대 선택성을 보장한다. 이는 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체 (a)의 경우에도 마찬가지이다(실시예 6 및 실시예 8)
요컨대, FL118 약물은
(i) 잘 검증된 항암 타깃인 Top 1 이외에 또 다른 항암 타깃인 DDX5, UBE2T 및 USP2a를 선택적으로 저해/분해하여 강력한 항암 효과를 창출하고;
(ii) SN-38 대비 5 - 10배 강력한 세포독성(Cellular Cytotoxicity), Exatecan 대비 동등 이상의 강력한 세포독성을 보이며;
(iii) SN-38 및 Exatecan과는 다르게 ABCG2 및 P-GP의 기질(Substrate)이 아니기 때문에, 이들 Transporter 단백질의 과발현에 의한 내성기전 회피가 가능하고;
(iv) Top 1 저해제 내성 발생의 주요 기전인 Top 1의 Epigenetic Silencing/Top 2의 Over-expression이 일어난 암의 동물모델에서 우수한 효력을 발휘하며;
(v) 대부분의 암에 공통된 내성발생 기전인 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)의 과발현을 원천적으로 차단하여 내성 회피가 가능하고;
(vi) 환자에서의 항암 반응을 예측할 수 있는 바이오마커 (DDX5, K-ras, p53), 동반진단 기법 등이 이미 확립되어 있으며, 맞춤형 바이오마커 확보로 동반 진단을 통한 개인 맞춤형 치료 가능하고, 특히 예후가 좋지 않은 p53/K-ras 돌연변이 암세포들에서 강력한 효능을 보인다.
KRAS는 세포 증식 신호 전달에 관여하는 RAS 단백질 생성과 관련된 유전자 세 종류 중 하나다. 암종별로 다르지만 전체적으로 약 20% 이상에서 돌연변이가 발생한다고 알려져 있었다. 하지만 과학적으로 항암 효능을 기대할 수 있음에도 불구하고 언드러거블 타깃으로 취급됐다. RAS단백질의 표면이 매끄러워 화합물을 결합시키기에 적합한 포켓이 발견되지 않았기 때문이다.
[제1형 토포이소머라제(topoisomerase-1)의 선택적인 억제제로서 항암기전 1]
캄토테신(camptothecin)은 DNA의 복제 및 재조합 등에 관여하는 이성질화 효소인 제1형 토포이소머라제(topoisomerase-1)의 선택적인 억제제이다(도 1). in vitro에서 강력한 세포독성(cytotoxicity)을 나타낸 것으로 판명된 이래 미국 암연구센터(NCI) 등에서 임상시험을 통한 개발에 착수되었으나 극히 난용성이라는 한계로 인해 그와 관련된 골수억제 및 출혈성 방광염 등의 다양한 부작용을 보임에 따라 개발이 중단되었다. 그러나 1990년 이후, 캄토테신이 가지는 독특한 작용기전, 즉 DNA 제2형 토포이소머라제(topoisomerase-2) 저해기전과는 달리 DNA 제1형 토포이소머라제를 선택적으로 억제하여 항종양효과를 나타냄이 확인되었다.
DNA 토포이소머라제는 핵내의 효소들로서, 복제나 전사를 위해 세포가 유전 물질에 접근이 요구될 때 일시적으로 DNA의 절단하거나 이중 나선을 푸는 역할을 한다. 이들은 또한 염색체 농축 및 재조합, DNA 수리 등 다양한 세포내 활동에 참여한다. 토포이소머라제의 유전암호는 종들 간에 상당히 보존적이다.
캄토테신의 약물 표적인 제1형 토포이소머라제는 다양한 악성 종양에서 그 수준이 증가하는 것이 관찰되었다. 이 약물은 유리효소를 억제하지는 못하나 토포-DNA 복합체의 공유결합을 안정화시켜 절단된 DNA 조각들이 다시 연결되는 것을 방해한다. 따라서, 이러한 토포이소머라제-대상 약물에 대한 세포의 민감성은 핵내 존재하는 효소의 수준과 관련이 있다. 이 약물은 DNA의 재결합을 방해함으로써 전사가 진행되는 것을 불가능하게 한다. 제1형 토포이소머라제의 양이 더 많을수록, 더 많은 절단가능한 복합체를 형성하며 이는 약제 감수성이 높음을 의미한다. 이것은 중요한 임상적 관련성을 가지는데, 제1형 토포이소머라제 억제제는 제2형 토포이소머라제의 발현을 증가시키는데 사용되어 이는 제2형 토포이소머라제 억제제에 더욱 감수성을 가지게 한다. 이러한 결과는 제1형 토포이소머라제와 제2형 토포이소머라제 간의 대립 관계에 의해 지지된다. 이러한 제1형 토포이소머라제는 제2형 토포이소머라제와 달리 정상 조직에서는 증식과 밀접한 관련이 없으며, 임파종으로 포함한 대장암, 난소암, 식도암 등의 세포분열이 왕성한 “S”기의 고형암에 주변의 정상 조직에 비해 다량 존재하며, 실제적으로 세포주기상“S”기에 종양세포 내에 유전자의 복제 및 전사를 차단함으로써 세포사를 유발할 수 있다고 알려져 있다.
[DDX5에 결합하는 분자 접착 분해제(molecular glue degrader)로서 항암기전 2]
유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 광범위한 세포 과정을 조절하는 세포내 단백질의 분해를 위한 중요한 경로이다. 유비퀴틴은 유비퀴틴 활성화 효소(E1s), 유비퀴틴 접합 효소(E2s) 및 유비퀴틴 리가아제(E3s)를 포함하는 일련의 효소 반응에 의해 기질 단백질의 라이신 잔기에 공유 결합되는 작은 단백질이다. 이 과정을 유비퀴틴화(ubiquitination)라고 하며 단백질 분해, 신호 전달 및 트래피킹을 조절하는 중요한 메커니즘이다.
유비퀴틴 리가아제는 유비퀴틴화 경로에서 기질 특이성을 담당한다.
이와 관련하여, 본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 것이다.
DDX5 단백질(p68이라고도 함)는 하기와 같은 기전에 작용하는 다기능 마스터 조절자(multifunctional master regulator)이다: (1) 발암 유전자 프로모터(oncogenic gene promoters)에서 다양한 전사 인자들(예: c-Myc)와의 직접적인 상호작용을 통해 많은 종양 유전자들의 전사를 함께 활성화(co-activation)시키는 생물학적 과정, (2) miRNA 및 pre-RNA 스플라이싱(예: U1, U2, U3, ... snRNP)을 조절하는 생물학적 과정, 및 (3) 리보솜 생합성(예: 32S rRNA, pre-ribosome).
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 DDX5 mRNA 감소 없이 DDX5 단백질에 결합하여 기능적으로 탈인산화 및 프로테아좀 분해 경로를 통해 분해시키는데, 이는 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체가 DDX5 및 유비퀴틴 관련 단백질 안정성/분해 조절제(ubiquitin-involved protein stability/degradation regulators) 모두에 붙을 수 있다는 것을 시사하며, "분자 접착 분해제" 역할을 한다.
DDX5 다운스트림 단백질 표적들(DDX5 downstream protein targets)은 모두 암 개시, 발달, 전이, 재발 및 치료 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체에 의한 DDX5 단백질의 분해를 통해 DDX5 다운스트림 표적을 간접적으로 차단하면, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 높은 항종양 효능이 나타날 수 있다.
[약물 표적 및/또는 바이오마커로서 DDX5]
전사 인자는 DNA 결합 도메인을 통해, 프로모터 또는 인핸서라는 DNA 가닥들에 결합하고, RNA 폴리머라제 및 기타 보조 인자의 협력으로 유전자의 전사를 개시하는 단백질 그룹이다. 그들은 배아 발생 및 발달 동안 전사를 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 다른 세포 유형에서 전사 인자의 생리학적 상태는 또한 세포 항상성을 유지하는 데 중요하다. 따라서 전사 인자가 조절되지 않으면(deregulation) 암 세포의 발달과 종양 진행으로 이어질 것이다. 암 세포에서의 기능에 따라 전사 인자는 발암성 또는 종양 억제성일 수 있다. 또한, 전사 인자는 암 줄기 세포, 상피-간엽 전이(EMT) 및 약물 반응을 조절하는 것으로 나타났다. 따라서, 조절되지 않은 전사 인자를 측정하는 것은 암 환자의 치료 결과를 예측할 수 있다고 생각되며, 조절되지 않은 전사 인자를 표적으로 삼는 것은 암 치료를 위한 고무적인 전략이 될 수 있다. 조절되지 않는 주요 전사 인자는 암 환자의 나쁜 임상 결과를 유발할 수 있다. 따라서, 예후 및 약물 반응을 예측하고 조절되지 않는 전사 인자를 표적으로 하여 암 치료를 위한 새로운 약물 및 치료 전략을 설계하는 데 도움이 될 것이다.
전사는 배아 발생, 발달 및 항상성 동안 세포에서 유전자 발현의 첫 번째 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 전사 과정에서 특정 코딩 정보가 있는 RNA 전사체가 DNA에서 생성된다. 상이한 세포와 조직에서 유전자 발현의 특이성을 보장하기 위해, 특정 단백질 그룹인 전사 인자가, RNA 전사체로 전사될 유전자들을 선택하여 전사를 제어한다. 전사 인자는 DNA 결합 도메인을 가지고 있으며, 유전자의 프로모터 또는 인핸서라는 특정 DNA 서열에 결합할 수 있고, 활성제(activator), 매개체(mediator), 보조 인자(co-factor) 및 RNA 폴리머라아제의 협력으로 유전자의 전사를 개시할 수 있다.
전사 인자는 또한 DNA에서 mRNA로의 전사 속도를 제어한다. 결과적으로, 상이한 유형의 세포에서 전사 인자의 생리학적 상태는 세포 항상성 유지에 중요하다. 세포 내 전사 인자의 생리학적 상태의 변화는 전사 장애(disorder)를 일으키고 특정 유전자의 번역을 일으켜 세포의 병리학적 변화를 일으킨다. 따라서 조절되지 않은 전사 인자는 많은 인간 질병을 유발할 수 있다. 조절되지 않은 전사 인자를 가진 일반적인 질병 중 하나가 암이다.
인간 세포의 항상성 제어는 일반적으로 부적절한 증식을 방지하고, 정상적인 적소 외부에서 비정상적으로 증식하는 세포의 성장을 억제한다. 전사 제어는 항상성 동안의 핵심 과정이기 때문에 전사 인자의 수준 또는 활동이 조절되지 않으면 세포가 항상성 제어를 벗어나 인간의 암 발병 및 진행을 유발할 수 있다.
실제로, 많은 화학요법이 종양 억제 전사 인자를 활성화할 수 있다.
조절되지 않은 전사 인자는 종양 형성 및 종양 진행에 중요한 역할을 한다. 그들은 NF-κB, Notch, Wnt/β-catenin, JAK/STAT와 같은 중심 종양 신호 경로(central tumor signaling pathways)를 조절한다. 조절되지 않은 발암 및 종양 억제 전사 인자는 암 세포, 암 줄기 세포 및 EMT 세포의 생존을 선호하여 암 치료에서 내재적 또는 후천적 약물 내성 및 종양 진행을 유도한다.
DDX5(p68)는 잘 알려진 다기능 DEAD-box RNA helicase이자 전사 보조인자(transcription cofactor)이다. 따라서, DDX5의 생리학적 상태에 의해 전사 인자가 조절되지 아니하여(deregulation) 암이 발병한 경우, 전사 보조인자(transcription cofactor)인 DDX5(p68)를 선택적으로 분해시킴으로써, 암 질환을 치료할 수 있다. 마찬가지로, 전사 보조인자(transcription cofactor)인 DDX5(p68)를 선택적으로 분해시킴으로써, 암 질환을 예방할 수 있다.
DDX5는 다양한 암 유형의 치료를 위한 잠재적인 바이오마커 및 표적으로 인식되고 있다. 수년에 걸친 연구를 통해 다양한 암 유형에서 DDX5의 기능적 다양성에 대한 이해가 크게 확장되었으며 MoA(Mechanism of Action)에 대한 지식이 확장되었다. 이는 DDX5를 바이오마커 및 치료 표적으로 사용하여 새로운 암 치료제 개발에 대한 이론적 근거(rationale)를 제공한다. 그러나 발표된 대부분의 연구에서 DDX5가 발암성 표적이자 암 치료 저항성 바이오마커인 것으로 밝혀졌지만 일부 연구에서는 특정 시나리오에서 DDX5가 종양 억제인자(tumor suppressor)로 작용할 수 있다고 보고했다. DDX5의 다중 기능이 DDX5를 우수한 독립적 발암 바이오마커이자 표적 암 치료의 표적으로 만든다.
정상 세포가 암성 세포(cancerous cell)로 변형되는 것은, 단백질-단백질 상호 작용의 복잡한 네트워크를 포함하는 상이한 대사 경로가 조절되지 않음 (deregulation)으로써 발생한다. 세포 효소 및 DDX5는 정상적인 세포 대사 유지에 중요한 역할을 하지만 이들이 조절되지 않으면(deregulation), 종양 변형을 가속화할 수 있다. DDX5는 모두 수백 가지의 다른 세포 단백질과 상호 작용하며, 관련된 특정 경로에 따라 두 단백질 모두 종양 억제 유전자 또는 종양유전자로 작용할 수 있다.
DEAD-box 계열의 RNA 헬리카제는, 전사 및 번역뿐만아니라, 세포 증식, 선천적 면역 및 스트레스 반응에 이르기까지, 여러 대사 경로에 관여한다. 그들의 다양한 역할을 감안할 때 그들이 조절되지 않거나(deregulation) 또는 그들의 돌연변이가 암을 포함한 다양한 병리학적 상태(pathological conditions)와 연결되어 있다. 그러나 어떤 경우에는 주어진 DEAD-box helicase의 기능 상실이 종양 변형(tumor transformation)을 촉진하여 종양 억제 역할을 나타내는 반면, 다른 상황에서는 동일한 효소의 과발현이 암 진행을 선호하여 전형적인 발암 유전자로 작용한다. 종양유전자 및 종양 억제 유전자로서 DDX5의 역할은 여러 암 유형에서 문서화되었다. 서로 다른 종양에서 DDX5의 분자 상호작용 네트워크에 의해 정의된 서로 다른 세포 상황의 상호작용을 이해하면 이들 단백질이 수행하는 암 특이적 역할이 암 유발인자 또는 억제인자로서 분명히 상충되는 역할을 설명하는 데 도움이 될 수 있다.
DDX5가 종양유전자 (oncogene)로 훨씬 더 자주 작용하지만 특정 암 유형에서 종양 억제제 기능들(tumor suppressor functions)을 가질 수도 있음을 나타낸다(표 1).
출처: Secchi, M.; Lodola, C.; Garbelli, A.; Bione, S.; Maga, G. DEAD-Box RNA Helicases DDX3X and DDX5 as Oncogenes or Oncosuppressors: A Network Perspective. Cancers 2022, 14, 3820. https://doi.org/10.3390/cancers14153820
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 DDX5 단백질이 약물 표적이므로, 약물 내성, 표적치료에 저항성 및/또는 치료 중 내성을 피할 수 있게 할 수 있다. 또한, 활성형 캄토테신 유도체에 의해, 항세포사멸 유전자(anti-apoptotic genes)의 전사 유도를 차단(off)시킬 수 있다. 나아가, 활성형 캄토테신 유도체에 의해, 전사 보조인자(transcription cofactor)인 DDX5 단백질이 분해되어, 화학 요법이나 방사선 요법에 대한 암 세포의 민감도를 유지 또는 향상시킬 수 있다.
[화학식 1, 화학식 3 내지 화학식 9로 표시되는 캄토테신 유도체 및 이의 이성질체들]
본 발명에 따라 일반식 1에서 R1 및 R2 가 FL118 화합물과 동일하게 설계된, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체, 예컨대 하기 화학식 3의 화합물, 화학식 4의 화합물, 화학식 5의 화합물, 화학식 6의 화합물, 화학식 7의 화합물, 화학식 8의 화합물, 화학식 9의 화합물 및 이의 이성질체들 역시 전사보조인자이면서 종양단백질(oncoprotein)인 DDX5를 분해하고, 이로인해 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)(Survivin, cIAP2, XIAP 등)의 발현을 농도 의존적으로 강하게 억제할 뿐만 아니라(도 11 내지 도 14), Cell viability 실험으로 통해 상기 화합물들이 세포 안으로 도입된 해당 세포들을 사멸시킨다(도 15 및 도 16).
본 발명에 따라 화학식 1, 예컨대 화학식 3 내지 화학식 9로 표시되는 캄토테신 유도체는 도 1에 도시된 캄토테신과 같이 세포독성에 필수적인 E-고리에 락톤을 갖는 펜타사이클릭 구조를 가지며, 제1형 토포이소머라제-DNA 부산물의 안정을 위해 중요한 E-고리의 20번 탄소에 위치한 락톤기와 알파수산화기는 유지하도록 설계된 것으로, 전술한 FL118 약물의 잇점을 유지하는 FL118 약물의 구조, 일반식 1 중 R1 및 R2 (-OCH2O- (methylenedioxo) 5각형 링)를 유지하면서, Exatecan 약물의 구조적 특징 (일반식 1 중 R3 및 R4)은, A- 및 B-고리가 형성하는 방향족 고리들의 π-π적층(stacking)에 의해 응집이 유도되는 SN-38 대비, A- 및 B-고리로부터 확장된 6각 고리의 연속적인 탄소-탄소 단일 결합의 다양한 배향들이 동적 평형을 이루어 A- 및 B-고리가 형성하는 방향족 고리들의 적층(stacking)이 약화 또는 억제가능하다.
이에 더하여, 화학식 3 또는 화학식 3-1로 표시되는 화합물은, A- 및 B-고리로부터 확장된 6각 고리에 있는 탄소-탄소 단일 결합에 대하여 분자 결합의 회전이 가능하여 자유도가 큰 -NH2가 물(H2O)에 노출되어 (+) 전하를 띠거나 물과 수소결합하여 수분산성(water dispersibility)을 증가시킴을 접목하도록 설계한 화합물이다.
이에 더하여, 화학식 4 또는 화학식 4-1로 표시되는 화합물은, A- 및 B-고리로부터 확장된 6각 고리에 있는 탄소-탄소 단일 결합에 대하여 분자 결합의 회전이 가능하여 자유도가 큰 -NH2의 glycolic acid 형태의 작용기 CH2(OH)CONH-가 물(H2O)에 노출되어 프로펠러처럼 회전하면서 물과 수소결합하여 수분산성을 증가시킴을 접목하도록 설계한 화합물이다.
이에 더하여, 화학식 5 또는 화학식 5-1로 표시되는 화합물은, A- 및 B-고리로부터 확장된 6각 고리에 있는 탄소-탄소 단일 결합에 대하여 분자 결합의 회전이 가능하여 자유도가 큰 -NH2의 Lactic acid 형태의 작용기 CH3CH(OH)CONH-가 물(H2O)에 노출되어 프로펠러처럼 회전하면서 물과 수소결합하여 수분산성을 증가시킴을 접목하도록 설계한 화합물이다.
본 발명의 화학식 5 또는 화학식 5-1로 표시되는 화합물은 화학식 4 또는 화학식 4-1로 표시되는 화합물에 약물의 수명을 줄이기 위해 대사에 불안정한 작용기인 메틸기를 도입한 것이다. 대사에 극도로 안정적이어서 아주 느리게 대사되는 약물은 축적으로 독성과 심각한 부작용 우려가 있으므로 적절한 머무름시간을 확보하기 위하여 필요하다.
한편, Enhertu에 사용되는 DXd payload는 원래는 ABCG2에 영향을 거의 받지 않는 Exatecan 화합물로부터 만들어졌지만, Exatecan을 DXd로 전환시키기 위하여 사용된 glycolic acid (alpha-hydroxy acetic acid) 관능기의 존재로 인하여 ABCG2에 의하여 강하게 영향을 받게 되었다. 하지만, glycolic acid 관능기는 Enhertu의 우수한 안전성/효력 프로파일에 매우 중요한 역할을 하는 것으로서, 이를 제거할 경우 ADC 제조 시의 난점과 동시에 동물 모델, 임상 시험에서 ADC의 성능이 나빠지는 (안전성 문제 대두 또는 효력의 감소) 문제를 가지고 온다. 이에 ADC 제조에 용이하게 사용될 수 있으면서도 ABCG2의 영향을 받지 않는 새로운 캄토테신 유도체에 대한 니즈가 매우 높은 상황이다. 화학식 9로 표시되는 화합물(PBX-7024)은 화학식 3으로 표시되는 화합물(PBX-7011)로부터 출발하여 도출된 화합물로, ABCG2에 의하여 영향을 받지 않으면서도 ADC 제조에 용이하게 사용될 수 있는 새로운 캄토테신 화합물이다.
PBX-7024의 항암 효능을 확인하기 위하여, ABCG2를 발현하지 않는 암 세포인 FaDu와 ABCG2를 과발현하고 있는 암세포인 A549에서의 효능 평가를 진행하였다. ABCG2를 과발현하고 있는 암세포주인 A549에서는 도 15에서와 같이 DXd를 비롯한 캄토테신 화합물들이 높아진 IC50 수치를 보이고 있는 것에 비하여 PBX-7016 및 PBX-7024는 여전히 강한 효력을 유지하고 있는 것을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 새로운 캄토테신 화합물인 PBX-7016 및 PBX-7024를 사용할 경우 기존 캄토테신 화합물들인 SN-38, DXd 등을 사용하는 ADC들과는 다르게 ABCG2의 과발현에 의한 내성 기전을 극복할 수 있는 효과를 가지고 있다.
도 28 및 도 29은 FL118, Exatecan, SN-38, Dxd, 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 G, 화합물 H, 화합물 I, 화합물 J, 화합물 G', 화합물 H', 화합물 I', 화합물 J'의 LogP, cLogP및 tPSA(topological polar surface area)를 비교한 것이다.
화학식 3의 화합물과 화학식 3-1의 화합물은 서로 부분입체 이성질체(isomer) 관계이다. 마찬가지로, 화학식 4의 화합물과 화학식 4-1의 화합물; 및 화학식 5의 화합물과 화학식 5-1의 화합물도 서로 부분입체 이성질체(isomer) 관계이다. 따라서, 화학식 6의 화합물, 화학식 7의 화합물, 화학식 8의 화합물 또는 화학식 9의 화합물과 부분입체 이성질체(isomer) 관계에 있는 화합물들도 본 발명의 범주에 속한다.
제조예 2에 예시된 바와 같이, 화학식 4의 PBX-7014는 화학식 3의 PBX-7011로부터, 화학식 4-1의 PBX-7015는 화학식 3-1의 PBX-7012로부터 합성가능하다.
제조예 3에 예시된 바와 같이, 화학식 5의 화합물(PBX-7016, 화합물 E)는 화학식 3의 화합물(PBX-7011, 화합물 A)로부터 합성가능하고, 동일한 방법으로 화학식 5-1의 화합물(PBX-7017, 화합물 F)은 화학식 3-1의 화합물(PBX-7012, 화합물 B)로부터 합성가능하다.
본 명세서에서, 본 발명에 따른 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9의 캄토테신계 약물은 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물 뿐만 아니라 이의 약제학적 허용염, 이의 용매화물, 이의 프로드럭(prodrug), 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)을 포함한다.
본 명세서에서, 약제학적 허용염은 제약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 리튬, 구리, 망간, 아연, 철 등을 비롯한 무기이온의 염과 염산, 인산, 황산과 같은 무기산의 염이 있으며, 그 외에 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산, 프로피온산, 아세트산, 오로테이트산, 아세틸살리실산과 같은 유기산의 염 등과 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염이 있다. 또한 약학적인 반응, 정제 및 분리과정에서 사용될 수 있는 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 테트라프로필 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 벤질 트리메틸 암모늄, 벤제토늄 등의 유기이온의 염이 있다. 다만, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.
"용매화물"은, 비공유 분자간 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비화학량론적 양의 용매를 추가로 포함하는 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물 및 이의 약제학적 허용염을 의미한다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 수화물이다.
[분자 접착 분해제(molecular glue degrader)라는 약물 모달리티의 잇점]
몸속 세포 내 단백질들은 제 기능을 수행한 후 수시간에서 수일 내 자연 분해된다. 체내의 모든 세포에는 단백질을 분해시키는 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(Ubiquitin proteasome system, UPS)이라는 정화작용이 존재하는데, 이 과정에서 유비퀴틴은 분해되어야 하는 단백질을 알려주는 표식(marker) 역할을 하며, 프로테아좀은 유비퀴틴 표식을 인지하고 해당 단백질을 파괴하는 분쇄기 역할을 한다. 즉, 제 역할을 다한 단백질 옆에 유비퀴틴(Ubiquitin)이라는 물질 여러 개가 표식처럼 붙고, 프로테아좀(Proteasome)이라는 물질이 이 표식을 가진 단백질만 골라서 분쇄기처럼 분해해버린다. E3 리가아제는 체내 단백질 분해 시스템을 일으키는 효소로서, 유비퀴틴화 경로에서 기질 특이성을 담당한다.
분자 접착 분해제(molecular glue degrader) 또는 분자접착제(molecular glue)는 표적 단백질과 우리 몸의 특정 효소(E3 리가아제)를 서로 붙이는 접착제 기능을 하는 화합물이다. 분자접착제(molecular glue)의 장점 중 하나는 촉매 역할로, 표적을 분해한 뒤 다시 분리돼 또 다른 표적 단백질을 분해할 수 있다는 것이다.
분자접착제(molecular glue)를 통해 종양단백질에 E3 리가아제 효소가 붙으면 종양단백질이 분해되고, 표적인 종양단백질이 없어질 때까지 연속적으로 다른 종양단백질들이 분해되기 때문에 암세포 증식을 막을 수 있다. 따라서, 종양단백질에 대한 분자접착제는 표적 항암제의 문제점인 약물 내성을 극복하고, 적은 투여 용량으로도 치료 효과가 높다.
FL118 약물뿐만 아니라, 본 발명에 따라 화학식 1에서 설계되는 활성형 캄토테신 유도체는 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하는 분자접착 분해제(molecular glue degrader), 즉 종양단백질 DDX5 분해를 활성화하는 분자접착제이다(도 11 내지 도 14).
분자접착제(molecular glue degrader)는 표적 단백질에 결합하는 리간드(warhead)일 뿐만아니라, E3 리가아제 리간드(binder) 역할을 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 화학식 1에서 설계되는 활성형 캄토테신 유도체는 종양단백질 DDX5 분해를 활성화하는 분자접착제이므로, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 또는 DDX5 단백질에 결합하는 리간드로서 사용될 수 있다.
분자접착제(molecular glue degrader)은 키나제 저해제와 달리 '위치 주도형 (proximity-driven)'이고 분해 유도 능력은 일시적인 '표적단백질- 분자접착제(molecular glue)-E3 리가아제' 삼중 복합체 형성에 달려 있는 '발생 주도형(event-driven)'이다. 분해 발생 이후에 분리된 분자접착제(molecular glue)이 표적 단백질과 추가적인 삼중 복합체를 형성하여 표적 단백질이 없어질 때까지 여러 번의 분해 과정을 진행할 수 있다.
대부분 약물 타겟이 되는 단백질은 약물에 적응해 진화하는 내성이 발생한다. 그러나, 종양단백질과 E3 리가아제를 서로 붙이는 접착제 기능을 하는 저분자 화합물인 분자접착제(molecular glue)은 내성에 강하기 때문에 암 치료제에 적합한 모달리티이다.
유전자 변이가 일어날 때마다 약물 타겟 단백질의 모양은 조금씩 바뀐다. 한 가지 약물로 모든 변이체의 활성을 막으면 좋겠지만 선택성의 문제 때문에 가능하지 않기에, 한 가지 약물이 모든 변이의 활성을 막기 위해, 약물 타겟 단백질을 분해시켜 아예 제거해 버리는 것이다.
따라서, 본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 DDX5 종양단백질에 정확하게 결합할 수 있는 약물로, 바로 선택적으로 단백질을 분해하는 분자접착제(molecular glue) 접근 방법을 통해, 표적치료제들의 내성 문제를 피할 수 있다.
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 이의 물리화학적 특성에 따라 표적 단백질인 DDX5 종양단백질에 결합강도가 결정되며, 너무 강하게 결합해 다시 이전의 상태로 돌아오지 못하는 비가역적 약물인 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 화학식 1에서 X1, (X2)n, X3, Y1, Y2 및/또는 Y3 변형을 통해 표적 단백질인 DDX5 종양단백질에 대한 결합강도를 제어할 수 있다.
본 발명에 따라 화학식 1로부터 설계되는 활성형 캄토테신 유도체는 기존 SN38 약물과 달리 DDX5 단백질과의 친화도가 높아 쉽게 떨어지지 않고 분자접착제(molecular glue) 기능을 통해 DDX5 단백질을 분해시켜 DDX5과 관련된 암세포의 신호전달을 비가역적으로 억제할 뿐만 아니라, 이의 물리화학적 특성에 따라 약물의 세포막 투과도를 원하는대로 조절하여, 주변세포살상효과 (bystander effect)를 발휘 또는 그 효과의 정도를 제어시킴으로써 주변세포살상효과가 높아서 비균질종양의 치료에 이점이 있을 뿐만 아니라, 장기간 암 진행을 억제하고, 내성 발현의 위험을 줄여 치료 반응률을 높일 수 있다.
[세포사멸 및 항암제의 약물내성]
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 세포 내에서 종양단백질(oncoprotein)로 작동하는 DDX5에 결합하여 DDX5 단백질 분해를 통해 세포사멸(cell death)을 유도할 수 있다(도 30).
종양의 성장을 결정짓는 데는 두 가지 요소가 있는데, 우선은 세포의 증식이며, 다른 면은 세포의 사멸이다. 세포독성물질에 의해 종양세포의 세포주기가 정지되면 apoptosis로 인해 종양세포가 죽게 된다.
세포사멸은 조직의 항상성과 형태의 유지, 세포수의 조절, 손상된 혹은 비정상적인 세포의 제거, 감염에 대한 방어기작으로써 무척 중요한 역할을 하며, 생명체는 세포의 성장, 분화 및 사멸과정을 정확하게 조절함으로써 그 생명을 정상적으로 유지한다.
세포자멸사(apoptosis)는 각종 유전자의 발현과 발현산물인 단백질의 활성화가 동반되어 세포의 사망을 유도하는 복잡한 과정으로 설명되고 있다. 이러한 세포자멸사는 세포내 생리적, 능동적 자살기전으로 다세포 생명체의 발달 및 분화와 항상성을 유지하는데 필수불가결한 역할을 한다. 세포자멸사는 많은 인자에 의해 다양한 종류의 세포에서 발생하며, 세포괴사와는 달리 리소좀(lysosome) 효소의 유리가 없고 세포자멸사체(apoptotic body)가 발견되며 세포의 축소, 핵의 농축 및 특징적인 사다리형 DNA 분절 등이 발견된다.
세포자멸사(apoptosis)는 동물의 정상적인 발달 프로그램의 일부이며 암 예방에 중요하다. 단백질 분해 효소 계열인 카스파제(caspases)는 세포 사멸에 관여하며 많은 표적 단백질을 절단한다. 세포 사멸이 손상되면 죽여야 할 세포가 생존하고 증식하여 잠재적으로 암이 될 수 있는 클론을 형성할 수 있다.
암 치료에서 본질적인 약물 내성은 세포 증식과 세포 사멸의 결정적인 조절자인 비정상적으로 발현된 전사 인자에 의해 야기될 수 있다. 따라서, 본 발명의 활성형 캄토테신 유도체는, 전자인자 보조인자이면서 종양단백질(oncoprotein)인 DDX5에 결합하는 분자 접착분해제(molecular glue degrader)로서의 작용기전을 통해 DDX5 단백질 분해 및 이로인한 세포사멸(cell death)을 유도할 수 있다. 이때, DDX5 단백질 분해는 항세포사멸 유전자(anti-apoptotic genes)의 전사를 하향조절할 수 있다. 따라서, 다른 표적치료제와 달리 비정상적으로 발현되는, 세포 증식 및/또는 세포 사멸 관련 전사 인자에 의해 야기되는 약물 내성이 잘 일어나지 않고/않거나, 화학요법 및/또는 방사선요법 동안 조절되지 않은 전사 인자의 활성화를 통해 유도되는 후천적 약물 내성을 억제할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 활성형 캄토테신 유도체의 항암기전은 암 치료 저항성의 분자 메커니즘을 우회할 수 있으므로, 약물 내성 문제에서 자유로울 수 있다. 내성이 발생하면 이전보다 치료 효과가 떨어지기 때문에, 본 발명의 활성형 캄토테신 유도체는, 암 진단 후 표준 치료제 또는 1차 치료제로 선호될 수 있다.
요컨대, 본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 암세포의 성장, 생존(cell survivor), 증식, 전이 및/또는 대사에 중요한 역할을 하는 DDX5 단백질에 작용하는 표적 항암제가 될 수 있다.
[캄토테신계 페이로드 기반 ADC(ADCs with Camptothecin Payloads)의 임상 결과 및 부작용]
Trastuzumab Deruxtecan (Enhertu)은 안정된 링커를 통해 캄토테신 유도체인 데룩스테칸에 연결된 인간화 항 HER2 항체이다. 첫 번째 1상 용량 증량 연구에서 HER-2 양성 진행성 또는 전이성 유방암, 위암 또는 기타 HER-2 발현 고형 종양 환자 22명을 대상으로 3주에 한 번씩 트라스투주맙 데룩스테칸 0.8 mg/kg ~ 8.0 mg/kg으로 치료했다. 용량 제한 독성은 관찰되지 않았으며 MTD에 도달하지 않았다. 목표 약물 노출은 권장 2상 용량으로 선택된 6.4 mg/kg의 용량에서 달성되었다.
중추적인 단일군 2상 임상시험인 DESTINY-Breast01 임상시험은 두 부분으로 구성되었다. 첫 번째 파트에서는 이전에 두 가지 이상의 항 HER2 요법으로 치료받은 적이 있는 진행성/전이성 유방암 환자를 무작위로 배정하여 트라스투주맙 데룩스테칸을 5.4 mg/kg(n = 50), 6.4 mg/kg(n = 48) 또는 7.4 mg/kg(n = 21) 용량으로 3주마다 한 번씩 투여했다. 두 번째 파트에서는 첫 번째 파트 1에서 얻은 효능 및 독성 데이터를 기반으로 134명의 환자에게 5.4 mg/kg 용량을 투여했다. 트라스투주맙 데룩스테칸 5.4 mg/kg으로 치료받은 184명의 환자 중 모든 등급(≥20%)에서 가장 흔하게 나타난 이상반응은 메스꺼움(77.5%), 피로(49.8%), 탈모(49. 8%), 구토(44.3%), 호중구 감소증(40.3%), 변비(37.5%), 빈혈(33.6%), 식욕 감소(33.2%), 설사(29.2%), 백혈구 감소증(26.9%), 혈소판 감소증(24.9%)이었다. 환자의 57.1%에서 3등급 이상의 이상 반응이 발생했으며 호중구 감소증(20.7%), 빈혈(8.7%), 메스꺼움(7.6%), 백혈구 감소증(6.5%), 림프구 감소증(6.5%), 피로(6.0%)가 가장 흔하게 나타났다. 이상 반응으로 인한 투약 중단, 투약량 감소, 치료 중단은 각각 35.3%, 23.4%, 15.2%의 환자에서 발생했으며, 폐렴(11명)과 간질성 폐질환(5명)이 가장 흔한 이유였다. 트라스투주맙 데룩스테칸으로 치료받은 환자에 대한 블랙박스 경고에 간질성 폐질환(ILD)과 폐렴이 포함되어 있다. 트라스투주맙 데룩스테칸으로 치료받은 환자의 9%와 2.6%에서 치료 관련 간질성 폐질환과 치명적인 결과가 각각 발생했다. 다른 HER-2 표적 ADC와 마찬가지로 Trastuzumab Deruxtecan으로 치료받은 환자도 배아-태아 독성 및 좌심실 기능 장애의 위험이 증가했다.
한편, Sacituzumab Govitecan (Trodelvy)은 pH에 민감한 링커를 통해 이리노테칸(SN-38)의 활성 대사산물에 연결된 인간화 항-TOP-2 IgG이다. 최초의 인간 대상 용량 증량 1/2상 임상 1상에서 다양한 전이성 고형 종양 환자 25명을 대상으로 21일 주기의 1일차 및 8일차에 사시투주맙 고비테칸을 8 mg/kg에서 18 mg/kg으로 투여했다. 첫 번째 사이클의 MTD는 12 mg/kg으로 결정되었으며 호중구 감소증이 용량 제한 독성으로 나타났다. 그러나 이 용량 수준은 후속 주기에는 너무 독성이 강하여 2상 임상시험에서는 8 mg/kg 및 10 mg/kg 용량을 선택했다. 이 임상 2상에서는 이전에 여러 치료를 받은 적이 있는 다양한 전이성 상피암 환자에게 사시투주맙 고비테칸을 8 mg/kg(n = 81) 또는 10 mg/kg(n = 97) 용량으로 투여했다. 8 mg/kg 및 10 mg/kg 코호트에서 보고된 모든 등급(≥25%)의 가장 흔한 이상 반응은 메스꺼움(59% 대 63%), 설사(53% 대 62%), 호중구 감소증(42% 대 58%). 58%), 피로(61% 대 52%), 구토(36% 대 43%), 빈혈(38% 대 42%), 탈모(46% 대 37%), 변비(33% 대 37%)가 각각 발생했다. 8 mg/kg 및 10 mg/kg 투여군에서 보고된 3등급 이상(≥10%)의 가장 흔한 이상 반응은 호중구 감소증(30% 대 36%), 빈혈(13% 대 12%), 설사(4% 대 10%), 백혈구 감소증(6% 대 12%)이었다. 8 mg/kg 및 10 mg/kg 코호트에서 각각 19%와 28%의 환자에서 용량 감소가 발생했다. 호중구 감소증은 용량 지연 또는 감소로 이어진 가장 흔한 이상 반응이었다. 10 mg/kg 코호트에서 첫 번째 투여 후 3등급 이상의 호중구 감소증을 경험한 환자가 8 mg/kg 코호트보다 훨씬 더 많았다(47% 대 21%).
중증 또는 생명을 위협하는 호중구 감소증과 중증 설사에 대한 블랙박스 경고가 사시투주맙 고비테칸 라벨에 추가되었다. 이러한 부작용은 방출된("유리") SN-38에 의해 매개될 가능성이 높으며, SN-38 전구 약물인 아이오노테칸과 동일한 독성이 연관되어 있기 때문이다. 사시투주맙 고비테칸으로 치료받은 전체 환자 중 모든 등급 및 3등급 이상의 호중구 감소증이 각각 61%와 47%에서 발생했다. 환자의 7%에서 열성 호중구 감소증이 발생했다. 사시투주맙 고비테칸으로 치료받은 전체 환자의 65%와 12%에서 각각 모든 등급 및 3등급 이상의 설사가 발생했다. 호중구 감소성 대장염은 환자의 0.5%에서 발생했다.
한편, 트라스투주맙 데룩스테칸(Enhertu)으로 치료받은 환자가 ILD/pneumonitis를 경험하는 경우, 코르티코스테로이드 치료(corticosteroid treatment)를 적용한다(https://www.enhertuhcp.com/en/gastric/manage-potential-risks/ild-and-pneumonitis).
코르티코스테로이드는 면역 반응의 다양한 측면을 조절하고 염증을 감소시킴으로써 면역 억제에 중요한 역할을 한다. 코르티코스테로이드의 작용 메커니즘은 과도한 면역 활동을 억제하고 면역 조절 장애가 발생하는 조건에서 장기 손상을 완화하는 데 기여한다.
면역 억제제, 특히 코르티코스테로이드는 자가 면역 질환, 이식 거부 반응, 체크포인트 차단 요법과 관련된 면역 관련 이상 반응(irAE) 등 다양한 임상 시나리오에서 과도한 면역 반응을 억제하고 장기 손상을 완화하는 데 널리 사용된다.
코르티코스테로이드 작용의 주요 메커니즘 중 하나는 전 염증성 유전자의 전사를 억제하는 능력이다. 면역 세포 내에서 코르티코스테로이드는 세포질의 특정 수용체에 결합하여 코르티코스테로이드-수용체 복합체를 형성한다. 이 복합체는 세포 핵으로 이동하여 표적 유전자의 프로모터에 위치한 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)로 알려진 특정 DNA 서열에 결합한다. 이렇게 함으로써 코르티코스테로이드는 전사인자 및 보조 인자의 모집을 방해하여 궁극적으로 전 염증성 유전자의 전사 활성화를 차단한다. 이로 인해 사이토카인(예: 인터루킨 및 종양괴사인자-알파) 및 프로스타글란딘과 같은 염증 매개체의 합성이 감소하여 조직 손상에 기여한다.
또한 코르티코스테로이드는 면역 세포 기능을 직접 조절할 수도 있다. 코르티코스테로이드는 내피 세포의 접착 분자의 발현을 감소시키고 면역 세포의 케모카인 수용체를 하향 조절하여 면역 세포가 염증 부위로 이동하는 것을 억제한다. 코르티코스테로이드는 또한 면역 반응의 중요한 매개체인 T 세포의 활성화와 증식을 저해한다. 항원 제시 과정과 공동 자극 분자의 생성을 방해하여 T 세포의 활성화를 약화시키고 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다. 또한 코르티코스테로이드는 B 세포의 기능을 억제하여 항체 생산을 감소시킨다.
따라서, 캄토테신계 페이로드 기반 ADC(ADCs with Camptothecin Payloads) 역시 면역 반응(경우에 따라서는 폐렴/ILD 부작용)을 유발하는 약물에 해당할 수 있다.
[항체-약물 접합체 (ADC)의 ADME 프로필]
항암제의 생체 내 효능(in vivo efficacy) 및 생체 내 부작용(in vivo side effects)은 ADC 및 이로부터 방출되는 페이로드의 흡수, 분포, 대사 및 배설(Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion, ADME) 특성에 의해 영향을 받을 수 있다. 약물의 ADME 프로필은 암세포에 도달하여 작용하는 능력에 영향을 줄 수 있다. 즉, ADC 및 이로부터 방출되는 페이로드의 ADME 특성은 생체 내 효능(in vivo efficacy) 및 생체 내 부작용(in vivo side effects)에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
종양 조직에 침투하는 ADC 및 이로부터 방출되는 페이로드의 능력은 혈류 및 세포 밀도를 포함한 종양의 미세 환경과 같은 요인에 의해 영향을 받을 수도 있다.
따라서, ADC 및 이로부터 방출되는 페이로드의 ADME 특성을 이해하고 약물/약물 모달리티 선택 및 용량/용법을 최적화하면 이러한 ADC 및 이로부터 방출되는 페이로드의 치료 지수를 개선하여 암 환자에게 더 나은 결과를 가져올 수 있다.
항체(Ab)와 항체-약물 접합체(ADC)는 서로 다른 구조와 작용 메커니즘으로 인해 서로 다른 수명(life time)과 ADME 프로필을 갖는다.
항체는 외부 물질(항원)에 반응하여 면역 체계에 의해 자연적으로 생성되는 큰 단백질이다. 크기와 복잡한 구조로 인해 순환 반감기가 길며(몇 주에서 몇 달) 분해 및 제거로부터 보호할 수 있다. 항체는 조직을 포함하여 신체 전체에 분포하며 높은 특이성과 친화력으로 표적 항원과 상호 작용할 수 있다. 항체들은 주로 간과 비장을 포함하는 세망내피계(RES)와 신장 및 기타 기관의 이화작용에 의해 제거된다.
ADC는 세포독성 약물 분자에 접합된 항체(일반적으로 단클론 항체)로 구성된다. 항체 성분은 종양 또는 질병 조직에 대한 특이성과 표적화를 제공하는 반면, 약물 성분(ADC로부터 방출되는 페이로드)은 표적 세포를 죽이는 세포독성 활성을 제공한다. ADC는 항체보다 짧은 반감기를 가지며 일반적으로 며칠에서 일주일에 이른다. 이는 ADC가 표적 세포로 내재화되어 ADC의 리소좀 분해 및 약물 페이로드의 방출을 초래하기 때문이다. ADC는 주로 RES에 의해 제거되지만, ADC에서 방출된 약물 페이로드는 림프 배출(drainage) 및 이어서 순환계를 통해 간과 신장에서 대사 및 배설(Metabolism and Excretion)을 겪을 수도 있다(실시예 4).
단일 클론 항체의 약동학 및 생체 분포에서 예상한 바와 같이, ADC에서도 세포막 단백질에 대한 고친화성 mAb 결합은 표적 세포 집단에 상당 부분의 mAb를 국소화할 수 있으며, 페이로드와 항암 mAb의 화학 접합은 페이로드가 암세포로 전달되는 선택성을 증가시켜 페이로드의 치료 지수를 증가시킨다.
항체는 일반적으로 피하 또는 정맥 주사로 투여되며 혈류로 흡수된다. 그들은 조직을 포함하여 몸 전체에 분포할 수 있지만 일반적으로 크기 때문에 세포외 공간으로 제한된다. ADC도 주사로 투여되어 혈류로 흡수되지만, 항체 성분으로 인해 종양 또는 질병 조직에 표적화 및 경우에 따라서는 수용체 매개 내재화(Receptor-mediated endocytosis)된 후 ADC에서 방출된 약물 페이로드는 이의 물리화학적 특성(예, 소수성, 크기, 응집여부)에 따라 세포와 조직으로 침투할 수 있고, 비선택적 흡수(non-selective uptake)를 통해 주변세포 살상효과(bystander effect)를 발휘할 수 있다(도 31). 나아가, ADC의 대사 및 배설은 특정 구조 (specific structure) 및 사용된 특정 약물 또는 항체(specific drug or antibody)에 따라 다르다.
약물항체 비율(drug-to-antibody ratio)인 DAR은 ADC 개발에서 약물동태학적 특성과 생체 내 분포를 결정하는 매우 중요한 특성이다.
DAR이 높은 ADC 일수록 in vitro 시험에서는 효능이 높게 나왔다. 그러나 정작 높은 DAR을 가진 ADC가 기대와 달리 생체 내 효능이 낮게 나오는데, 그 이유는 결합된 약물이 많은 ADC 일수록 혈장 청소율이 높기 때문인 것으로 추정되었다. 이에 따라 한동안 ADC 제제의 DAR 은 2~4 정도로 맞추어 왔다. 그로 인해 항체의 시스테인 또는 라이신 잔기에 대한 약물 결합 방식에 사용되는 기술이 주로 사용되고 있다.
주로 사용되는 상당수의 세포독성약물과 링커가 소수성(hydrophobicity)이기 때문에 ADC가 응집하거나, 표적 항원에 대한 친화력을 상실하거나, 혈장 청소율이 높아지는 등의 문제가 발생한다. Sulfonate 혹은 polyethylene glycol (PEG)을 함유한 친수성 링커는 소수성 링커로 인한 문제점을 해결해준다. PEG 링커는 수용성이며, 독성이 낮고 또한 면역원성이 낮은 장점이 있다.
DAR이 4 정도가 최적이라고 오랫동안 생각해왔었는데 사실 이는 MMAE나 DM1을 약물로 쓰는 2세대 링커에 해당되는 경우이며 3세대 링커에서는 DAR이 높은 것이 더 좋다. 근래에 승인된 ADC는 DAR 값이 거의 8에 달하는 것이 많으며, 현재 임상시험 중인 신규 ADC들은 DAR 값이 1에서 15 까지 다양하다.
캄토테신(Camptothecin) 기반 페이로드를 사용하는 ADC(Antibody-Drug Conjugates)는 다양한 암, 특히 고형 종양을 치료하기 위한 새로운 방식으로 높은 관심을 받고 있다. 이러한 ADC 중에서 특히 ADC 모달리티에 최적화된 새로 합성된 캄토테신 기반 페이로드(예: DXd)를 포함하는 새로운 ADC(예, 엔허투)는 성공적인 임상 결과로 인해 최근 특별한 관심을 받고 있다.
이러한 ADC의 성공은 부분적으로 새로운 캄토테신이 (1) 우수한 세포 성장 억제; (2) 기존 ADC 페이로드보다 더 나은 안전성 프로필; (3) 최적화된 방관자 효과; 및 (4) 높은 DAR ADC 생성에 적합한 우수한 물리화학적 특성과 같은 특징을 가지고 있다는 사실에서 기인한다. 그러나, Enhertu 또는 DS-1062a와 같이 캄토테신(Camptothecin) 기반 페이로드를 활용하는 ADC의 놀라운 성공에도 불구하고, 전술한 바와 같이 안전성 프로파일의 개선(간질성폐질환 (ILD) 및 호중구 감소증의 최소화) 및 암 이질성에 대처하기 위한 다중 MoA 페이로드가 있는 새로운 ADC의 개발을 포함하여 여전히 충족되지 않은 명확한 요구 사항이 있다.
이러한 충족되지 않은 요구 사항을 해결하기 위해, 본 발명은 분자접착제(molecular glue degrader)로 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체들을 다양한 물리화학적 특성을 제공하는 후보 약물로 제공하고, 나아가 화학식 1로 표시되는 새로운 캄토테신 기반 페이로드(PBX 시리즈 화합물들)를 합성하고(제조예 1 내지 제조예 4) 평가하였다(실시예 2 내지 실시예 10).
화학식 1로 표시되는 새로운 PBX 시리즈 화합물은 안전성 프로파일이 우수하고 강력한 이중 Top1/항세포사멸 경로 억제제인 화학식 2의 FL118을 모핵으로 한 유도체로, Dxd에 필적하는 강력한 ex-vivo 세포독성을 나타내며 마우스를 대상으로 한 예비 독성 연구에서 우수한 안전성 프로파일을 나타내고, PK 연구에서 빠른 제거를 나타낸다(실시예 4, 표 4 및 표 5). 이는 ADC의 페이로드로 사용시 링커가 조기에 절단될 때 전신 부작용을 최소화할 것이다.
pH 7.4에서 락톤 형태에서 카르복실레이트로의 전환 실험 결과인 도 17에 나타난 바와 같이(실시예 5), 혈중 또는 세포외액의 pH인 7.4에서 화학식 1로 표시되는 PBX-7014, PBX-7016 및 PBX-7024 화합물이 다른 reference 화합물들(엑사테칸, DXd, SN-38, FL118)에 비하여 더 빠를 뿐만 아니라 더 높은 비율로 lacton 형태(활성형)에서 TOP1　제해제로서 활성이 없는 carboxylate 형태(비활성형)로 변환되는 것을 확인하였다.
특히, 혈중　pH 7.4에서　TOP1　제해제로서 활성이 없는　carboxylate form의 형성 정도(63~86%)와 속도(0.4~0.8%/min)는 캄토테신 유도체 종류에 따라 차이가 크다(도 17). PBX-7014, PBX-7016은　86%　이상의　carboxylate form을 형성하고,　모두 분당　0.8%　수준으로 상대적으로 빠르게　lactone form에서　carboxylate form으로 전환되었다. 경쟁약물인　DXd는　76.5%　수준의　carboxylate form을 형성하고,　분당　0.6%　수준으로　lactone form에서　carboxylate form으로 전환되었다.
미세종양환경(TME)의　pH인　6.0에서　TOP1　저해제로서 활성을 갖는　lactone form의 형성속도(carboxylate form을 측정)는 모든 평가 약물들이 비슷한 수준(대략　800분 경과 후　20%　수준의　carboxylate form　형성)을 확인하였다(도 18).
이를 통해서 PBX-7014, PBX-7016 및 PBX-7024 화합물과 같이 화학식 1로 표시되는 화합물이 reference 화합물들에 비하여 상대적으로 혈중 또는 세포외액(종양조직 이외의 정상 조직)에서 빠르고 높은 비율로 세포독성을 보이는 활성형인 lacton이 아니라 불활성형인 carboxylate form을 형성함으로써 상대적으로 낮은 독성을 갖는 것으로, 즉 정상세포에서 높은 안전성을 보일 것으로 예측된다. 그러나, 미세종양환경에서는 화학식 1로 표시되는　PBX-7014, PBX-7016 및 PBX-7024 화합물 모두 다른　TOP1　저해제들과 동등 수준으로 활성을 갖는　lactone form을 형성함으로써 효력의 감소요인이 없다.
화학식 1로 표시되는 PBX 시리즈 화합물들 중 Trastuzumab(HER2 항체), Nimotuzumab, Sacituzumab을 포함한 다양한 항체에 연결된 ADC 페이로드로 추가 평가를 위해 2개의 선도 화합물인 PBX-7014 및 PBX-7016이 선택되었다.
Trastuzumab-7014 및 Trastuzumab-7016 (DAR 7-8)은, 엔허투(dxd-Trastuzumab)와 비교평가하기 위해 동일한 방식으로 PBX-7014 또는 PBX-7016을 Trastuzumab에 기존의 효소 절단 가능한 링커로 연결하여, 응집 문제 없이 쉽게 합성되었다(제조예 5, 도 19 및 도 20).
Her2-high 세포주(MDA-MB-453) 및 Her2-low/mid 세포주(FaDu)에서 이들 2개의 새로운 ADC는 DS-8201a(anti-HER2-DXd)보다 우수한 세포 독성을 보인 반면, Her2 음성 세포주(MDA-MB-468)에서는 DS-8201a와 비슷한 수준의 세포 독성을 나타냈다(실시예 7 및 도 22).
Her2 발현이 높은 NCI-N87CDX 모델에서 Trastuzumab-7014와 Trastuzumab-7016은 DS-8201과 동일 용량과 유사하거나 더 우수한 명확한 용량 의존적 항암 효능을 보였을 뿐만 아니라(실시예 8, 도 23 및 도 24), Trastuzumab-7016도 엔허투와 유사한 방관자 효과를 보인다(실시예 9, 도 25 및 도 26).
Trastuzumab-7014와 Trastuzumab-7016는 투여 후 종양조직에서 방관자 효과를 통해 20일 넘도록 종양 regression 효과를 발휘할 뿐만 아니라, 메틸기 하나 차이만으로도 서로 상이한 ADME를 발휘하여 표적화된 종양 조직에서 용량 의존적 항암 효능 차이(conc. vs. effect) 뿐만 아니라 시간에 따른 항암 효능 차이(effect vs. time)도 보였다(실시예 8, 도 23 및 도 24).
링커와 약물의 소수성이 증가되면, ADC의 응집력 증가와 이에 따른 약물의 치료계수감소와 같은 문제점을 야기된다. 놀랍게도, Trastuzumab-7016는 Trastuzumab-7014와 메틸기 하나 차이로 소수성이 증가함에도 불구하고, 용량 의존적 항암 효능(conc. vs. effect) 및 시간에 따른 항암 효능(effect vs. time)이 우수하였다(실시예 8, 도 23 및 도 24).
그러나, 경우에 따라서는 시간에 따른 항암 효능이 우수함이 부작용(만성 항원 노출로 인한 지속적인 T 세포 활성화 및 억제 신호 축적 및 이로부터 야기되는 T 세포 고갈(T cell exhaustion), 종양조직 주변 결합조직 유래 섬유아세포에 대한 주변세포 살상효과로 인한 부작용, ILD, 호중구 감소증) 역시 커질 수 있다. 예컨대, 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체의 약물 모달리티(small molecule vs. ADC)에 따라 특정 약물 농도(高)를 넘는 것이 중요할 수 있고, 경우에 따라서 특정 약물 농도(低) 이상으로 유지된 시간이 중요할 수 있으며, 원하는 정도의 소수성 제공 및/또는 응집을 제어함으로써 림프 배출(drainage)을 통해 빠르게 또는 천천히 제거되는 것이 중요할 수 있다.
따라서, 다양한 부작용 뿐만아니라 치료계수감소와 같은 문제점까지 고려하여, 적절한 항암 효능을 발휘하는 ADC의 페이로드의 선택 범위를, 분자접착제(molecular glue degrader)로 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체들을 포함하는 다양한 후보군으로 확장시킬 수 있게 하는 것도 본 발명의 주요 특징이다.
Enhertu 또는 DS-1062a와 같이 캄토테신(Camptothecin) 기반 페이로드를 활용하는 ADC의 놀라운 성공에도 불구하고 안전성 프로파일의 개선(ILD 및 호중구 감소증의 최소화) 및 암 이질성에 대처하기 위한 다중 MoA 페이로드의 후보로, 본 발명에 따라 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체를 다양하게 제공함으로써, 원하는 효능(예, 항암, 병용요법) 및 부작용(발암촉진 염증, 약물 내성, ILD, 호중구 감소증)을 정밀하게 제어할 수 있도록 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체들 중 하나 이상의 적절한 약물을 선택하고, 나아가 이에 적절한 링커를 선택하며, 적절한 용량(dose)- 용법(dosage)을 적용할 수 있다.
[ADC의 독성 프로필, 비선택적 흡수(non-selective uptake) 및 주변세포 살상효과(bystander effect)]
약물의 치료 지수(therapeutic index)는 약물 치료(medical treatment)에서 약물의 안전성과 효능(safety and efficacy)을 측정하는 척도이다. 치료 효과(therapeutic effect)를 일으키는 약물의 용량과 독성 또는 부작용(toxicity or adverse effects)을 일으키는 용량 사이의 비율로 정의된다. 즉, 약물의 치료 용량과 독성 용량 사이의 범위를 나타낸다.
치료 지수가 높다는 것은 유효 용량(effective dose)이 독성 용량(toxic dose)보다 현저히 낮은 넓은 안전 마진(wide margin of safety)을 나타낸다. 이는 심각한 부작용이나 독성을 유발하지 않고 치료 수준으로 약물을 투여할 수 있음을 의미한다. 치료 지수가 높은 약물은 일반적으로 임상에서 사용하기에 더 안전하고 바람직한 것으로 간주된다.
반면에 치료 지수가 낮다는 것은 안전성의 폭이 좁다는 것을 의미한다. 이러한 경우 유효 용량과 독성 용량이 상대적으로 가깝고 약물 사용 시 부작용이나 독성 위험이 높다. 치료 지수가 낮은 약물은 환자에게 해를 끼치지 않도록 신중한 모니터링과 정확한 투약이 필요하다.
치료 지수는 부작용의 위험을 최소화하면서 원하는 치료 효과를 제공할 수 있는 용량 범위를 결정하는 데 도움이 되므로 약물 개발에서 중요한 고려 사항이다. 약물을 처방할 때 유용한 정보를 제공하고 약물의 전반적인 유익성 대비 위험성(benefit-to-risk ratio)을 평가할 수 있게 해준다.
항체-약물 결합체(ADC)는 빠르게 성장하고 있는 항암 치료제로, 100개 이상의 ADC가 임상 연구 중이다. 현재 gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg), brentuximab vedotin (Adcetris), inotuzumab ozogamicin (Besponsa), trastuzumab emtansine (Kadcyla), polatuzumab vedotin (Polivy), enfortumab vedotin (Padcev), trastuzumab deruxtecan (Enhertu), sacituzumab govitecan (Trodelvy), belantamab mafodotin (Blenrep), loncastuximab tesirine (Zynlonta), tisotumab vedotin (Tivdak), and mirvetuximab soravtansine (Elahere) 등 12개의 ADC가 미국 식품의약국(FDA)에서 승인되었다, 나아가, 상대적으로 적은 수의 페이로드 분자(예: MMAE, MMAF, DM1, DM4, 칼리세미신, SN38, Dxd, PBD)가 대부분의 승인된 ADC 및 개발 중인 ADC에 사용되고 있다.
몇몇 ADC는 FDA 승인을 받을 만큼 충분한 효능과 안전성을 입증했지만, 모든 ADC를 임상에서 사용하면 치료받은 환자에게 상당한 독성을 유발하며 많은 ADC가 허용할 수 없는 독성 프로필로 인해 임상 개발 중에 실패했다. 이는 오프사이트 독성이 여전히 문제가 되어 내약성 있는 ADC 용량을 실질적인 항암 효능에 필요한 수준 이하로 제한하기 때문이다. FDA 승인을 받은 ADC의 경우에도 치료받은 환자 중 상당수가 ADC 관련 독성의 심각성을 줄이기 위해 보조 치료가 필요하며, 많은 환자가 용량 감소, 치료 지연 또는 치료 중단을 필요로 한다.
임상 데이터를 분석한 결과, 용량 제한 독성(dose-limiting toxicities, DLT)은 표적 항원 및/또는 치료 대상 암 유형에 관계없이 동일한 세포 독성 페이로드를 전달하는 여러 ADC가 공유하는 경우가 많다는 것이 입증되었다. DLT는 일반적으로 표적 항원을 발현하지 않는 세포 및 조직(즉, 표적 외 독성)과 관련이 있으며, 최적의 항암 효과에 필요한 수준 이하로 ADC 용량을 제한하는 경우가 많다.
ADC는 세포독성약물의 효력을 단독 약물로 사용할 때보다 안전하게 향상시킬 수 있는 잠재력이 있다. ADC는 항체에 약물을 달아서 항체가 특이적으로 병소부위만 타겟팅하도록 하여 약물이 정상조직에는 전달되지 않고 병소부위에만 전달되도록 한다. 암세포의 경우 암세포 표면에 발현된 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 독성이 강한 약물을 암세포에 특이적으로 전달하여 암세포만 사멸시키게 한다.
ADC가 작동하려면 ADC가 표적세포 내로 진입하여야 한다. 암세포와 같은 표적세포의 표면에 발현된 특정 항원에 ADC의 항체가 특이적으로 결합된 다음 세포막의 클라트린 피복 소공(clathrin-coated pit) 작동기전으로 표적세포 안으로 들어간다.
세포 내로 함입된 ADC는 클라트린에서 분리되고, 세포 내에서 다른 소포체(vesicles)와 융합된 다음, 엔도좀-리소좀(endosome-lysosome) 경로를 따라가게 된다. 엔도좀에 도달한 다음 이곳의 특이적인 종양세포 내부 환경의 특정 요소에 의해 항체에서 약물이 분리된다. 항체에서 떨어져 독립한 자유로운 세포독성약물은 리소좀 막을 관통하여 세포질로 가게 된다. 활성화된 약물은 주변에 있는 자기 자신의 분자 타겟에 결합함으로써 약리효과를 발휘하여 세포사멸을 유도하여 암세포를 죽이게 된다.
이러한 활동 가운데에서 일부의 세포독성약물은 수동적으로 확산되거나, 능동적으로 수송되거나, 혹은 죽은 세포를 통해 세포 밖으로 빠져나가게 된다. 이렇게 주변으로 퍼진 약물이 세포막으로 투과되면 인접세포에 들어가 주변세포도 같이 죽이는 주변세포살상 작용이 발생하기도 한다(소위 by-stander cell-killing 현상).
캐사일라의 DM1과 대조적으로 엔허투의 DXd는 막 투과성이 높았고 그 결과 세포 내부에서 방출된 페이로드가 표적 세포 근처에 인접한 HER2를 발현하지 않는 세포로 전달된다는 연구 결과 또한 보고됐다. 이는 엔허투가 페이로드의 특성으로 인해 잠재적인 방관자살상효과(bystander effect)를 가지고 허셉틴 혹은 캐사일라 불응성 환자에게도 임상적 이점을 제공할 수 있다.
상당수의 암 특이적 항원은 암세포의 표면에 제한적으로 발현된다. 이러한 경우 ADC로 충분한 양의 세포독성약물을 암세포 내로 전달하는 것이 쉽지 않아서 대안으로 독소의 강도를 높인다.
또한 항체에 영향을 적게 주면서 약물을 접합하여야 하기 때문에 운반할 수 있는 payload의 양은 한정적이다. 이는 ADC에 적용하기 위한 세포독성약물은 낮은 농도 (nM 또는 pM)에서 대부분의 종양세포를 죽일 수 있어야 하며, 약물 방출 조절이 되면서 치료효과를 나타낼 필요가 있음을 나타낸다.
ADC에 결합되는 세포독성약물로는 일반적인 항암제보다 강한 약물이 사용되었다. ADC에 결합된 세포 독성 약물(payload)의 효력(potency)은 독성 약물 단독으로 사용할 때의 효력보다 보통 100~1000 배 더 크다.
ADC에 도입된 강력한 세포독성약물 대부분은 독성이 너무 강하고, ADC에서 방출된 약물 페이로드는 주변세포 살상효과(bystander effect)로 인해 정상세포에도 영향을 미칠 수 있다(도 31).
따라서, 정상 세포에서 심각한 부작용을 유발하지 않으면서 표적 암 세포에 매우 특이적으로 작용하는 ADC를 개발하여야 한다.
결합조직의 일원인 섬유아세포(Fibroblasts)는 특히 유방암, 전립선암, 췌장암의 경우 간질(stroma)에서 우세한 세포이다.
암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblasts, CAF)라고도 하는 간질 섬유아세포(Stromal fibroblasts)는 종양 미세 환경 내에서 발견되는 특정 유형의 섬유아세포이다. 간질 섬유아세포는 종양의 성장, 침습 및 전이에 중요한 역할을 하기 때문에 큰 주목을 받고 있다. CAF는 파라크린 성장 인자, 단백질 분해 효소 및 ECM 성분의 생산을 담당한다.
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 약물은 세포막을 투과할 수 있는 소수성 저분자이므로, 암조직 심부까지 침투하면서 높은 농도로 축적 가능하고, 세포막을 관통해 세포 내부에서 세포독성을 발휘하여 세포 사멸시킨 후 방출되어 연속적으로 주변 세포에도 세포막을 관통해 세포내로 이동하여 작용할 수 있다. 이 경우, 주변세포살상효과가 높아서 비균질종양의 치료에 이점이 있을 수도 있으나, 경우에 따라서는, 자가면역질환의 일종인 ILD와 같은 캄토테신계 페이로드 기반 ADC 독성을 완화하거나 예방하기 위한 접근 방식(modality)을 제공하기 위해, ADC에서 방출된 캄토테신계 페이로드가 암세포 주변의 섬유아세포에 대해 주변세포 살상효과를 발휘하지 않도록, 예컨대 섬유아세포의 세포막 투과하지 않거나, IC50가 높거나, 림프 배출(drainage)을 통해 빠르게 제거되어 높은 농도로 축적되지 않는 페이로드를 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체들을 포함하는 다양한 후보군으로부터 설계/선택할 수 있다. 나아가, 이의 용량-용법을 적절히 적용하여, 원하는 효능(예, 항암, 병용요법) 및 부작용(만성 암항원 노출, 약물 내성, ILD)을 정밀하게 제어할 수 있다.
또한, 페이로드인 캄토테신계 약물의 치료 지수(therapeutic index)를 높이면서 세포사멸된 세포에서 방출된 캄토테신계 약물 및/또는 ADC의 비선택적 흡수(non-selective uptake)를 억제하도록, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 약물 후보군에서 ADC의 페이로드를 선택할 수 있다. 예컨대, 낮은 농도의 약물(페이로드)에서 표적 암세포의 살상효과가 높은 캄토테신계 약물을 화학식 1로 표시되는 후보 약물로부터 선택함으로써, ADC의 페이로드의 총 농도를 낮추는 ADC 투여량을 통해, 도 31에 도시된 바와 같아, 사멸 세포에서 방출된 유리형 약물(페이로드)의 정상세포에 대한 주변세포살상 작용 (by-stander cell-killing 현상)을 억제하거나 표적/비표적 세포 사멸 세포에서 방출된 유리형 캄토테신계 약물(페이로드)의 off-target toxicity의 문제를 극복할 수 있다.
[암세포 또는 종양조직 주변 결합조직의 일원인 섬유아세포의 세포사멸 및 이로부터 야기되는 면역반응]
화학식 1로 표시되는 캄토테신계 화합물은 SN-38와 달리, 내성 기전에 관여하는 내성 단백질인 Survivin 등 Bcl family를 억제하거나 c-Myc, survivin 및 mutant Kras를 제어하는 oncoprotein DDX5 (p68)에 결합하여 분해하는 저분자 약물이다.
또한, 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 화합물은 DDX5 단백질을 분해하는 캄토테신계 세포독성약물은 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된 것으로, 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 작용기전(MoA)를 통해 세포를 사멸시킬 수 있다.
세포사멸을 조절하는 신호전달 경로는 다양한 단백질에 의해 엄격하게 조절되고, DNA 손상, 산화 스트레스 및 성장 인자 결핍과 같은 다양한 내부 또는 외부 자극에 의해 활성화될 수 있는 세포내 신호전달 경로의 복잡한 네트워크이다. 이러한 경로의 조절 장애는 암 및 신경퇴행성 장애를 비롯한 다양한 질병을 유발할 수 있다.
세포 사멸을 조절하는 주요 신호 경로는 모두 다양한 세포 기질을 절단하고 궁극적으로 세포 사멸을 초래하는 시스테인 프로테아제 계열인 카스파제의 활성화에서 수렴한다. Caspase 활성화는 Bcl-2 계열의 단백질을 비롯한 다양한 단백질에 의해 엄격하게 조절되며, 이는 세포자멸사를 촉진하거나 억제할 수 있다.
Bcl-2 단백질 계열에는 각각 세포자살을 촉진하거나 억제할 수 있는 pro-apoptotic 및 anti-apoptotic 구성원이 모두 포함된다. pro- 및 anti-apoptotic Bcl-2 계열 구성원 간의 균형은 세포의 운명과 세포 사멸에 대한 민감도를 결정하는 데 중요하다.
p53 경로 및 PI3K/Akt 경로와 같은 다른 신호 경로도 세포사멸을 조절할 수 있다. p53 경로는 DNA 손상에 반응하여 활성화되고 Bax 및 Puma와 같은 pro-apoptotic 유전자의 전사로 이어진다. 반면에 PI3K/Akt 경로는 Bad 및 Bim과 같은 프로-아폽토시스 단백질을 인산화 및 비활성화하여 아폽토시스를 억제할 수 있다.
일부 형태의 괴사(necroptosis)는 감염이나 DNA 손상과 같은 자극에 대한 프로그래밍된 세포 반응일 수 있다.
면역원성 세포사멸은 암세포가 손상을 받아 사멸하는 과정에서 세포 표면의 변화, 암항원 및 손상-관련 분자 패턴의 방출 등을 수반한다. 방출된 면역유도물질들은 면역세포인 수지상세포와 대식세포를 자극하여 항종양 면역 반응을 유도할 수 있다.
세포자멸사(Apoptosis)는 손상되거나 노화된 세포가 스스로 죽는 방법의 한 종류로, 다양한 세포 내 물질들의 변형 및 분해가 수반된다. 이 과정에서 암 세포에 대한 체내 면역을 유발하는 암 항원, 손상-연관 분자패턴 (DAMP) 등의 면역유발 물질들이 단백질 분해효소, 산화 등에 의해 손상되어 치료 후 잔존하는 암이나 전이 암에 대한 면역치료 효과가 제한적일 수 있다.
화학항암제에서 발생하는 활성산소종에 의한 세포사멸은 주로 단백질 분해효소인 카스파아제(caspase)가 관여하는 세포자멸사(apoptosis)이다.
세포막을 붕괴시켜 스스로 사멸하는 괴사의 일종인 네크롭토시스(necroptosis)는 카스파아제 등 분해효소가 관여하는 자멸사(apoptosis)와 달리, 단백질 분해나 산화 등이 일어나지 않아 암 표지자나 면역유발물질의 손상을 최소화할 수 있다.
손상-연관 분자패턴(Damage-associated molecular patterns, DAMPs)은 세포사멸 과정에서 방출되는 세포 내의 면역 반응을 유발할 수 있는 분자들로서 면역세포를 자극한다. 대표적으로 calreticulin, heat shock protein 70/90, high-mobility group box 1, ATP 등이 있다.
한편, 염증은 감염이나 부상에 대한 신체의 자연스러운 반응으로 염증성 사이토카인의 방출과 영향을 받는 부위로의 면역 세포 모집을 포함한다. 또한, 염증이 오래 지속되면 조직을 손상시키고 암 발병 위험을 높일 수 있다.
암과 관련하여 만성 항원 노출(chronic antigen exposure)로 인해 T 세포 고갈(T cell exhaustion)이 발생할 수도 있다. 종양 세포는 T 세포가 인식할 수 있는 항원을 발현하지만 이러한 항원에 지속적으로 노출되면 T 세포가 고갈될 수 있다. 이로 인해 항종양 반응이 약화되어 종양이 자라고 퍼질 수 있다.
전반적으로 T 세포 고갈, 만성 항원 노출 및 질병 사이의 관계는 복잡하고 다면적이다.
캄토테신계 페이로드 기반 ADC(ADCs with Camptothecin Payloads)의 임상 결과 및 부작용과 관련해서 전술한 바와 같이, 캄토테신계 페이로드 기반 ADC(ADCs with Camptothecin Payloads) 역시 세포사멸을 통해 면역 반응(경우에 따라서는 폐렴/ILD 부작용)을 유발하는 약물에 해당할 수 있다.
본 발명의 일양태는 (a) DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 상기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)을 암세포의 세포사멸을 통해 항원제시세포(APC)를 자극하여 항종양 면역 반응을 유도할 수 있는 용법(dosage)으로 투여하는 것이 특징인 항암 제형을 제공한다.
여기서, 항원제시세포(APC)는 수지상세포와 대식세포일 수 있다.
또한, 본 발명의 일양태는 만성 항원 노출(chronic antigen exposure)로 인해 T 세포 고갈(T cell exhaustion)이 발생하지 않도록 또는 원하는 정도의 소수성 제공 및/또는 응집을 제어함으로써 림프 배출(drainage)을 통해 빠르게 또는 천천히 제거되도록 활성형 캄토테신 유도체(a)의 주변세포 살상 효과 (bystander effect) 및/또는 ADME 프로필이 제어된 활성형 캄토테신 유도체(a) 기반 항암제의 제조방법으로서,
활성형 캄토테신 유도체(a) 기반 항암제는 (a) 분자접착제(molecular glue degrader)로 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 활성형 캄토테신 유도체; 또는 (b) 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 이의 프로드럭, 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC);을 함유하는 항암 제형이고,
활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b)가 상기 화학식 1로 표시되는 캄토테신계 골격을 모핵으로 포함하도록 설계하거나, 이렇게 설계된 화합물을 선택하거나, 이렇게 설계된 화합물을 합성하는 단계를 포함하는 것이 특징인 항암제 제조방법을 제공한다.
Trastuzumab Deruxtecan (Enhertu)의 임상 결과 및 부작용과 관련해서 전술한 바와 같이, 캄토테신계 페이로드 기반 ADC에 의해 야기될 수 있는 항암 세포 매개 작용(cell-mediated action)은 면역 시스템을 통해 암 세포를 타겟으로 하는 치료법을 제공할 수 있다. 항암 세포 매개 작용은 주로 T 세포와 자연 살해 세포(NK 세포)를 이용하여 암 세포를 공격하는 것을 의미한다.
Trastuzumab Deruxtecan (Enhertu)에 의해 야기되는 항암 세포 매개 작용은 암 치료에 매우 유용한 방법이지만, 종종 부작용이 발생할 수 있다. 부작용 중에서 가장 흔한 것은 자가면역 질환의 발생이다. 자가면역 질환은 면역 시스템이 실수로 자신의 정상적인 조직을 공격하는 상태를 의미한다.
항암 세포 매개 작용 치료를 받는 동안 자가면역 질환의 발생 가능성이 있으며, 이는 항암 세포 매개 작용이 암 세포 뿐만 아니라 정상 세포도 공격할 수 있기 때문이다. 일반적인 부작용으로는 면역 반응을 유발하는 약물에 의한 염증, 피로, 발진, 발열 등이 포함될 수 있다. 그러나 심각한 자가면역 질환의 경우 피부, 관절, 신장, 간, 폐 등 다양한 조직과 장기에 영향(예, ILD)을 줄 수 있다.
캄토테신계 페이로드 기반 ADC에서 방출된 캄토테신계 페이로드가 표적세포 세포사멸 뿐만 아니라, 주변세포살상효과가 높아서 비균질종양의 치료에 이점이 있을 수 있으나, 경우에 따라서는 종양조직 주변 결합조직 유래 섬유아세포의 세포사멸에 의해 ILD와 같은 자가면역질환이 발생할 수 있다.
이러한 점들을 고려하여, Trastuzumab-7016는 Trastuzumab-7014와 메틸기 하나 차이로 소수성이 증가함에도 불구하고, 용량 의존적 항암 효능 및 시간에 따른 항암 효능이 우수하였으나(실시예 8, 도 23 및 도 24), T 세포 고갈, ILD, 및/또는 호중구 감소증과 같은 부작용 측면에서, 주변세포살상효과 제어를 위해 낮은 농도/투여용량의 Trastuzumab-7016 뿐만 아니라 Trastuzumab-7014로 치료하는 것이 요구될 수 있다.
약의 특성을 알아야 약을 제대로 사용할 수 있다. 약의 특성을 이해하는데 약물의 약력학, 약동학적 파라미터는 도움을 준다.
약력학은 약이 수용체에 결합한 후 일어나는 세포나 몸에서 일어나는 변화(약효, effect) (cell viability, clinical effect)(therapeutic action, toxic effect, adverse effect )의 크기와 양상을 약물농도와의 관계로 설명한다.
PK(Pharmaco-kinetics)는 약물 또는 약물의 모달리티에 따라 ADME을 통해 신체의 다른 구획(Compartment)을 통해 이동할 때 약물 농도는 어떻게 변하는지를 보여준다. 실시예 8, 표 6, 도 23 및 도 24는 다양한 약물/모달리티에서 시간에 따른 종양 조직 내 활성형 캄토테신 유도체(a)의 약물농도를 예측할 수 있다.
약동학적 측면에서 신약 개발시 실패이유는, 캄토테신계 페이로드 기반 ADC에서 방출된 캄토테신계 페이로드와 같이, 독성 약물(Toxic drugs)이 축적될 수 있으며, 유용한 약물(Useful drugs)은 치료를 확립하기에는 복용량(doses)이 너무 적기 때문에 이점이 없을 수 있고, 약물이 빠르게 대사될 수 있기 때문이다.
따라서, 약을 제대로 사용하기 위해, 예컨대 림프 배출(drainage)을 통해 주변세포살상효과를 제어하도록 화학식 1의 캄토테신계 페이로드의 소수성 및/또는 응집을 제어하기 위해, 적절한 화학식 1의 캄토테신계 페이로드를 선택할 뿐만 아니라, 적절한 용량(dose)-용법(dosage)을 적용하여야 한다.
용량(Dose)은 한 번에 투여되는 약물의 양을 나타낸다. 약물의 용량은 일반적으로 환자의 나이, 체중 및 건강 상태와 같은 요인에 따라 의료 제공자가 처방한다. 반면, 용법(Dosage)은 약물 투여 빈도와 기간을 나타낸다. 일정 기간 동안 주어진 총 약물 양을 측정한 것으로 일반적으로 일일 또는 주간 양으로 표시된다. 용량(Dose)과 용법(Dosage)은 약물의 안전하고 효과적인 사용에 중요한 고려 사항이다.
이러한 측면에서, 본 발명은 분자접착제(molecular glue degrader)로 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하는 다양한 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체들을 다양한 약물 후보로 제공함으로써, 하나 이상의 적절한 약물을 선택 및 이의 용량-용법을 적절히 적용하여, 원하는 효능(예, 항암, 병용요법) 및 부작용(만성 암항원 노출, 약물 내성, ILD)을 정밀하게 제어할 수 있다.
예컨대, 화학식 1의 활성형 캄토테신 유도체는 약물 모달리티(small molecule, ADC)에 따라 비균질종양세포 및/또는 종양조직 주변 결합조직 유래 섬유아세포의 세포사멸 측면에서 주변세포살상효과를 제어하도록 종양조직 내에서 특정 약물 농도(高)를 넘는 것이 중요할 수 있고, 경우에 따라서 종양조직 내에서 특정 약물 농도(低) 이상으로 유지된 시간이 중요할 수 있으며, 림프 배출(drainage)을 통해 빠르게 또는 천천히 제거되는 것이 중요할 수 있다. 이는 적절한 화학식 1의 캄토테신계 페이로드를 선택하여, 원하는 정도의 소수성 제공 및/또는 응집을 제어함으로써, 구현할 수 있다.
[프로드럭(pro-drug)]
본 명세서에서, 프로드럭은 미리 결정된 생리학적 환경에 배치된 후 생물학적으로 활성화되거나 더 활성화되는 프로드럭(pro-drug)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, 생리 활성 물질(physiologically active substance) 또는 치료적 활성 유기 화합물(therapeutically active organic compound)을 화학적으로 수식하고, 생체 내에서 효소적 또는 그 외의 조건하에서 모 화합물(parent compound)을 유리 혹은 방출하도록 설계된 화합물을 의미한다. 프로드럭은 투여후에 생체내에서 목적으로 하는 화합물로 변화된다. 유용한 약물임에도 불구하고 부작용, 안정성, 용해성, 흡수성, 작용시간 등에서 적합치 않는 성질을 가지고 있는 것에 화학적 수식을 가해서 임상사용 가능하게 한다.
프로드럭의 일례로, 암 세포 표면에 발현하고, 또한 세포에 내재화할 수 있는 항원에 결합하는 항체에, 세포 독성이 있는 약물을 결합시킨 항체-약물 접합체(ADC)는, 암 세포에 선택적으로 약물을 송달할 수 있는 것에 의해, 암 세포 내에 약물을 축적시켜, 암 세포를 사멸시키는 것을 기대할 수 있다.
ADC를 구성하는 요소 중 항체와 세포 독성 약물을 결합시키는 것이 링커이다.
링커는 혈류에 안정(stable)하여 약물이 항체로부터 분리되는 것을 막아 타겟에 도달할 때까지 prodrug 상태로 유지되어 정상적인 조직에 입히는 피해를 최소화해야 한다. 가장 이상적인 링커는 ADC가 전신 순환될 때는 안정하면서도 표적 세포에서는 절단되어 세포 독성 약물을 적절히 방출시켜 약물을 표적에 안전하게 전달하여 ADC가 효능과 안전성을 동시에 갖도록 하는 것이다.
링커로 약물을 항체에 결합할 때, 약물이 항체의 구조적 안정성과 기질 결합특성과 약물동태에 영향을 주지 않아야 한다. 초창기 ADC 약물이 실패한 원인 중의 하나는 약물의 조기 방출로 알려져 있다.
현재 임상시험 중인 상당수의 ADC는 hydrazone, disulfide, peptide 또는 thioether 결합 등 화학적 링커를 채택하고 있다. 링커에서 약물을 방출하는 과정은 암세포 내의 특정한 pH나 효소 농도 등의 차이를 이용한다. 보통 hydrazone과 disulfide 링커는 혈장 내에서 안정성이 제한되어 있다. 반면 펩타이드 기반의 링커는 혈장 내 안정성이 우수하고 약물 방출 조절도 용이하다.
일부 화학적 링커는 항체와 약물의 소수성(hydrophobicity)의 균형을 조절하여 친수성 환경인 혈류 내에서 ADC의 응집을 방지한다. 친수성 링커와 스페이서(spacer)에는 cyclodextrin, polyethylene glycol (PEG) 또는 다른 중합체가 있는데, 혈류 내의 안정성과 약물동력학적 특성에 역할을 한다.
ADC에 사용된 링커는 절단능력에 따라 비절단성과 절단성으로 나누어진다.
비절단성 링커(Non-cleavable linker)는 Thioether 링커가 대표적인데 절단성 링커와 비교하여 상대적으로 높은 혈장 안정성을 가지고 있으며 단백질분해에 저항적이다. 비절단성 링커는 절단성 링커와는 다르게 링커 자체의 분해가 일어나지 않기 때문에 ADC 형태로 세포내 도입 이후에 항체의 분해가 이루어져야 약물의 방출이 가능한 특성을 갖고 있다.
이렇게 방출된 약물은 전하를 띠며 주변 세포로 확산(bystander effect, 방관자 효과)이 일어날 가능성이 낮다. 주변 세포에 대한 독성은 나타내는 방관자 효과는 없지만 표적 세포 내재화 후 표적 세포에만 효과가 나타나기 때문에 상대적으로 안전성이 높다는 것을 의미하며 비절단성 링커에 의해 제조된 ADC는 표적 세포내 생물학적 기전에 더 의존적임을 알 수 있다. 많은 연구에서 비절단성 링커를 갖는 ADC가 높은 안정성과 효능을 보여 ADC 개발을 위한 링커로 활용되고 있으며 현재 이 기술이 적용된 ADC는 Kadcycla®가 있다.
절단형 링커는 특정 환경요소에 반응하여 절단되어 약물을 세포질로 방출한다. 절단형에는 효소 절단형과 비효소 절단형이 있다.
효소 절단형은 cathepsin B, β-glucuronidase, phosphatase, pyrophosphatase, sulfatase와 같은 효소에 의해 절단된다.
Peptide 링커는 단백질 분해효소에 의해 분해되며, 혈장 내에서는 단백질 분해효소 억제제가 존재하여 혈장 안정성이 높다. ADC에 이용되는 단백질 분해효소로는 cathepsin B가 대표적이다. Cathepsin B는 종양조직에서 높은 수준으로 존재하여 ADC에게 종양 선택성을 준다. Peptide 링커는 주로 아미노산 두 개를 붙인 dipeptide로 개발되고 있으며 애드세트리스(Adcetris®)에 적용되었다.
Peptide 링커는 ADC가 내재화되면 리소좀 내 단백질 분해 효소에 의해 인식되고 절단되는 dipeptide 또는 tetrapeptide로 구성된다. Tetrapeptide는 개발 초기에 사용되었으며 비교적 느린 약물 방출 및 소수성 약물과 결합하여 응집이 일어날 수 있는 한계가 나타났다. 이러한 문제는 Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys 및 Val-Ala과 같은 dipeptide linker의 개발로 해결되었으며 Adcetris®, Vedotin®과 같은 몇몇 ADC에 성공적으로 적용되었다.
β-glucuronide 링커는 리소좀 내에 존재하는 당분해효소인 β-glucuronidase에 의해 분해된다. β-glucuronidase는 일부 종양세포에서 과발현되어 종양 특이성을 준다. 이 효소는 낮은 pH에서 활성이 높으나 중성 pH에서는 10 %로 떨어지는데 이러한 특성으로 인해 β-glucuronide 링커를 가진 ADC는 혈장에서의 안정성이 향상되어 표적 외에서 약물이 방출되는 것을 방지한다.
비효소 절단형에는 산 불안정 링커(acid-labile linker)와 산화환원반응 링커(oxidation-reduction reaction linker)가 있다.
Acid-labile 링커는 화학적으로 불안정한 링커로 ADC 개발 초기에 개발되어 안정성이 낮지만 지금도 사용되고 있다. 대표적인 링커는 hydrazone 링커로 혈액의 중성 환경인 pH 7.3~7.5에서는 안정적이지만 종양세포 주변 (pH 6.5~7.2)이나 세포내 내재화가 일어나 엔도좀 (pH 5.0~6.5)과 리소좀(pH 4.5~5.0)같은 약산성 환경에서 가수분해되어 약물을 방출하는 메커니즘을 갖고 있다. 그러나 산성 상태는 종양 미세환경에 국한되어 있지 않고 종종 세포외부에서도 발견되기 때문에 비특이적 약물 방출이 일어날 수 있다.
산화환원반응 링커는 disulfide 링커가 대표적이다. Disulfide 링커도 화학적으로 불안정한 링커의 한 종류로 산화-환원 반응을 기반으로 한다. 내재화된 후 이황화 교환이나 glutathione과 같은 환원제에 의해 링커가 분해되면서 세포독성약물을 방출한다.
글루타티온(glutathione)은 저분자량 티올로 세포 증식 및 사멸 조절을 하며 염증 및 산화 스트레스 등으로부터 세포를 보호하는 항산화제로 알려져 있다. 글루타티온은 세포내에서 0.5~10 mM의 농도로 존재하나 저산소 상태인 종양에서는 최대 1000배 높은 농도로 존재한다. 혈장에서는 낮은 농도(2~20 μM)로 존재하여 disulfide 링커는 높은 혈장 안정성을 가짐으로써 비특이적 약물방출이 줄어들어 상대적 안전하게 종양 특이적으로 반응하는 링커이다.
어떤 링커를 사용하는지에 따라 세포 독성 약물의 효율적인 방출에 영향을 주게 된다.
링커의 개발은 단일 클론 항체(mAb)의 장점인 긴 반감기를 반영하여 mAb가 전신 순환 중에는 안정해야 하며, 링커와 세포 독성 약물의 결합이 항체의 안정성 및 약물동태에 영향을 주지 않는 것이 중요하다.
일반적으로, 링커-세포독성 약물 관련 전신 혈액 순환 중 발생할 수 있는 이화 작용들은 다음과 같으며, 그 외에도 밝혀지지 않은 다양한 이화작용들이 있다: 히드라존기 절단(hydrazone cleavage), 단백분해 효소 매개 디펩티드 절단(protease-mediated dipeptide cleavage), 에스터기 분해효소 매개 카바메이트 절단(esterase-mediated carbamate cleavage), 아세테이트 에스터 가수분해(hydrolysis of acetate ester), 이황화 절단(disulfide cleavage), 석신이미드 고리 개방(succinimde ring opening).
링커-세포독성 약물의 특정 위치에서 발생하는 이화 작용은 경우에 따라 세포독성 효과를 유지하여 표적에서 활성을 나타내기도 하며, 전신 혈액 순환 중에서는 독성을 일으킬 수 있다. 반대로 세포독성 효과를 잃어버리는 경우 약물이 표적에 도달할지라도 약리 효과를 기대하기 어려울 수 있다. 예를 들어 splicesome 억제제로서 payload로 개발된 thailanstatin의 경우 에스터기 가수분해가 일어나도 활성을 유지하는 반면, tubulin inhibitor인 cyptophycin이나 tubulysin의 경우 에스터기 가수분해가 일어날 경우 활성을 잃어버린다.
표적으로 이동하는 동안의 ADC 안정성은 절단성, 비절단성 링커 등 어떤 종류의 링커를 사용하던지 간에 원하는 치료 지표를 달성하는데 아주 중요하다.
본 발명에 따라 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a)의 프로드럭의 일례는 후술한 DE-310에서 엑사테칸 대신 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a)을 사용한 것일 수 있다.
WO97/46260(이에 대응하는 한국 등록 10-2087017 B1)에 기재된 바와 같이, DE-310은 생분해성의 카르복시메틸덱스트란폴리알코올폴리머에 엑사테칸을 GGFG 펩티드 스페이서를 개재하여 결합시킨 복합체이다. 엑사테칸을 고분자 프로드러그화함으로써, 높은 혈중 체류성을 유지시키고, 또한 종양 신생 혈관의 투과성의 항진과 종양 조직 체류성을 이용하여, 수동적으로 종양 부위에 대한 지향성을 높인 것이다. DE-310 은, 효소에 의한 펩티드 스페이서의 절단에 의해, 활성 본체인 엑사테칸, 및 글리신이 아미노기에 결합하고 있는 엑사테칸이 지속적으로 유리된다. 그 결과, 약물 동태가 개선되어, 비임상 시험에 있어서의 여러 가지의 종양의 평가 모델에 있어서, DE-310 은 엑사테칸의 투여량이 엑사테칸 단제의 투여 시보다 감소하고 있는데도 불구하고, 엑사테칸 단제의 투여 시보다 더 높은 유효성을 나타냈다. DE-310에 관해서는 임상 시험이 실시되어, 인간에게 있어서 유효예가 확인되고, 활성 본체가 정상 조직보다 종양에 집적하는 것이 확인되었다는 보고가 있는 한편, 인간에게 있어서의 종양에의 DE-310 및 활성 본체의 집적은 정상 조직에의 집적과 큰 차이 없고, 인간에서는 수동적인 타게팅은 보이지 않았다는 보고도 있다.
DE-310의 관련 화합물로서, -NH(CH2)4C(=O)- 로 나타내는 구조 부분을 -GGFG- 스페이서와 엑사테칸의 사이에 삽입하고, -GGFG-NH(CH2)4C(=O)- 를 스페이서 구조로 하는 복합체도 알려져 있다.
본 발명에 따라 DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a)의 프로드럭의 일례는 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 링커 및/또는 스페이서를 포함하는 것일 수 있다.
Self immolative spacer의 비제한적인 예는 도 32에 예시되어 있다.
본 발명에 따라, DDX5 단백질 및 E3 리가아제에 결합하도록 설계된, 하기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체, 예컨대 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9의 캄토테신계 약물은 다양한 운반체-약물 접합체 (Carrier-Drug Conjugate)용 Payload로 사용가능하다. 즉, 활성형 캄토테신 유도체가 Payload로 연결된 다양한 운반체-약물 접합체는 생체내에서 활성형 캄토테신 유도체를 방출시키는 활성형 캄토테신 유도체의 일종의 프로드럭이다. 이에 따라 본 발명은 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체인 화합물, 바람직하게는 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물을 포함하는 운반체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명에 따른 운반체-약물 접합체에 있어, 상기 운반체(Carrier)는 항체, 펩타이드, 리피바디, 및/또는 압타머일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프로드럭의 일종인 항체-약물 접합체(ADC)은 본 발명의 활성형 캄토테신 유도체(a)를 생체내에서 방출하도록 설계된, 항체 또는 이의 항원결합부위 함유 단편을 포함하는 면역접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
ADC에 사용되는 단일클론항체로는 IgG1, IgG2, IgG4가 사용되는데 이중 IgG1이 가장 많이 사용된다. 전통적인 ADC에서는 온전한 전체 크기의(full length) 항원이 사용되었다. 흡수와 투과를 증진시키기 위한 전략으로 보다 작은 Fab, scFv, diabody를 단일클론항체 대신 사용하는 것이 시도되고 있다.
본 발명의 면역접합체는 암 세포의 항원에 특이적으로 결합하고 암 세포 내외에서 약물을 방출하여 세포 독성을 나타내므로, 암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
예컨대, 항체-약물 접합체(ADC)는 암세포의 표면에 발현된 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 높은 조직 선택성을 이용하여 강한 항암 효능을 가진 페이로드(payload)를 암 조직에만 선택적으로 전달하는 신약 플랫폼이다. ADC는 pM 수준의 낮은 농도에서도 암세포를 사멸하는 강력한 Payload를 암 조직에만 선택적으로 전달하고, 전신으로의 약물 노출은 최소화하여 항암 효능과 안전성을 동시에 확보할 수 있다.
대부분 ADC의 세포 내 도입은 clathrin-coated pit 기능으로 진행된다. 세포 내로 이동된 ADC는 clathrin에서 떨어지고 세포 내 다른 vesicles와 융합한 다음 endosome-lysosome 경로로 진행된다. 이어서 endosomes의 산성 환경에 있는 proteases가 링커를 절단하고, 활성화(active)된 “free” 약물은 lysosomal membrane을 통과하여 cytoplasm로 이동한 후 약물의 molecular 타겟에 결합함으로써 종양세포의 세포주기는 정지되고 apoptosis로 인해 암세포가 죽게 된다. 이중 일정 양의 약물은 세포에서 수동적 확산되거나(passive diffusion), 능동적으로 수송되거나(active transport), 또는 죽은 세포를 통해 세포 밖으로 유출된다. 이때, 유출된 약물이 세포막 투과성을 지니면 주변 세포에도 들어가 소위 by-stander cell-killing 현상이 일어날 수도 있다.
압타머-약물 접합체(Aptamer-Drug Conjugate, ApDC)는 ADC의 항체 대신 압타머를 도입한 것이다. 압타머는 3차원 입체구조를 갖는 단일 가닥 핵산이다. 'SELEX'(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 과정을 통해 발굴된다. 셀렉스는 화합물 라이브러리에 표적하는 단백질 분자를 넣어 이와결합하는 기능성 핵산을 얻는 기술이다.
압타머는 표적에 매우 강력하고 선택적으로 결합할 수 있어 화학적 항체(chemical antibody)라고도 불린다. 압타머는 20kDa 정도의 크기이며, 항체에 비해 우수한 세포 침투성과 낮은 면역원성을 가진 것으로 알려져 있다.
압타머는 화학적 합성이 가능하므로 압타머·약물 접합체의 제조 시 결합 약물의 접합 위치 및 개수에 대한 정밀한 설계가 가능하다. ADC에 비해 생산비용이 낮다.
압타머는 일반적으로 천연 핵산으로 이루어져 있어서 체내 핵산분해효소로 분해돼 생체 내 안정성이 떨어진다. 하지만 압타머의 화학적 변형이 용이하다는 점을 이용해 변형된 압타머의 안정성에 대한 한계를 극복할 수 있다.
펩타이드-약물 접합체(Peptide-Drug Conjugate, PDC)는 ADC에서 항체 대신 펩타이드를 도입한 형태다. 펩타이드는 아미노산으로 구성되며, 500~5000Da(달톤) 범위의 크기를 가진다. 이는 150kDa(킬로달톤)이상인 항체와 비교해 매우 작은 크기다. 따라서 펩타이드 기반인 PDC는 ADC에 비해 우수한 세포 침투 능력을 가지며, 면역원성이 발생할 가능성이 매우 낮다. 또한 펩타이드는 화학적 합성이 가능하다. 이 때문에 PDC는 생산비용이 매우 낮을 뿐 아니라 펩타이드와 약물의 접합 위치와 비율을 정밀하게 조절할 수 있다.
일반적으로 펩타이드는 단백질분해효소에 쉽게 분해되므로 짧은 생물학적 반감기를 갖는다. 이러한 펩타이드 기반 약물접합체의 한계를 극복하기 위해 고리형 펩타이드, 비천연아미노산 도입 등 변형된 펩타이드를 활용하는 전략이 제시되고 있다.
리피바디(Repebody)는 항체 골격을 갖고 있지는 않지만 항체와 같이 항원을 인식하는 기능을 갖는 일종의 인공항체다. 표적 단백질에 특이적인 리피바디는 파지디스플레이(phage display) 기술을 통해 발굴할 수 있다.
파지디스플레이는 박테리오파지의 표면에 원하는 단백질을 발현시키는 기술이다. 리피바디는 항체의약 20% 수준인 30kDa 정도의 크기다. 따라서 항체에 비해 상대적으로 낮은 면역원성과 향상된 세포침투성을 갖는다고 알려져 있다. 또한, 리피바디의 열적,pH 안정성을 조절할 수 있어 구조적 안정성을 높일 수 있을 것으로 기대된다. 항체에 비해 생산 비용 또한 비교적 낮은 것으로 평가된다. 이러한 리피바디의 장점 때문에 항체를 리피바디로 대체하는 전략으로서 리피바디-약물 접합체(Repebody-DC)개발에 대한 관심도 높아지고 있다.
본 발명에 따른 운반체-약물 접합체는 운반체가 링커를 통해 약물, 즉 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체인 화합물, 바람직하게는 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물과 접합된 형태인 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 운반체-약물 접합체에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체인 화합물, 바람직하게는 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물은 그 항암 활성 등의 특성이 변화하지 않는 한, 적절한 부위에서 링커와 연결될 수 있으며, 이에 따라 본 발명은 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체인 화합물, 바람직하게는 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9의 화합물과 링커가 연결된 약물-링커를 제공한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 약물-링커는 화학식 3a, 화학식 3a-1, 화학식 4a, 화학식 4a-1, 화학식 5a, 화학식 5a-1, 화학식 6a, 화학식 7a, 화학식 8a 또는 화학식 9a의 구조를 가질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 3a]
Figure 112023116004382-pat00027
[화학식 3a-1]
[화학식 4a]
[화학식 4a-1]
[화학식 5a]
[화학식 5a-1]
[화학식 6a]
[화학식 7a]
[화학식 8a]
[화학식 9a]
상기 구조식에서 L은 링커를 의미한다.
[표적 항원 및 항체]
ADC에서 항체와 표적 항원의 상호작용은 안전성을 확보하고 치료효과를 얻는데 중요하다. 항원선택의 두 변수는 종양특이성과 발현수준이다. 이상적으로는 항원이 종양에서만 특이적으로 발현되고, 정상세포에서는 발현이 없거나 최소화되는 것이다. 특이성은 독성을 줄이는데 결정적이며 ADC의 성공을 좌우한다. 암 특이 항원은 종양세포의 표면에서 표면 수용체로 발현되거나 종양혈관계통, 종양미세환경 내부에서 발현된다.
균질 종양에서처럼 암 특이 항원이 종양조직에서 균질하게 발현되어서 모든 암세포가 약물에 반응하면 암의 치료가 쉬워진다. 비균질 종양의 경우 반응을 하지 않는 암세포가 섞여 있어서 ADC 치료 후에도 살아남는 암세포가 존재할 수 있다. ADC가 주변세포살상효과를 가지고 있다면 이러한 비균질 종양의 문제를 극복할 수 있다.
종양세포에 내부화된 항원을 표적으로 삼는 것은 세포내 기질이 풍부한 고형종양에서 쉽지 않은 일이다. 이러한 경우 암세포보다 종양미세환경을 표적으로 삼아 접근한다. 세포 외 단백질이나 세포 외 기질의 산성물질이나 글루타치온과 같은 성분을 이용하여 세포독성약물을 세포 외에서 방출한다.
현재 임상시험 중인 ADC 중에서 뛰어난 시장성으로 인해 매력적으로 사용되는 표적 항원은 HER2로 알려져 있으며 3개의 HER2 표적 ADC가 임상3상 단계에 있다(Dean et al., 2021).
HER2 양성 암의 경우, 본 발명에 따라 DDX5 단백질을 약물 표적으로 하는 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭인 ADC은 항HER2 치료 내성을 해결할 수 있는 새로운 치료법이 될 수 있다.
강력한 세포독성약물을 특정 암세포에만 전달하기 위해서는 표적화할 항원을 결정하는 것이 ADC 개발의 첫 번째 주요 단계이다. 항체를 사용함으로써 표적에 대한 높은 특이성과 긴 반감기로 장기적인 전신 순환을 가능하게 하는데 이로 인해 세포독성약물을 종양세포에만 선택적으로 축적이 가능하게 하고 정상조직의 노출을 최소화해 손상을 줄여 부작용을 줄이고 치료효과를 증가시킬 수 있다. 이를 위해 종양세포를 특정할 수 있는 표적 항원을 찾아야 하는데 다음과 같은 조건이 필요하다. 첫 번째로 표적 항원은 종양 세포 표면에서 균일하게 과발현되어야 하며 정상 세포에서는 상대적으로 발현이 적거나 없어야 한다. 대표적인 예로 Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) 수용체가 있으며 HER2 양성 유방암에서는 정상 세포보다 100배 이상 더 많이 발현이 되는 것으로 알려져 있다. 그래서 항체를 만들기 전에 다양한 프로파일링을 통해 표적 항원의 종양 발현을 분석하여 특정 항원의 과발현을 확인하면 이 항원을 인식하는 단일 클론 항체를 생성한다. 두 번째는 항원에 대한 결합력인데 수용체를 매개로 내재화가 일어나는 항체의 특징으로 인해 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하는 힘이 강할수록 더 많은 내재화가 일어날 수 있어 치료효과를 증가시킬 수 있기 때문이다. 추가적으로 낮은 면역원성이 있다. 초기에는 쥐를 통해 항체를 생산한 항체를 사용하여 1세대 ADC를 생산했다. 1세대 ADC는 인간에게 쥐의 항체를 주입하였는데 투여한 mouse antibody에 대한 인체내 면역 반응으로 인한 부작용 및 항체 중화작용이 발생하여 항암 효과를 보기 어려웠다. 면역 반응에 대한 문제점은 유전공학 기술의 발전에 따라 키메라 항체 (chimeric antibody), 인간화 항체 (humanized antibody) 및 완전 인간 항체 (human antibody)를 제조하게 되면서 많은 개선을 보였다.
암세포의 항원을 인지한 항체는 약물과 함께 세포 내재화가 일어나야 한다. 암세포에서 세포 내재화를 높이기 위해 이중특이성 항체(bispecific antibody)가 개발되고 있다.
Medimmune과 Astrazeneca에서 개발 중인 MEDI4267 (Trastuzumab-META)은 HER2에서 두 개의 비중첩 에피토프를 표적으로 하는 2중 파라토프 항체 (biparatopic antibody)가 HER2 수용체 클러스터링을 유도하고 이를 통해 세포 내재화, 리소좀 trafficking 및 분해를 촉진함을 보여주었다.
또한, 종양 표적 항체와 함께 리소좀 마커인 CD63 또는 APLP2, 프로락틴 수용체를 도입한 이중특이성 항체는 종양항원인식과 함께 단일 항체 대비 세포 내재화가 향상되는 것을 보여주었다. HER2를 표적으로 하는 trastuzumab과 CD63의 bispecific ADC (HER2xCD63-duostatin-3, Creative biolabs)가 있는데 정상 조직으로 전달을 낮춰주고 암세포 특이적으로 전달하게 해 강력한 항암효과를 보여주었다.
본 발명의 항체-약물 접합체(ADC) 또는 면역접합체(Immunoconjugate) 또는 운반체-약물 접합체 설계시 표적화하는 대상은 암세포뿐만 아니라, 감염성 질환 유기체 및/또는 자가면역 질환과 관련된 세포까지 확장될 수 있다.
따라서, 항체 또는 이의 항원결합부위 함유 단편이 표적화하는 세포는, 암 세포, 감염성 질환 유기체 및/또는 자가면역 질환과 관련된 세포일 수 있다.
표적 항원의 비제한적인 예로, Her2, FolR, PSMA 등 암 표면에 선택적으로 분포하는 항원 및 Trop2 등 정상 조직에도 소수 분포하는 암세포 과발현 항원이 있다.
암 세포 표적 항원은 예컨대, 5T4, ABL, ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, ADORA2A, AFP, Aggrecan, AGR2, AICDA, AIF1, AIGI, AKAP1, AKAP2, ALCAM, ALK, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOCl, AR, 아로마타제 (aromatase), ASPH, ATX, AX1, AXL, AZGP1 (zinc-a-glycoprotein), B4GALNT1, B7, B7.1, B7.2, B7-H1, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BAD, BAFF, BAG1, BAI1, BCR, BCL2, BCL6, BCMA, BDNF, BLNK, BLR1 (MDR15), BIyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, BMP10, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1 (플렉틴), BRCA1, C19orflO (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CA6, CA9, CANT1, CAPRIN-1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCL1 (1-309), CCLI1 (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, exodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIPIb), CCL5(RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 또는 CDw198 (CMKBR8/TERI/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), CD13, CD164, CD19, CDH6, CDIC, CD2, CD20, CD21, CD200, CD22, CD23, CD24, CD27, CD28, CD29, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD47, CD52, CD56, CD69, CD70, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD97, CD99, CD117, CD125, CD137, CD147, CD179b, CD223, CD279, CD152, CD274, CDH1 (E-카드헤린), CDH1O, CDH12, CDH13, CDH18, CDH19, CDH2O, CDH3, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDH17, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CDKN1B (p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A (p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEA, CEACAM5, CEACAM6, CEBPB, CERI, CFC1B, CHGA, CHGB, 키티나제 (Chitinase), CHST1O, CIK, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN6, CLDN7 (클라우딘-7), CLDN18, CLEC5A, CLEC6A, CLEC11A, CLEC14A, CLN3, CLU (클러스테린), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, C-MET, COL18A1, COLIA1, COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTAG1B (NY-ESO-1), CTLA4, CTL8, CTNNB1 (b-카테닌), CTSB (카텝신 B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCL1 (GRO1), CXCL1O (IP-IO), CXCLI1 (1-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), CYB5, CYC1, CYSLTR1, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DLK1, DNCL1, DPP4, E2F1, Engel, Edge, Fennel, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, Enola, ENO2, ENO3, EpCAM, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EPHRIN-A1, EPHRIN-A2, EPHRINA3, EPHRIN-A4, EPHRIN-A5, EPHRIN-A6, EPHRIN-B1, EPHRIN-B2, EPHRIN-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (HER-2), ERBB3, ERBB4, EREG, ERK8, 에스 트로겐 수용체, Earl, ESR2, F3 (TF), FADD, FAP, 파르네실트란스퍼라제, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF1 1, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FIGF (VEGFD), FIL1(EPSILON), FBL1 (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRT1 (피브로넥틴), FLT1, FLT-3, FOLR1, FOS, FOSL1(FRA-1), FR-알파, FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GD3, GDF5, GFI1, GFRA1, GGT1, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPC1, GPC3, GPNB, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC1O (C1O), GRP, GSN (Gelsolin), GSTP1, GUCY2C, HAVCR1, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HER3, HGF, HIF1A, HIP1, 히스타민 및 히스타민 수용체, HLA-A, HLA-DR, HLA-DRA, HLA-E, HM74, HMOXI, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFN감마, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGFIR, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, DL-1, ILIO, ILIORA, ILIORB, IL-1, IL1R1 (CD121a), IL1R2(CD121b), IL-IRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB(CD122), IL2RG(CD132), IL-4, IL-4R(CD123), IL-5, IL5RA(CD125), IL3RB(CD131), IL-6, IL6RA, (CD126), IR6RB(CD130), IL-7, IL7RA(CD127), IL-8, CXCR1 (IL8RA), CXCR2, (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R(CD129), IL-10, IL10RA(CD210), IL10RB(CDW210B), IL-11, IL11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, ILIA, ILIB, ILIF10, ILIF5, IL1F6, ILIF7, IL1F8, DL1F9, ILIHYI, ILIR1, IL1R2, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRL1, IL1RL2, ILIRN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, 1L4, IL6ST (당단백질 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (α6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (β4 인테그린), JAG1, JAK1, JAK3, JTB, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KIT, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (케라틴 19), KRT2A, KRTHB6 (헤어 (hair)-특이적 타입 II 케라틴), L1CAM, LAG3, LAMA5, LAMP1, LEP (렙틴), Lewis Y 항원 ("LeY"), LILRB1, Lingo-p75, Lingo-Troy, LGALS3BP, LRRC15, LPS, LTA (TNF-b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, LY75, LYPD3, MACMARCKS, MAG 또는 OMgp, MAGEA3, MAGEA6, MAP2K7 (c-Jun), MCP-1, MDK, MIB1, midkine, MIF, MISRII, MJP-2, MLSN, MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (메탈로티오넥틴-UI), mTOR, MTSS1, MUC1 (mucin), MUC16, MYC, MYD88, NCK2, NCR3LG1, 뉴로칸 (neurocan), NFKBI, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgRNogo66, (Nogo), NgR-p75, NgR-Troy, NMEI (NM23A), NOTCH, NOTCH1, NOTCH3, NOX5, NPPB, NROB1, NROB2, NRID1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR112, NR113, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NT5E, NTN4, NY-ESO1, ODZI, OPRDI, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, P-카드헤린, PCA3, PCD1, PD-L1, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, L1-CAM, peg-아스파라기나제, PF4 (CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸 (phosphacan), PIAS2, PI3 키나제, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG, PLXDCI, PKC, PKC-베타, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRAME, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PSMA, PTAFR, PTEN, PTHR2, PTGS2 (COX-2), PTN, PVRIG, RAC2 (P21Rac2), RANK, RANK 리간드, RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFI1O (ZNF144), Ron, ROBO2, ROR1, RXR, S100A2, SCGB 1D2 (리포필린 B), SCGB2A1 (맘마글로빈 2), SCGB2A2 (맘마글 로빈 1), SCYE1 (내피 단핵구-활성화 사이토카인), SDF2, SERPENA1, SERPINA3, SERPINB5 (마스핀), SERPINEI (PAI-I), SERPINFI, SHIP-1, SHIP-2, SHB1, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLAMF7, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLC44A4, SLC34A2, SLIT2, SPP1, SPRR1B (Spr1), ST6GAL1, ST8SIA1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TB4R2, TBX21, TCP1O, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, THIL, THBS1 (트롬보스폰딘-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, 조직 인자 (tissue factor), TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFI1A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF1O (TRAIL), TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF12A, TNFRSF17, TNFSF1 1 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFRSF14 (HVEM), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TOLLIP, Toll-유사 수용체, TOP2A (토포이소머라제 Iia), TP53, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TRKA, TREM1, TREM2, TROP2, TRPC6, TSLP, TWEAK, 티로시나제 (Tyrosinase), uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, 베르시칸 (versican), VHL C5, VLA-4, WT1, Wnt-1, XCL1 (림포탁틴), XCL2 (SCM-Ib), XCRI (GPR5/CCXCR1), YY1, ZFPM2, CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CDH6, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (덱틴-2), CLEC5A (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1), CLEC7A (덱틴-1), CLEC11A, PDGFRa, SLAMF7, GP6 (GPVI), LILRA1 (CD85I), LILRA2 (CD85H, ILT1), LILRA4 (CD85G, ILT7), LILRA5 (CD85F, ILT11), LILRA6 (CD85b, ILT8), LILRB1, NCR1 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD337, NKp30), OSCAR, TARM1, CD30, CD300C, CD300E, CD300LB (CD300B), CD300LD (CD300D), KIR2DL4 (CD158D), KIR2DS, KLRC2 (CD159C, NKG2C), KLRK1 (CD314, NKG2D), NCR2 (CD336, NKp44), PILRB, SIGLEC1 (CD169, SN), SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC7, SIGLEC8, SIGLEC9, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC14, SIGLEC15 (CD33L3), SIGLEC16, SIRPA, SIRPB1 (CD172B), TREM1 (CD354), TREM2, KLRF1 (NKp80), 17-1A, SLAM7, MSLN, CTAG1B/NY-ESO-1, MAGEA3/A6, ATP5I (Q06185), OAT (P29758), AIFM1 (Q9Z0X1), AOFA (Q64133), MTDC (P18155), CMC1 (Q8BH59), PREP (Q8K411), YMEL1 (O88967), LPPRC (Q6PB66), LONM (Q8CGK3), ACON (Q99KI0), ODO1 (Q60597), IDHP (P54071), ALDH2 (P47738), ATPB (P56480), AATM (P05202), TMM93 (Q9CQW0), ERGI3 (Q9CQE7), RTN4 (Q99P72), CL041 (Q8BQR4), ERLN2 (Q8BFZ9), TERA (Q01853), DAD1 (P61804), CALX (P35564), CALU (O35887), VAPA (Q9WV55), MOGS (Q80UM7), GANAB (Q8BHN3), ERO1A (Q8R180), UGGG1 (Q6P5E4), P4HA1 (Q60715), HYEP (Q9D379), CALR (P14211), AT2A2 (O55143), PDIA4 (P08003), PDIA1 (P09103), PDIA3 (P27773), PDIA6 (Q922R8), CLH (Q68FD5), PPIB (P24369), TCPG (P80318), MOT4 (P57787), NICA (P57716), BASI (P18572), VAPA (Q9WV55), ENV2 (P11370), VAT1 (Q62465), 4F2 (P10852), ENOA (P17182), ILK (O55222), GPNMB (Q99P91), ENV1 (P10404), ERO1A (Q8R180), CLH (Q68FD5), DSG1A (Q61495), AT1A1 (Q8VDN2), HYOU1 (Q9JKR6), TRAP1 (Q9CQN1), GRP75 (P38647), ENPL (P08113), CH60 (P63038), 또는 CH10 (Q64433)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
표적 항원은 정상세포 대비 암세포에 10배 이상 많이 분포하는 항원일 수 있다.
본 발명에 따른 항체-약물 접합체(ADC)에 사용될 수 있는 본 발명에서 항체의 비제한적인 예로는 우렐루맙 (Urelumab), 우토밀루맙 (Utomilumab), 벱텔로비맙 (Bebtelovimab), 아두카누맙 (Aducanumab), 바피네주맙 (Bapinezumab), 크레네주맙 (Crenezumab), 도나네맙 (Donanemab), 간테네루맙 (Gantenerumab), 레카네맙 (Lecanemab), 솔라네주맙 (Solanezumab), 네스바쿠맙 (Nesvacumab), 에비나쿠맙 (Evinacumab), 에놉리투주맙 (Enoblituzumab), 옴부르타맙 (Omburtamab), 벨리무맙 (Belimumab), 이아나루맙 (Ianalumab), 타발루맙 (Tabalumab), 베르틸리무맙 (Bertilimumab), 모가물리주맙 (Mogamulizumab), 레론리맙 (Leronlimab), 시필리주맙 (Siplizumab), 포랄루맙 (Foralumab), 무로모납-CD3(Muromonab-CD3), 오텔릭시주맙 (Otelixizumab), 테플리주맙 (Teplizumab), 이발리주맙 (Ibalizumab), 트레갈리주맙 (Tregalizumab), 자노리무맙 (Zanolimumab), 이톨리주맙 (Itolizumab), 에팔리주맙 (Efalizumab), 이네빌리주맙 (Inebilizumab), 타파시타맙 (Tafasitamab), 토시투모맙 (Tositumomab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 리툭시맙 (Rituximab), 우블리툭시맙 (Ublituximab), 벨투주맙(Veltuzumab), 에프라투주맙 (Epratuzumab), 바실릭시맙 (Basiliximab), 다클리주맙 (Daclizumab), 바르릴루맙 (Varlilumab), 룰리주맙 (Lulizumab), 이라투무맙 (Iratumumab), 린투주맙 (Lintuzumab),다라투무맙 (Daratumumab), 펠자르타맙 (Felzartamab), 이사툭시맙 (Isatuximab), 메자키타맙(Mezagitamab), 블레셀루맙 (Bleselumab), 다쎄투주맙 (Dacetuzumab), 이스칼리맙 (Iscalimab), 루카투무맙 (Lucatumumab), 미타잘리맙 (Mitazalimab), 소티갈리맙 (Sotigalimab), 다피롤리주맙 (Dapirolizumab), 아파미스타맙 (Apamistamab), 리구팔리맙 (Ligufalimab), 마그롤리맙 (Magrolimab), 알렘투주맙 (Alemtuzumab), 크리잔리주맙 (Crizanlizumab), 인클라쿠맙 (Inclacumab), 쿠사투주맙 (Cusatuzumab), 올레클루맙 (Oleclumab), 밀라투주맙 (Milatuzumab), 갈릭시맙 (Galiximab), 카로툭시맙 (Carotuximab), 아데카투무맙 (Adecatumumab), 엡티네주맙 (Eptinezumab), 에레누맙 (Erenumab), 프레마네주맙 (Fremanezumab), 갈카네주맙 (Galcanezumab), 졸베툭시맙 (Zolbetuximab), 오나르투주맙 (Onartuzumab), 에쿨리주맙 (Eculizumab), 포젤리맙 (Pozelimab), 라불리주맙 (Ravulizumab), 라크노투주맙 (Lacnotuzumab), 악사틸리맙(Axatilimab), 카비랄리주맙 (Cabiralizumab), 에막투주맙 (Emactuzumab), 이필리무맙 (Ipilimumab), 쿠아본리맙 (Quavonlimab), 트레멜리무맙 (Tremelimumab), 잘리프레리맙 (Zalifrelimab), 세툭시맙(Cetuximab), 데파툭시주맙 (Depatuxizumab), 푸툭시맙 (Futuximab), 임가투주맙 (Imgatuzumab), 마투주맙(Matuzumab), 모도특시맙 (Modotuximab), 네씨투무맙 (Necitumumab), 니모투주맙 (Nimotuzumab), 파니투무맙(Panitumumab), 토무조툭시맙 (Tomuzotuximab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), 바토클리맙(Batoclimab), 니포칼리맙 (Nipocalimab), 로자놀릭시주맙 (Rozanolixizumab), 부로수맙 (Burosumab), 팔레투주맙 (Farletuzumab), 디누툭시맙 (Dinutuximab), 낙시타맙(Naxitamab), 라기필리맙 (Ragifilimab), 김실루맙 (Gimsilumab), 렌질루맙 (Lenzilumab), 마브릴리무맙 (Mavrilimumab), 나밀루맙 (Namilumab), 오틸리맙 (Otilimab), 플론마를리맙 (Plonmarlimab), 코드리투주맙 (Codrituzumab), 마르게툭시맙 (Margetuximab), 페르투주맙 (Pertuzumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab), 다토포타맙(Datopotamab), 파트리투맙 (Patritumab), 세리반투맙 (Seribantumab), 둘리고투주맙 (Duligotuzumab), 피클라투주맙 (Ficlatuzumab), 릴로투무맙 (Rilotumumab), 알롬필리맙 (Alomfilimab), 아니프롤루맙 (Anifrolumab), 에마팔루맙 (Emapalumab), 리겔리주맙 (Ligelizumab), 오말리주맙 (Omalizumab), 씩수투무맙(Cixutumumab), 달로투주맙 (Dalotuzumab), 피키투무맙 (Figitumumab), 가니투맙 (Ganitumab), 테프로투무맙(Teprotumumab), 베르메키맙 (Bermekimab), 카나기누맙 (Canakinumab), 게보키주맙 (Gevokizumab), 브리아키누맙 (Briakinumab), 우스테키누맙 (Ustekinumab), 안루킨주맙 (Anrukinzumab), 쎈다키맙 (Cendakimab), 레브리키주맙 (Lebrikizumab), 트랄로키누맙 (Tralokinumab), 브로달루맙 (Brodalumab), 비메키주맙 (Bimekizumab), 익세키주맙 (Ixekizumab), 세쿠기누맙 (Secukinumab), 브라지쿠맙 (Brazikumab), 구셀쿠맙 (Guselkumab), 미리키주맙 (Mirikizumab), 리산키주맙 (Risankizumab), 틸드라키주맙 (Tildrakizumab), 네몰리주맙(Nemolizumab), 임시돌리맙 (Imsidolimab), 스페솔리맙 (Spesolimab), 파스콜리주맙 (Pascolizumab), 두필루맙 (Dupilumab), 데페모키맙 (Depemokimab), 메폴리주맙 (Mepolizumab), 레슬리주맙 (Reslizumab), 벤랄리주맙 (Benralizumab), 클라자키주맙 (Clazakizumab), 올로키주맙 (Olokizumab), 실툭시맙 (Siltuximab), 시루쿠맙 (Sirukumab), 질티베키맙 (Ziltivekimab), 레빌리맙 (Levilimab), 사릴루맙 (Sarilumab), 사트랄리주맙(Satralizumab), 토씰리주맙 (Tocilizumab), 아비투주맙 (Abituzumab), 파베젤리맙 (Favezelimab), 피안리맙 (Fianlimab), 이에라밀리맙 (Ieramilimab), 렐라틀리맙 (Relatlimab), 심투주맙 (Simtuzumab), 아바고보맙 (Abagovomab), 오레고보맙 (Oregovomab), 타네주맙 (Tanezumab), 이븍솔리맙 (Ivuxolimab), 로카틴리맙 (Rocatinlimab), 타볼리맙(Tavolimab), 델라조를리맙 (Telazorlimab), 본레롤리주맙 (Vonlerolizumab), 알리로쿠맙 (Alirocumab), 보코씨주맙 (Bococizumab), 에브로누씨맙 (Ebronucimab), 에볼로쿠맙 (Evolocumab), 프로보씨맙 (Frovocimab), 온게리씨맙 (Ongericimab), 타폴레씨맙 (Tafolecimab), 도스타를리맙 (Dostarlimab), 발스틸리맙 (Balstilimab), 캄렐리주맙 (Camrelizumab), 쎄미플리맙 (Cemiplimab), 겝타놀리맙 (Geptanolimab), 니볼루맙 (Nivolumab), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab), 펜풀리맙 (Penpulimab), 피딜리주맙 (Pidilizumab), 프롤골리맙(Prolgolimab), 레티판리맙 (Retifanlimab), 사산리맙 (Sasanlimab), 세르플루리맙 (Serplulimab), 신틸리맙(Sintilimab), 스파르탈리주맙 (Spartalizumab), 티슬렐리주맙 (Tislelizumab), 토리팔리맙 (Toripalimab), 에자벤리맙 (Ezabenlimab), 짐베렐리맙 (Zimberelimab), 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 아벨루맙 (Avelumab), 코시벨리맙 (Cosibelimab), 수게말리맙 (Sugemalimab), 두르발루맙 (Durvalumab), 엔바폴리맙(Envafolimab), 수브라톡수맙 (Suvratoxumab), 데노수맙 (Denosumab), 질로베르타맙 (Zilovertamab), 엘로투주맙 (Elotuzumab), 돔바날리맙 (Domvanalimab), 에티길리맙(Etigilimab), 오씨페를리맙 (Ociperlimab), 티라골루맙 (Tiragolumab), 비보스톨리맙 (Vibostolimab), 수르제비씰리맙 (Surzebiclimab), 코볼리맙 (Cobolimab), 사바톨리맙 (Sabatolimab), 콘씨주맙(Concizumab), 마르스타씨맙 (Marstacimab), 아달리무맙 (Adalimumab), 골리무맙 (Golimumab), 인플릭시맙(Infliximab), 쎄르톨리주맙(Certolizumab), 코나투무맙 (Conatumumab), 티가투주맙(Tigatuzumab), 테제펠루맙 (Tezepelumab), 가티포투주맙 (Gatipotuzumab), 카비랄리주맙 (Cabiralizumab), 베바씨주맙 (Bevacizumab), 브롤루씨주맙 (Brolucizumab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 올린바씨맙(Olinvacimab), 이크루쿠맙 (Icrucumab), 라무씨루맙 (Ramucirumab), 카프라씨주맙 (Caplacizumab), 아부릴루맙 (Abrilumab), 에트롤리주맙 (Etrolizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 인테투무맙 (Intetumumab), 나탈리주맙 (Natalizumab), 오브린다타맙 (Obrindatamab), 엘라나타맙 (Elranatamab), 린보셀타맙(Linvoseltamab), 테클리스타맙 (Teclistamab), 엡코리타맙 (Epcoritamab), 글로피타맙 (Glofitamab), 모수네투주맙 (Mosunetuzumab), 오드로넥스타맙 (Odronextamab), 플로테투주맙 (Flotetuzumab), 비베코타맙(Vibecotamab), 카투막소맙 (Catumaxomab), 씨비사타맙 (Cibisatamab), 탈쿠에타맙 (Talquetamab), 우바마타맙 (Ubamatamab), 엠피자타맙 (Emfizatamab), 블리나투모맙 (Blinatumomab), 아미반타맙 (Amivantamab), 에미씨주맙 (Emicizumab), 제노쿠투주맙 (Zenocutuzumab), 자니다타맙 (Zanidatamab), 티불리주맙 (Tibulizumab), 나프투모맙 (Naptumomab), 벨란타맙 (Belantamab), 피베키맙(Pivekimab), 프랄루자타맙 (Praluzatamab), 콜툭시맙 (Coltuximab), 데닌투주맙 (Denintuzumab), 론카스툭시맙 (Loncastuximab), 이브리투모맙(Ibritumomab), 이노투주맙 (Inotuzumab), 에프라투주맙 (Epratuzumab), 목세투모맙 (Moxetumomab), 브렌툭시맙 (Brentuximab), 겜투주맙 (Gemtuzumab), 바다스툭시맙 (Vadastuximab), 로보투주맙 (Lorvotuzumab), 폴라투주맙 (Polatuzumab), 투사마타맙 (Tusamitamab), 텔리소투주맙 (Telisotuzumab), 로발피투주맙 (Rovalpituzumab), 데파툭시주맙 (Depatuxizumab), 파를레투주맙 (Farletuzumab), 미르베툭시맙 (Mirvetuximab), 디시타맙 (Disitamab), 아네투맙 (Anetumab), 엔포르투맙 (Enfortumab), 사씨투주맙 고비테칸 (Sacituzumab), 보바릴리주맙(Vobarilizumab), 카도닐리맙 (Cadonilimab), 부달리맙 (Vudalimab), 테보텔리맙 (Tebotelimab), 이보네스씨맙 (Ivonescimab),에르폰릴리맙 (Erfonrilimab), 오조랄리주맙 (Ozoralizumab), 파리시맙 (Faricimab), 바누씨주맙(Vanucizumab), 나비씩시주맙 (Navicixizumab) 등이 있다.
[암의 예방 또는 치료용 약학 조성물]
본 발명은 전술한 화학식 1, 예컨대 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물, 이의 약제학적 허용염, 이의 용매화물, 또는 이의 프로드럭(prodrug), 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b), 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)은 세포 내에서 DDX5가 종양단백질(oncoprotein)로 작동하는 환자군에 투여하기 위한 약학 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있다.
예컨대, 조직생검 또는 액체생검에서 화학식 2의 FL118 화합물 또는 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을, 바람직하게는 비절단성, 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체(c)를 사용하여 세포내 DDX5 단백질을 정량 또는 정성분석함으로써, 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b)의 투여 대상인 환자군을 확인할 수 있다.
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a), 예컨대 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물은 새로운 구조의 캄토테신 유도체이다. 따라서, 이를 통해 Dxd 약물의 효능, 독성, 선택성, 작용 시간, 투여, 취급, 안정성 및/또는 생산 가능성 등에서 보다 더 바람직한 성질을 갖는 약물후보물질을 제공할 수 있다. 또한, 표적과 약물후보물질의 상호작용 즉 약력학적인 성질을 최적화할 수도 있고, 약물의 표적에 대한 접근 최적화하는 즉 약동학적인 능력을 향상시킬 수도 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예는, 화학식 1, 예컨대 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물, 이의 약제학적 허용염, 이의 용매화물, 또는 이의 프로드럭(prodrug), 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)의 치료학적으로 유효한 양을, 이를 필요로 하는 대상 (subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 대상 (subject)은 인간을 포함하는 포유류일 수 있다.
본 발명에서, 상기 암은 토포아이소머라제 I의 억제, 및/또는 DDX5, 서바이빈 (survivin), Mcl-1, XIAP 및 cIAP2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 암-관련 생존 유전자 (cancer-associated survival genes)의 억제로 치료 가능한 모든　암을 포함하며, 고형암　또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기　암은 원발성　암뿐 아니라 전이성　암도 포함한다.
본 명세서에서, "환자", “피험자” 및 "대상체"는 포유동물과 같은 동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 환자는 사람이다. 다른 실시양태에서, 환자는 개, 고양이, 가축(예를 들어, 말, 돼지 또는 당나귀), 침팬지 또는 원숭이와 같은, 사람이 아닌 동물이다.
본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 암의 치료 또는 예방에 유효한, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a), 예컨대 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5 또는 화학식 5-1로 표시되는 화합물, 이의 약제학적 허용염, 이의 용매화물, 또는 이의 프로드럭(prodrug)의 양을 나타낸다. 구체적으로, "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 시판되는 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 본 발명의 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물 및 이의 약제학적 허용염은 용량 의존적인 효과를 나타내므로, 투여 용량은 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분은 안전성이 우수하므로, 결정된 투여 용량 이상으로도 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제 (medicament)의 제조에 사용하기 위한, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a), 예컨대 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물, 이의 약제학적 허용염, 이의 용매화물, 또는 이의 프로드럭(prodrug), 바람직하게는 운반체-약물 접합체(CDC), 더욱 바람직하게는 항체-약물 접합체(ADC)의 용도 (use)를 제공한다. 약제의 제조를 위한 상기 화학식 3, 화학식 3-1, 화학식 4, 화학식 4-1, 화학식 5, 화학식 5-1, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물, 이의 약제학적 허용염, 이의 용매화물, 또는 이의 프로드럭 (prodrug)은 허용되는 보조제, 희석제, 담체 등을 혼합할 수 있으며, 기타 활성제제와 함께 복합 제제로 제조되어 활성 성분들의 상승 작용을 가질 수 있다.
본 발명의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 명세서에서, 항암제에 의한 항암 효과 또는 치료 효과는 환자가 특정의 암을 앓고 있는 동안 발생하는, 암의 중증도를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 암의 진행을 지연 또는 둔화시키는 작용을 지칭할 수 있다.
예컨대 항암제에 의한 항암 효과는 인비트로(in-vitro) 및/또는 인비보(in-vivo) 상으로 암 세포에 항암제를 처리한 후 암 세포의 Cell Viability(cytotoxicity 정도 또는 세포 수의 변화)일 수 있다. 예컨대, 세포주(Cell line)나 비임상 동물모델(xenograft)을 통해 약물의 반응(drug response) 검사를 통해 간접적으로 확인할 수 있다. 또한, 암 환자에서도 항암제에 의한 항암 효과를 직접 확인하여, 이와 관련된 데이터를 도출하여 데이터베이스로 사용할 수 있다. 또한, 항암제의 투약 가이드 라인 설계시 동물모델 PK 파라미터들 및/또는 독성 프로파일(profile)을 병행하여 고려할 수 있다.
항암제에 의한 항암 효과는 시험관내(in-vitro) 데이터인 해당 항암제의 % 최대효과(Maximum effect) 예컨대 IC50, IC60, IC70, IC80 및 IC90로부터 유추할 수도 있고, 약물의 최고 혈중농도(Cmax) 및/또는 혈중 약물농도-시간 곡선 하 면적(AUC)과 같은 생체내(in-vivo) 데이터를 통해 비임상 동물모델 및 임상 암 환자에서도 확인할 수 있다.
항암제의 반응성은 항암 효과 측면에 있어서 임상적 민감도를 의미한다.
항암제를 이용한 치료와 관련하여 언급할 때 "민감도" 및 "민감한"은 치료되는 종양 또는 질환의 진행을 완화 또는 감소시키는데 있어 화합물의 효과의 정도를 지칭하는 상대적 용어이다.
"효과적인 환자의 항암 효과/반응"은, 예를들어, 임의의 적합한 수단, 예컨대 유전자 발현, 세포 계수, 분석 결과 등에 의해 측정되는 바와 같은, 환자 반응에서 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 또는 그 이상의 억제일 수 있다.
본 명세서에서, 투여용량은 약효가 기대되는 용량이다. 본 발명에서 약효는 항암 효과일 수 있다. 항암제의 반응성(항암 효과)은 반응정도로서, 해당 항암제의 % 최대효과(Maximum effect) 예컨대 IC50, IC60, IC70, IC80 및 IC90, 정상세포에 대한 독성을 발휘하는 값 (LC50)일 수 있다.
예컨대, 경구용 제형은 당해 기술에서 공지된 다양한 제형 기술을 사용하여 제제화될 수 있다. 예컨대, 구강 점막에 부착하는데 쓰이는 생체붕괴성 (가수분해성) 폴리머성 담체를 포함할 수 있다. 예정된 기간에 걸쳐 서서히 침식되도록 제작되고, 여기서 약물 전달은 본질적으로 전체적으로 제공된다.
경구용 제형에서 약물 전달은, 경구 약물 투여에 마주치는 약점, 예를 들면, 느린 흡수, 위장관에서 존재하는 유체에 의한 활성제의 분해 및/또는 간에서의 초회통과 불활성화를 피한다. 생체붕괴성 (가수분해성) 폴리머성 담체에 대해, 사실상 임의의 그와 같은 담체가 원하는 약물 방출 프로파일이 손상되지 않는 한 사용될 수 있고, 담체는 구강 복용량 단위로 존재하는 임의의 다른 성분과 양립가능하다. 일반적으로, 폴리머성 담체는 구강 점막의 습성 표면에 부착되는 친수성 (수용성 및 수팽윤성) 폴리머를 포함한다. 본 명세서에서 유용한 폴리머성 담체의 예는 아크릴산 폴리머(예, 카보머)가 있다. 일부 구현예에서, 경구용 제형에 편입될 수 있는 다른 성분의 비제한적인 예들은 붕해제, 희석제, 결합제, 윤활제, 풍미제, 착색제, 보존제 등이 있다. 일부 구현예에서, 구강 또는 설하 투여에 대해, 종래의 방식으로 제형화된 정제, 로젠지, 또는 겔의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 환자의 상태가 개선되는 경우에 의사의 재량에 따라 화합물의 투여는 계속해서 제공되고; 대안적으로, 투여될 약물의 용량은 일시적으로 감소되거나 일시적으로 어떤 시간의 길이 (즉, “휴약”) 동안에 중단될 수 있다. 휴약의 길이는 2 일 내지 1 년 사이에서 변할 수 있고, 단지 예로써, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 12 일, 15 일, 20 일, 28 일, 35 일, 50 일, 70 일, 100 일, 120 일, 150 일, 180일, 200 일, 250 일, 280 일, 300 일, 320 일, 350 일, 또는 365 일을 포함한다. 일부 구현예에서, 휴약 동안의 용량 감소는 10%-100%이고, 단지 예로써, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 포함한다.
환자의 병태의 개선이 일어나면, 유지 용량은, 필요하면, 투여된다. 그 뒤에, 복용량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는, 개선된 질환, 장애 또는 병태가 유지되는 수준으로, 증상의 함수로서 감소될 수 있다. 그러나 환자는 증상의 임의의 재발시 장기간에 걸쳐 간헐적 치료를 필요로 한다.
그와 같은 양에 상응할 주어진 제제의 양은 치료가 필요한 대상체의 인자 예컨대 특정한 화합물, 질환의 중증도, 동일성 (예를 들면, 체중)에 따라 변할 것이지만, 그럼에도 불구하고 예를 들면, 투여될 제형, 투여 경로, 및 치료될 대상체를 둘러싸는 특정에 상황에 따라 당해기술에서 공지된 방식으로 일상적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 그러나, 성인 인간 치료에 이용된 용량은 전형적으로 0.02-5000 mg/1일, 또는 약 1-1500 mg/1일의 범위일 것이다.
본 명세서에서 1회 투여용량은 단회 용량으로 또는 동시에, 예를 들면 2, 3, 4 또는 그 초과의 하위-용량으로서 투여된 분할 용량으로 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 경구용 제형은 정확한 복용량의 단일 투여에 적합한 단위 복용 형태이다. 단위 복용 형태에서, 제형은 적절한 양의 1종 이상의 화합물을 함유하는 단위 용량으로 분할된다. 일부 구현예에서, 단위 복용량은 별개의 양의 제형을 함유하는 패장의 형태이다. 비-제한적인 예는 포장된 정제 또는 캡슐, 및 분말 바이알에서 또는 앰풀이다. 수성 서스펜션 조성물은 단일-용량 비-재밀폐가능 용기 내에서 포장될 있다. 대안적으로, 다중-용량 재밀폐가능 용기가 사용될 수 있고, 이 경우에 조성물 중 보존제를 포함하는 것이 전형적이다.
일부 구현예에서, 비경구 주사용 제형은 부가된 보존제와 함께, 비제한적으로 앰플을 포함하는 단위 복용 형태, 또는 다중-용량 용기로 제공된다.
전형적으로 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 단위 투여 주사가능한 형태로, 비경구 투여, 즉 볼루스, 정맥내, 및 종양내 주사를 위해 제조된다. 제약상 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.)와 함께 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 임의로 혼합된다.
[DDX5 단백질을 표적화하는 리간드]
FL118 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체는 종양단백질 DDX5 분해를 활성화하는 분자접착제이므로, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 또는 DDX5 단백질에 결합하는 리간드로서 사용될 수 있다. 따라서, FL118 화합물 또는 상기 활성형 캄토테신 유도체(a)에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체를 제공할 수 있다.
링커는 비절단성 링커일 수 있으며, 비절단성 링커의 비제한적인 예로, Thioether 링커가 있다.
FL118 화합물 또는 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a)는 DDX5 단백질에 결합하며, DDX5 단백질은 활성형 캄토테신 유도체(a)의 직접 표적(direct target)이다.
따라서, DDX5을 약제 감수성 또는 종양 감수성(tumour sensitivity)을 예측하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다.
조직생검 또는 액체생검에서 화학식 2의 FL118 화합물 또는 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a)에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체(c)를 사용하여, 세포내 DDX5 단백질을 정량 또는 정성분석함으로써, 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b)의 투여 대상인 환자군을 결정하거나, 화학 항암제 치료 시 재발율 및/또는 예후를 예측할 수 있다.
[암 진단 조성물]
본 발명은 화학식 2의 FL118 화합물 또는 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a)에서 제1형 토포이소머라제 저해 능력을 링커 연결을 통해 불활성화시킨, DDX5 단백질을 표적화하는 리간드 함유 복합체(c)를 함유하는 암 진단 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 암 진단 조성물을 사용하면, 활성형 캄토테신 유도체(a) 또는 이의 프로드럭(b)의 투여대상인 환자군을 결정하기 위해 사용하거나, 화학 항암제 치료 시 약물 반응, 재발율 및/또는 예후를 예측할 수 있다.
본 발명에 따라 화학식 1로 표시되는 캄토테신 유도체, 예컨대 화학식 3 내지 화학식 9 또는 이의 이성질체로 표시되는 캄토테신 유도체는 새로운 구조의 화합물이다. 이를 통해 Dxd 약물의 효능, 독성, 선택성, 작용 시간, 투여, 취급, 안정성 및/또는 생산 가능성 등에서 보다 더 바람직한 성질을 갖는 약물후보물질을 제공할 수 있다. 또한, 표적과 약물후보물질의 상호작용 즉 약력학적인 성질을 최적화할 수도 있고, 약물의 표적에 대한 접근 최적화하는 즉 약동학적인 능력을 향상시킬 수도 있다.
본 발명은 (i) 내성 단백질인 Survivin 등 Bcl family를 동시에 억제하고/하거나 (ii) 유출펌프(efflux pump)의 작용을 억제하는 추가 작용 기전을 통해, 주된 약물 타깃 modulation의 효능을 극대화할 수 있는 FL118 약물의 잇점을 유지하는 FL118 약물의 구조를 유지한 화학식 1의 화합물, 예컨대 화학식 3 내지 화학식 9의 화합물 또는 이의 이성질체를 제공한다.
따라서, 화학식 1의 화합물, 예컨대 화학식 3 내지 화학식 9의 화합물 또는 이의 이성질체는, FL118 약물과 같이, 한 개의 약물로 하나의 약물 표적을 타게팅하여 치료 효능이 제한되는 기존의 약물개발 방식에서 벗어나, 함께 제어가 필요한 여러 약물표적을 동시에 타게팅함으로써 우수한 치료 효능을 얻는 다중약리학 (Well-designed polypharmacology)기반 접근방법을 기반하여 설계된 것으로, 기존 치료제들이 뚜렷한 치료 효과를 보이지 못한 난치성 질환을 치료할 수 있다. 또한, 재발성/내성 암은 하나의 약물 타깃의 활성 조절만으로는 충분한 효능을 얻을 수 없고, 동시에 불특정된 다수의 약물 타깃을 표적으로 할 경우 안전성을 담보할 수 없는 문제가 있으나, FL118 약물과 같이, 잘 선택된 두 개 이상의 약물 표적을 활용하여 약효 면에서는 시너지를 나타내고 동시에 충분한 안전성을 확보할 수 있게 한다.
도 1은 FL118 구조 개선을 통해, 제1형 토포이소머라제 저해 능력과 함께 종양단백질(oncoprotein) DDX5를 분해하는 이중 작용기전(dual MoA)을 가지는 새로운 활성형 캄토테신 유도체(a)의 합성 설계 개념(synthetic design concept)을 나타낸 것이다.
도 2는 캄토테신(camptothecin, CPT)의 구조식 및 이의 제1형 토포이소머라제(topoisomerase-1)와의 결합을 도시한 것으로, Camptothecin으로부터 FL118 및 PBX-7011 분자설계 개념 확장 및 PBX-7011로부터 확장된 새로운 구조의 화합물 PBX-7014 및 PBX-7016 도출 및 이의 hydrophilicity 계산 결과이다.
도 3은 Dxd로부터 Deruxtecan를 합성하는 공정과 유사하게, PBX-7014 및 PBX-7016로부터 25-4 및 25-6의 합성법을 예시한 것이다.
도 4는 기존 캄토테신계 약물과 TOP1의 상호작용을 분석해 주는 분자동역학(Molecular dynamics) 시뮬레이션 및 Docking Score 이다.
도 5는 본 발명의 신규 캄토테신계 약물과 TOP1의 상호작용을 분석해 주는 분자동역학(Molecular dynamics) 시뮬레이션 및 Docking Score 이다.
도 6은 캄토테신과 돌연변이 TOP1 (E418K)의 상호작용을 분석해 주는 분자동역학(Molecular dynamics) 시뮬레이션이다.
도 7은 Normal TOP1에서의 SN38 - TOP1 상호작용을 보여주는 것이다.
도 8은 E418K mutated TOP1에서의 SN38 - TOP1 상호작용을 보여주는 것이다.
도 9는 E418K mutated TOP1에서의 화학식 1-1의 화합물(화합물 A) - TOP1 상호작용을 보여주는 것이다.
도 10 내지 도 14는 실시예 2-1에 따라 Dual MoA (Topoisomerase I inhibition & DDX5 degradation) 검증하기 위해, FaDu 세포주 및 A549 세포주에서 다양한 캄토테신계 약물(FL118 약물, SN-38 약물, Exatecan 약물, PBX-7011, PBX-7014, PBX-7016)의 anti-apoptotic protein들의 저해 정도를 보여주는 웨스턴 블럿 결과이다. 도 12 및 도 14는 FaDu 세포주 및 A549 세포주에서 실시한 western blot 실험결과(도 11 및 도 13)에서 농도를 그래프로 수치화한 결과이다.
도 15는 FaDu 세포주 또는 A549 세포주에서 다양한 캄토테신계 약물에 대해 in vitro cell viability 비교 평가 결과이다.
도 16은 MDA-MB-453(HER2++) 세포주 및 FaDu (HER2+) 세포주에서 다양한 캄토테신계 약물에 대해 in vitro cell viability 비교 평가 결과이다.
도 17은 pH 7.4에서 카르복실레이트에서 락톤 형태로의 전환 (Carboxylate to lactone form conversion in pH 7.4) 결과이다.
도 18은 pH 6.0에서 카르복실레이트에서 락톤 형태로의 전환(Carboxylate to lactone form conversion in pH 6.0) 결과이다.
도 19 및 도 20은 SEC 및 SDS PAGE를 이용한 ADC 제작 확인 결과이다.
도 21은 트라스트주맙과 트라스트주맙과 PBX-7014와 PBX-7016이 컨쥬게이션된 ADC의 Her2에 대한 결합력을 비교한 결과이다.
도 22는 MDA-MB-453(HER2++) 세포주, FaDu (HER2+) 세포주 및 MDA-MB-468(HER2-) 세포주에서 다양한 캄토테신계 약물 및 이를 payload로 하는 ADC에 대해 in vitro cell viability 비교 평가 결과이다.
도 23은 JIMT-1 세포주를 이용한 마우스에 in vivo xenograft 모델에서 다양한 캄토테신계 약물을 payload로 하는 ADC에 대한 효력시험 결과이다.
도 24는 JIMT-1 세포주를 이용한 마우스에 in vivo xenograft 모델에서 다양한 캄토테신계 약물을 payload로 하는 ADC에 대한 마우스 체중변화 결과이다.
도 25는 MDA-MB-453(HER2++) 세포주와 GFP가 발현된 MDA-MB-468(HER2-) 세포주를 함께 배양 후 캄토테신계 약물을 payload로 하는 ADC를 GFP 발현 유무를 기준으로 FACS로 세포수를 개수한 결과이다.
도 26은 MDA-MB-453(HER2++) 세포주와 MDA-MB-468(HER2-) 세포주를 함께 배양 후 캄토테신계 약물을 payload로 하는 ADC를 HER2-FITC 항체를 이용하여 HER2 발현 유무를 기준으로 FACS로 세포수를 개수한 결과이다.
도 27은 MDA-MB-468(EGFR positive) 세포주와 SW480(EGFR negative) 세포주에서 Cetuximab-25-6에 대해 in vitro cell viability (ADC 6 days Treatment) 비교 평가 결과 (도 27a); 및 FaDu(Trop2+++) 세포주와 Calu-6(Trop2--) 세포주를 대상으로 Sacituzumab-25-6에 대해 in vitro cell viability (ADC 6 days Treatment) 비교 평가 결과(도 27b) 이다.
도 28은 FL118, Exatecan, SN-38, Dxd, 화합물 A(PBX-7011), 화합물 B(PBX-7012), 화합물 C(PBX-7014), 화합물 D (PBX-7015), 화합물 E(PBX-7016), 화합물 F(PBX-7017)의 LogP, cLogP및 tPSA(topological polar surface area)를 비교한 것이다.
도 29는 화학식 1에서 도출가능한 다양한 캄토테신계 약물, 화합물 G, 화합물 H, 화합물 I, 화합물 J, 화합물 G', 화합물 H', 화합물 I', 화합물 J'의 LogP, cLogP및 tPSA(topological polar surface area)를 비교한 것이다.
도 30는 프로그램된 세포사멸(programmed cell death)와 관련한 세포 사멸의 상세 분류도이다.
도 31은 ADC 독성의 메커니즘을 나타낸 것이다(출처: Cancers　2023,　15(3), 713; https://doi.org/10.3390/cancers15030713)
도 32는 다양한 Self immolative spacer의 작동기전이 예시되어 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
제조예 1: 화학식 3 또는 화학식 3-1의 활성형 캄토테신 유도체 (PBX-7011 및 PBX-7012)의 합성
1-1. 화합물 2의 합성
디클로로메탄(748ml) 플라스크 중 5-니트로벤조[d][1,3]디옥솔(25g, 150mmol) 용액에 은 트리플레이트(57.7g, 224mmol) 및 요오드(57.0g, 224mmol)를 첨가하였다. 이 용액을 N2 분위기 하에 실온의 암실에서 교반하였다.
여과에 의해 AgI를 제거하고 고형물을 디클로로메탄(100mL)으로 세척하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 잔류물을 EtOAc(250mL)와 5%(v/v) NH4OH/H2O 용액(200mL) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고 1M Na2SO3(5 x 200 mL) 및 염수(200 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조시키고 활성탄으로 처리하고 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 감압 하에 증발시켜 미정제물을 갈색 고형물로 제공하였다. 이것을 빙냉 EtOH(400mL)로부터 분쇄하고, 여과하고, 고형물을 빙냉(ice-cold) EtOH(100mL)로 세척하여 생성물을 옅은 갈색-회색 고형물(14.3g)로 제공하였다. 여액으로부터 용매를 제거하고 미정제물을 빙냉 EtOH(300mL)로부터 두 번째로 분쇄하였다. 고형물을 여과에 의해 수집하고, EtOH(50mL)로 세척하여 추가량의 생성물(10.2g)을 암갈색-회색 고체로서 제공하였다. 두 배치 모두 추가 정제 없이 그대로 사용되었다.
SC_ACID: m/z 294.2 [M+H]+
1-2. 화합물 3의 합성
물(80ml), 메탄올(40.0ml) 및 테트라히드로푸란(40.0ml)의 혼합물 중 4-요오도-6-니트로벤조[d][1,3]디옥솔(8.75g, 29.9mmol)의 현탁액에 철 분말(6.67g, 119mmol) 및 염화암모늄(6.39g, 119mmol)을 첨가하였다. 현탁액을 75℃로 가열하고 16.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압하에 농축시켰다. 생성된 흑색 고형물을 에틸 아세테이트(100ml)에 현탁시키고 용액을 따라내었다. 잔류물을 EtOAc(3 x 50mL)로 세척하였다. 혼합물을 분별 깔때기로 옮기고, 물을 첨가하고, 수성 층을 제거하였다. 유기층을 포화 수성 NaHCO3용액(150mL) 및 염수(150mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하여 갈색 고체를 수득하였다(4.75g, 60% 수율). 철 잔류물을 에틸 아세테이트로 철저히 세척하여 추가 생성물을 회수하였다. 이어서, 유기 분획을 포화 수성 NaHCO3용액(150mL), 염수(150mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하여 갈색 고형물을 얻었다(1.74g, 22% 수율).
SC_ACID: m/z 264.0 [M+H]+
1-3. 화합물 4의 합성
디클로로메탄(49ml) 중 7-요오도벤조[d][1,3]디옥솔-5-아민(6.39g, 24.29mmol)의 용액에 아세트산 무수물(2.75mL, 29.2mmol) 및 트리에틸아민(4.06mL, 29.2mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 몇 시간 후에 추가 DCM(10ml)을 첨가하였다. 현탁액을 소결 깔때기를 통해 여과하고 빙냉 DCM(10 mL)으로 세척하였다. 생성물을 추가로 감압하에 건조시켜 밝은 회색 고체(4.46g)를 얻었다. 여액을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 갈색 고체 (~3g)를 수득하였다. 갈색 고체를 플래시 컬럼 크로마토그래피(80g Si, 헵탄 중 0-100% 에틸 아세테이트)로 정제했습니다. 생성물의 모든 배치를 빙냉 EtOAc(5-10 ml)로부터 분쇄하였다. 두 배치를 합하고 추가로 건조시켜 회백색 고체를 얻었다.
총 수율: 5.0g, 66%
SC_ACID: m/z 306.0 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.88 (s, 1H), 7.39 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.04 (s, 2H), 1.99 (s, 3H).
1-4. 화합물 5의 합성
콘덴서가 장착된 3-neck 플라스크에 아세토니트릴(40mL) 중 N-(7-요오도벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)아세트아미드(5.06g, 16.59mmol), 부트-3-엔산(1.69mL, 19.90mmol) 및 탄산칼륨(2.98 g, 21.56mmol)의 슬러리를 0 ~ 5 ℃로 냉각시켰다. 물(13.33mL)을 천천히 첨가하여 기체를 발생시켰다. 기체 발생이 중단되면 혼합물을 Ar로 30분 동안 탈기시켰다. 트리-o-톨릴포스핀(0.505g, 1.659mmol) 및 팔라듐 아세테이트(0.186g, 0.829mmol)를 첨가하고 혼합물을 다시 30분 동안 탈기시킨 후 Ar 하에 환류 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 셀라이트를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 H2O 및 EtOAc로 세척하였다. 유기 용매를 진공 하에 여액으로부터 제거하고 수성 물질을 진한 용액으로 산성화시켰다. pH = 1-2가 될 때까지 HCl. 수성층을 EtOAc로 추출하고, 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 조 물질을 빙냉 EtOAc(30 mL)로부터 분쇄하고 고체를 여과에 의해 수집하여 생성물을 갈색 고체로 제공하였다. 모액을 감압 하에 농축하고 플래쉬 크로마토그래피(80g Si, 헵탄 중 0 - 100% EtOAc)를 통해 정제하였다. 생성물 분획을 감압 하에 농축하여 연갈색 발포체를 수득하였다. 총 수율: 3.46g, 75%. E/Z 이성질체의 혼합물을 얻었다.
SC_ACID: m/z 264.4 [M+H]+
1-5. 화합물 6의 합성
테트라히드로푸란(50mL)/물(50mL) 중 4-(6-아세트아미도벤조[d][1,3]디옥솔-4-일)부트-3-엔산(3.47g, 13.18mmol)의 현탁액)를 15분 동안 N2로 탈기시켰다. H2 하(풍선)에서 40℃로 가열하기 전에 Pd/C(2.97g, 1.397mmol)를 첨가하고 현탁액을 H2로 5분 동안 탈기시켰다. 24시간 후, 반응 혼합물을 질소 및 추가의 Pd/C(2.97 g, 1.397 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소로 10분 동안 버블링하고 수소 하에 45℃에서 밤새 교반하였다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 필터 케이크를 H2O (50 mL)로 세척하였다 및 EtOAc(50 mL) 및 EtOAc(50 mL) 및 유기 용매를 진공하에 여과액으로부터 제거하였다. 수성 용액을 진한 HCl로 pH = 1이 될 때까지 산성화하고 암갈색/녹색 침전물을 소결 깔때기를 통한 여과에 의해 수집하였다. 수성 여과액을 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하여 갈색 오일을 얻었다. 생성물 회수율이 낮았으므로, 필터 케이크를 EtOAc(50 ml), 물(200ml) 및 나 OH(400ml). 물/EtOAc 플러시를 MeOH 플러시로부터의 고체를 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 수성 층을 진한 농도로 산성화하였다. pH = 1이 될 때까지 HCl 및 회백색 침전물이 형성되었으며, 이를 소결 깔때기를 통한 여과에 의해 수집하였다. 수성 여액을 EtOAc(3x200 mL)로 추출한 후, LCMS는 모든 생성물이 수성에서 제거되었음을 나타내었다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공하에 제거하여 밝은 갈색 고체를 수득하였다. 모든 제품 배치를 합하고 플래시 컬럼 크로마토그래피(40g Si, DCM 중 0-10% MeOH)를 통해 정제했습니다. 생성물 분획을 농축하여 밝은 갈색 고체를 얻었다. 수율: 2.52g, 72%.
SC_ACID: 266.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.07 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 7.14 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.95 (s, 2H), 2.50 - 2.46 (m, 2H), 2.23 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.84 - 1.70 (m, 2H).
1-6. 화합물 7의 합성
TFA(433μL, 5.65mmol) 중의 4-(6-아세트아미도벤조[d][1,3]디옥솔-4-일)부탄산(150mg, 0.565mmol)의 현탁액을 얼음 위에서 냉각시켰다. TFAA(157μL, 1.131mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반하고, 시간이 지남에 따라 어두운 용액으로 변하였다. 반응 혼합물을 빙냉 포화 수성 NaHCO3용액(10 mL)에 적가하고 수성 용액을 에틸 아세테이트(3 x 25 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 sat. NaHCO3 및 염수를 Na2SO4로 건조시키고 여과하고 용매를 진공하에 제거하여 연어 핑크색 고체를 수득하였다. 수율: 140mg, 100%
SC_ACID: m/z 248.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.34 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 6.13 (s, 2H), 2.80 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.66 - 2.58 (m, 2H), 2.12 (s, 3H), 2.01 - 1.91 (m, 2H).
1-7. 화합물 8의 합성
테트라히드로푸란 (1.2 mL) 중 N-(6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로나프토[1,2-d][1,3]디옥솔-5-일)아세트아미드 (50 mg, 0.202 mmol)의 현탁액을 0℃로 냉각시키고 칼륨 tert-부톡사이드(27.2mg, 0.243mmol) 및 이소아밀 아질산염(35.0μL, 0.263mmol)을 첨가하였다. 짙은 녹색 혼합물을 얼음(< 5℃) 위에서 1.5시간 동안 교반하였다. 아세트산(170μL, 2.94mmol), 아세트산 무수물(170μL, 1.810mmol) 및 아연, 더스트(66.1mg, 1.011mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 현탁액을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하고 DCM으로 플러싱하였다. 여액을 감압 농축하여 흑색 유상 물질을 얻었다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(4g Si, DCM 중 0-4% MeOH)를 통해 정제하였다. 생성물 분획을 농축하여 80-90% 순도로 회색 고체(32 mg, 52%)를 수득하였다. 정제용 MPLC로 정제하면 더 높은 순도의 샘플을 얻을 수 있다.
SC_ACID: m/z 305.4 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.10 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H), 6.15 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 4.66 - 4.56 (m, 1H), 2.93 (dd, J = 8.9, 4.0 Hz, 2H), 2.14 (s, 3H), 2.13 - 1.93 (m, 2H), 1.91 (s, 3H).
1-8. 화합물 9의 합성
N,N'-(6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로나프토[1,2-d][1,3]디옥솔-5,7-디일)디아세트아미드 (244 mg, 0.802 mmol) 를 에탄올/물 (5/1) 중 2M 염산(4.69 mL, 9.38 mmol)에 현탁시켰다. 혼합물을 4시간 동안 55℃로 가열하였다. 흑색 혼합물을 0-5℃로 냉각시켰다. 교반하면서 트리에틸아민(1.4mL, 10.04mmol)을 적가하였다. 그 다음 혼합물을 EtOH로 희석하고 증발 건조시켰다. 잔류물을 물과 DCM 사이에 분배하였다. 층을 분리하고 수성 층을 DCM으로 1회 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축하여 생성물을 갈색 고체(178 mg, 73%)로서 86% 순도로 수득하였다.
SC_ACID: m/z 263.0 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.04 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.20 (s, 1H), 5.94 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.48 - 4.41 (m, 1H), 3.08 (s, 2H), 2.88 - 2.69 (m, 2H), 2.15 - 2.03 (m, 1H), 1.88 (s, 3H), 1.86 - 1.75 (m, 1H).
1-9. 화합물 10의 합성
(4S)-4-에틸-7,8-디히드로-4-히드록시-1H-피라노[3,4-f]인돌리진-3,6,10(4H)-트리온 (146 mg, 0.555 mmol) 및 N- (5-아미노-6-옥소-6,7,8,9-테트라히드로나프토[1,2-d][1,3]디옥솔-7-일)아세트아미드(112 mg, 0.427 mmol)를 건조 톨루엔( 4.5ml). PPTS(21mg, 0.085mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 115℃에서 40시간 동안 교반하였다.
반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 현탁액을 2mL DCM으로 희석하고 여과하였다. 흑색 잔류물(210 mg)을 얻었다.
조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(12g Si, DCM 중 0-7% 메탄올)로 정제하여 생성물(45 mg, 21%)을 갈색 고체로 수득하였다.
LCMS 분석은 2개의 부분입체이성질체를 보여주었다.
SC_ACID: m/z 490.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.47 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.29 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 5.57 - 5.49 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.23 - 5.07 (m, 2H), 3.09 - 3.00 (m, 2H), 2.11 - 2.01 (m, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.89 - 1.79 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
1-10. PBX-7011 및 PBX-7012의 합성
N-((10S)-10-에틸-10-히드록시-11,14-디옥소-2,3,10,11,14,16-헥사히드로-1H,13H-벤조[de][1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드(73.5mg, 0.150mmol)를 1.0mL 6N HCl에 용해시키고, 90℃에서 8시간 동안 이어서 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고 산성 분취용 MPLC를 통해 2회 실행(Luna2-30)하여 정제하였다. 분리된 부분입체이성질체를 함유하는 분획을 3N HCl 5방울로 산성화하고 동결건조하여 생성물을 황색 고체로 수득하였다.
1st eluting isomer: PBX-7011, 23 mg, 34% yield
U_AN_ACID: m/z 448.4 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (s, 3H), 7.50 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.34 (d, J = 13.3 Hz, 2H), 5.77 (d, J = 19.3 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.37 (d, J = 19.3 Hz, 1H), 5.05 (s, 1H), 3.19 - 3.02 (m, 2H), 2.46 (s, 1H), 2.20 - 2.03 (m, 1H), 1.94 - 1.81 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
2nd eluting isomer: PBX-7012, 28 mg, 41% yield
U_AN_ACID: m/z 448.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 (d, J = 4.7 Hz, 3H), 7.51 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.34 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 5.76 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.37 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 5.08 (s, 1H), 3.16 - 2.98 (m, 2H), 2.46 (s, 1H), 2.18 - 2.06 (m, 1H), 1.94 - 1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
제조예 2: 화학식 4 또는 화학식 4-1의 활성형 캄토테신 유도체 (PBX-7014 및 PBX-7015)의 합성
본 실시예는 Exatecan-하이브리드 화합물(PBX-7011 및 PBX-7012)의 두 개의 분리된 부분입체이성질체로부터 시작하여 화합물 PBX-7014 및 PBX-7015의 합성을 설명한다.
2-1: PBX-7014의 합성
다음 절차에 따라 활성화된 글리콜산의 스톡 용액을 제조했다:
글리콜산(17mg, 0.224mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 1mL에 용해시켰다. HOSu(25.7mg, 0.223mmol) 및 EDC(42.8mg, 0.223mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
이어서, N,N-디메틸포름아미드(2.5mL) 중 (1S,10S)-1-아미노-10-에틸-10-히드록시-1,2,3,10,13,16-헥사히드로-11H,14H-벤조[de][1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-11,14-디온 (40 mg, 0.089 mmol ) 및 트리에틸아민(0.025ml, 0.179mmol)의 현탁액에 0.4mL의 활성화된 산 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 새로 제조된 활성화된 산 용액 0.05mL를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시켰다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(클로로포름 중 0-8% 메탄올)로 정제하였다. 이것은 PBX-7014 생성물 및 잔류 숙신이미드를 함유하는 황색 고체를 제공하였다. 생성물을 산성 분취용 MPLC(Luna5-40)에 의해 추가로 정제하여 생성물 분획의 동결건조 후 밝은 황색 고체를 얻었다. 수율: 20mg, 50%
U_AN_ACID: m/z 506.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.40 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.28 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 5.61 - 5.45 (m, 2H), 5.45 - 5.35 (m, 2H), 5.19 - 5.06 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.13 - 2.96 (m, 2H), 2.21 - 2.02 (m, 2H), 1.94 - 1.77 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
2-2: PBX-7015의 합성
다음 절차에 따라 활성화된 산의 스톡 용액을 제조했다:
글리콜산(17.00mg, 0.223mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 1mL에 용해시켰다. HOSu(25.7mg, 0.223mmol) 및 EDC(42.8mg, 0.223mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다.
이어서, N,N-디메틸포름아미드(2.5mL) 중 (1R,10S)-1-아미노-10-에틸-10-히드록시-1,2,3,10,13,16-헥사히드로-11H,14H-벤조[de][1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-11,14-디온 (25 mg, 0.056 mmol ) 및 트리에틸아민(0.016ml, 0.112mmol)의 현탁액에 0.25 mL의 활성화된 산 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 새로 제조된 활성화된 산 용액 0.03mL를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 이전의 더 작은 배치와 합하고 증발 건조시켰다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 이것은 PBX-7015 생성물 및 잔류 숙신이미드를 함유하는 황색 고체를 제공하였다. 생성물을 산성 분취용 MPLC(Luna5-40)로 정제하였다. 생성물 분획을 동결건조시켜 밝은 황색 고체를 수득하였다. 수율: 15mg, 38%
U_AN_ACID: 506.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.44 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.29 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 5.61 - 5.44 (m, 2H), 5.44 - 5.36 (m, 2H), 5.20 - 5.07 (m, 2H), 3.96 (s, 2H), 3.10 - 2.96 (m, 2H), 2.20 - 2.06 (m, 2H), 1.95 - 1.79 (m, J = 7.3 Hz, 2H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
제조예 3: 화학식 5의 활성형 캄토테신 유도체(PBX-7016)의 합성
본 실시예는 Exatecan-하이브리드 화합물(PBX-7011)로부터 시작하여 화합물 PBX-7016의 합성을 설명한다.
활성화된 D-락트산의 스톡 용액은 다음 절차에 따라 제조되었다.
D-락트산(22 mg, 0.244 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 1mL에 용해시켰다. HOSu(27 mg, 0.235 mmol) 및 EDC(38.6 mg, 0.201 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
이어서, N,N-디메틸포름아미드(2.5ml) 중 (1S,10S)-1-아미노-10-에틸-10-히드록시-1,2,3,10,13,16-헥사히드로-11H,14H-벤조[de][1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-11,14-디온 (36 mg, 0.080 mmol) 및 트리에틸아민(0.022 ml, 0.161 mmol)의 용액에 0.3 mL의 활성화된 산 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 제조된 활성산 용액 0.05mL를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 산성 분취용 MPLC(Luna10-50)로 직접 정제하여 생성물 분획의 동결건조 후 밝은 황색 고체를 얻었다.
수율: 22mg, 52%
U_AN_ACID: m/z 520.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.43 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.29 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 5.62 - 5.58 (m, 1H), 5.58 - 5.51 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.21 - 5.01 (m, 2H), 4.17 - 4.07 (m, 1H), 3.14 - 2.95 (m, 2H), 2.19 - 2.04 (m, 2H), 1.92 - 1.78 (m, 2H), 1.39 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
전술한 바와 같이, 화학식 5의 PBX-7016는 화학식 3의 PBX-7011로부터 합성가능하므로, 동일한 방법으로 화학식 5-1의 PBX-7017은 화학식 3-1의 PBX-7012로부터 합성가능하다.
제조예 4: 화학식 9의 활성형 캄토테신 유도체(PBX-70124의 합성
PBX-7011 화합물에 (2S)-2-cyclopropyl-2-hydroxyacetic acid를 결합시켜 PBX-7024를 높은 수율로 제조하였다.
(2S)-2-cyclopropyl-2-hydroxyacetic acid (26 mg, 0.244 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 1 mL에 용해시켰다. HOSu(26 mg, 0.226 mmol) 및 EDC(42 mg, 0.219 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, N,N-디메틸포름아미드(2.5 ml) 중 (1S,10S)-1-아미노-10-에틸-10-히드록시-1,2,3,10,13,16-헥사히드로-11H,14H-벤조[de][1,3]디옥솔로[4,5-g]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-11,14-디온 (40 mg, 0.089 mmol) 및 DIPEA(0.047 ml, 0.268 mmol)의 용액에 0.6 mL의 활성화된 산 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 산성 분취용 MPLC(Luna10-50)로 직접 정제하여 생성물 분획의 동결건조 후 밝은 흰색 고체를 얻었다.
수율: 32 mg, 65%
U_AN_ACID: m/z 520.2 [M+H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.33 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.28 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 5.50 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 5.40 (s, 3H), 5.23 - 5.06 (m, 2H), 3.62 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 3.03 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 2.21 - 2.02 (m, 2H), 1.92 - 1.79 (m, 2H), 1.18 - 1.08 (m, 1H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 0.47 - 0.30 (m, 4H).
실시예 1: 캄토테신 유도체의 TOP1/DNA와의 결합모드 분석
분자동역학(Molecular dynamics) 시뮬레이션을 통한 결합모드 예측 결과(Docking Score)에 따르면, 표 2의 모든 캄토테신 유도체들은 기본적으로는 DNA base 사이에서 강한 π - π stacking을 통하여 결합하고 있으며(도 4 및 도 5), lactone의 ester는 TOP1의 Arg488과, ethyl 및 OH기는 TOP1의 Asp533과 수소결합(H-bonding)을 하여(도 1), 캄토테신 유도체가 TOP1 Protein과 DNA 사이에 잘 결합할 수 있도록 지탱해주는 역할을 하고 있다.
SN-38 약물은 TOP1의 Glu356 및 Arg364와 수소결합(H-bonding)하여 안정화된다(도 4).
Exatecan 약물은 주변 DNA base와 수소결합(H-bonding)하며 추가로 안정화된다(도 4).
FL118 약물의 -OCH2O- (methylenedioxo) 5각형 링은 수소결합 보다는 약하여 (실제 cytotoxicity와는 다르게) SN-38 약물이나 Exatecan 약물보다는 나쁜 Docking Score를 나타내나, 이러한 결합은 DNA base사이에서 완벽하게 결합하며 solvation에도 도움을 준다(도 4).
도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따라 FL118 약물과 Exatecan 약물의 작용기를 혼합하여 설계된 화학식 3의 화합물(PBX-7011) 및 화학식 3-1의 화합물(PBX-7012)은 부분입체 이성질체 관계이므로 같은 바인딩 포즈를 공유하며 TOP1과 안정적으로 바인딩할 것으로 예측된다. 특히 화학식 3의 화합물(PBX-7011)는 SN-38 약물보다 docking score가 높은 것으로 계산되었다.
Exatecan 약물과 같은 키랄성(chirality)를 갖는 화학식 3의 화합물(PBX-7011)가 화학식 3-1의 화합물(PBX-7012) 보다 약간 더 좋은 binding을 보였다.
한편, Trodelvy(payload: SN-38)에 내성을 보인 TOP1 mutation (E418K)과 관련하여, 도 6에 도시된 바와 같이, E418K mutation은 약물 결합자리와는 거리가 있다.
도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, E418K mutation 후에 energy minimization을 진행한 결과 새로 도입된 Lys418은 약물 결합자리 일부를 상대적으로 polar한 환경으로 바꾸며 또한 주변에 있는 Glu356과도 지속적으로 이온 결합하고 있음을 MD simulation을 수행하여 확인하였다. Mutation에 의해 결합자리 일부가 polar하게 되면 오히려 SN-38 약물 같이 polar한 작용기를 가지고 있는 물질들은 Lys418 및 Glu356과 이온성 상호작용을 하기 위하여 기존 바인딩 사이트를 살짝 이탈하면서 이동하는 것이 MD simulation에서 관측되었다. 이는 같은 계열 TOP1 저해제들이 공통적으로 갖고 있는 저해 활성 원리인 lactone과 Asp533 및 Lys532와의 상호작용을 약화시킬 수 있다.
Mutation된 TOP1 구조에 SN-38 약물을 docking 하였을 때, 비록 SN-38 약물은 본 결합자리에서 이탈하여 사이드 쪽으로 이동하였지만, 새로운 수소결합(H-bonding) 등을 획득하여 좋은 결합 docking score를 보여주고 있어서 docking score로는 mutation된 TOP1이 SN-38에 내성을 보이는 현상을 설명하기에는 한계가 있다.
도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, MD simulation 동안 SN-38 약물과 TOP1의 상호작용을 분석해 보면, mutation에 의해 Asp533 및 Arg488와의 SN-38 상호작용 (89%)이 10%이하로 감소되지만 Asn352 및 Glu356과의 작용은 40%에서 80% 수준으로 증가하는 것을 확인되었다.
TOP1 Mutation 후 docking을 진행하면, SN-38 약물은 새롭게 변형된 결합자리로 옮겨가 새로운 형태로 결합하며 기존과 유사한 점수의 score를 보여주고 있다(표 2).
반면, 표 2에 나타난 바와 같이, A-고리의 10번 탄소에 Polar한 작용기(-OH)를 갖고 있지 않는 Exatecan 약물, FL118 약물, 화학식 3의 화합물(PBX-7011) 및 화학식 3-1의 화합물(PBX-7012)는 새로운 결합자리의 일부 환경 변화로 인하여 mutation된 TOP1과의 상대적 docking score가 나빠진 것을 확인되었다. 그럼에도 불구하고, Exatecan 약물, FL118 약물, 화학식 3의 화합물(PBX-7011) 및 화학식 3-1의 화합물(PBX-7012)는 기존의 lactone과 Asp533 및 Lys532와의 상호작용이 유지되고 있음을 MD simulation으로 확인하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, TOP1 Mutation 되어도 화학식 3의 화합물(PBX-7011)는 기존의 결합모드를 (특히 lactone 및 -OH기) 그대로 유지하고 있다.
결론적으로, E418K mutation은 TOP1 저해제와 직접적으로 상호작용하지는 않지만, E418K에 의해 SN-38 약물에 대해 내성을 보이는 TOP1 mutation에 대해서도 FL118 약물이 높은 수준으로 inhibition하고 있는 상황을 설명하기 위해서는, mutation에 의해 변형된 결합자리에의 SN-38의 새로운 결합이 docking 결과와는 다르게 오히려 lactone과 Asp533 및 Lys532의 작용이 약화되는 형태로 진행되어 TOP1의 작용을 억제하지 못하는 결합이라는 가정을 생각해볼 수 있다.
이러한 가정하에, Exatecan 약물, FL118 약물, 화학식 3의 화합물(PBX-7011) 및 화학식 3-1의 화합물(PBX-7012)은, mutation된 TOP1의 Asp533 및 Lys532와도 지속적인 작용을 하여, 내성을 덜 보일 것으로 사료된다.
실시예 2
FL118, Exatecan, SN-38, Dxd, Exatecan-Lactic acid, PBX-7011, PBX-7014, PBX-7016, PBX-7024에 대해, 하기와 같이 anti-apoptotic protein들의 발현 저해 분석 및 in vitro Cell viability assay을 수행하였다.
2-1: Western blot을 통한 DDX5, survivin, Mcl-1, XIAP 및 cIAP2의 암-관련 생존 유전자 (cancer-associated survival genes)의 발현 억제 활성 확인
(1) protein extraction
6well plate에 well당 200000개의 FaDu 세포주를 파종(seeding)하고 항온배양(37℃, 5% CO2)하였다. 24시간 후, 0 nM, 10 nM, 100 nM의 농도로 약물(FL118 약물, SN-38 약물, exatecan 약물, PBX-7011, PBX-7014, PBX-7016)을 well에 각각 처리하였다. 24시간동안 항온배양(37℃, 5% CO2) 시켰다. well에 protease inhibitor cocktail을 녹인 RIPA buffer 100ul를 처리하였다. plate를 얼음 위에 박고 orbital shaker에서 2시간동안 항온배양하였다. lysis된 cell이 포함된 RIPA buffer를 ep tube에 옮기고 원심분리 (16000rcf, 20min, 4℃)시켰다. 이후 상층액만 새로운 ep tube에 옮겼다. protein assay를 통해 단백질의 농도를 확인하였다.
(2) 전기영동을 통한 단백질 분리
protein sample과 4x SDS-PAGE Loading Buffer를 3:1비율로 섞고 95℃에서 10분간 끓인 후 식혔다. 단백질의 양이 동일하게끔 샘플들을 gel의 well에 로딩하였다. 60V로 gel에서 전기영동하였다.
(3) 단백질을 gel에서 membrane으로 transfer
Trans-Blot® Turbo™ Transfer System의 cassettes에 활성화된 filter paper 7장, PVDF membrane, gel, filter paper 7장을 차례로 놓고 뚜껑을 닫고, 기계에 꽂은 후 protocol을 작동시켰다.
(4) Antibody incubation
transfer된 membrane을 blocking buffer에 담그고 항온배양(RT,1h) 시켰다. 그 다음, 1차 antibody solution에서 항온배양(4℃, overnight)하였다. TBST buffer로 3min동안 헹구었다(3회 반복). HRP가 conjugation된 2차 antibody solution에서 항온배양(RT,1h)시켰다. TBST buffer로 3min동안 헹구었다(3회 반복).
(5) Imaging과 결과 분석
membrane을 ECL substrate에 3~5min정도 담군 후 ChemiDoc™ MP Imaging System을 이용하여 signal을 확인하였다. 2차 항체에 결합된 HRP가 ECL의 Luminol을 산화시켜 방출되는 빛을 detection하여 이미지로 보여주었다. band의 굵기는 단백질의 양과 비례하므로 band의 굵기를 통해 단백질의 양을 비교할 수 있다.
도 10 내지 도 12에 도시된 바와 같이, 약물(FL118 약물, SN-38 약물, exatecan 약물, PBX-7011, PBX-7014, PBX-7016) 처리에 의해 단백질의 발현량이 어떻게 변하는지 확인하였다. GAPDH는 세포에서 필수적인 대사과정인 glycolysis에 관여하는 효소이며, 세포내에서 항상 발현되면서 그 발현량이 잘 변하지 않는 유전자로 샘플들이 동일양의 단백질이 gel 로딩되었는지 알 수 있는 지표이다.
동일한 방법으로 ABCG2를 발현하지 않는 FaDu 세포주 대신 ABCG2를 과발현하고 있는 A549를 파종(seeding)하고, protein 4ug loading하여, Western blot을 수행하였다(도 13 및 도 14).
고찰: PBX-7011, PBX-7014 및 PBX-7016 평가
FaDu 세포주에서 anti-apoptotic protein들의 발현 저해 정도를 Western blot을 통해서 확인한 결과, PBX-7011, PBX-7014 및 PBX-7016은 농도 증가에 따라 Survivin, cIAP2, Mcl-1, XIAP의 발현이 모두 감소하는 것을 보였으며, 기존 FL118, SN-38, Exatecan 약물과 비교했을 때, FL118 및 Exatecan 약물과는 유사한 수준, SN-38 보다는 더 좋은 것으로 나타났다.
실시예 2-1에서는, Topoisomerase 1을 억제하면서도 DDX5를 Degradation 시키는, Dual inhibition 작용을 나타내는 것으로서, DDX5 degradation이라는 이질적인 특징 및 그에 따른 항암 효과를 가지는 것을 확인하였다.
구체적으로, 2종의 cell line(FaDu, A549)에서 일정 농도(0, 10, 100 nM)의 약물을 처리하고 각 단백질(DDX, Survivin, Mcl-1, XIAP)의 발현량을 Western blot으로 확인한 결과, FL118에 의한 DDX5 degradation이 다른 물질들에 비하여 탁월하고, 다음으로 7011, 7016, 7014의 순서이었다.
DDX5 뿐만 아니라 그 down stream에 있는 다른 anti-apoptotic protein들의 경향도 이와 유사하였다.
요컨대, PBX-7014 및 PBX-7016은 제1형 토포이소머라제를 저해할 뿐만 아니라, Survivin, Mcl-1, XIAP 등을 조절하는 oncoprotein인 DDX5(p68)의 degrader로 작용하는 dual MoA를 보여주고 있다.
평가결과 PBX-7014, PBX-7016 가운데, PBX-7016은 DDX5를 농도의존적으로 저해하며, 그 결과 Survivin, Mcl-1, XIAP을 저해하는 것을 관찰함으로써 Topoisomerase I inhibitor 뿐만 아니라 FL118의 DDX5 degrader로써 역할이 PBX-7016에서도 보여줄 뿐만 아니라, PBX-7016이 PBX-7014에 비하여 탁월하게 작동하고 있음을 확인하였다(도 11 내지 도 14).
2-2: FaDu 세포주 / A549 세포주에 대한 Cell viability assay
96well plate에 well당 3000개의 FaDu 세포주(ABCG2를 발현하지 않는 암 세포) 또는 A549 세포주(ABCG2를 과발현하고 있는 암세포)를 파종(seeding)하고 항온배양(37℃, 5% CO2)하였다. 24시간 후, 9개 농도(1000nM부터 1/5씩 serial dilution)의 약물 100ul를 셀에 처리하였다. 이 때, Dxd 약물, PBX-7014, PBX-7016, PBX-7024을 처리하였다. 이때, 약물을 처리하지 않은 대조군(약물 농도 0)도 준비하였다. 3일 또는 6일동안 항온배양(37℃, 5% CO2) 시켰다. well에 CellTiter-Glo reagent(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega, G7571)를 사용) 100ul씩 추가한 후 파이펫팅해 주었다. 10분동안 항온배양 (RT)후 luminescence를 측정하였다. 약물농도가 0일 때의 발광 값을 100%로 볼 때, 50%의 발광 값을 나타내는 농도가 IC50값이다.
2종의 세포주(FaDu, A549)를 대상으로 2종의 화합물(PBX-7016, PBX-7024)과 reference 화합물(Dxd, SN-38, exatecan, FL118)을 처리하고 3일간 incubation을 통해 cell viability를 관찰하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, ABCG2를 발현하고 있지 않은 FaDu 세포주뿐만아니라 ABCG2를 과발현하고 있는 암세포주인 A549에서도 PBX-7024는 강력한 세포사멸 효능을 보인다. 즉, 기존 Enhertu에 사용되는 payload인 Dxd에 비하여 동등 이상 수준의 IC50를 갖는 것을 확인하였다.
ABCG2를 과발현하고 있는 암세포주인 A549에서는 도 15에서와 같이 Dxd를 비롯한 캄토테신 화합물들이 높아진 IC50 수치를 보이고 있는 것에 비하여 PBX-7016 및 PBX-7024는 여전히 강한 효력을 유지하고 있는 것을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 새로운 캄토테신 화합물인 PBX-7016 및 PBX-7024를 사용할 경우 기존 캄토테신 화합물들인 SN-38, DXd 등을 사용하는 ADC들과는 다르게 ABCG2의 과발현에 의한 내성 기전을 극복할 수 있는 효과를 가지고 있다.
실시예 3. New PBX-series compounds as candidate for ADC payload: in vitro cell viability test
실시예 2-2과 동일한 방법으로 MDA-MB-453(HER2++) 세포주 및 FaDu (HER2+) 세포주에 대한 Cell viability assay을 수행하였다.
2종의 세포주(MDA-MB-453, FaDu)를 대상으로 2종의 화합물(PBX-7014, PBX-7016, PBX-7018, PBX-7020, PBX-7022)과 1종의 reference 화합물(Dxd)을 처리하고 3일간 incubation을 통해 cell viability를 관찰하였다. 그 결과는 도 16에 나타나 있다.
도 16에 나타난 바와 같이, 평가 결과 PBX-7016, PBX-7018, PBX-7020, PBX-7022는 Dxd에 비하여 동등 이상 수준의 IC50를 갖는 것을 확인하였다. 또한, ABCG2를 발현하고 있지 않은 FaDu 세포주에서 Dxd와 동등 이상 수준의 IC50 값을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 4 PBX-7016 IV and IP Pharmacokinetic Profile in NOD SCID Mice
실험 방법은 하기 표 3과 같다. PBX-7016의 IV Plasma concentration-time data는 표 4에, PBX-7016 IP Plasma concentration-time data는 표 5에 나타나 있다.
표 4 및 표 5의 결과를 통해, PBX-7016 화합물은 마우스에 혈관내 또는 복강내로 투여하였을 때, 매우 빠른 시간내에 혈중에서 클리어런스가 일어나는 것을 확인함으로써, 프로드럭 또는 ADC의 형태가 아닌 PBX-7016 화합물 단독으로 생체내 투여시 높은 안전성을 보일 것으로 예상된다. PBX-7016 화합물을 IV 투여 시 매우 짧은 시간 내에 체외로 방출되는 것으로부터 체내로 들어가 이른 시기에 premature 하게 약물이 방출되었을 시에도 약물의 전신 노출을 줄일 수 있는 안전장치로 작용할 수 있다.
또한, 이 실험은 payload로 사용되는 PBX-7016 화합물 단독의 PK로서, 혈중에서는 단시간 내 PBX-7016 약물의 clearance가 일어나는 안전한 payload임을 시사한다. 즉, 종양부위에서 PBX-7016 화합물이 방관자살상효과를 발휘한 후, 혈액에 순환 시에도 안전하게 매우 짧은 시간 내에 체외로 방출되다는 것을 시사한다.
실시예 5. PBX-7016의 pH 6.0에서 카르복실레이트에서 락톤 형태로의 전환율(Carboxylate to Lactone conversion rate)
실시예 5(도 17 및 도 18)은 Top1 저해제의 활성인자로 알려진 캄토테신의 락토 부분의 활성화와 관련된 실험이다.
5-1. Carboxylate to lactone form conversion in pH 6.0
PBX-7016 powder를 DMSO에 5mM로 용해시켜 준비하였다. DMSO에 용해된 PBX-7016은 Lactone form으로 존재하므로 0.1 N NaOH로 1/10 dilution하여 25℃ water bath에 30분동안 incubation 시켜 carboxylate form로 전환시켰다. Carboxylate form의 PBX-7016을 10% DMSO가 포함된 4℃ PBS (pH 6.0)을 이용하여 3μM으로 희석하였다. 이때, 사용한 0.1 N NaOH와 같은 당량의 HCl을 첨가하여 pH변화를 최소화하였다. 희석 후 4℃ 2 mins, 13000 RCF 조건으로 원심 분리하여 상등액을 샘플로 이용하였다.
PBX-7016 lactone form이 생성될 때 이를 RP-HPLC로 분리하기 위해 2가지 용매, Solvent A: 100mM Acetate buffer pH 5.5 와 Solvent B: ACN을 이용하였다. 컬럼은 Cortecs C18 2.7μm, 4.6ⅹ50mm Column을 사용하였으며, 다음의 조건으로 분석 진행하였다: 1) 20 min : 5% B, 2) sample injection, 3) 2 min : 5% B, 4) 10 min : 5% B → 50% B, 5) 1 min : 50% B.
시간에 따른 변화를 측정하기 위하여 샘플 챔버는 37℃로 유지했으며, 측정시간마다 샘플이 injection 되게 설정하였다. 측정시간은 0, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 480, 600, 720, 840, 960, 1200, 1440 mins으로 하였다.
Lactone과 carboxylate 각각의 peak area로 함량을 구하였다. Lactone과 carboxylate의 흡광계수가 다르기 때문에, carboxylate area에 아래의 식을 곱하여 lactone area를 구하였다.
lactone EC390 / carboxylate EC390 = 0.918
PBX-7016 대신 FL118, SN38, DxD, exatecan, PBX-7014, PBX-7024을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 5-1와 동일한 실험을 수행하였다.
pH 6.0에서 카르복실레이트에서 락톤 형태로의 전환 실험 결과는 도 18에 나타나 있다. 도 18에 나타난 바와 같이, 다양한 캠토테신계 화합물들은 pH 6.0에서 유사한 속도와 동등 수준의 양으로 carboxylate에서 토포아이소머레이즈 I을 저해하는 활성형인 lactone으로 형태를 변하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 일반적으로 pH가 6.0인 미세종양환경(Tumor Micro-environment)에서 동등 수준의 활성을 띌 것으로 예측된다.
5-2. Lactone to carboxylate form conversion in pH 7.4
PBX-7016 powder를 DMSO에 5mM로 용해시켜 준비하고, 10% DMSO가 포함된 4℃ PBS (pH 7.4) 로 희석하여 3μM PBX-7016을 준비하였다. 이후, 이를 4℃ 2 mins, 13000 RCF 조건으로 원심 분리하여 상등액을 샘플로 이용하였다. DMSO에 용해된 상태의 PBX-7016은 Lactone form으로 존재하였다.
PBX-7016 carboxylate form 이 생성될 때 이를 RP-HPLC로 분리하기 위해 2가지 용매, Solvent A: 100mM Acetate buffer pH 5.5 와 Solvent B: ACN을 이용하였다. 컬럼은 Cortecs C18 2.7μm, 4.6ⅹ50mm Column을 사용하였으며, 다음의 조건으로 분석 진행함. 1) 20 min : 5% B, 2) sample injection, 3) 2 min : 5% B, 4) 10 min : 5% B → 50% B, 5) 1 min : 50% B.
시간에 따른 변화를 측정하기 위하여 샘플 챔버는 37℃로 유지했으며, 측정시간마다 샘플이 injection 되게 설정하였다. 측정시간은 0, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 480, 600, 720 mins으로 하였다.
Lactone과 carboxylate 각각의 peak area로 함량을 구하였다. Lactone과 carboxylate의 흡광계수가 다르기 때문에, carboxylate area에 아래의 식을 곱하여 lactone area를 구하였다.
lactone EC390 / carboxylate EC390 = 0.918
PBX-7016 대신 FL118, SN38, DxD, exatecan, PBX-7014, PBX-7024을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 5-2와 동일한 실험을 수행하였다.
pH 7.4에서 락톤 형태에서 카르복실레이트로의 전환 실험 결과인 도 17에 나타난 바와 같이, 혈중 또는 세포외액의 pH인 7.4에서 화학식 1로 표시되는 PBX-7014, PBX-7016 및 PBX-7024 화합물이 다른 reference 화합물들(엑사테칸, DXd, SN-38, FL118)에 비하여 더 빠를 뿐만 아니라 더 높은 비율로 lacton 형태(활성형)에서 TOP1　제해제로서 활성이 없는 carboxylate 형태(비활성형)로 변환되는 것을 확인하였다.
특히, 혈중　pH 7.4에서　TOP1　제해제로서 활성이 없는　carboxylate form의 형성 정도(63~86%)와 속도(0.4~0.8%/min)는 캄토테신 유도체 종류에 따라 차이가 크다. PBX-7014, PBX-7016은　86%　이상의　carboxylate form을 형성하고,　모두 분당　0.8%　수준으로 상대적으로 빠르게　lactone form에서　carboxylate form으로 전환되었다. 경쟁약물인　DXd는　76.5%　수준의　carboxylate form을 형성하고,　분당　0.6%　수준으로　lactone form에서　carboxylate form으로 전환되었다.
이를 통해서 PBX-7014, PBX-7016 화합물이 reference 화합물들에 비하여 상대적으로 혈중에서 빠르고 높은 비율로 세포독성을 보이는 활성형인 lacton이 아니라 불활성형인 carboxylate로 존재하여 정상세포에서 높은 안전성을 보일 것으로 예측된다.
제조예 5: PBX-7014 및 PBX-7016로부터 25-4 및 25-6의 합성 및 이의 ADC(DAR7-8) 제조 (Trastuzumab-25-4 및 Trastuzumab-25-6)
2종의 화합물(PBX-7014, PBX-7016)를 포함하고 enzymatically cleavable linker system인 GGFG를 도입한 linker-payload인 25-4 (화학식 10) 및 25-6(화학식 11)을 합성하였다.
[화학식 10]
[화학식 11]
25-4의 분자구조는 GGFG-PBX-7014 이고, 25-6의 분자구조는 GGFG-PBX-7016 이다. 즉, 각각 엔허투(Enhertu®)와 동일한 GGFG 링커를 사용한 것이다.
나아가, 엔허투(Enhertu®)와 동일한 GGFG 링커 및 Trastuzumab 항체를 사용하여 PBX-7014 및 PBX-7016를 페이로드로 하여 이의 ADC를 제조하였다.
화학식 10 및 화학식 11의 Linker-payload 화합물을 Her2 target 항체인 Trastuzumab과 conjugation하여 ADC합성하였다. (Tra-25-4 and Tra-25-6, 모두 DAR 8).
Trastuzumab-25-4(Trastuzumab-7014)는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 준비된 Trastuzumab은 PD-10 desalting column을 이용하여 Reaction buffer (150mM NaCl, 50mM Histidine pH 6.0)로 buffer exchange 후 825uM TCEP을 27.5uM의 항체에 25℃, 2시간 처리하여 항체의 disulfide로부터 반응에 필요한 thiol 자리를 만들었다.
이후 PD-10 desalting column을 이용하여 여분의 TCEP을 제거하였으며, 10% DMSO를 포함하는 Reaction buffer에서 61.9uM 25-4 drug linker(화학식 10) 와 13.8uM reduction 된 Trastuzumab을 25℃ 1시간 반응하여 1차 conjugation 반응을 진행하였다.
Trastuzumab-25-6(Trastuzumab-7016)의 경우 동일한 과정을 통해 제조되었으며, 61.9uM 25-4 drug linker(화학식 10) 대신 동일농도의 25-6 drug linker(화학식 11)를 사용하였다.
이후 SEC를 이용하여 각각의 ADC를 정제하였으며, aggregation없이 monomer로 정제되었음을 확인하였다(도 19). SDS-PAGE를 통하여 light chain 및 heavy chain의 band shift을 통해 drug이 conjugation 되었음을 확인하였다(도 20a).
제조예 6: PBX-7016로부터 25-6의 합성 및 이의 ADC(DAR7-8) 제조 (Nimotuzumab-25-6 및 Sacituzumab-25-6)
Trastuzumab 대신 Nimotuzumab, Sacituzumab 또는 Cetuximab 를 사용한 것을 제외하고 제조예 5와 동일한 방법으로, Nimotuzumab-25-6, Sacituzumab-25-6 및 Cetuximab-25-6를 합성하였다.
이후 SEC를 이용하여 각각의 ADC를 정제하였으며, aggregation없이 monomer로 정제되었음을 확인하였다. SDS-PAGE를 통하여 light chain 및 heavy chain의 band shift을 통해 drug이 conjugation 되었음을 확인하였다(도 20b, 도 20 c, 및 도 20d).
실시예 6. Anti HER2 ADCs with PBX-payloads: binding affinity analysis
Coating buffer는 타깃 antigen을 ELISA plate coating buffer (R&D systems, #DY006)를 이용하여 0.66 μg/ml로 희석해 준비하였다. 준비한 Coating buffer를 well당 100 μL씩 이용해 Coating하였다. Plate 커버를 닫고, 2 ~ 8 ℃로 유지하며 overnight (12~18시간)으로 진행하였다. 사용하는 Plate는 Corning, #3590으로 하였다. 200 μL 이상의 TBS Tween-20 buffer (thermo, #28360)를 이용해 3회 washing 하였다. Washing시 우선 파이펫으로 액체를 제거 후, 페이퍼 타올 위로 살살 쳐서 여분의 buffer를 제거하였다. Blocking은 200 μL의 Assay buffer를 이용하여 1시간동안 room temperature에서 실시하였다. 파이펫으로 액체를 제거하고 페이퍼 타올에 살살 쳐서 여분의 buffer를 제거하였다. 측정할 Control antibody 및 ADC를 assay buffer에 1μg/ml 로 준비한 후 1/5 serial dilution을 통해 다음과 같은 농도로 필요량 이상 제조하였다. 예를 들어, Duplication 기준 [240ul assay buffer + 이전농도의 시료 60ul ]로 다음과 같은 농도로 희석하여 샘플을 제조하면 된다: 1μg/ml, 0.4μg/ml, 0,08μg/ml, 0.016μg/ml, 0.0032μg/ml, 0.00064μg/ml, 0.000128μg/ml. 희석해 둔 control antibody 및 ADC를 coating된 well당 100 μL씩 duplicate로 binding 시켰다. 상온에서 1시간 진행하였다. 100ul의 TBS Tween-20 buffer (thermo, #28360)를 이용해 3회 washing 하였다. Washing시 우선 파이펫으로 액체를 제거 후, 페이퍼 타올에 살살 쳐서 여분의 buffer를 제거하였다. Detection antibody를 제조사 메뉴얼 참조하여, Assay buffer에 희석하여서 준비하였다. Human antibody의 경우 Goat anti-Human Fc-HRP (Novex, #A18817)를 detection antibody로 이용하며 1/2000으로 희석하여 준비하였다. 각 well에 희석된 detection antibody를 100 μL씩 첨가 후 상온에서 1시간동안 incubation 시켰다. 100ul의 TBS Tween-20 buffer (thermo, #28360)를 이용해 3회 washing 하였다. Washing시 우선 파이펫으로 액체를 제거 후, 페이퍼 타올에 살살 쳐서 여분의 buffer를 제거하였다. 100 μL의 TMB substrate solution (Thermo, #N301)을 이용하여 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 100 μL의 Stop solution (Thermo, N600)을 이용하여 반응을 멈추었다. 반응을 멈추고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Stop solution 첨가 후 30분 이내로 완료하였다. 버블이 존재할 시 새로운 플레이트에 100 ~ 150ul 옮겨서 측정하였다. 이를 통하여 트라스트주맙 및 트라스트주맙과 PBX-7014와 컨쥬게이션한 ADC 및 트라스트주맙과 PBX-7016을 컨쥬게이션한 ADC를 측정하여 도 21의 결과를 얻었다. 도 21에 나타난 바와 같이, 트라스트주맙이 갖는 Her2 항원에 대한 결합세기 대비 트라스트주맙에 PBX-7014 또는 PBX-7016을 컨쥬게이션시킨 ADC의 Her2 항원에 대한 결합세기를 다양한 농도에서 실시하였을 때, 결합세기의 차이가 없는 것을 확인하였다.
실시예 7. Anti HER2 ADCs with PBX-payloads : in vitro potency and target selectivity
Dxd, PBX-7014 및 PBX-7016을 각각 payload로 하는 ADC에 대해, 실시예 2-2와 동일한 방법으로, 하기와 같이 MDA-MB-453(HER2++) 세포주, FaDu (HER2+) 세포주 및 MDA-MB-468(HER2-) 세포주에 대한 in vitro Cell viability assay을 수행하였다.
이때, HER2 표적치료제인 허셉틴(Herceptin, 성분명: Trastuzumab), Dxd 약물, PBX-7014(제조예 2), PBX-7016(제조예 3), 이의 ADC인 Tra-25-4, Tra-25-6(제조예 5) 및 Tra-Dxd (엔허투(Enhertu®))을 처리하였다.
Reference로서 Enhertu (Tra-Dxd, DAR 8)를 Her2 발현양에 따른 3종의 세포주, MDA-MB-453(Her2++), FaDu(Her2+), MDA-MB-468(Her2-)에 각각 처리하고 3일간 incubation을 통해 cell viability를 관찰하였다(도 22).
도 22에 나타난 바와 같이, PBX-페이로드가 있는 anti Her2 ADC가 우수한 표적 선택성(target selectivity)을 가지고 있음을 확인하였다.
고찰: ADC payload로서 PBX-7014 및 PBX-7016 평가
도 22에 나타난 바와 같이, Her2++인 MDA-MB-453에서 PBX-7016을 payload로 하는 ADC(Tra-25-6)이 Enhertu(Tra-Dxd)에 비하여 대략 5배 정도 우수한 IC50값을 갖는 것을 확인하였으며, Negative 세포주인 MDA-MB-468에서는 동등 수준의 IC50값을 갖는 것을 확인함으로써, 화학식 10 및 화학식 11의 linker-payload system이 ADC로 개발했을 때 Positive/Negative 세포주를 구별하여 작동할 뿐만 아니라, reference인 Enhertu에 비하여 우수한 효력을 보이는 것을 확인하였다.
고찰: PBX-7016의 독창성 및 우수성
본 발명에 따라 화학식 1에서 새롭게 설계 및 합성한 camptothecin계 화합물인 PBX-7016은 MD-CPT 골격인 FL118로부터 새롭게 도출된 화합물이며, FL118이 Topoismerase I 저해제로서 작용할 뿐만 아니라 DDX5 degrader로서도 작용하고 있는 것과 동일하게 DDX5를 degradation시키는 새로운 Topoismerase 1 저해제를 새롭게 제시한다(도 11 내지 도 14).
또한 Cell viability를 단순 비교하였을 때, PBX-7016은 Dxd에 비하여 1.5~2배 수준의 IC50값을 보이고 있으나, 놀랍게도 ADC payload로 사용되었을 때, PBX-7016을 포함하는 ADC가 Dxd를 포함하는 ADC(Enhertu)에 비하여 약 5배 정도 우수한 cell viability를 갖는 것을 확인하였다(도 22).
실시예 8. Anti HER2 ADCs with PBX-payloads : in vivo efficacy
8-1. 세포 배양
JIMT-1 유방암 세포는 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 10 % FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 함유 DMEM으로 배양하고, 트립신-EDTA 처리에 의해 주 2 회 일상적인 방법으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
8-2. BALB/c Nude 마우스
SCID 마우스와 BALB/c Nude Mice는 모두 면역 체계를 연구하고 다양한 질병에 대한 치료법을 테스트하기 위한 동물 모델로 사용된다.
SCID 마우스와 BALB/c 누드 마우스 모두 면역 체계가 손상되었지만 면역 결함의 기본 메커니즘은 다르다.
SCID 마우스는 유전 공학적으로 기능적 T 세포와 B 세포가 결여된 마우스로 면역 체계가 심각하게 손상된 것이다. 이들은 면역 체계 발달 및 기능을 연구하고 자가 면역 장애 및 특정 유형의 암과 같은 면역 체계에 영향을 미치는 질병에 대한 잠재적 치료법을 테스트하는 데 사용된다.
반면에 BALB/c 누드 마우스는 흉선이 없어서 T 세포를 생산할 수 없는 마우스이다. 이들은 또한 털이 없는 유전자에 결함이 있어 머리카락 없이 태어난다. 이 마우스는 면역 반응에서 T 세포의 역할을 연구하고 특정 유형의 암과 같이 T 세포 기능에 영향을 미치는 질병에 대한 잠재적 치료법을 테스트하는 데 사용된다.
8-3. 종양 접종 및 약물 처리
마트리겔이 있는 0.2 mL의 DPBS 내 JIMT-1 종양 세포 (5 x 106)를 각 BALB/c Nude Mice 오른쪽 앞 옆구리에 피하로 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 215 mm3에 도달했을 때 동물을 무작위로 그룹화한 다음, 약물 효능 연구를 위한 치료를 하기와 같이 시작하였다.
Treatment: I.V., Q1W
Vehicle 군: Vehicle,0 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Isotype-Dxd(3) 군: CTP63-Dxd, 3 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Isotype-Dxd(10) 군: CTP63-Dxd, 10 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Isotype-PBX7016(3) 군; CTP63-PBX7016, 3 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Isotype-PBX7016(10) 군: CTP63-PBX7016,10 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Isotype-PBX7014(3) 군: CTP63-PBX7014, 3 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Isotype-PBX7014(10) 군: CTP63-PBX7014,10 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Trastuzumab-PBX7014(3) 군: CTP6-PBX7014,3 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Trastuzumab -PBX7014(10)군: CTP6-PBX7014, 10 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Trastuzumab -PBX7016(3) 군: CTP6-PBX7016, 3 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Trastuzumab -PBX7016(10) 군: CTP6-PBX7016, 10 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Enhertu (3) 군: Enhertu, 3 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
Enhertu (10)군: Enhertu,10 mg/kg,5 μL/g,i.v.,Twice(Day 0,day 6)
8-4. 종양 측정 및 종료점
종양 성장이 지연될 수 있는지 또는 마우스가 치료될 수 있는지 확인할 수 있는 시점을 주요 종료점으로 삼았다. 종양의 2 차원적 크기는 캘리퍼 (caliper)를 사용하여 매주 두 번 측정하였고, 부피는 공식 (V = 0.5 a x b2, 여기서 a와 b는 각각 종양의 긴 지름과 짧은 지름)을 사용하여 mm3로 표시하였다.
각 그룹에 대해 TGI (Tumor growth inhibition)를 계산하였다.
TGI (%) = [1 - (Ti - T0) / (Vi - V0)] × 100
(Ti는 주어진 날짜에 치료군의 평균 종양 부피, T0은 치료 첫날 치료군의 평균 종양 부피, Vi는 Ti와 같은 날 비히클 대조군의 평균 종양 부피, V0는 치료 첫날에 비히클 그룹의 평균 종양 부피임).
체중 감소가 15 % 이상이거나 종양 부피가 3000 mm3 이상인 동물은 인도적 종료점으로 안락사하였다.
8-5. 통계 분석
결과는 평균 및 표준 오차 (평균 ± SEM)로 표시하였다. 데이터는 Graphpad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 양방향 RM ANOVA Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석되었으며 p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
하기 표 6은 시간에 따른 Tumor Volume (mm³)의 추이(effect vs. time)를 나타낸 것이다.
표 6을 그래프로 나타낸 도 23는 JIMT-1 세포주를 이식한 마우스, 즉 in vivo xenograft 모델에서 다양한 캄토테신계 약물을 payload로 하는 ADC에 대한 효력시험 결과를 보여주고 있다.
8-6. JIMT-1 종양 모델의 체중
JIMT-1 종양 모델 마우스의 체중을 정기적으로 모니터링하였다(도 24).
실시예 9: Anti HER2 ADCs with PBX-payload: Bystander effect study
주변세포살상효과(bystander effect)는 ADC 약물로서의　효능에 중요한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 주변세포살상효과(bystander effect) 확인을 위해, 40 nM ADC 처리 조건에서 FACS로　분석하였다.
HER2　단백질을 타겟으로 하는　Trastuzumab　항체에　페이로드-링커가 결합된　Antibody-Drug Conjugate(ADC)에서 본 발명의 선도물질인 PBX-7016을 페이로드로 이용하여 ADC　약물로서의　효능 및 효용성을 검증하고자, 유세포분석　(Flow cytometric analysis)　실험을 통해　in vitro로 주변세포살상효과(bystander effect)를　확인하였다.　HER2　양성 세포주인　MDA-MB-453에　ADC　처리하여 이로　인한　세포사멸이 유도되고, 세포사멸되는 과정에서　방출된　약물　(payload)가 주변의　HER2　음성 세포주에 독성을 유발하여 세포사멸에 이르게 하는　것을 본 실시예에서　주변세포살상효과(bystander effect)로 정의하였다.
　 제조예 5에서, 제조한　ADC의　in vitro bystander effect　를 평가하고자,　6　well scale 의 cell culture　plate　에　HER2　발현 음성 세포주와 HER2 발현 양성 세포주를 섞어서 비율별로 coculture 한 조건에서 ADC 처리로 인한 bystander effect 여부를　평가하였다.
구체적으로는,　HER2　발현 음성 세포주인　MDA-MB-468에　GFP (Green fluorescent protein)　단백질을 발현하도록　제작한　GFP-MDA-MB-468　세포　(3 x 10^5 cells)와　HER2　발현 양성 세포주인　MDA-MB-453　세포　(1 x 10^5 cells)　을　3:1의 비율로 섞어　24시간 동안　coculture　배양한 후,　Trastuzumab　항체 및　총　5종의　ADC　샘플　(Trastuzumab-DXd, Isotype IgG-DXd,　Trastuzumab-25-6,　Isotype IgG-25-6,　Enhertu)　을 각 각　40　nM　농도로 처리하고　6일간　세포 배양한 다음,　유세포분석을　통해　살아있는 세포 중　HER2　발현 음성 세포주인　GFP-MDA-MB-468　세포의　GFP　형광 측정　및　세포 수를　확인하였다.
또한,　동시에　6 well　cell culture　plate　에　HER2　발현 음성 세포주인　MDA-MB-468　세포　(3 x 10^5 cells)　와　HER2　발현 양성 세포주인　MDA-MB-453　세포　(1 x 10^5 cells)　을　3:1의 비율로 섞어　24시간 동안　coculture　배양한 후, Trastuzumab　항체 및　총　5종의　ADC　샘플　(Trastuzumab-DXd, Isotype IgG-DXd,　Trastuzumab-25-6,　Isotype IgG-25-6,　Enhertu)　을 각각　40　nM　농도로 처리하고　6일간　세포 배양한 다음, HER2　단백질을 인식할　수 있는 항체에　FITC (Fluorescein isothiocyanate) fluorochrome dye 를　표지하여　형광을 나타내도록 한　anti-HER2-FITC　항체를 활용하여　세포 염색한 후,　유세포분석을 통해　살아있는 세포 중　HER2　발현　양성 세포주인　MDA-MB-453　세포의　FITC　형광 측정　및　세포 수를　확인하였다.
유세포분석은　6 well　cell culture　plate　의 각　well　에 존재하는 세포들을 채취하여　buffer (400　ul)　로 희석한　후,　FL1 laser　를 사용하여　각　샘플 당 동일한 시간　(1　분 씩)　및　동일한　flow　로　GFP　또는　FITC　형광을 측정하였다.
도 25 및 도 26에 도시된 바와 같이, 유세포분석을　통해　확인한 결과,　PBX-7016　기반의　ADC인　Trastuzumab-25-6은　DXd　기반의　ADC인　Trastuzumab-Dxd　및　Enhertu와 비교했을 때, HER2　발현 양성 세포를　사멸시켰을　뿐 아니라　HER2　발현 음성 세포의 사멸이 동시에 나타나 기존　DXd 기반의 Enhertu　와　동등 수준의　bystander effect　를 나타냈다고 판단되며,　그에　반해　negative control ADC인　Isotype IgG-DXd,　Isotype IgG-25-6　은　ADC　를 처리하지 않은　untreat　조건 대비　HER2 발현　음성 세포사멸이 크게 유도되지 않음을 확인하였다.
요컨대, PBX-7016을 사용한 Anti HER2 ADC는 Enhertu와 유사한 방관자 효과를 나타내었다.
실시예 10: Cetuximab-25-6 및 Sacituzumab-25- 6의 in vitro cell cytotoxicity test
실시예 2-2과 동일한 방법으로 MDA-MB-468(EGFR positive) 세포주와 SW480(EGFR negative) 세포주를 대상으로 Cetuximab-25-6 (도 27a); 및 FaDu(Trop2+++) 세포주와 Calu-6(Trop2--) 세포주를 대상으로 Sacituzumab-25-6(도 27b)을 처리하고 6일간 incubation을 통해 cell viability assay을 수행하였다. 그 결과는 도 27에 나타나 있다.
도 27는 Cetuximab-25-6 및 Sacituzumab-25-6와 같은 ADC에서도 세포막 단백질에 대한 고친화성 mAb 결합을 통해 표적 세포 집단에 상당 부분의 mAb를 국소화할 수 있으며, PBX-7016 페이로드와 항암 mAb의 화학 접합은 PBX-7016 페이로드가 암세포로 전달되는 선택성을 증가시켜 페이로드의 치료 지수를 증가시킴을 시사한다.
특히, FaDu(Trop2+++) 세포주와 Calu-6(Trop2--) 세포주를 대상으로 Sacituzumab-25-6 및 PBX-7016에 대한 in vitro cell viability (ADC 6 days Treatment) 비교 평가 결과(도 27b)는, 화학식 1로 표시되는 활성형 캄토테신 유도체(a)의 일례로 생체내 표적부위에서 방출하도록 설계된 PBX-7016이 비표적 세포의 세포막을 관통해 세포내로 이동하여 세포사멸 기전을 발휘할 수 있다는, 즉 PBX-7016 기반 ADC이 주변세포 살상 효과(bystander effect)을 발휘할 수 있다는 것을 시사한다.

Claims (16)

  1. 화학식 5 또는 화학식 5-1로 표시되는 캄토테신 유도체, 이의 약제학적 허용염, 또는 이의 용매화물.
    [화학식 5]

    [화학식 5-1]

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항의 캄토테신 유도체, 이의 약제학적 허용염, 또는 이의 용매화물을 포함하는 약물-링커로서, 화학식 11의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 약물-링커.
    [화학식 11]

  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 따른 약물-링커에 트라스투주맙(Trastuzumab)이 접합(conjugation)된 항체-약물 접합체(ADC).
  15. 제14항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 위암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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