KR20220009437A - 올리고뉴클레오타이드의 탈보호 방법 - Google Patents

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 산을 사용한 컬럼 상의 탈보호를 통해 올리고뉴클레오타이드의 5'-O-올리고뉴클레오타이드 말단에서 산 불안정 5'하이드록시 보호기를 제거하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 신규한 정제 방법에 관한 것이다.

Description

올리고뉴클레오타이드의 탈보호 방법
본 발명은 산을 사용한 컬럼 상의 탈보호를 통해 올리고뉴클레오타이드의 5'-O-올리고뉴클레오타이드 말단에서 산 불안정 5'하이드록시 보호기를 제거하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 신규한 정제 방법에 관한 것이다.
일반적으로 고체상 합성을 통해 제조되는 올리고뉴클레오타이드는, 고체 지지체로부터 절단된 후, 여전히 상당한 양의 불순물을 포함한다. 15- 내지 20-머 길이의 표준 단량체의 경우 API 순도는 기껏해야 70 내지 80%의 범위이다. 화학적으로 변형된 단량체 또는 더 긴 서열의 경우에 API 함량은 일반적으로 훨씬 더 낮다.
치료적 적용을 위한 사양을 충족하는 고순도 올리고뉴클레오타이드 제조를 위해 선택적 분리 방법이 개발되었다.
한 방법에서 올리고뉴클레오타이드는, 고체 지지체로부터 절단된 후, 5'-O-올리고뉴클레오타이드 말단에서 산 불안정 5'하이드록시 보호기와 함께 남겨진다. 이 기의 소수성은 정제를 위한 효과적인 크로마토그래피 기술의 적용을 허용한다.
미정제 올리고뉴클레오타이드가 다음 단계를 통과하는 것이 일반적인 전략이다 (예를 들어 Krotz et al, Organic Process Research & Development 2003, 7, 47-52):
a) 역상 크로마토그래피
b) 농축 및 탈염
c) 용액 중에서 산 불안정 5'하이드록시 보호기의 제거 및
d) 추가 농축 및 탈염
이러한 알려진 방법은 단일 작업 단계 a) 내지 d)의 수로 인해 상당한 작업 시간을 필요로 하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 목적은 정제 단계의 수를 감소시켜 작업 시간을 단축시키고 또한 더 높은 전체 수율에 도달하려는 시도였다.
본 발명의 목적은 위에 개략된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드의 정제를 위한 신규한 방법으로 달성될 수 있음이 밝혀졌다.
하기의 정의는 본원의 발명을 설명하기 위해 사용된 다양한 용어의 의미 및 범위를 예시하고 정의하기 위해 제시된다.
용어 산 불안정 5'하이드록시 보호기는 적합한 산의 도움으로 절단될 수 있고 소수성 특징을 갖는 보호기로 정의된다.
전형적인 산 불안정 5'하이드록시 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸, 4-메톡시트리틸, 트리틸, 9-페닐-잔텐-9-, 9-(p-톨릴)-잔텐-9-일 또는 tert-부틸디메틸실릴, 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸, 4-메톡시트리틸 또는 트리틸 또는 더욱더 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸로부터 선택된다.
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 둘 이상의 공유적으로 연결된 뉴클레오타이드를 포함하는 분자로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 치료적으로 가치 있는 올리고뉴클레오타이드로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 10 내지 40 개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10 내지 25 개의 뉴클레오타이드 길이를 포함하도록 합성된다.
올리고뉴클레오타이드는 임의로 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오사이드 단량체 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
LNA 뉴클레오사이드 단량체는 뉴클레오타이드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이의 링커 기 또는 가교를 포함하는 변형된 뉴클레오사이드이다. 이들 뉴클레오사이드는 문헌에서 가교 핵산 또는 이환 핵산(BNA)으로도 명명된다.
본원에서 사용된 임의로 변형된은 동등한 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오사이드와 비교하여 당 모이어티 또는 핵염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입에 의해 변형된 뉴클레오사이드를 지칭한다. 바람직한 구체예에서 변형된 뉴클레오사이드는 변형된 당 모이어티를 포함하고, 예를 들어 하나 이상의 2' 치환된 뉴클레오사이드 및/또는 하나 이상의 LNA 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 용어 변형된 뉴클레오사이드는 또한 용어 "뉴클레오사이드 유사체" 또는 변형된 "단위체" 또는 변형된 "단량체"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오사이드는 일반적으로 두 개의 뉴클레오사이드를 함께 공유적으로 결합하는 포스포디에스테르(P=O) 및/또는 포스포로티오에이트(P=S) 뉴클레오사이드간 연결에 의해 연결된다.
따라서, 일부 올리고뉴클레오타이드에서 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포디에스테르(P=O)로 구성될 수 있고, 다른 올리고뉴클레오타이드에서 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트(P=S)로 구성될 수 있고 또는 또 다른 올리고뉴클레오타이드에서 뉴클레오사이드간 연결의 서열은 달라지고 포스포디에스테르(P=O) 및 포스포로티오에이트(P=S) 뉴클레오사이드간 연결을 모두 포함한다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U에 의해 표시될 수 있고, 여기서 각각의 문자는 임의로 동등한 기능의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오타이드에서, 핵염기 모이어티는 DNA 뉴클레오사이드에 대해 대문자 A, T, G 및 MeC(5-메틸 시토신)로 기재된다. 변형된 핵염기는 tert-부틸페녹시아세틸, 페녹시아세틸, 벤조일, 아세틸, 이소부티릴 또는 디메틸포름아미디노와 같은 보호기를 보유하는 핵염기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다 (Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese of March 24, 2016 참조).
올리고뉴클레오타이드 합성의 원리는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis, of March 15, 2016 참조).
오늘날 대규모 올리고뉴클레오타이드 합성은 컴퓨터 제어된 합성기를 사용하여 자동으로 수행된다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 고체상 합성이며, 조립되는 올리고뉴클레오티드는 3'-말단 히드록시기를 통해 고체 지지체 물질에 공유 결합되고 사슬 조립의 전체 과정에 걸쳐 부착된 상태로 유지된다. 적합한 지지체는 Cytiva의 Primer 지지체 5G 또는 Kinovate의 NittoPhase®HL 지지체와 같은 상업적으로 입수 가능한 거대 다공성 폴리스티렌 지지체이다.
올리고뉴클레오티드 합성은 원칙적으로 원하는 서열이 조립될 때까지 성장하는 사슬의 5'-말단에 뉴클레오티드 잔기를 단계적으로 첨가하는 것이다.
일반적으로, 각 첨가는 합성 주기로 지칭되며 원칙적으로 하기의 화학 반응들로 구성된다:
a1) 고체 지지체 상에서 5'보호된 하이드록실기 탈보호,
a2) 고체 지지체 상에서 활성화된 포스포라미다이트로서의 제1 뉴클레오사이드와 유리 5'하이드록실기의 커플링,
a3) 각각의 P-연결된 뉴클레오사이드를 산화 또는 황화시켜 각각의 포스포디에스테르(P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트(P=S)를 형성;
a4) 임의로, 고체 지지체 상에서 임의의 미반응 5'하이드록실기 캡핑,
a5) 고체 지지체에 부착된 제1 뉴클레오사이드의 5'하이드록실기 탈보호;
a6) 활성화된 포스포라미다이트로서 제2 뉴클레오사이드를 커플링하여 각각의 P-O 연결된 이합체 형성;
a7) 각각의 P-O 연결된 디뉴클레오사이드를 산화 또는 황화시켜 각각의 포스포디에스테르(P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트(P=S)를 형성;
a8) 임의로, 임의의 미반응 5'하이드록실기 캡핑;
a9) 원하는 서열이 조립될 때까지 이전 단계 a5 내지 a8 반복.
고체 지지체로부터의 후속 절단은 진한 수성 암모니아를 사용하여 수행될 수 있다. 포스페이트 및 뉴클레오타이드 염기 상의 보호기가 또한 이 절단 절차 내에서 제거된다.
절단 후 미정제 올리고뉴클레오타이드는 5'-O-올리고뉴클레오타이드 말단에서 산 불안정 5'하이드록시 보호기와 함께 남겨진다.
올리고뉴클레오타이드 정제 방법은 산을 사용한 컬럼 상의 탈보호를 통해 올리고뉴클레오타이드의 5'-O-올리고뉴클레오타이드 말단에서 산 불안정 5'하이드록시 보호기를 제거하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "컬럼 상의 탈보호"는 5'-O-올리고뉴클레오타이드 말단에서의 산 불안정 5'하이드록시 보호기의 탈보호가 크로마토그래피 컬럼, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 더욱 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에서 직접 일어남을 의미한다.
음이온 교환 크로마토그래피는 샘플 용액의 하전된 이온과 사용된 완충 매질의 경쟁적 상호작용을 기반으로 한다. 이는 통상적인 상업적을 입수 가능한 음이온 교환 수지, 바람직하게는 트리메틸암모늄-작용성을 갖는 것으로 수행될 수 있다. 이러한 상 물질은 예를 들어 Cytiva, Tosoh Bioscience, Bio-Rad 또는 Merck로부터 획득될 수 있다. 전형적인 음이온 교환 수지는 Tosoh Bioscience로부터 입수 가능한 TSKgel Super Q-5PW (QAE) 또는 Cytiva의 Source 30Q 수지이다.
위에서 약술한 바와 같이 산 불안정 5'하이드록시 보호기는 일반적으로 4,4'-디메톡시트리틸, 4-메톡시트리틸, 트리틸, 9-페닐-잔텐-9-, 9-(p-톨릴)-잔텐-9-일 또는 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되지만, 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸이다.
컬럼 상의 탈보호 방법은 편의상 다음 단계를 포함한다
a. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제1 평형화 단계;
b. 미정제 올리고뉴클레오타이드의 희석된 암모니아 수용액을 음이온 교환 컬럼에 충전하는 단계;
c. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제2 평형화 단계;
d. 포스페이트 염, 유기 용매 및 알칼리 할라이드를 포함하는 완충액으로 컬럼을 세척하는 단계;
e. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제3 평형화 단계;
f. 산을 사용한 컬럼 상의 탈보호 단계;
g. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제4 평형화 단계;
h. 포스페이트 염, 유기 용매 및 알칼리 할라이드를 포함하는 완충액으로 탈보호된 올리고뉴클레오타이드를 용리하고, 후속하여 포스페이트 염, 유기 용매 및 알칼리 할라이드를 포함하는 완충액으로 음이온 교환 컬럼을 등용매 세척하는 단계.
완충 용액은 일반적으로, 유기 용매 및 방법 단계에 따라 알칼리 할라이드를 추가로 포함하는 포스페이트 완충 용액이다.
완충 용액 중의 포스페이트는 일반적으로 알칼리 포스페이트, 예컨대 모노- 또는 디-소듐 또는 -포타슘 포스페이트 또는 이들의 혼합이지만, 바람직하게는 모노- 소듐 포스페이트 또는 디-소듐 포스페이트 또는 이들의 혼합이다.
완충 용액 중의 포스페이트 함량은 10 mM 내지 40 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM로부터 선택된다.
완충 용액의 pH 범위는 6.0 내지 7.5에서 이상적으로 조정된다.
완충 용액의 온도는 일반적으로 15℃ 내지 50℃, 바람직하게는 실온, 즉 20℃ 내지 40℃로 유지된다.
희석된 충전 용액을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 합성으로부터 직접 수득된 암모니아 수용액은 일반적으로 먼저 1.5 내지 2.5 부피 당량, 바람직하게는 2.0 부피 당량의 물로 희석되어 2.5 내지 3.5, 바람직하게는 3.0의 희석 등급을 달성한다.
음이온 교환 컬럼에 충전된 희석된 암모니아 수용액은 일반적으로 컬럼 부피 L당 8 내지 20 g, 바람직하게는 컬럼 부피 L당 10 내지 15 g의 총 올리고뉴클레오타이드 함량을 갖는다.
완충 용액 중의 유기 용매는 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매, 바람직하게는 극성 비양성자성 용매, 더욱 바람직하게는 아세토니트릴로부터 선택될 수 있다.
적합한 극성 양성자성 용매는 일차 지방족 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 i-프로판올, 바람직하게는 에탄올이다.
적합한 극성 비양성자성 용매는 아세토니트릴, 디메틸설폭사이드 또는 N-메틸-2-피롤리돈이지만, 바람직하게는 아세토니트릴이다.
더욱 바람직한 구체예에서 아세토니트릴이 사용된다.
일반적으로 완충 용액은 유기 용매를 5 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 약 10 중량%의 양으로 포함한다.
탈보호를 위해 산, 바람직하게는 양성자성 산이 사용된다.
용어 양성자성 산은 무기산 또는 유기산, 바람직하게는 수성 형태의 무기산 또는 유기산을 의미하며 염산, 황산, 인산, 질산, 포름산, 또는 아세트산, 더욱 바람직하게는 아세트산으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서 양성자성 산은 물 중의 아세트산 농도가 50 내지 95 중량%, 더욱 바람직하게는 70 내지 90 중량%, 더욱더 바람직하게는 75% 내지 85 중량%인 수성 아세트산이다.
세척 단계 및 용리 단계에서 완충 용액은 알칼리 할라이드, 예컨대 소듐 또는 포타슘 클로라이드, 바람직하게는 소듐 클로라이드를 추가로 포함한다.
세척 단계 d)에서 완충 용액은 일반적으로 0.2 M 내지 1.0 M, 바람직하게는 0.4 M 내지 0.7 M의 알칼리 할라이드를 포함한다.
용리 단계 h) 및 후속 등용매 세척 단계에서 완충 용액은 일반적으로 1.5 M 내지 3.0 M, 바람직하게는 1.8 M 내지 2.5 M의 알칼리 할라이드를 포함한다.
완충 용액 또는 산 용액의 유량은 고체 지지체 결합된 올리고에 대한 완충액의 노출을 조정하는 중요한 파라미터이다.
일반적으로 컬럼 상의 탈보호를 위한 산 용액의 유량은 산 용액의 더 높은 점도 및 산 불안정 5'하이드록시 보호기에 대한 비교적 더 많은 산의 노출에 대한 조정을 허용하기 위해 다른 단계에서의 완충액의 유량에 비해 더 낮다.
일반적으로 컬럼 상의 탈보호 단계 f)에서 산 용액의 유량은 1.5 L/분 내지 2.5 L/분, 바람직하게는 1.8 L/분 내지 2.2 L/분이다.
다른 단계를 위해 완충액의 유량은 2.0 L/분 내지 3.0 L/분, 바람직하게는 2.3 L/분 내지 2.7 L/분 범위에서 선택된다.
컬럼 상의 탈보호 단계 f) 및 용리 단계 h)는 일반적으로 컬럼 부피(CV)의 10 내지 30 배, 바람직하게는 컬럼 부피(CV)의 15 내지 25 배인 비교적 많은 양의 각각의 산 또는 완충 용액을 필요로 한다.
올리고 용리는 UV 검출에 의해 적절하게 측정되고 올리고 함유 용리액은 그에 따라 분획화된다.
바람직한 구체예에서 방법은 정제 단계 a) 내지 h) 후에 오는 다음 단계를 추가로 포함한다.
i) 접선 유동 여과를 통해 여과액을 정제수로 세척하는 것을 포함하는 탈염 및 농축 단계; 및
j) 탈염 및 농축 단계로부터 수득된 여과액의 동결건조 단계.
접선 유동 여과는 투과물 측면에 대해 양압에서 공급물이 필터 막을 (접선 방향으로) 가로질러 통과하는 것을 특징으로 한다. 일정 비율의 막 기공 크기보다 작은 물질이 투과액 또는 여과액으로서 막을 통과하고; 나머지 모두는 잔류액으로서 막의 공급 측에 보유된다.
적합한 막은 예를 들어 상표명 PelliconTM 하에 Merck Millipore로부터 또는 상표명 HydrosartTM 하에 Sartorius로부터 상업적으로 입수 가능하다.
동결건조는 당업자에게 공지된 기술이?玭? 그에 따라 적용될 수 있다.
본 발명의 방법의 예시로서 하기 서열의 올리고뉴클레오타이드가 선택되었다:
5'-Me C S Me U O Me C O A O G STSASAS MeCSASTSTSGSAS MeCS A O Me C O Me C O A S Me C-3' 19 Na
여기서 "S"는 포스포로티오에이트 가교를 나타내고, "O"는 포스페이트 가교를 나타내고; A, G, T, U 및 DNA 뉴클레오사이드 단량체이고, "Me"은 메틸을 나타내고 밑줄 친 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다.
본원에 개시된 화합물은 하기의 핵염기 서열을 갖는다:
서열 식별 번호 1: cucagtaacattgacaccac'
실시예
약어:
Ac2O = 아세트산 산무수물
(d)A = (데옥시) 아데노신
(d)C = (데옥시) 시티딘
(d)G = (데옥시) 구아노신
DCA = 디클로로아세트산
DCI = 4,5-디시아노이미다졸
DMT = 4,4'-디메톡시트리틸
CV = 컬럼 부피
Et3N = 트리에틸아민
EtOH = 에탄올
MeCN = 아세토니트릴
MOE = 2-메톡시에틸
NA = 해당 없음
NaOAc = 소듐 아세테이트
NMI = N-메틸 이미다졸
PADS = 페닐아세틸디설파이드
PhMe = 톨루엔
T = 티미딘
U = 우리딘
밑줄 친 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다
실시예 1
a) 5'-DMT- Me C S Me U O Me C O A O G S T S A S A S Me C S A S T S T S G S A S Me C S A O Me C O Me C O A S Me C -3' 19 NH 3 의 합성
표제 화합물은 72 mmol 규모에서
Figure pct00001
KTA oligopilot-100을 사용하여 "DMT-온"으로 합성되었다.
다음 포스포라미다이트가 각 사이클에서 사용되었다:
Figure pct00002
합성 파라미터 사이클 3-5, 17-19
Figure pct00003
합성 파라미터 사이클 1-2, 6-16:
Figure pct00004
합성 파라미터 사이클 20:
Figure pct00005
Figure pct00006
b) 5'- Me C S Me U O Me C O A O G S T S A S A S Me C S A S T S T S G S A S Me C S A O Me C O Me C O A S Me C -3' 19 Na 의 컬럼 상의 탈트리틸화 및 형성
실시예 1a)로부터 수득한 미정제 물질 (338.87 g)의 용액이 여러 평형화 단계, 컬럼 세척 단계, 컬럼 상의 탈트리틸화 단계 및 최종 생성물 용리 단계로 구성된 정제 단계를 거쳤다.
먼저, 고체상 유기 합성으로부터의 미정제 생성물이 사전 평형화된 AEX 컬럼에 로딩되었고, 재평형화가 이어졌다. DMT-온 쇼트머(shortmer), 캡핑된 실패 서열 및 다른 소분자는 저농도의 소듐 클로라이드를 포함하는 완충액으로 컬럼을 세척하여 제거되었다. 컬럼 평형화 후, 결합된 올리고뉴클레오타이드의 DMT 기는 수성 아세트산에 의해 제거되고 (컬럼 상의 탈트리틸화로 지칭됨) 또 다른 컬럼 평형화가 이어져 잔류 산을 제거하고 용리 단계의 시작 조건을 확립한다. 최종 단계에서, 생성물은 고농도 소듐 클로라이드 구배를 적용하여 용리되었다. 용리 프로파일은 자외선(UV) 흡수 분광법에 의해 모니터링되었다. 전체 길이의 DMT-오프 생성물 피크를 여러 분획으로 수집했다. 분획을 순도, 유기 불순물에 대해 테스트하고 그에 따라 풀링했다. 정제 파라미터는 아래 표에 요약된다:
Figure pct00007
c) 접선 유동 여과 / 동결건조
접선 유동 여과 / 동결건조 단계를 위해 둘의 정제 배치(실시예 1b)를 조합했다.
조합된 용액(541.76 g, 순도 89.2%)을 농축한 후 접선 유동 여과에 의해 정제수로 탈염했다. 탈염의 끝은 제거된 투과액의 전도도에 의해 감지되었다. 탈염된 용액을 다시 농축하고 용액 중 올리고뉴클레오타이드의 농도를 정제수의 첨가에 의해 60-100 mg/mL로 조정했다. 용액을 0.2 μm 필터(Sartopore-2, Sartorius)를 통해 여과한 다음 동결건조했다. 수행된 동결건조 사이클의 조건은 아래 표에 나타난다:
Figure pct00008
헹굼 후 수득된 용액을 동결건조하여 508.26 g의 표제 생성물을 수득했다 (순도 90.9%).
실시예 2 (비교예)
a) 5'-DMT- Me C S Me U O Me C O A O G S T S A S A S Me C S A S T S T S G S A S Me C S A O Me C O Me C O A S Me C -3' 19 NH 3 의 합성
표제 화합물은 실시예 1a에 따라 제조되었다.
b) HPLC
미정제 물질의 일부를 아래 표의 파라미터에 따라 HPLC(Amberchrom XT20 수지가 있는 컬럼)에 의해 정제했다:
Figure pct00009
정제된 용액은 97.2% 순도 및 90.8% 수율을 나타냈다.
c) 용액 중의 탈트리틸화
실시예 2b의 조합된 분획의 pH를 빙초산을 탈트리틸화제로서 사용하여 pH 3으로 조정한 다음 10 M NaOH를 사용하여 pH를 5로 재조정했다. pH 조정된 용액을 에탄올에 첨가하여 표제 화합물을 침전시켰다. 얻어진 수율은 66.0%였다.
<110> F.Hoffmann-La Roche Ltd. <120> Process for the deprotection of oligonucleotides <130> P35629-WO <140> EP19185225.0 <141> 2019-07-09 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Oligonucleotide <400> 1 cucagtaaca ttgacaccac 20

Claims (17)

  1. 산을 사용한 컬럼 상의 탈보호를 통해 올리고뉴클레오타이드의 5'-O-올리고뉴클레오타이드 말단에서 산 불안정 5'하이드록시 보호기를 제거하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 컬럼은 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼인 방법.
  3. 제1항 내지 제2항에 있어서, 산 불안정 5'하이드록시 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸, 4-메톡시트리틸, 트리틸, 9-페닐-잔텐-9-, 9-(p-톨릴)-잔텐-9-일 또는 tert-부틸디메틸실릴, 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    a. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제1 평형화 단계;
    b. 미정제 올리고뉴클레오타이드의 희석된 암모니아 수용액을 컬럼에 충전하는 단계;
    c. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제2 평형화 단계;
    d. 포스페이트 염, 유기 용매 및 알칼리 할라이드를 포함하는 완충액으로 컬럼을 세척하는 단계;
    e. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제3 평형화 단계;
    f. 산을 사용한 컬럼 상의 탈보호 단계;
    g. 포스페이트 염 및 유기 용매를 포함하는 완충액을 사용한 음이온 교환 컬럼의 제4 평형화 단계;
    h. 포스페이트 염, 유기 용매 및 알칼리 할라이드를 포함하는 완충액으로 탈보호된 올리고뉴클레오타이드를 용리하고, 후속하여 포스페이트 염, 유기 용매 및 알칼리 할라이드를 포함하는 완충액으로 컬럼을 등용매 세척하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 완충액 중의 포스페이트 염은 알칼리 포스페이트 또는 이들의 혼합으로부터 선택된 포스페이트이지만, 바람직하게는 모노 소듐 포스페이트 또는 디 소듐 포스페이트 또는 이들의 혼합인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 완충액 중의 포스페이트 염 함량은 10 mM 내지 40 mM, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM로부터 선택되는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 컬럼에 충전된 암모니아 수용액은 컬럼 부피 L당 8 내지 20 g, 바람직하게는 컬럼 부피 L당 10 내지 15 g의 총 올리고뉴클레오타이드 함량을 갖는 방법.
  8. 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액 중의 유기 용매는 극성 양성자성 또는 극성 비양성자성 용매, 바람직하게는 극성 비양성자성 용매, 더욱 바람직하게는 아세토니트릴로부터 선택되는 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리 할라이드는 소듐 클로라이드인 방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 단계 d)에서 완충액은 0.2 M 내지 1.0 M, 바람직하게는 0.4 M 내지 0.7 M 소듐 클로라이드를 포함하는 방법.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 단계 h)에서 완충액은 1.5.M 내지 3.0 M, 바람직하게는 1.8 M 내지 2.5 M 소듐 클로라이드를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 산은 양성자성 산인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 산은 아세트산, 바람직하게는 물 중의 아세트산 농도가 50 내지 95 중량%, 더욱 바람직하게는 70 내지 90 중량%, 더욱더 바람직하게는 75 내지 85 중량%인 수성 아세트산인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 컬럼 상의 탈보호 단계 f)의 산 용액의 유량은 1.5 L/분 내지 2.5 L/분에서 선택되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 내지 e) 및 g) 내지 h)에서 완충액의 유량은 2.0 L/분 내지 3.0 L/분에서 선택되는 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계 a) 내지 h) 후에 오는 다음 단계를 추가로 포함하는 방법:
    i) 접선 유동 여과를 통해 여과액을 정제수로 세척하는 것을 포함하는 탈염 및 농축 단계; 및
    j) 탈염 및 농축 단계로부터 수득된 여과액의 동결건조 단계.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 임의로 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오사이드 단량체 또는 이들의 조합으로 구성되고 길이가 10 내지 40, 바람직하게는 10 내지 25 개의 뉴클레오타이드인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7273933B1 (en) * 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US20050136458A1 (en) * 1998-12-31 2005-06-23 Oligos, Etc, Inc. Method for nucleic acid preparation
AU2003216830A1 (en) * 2002-03-21 2003-10-08 Avecia Biotechnology Inc. Purification methods for oligonucleotides and their analogs
US6989442B2 (en) * 2002-07-12 2006-01-24 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
US7655790B2 (en) * 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
US7345163B2 (en) * 2002-08-28 2008-03-18 Quiatech Ab Process for separating and deprotecting oligonucleotides
KR20080072023A (ko) 2005-12-02 2008-08-05 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 방사성 불소 표식 화합물의 제조 방법
CA2632133A1 (en) 2005-12-06 2007-06-14 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. Process for production of compound labeled with radioactive fluorine
EP3658155A4 (en) * 2017-07-28 2021-06-30 Nogra Pharma Limited PROCESS FOR THE PREPARATION OF OLIGONUCLEOTIDIC COMPOUNDS
CA3134036A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Wave Life Sciences Ltd. Technologies useful for oligonucleotide preparation

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