JP2000342265A - オリゴヌクレオチド類の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 液体クロマトグラフィーによるオリゴヌクレ
オチド類の精製方法において、その工程を簡略化すると
ともにその工程日数を短縮する。 【解決手段】 (a)耐酸性及び耐アルカリ性の充填材を
有する液体クロマトグラフィーカラムに疎水性保護基で
保護されたオリゴヌクレオチド類を注入し、(b)カラム
に昇華性の塩からなるバッファと水溶性有機溶媒との混
合展開溶媒などを注入して保護基で保護されていない成
分を溶出し、(c)カラムに酸を注入してオリゴヌクレオ
チド類の疎水性保護基を脱保護し、(d)カラムに前記混
合展開溶媒を注入し、脱保護されたオリゴヌクレオチド
類を溶出させ、(e) 減圧加熱等によりオリゴヌクレオチ
ド類から溶媒及び塩を除去する方法。充填材はポリスチ
レン系樹脂製、酸は酢酸、バッファはアンモニアでpH8
〜10とした0.05〜0.5Nの炭酸水素アンモニウム水溶液が
好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィーを用いてオリゴヌクレオチド類の疎水性保護基を
脱保護するとともに該オリゴヌクレオチド類を精製する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】DNAの合成は、昨今の自動合成機の普及
により簡単に行えるようになった。かかる合成機で一般
に用いられている合成法は、固相シアノエチルホスホア
ミダイト法であり、図１に示されるような合成サイクル
で表わされる。すなわち、まず、５′位の水酸基がジメ
トキシトリチル（DMTr）基で保護されたヌクレオシド
を、その３′位水酸基を介して、CPG（コントロールポ
アグラス）等の不溶性の担体にエステル結合させる（図
１[I]）。そして、このヌクレオシドユニットの５′位
の水酸基を脱保護し（図１[II]）、次に、触媒存在下、
次のヌクレオチドユニットのアミダイト体（図１[II
I]）を縮合させる。このアミダイト体は、ヌクレオシド
の５′位の水酸基がDMTr基で保護され、３′位の水酸基
に３価のリンを備え、当該３価のリンには保護基として
β−シアノエチル基が結合し、脱離基としてジアルキル
アミノ基が結合している。かくして生成したジヌクレオ
チド（図１[IV]）の３価のリンは、ヨウ素で５価に酸化
される（図１[V]）。また、未反応の５′位の水酸基
は、アセチル化によりキャッピングすることで、以後の
伸長反応から排除される。そして、このサイクルを繰り
返すことにより、所望のDNAが合成される。

【０００３】合成されたDNAは、濃アンモニア水により
担体から切り出されてバイアルに捕集され、これを６０
℃で４〜５時間処理して、ヌクレオシドの塩基のアミノ
基の保護基とリンの保護基（β−シアノエチル基）とが
脱離される。その後、この粗オリゴDNAは、必要な純度
に精製される。逆相液体クロマトグラフィー（逆相HPL
C）法で精製する場合は、粗オリゴDNAは、その５′一末
端の保護基であるDMTr基がついている状態（Tr/ON体）
あるいは脱保護された状態（Tr/OFF体）で精製に供され
る。しかし脱保護されない状態で精製する場合には、目
的物であるTr/ON体のクロマトグラフィーにおける性質
が不純物であるTr/OFF体のそれとは大きく異なることを
利用しているので、目的物を容易に分離することができ
るという利点がある。なお、この合成方法は、前記酸化
工程を硫化工程に置き換えることにより、アンチセンス
核酸医薬に用いられるホスホロチオエート型オリゴDNA
（オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエート）の
合成にも同様に用いられている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】逆相ＨＰＬＣ法は、か
かる粗オリゴDNAを高純度に精製する場合に、常法とし
て用いられており、従来、図２に示されるような手順に
従って実施されていた。従来のＨＰＬＣ法では、シリカ
系の充填材が充填されたカラムを用いており、使用可能
なｐＨの範囲は4.0〜7.5に制限される。したがって、ま
ず、上記のようにして脱保護されたTr/ON体の粗オリゴD
NAの濃アンモニア水溶液（図２PS1）を、減圧乾燥によ
ってアンモニア除去して乾固させ(図２PS2)、0.1Nの酢
酸トリエチルアンモニウムバッファ（ｐＨ7.2）で再溶
解する(図２PS3)。そして、カラムに注入し、グラディ
エントモード法によって溶出させ、目的のTr/ON体のピ
ークを分取する(図２PS4)。その後、１Ｎ塩酸でTr/ON体
を脱保護（脱DMTr基）し(図２PS5)、１Ｎ炭酸ナトリウ
ムで中和して乾燥後（図２PS6）、純水に再溶解させる
(図２PS7)。そして、透析により、脱離したDMTr基や上
記中和反応生成物を除去して目的のTr/OFF体を精製し
(図２PS8)、真空凍結乾燥し(図２PS9)、精製品を得る。

【０００５】しかし、かかる従来の方法では、図２の工
程PS２、PS3、PS6、PS７及びPS９に示されるように、再
三にわたり乾燥と再溶解を繰り返す必要があることか
ら、精製に数日を要していた。

【０００６】本発明は、液体クロマトグラフィーによる
オリゴヌクレオチド類の精製方法において、その工程を
簡略化するとともにその工程日数を短縮することを目的
とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記目
的は、下記(a)乃至(e)の工程を備えることを特徴とする
オリゴヌクレオチド類の精製方法によって達成される。

【０００８】(a)耐酸性及び耐アルカリ性の充填材が充
填された液体クロマトグラフィーカラムを用い、疎水性
保護基で保護されたオリゴヌクレオチド類及び同保護基
で保護されていないオリゴヌクレオチド類の混合物を前
記カラムに充填し、(b)前記カラムに昇華性の塩からな
るバッファと水溶性有機溶媒との混合展開溶媒などを適
当な濃度勾配で注入して前記疎水性保護基で保護されて
いないオリゴヌクレオチド類を溶出させ、(c)前記カラ
ムに酸を注入して、該カラム内の前記オリゴヌクレオチ
ド類の疎水性保護基を脱保護し、(d)前記カラムに昇華
性の塩からなるバッファと水溶性有機溶媒との混合展開
溶媒を適当な濃度勾配で注入して前記脱保護されたオリ
ゴヌクレオチド類を溶出させ、(e)溶出された前記オリ
ゴヌクレオチド類から溶媒及び塩を除去する。

【０００９】本発明は、液体クロマトグラフィーのカラ
ムとして、耐酸性及び耐アルカリ性の充填材が充填され
たものを使用するため、疎水性保護基で保護されたオリ
ゴヌクレオチドをカラムに注入（インジェクション）し
て吸着させた状態で、カラムに酸を注入して脱保護する
ことができ、しかも、溶出に使用する展開溶媒として昇
華性の塩を含有するバッファを使用することができる。
かくしてカラムから溶出されたオリゴヌクレオチド類か
ら、溶媒及び塩を減圧加熱により一段階の操作で除去し
精製でき、従来の最終精製工程として必要とされていた
透析脱塩操作を省略できる。また、精製しようとする粗
オリゴヌクレオチドをアルカリ性水溶液のまま直接カラ
ムに注入して吸着させることができる。例えば、粗オリ
ゴヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成機の担体から切り出
されたアンモニア水溶液の状態のまま、または、これを
適当に稀釈したアルカリ水溶液のまま、カラムに注入す
ることができる。その結果、従来のＨＰＬＣ精製に必要
とされていた乾燥と再溶解の工程を削減することが可能
となり、精製工程に要する数日を大幅に短縮することが
できる。

【００１０】本発明の精製方法は、疎水性保護基で保護
されたオリゴヌクレオチドであれば、いかなる種類のも
のにも適用できる。本発明において、オリゴヌクレオチ
ド類は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチ
ド等のヌクレオチドを構成単位とし、各ヌクレオチド間
が糖の３′位と５′位炭素のリン酸ジエステル結合で結
ばれたものであり、天然及び合成のDNA及びRNAの他、こ
れらのリン酸部又はヌクレオシド部が修飾されている修
飾体をも包含する概念である。リン酸部が修飾されたオ
リゴヌクレオチド類としては、例えば、オリゴデオキシ
ヌクレオチドホスホロチオエート（ホスホロチオエート
型オリゴDNA）が挙げられる。合成オリゴヌクレオチド
類は、公知のアミダイト法及びリン酸トリエステル法等
に基づく方法によって得られたものを包含する。疎水性
保護基としては、代表的には、オリゴヌクレオチド類の
５′末端の水酸基を保護するジメトキシトリチル（DMT
r）基が挙げられるが、これに限定されるものではな
い。

【００１１】本発明において、液体クロマトグラフィー
カラムで用いる耐酸性及び耐アルカリ性の充填材として
は、代表的には、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体
等のポリスチレン系樹脂製の逆相充填材が使用できる。
ポリスチレン系逆相充填材は、ｐH１乃至１４で使用で
きるだけでなく、充填材内部にも展開溶媒が流れるた
め、いわゆるパーフュージョンクロマトグラフィーを構
成し、カラム内の流速も高速にすることができ、好都合
である。また、工程(c)の脱保護に用いる酸についても
特に制限はなく、一般には、酢酸、トリフロオロ酢酸、
塩酸などが用いられ、好ましくは酢酸が用いられる。ま
た、工程(b)及び(d)の展開溶媒に使用される昇華性の塩
からなるバッファとしては、例えば、アンモニアなどで
ｐH7.7以上、好ましくはpH8〜10に調整された0.05〜0.5
Nの炭酸水素アンモニウム水溶液を用いることができ
る。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、図３及び図４を参照しつ
つ、DNA自動合成機で合成された粗オリゴDNAの精製に本
発明を応用した例について説明する。

【００１３】まず、図１のサイクルに従ってDNA自動合
成機でオリゴDNAを合成した後、これを濃アンモニア水
で担体から切り出し、さらに加熱してヌクレオシドの塩
基部のアミノ基及びリン酸部を保護している保護基を脱
離させて、粗オリゴDNAの濃アンモニア水溶液として回
収する（図３工程P1）。この粗オリゴDNA溶液には、目
的DNAのTr/ON体の他に、Tr/OFF体DNA(目的外)、脱保護
された前記塩基部及びリン酸部の保護基が含まれている
（図４工程P1）。

【００１４】この粗オリゴDNA溶液を、バッファで稀釈
し（図３工程P2）、そのまま、ポリスチレン製のパーフ
ュージョンクロマトグラフィーカラムに注入する（図３
工程A）。この時、目的DNAのTr/ON体と脱保護された疎
水性の保護基はカラムに吸着するが、Tr/OFF体DNAと脱
保護された親水性の保護基はカラムから溶出され、目的
DNAのTr/ON体とTr／OFF体DNAとが分離される（図４工程
A）。この時使用する展開溶液としては、例えば、０．
１Ｎ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ９．０）／１１％アセ
トニトリルが挙げられる。

【００１５】そして、カラムに例えば6〜16vol.％の酢
酸を注入すると（図３工程B1）、カラムに吸着した目的
DNAのTr/ON体からDMTr基が脱離される（図４工程B1）。
そして、この脱保護に用いた酸を０．１Ｎ炭酸水素アン
モニウム（ｐＨ９．０）などで洗浄し（図３工程B2及び
図４工程B2）、その後、アンモニアでpH8〜10に調整さ
れた0.05〜0.5Nの炭酸水素アンモニウム水溶液とアセト
ニトリルやメタノール等の水溶性有機溶媒との混合展開
溶媒をカラムに適当な濃度勾配で注入することにより、
目的DNAのTr/OFF体を分離して溶出させることができる
（図３工程C及び図４工程C）。

【００１６】得られた目的DNAのTr/OFF体は、有機溶媒
と炭酸水素アンモニウムのアンモニア溶液の混合物であ
るため、減圧加熱により脱塩及び乾燥を一挙に行い、最
終製品を得ることができる（図３工程D参照）。この減
圧加熱は、例えば、0.3mmHg以下の減圧下、４５乃至５
５℃の温度で一昼夜行うことが望ましい。

【００１７】なお、目的DNAのTr/OFF体を溶出させた
後、カラムを洗浄して次の精製に供することができる
（図４工程F）。この洗浄は、有機溶媒を用いて行って
も良いが、本発明では純水を用いて行うこともでき、こ
の場合、カラムの劣化を防止できるので好都合である。

【００１８】

【実施例】以下、実施例を参照しつつ、本発明について
更に詳細に説明する。

【００１９】参考例１（オリゴDNAの合成） オリゴDNAはDNA自動合成機（Expedite Model8909:日本
パーセプティブ社製）を用い、図１の方法に従い、1.0
μmolスケールでTr/ON体として合成した。担体からの切
出条件は、常法に従い、30％濃アンモニア水1.0mlで行
った。脱保護条件は、常法に従い、切出後の濃アンモニ
ア水溶液のまま耐圧バイアルにて、50℃で１晩行い、こ
れをサンプルとした。

【００２０】なお、合成した各種オリゴDNAは表1に示す
とおりである。

【００２１】

【表１】

【００２２】表１の各DNAサンプルの特徴について説明
する。サンプルNo.1は、塩基組成が平均的で、脱Tr化反
応が最も進み難いTを5′末端に備え、自己相補（オリゴ
DNAの分子間又は分子内で二重鎖を形成する）でない塩
基配列であり、標準的な配列と考えられる。サンプルN
o.2〜15は、塩基組成の偏りがあるか、または、比較的
長鎖長の塩基配列である。なお、表１に示すサンプルの
配列表を後記する。

【００２３】実施例１（逆相HPLC精製） 参考例１で得た表１のオリゴDNAサンプルを、HPLC装置
（日本ウォーターズ社製）で精製した。カラムとして、
ポリスチレン系逆相充填材が充填されたもの（商品名：
OligoR3、パーセプチィブ・バイオシステムズ社製）を
用い、バッファとしてアンモニアでｐH9.0に調整された
0.1N-炭酸水素アンモニウムバッファを用い、各種制御
パラメータは下記のとおり設定した：

【００２４】１．サンプルインジェクション量：参考例
１で得たサンプルを8000μlに希釈して1480μlインジェ
クション（表３の＃2）。この量は、0.2μmolスケール
での合成DNA量に相当する． ２．酢酸濃度とインジェクション量：12.0vol.%；1480
μl（表３の＃3）。反応時間：流量0.01ml/min（ポンプ
停止）、ディレイ時間0.0min：反応時間＝4.4min． ３．反応温度（カラムオーブン温度）：40℃ ４．サンプルセットとグラディエントパラメータ表：サ
ンプルセットは表３、グラディエントパラメータ表は、
表４、５、６及び７に示した． ５．フラクションコレクタパラメータ表：フラクション
コレクタパラメータ表は、表２に示した。ピークの高さ
が1.5ABS程度あり、余裕があるので、Lebelを20％にし
た。

【００２５】

【表２】

【００２６】

【表３】

【００２７】

【表４】

【００２８】

【表５】

【００２９】

【表６】

【００３０】

【表７】

【００３１】HPLC精製の結果は、表８乃至表１０に示し
た。なお、表８乃至表１０中、オーバーフローTr/ON体
は、サンプルセット＃2で目的外オリゴDNAのTr/off体を
溶出させるときに、同時に溶出してしまう目的オリゴDN
AのTr/ON体を意味する。

【００３２】

【表８】

【００３３】

【表９】

【００３４】

【表１０】

【００３５】表８は各種鎖長のオリゴDNAの精製結果を
対比して示したものであるが、鎖長４０mer以下では、
きわめて良好な純度で精製されることが示された。ま
た、鎖長６０以上では純度が落ちるものの、PCRグレー
ドの製品としては十分な純度（６０％以上）が確保され
ることが示された。なお、表８のサンプルNo.5は、DNA
合成時の平均縮合率が96.5％と低かったため、収率が低
下している。

【００３６】表９は、各種G比率のオリゴDNAの精製結果
を対比して示したものであるが、何れの場合もきわめて
良好な純度と収量で精製されることが示された。なお、
表９のサンプルNo.17は、G比率が極端に高いためピーク
が二峰性を示したため、純度値を示すことができなかっ
た。

【００３７】表１０は、各種A、C、T比率のオリゴDNAの
精製結果を対比して示したものであるが、A比率につい
ては、８５％の場合に若干脱Tr化率が低下するとして
も、何れの場合も良好な純度と収量で精製されることが
示された。また、C比率については、８５％の場合に純
度、収量及び脱Tr化率が低下し、G比率については、８
５％の場合に純度が低下することが示されたが、何れの
場合も、PCRグレードの製品としては十分な純度が確保
されることが示された。なお、A及びC比率が８５％以上
の場合の脱Tr化率低下は、塩基の塩基性が影響している
ものと推定される。しかし、上記の問題のあるケース
は、DNA組成として非常に極端な場合である。

【００３８】また、表８乃至表１０から、どのような組
成及び鎖長のオリゴDNAでも、サンプルセット＃2でのTr
/ON体のオーバーフローは見られず、また脱Tr化後のサ
ンプルセット＃4でのオーバーフローも問題ないレベル
であった。

【００３９】以上から、本発明の精製方法は、合成オリ
ゴヌクレオチド、特に、各塩基の比率が６０％以下であ
り、または、鎖長が４０mer以下である通常のオリゴヌ
クレオチドに対して、きわめて有効であることが示され
た。

【００４０】実施例２（炭酸水素アンモニウムバッファ
の昇華脱塩） 実施例１で展開溶媒として用いた0.1N-pH9.0-炭酸水素
アンモニウム（AMHCA）バッファの昇華脱塩効果につい
て検討した。

【００４１】実施例１のサンプルNo.１の分取液の半分
をエッペンドルフチューブに入れ、このチューブを遠心
減圧加熱乾燥機（内圧＜0.3mmHg＞）にセットして、５
０℃でオーバーナイト（１５時間）減圧乾燥した。その
後、このチューブに１０００μｌの純水を加えてよく攪
拌し、DNA溶液の昇華脱塩サンプルとした。

【００４２】また、上記サンプルNo.1の分取液の残り
を、常法により２時間透析して、常法によりオーバーナ
イト減圧乾燥し、DNA溶液の従来法脱塩サンプルとし
た。

【００４３】両サンプルを元素分析にかけた。その結果
を、表１１に示す。

【００４４】

【表１１】

【００４５】表１１から、本発明の昇華脱塩法は、従来
の透析法と同等又はそれ以上の脱塩効果が得られること
がわかる。特に、NH_４については、DNAのリン酸に対す
るカウンターイオン分しか残留していないものと考えら
れる。また、Ni、Zn、Pb等の重金属の残留については、
本発明の方が従来の透析法よりも残留量が少ないことが
示された。

【００４６】

【発明の効果】以上詳述のとおり、本発明によれば、DM
Tr基などの疎水性保護基で保護されたオリゴヌクレオチ
ドをHPLCで精製する際、アンモニア水で担体から切り出
されたオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を、その
まま、カラムに注入することができ、しかも、上記疎水
性保護基の脱保護をカラムに酸を注入することによりカ
ラム上で行うことができ、引き続き、展開溶媒を用いて
目的のオリゴヌクレオチドを分離精製することができ
る。さらには、オリゴヌクレオチドの溶出に使用する展
開溶媒として昇華性の塩からなるバッファと水溶性有機
溶媒との混合溶媒を用いたことから、脱塩の操作を減圧
加熱で一挙に行うことができる。本発明の精製方法は、
その途中に乾燥及び再溶解の工程が介在しないため、従
来の精製工程よりも大幅に工程が簡略化され、精製に要
する日数も大幅に短縮される。

【００４７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOAGOSEI CO., LTD. <120> METHOD FOR PURIFICATION OF OLIGONUCLEOTIDES <130> IDP-264 <160> 15 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 1 tacgacgcag gtgttactac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 2 tgcgacgcag gtgtgagtac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 3 tgcgacggag gtgtgagggc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 4 tgcggcggag gtgggagggg 20 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 5 tacgacgcag gtgttactac tacgacgcag gtgttactac 40 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 6 tacgacgcag gtgttactac tacgacgcag gtgttactac tacgacgcag gtgttactac 60 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 7 tacgacgcag gtgttactac tacgacgcag gtgttactac tacgacgcag gtgttactac 60 tacgacgcag gtgttactac 80 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 8 tacgacaaag gtataaaaac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 9 taaaaaaaaa gaaaaaaaac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 10 tccgacgcac gtctcacccc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 11 tcccccgccc cccccacccc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 12 tgcgacggag gtgtgagggc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 13 tggggcgggg gggggagggg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 14 ttcgacttat gtgttatttc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Experimental <400> 15 tttttctttt gttttatttt 20

【図面の簡単な説明】

【図１】オリゴヌクレオチドの合成反応サイクルを示す
模式図である。

【図２】従来のオリゴヌクレオチドの精製工程を示すフ
ローチャートである。

【図３】本発明のオリゴヌクレオチドの精製工程を示す
フローチャートである。

【図４】図３に対応する精製工程説明図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記(a)乃至(e)の工程を備えることを特
   徴とするオリゴヌクレオチド類の精製方法： (a)耐酸性及び耐アルカリ性の充填材が充填された液体
   クロマトグラフィーカラムを用い、疎水性保護基で保護
   されたオリゴヌクレオチド類及び同保護基で保護されて
   いないオリゴヌクレオチド類の混合物を前記カラムに充
   填し、 (b)前記カラムに昇華性の塩からなるバッファと水溶性
   有機溶媒との混合展開溶媒などを適当な濃度勾配で注入
   して前記疎水性保護基で保護されていないオリゴヌクレ
   オチド類を溶出させ、 (c)前記カラムに酸を注入して、該カラム内の前記オリ
   ゴヌクレオチド類の疎水性保護基を脱保護し、 (d)前記カラムに昇華性の塩からなるバッファと水溶性
   有機溶媒との混合展開溶媒を適当な濃度勾配で注入して
   前記脱保護されたオリゴヌクレオチド類を溶出させ、 (e)溶出された前記オリゴヌクレオチド類から溶媒及び
   塩を除去する。
2. 【請求項２】 前記充填材はポリスチレン系樹脂製であ
   ることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記工程(c)において、酸として、6〜16
   vol.％の酢酸を用いることを特徴とする請求項１又は２
   に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記工程(d)において、昇華性の塩から
   なるバッファとして、アンモニアでpH8〜10に調整され
   た0.05〜0.5Nの炭酸水素アンモニウム水溶液を用いるこ
   とを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方
   法。