KR20220008306A

KR20220008306A - 인간화 항-cd137 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220008306A
Application number: KR1020217040560A
Authority: KR
Inventors: 지이 왕; 이 우
Original assignee: 리브젠 바이오파마 코., 엘티디.; 리브젠 바이오파마 (쑤저우) 코., 엘티디.
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2022-01-20
Also published as: EP3966252A4; EP3966252A1; US11203643B2; JP2022532173A; CA3139274A1; US20210246218A1; WO2020231809A1; AU2020276500A1; CN114026120A; CN114026120B

Abstract

본원은 인간화 항-CD137 항체, 및 CD137 신호전달을 유도하기 위해 이를 사용하여 T 세포 기능과 같은 면역 반응을 향상시키는 방법을 개시한다. 본원에 개시된 항체는 암 및 면역 장애와 같은 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

인간화 항-CD137 항체 및 이의 용도

관련 출원

본 출원은 2019년 5월 10일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/CN2019/086364호의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.

4-1BB 또는 종양 괴사 인자 수용체 서브패밀리 9(TNFRSF9: tumor necrosis factor receptor subfamily 9)로도 알려진 CD137은 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor) 수용체 패밀리의 구성원이다. 이것은 활성화된 T 세포(보다 우세하게 CD4⁺보다는 CD8⁺)에 의해서 뿐만 아니라 수지상 세포, B 세포, 여포성 수지상 세포, 자연 살해 세포, 과립구에 의해, 및 염증 부위의 혈관벽 세포에서 발현된다.

CD137은 활성화된 T 세포에 대한 공동자극자 수용체이며, CD137의 가교는 T 세포 증식, IL-2 분비, 생존 및 세포용해 활성을 향상시킨다. CD137은 또한 말초 단핵구에서의 증식을 유도하고, TCR/CD3-촉발된 활성화 및 조절된 CD28 공동자극에 의해 유도된 T 세포 세포사멸을 향상시킬 수 있어, Th1 세포 반응의 촉진을 야기시킨다. 이의 발현은 림프구 활성화에 의해 유도되고, CD137 리간드(CD137L) 외에 TNF 수용체 관련 인자(TRAF: TNF receptor associated factor) 어댑터 단백질이 상기 수용체에 결합하여 NF-κB를 활성화시키는 신호의 전달을 유발하는 것으로 밝혀져 왔다.

CD137에 특이적인 길항성(antagonistic) 및 작용성(agonistic) 항체 둘 모두가 개발되어 왔다. 미국 특허 US 6,569,997호, US 8,137,667호 및 문헌[Fisher et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61:1721-1733]. CD137에 특이적인 작용성 항체는 T 세포 기능을 향상시키고, 항종양 활성을 촉진시키는 것으로 보고되어 왔다. 문헌[Fisher et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61:1721-1733]. 반면에, CD137에 특이적인 작용성 항체는 또한 환자에서 유의한 간 독성을 유도하는 것으로 보고되어 왔다. 문헌[Segal et al., Clin Can Res., 2017, 23: 1929-1936].

따라서, 치료적 응용 분야를 위한 효과적이고 안전한 CD137 작용제를 개발하는 것이 관심 대상이다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로, 우수한 인간화 항-CD137 항체의 개발에 기초하며, 이 항체는 선택적으로, 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 변형된 결합 활성을 갖는 Fc 변이체를 포함하는 전장 항체일 수 있다. 이러한 인간화 항-CD137 항체는 하기 실시예에 보고된 바와 같이 다양한 우수한 특징을 갖는 것으로 입증되었다.

따라서, 본 개시내용의 일 양태는 CD137에 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 이러한 항체는 (i) 중쇄 가변 도메인(V_H), 및 (ii) 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함할 수 있다. 상기 V_H는 참조 항체 371과 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1 내지 3을 포함하며, 상기 중쇄 CDR은 인간 IGHV1-2*2 프레임워크에 이식된다. 상기 V_L은 참조 항체 371과 동일한 경쇄 CDR 1 내지 3을 포함하며, 상기 경쇄 CDR은 인간 IGKV1-39*01 프레임워크에 이식된다.

일부 실시형태에서, 상기 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HC CDR1), 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LC CDR1), 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 18의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 1(HC FR1), 서열 번호 19의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 HC FR2, 서열 번호 20의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 HC FR3, 및/또는 서열 번호 21의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 HC FR4를 포함할 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 프레임워크 영역 1(LC FR1), 서열 번호 36의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 LC FR2, 서열 번호 37의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 LC FR3, 및/또는 서열 번호 38의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 LC FR4를 포함할 수 있다.

일부 예에서, 상기 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 4의 위치 K42(예를 들어, K42G), P44(예를 들어, P44V), F71(예를 들어, F71Y), Y87(예를 들어, Y87F), 및 V104(예를 들어, V104L)에서 하나 이상의 역돌연변이를 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일례에서, 상기 인간화 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 LC FR1, 서열 번호 36 또는 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 LC FR2, 서열 번호 37 및 서열 번호 40으로부터 선택된 서열을 포함하는 LC FR3, 및/또는 서열 번호 38 또는 서열 번호 41의 서열을 포함하는 LC FR4를 포함한다. 특정 예에서, 제4항의 인간화 항체는 서열 번호 35의 서열을 포함하는 LC FR1, 서열 번호 39의 서열을 포함하는 LC FR2, 서열 번호 40의 서열을 포함하는 LC FR3, 및 서열 번호 38의 서열을 포함하는 LC FR4를 포함한다.

일부 예에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 3, 8, 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및/또는 서열 번호 4, 5, 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 상기 인간화 항체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 인간화 항체는 전장 항체(예를 들어, IgG 분자, 예를 들어 IgG1 분자)일 수 있다. 대안적으로, 상기 인간화 항체는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 일부 예에서, 상기 전장 항체는 야생형 Fc 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 전장 항체는 변형된 효과기 활성을 갖는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 일례는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역이다. 특정 예에서, 본원에 개시된 인간화 항체는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및/또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는, FcγRIIB에 추가로 결합하는 다중특이적 항체의 일부일 수 있다.

다른 양태에서, 본원은 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체 중 임의의 것을 집합적으로 암호화하는 단리된 핵산 또는 핵산 세트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 단리된 핵산 또는 핵산 세트는 하나의 벡터 상에 위치한다. 다른 실시형태에서, 상기 핵산 세트는 2개의 벡터 상에 위치한다. 일부 예에서, 상기 하나 또는 2개의 벡터는 하나 또는 2개의 발현 벡터이다.

또 다른 양태에서, 본원은 본원에 개시된 단리된 핵산 또는 핵산 세트 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 상기 인간화 항-CD137 항체를 생산하기 위한 하나 이상의 발현 벡터를 포함할 수 있다.

또한, 본 개시내용은 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체 중 임의의 것, 또는 이를 암호화하는 핵산(들)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체를 포함하는 본원에 또한 개시된 약학적 조성물 중 임의의 것을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 요법을 투여 받고 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 체크포인트 억제제는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일례는 펨브롤리주맙이다.

일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 암을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 위험을 갖는 인간 환자일 수 있다. 그 예는 전립선암, 결장암 또는 흑색종을 포함한다. 일부 예에서, 상기 암은 진행성, 전이성 또는 절제 불가능한 악성 종양이다. 일부 예에서, 상기 암은 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된다.

일부 실시형태에서, 치료될 대상체는 면역 장애를 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 위험을 갖는 인간 환자일 수 있다. 일부 예에서, 상기 면역 장애는 자가면역 질환일 수 있다. 그 예는 류마티스 관절염(RA: rheumatoid arthritis), 전신성 홍반 루푸스(SLE: systemic lupus erythematosus), 제I형 당뇨병, 다발성 경화증, 셀리악병 및 이식편대숙주(GVH: graft-versus-host) 질환을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 대상체(예를 들어, 인간 환자)는 상기 암 또는 상기 면역 장애를 위한 요법을 투여 받았거나 투여 받고 있다.

일부 실시형태에서, 상기 인간화 항-CD137 항체(예를 들어, 클론 3712-IgG1v)는 약 0.3 내지 10 mg/kg의 용량으로 상기 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 인간화 항-CD137 항체는 2주 내지 4주마다 1회, 선택적으로 3주마다 1회, 상기 대상체에게 투여된다.

또한, 본원은 인간화 항-CD137 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 이는 (i) 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체 중 임의의 것을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 본원에 개시된 숙주 세포를 상기 항-CD137 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 이렇게 생산된 항-CD137 항체를 세포 배양물로부터 수확하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 숙주 세포 또는 상기 배양 상청액으로부터 상기 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 개시내용의 범위 내에는, 본원에 개시된 암 또는 면역 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 개시된 인간화 항-CD137뿐만 아니라 상기 암 또는 면역 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 이러한 인간화 항-CD137 항체의 용도가 포함된다.

본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부사항이 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 하기 도면 및 여러 실시형태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 분명해질 것이다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 양태들을 추가로 나타내도록 포함되며, 이는 본원에 제시된 특정 실시형태들의 상세한 설명과 조합되어 도면을 참조하여 더 양호하게 이해될 수 있다.
도 1은 인간 CD137을 과발현하는 CHO 세포에 대한 결합에 대한, 참조 항체 371(쥐/인간 키메라) 및 이의 인간화 버전인 클론 3711 및 3712의 FACS 분석을 나타내는 그래프이다. 표시된 최종 농도들의 연속 희석된 항체를 CHO-인간 CD137 세포와 함께 배양하였다. y-축에 표시된 평균 형광 강도(MFI: mean fluorescence intensity)는 항체 결합을 나타낸다.
도 2는 인간 CD8+ T 세포 공동자극 분석에서의 참조 항체 371과 인간화 항체 3711 및 3712 항체의 비교를 도시하는 막대 그래프이다. 인간 CD8+ T 세포가 CHO-K1-huFcγRIIB 세포와 공동배양된 플레이트에, 표시된 10, 20 및 40 ng/mL의 최종 농도의 연속 희석된 항체를 첨가하였다. y-축에 표시된 IFNγ 농도는 인간 CD8+ T 세포의 활성화를 나타낸다.
도 3은 Biacore T200 상의 클론 3712에 대한 huCD137-C6His의 결합을 나타내는 선 그래프이다. 연속 희석된 클론 3712(2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 및 320 nM, 이중)를 180초의 결합 시간으로 고정된 인간 CD137 단백질을 갖는 플로우 셀에 순차적으로 주입하고; 완충제 흐름은 해리를 위해 180초 동안 유지하였다.
도 4a 및 도 4b는 CD137 단백질 및 인간화 항체 3712-결합 ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다. 재조합 인간(도 4a) 또는 시노(cyno)(도 4b) CD137 단백질로 코팅된 플레이트에, x-축에 표시된 최종 농도들의 연속 희석된 클론 3712 또는 아바스틴(Avastin)(음성 대조군)을 첨가하였다. y-축에 표시된 흡광도는 항체 결합을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 클론 3712 및 세포 CD137 결합 FACS를 도시하는 그래프이다. x-축에 표시된 최종 농도들의 연속 희석된 클론 3712 또는 아바스틴을 CHO-인간 CD137(도 5a), CHO-시노몰구스 원숭이 CD137(도 5b), 또는 모체 CHO(도 5c) 세포와 함께 배양하였다. y-축에 표시된 평균 형광 강도(MFI)는 항체 결합을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 FACS에 의한, 활성화된 CD8 T 세포 상의 내인성 CD137에 결합하는 클론 3712를 도시하는 그래프이다. x-축에 표시된 최종 농도들의 연속 희석된 클론 3712 또는 아바스틴을 항-CD3 항체에 의해 사전 활성화된 인간(도 6a) 또는 시노몰구스 원숭이(도 6b) PBMC와 함께 배양하였다. y-축에 표시된 CD8+ T 세포의 평균 형광 강도(MFI)는 항체 결합을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7e는 인간 Fcγ 수용체를 과발현하는 CHO 세포에 결합하는 클론 3712의 FACS 분석을 나타내는 그래프이다. x-축에 표시된 최종 농도(10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.1563, 0.078, 0.039, 0.0195, 0.0098, 0.0049, 0.0024, 0.0012 및 0.0006 μg/mL)의 연속 희석된 클론 3712 또는 아바스틴을 CHO-huFcγ 수용체 세포인 CHO-huFcγRIA(도 7a), CHO-huFcγRIIA-R131(도 7b), CHO-huFcγRIIA-H131(도 7c), CHO-huFcγIIB(도 7d), 및 CHO-huFcγIIIA(도 7e)와 함께 배양하였다. y-축에 표시된 평균 형광 강도(MFI)는 항체 결합을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 ELISA로 측정된, FcRn(도 8a) 및 C1q(도 8b)에 대한 클론 3712의 결합을 나타내는 그래프이다. 도 8a에서, 클론 3712 또는 아바스틴이 코팅된 플레이트에, x축에 표시된 10000, 5000, 2500, 1250, 625, 312.5, 및 156.3 ng/mL의 최종 농도의 FcRn을 첨가하였다. 코팅된 항체에 결합된 FcRn은 항-His 태그-HRP 항체에 의해 검출되었다. 도 8b에서, x-축에 표시된 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 및 8 μg/mL의 농도의 클론 3712 또는 아바스틴을 ELISA 플레이트에 코팅하고 2 mg/mL의 C1q를 플레이트에 첨가하였다. 항체에 결합된 C1q는 항-인간 C1q-HRP 항체에 의해 검출되었다.
도 9는 CD137 리포터 활성 분석 결과를 나타내는 그래프이다. CD137 리포터 세포가 CHO-K1-huFcγRIIB, CHO-K1, 또는 세포를 포함하지 않는 배지와 공동배양된 플레이트에, x-축에 표시된 25000, 6250, 1562.5, 390.6, 97.7, 24.4, 6.10, 1.53, 0.381, 0.095, 및 0.024 ng/mL의 최종 농도의 연속 희석된 클론 3712 또는 아바스틴을 첨가하였다. y-축에 표시된 IL-8 농도는 CD137 리포터 세포의 활성화를 나타낸다.
도 10은 인간 CD8+ T 세포 공동자극 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 인간 CD8+ T 세포가 CHO-K1-huFcγRIIB, CHO-K1 또는 배지와 공동배양된 플레이트에, x-축에 표시된 25000, 6250, 1562.5, 390.6, 97.7, 24.4, 6.10, 1.53, 0.381, 및 0.095 ng/mL의 최종 농도의 연속 희석된 클론 3712 또는 아바스틴을 첨가하였다. y-축에 표시된 IFNγ 농도는 인간 CD8+ T 세포의 활성화를 나타낸다.
도 11은 마우스에서의 클론 3712의 약동학을 나타내는 그래프이다. 수컷 C57BL/6 마우스에서의 3 mg/kg의 IV 투여 후 클론 3712의 개별 혈장 농도-시간 프로파일이 도시되어 있다.
도 12a 및 도 12b는 마우스 종양 모델에서의 다양한 그룹의 종양 성장 곡선을 나타내는 그래프이다. 쥐 결장암 MC38 세포를 0일째에 동형접합 B-h4-1BB 마우스 내로 피하 이식하였다. 종양이 확립된 마우스를 7일째에 대조군 및 치료군(n=6)으로 나누고, 표시된 치료를 복강내 주사로 투여하였다. 종양 크기는 캘리버로 주 2회 측정되었고 0.5×길이×너비²의 공식을 사용하여 종양 부피로서 계산되었다. 종양 크기의 평균 ± SEM을 도 12a에 나타냈고, 도 12b는 개별 마우스 데이터를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 다양한 그룹에서의 종양 성장 곡선을 나타내는 그래프이다. 쥐 결장암 MC38 세포를 0일째에 동형접합 B-h4-1BB 마우스 내로 피하 이식하였다. 종양이 확립된 마우스를 7일째에 대조군 및 치료군(n=6)으로 나누고, 표시된 치료를 복강내 주사로 투여하였다. 도 13a는 클론 3712를 사용한 치료와 문헌에 보고된 2개의 참조 항체를 비교한다. 도 13b는 클론 3712의 투여 효과를 보여준다. 종양 크기는 캘리버로 주 2회 측정되었고 0.5×길이×너비²의 공식을 사용하여 종양 부피로서 계산되었다. 종양 크기의 평균±SEM이 도시되어 있다. 평균값은 Prism에서 다중 t 시험을 사용하여 비교되었다. 도 13a 및 도 13b 둘 모두에서, 클론 3712 10 mg/kg 그룹과 비교하여 통계적으로 유의한 차이인 p<0.05 및 p<0.01은 각각 * 및 **로 표시되었다.
도 14는 쥐 종양 모델에서의 클론 3712와 항-PD-1 항체의 조합 효능을 나타내는 그래프이다. 치사 방사선 조사 후 hPD-1/4-1BB 마우스 공여자 골수 세포가 이식된 WT B6 마우스에 0일째에 쥐 흑색종 B16-OVA 세포를 피하 이식하였다. 종양 부피는 3개의 직교 축(a, b 및 c)을 따라 측정되었고 종양 부피 = abc/2로서 계산되었다. 종양이 확립된 후(14일째), 14, 21 및 28일째에 100 μg의 항-PD-1 항체로 치료되거나, 또는 14일째에 복강내 주사로 투여된 100 μg의 항-CD137 클론 3712로 치료되거나, 또는 상기 단일 제제들과 동일한 투여 일정을 사용한 조합 치료로 치료된 치료군(n=5) 및 대조군으로 마우스를 나누었다. 종양 성장은 주 2회 측정되었다. 상대적 종양 크기는 14일째에 종양 크기를 초기 종양 크기로 나눔으로써 계산되었다. 종양 크기의 평균±SEM이 도시되어 있다. 평균값은 Prism에서 다중 t 시험을 사용하여 비교되었다. 단일 제제 그룹들과 비교하여 통계적으로 유의한 차이인 p<0.05는 *로 표시하였다.
도 15는 상이한 농도들의 표시된 인간화 항체에 대한 T 세포 자극 활성을 나타내는 도표이다.
도 16a 내지 도 16d는 클론 3712와 다양한 키메라 CD137 수용체 단백질의 결합을 나타내는 도표를 포함한다. 도 16a 및 도 16c: 인간 CD137에 대비하여, CD137 수용체 단백질 Ly048, Ly049, 및 ly050에 대한 클론 3712의 결합. 도 16b 및 도 16d: 인간 CD137에 대비하여, CD137 수용체 단백질 Ly051, Ly052, 및 ly110에 대한 클론 3712의 결합.
도 17은 CD137 수용체에 대한 다양한 항-CD137 항체의 결합을 나타내는 도표이다.
도 18은 클론 3712-IgG1v에 의한 종양 성장 억제의 억제를 나타내는 도표이다.

본원은 (예를 들어, 적합한 Fc 부분을 통해) CD137 및 FcγRIIB에 결합할 수 있고 FcγRIIB의 존재 하에 CD137에 의해 매개되는 신호전달을 향상시킬 수 있는 인간화 작용성 항체를 제공한다. 이러한 항-CD137 항체는 본원에 개시된 참조 항-CD137 항체 클론 371(마우스 모체)로부터 유래될 수 있다. 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 하기 실시예에 나타난 바와 같이 모체 클론과 비교하여 유사하거나 우수한 대생물 작용을 나타냈다. 예를 들어, 인간화 항-CD137 항체 클론 3712(예를 들어, IgG Fc 변이체를 포함할 수 있는 IgG1 형식)는 모체 항체와 비교하여 유사한 CD137 결합 친화성, FcγRIIB에 대한 선택적 결합, 및 우수한 T 세포 자극 활성을 가졌고, 공지된 항-CD137 항체에 비해 우수한 항종양 활성을 나타냈다. 상기 인간화 항체는 동물 모델에서 조사된 바와 같이 안전하였다. 상기 인간화 항체는 인간에서 안전성 프로파일을 나타낼 것으로 예측된다. 또한, 본원에 기술된 인간화 항-CD137 항체는 항-PD-1 및 다른 면역치료제뿐만 아니라 암 백신, 세포 요법 및/또는 다른 종양학 치료 방법과 조합되어 상승적 활성을 가질 수 있다.

CD137(4-1BB 또는 TNFRSF9로도 알려짐) 은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리의 구성원이다. 이것은 활성화된 T 세포(보다 우세하게 CD4⁺보다는 CD8⁺)(문헌[Gramaglia et al., Eur. J. Immunol., 30(2):392-402 (2000)])에 의해서 뿐만 아니라 수지상 세포, B 세포, 여포성 수지상 세포, 자연 살해 세포, 과립구에 의해, 및 염증 부위의 혈관벽 세포에서 발현된다. 수지상 세포 상에서의 CD137 발현은 IL-6 및 IL-12의 분비를 유도할 뿐만 아니라, 동종항원에 대한 T 세포 반응을 자극할 뿐만 아니라 종양에 침투하는 DC의 능력을 증가시키는 것으로 나타났다(문헌[Pan et al., J. Immunol., 172(8):4779-89 (2004)]). 활성화된 자연 살해 세포는 사이토카인의 자극 후 CD137을 발현하여, 세포용해 활성에 영향을 미치지 않으면서 자연 살해 세포의 증식 및 IFN-γ 분비를 촉진한다(문헌[Wilcox et al., J. Immunol., 169(8):4230-6 (2002)]).

따라서, 본원은 인간화 항-CD137 항체(예를 들어, 작용성 항-CD137 항체), 이를 암호화하는 핵산, 상기 항체 또는 상기 암호화 핵산(들)을 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 치료적 응용 분야에서의 이러한 항체의 용도를 기술한다.

CD137에 결합하는 인간화 항체

본 개시내용은 CD137, 특히 인간 및/또는 원숭이 CD137에 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 이러한 항체는, CD137에 결합 시 CD137에 의해 매개된 세포 신호전달을 유도하는 작용성 항체일 수 있다.

항체(복수형과 상호교환적으로 사용됨)는, 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서, 용어 "항체"는 온전한(즉, 전장의) 다중클론 또는 단일클론 항체뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편(예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(scFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 디아바디, 나노바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유 결합으로 변형된 항체를 포함한, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열 형태를 포괄한다. 항체는 IgD, IgE, IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이의 하위 부류)과 같은 임의의 부류의 항체를 포함하고, 상기 항체는 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 다섯 가지 주요 부류, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위 부류(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 구분될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차원 배열 형태는 공지되어 있다.

전형적인 항체 분자는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하며, 이들은 일반적으로 항원 결합에 관여한다. 상기 V_H 및 V_L 영역은 "프레임워크 영역"("FR: framework region")으로 알려진 더 보존된 영역이 산재되어 있는, "상보성 결정 영역"("CDR": complementarity determining region)으로도 알려진 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. V_H 및 V_L 각각은 전형적으로 하기와 같은 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 예를 들어 카밧(Kabat) 정의, 초티아(Chothia) 정의, AbM 정의 및/또는 접촉 정의에 의해 당업계에 공지된 방법론을 사용하여 정확하게 식별될 수 있으며, 이들 정의 모두는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 문헌[Chothia et al., (1989) Nature 342:877]; 문헌[Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917], 문헌[Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948]; 및 문헌[Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)] 참조. 또한 문헌[hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs] 참조.

인간화 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특정 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 항원 결합 단편인 비인간(예를 들어, 쥐) 항체의 형태를 의미한다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 상기 인간화 항체는, 수용자 항체 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서는 발견되지 않지만 항체 성능을 추가로 개선시키고 최적화하기 위해 포함된 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 적어도 하나의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것들이다. 상기 인간화 항체는 최적으로는 또한, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함한다. 항체는 WO 99/58572에 기술된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화 항체는 원래 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 가지며, 이는 원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로도 지칭된다. 인간화 항체는 또한 친화성 성숙을 포함할 수 있다.

인간화 항체를 구축하는 방법은 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)] 참고. 일례에서, 모체 비인간 항체의 V_H 및 V_L의 가변 영역에 대해 당업계에 공지된 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석이 수행된다. 다음으로, 정확한 CDR 구조의 형성에 중요한 것으로 예측되는 프레임워크 아미노산 잔기가 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 식별된다. 동시에, 모체 비인간 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 갖는 인간V_H 및 V_L 사슬이 검색 쿼리로서 모체 V_H 및 V_L 서열을 사용하는 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 식별된다. 이어서, 인간 V_H 및 V_L 수용체 유전자가 선택된다.

선택된 인간 수용체 유전자 내의 CDR 영역은 모체 비인간 항체 또는 이의 기능적 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요한 경우, CDR 영역과 상호작용하는 데 중요하다고 예측되는 모체 사슬의 프레임워크 영역 내의 잔기를 사용하여 인간 수용체 유전자 내의 상응하는 잔기를 대체할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항-CD137항체는 표적 항원(예를 들어, CD137) 또는 이의 항원성 에피토프에 대해 적합한 결합 친화성을 갖는다. 본원에서, "결합 친화성"은 겉보기 결합 상수 또는 K_A를 의미한다. 상기 K_A는 해리 상수(K_D)의 역수이다. 본원에 기술된 항-CD137 항체는 표적 항원 또는 항원성 에피토프에 대해 적어도 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10 M 또는 그 미만의 결합 친화성(K_D)을 가질 수 있다. 증가된 결합 친화성은 감소된 K_D에 해당한다. 제2 항원에 대비해 제1 항원에 대한 항체의 더 높은 친화성 결합은, 상기 제2 항원에 결합하는 것에 대한 K_A(또는 수치 K_D)보다 상기 제1 항원에 결합하는 것에 대한 더 높은 K_A(또는 더 작은 수치 K_D)에 의해 표시될 수 있다. 이러한 경우에서, 상기 항체는 상기 제2 항원(예를 들어, 제2 형태의 동일한 제1 단백질 또는 이의 모방체; 또는 제2 단백질)에 비해 상기 제1 항원(예를 들어, 제1 형태의 제1 단백질 또는 이의 모방체)에 대해 특이성을 갖는다. 결합 친화성(예를 들어, 특이성 또는 다른 비교의 경우)의 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 또는 10⁵배일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 항-CD137 항체 중 임의의 것은 추가로 친화성 성숙되어 표적 항원 또는 이의 항원성 에피토프에 대한 항체의 결합 친화성을 증가시킬 수 있다.

결합 친화성(또는 결합 특이성)은 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 분광법(예를 들어, 형광 분석 사용)을 포함한 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 평가하기 위한 예시적인 조건은 HBS-P 완충제(10 mM HEPES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.005%(v/v) 계면활성제 P20)이다. 이들 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질([결합])의 농도는 일반적으로 하기의 방정식에 의해 유리 표적 단백질([유리])의 농도와 연관된다:

[결합] = [유리]/(Kd + [유리])

그러나 항상 K_A를 정확하게 측정할 필요는 없는데, 그 이유는, K_A에 비례하며 따라서 더 높은 친화성이 예를 들어 2배 더 높은 것인지 여부를 측정하는 것과 같은 비교에 사용될 수 있는, 예를 들어 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 측정된 친화성의 정량적 측정값을 획득하거나, 친화성의 정성적 측정값을 획득하거나, 또는 예를 들어 기능성 분석, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 분석에서, 예를 들어 활성에 의해 친화성의 추론을 획득하는 것으로 때때로 충분하기 때문이다.

본원에 기술된 인간화 항-CD137 항체는 항체 클론 371로부터 유래될 수 있으며, 이의 V_H 및 V_L 서열을 하기에 제공하였으며 CDR은 볼드체로 표시되었다(카밧 넘버링에 의해 결정됨). 참조 항체 371에 대한 추가적인 정보는 국제공개 WO2019/113039호에서 찾을 수 있으며, 이의 관련 개시내용은 본원에 언급된 목적 또는 기술 요지를 위해 원용에 의해 본원에 포함된다.

참조 항체 371로부터 유래된 인간화 항-CD137 항체는, 각각 적합한 인간 V_H 프레임워크 및 적합한 V_L 프레임워크에 이식될 수 있는, 실질적으로 유사한 중쇄 및 경쇄 상보성 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 참조 항체 내의 상응하는 CDR과 비교하여 "실질적으로 유사한" 중쇄 CDR 또는 경쇄 CDR을 갖는 항체는, 상기 항체 내의 중쇄 또는 경쇄 CDR이 상기 참조 항체 내의 연관된 상응하는 CDR에 비해, 집합적으로, 10개 미만의 아미노산 잔기 변이(예를 들어, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만 또는 1개 미만의 아미노산 변이)를 함유한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 인간화 항체는 전체 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 영역 내에 단지 최대 8개(예를 들어, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 아미노산 잔기 변이를 포함할 수 있고, 상기 참조 항체와 실질적으로 유사한 친화성(예를 들어, 동일한 차수 K_D 값을 가짐)으로 CD137의 동일한 에피토프에 결합한다.

일부 경우에서, 본원에 개시된 인간화 항체는 참조 항체 371과 동일한 중쇄 CDR3, 및 선택적으로, 상기 참조 항체와 동일한 경쇄 CDR3을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 인간화 항체는 상기 참조 항체와 동일한 중쇄 CDR1 및/또는 CDR2, 및 선택적으로, 상기 참조 항체와 동일한 경쇄 CDR1 및/또는 CDR2를 가질 수 있다.

상기 아미노산 잔기 변이는 보존적 아미노산 잔기 치환일 수 있다. 본원에서, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어진 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특성을 변경하지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 변이체는 당업자에게 공지된 폴리펩타이드 서열을 변경하는 방법, 예를 들어, 이러한 방법을 집대성한 참조문헌, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989], 또는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 발견되는 것들에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기의 그룹 내의 아미노산 중에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 참조 항체 371과 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR을 함유한다. 동일한 V_H 및/또는 V_L CDR을 갖는 2개의 항체는, 동일한 접근법(예를 들어 카밧 접근법, 초티아 접근법, AbM 접근법, 접촉 접근법 또는 당업계에 공지된 IMGT 접근법)에 의해 측정되었을 때 이들의 CDR이 동일하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 문헌[bioinf.org.uk/abs/] 참조.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는, 적합한 수용자 인간 V_H 유전자 및 V_L 유전자의 프레임워크에 이식될 수 있는, 모체 항체 371로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 CDR(실질적으로 유사하거나 동일함)을 포함한다. 일부 예에서, 상기 수용자 인간 V_H 유전자는 IGH1-2*02일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 수용자 인간 V_L 유전자는 Vκ 유전자일 수 있고, 이는 IGKV1-39*01일 수 있다.

일부 실시형태에서, 클론 371로부터의 중쇄 및 경쇄 CDR은, 프레임워크 영역에 추가적인 돌연변이를 도입하지 않으면서, 적합한 수용자 V_H 및 V_L 유전자의 프레임워크 내로 이식될 수 있다. 다른 실시형태에서, 결합 활성, 안정성, 및/또는 다른 바람직한 특성을 향상시키기 위해 하나 이상의 역돌연변이가 상기 프레임워크 영역 내로 도입될 수 있다. 본원에서, "역돌연변이"는 인간 수용자 V_H 또는 V_L 프레임워크의 특정 위치에 있는 아미노산 잔기를 마우스 모체 항체 프레임워크 내의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기로 다시 전환시키는 것을 의미한다.

참조 항체 371로부터 유래된 예시적인 인간화 VH 및 VL 사슬이 하기에 제공된다(카밧 넘버링 방식에 따른 CDR이 볼드체로 표시되고, 역돌연변이는 볼드체 및 밑줄로 표시됨):

하기 표 1 및 2는 모체 항체의 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역(FR) 및 CDR 서열 및 이로부터 유래된 예시적인 인간화 V_H 및 V_L 사슬을 제공한다:

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 12의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HC CDR1), 서열 번호 14의 서열을 포함하는 HC CDR2, 서열 번호 16의 서열을 포함하는 HC CDR3, 및/또는 서열 번호 29의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LC CDR1), 서열 번호 31의 서열을 포함하는 LC CDR2, 및 서열 번호 33의 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 LYV371_VH-1(예를 들어, 서열 번호 18)과 동일한 중쇄 프레임워크 영역 1(HC FR1) 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 인간화 항-CD137 항체는 LYV371_VH-1(예를 들어, 서열 번호 19)과 동일한 HC FR2 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 인간화 항-CD137 항체는 LYV371_VH-1(예를 들어, 서열 번호 20)과 동일한 HC FR3 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 인간화 항-CD137 항체는 LYV371_VH-1(예를 들어, 서열 번호 21)과 동일한 HC FR4 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 역돌연변이는 FR1의 위치 K12(예를 들어, K12V), V20(예를 들어, V20L), FR2의 V37(예를 들어, V37I), E46(예를 들어, E46G), 및 W48(예를 들어, W48I), FR3의 V68(예를 들어, V68A), M70(예를 들어, M70L), R72(예를 들어, R72A) 및 A97(예를 들어, A97T) 중 하나 이상에서 발생할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 (i) 서열 번호 18, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 25의 HC FR1; (ii) 서열 번호 19, 서열 번호 23, 또는 서열 번호 26의 HC FR2, (iii) 서열 번호 20, 서열 번호 24, 또는 서열 번호 27의 HC FR3; 및/또는 (iv) 서열 번호 21의 HC FR4를 포함한다. 일부 예에서, 상기 인간화 항-CD137 항체는 표 1에 제시된 VH-1, VH-2 또는 VH-3과 동일한 중쇄 FR1, FR2, FR3, 및 FR4를 갖는다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 LYV371_VL-1(예를 들어, 서열 번호 35)과 동일한 경쇄 프레임워크 영역 1(LC FR1) 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 c LYV371_VL-1(예를 들어, 서열 번호 36)과 동일한 LC FR2 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 인간화 항-CD137 항체는 LYV371_VL-1(예를 들어, 서열 번호 37)과 동일한 LC FR3 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 인간화 항-CD137 항체는 LYV371_VL-1(예를 들어, 서열 번호 338)과 동일한 LC FR4 또는 1개 이하, 2개 이하 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 FR2의 위치 K42(예를 들어, K42G) 및 P44(예를 들어, P44V), FR3의 F71(예를 들어, F71Y) 및 Y87(예를 들어, Y87F), 및 FR4의 V104(예를 들어, V104L) 중 하나 이상에서 하나 이상의(예를 들어 1, 2, 3, 또는 4개의) 역돌연변이를 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 (i) 서열 번호 35의 서열을 포함하는 LC FR1, (ii) 서열 번호 36 또는 서열 번호 39의 서열을 포함하는 LC FR2, (iii) 서열 번호 37 또는 서열 번호 40의 서열을 포함하는 LC FR3, 및/또는 (iv) 서열 번호 41의 서열을 포함하는 LC FR4를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 상기 인간화 항-CD137 항체는 표 2에 제시된 VL-1, VL-2, 또는 VL-3과 동일한 LC FR1, LC FR2, LC FR3, 및 LC FR4를 갖는다.

특정 예에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 3, 서열 번호 8, 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 사슬을 포함한다. 본원에 제공된 예시적인 인간화 항-CD137 항체는 클론 3711, 3712, 3713, 3714, 3715, 3716, 3717, 3718, 및 3719를 포함한다. 이들 예시적인 인간화 항-CD137 항체의 VH 및 VL 성분에 대해서는 하기 표 3을 참조한다. 이러한 예시적인 항체는 본원에 개시된 임의의 항체 형식, 예를 들어 단일 사슬 항체, Fab 단편, 또는 전장 항체일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항-CD137 항체 중 임의의 것의 중쇄는 중쇄 불변 영역(CH) 또는 이의 일부(예를 들어, CH1, CH2, CH3, 또는 이의 조합)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 항체의 중쇄 불변 영역은 단일 도메인(예를 들어, CH1, CH2, 또는 CH3) 또는 상기 단일 도메인 중 임의의 것의 조합을 포함할 수 있다.

하나의 특정 예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 본원에 기술된 임의의 IgG 서브패밀리의 인간 IgG(감마 중쇄)로부터 유래된다. 일례에서, 상기 불변 영역은 IgG1과 같은 인간 Ig 분자로부터 유래된다. 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체 중 임의의 것의 Fc 영역은 야생형 Fc 도메인일 수 있다. 대안적으로, 상기 Fc 도메인은 하나 이상의 효과기 활성을 조절하기 위해 야생형 대응물에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체일 수 있다. 예를 들어, 이것은 면역학적으로 불활성인, 예를 들어 보체 매개 용해를 촉발하지 않거나 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는, 변형된 불변 영역을 포함할 수 있다. ADCC 활성은 미국 특허 제5,500,362호에 기술된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 불변 영역은 문헌[Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 PCT/GB99/01441호; 및/또는 영국 특허 출원 제9809951.8호에 기술된 바와 같이 변형된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항-CD137 항체는, 상기 항체가 Fc 수용체, 예를 들어 FcγRIIB(CD32B)에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖도록, 야생형 대응물과 비교하여 돌연변이된 Fc 영역을 함유할 수 있다. 이러한 항체는 FcγRIIB 발현 세포와 효율적으로 결합하여, 치료 효과를 높일 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-CD137 항체는, 상기 항체가 Fc 수용체, 예를 들어 FcγRIIB(CD32B)에 대해 선택적인 결합 친화성을 갖도록, 야생형 대응물과 비교하여 돌연변이된 Fc 영역을 함유할 수 있다. 이러한 항체는 FcγRIIB 발현 세포와 선택적으로 및 효율적으로 결합하여, 치료 효과를 높일 수 있다.

상기 인간화 항-CD137 항체를 제조하는 데 사용하기 위한 Fc 변이체는 예를 들어 국제공개 WO2018/183520호에서 찾을 수 있으며, 이의 관련 개시내용은 본원에 언급된 기술 요지의 목적을 위해 원용에 의해 본원에 포함된다. 일부 경우에서, 상기 Fc 변이체는 위치 228(EU 넘버링)에서 S/P 치환을 함유할 수 있다. 일례에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 하기에 제공된 하기의 아미노산 서열(서열 번호 42)을 포함하는 Fc 도메인을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 항-CD137 항체 중 임의의 것은 당업계에 공지된 임의의 CL일 수 있는, 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 CL은 카파 경쇄이다.

항체 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 IMGT 데이터베이스 (imgt.org) 또는 vbase2.org/vbstat.php.에서 제공된 것들이며, 이들 둘 모두는 원용에 의해 본원에 포함된다.

하나의 예시적인 전장 인간화 항-CD137 항체 클론 3712(IgG1v/카파)의 아미노산 서열이 하기에 제공된다:

일부 실시형태에서, 상기 항-CD137 항체는 (Fc-FcR 상호작용을 통하지 않으면서) CD137 및 FcγRIIB 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 항체이다. 이러한 이중특이적 항체는, 제1 항원-결합 영역 및 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 V_H/V_L 쌍을 포함할 수 있다. 상기 제1 항원-결합 영역은 CD137에 결합하고, 상기 제2 항원-결합 영역은 FcγRIIB에 결합한다.

일부 실시형태에서, 상기 항-CD137 항체는 CD137 및 하나 이상의 다른 관심 항원 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 삼중특이적) 항체이다. 이러한 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 제1 항원-결합 영역, 제2 항원-결합 영역, 및 선택적으로, 제3 항원-결합 영역을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 V_H/V_L 쌍을 포함할 수 있다. 상기 제1 항원-결합 영역은 CD137에 결합하고, 상기 제2 항원-결합 영역은 다른 관심 항원에 결합한다.

인간화 항-CD137 항체의 제조

인간화 항체를 구축하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)] 참고. 일례에서, 모체 비인간 항체의 V_H 및 V_L의 가변 영역에 대해 당업계에 공지된 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석이 수행된다. 다음으로, 정확한 CDR 구조의 형성에 중요한 것으로 예측되는 프레임워크 아미노산 잔기가 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 식별된다. 동시에, 모체 비인간 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 갖는 인간V_H 및 V_L 사슬이 검색 쿼리로서 모체 V_H 및 V_L 서열을 사용하는 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 식별된다. 이어서, 인간 V_H 및 V_L 수용체 유전자가 선택된다.

선택된 인간 수용체 유전자 내의 CDR 영역은 모체 비인간 항체 또는 이의 기능적 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요한 경우, CDR 영역(상기 설명 참고)과 상호작용하는 데 중요하다고 예측되는 모체 사슬의 프레임워크 영역 내의 잔기를 사용하여 인간 수용체 유전자 내의 상응하는 잔기를 치환할 수 있다.

일부 예에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체는 하기에 예시된 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.

본원에 기술된 항-CD137 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 하나의 발현 벡터로 클로닝될 수 있으며, 각각의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일례에서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 각각의 뉴클레오타이드 서열은 별개의 프롬프터에 작동 가능하게 연결되어 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 단일 프로모터와 작동 가능하게 연결되어, 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 동일한 프로모터로부터 발현되도록 할 수 있다. 필요한 경우 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosomal entry site)가 중쇄와 경쇄 암호화 서열 사이에 삽입될 수 있다.

일부 예에서, 상기 항체의 2개 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 동일하거나 상이한 세포 내로 도입될 수 있는, 2개의 벡터로 클로닝된다. 상기 2개의 사슬이 상이한 세포에서 발현되는 경우, 이들 각각은 이를 발현하는 숙주 세포로부터 단리될 수 있고, 단리된 중쇄 및 경쇄는 상기 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 혼합 및 배양될 수 있다.

일반적으로, 항체의 하나의 또는 모든 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적합한 프로모터와 작동 가능하게 연결된 적합한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드 서열 및 벡터는 적절한 조건 하에서 제한 효소와 접촉되어, 서로 쌍을 이루고 리가제와 함께 결합될 수 있는 각각의 분자 상에 상보적인 말단을 생성할 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커가 유전자의 말단에 결찰될 수 있다. 이들 합성 링커는 상기 벡터 내의 특정 제한 부위에 해당하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 벡터/프로모터의 선택은 상기 항체를 생산하는데 사용하기 위한 숙주 세포의 유형에 따라 결정될 것이다.

사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 중간 초기 프로모터, 바이러스 LTR 예를 들어 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 유인원 바이러스 40(SV40: simian virus 40) 초기 프로모터, 대장균 lac UV5 프로모터 및 헤르페스 심플렉스 tk 바이러스 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 프로모터가 본원에 기술된 항체의 발현을 위해 사용될 수 있다.

조절 가능한 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 조절 가능한 프로모터는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하기 위한 전사 조절자로서 대장균으로부터의 lac 억제자를 사용하는 것들(문헌[Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)]), 테트라사이클린 억제자(tetR: tetracycline repressor)를 사용하는 것들(문헌[Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)]; 문헌[Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998)]; 문헌[Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)])을 포함한다. 다른 시스템은 아스트라디올, RU486, 디페놀 무리스레론, 또는 라파마이신을 사용하는 FK506 이량체, VP16 또는 p65를 포함한다. 유도성 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad로부터 입수 가능하다.

오페론을 갖는 억제자를 포함하는 조절 가능한 프로모터가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 대장균으로부터의 lac 억제자는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하기 위한 전사 조절자로 기능할 수 있으며, 문헌[M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; 문헌[Gossen 및 Bujard (1992)]; 문헌[M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]는 테트라사이클린 억제자(tetR)를 전사 활성자(VP 16)와 조합하여 tetR-포유동물 세포 전사 활성자 융합 단백질, tTa(tetR-VP 16)를 생성하였고, 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 주요 즉시 초기 프로모터로부터 유래된 tetO-보유 최소 프로모터와 조합하여 tetR-tet 오퍼레이터 시스템을 생성하여 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 제어하였다. 일 실시형태에서, 테트라사이클린 유도성 스위치가 사용된다. tetR-포유동물 세포 전사 인자 융합 유도체가 아닌 테트라사이클린 억제자(tetR) 단독은, 테트라사이클린 오퍼레이터가 CMVIE 프로모터의 TATA 요소에 대해 하류에 적절하게 위치할 때 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 조절하기 위한 강력한 트랜스-조절자(trans-modulator)로서 기능할 수 있다(문헌[Yao et al., Human Gene Therapy, 10(16):1392-1399 (2003)]). 이 테트라사이클린 유도성 스위치의 한 가지 특별한 이점은, 이의 조절 가능한 효과를 달성하기 위해, 일부 경우에서 세포에 대해 독성일 수 있는(문헌[Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]; 문헌[Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]) 테트라사이클린 억제자-포유동물 세포 트랜스활성자(transactivator) 또는 억제자 융합 단백질의 사용을 필요로 하지 않는다는 것이다.

추가로, 상기 벡터는 예를 들어 하기 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: 포유동물 세포에서의 안정한 또는 일시적인 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자와 같은 선택 가능한 마커 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 즉시 초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종료 및 RNA 처리 신호; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제 원점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위(IRES: internal ribosome binding site), 다용도 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 이식유전자를 함유하는 벡터를 생산하기 위한 적합한 벡터 및 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 입수 가능하다.

본원에 기술된 방법을 실시하는 데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

상기 항체 중 임의의 것을 암호화하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 상기 항체를 생산하기 위한 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 숙주 세포는 상기 항체 또는 이의 임의의 폴리펩타이드 사슬의 발현에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 폴리펩타이드 사슬은 통상적인 방법, 예를 들어 친화성 정제를 통해 배양된 세포에 의해(예를 들어, 세포 또는 배양 상청액으로부터) 회수될 수 있다. 필요한 경우, 항체의 폴리펩타이드 사슬은 항체의 생산을 허용하는 적절한 기간 동안 적절한 조건 하에서 배양될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항체를 제조하는 방법은, 본원에 또한 기술된 항-CD137 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 상기 재조합 발현 벡터는 통상적인 방법, 예를 들어 인산 칼슘 매개 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포(예를 들어, dhfr-CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체 숙주 세포는, 세포 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있는, 상기 항체를 형성하는 2개의 폴리펩타이드 사슬의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 선택되고 배양될 수 있다. 필요한 경우, 숙주 세포로부터 회수된 2개의 사슬은 상기 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다.

일례에서, 2개의 재조합 발현 벡터가 제공되며, 하나는 상기 항-CD137 항체의 중쇄를 암호화하고 다른 하나는 상기 항-CD137 항체의 경쇄를 암호화한다. 상기 2개의 재조합 발현 벡터 모두는 통상적인 방법, 예를 들어 인산 칼슘 매개 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포(예를 들어, dhfr-CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 각각의 발현 벡터가 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체는 상기 항체의 폴리펩타이드 사슬의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 선택되고 배양될 수 있다. 상기 2개의 발현 벡터가 동일한 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 그 안에서 생산된 항체는 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우, 상기 폴리펩타이드 사슬은 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수된 다음 상기 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 2개의 발현 벡터가 상이한 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 이들 각각은 상응하는 숙주 세포 또는 상응하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 이어서, 상기 2개의 폴리펩타이드 사슬은 상기 항체의 형성에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다.

표준 분자 생물학 기술을 사용하여 상기 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 결합된 매트릭스를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.

본원에 기술된 항-CD137 항체의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 모두를 암호화하는 핵산 중 임의의 것, 이를 함유하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터); 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포는 본 개시내용의 범위 내에 속한다.

이렇게 제조된 항-CD137 항체는, CD137 생물학적 활성의 증가가 검출 및/또는 측정되는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, ELISA 유형 분석은 T 세포 증식의 CD137 촉진의 정성적 또는 정량적 측정에 적합할 수 있다.

치료 방법

본 개시내용은 치료적 유효량의 항-CD137 항체를 투여함으로써 질환, 예를 들어 암 또는 면역 장애, 예를 들어 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체 중 임의의 것은 항-PD-1 항체와 같은 면역 체크포인트 억제제와 공동으로 사용될 수 있다. 일례에서, 상기 항-PD-1 항체는, 관련 개시내용이 본원에 언급된 기술 요지 및 목적을 위해 원용에 의해 포함되는 국제공개 WO2017087599호에 개시된 항-PD-1 항체 SSI-361, 니볼루맙(옵디보^®(OPDIVO^®)), 펨브롤리주맙(키트루다^®(KEYTRUDA^®)), 아벨루맙(바벤시오^®(BAVENCIO^®)), 더발루맙(임핀지^®(IMFINZI^®)) 또는 아테졸리주맙(티쎈트릭^®(TECENTRIQ^®))일 수 있다. 특히, 상기 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙일 수 있다.

약학적 조성물

본원에 기술된 항체뿐만 아니라 암호화 핵산 또는 핵산 세트, 이를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포는 약학적으로 허용 가능한 담체(부형제)와 혼합되어 표적 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물을 형성할 수 있다. "허용 가능한"은, 상기 담체가 상기 조성물의 활성 성분과 상용성이어야 하고 (그리고 바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있고), 치료될 대상체에게 해롭지 않아야 한다는 것을 의미한다. 완충제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 부형제(담체)는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover] 참조.

본 방법에 사용되는 약학적 조성물은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. (문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로파일 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개의 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 트윈^TM(TWEEN^TM), 플루로닉스^TM(PLURONICS^TM) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)를 포함할 수 있다.

일부 예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; 문헌[Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기술된 것과 같은, 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있는 항체(또는 암호화 핵산)를 함유하는 리포솜을 포함한다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE: PEG-derivatized phosphatidylethanolamine)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정의된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.

상기 항체 또는 상기 암호화 핵산(들)은 또한, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소 구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 각각에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참고한다.

다른 예에서, 본원에 기술된 약학적 조성물은 지속 방출형 형태로 제형화될 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐 알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT^TM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소 구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 약학적 조성물은 무균이어야 한다. 이는, 예를 들어, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료적 항체 조성물은 일반적으로, 무균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 배치된다.

본원에 기술된 약학적 조성물은 단위 투여 형태, 예를 들어, 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제일 수 있다.

정제와 같은 고체 조성물의 제조를 위해, 주요 활성 성분이 약학적 담체, 예를 들어 통상적인 정제화 성분, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산 이칼슘 또는 검, 및 다른 약학적 희석제, 예를 들어 물과 혼합되어, 본 발명의 화합물 또는 이의 비독성의 약학적으로 허용 가능한 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성할 수 있다. 이들 예비제제 조성물을 균질한 것으로서 언급하는 경우에, 이는 상기 조성물이 정제, 환제 및 캡슐과 같은 동등하게 효과적인 단위 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있도록, 활성 성분이 상기 조성물 전반에 걸쳐 균일하게 분산되는 것을 의미한다. 이어시, 이 고체 예비제제 조성물은 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기에 기술된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 상기 신규한 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나, 그렇지 않으면 연장된 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공하도록 컴파운딩될 수 있다. 예를 들어, 상기 정제 또는 환제는 내부 투여 성분 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자의 외피 형태이다. 상기 2개의 성분은, 위에서의 붕해에 저항하는 역할을 하고 내부 성분이 온전하게 십이지장으로 통과하도록 또는 이의 방출이 지연되도록 허용하는 장용성 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용성 층 또는 코팅에 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산, 및 중합체성 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.

적합한 계면활성제는 특히 비이온성 제제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들어, 트윈^TM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄(예를 들어, 스팬^TM(Span^TM) 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 계면활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05% 내지 5%의 계면활성제를 포함하고, 이는 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

적합한 에멀젼은 Intralipid^TM, Liposyn^TM, Infonutrol^TM, Lipofundin^TM 및 Lipiphysan^TM과 같은 상업적으로 입수 가능한 지방 에멀젼을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 예비-혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나, 대안적으로, 오일(예를 들어, 대두유, 홍화유, 목화씨유, 참깨유, 옥수수유 또는 아몬드유) 및 인지질(예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴)과의 혼합 시 형성되는 에멀젼 및 물에 용해될 수 있다. 상기 에멀젼의 등장성을 조정하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 통상적으로 20% 이하, 예를 들어 5% 내지 20%의 오일을 함유한다. 상기 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0의 범위의 pH를 가질 수 있다.

상기 에멀젼 조성물은 항체와 Intralipid^TM 또는 이의 성분들(대두유, 난 인지질, 글리세롤 및 물)을 혼합함으로써 제조된 것들일 수 있다.

흡입용 또는 취입용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 수성 또는 유기 용매 또는 이의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 상기 액체 또는 고체 조성물은 상기에 기술된 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위한 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.

바람직하게는 무균인 약학적으로 허용 가능한 용매 중의 조성물은 기체를 사용하여 네뷸라이징될 수 있다. 네뷸라이징된 용액이 네뷸라이징 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 또는 네뷸라이징 장치가 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은, 적절한 방식으로 상기 제제를 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.

치료적 응용 분야

본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 유효량의 본원에 기술된 약학적 조성물이 적절한 경로, 예를 들어 정맥내 투여를 통해, 예를 들어 볼루스로 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 척추강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의한 일정 기간에 걸친 지속적인 주입에 의해, 상기 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 포함한, 액체 제제용의 상업적으로 입수 가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 네뷸라이징될 수 있으며 동결건조된 분말은 재구성 후 네뷸라이징될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 항체는 플루오로카본 제제 및 계량된 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화되거나, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.

본원에 기술된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 랫트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 표적 질환/장애, 예를 들어 암, 면역 장애, 예를 들어 자가면역 질환, 또는 감염을 갖거나, 이의 위험을 갖거나, 또는 이를 갖는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 인간화 항-CD137 항체를 포함하는 약학적 조성물은 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 데 사용하기 위한 것이며, 이 또한 본 개시내용의 범위 내에 속한다.

암의 예는 유방암; 담도암; 방광암; 교모세포종 및 수모세포종을 포함한 뇌암; 자궁경부암; 융모암; 대장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 급성림프구성 및 골수성 백혈병, 예를 들어 B 세포 CLL을 포함한 혈액학적 종양; T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종; 털세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종; AIDS-관련 백혈병 및 성인 T-세포 백혈병/림프종; 보웬병 및 파제트병을 포함한 상피내 종양; 간암; 폐암; 호지킨병 및 림프구성 림프종을 포함한 림프종; 신경모세포종; 편평 세포 암종을 포함한 구강암; 상피 세포, 간질 세포, 생식 세포 및 간엽 세포에서 발생하는 것들을 포함한 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 평활근 육종, 횡문근 육종, 지방 육종, 섬유 육종 및 골 육종을 포함한 육종; 흑색종, 메르켈 세포 암종, 카포시 육종, 기저 세포 암종 및 편평 세포 암을 포함한 피부암; 정상피종, 비정상피종(기형종, 융모암), 간질 종양 및 생식 세포 종양과 같은 생식 종양을 포함한 고환암; 갑상선 선암 및 수질 암종을 포함한 갑상선암; 및 선암 및 윌름스 종양을 포함한 신장암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

일례에서, 상기 암은 진행성, 전이성 또는 절제 불가능한 악성 종양일 수 있다. 상기 악성 종양은 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인될 수 있다. 특히, 상기 악성 종양은 진행성 또는 전이성일 수 있다.

표적 암을 갖는 대상체는 일상적인 건강 진단, 예를 들어, 실험실 검사, 장기 기능 검사, CT 스캔 또는 초음파에 의해 식별될 수 있다. 표적 암은 또한 조직학적으로 및/또는 세포학적으로 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 치료될 대상체는 항암 요법, 예를 들어 화학요법, 방사선요법, 면역요법 또는 수술을 받았거나 받고 있는 인간 암 환자일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법(예를 들어, 클론 3712-IgG1v를 포함함)에 의해 치료될 대상체는 18세 이상의 인간 환자일 수 있다. 상기 환자는 (i) 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 전이성 또는 절제 불가능한 악성 종양을 갖고/거나, (ii) 적절한 골수, 간 및 신장 기능을 갖고/거나, (iii) 이전의 항암 요법의 모든 가역적 AE로부터 기준선까지 회복되었을 수 있다. HIV에 감염된 환자는, 상기 질환이 효과적인 요법으로 제어되는 경우 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 상기 대상체는 하기 중 하나 이상을 갖지 않는 인간 환자일 수 있다: (1) 본원에 개시된 항-CD137 항체의 제1 용량의 반감기의 5배 동안 전신 항암 요법 투여; (2) 본원에 개시된 항-CD137 항체의 제1 용량으로부터 14일 이내의 이전의 방사선요법; (3) 활동성 CNS 전이 및/또는 암종 수막염을 가짐; (4) 30일 이내에 생바이러스 백신을 투여 받았음; (5) 단일클론 항체 치료에 대해 3등급 이상의 알레르기 반응이 있었음; (6) QT 간격 또는 증후군의 이상; (7) 3등급 이상의 면역 관련 AE(irAE) 또는 irAE의 병력이 있음; (8) 임의의 이유로 면역학적 기반 치료를 투여 받고 있음; (9) 상기 항-CD137 항체의 제1 용량 이전 4주 내에 전신 면역 자극제로 치료받음; (10) 지난 2년 동안 전신 치료가 필요한 활동성 만성 자가면역 질환을 갖거나, 자가면역 또는 염증성 질환을 위한 전신 요법을 투여 받고 있음; (11) 6개월 이내에 불안정 협심증, 급성 심근경색증을 포함한 임상적으로 유의한 심장 병태를 가짐; (12) 상기 항-CD137 항체의 제1 용량 이전 14일 이내에 정맥내(i.v.) 항감염제가 필요한 활성 감염을 가짐; (13) 관리를 돕기 위해 경구 또는 정맥내 글루코코르티코이드와 같은 치료가 필요한 간질성 폐 질환 또는 활동성, 비감염성 폐렴의 현재의 증거 또는 병력을 나타냄; (14) 심각하거나 제어되지 않는 전신 질환의 증거를 나타냄; (15) 실험실 매개 변수에 있어 다른 질환 또는 임상적으로 유의한 이상이 있음; 및/또는 (16) 이전에 줄기 세포 또는 골수 또는 고형 장기 이식을 받은 적이 있음.

일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 면역 장애를 치료하기 위한 것이다. 면역 장애는 면역계의 기능 장애를 의미한다. 그 예는 자가면역 질환, 면역 결핍 또는 알레르기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료를 위한 표적 질환은 자가면역 질환이다. 그 예는 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반 루푸스(SLE), 중증 근무력증(MG: myasthenia gravis), 그레이브스병, 특발성 혈소판감소증 자반병(ITP), 길랭-바레 증후군, 자가면역 심근염, 막 사구체 신염, 당뇨병, 제I형 또는 II형 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 자가면역 갑상선염, 위염, 셀리악병, 백반증, 간염, 원발성 담즙성 간경변, 염증성 장 질환, 척추관절감소증, 실험적 자가면역성 뇌척수염, 면역 호중구 감소증, 청소년 발병 당뇨병 및 사이토카인에 의해 매개되는 지연 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증 및 다발근염에서 일반적으로 발견되는 T-림프구, 다발 동맥염, 피부 혈관염, 천포창, 펨피골드, 굿파스처 증후군, 가와사키 병, 전신 경화증, 항인지질 증후군, 쇼그렌 증후군, 이식편대숙주(GVH) 질환 및 면역성 혈소판 감소증을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

표적 자가면역 질환을 갖는 대상체는 일상적인 건강 진단, 예를 들어 특히, 항핵 항체, 항미토콘드리아 자가항체, 항호중구 세포질 항체, 항인지질 항체, 항시트룰린화 펩타이드(항-CCP: anti-citrullinated peptide), 항류마티스 인자, 면역글로불린 A의 존재, C-반응성 단백질 시험, 보체 시험, 적혈구 침강 속도(ESR: erythrocyte sedimentation rate) 시험, 혈액 응고 프로파일, 단백질 전기영동/면역고정 전기영동에 의해 식별될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 치료될 대상체는 자가면역 질환 치료, 예를 들어, 면역억제 매개, 호르몬 대체 요법, 혈액 수혈, 항염증제 및/또는 진통제를 투여 받았거나 투여 받고 있는 자가면역 장애를 갖는 인간 대상체일 수 있다.

이러한 표적 질환/장애 중 임의의 것을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 상기 질환/장애의 하나 이상의 증상을 나타낼 수 있다. 상기 질환/장애의 위험을 갖는 대상체는 그 질환/장애에 대한 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 대상체일 수 있다.

본원에서, "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합되어 대상체에게 치료 효과를 부여하기 위해 필요한 각각의 활성제의 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 치료 효과는 증가된 CD137 활성, 증가된 T 세포 증식 및 생존, 및/또는 증가된 항종양 면역 반응이다. 상기 항체의 양이 상기 치료 효과를 달성했는지 여부에 대한 측정은 당업자에게 명백할 것이다. 유효량은, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 치료되고 있는 특정 병태, 병태의 중증도, 연령, 신체 상태, 몸집, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 매개 변수, 치료 기간, (존재하는 경우) 병행 치료의 특성, 특정 투여 경로 및 의료 종사자의 지식 및 전문 지식 내의 유사한 인자에 따라 변화한다. 이들 인자는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 단지 일상적 실험에 의해 해결될 수 있다. 일반적으로, 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉 합당한 의학 판단에 따른 안전한 최고 용량을 사용하는 것이 바람직하다.

반감기와 같은 경험적 고려사항이 일반적으로 용량의 결정에 기여한다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예를 들어 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 사용하여 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여의 빈도는 치료 기간에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로, 표적 질환/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 기초한다. 대안적으로, 항체의 지속 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치는 당업계에 공지되어 있다.

일례에서, 본원에 기술된 항체에 대한 용량은 상기 항체의 1회 이상의 투여(들)를 받은 개체들에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체들에게는 상기 작용제의 증분 용량이 제공된다. 상기 작용제의 효능을 평가하기 위해, 상기 질환/장애의 지표를 따를 수 있다.

일반적으로, 본원에 기술된 항체 중 임의의 것의 투여에 대해, 초기 후보 용량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 일일 용량은, 상기에 언급된 인자에 따라, 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 초과의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 일일 용량은 10 mg/kg일 수 있다. 수일 또는 그 초과의 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 치료는 원하는 증상 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 표적 질환 또는 장애, 또는 이의 증상을 완화시킬 때까지 지속된다. 예시적인 투여 요법은, 약 2 mg/kg의 초기 용량을 투여하고, 이어서 약 1 mg/kg의 상기 항체의 매주 유지 용량을 투여하거나, 또는 격주로 약 1 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 의사가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴의 패턴에 따라, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 주 1회 내지 4회 투여가 고려된다. 일부 실시형태에서, 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg(예를 들어, 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg 및 약 2 mg/kg)의 범위의 용량이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 빈도는 매주, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다 1회; 또는 매월, 2개월마다 또는 3개월마다 1회, 또는 더 길다. 각각의 이러한 기간은 주기로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최대 40 주기, 특히 35 주기가 투여될 수 있다. 이 요법의 진행상황은 통상적인 기술과 분석에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다. 상기 투여 요법(사용된 항체 포함)은 시간이 지남에 따라 변화할 수 있다.

일례에서, 상기 투여 빈도는 3주마다 1회이다. 특히, 0.3 내지 10 mg/kg의 본원에 개시된 인간화 항-CD137 항체(예를 들어, 클론 3712-IgG1v)가 3주마다 1회 투여될 수 있다. 최대 35 주기가 투여될 수 있다. 이들 실시형태에서의 투여 방식은 정맥내일 수 있다.

일부 실시형태에서, 정상 체중의 성인 환자의 경우, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기술된 항-CD137 항체의 용량은 10 mg/kg일 수 있다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 개체 및 그 개체의 병력뿐만 아니라 개별 제제의 특성(예를 들어, 상기 제제의 반감기 및 당업계에 널리 공지된 다른 고려사항)에 따라 결정된다.

본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 기술된 항체의 적절한 용량은 사용된 특정 항체, 항체들, 및/또는 비항체 펩타이드(또는 이의 조성물), 질환/장애의 유형 및 중증도, 상기 항체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 병력 및 작용제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 결정된다. 전형적으로, 원하는 결과를 달성하는 용량에 도달할 때까지 임상의는 항체를 투여한다. 일부 실시형태에서, 원하는 결과는 종양 미세환경에서의 항종양 면역 반응의 증가이다. 투여가 원하는 결과를 가져 왔는지 여부를 측정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 하나 이상의 항체의 투여는, 예를 들어, 투여 목적이 치료적이든 예방적이든, 수용자의 생리적 상태 및 숙련된 실무자에게 공지된 다른 인자에 따라, 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항체의 투여는 사전 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 예를 들어 표적 질환 또는 장애가 발생하기 전, 발생하는 동안 또는 발생 후의, 일련의 간격이 있는 용량일 수 있다.

본원에서, 용어 "치료"는 표적 질환 또는 장애, 상기 질환/장애의 증상, 또는 상기 질환/장애에 대한 경향을 갖는 대상체에게 상기 장애, 상기 질환의 증상, 또는 상기 질환 또는 장애에 대한 경향을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 교정, 개선, 향상 또는 영향을 주기 위한 목적으로 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 투여 또는 적용하는 것을 의미한다.

표적 질환/장애를 완화시키는 것은 상기 질환의 발생 또는 진행을 지연시키는 것, 또는 질환의 심각성을 감소시키는 것 또는 생존을 연장시키는 것을 포함한다. 상기 질환을 완화시키는 것 또는 생존을 연장시키는 것이 반드시 치유 결과를 요구하는 것은 아니다. 본원에서, 표적 질환 또는 장애의 발생을 "지연"시키는 것은 상기 질환의 진행을 연기, 방해, 지체, 지연, 안정화, 및/또는 미루는 것을 의미한다. 이러한 지연은 상기 질환의 병력 및 치료받고 있는 개체에 따라 다양한 기간일 수 있다. 질환의 발생을 "지연"시키거나 완화시키거나, 상기 질환의 발병을 지연시키는 방법은, 상기 방법을 사용하지 않는 경우와 비교할 때, 특정 기간에 상기 질환의 하나 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 특정 기간에 상기 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로, 통계적으로 유의미한 결과를 얻기에 충분한 다수의 대상체를 사용하여 임상 연구에 기초한다.

질환의 "발생" 또는 "진행"은 상기 질환의 초기 발현 및/또는 계속되는 진행을 의미한다. 상기 질환의 발생은 당업계에 널리 공지된 표준 임상 기술을 이용하여 검출 가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발생은 또한 검출 불가능할 수 있는 진행을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 의미한다. "발생"은 나타남, 재발 및 발병을 포함한다. 본원에서, 표적 질환 또는 장애의 "발병" 또는 "나타남"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항체는 CD137의 활성을 생체내에서 적어도 10%(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과) 향상시키기에 충분한 양으로 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.

치료하고자 하는 질환의 유형 또는 질환 부위에 따라, 약학 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 상기 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여할 수 있다. 이 조성물은 또한 다른 통상적인 경로에 의해, 예를 들어 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질내로 또는 이식된 저장조를 통해 투여될 수 있다. 본원에서, 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 병소내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 이것은 주사 가능한 데포 투여 경로를 통해, 예를 들어 1, 3 또는 6개월 데포 주사 가능한 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하여 상기 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 상기 약학적 조성물은 안와로 또는 유리체내로 투여된다.

주사 가능한 조성물은 다양한 담체, 예를 들어 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 수용성 항체는 드립(drip) 방법으로 투여될 수 있으며, 이로써 상기 항체 및 생리적으로 허용 가능한 부형제를 함유하는 약학적 제제가 주입된다. 생리적으로 허용 가능한 부형제는 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 식염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어 상기 항체의 적합한 가용성 염 형태의 무균 제제는 약학적 부형제, 예를 들어 주사용수, 0.9% 식염수 또는 5% 글루코스 용액에 용해되어 투여될 수 있다.

일 실시형태에서, 항체는 부위 특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위 특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예는, 상기 항체의 다양한 이식 가능한 데포 공급원 또는 국소 전달 카테터, 예를 들어 주입 카테터, 유치 카테터 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외막 랩, 션트 및 스텐트 또는 다른 이식 가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 WO 00/53211호 및 미국 특허 제5,981,568호 참조.

안티센스 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, 또는 서브게놈 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료적 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체 매개 DNA 전달 기술은 예를 들어 문헌[Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202]; 문헌[Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994)]; 문헌[Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621]; 문헌[Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542]; 문헌[Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655]; 문헌[Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338]에 기술되어 있다.

폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 본원에 기술된 항체를 암호화하는 것들)를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA 범위로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg 또는 그 초과의 DNA 농도 범위가 유전자 요법 프로토콜 동안 사용될 수도 있다.

본원에 기술된 치료용 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 상기 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비바이러스성 기원일 수 있다(일반적으로, 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51]; 문헌[Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845]; 문헌[Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185]; 및 문헌[Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148] 참조). 이러한 암호화 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하여 유도될 수 있다. 상기 암호화 서열의 발현은 구성적이거나 또는 조절될 수 있다.

원하는 폴리뉴클레오타이드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스 기반 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예시적인 바이러스 기반 비히클은 재조합 레트로바이러스를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, PCT 공개 WO 90/07936호; WO 94/03622호; WO 93/25698호; WO 93/25234호; WO 93/11230호; WO 93/10218호; WO 91/02805호; 미국 특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호 참조), 알파 바이러스 기반 벡터(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) 및 아데노 관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 벡터(예를 들어, PCT 공개 WO 94/12649호, WO 93/03769호; WO 93/19191호; WO 94/28938호; WO 95/11984호 및 WO 95/00655호 참조). 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147]에 기술된 바와 같이 살해된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.

살해된 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다중양이온 축합된 DNA(예를 들어, 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147] 참조); 리간드-연결된 DNA(예를 들어, 문헌[Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985] 참조); 진핵세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,814,482호; PCT 공개 WO 95/07994호; WO 96/17072호; WO 95/30763호; 및 WO 97/42338호 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비바이러스성 전달 비히클 및 방법도 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개 WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국 특허 제5,422,120호; PCT 공개 WO 95/13796호; WO 94/23697호; WO 91/14445호; 및 유럽 특허 제0524968호에 기술되어 있다. 추가적인 접근법은 문헌[Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411], 및 문헌[Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581]에 기술되어 있다.

본원에 기술된 방법에 사용되는 특정 투여 요법, 즉 용량, 시기 및 반복은 특정 대상체 및 그 대상체의 병력에 따라 결정된다.

일부 실시형태에서, 하나 초과의 항체, 또는 항체와 다른 적합한 치료제의 조합이 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 항체는 또한 상기 제제의 효과를 강화 및/또는 보완하는 역할을 하는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다.

표적 질환/장애에 대한 치료 효능은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.

조합 요법

본원에 기술된 항-CD137 항체는 암, 면역 장애 또는 감염과 같은 표적 질환을 위한 다른 유형의 요법과 조합하여 사용될 수 있다.

본원에 기술된 항-CD137 항체가 암 치료에 사용되는 경우, 이것은 항암 요법, 예를 들어 당업계에 공지된 것들과 조합될 수 있다. 추가적인 항암 요법은 화학요법, 수술, 방사선 조사, 면역요법 및 유전자 요법 등을 포함한다. 이러한 요법은 본 개시내용에 따른 면역요법과 동시에 또는 순차적으로(임의의 순서로) 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 항-CD137 항체는 다른 면역조절 치료, 예를 들어 체크포인트 분자(예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD40, LAG3, TIM-3, 또는 A2aR)의 억제제와 조합될 수 있다. 도 14에서 입증된 바와 같이, 항-CD137 항체 및 항-PD-1 항체의 조합 치료는 상승 효과를 유발하였으며, 종양 성장이 상기 두 치료 중 하나 단독에 비해 마우스 모델에서 유의하게 억제되었다.

대안적으로 또는 추가로, 본 개시내용의 치료는 화학요법제, 예를 들어 피리미딘 유사체(5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈 및 시타라빈), 퓨린 유사체, 엽산 길항제 및 관련 억제제(메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈)와 같은 천연물, 미세관 파괴제, 예를 들어 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신(에토포사이드, 테니포사이드), DNA 손상제(악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틴엘라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 메르클로르에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카르바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포사이드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 에토포사이드(VP16))를 포함한 항증식/항유사분열 제제; 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신과 같은 항생제; 효소(L-아스파라긴을 전신적으로 대사하고 이의 자체 아스파라긴을 합성할 능력이 없는 세포를 박탈하는 L-아스파라기나아제); 항혈소판 제제; 질소 머스타드(메클로레타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민(헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 설포네이트-부설판, 니트로소우레아(카르무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카르바지닌(DTIC)과 같은 항증식/항유사분열 알킬화제; 엽산 유사체(메토트렉세이트)와 같은 항증식/항유사분열 항대사제; 백금 배위 착물(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카르바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타마이드, 닐루타마이드) 및 아로마타제 억제제(레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제(헤파린, 합성 헤파린 염 및 다른 트롬빈의 억제제); 섬유소용해 제제(예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제 및 유로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 항이주 제제; 항분비 제제(브레벨딘); 면역 억제제(사이클로스포린, 타크로리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항혈관형성 화합물(예를 들어, TNP-470, 제니스테인, 베바시주맙) 및 성장 인자 억제제(예를 들어, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화 질소 공여자; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 항체(트라스투주맙); 세포 주기 억제제 및 분화 유도제(트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제(독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르코손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능 장애 유도제 및 카스파제 활성화제; 및 염색질 방해물질과 조합될 수 있다.

면역 장애를 치료하기 위해 본원에 기술된 항-CD137 항체가 사용되는 경우, 이것은 다른 면역조절 치료, 예를 들어, 치료용 백신(GVAX, DC 기반 백신 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않음)과 공동으로 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체는 자가면역 질환을 위한 다른 요법과 조합될 수 있다. 그 예는 정맥내 Ig 요법; 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID); 코르티코스테로이드; 사이클로스포린, 라파마이신, 아스코마이신; 사이클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 브레퀴나르; FTY 720; 레플루노미드; 미조리빈; 마이코페놀산; 마이코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스퍼구알린; 면역억제 제제 또는 접착 분자 억제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

추가적인 유용한 제제의 예에 대해서는, 문헌[Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.]; 문헌[Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams 및 Wilkins, Baltimore Md.]; 문헌[Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY]; 문헌[Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis 및 Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.]을 또한 참조한다.

추가적인 치료제와 공동투여되는 경우, 부가 작용 또는 상승 작용으로 인해 각각의 제제에 대한 적절한 치료적 유효 용량이 감소될 수 있다.

질환을 치료하는 데 사용하기 위한 키트

본 개시내용은 또한 본원에 기술된 암, 면역 장애 또는 감염과 같은 표적 질환을 치료 또는 완화시키는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 항-CD137 항체, 예를 들어 본원에 기술된 것들 중 임의의 것, 및 선택적으로, 상기 항-CD137 항체와 공동으로 사용될 본원에 또한 기술된 제2 치료제를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 기술된 방법 중 임의의 것에 따른 사용 설명서를 포함할 수 있다. 포함된 설명서는 본원에 기술된 표적 질환을 치료하거나, 발병을 지연시키거나, 완화시키기 위한 상기 항-CD137 항체, 및 선택적으로, 상기 제2 치료제의 투여에 대한 설명을 포함할 수 있다. 상기 키트는 개체가 상기 표적 질환을 갖는지 여부를 식별하는 것을 기초로 하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것, 예를 들어 본원에 기술된 진단 방법을 적용하는 것에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 설명서는 상기 표적 질환의 위험을 갖는 개체에게 항체를 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.

항-CD137 항체의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로, 의도된 치료를 위한 용량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 상기 용기는 단위 용량, 벌크 포장(예를 들어, 다중 용량 포장) 또는 하위 단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 설명서는 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물(예를 들어, 상기 키트에 포함된 종이 시트) 상에 기술된 설명서이지만 기계 판독 가능한 설명서(예를 들어, 자기 저장 디스크 또는 광학 저장 디스크에 보유된 설명서)도 또한 허용 가능하다.

상기 라벨 또는 포장 삽입물은, 상기 조성물이 암, 면역 장애(예를 들어, 자가면역 질환), 또는 감염과 같은 질환을 치료하고/거나, 발병을 지연시키고/거나, 완화시키는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 본원에 기술된 방법 중 임의의 것을 실시하기 위한 설명서가 제공될 수 있다.

본 발명의 키트는 적합한 포장재 내에 있다. 적합한 포장재는 바이알, 병, 단지, 가요성 포장재(예를 들어, 밀봉 마일라 또는 비닐 봉지) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 미니 펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 포장도 고려된다. 키트는 무균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 상기 용기는 무균 접근 포트를 또한 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 상기 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본원에 기술된 항-CD137 항체이다.

키트는 선택적으로, 완충제 및 해석 정보와 같은 추가적인 성분을 제공할 수 있다. 정상적으로, 상기 키트는 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 상기에 기술된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

일반적인 기술

본 발명의 실시는, 달리 표시되지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용하며, 이는 당업계의 기술 내에 속한다. 이러한 기술은 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press]; 문헌[Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; 문헌[Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; 문헌[Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; 문헌[Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]과 같은 문헌에 완전하게 설명되어 있다.

더 이상 첨언하지 않더라도, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 최대 한도로 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 하기의 특정 실시형태들은 단지 예시적이며, 어떤 방식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 출판물은 본원에 언급된 목적 또는 기술 요지를 위해 원용에 의해 본원에 포함된다.

실시예

실시예 1: 인간화 항-CD137 항체의 생성

인간화 및 역돌연변이 설계

참조 항체 371을 하기에 기술된 바와 같이 인간화하였다. 참조 항체 371 가변 도메인을 인간 생식계열과 비교하는 서열 정렬을 생성하였다(문헌[Glanville J. et al. PNAS 2009; 106 (48) 20216―21]). 전체 서열 동일성, 매칭 인터페이스 위치 및 유사하게 분류된 CDR 표준 위치에 기초하여, 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 특정 생식계열 패밀리가 가장 적절한 수용체 프레임워크를 함유하는 것으로 식별되었으며, 이는 경쇄에 대해 IGKV1-39*01이고 중쇄에 대해 IGHV1-2*02였다. 식별된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 수용체 프레임워크 아미노산 서열을 하기에 제공하였다:

선택된 인간 프레임워크에 대한 CDR-이식에 의해 클론 371의 인간화를 수행하였다(중쇄 및 경쇄 각각에 대해 서열 번호 3 및 4).

371개의 항체 Fv 단편의 상동성 모델링을 수행하였다. Fv 단편에 대한 주형을 식별하고 도메인 인터페이스를 구축하기 위해 단백질 데이터 은행(PDB: protein data bank) 항체 데이터베이스에 대해 클론 371 서열을 BLAST 검색하였다. 구조적 주형 1NMB(문헌[Malby et al., Structure, 1994 Aug 15;2(8):733-46])이 동일성이 78%였기 때문에 선택되었다. 참조 항체 371 항체(절단 전 서열 번호 2 및 절단 후 서열 번호 1)와 1NMB 주형(서열 번호 45) 간의 아미노산 서열 정렬을 하기에 제시하였으며, 여기서 │은 사슬 절단이고 *는 두 서열 모두에 있어 동일한 아미노산 잔기를 나타낸다.

상동성 모델은 맞춤형 Build Homology Models 프로토콜을 사용하여 구축하였다. 이황화 다리가 지정되고 연결되었다. 루프는 DOPE 방법을 사용하여 최적화되었다. 1NMB의 상동성 모델에 기초하여, 참조 항체 371의 서열을 분석하였다. 결합 활성에 중요한 것으로 여겨지는 프레임워크 영역(FR) 잔기, 즉, 항체의 표준 FR 잔기 및 V_H-V_L 인터페이스 잔기를 식별하였다. 내부 코어의 프레임워크 잔기를 추가로 분석하였다. 참조 항체 371_V_L-1(이식된 참조 항체 371_V_L; 서열 번호 2)의 하기의 4개 잔기에 대해 역돌연변이를 식별하였다: K42(측쇄 전하를 갖는 매장된 잔기), P44(V_H/V_L 인터페이스의 매장된 잔기), F71(매장된 표준 잔기) 및 Y87(V_H/V_L 인터페이스의 매장된 잔기). 식별된 잔기가 최적 활성을 유지하기 위해 필요한지를 시험하기 위해, 인간화 변이체인 참조 항체 371_V_L-2(서열 번호 5)는 식별된 잔기가 참조 항체 371 잔기(K42G, P44V, F71Y 및 Y87F)로 복귀하도록 설계되었다.

인간화 참조 항체 371 항체의 재조합 완전 인간 IgG4/카파는 힌지 S228P(EU 넘버링; 카밧 넘버링 241) 안정화 돌연변이(문헌[Angal et al., Mol. Immunol 30:105, 1993]) 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 인간 IgG4로 구축되었다. 인간화 참조 항체 371인 클론 3711은 역돌연변이를 갖지 않는 V_H-1 및 V_L-1의 CDR-이식된 371인 반면, 클론 3712는 4개의 아미노산 잔기 대응물(K42G, P44V, F71Y 및 Y87F)의 역돌연변이를 함유하는 V_H-1 및 V_L-2를 갖는다.

추가적인 인간화 V_H 사슬(V_H-2 ad V_H-3) 및 V_L 사슬(V_L-3) 또한 구축하였다. 모체 클론 371의 V_H 및 V_L의 아미노산 서열, 및 이로부터 유래된 모든 인간화 V_H 및 V_L 사슬을 상기에 제공하였다.

상기에 열거된 인간화 V_H 및 V_L 사슬의 무작위 조합을 포함하는 인간화 항-CD137 항체를 구축하였다. 하기 표 3을 참조한다.

항-CD137 항체 가변 도메인 서열을 암호화하는 cDNA 서열은, 힌지 S228P(EU 넘버링; 카밧 넘버링 241) 안정화 돌연변이(문헌[Angal et al., Mol. Immunol 30:105, 1993]) 또는 인간 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 인간 IgG4 중쇄 불변 영역에 대한 키메라로서 합성되었다. HEK293 및/또는 CHO 일시적 발현은 상응하는 중쇄 및 경쇄 서열을 함유하는 플라스미드로 수행되었다. 이들 키메라 및 인간화 항체는 단백질 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 항체에 대해 내독소(<5 EU/mg) 및 단량체화(>95%)를 확인하였다.

실시예 2: 항-CD137 인간화 항체의 평가

CD137 항원 결합의 K _D 측정

결합 동역학을 추정하기 위해 Octet Red 96 상에서의 항원 결합 분석에서 키메라 및 인간화 항체를 시험하였다. 항-인간 Fc(AHC: anti-human Fc) 바이오센서에 항체를 로딩하였다. 분석 완충제(0.1% BSA, 0.02% 트윈-20을 갖는 PBS(pH 7.2)) 중의 CD137 단백질(300 nM, 1:3 아래로, 7 포인트)의 연속 희석액에, 로딩된 센서를 침지시켰다. 1가(1:1) 모델을 이용하여 계산된 동역학 상수를 하기 표 4에 제시하였다. 인간화 항체 3711은 모체 키메라 참조 항체 371과 유사한 결합 동역학을 나타냈다. 역돌연변이를 갖는 항체 3712는 3배 더 높은 오프-레이트(off-rate)로 인해 더 낮은 친화성을 나타냈다.

CD137 결합 FACS

인간CD137을 과발현하는 CHO 세포를 트립신-EDTA 부분 분해를 사용하여 수확한 다음 1000 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포를 저온 PBS-BSA(2%)에 5x10⁶/mL로 재현탁시키고 100 μL/튜브로 분취하였다. 항-CD137 항체를 PBS-BSA에 3회 희석하고(최종 농도는 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/mL였음) 50 μL의 각각의 농도를 CHO-CD137 세포에 첨가하였다. 세포 용액을 혼합하고 2시간 동안 암실에서 4℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS-BSA로 2회 세척하였다. 1 μg/mL의 농도의 2차 항체 접합체(염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG - Fc(PE), 사전 흡착(ab98596))를 100 μL/웰로 첨가하고, 세포를 혼합하고 1시간 동안 암실에서 4℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS-BSA로 2회 세척한 후 2% PFA에서 고정한 다음, FACS 분석을 수행하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 참조 항체 371 및 인간화 항체 3711 및 3712는 인간 CD137을 과발현하는 CHO 세포에 대해 유사한 결합 친화성을 나타냈다.

T 세포 기능 분석

4명의 건강한 지원자로부터 신선한 PBMC를 단리하고 10% FBS를 함유하는 PRMI-1640에 1x10⁶/mL로 재현탁시켰다. EasySep™ 인간 CD8⁺ T 세포 단리 키트(Stemcell, 17953)를 사용하여 샘플로부터 CD8+ T 세포를 단리하였다. 생성된 T 세포를 RPMI 1640(10% FBS)에 5x10⁵/mL의 농도로 희석하였다.

인간 CD8-양성 T 세포의 공동자극 분석은 인간 FcγRIIB를 발현하는 CHO 세포와의 공동배양 하에 수행되었다. 공동배양 분석을 실행하기 위해, 인간 FcγRIIB를 발현하도록 조작된 CHO 세포를 2.5x10⁴ 세포/웰의 농도로 96-웰 배양 플레이트에 도말하였다. 37℃ 및 5% CO₂에서 세포 배양 인큐베이터에서 밤사이의 배양 기간 동안 세포가 부착되도록 하였다. 4명의 공여자로부터의 인간 CD8+ T 세포를 1x10⁵ 세포/웰로 첨가하고, OKT3을 0.1 μg/mL로 첨가하고, CD137 항체를 0, 0.01, 0.02, 및 0.04 μg/mL 최종 농도로 첨가하였다. 배양 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 세포 배양 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 배양 상청액 내의 IFN-γ 함량은 ELISA(eBioscience, 88-7316-88)에 의해 측정되었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 키메라 및 인간화 항체는 FcγRIIB-발현 CHO 세포의 존재 하에 인간 CD8-양성 T 림프구를 공동자극하는 능력을 나타냈다. 예기치 않게, 항체 3711은 모체 참조 항체 371 및 클론 3712(역돌연변이)보다 더 약한 효능을 나타낸 점이 주목되었다. 따라서, 경쇄 가변영역에 역돌연변이를 함유하는 인간화 항체인 클론 3712이, Fc 조작을 위한 원하는 인간화 서열로서 선택되었다.

실시예 3: 항-CD137 인간화 항체의 Fc 조작 및 특성화

Fc 점 돌연변이를 갖는 항체 클론 3712의 제조

상기에 기술된 클론 3712의 인간화 서열을 사용하여, 인간 IgG1의 Fc 변이체를 함유하는, 인간 IgG1/카파(서열 번호 6 및 7)의 Fc 영역을 포함하는 CD137 항체 클론 3712을 구축하였다(클론 3712-IgG1v/카파). 일시적 발현 CHO 세포 및 안정한 CHO 세포주에서의 생산을 위한 발현 벡터로 클론 3712를 클로닝하였다.

Biacore 상에서의 CD137 항원 결합의 K _D 측정

CM5 센서 칩(GE Healthcare Life Sciences)의 플로우 셀을 새로 혼합된 50 mmol/L NHS 및 200 mmol/L EDC로 420초(10 μL/분) 동안 활성화시켰다. 그런 다음, 10 mmol/L NaAC(pH 5.0) 중의 huCD137-C6His를 실행 완충제로서의 HBS-EP(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05% P20, pH 7.4)와 함께 활성화된 플로우 셀에 주입하였다(10 μL/분). 나머지 활성 커플링 부위는 1 mol/L 에탄올아민의 420초 주입으로 차단하였다. 측정은 25℃에서 수행하였으며, 실행 완충제로서 HBS-EP를 사용하였다. 시험된 분석물의 주입과 CM5 센서 칩의 표면 재생이 각각의 실행 주기에 포함되었다. 연속 희석된 클론 3712(2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 및 320 nM)를 약 180초의 결합 시간으로 두 셀 모두에 순차적으로 주입하였다. 완충제 흐름은 해리를 위해 약 180초 동안 유지되었다. 시험 항체를 제거하기 위해, 재생을 위해 약 30초 동안의 10 mM 글리신-HCl 주입이 사용되었다. 각각의 농도의 연속 희석된 시험 항체에 대해 상기 절차를 반복하였다. 표면 플라즈몬 공명 실험의 미가공 데이터는 1:1 결합 모델로 Biacore T200 평가 소프트웨어 3.1을 사용하여 평가되었다. 플로우 셀 1을 참조 플로우 셀로 사용하였다. 실험의 친화성 및 동역학 데이터는 표 5에 표시하였고 미가공 데이터는 도 3에 제공하였다. 클론 3712와 인간 CD137 단백질의 친화성(K_D 값)은 18.9 nM이었고, 패스트-온(fast-on) 및 패스트-오프(fast-off) 동역학을 가졌다.

CD137 결합 ELISA

클론 3712-IgG1v와 재조합 CD137 수용체 단백질의 결합 또한 표준 ELISA 형식으로 분석하였다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD137 수용체 단백질을 DPBS에 1 μg/mL로 희석한 다음, ELISA 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 9018, 높은 결합)에 웰당 100 μL(0.1 μg) 또는 50 μL(0.05 μg) 부피로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 경사분리하고 1회 세척하고; 분석 희석제를 200 μL/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. 클론 3712를 분석 희석제에 10 μg/mL로 희석한 다음, 분석 희석제에 11개 포인트로 3배 연속 희석하여 최종 농도가 10000, 3333.3, 1111.1, 370.4, 123.5, 41.2, 13.7, 4.6, 1.52, 0.51 및 0.17 ng/mL이 되도록 하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v를 분석 플레이트에 50 μL/웰로 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 1:100,000 희석된 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG-H+L를 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 4회 세척하였다. TMB 기질 용액을 100 μL/웰로 첨가하였다. 15분 동안 색이 발색되도록 하고 100 μL/웰의 2 N H₂SO₄로 중지시켰다. Tecan F200 Pro 판독기로 450 nm 및 620 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

클론 3712-IgG1v가 마우스 또는 랫트 CD137 수용체 및 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 PD-1, LAG-3, VISTA, B7-H3, B7-H4, GITR, CD40, TIGIT, PD-L1, CD20, CD47, CD19, CD27 및 LTBR에 결합하는지 여부를 측정하기 위해, 단백질 샘플을 DPBS에 1 μg/mL로 희석한 다음 ELISA 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 9018, 높은 결합)에 웰당 100 μL(0.1 μg) 또는 50 μL(0.05 μg)로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 경사분리하고 1회 세척하고; 분석 희석제를 200 μL/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. 양성 참조/대조군으로 사용된 표적 특이적 항체를 분석 희석제에 10 μg/mL로 희석하였고; 클론 3712-IgG1v를 분석 희석제에 10 μg/mL 및 1 μg/mL로 희석하고; 음성 대조군인 아바스틴을 분석 희석제에 10 μg/mL로 희석하였다. 이들 샘플을 플레이트에 50 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 1:100,000 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG-H+L 또는 1:50,000 희석된 염소 항-마우스 IgG(H+L) 2차 항체, HRP를 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 4회 세척하였다. TMB 기질 용액을 100 μL/웰로 첨가하였다. 15분 동안 색이 발색되도록 한 다음 100 μL/웰의 2 N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종료시켰다. Tecan F200 Pro 판독기로 450 nm 및 620 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그래프패드 7.0, "[작용제] 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"를 사용하여 결합 데이터를 도표화하고 결합 EC₅₀ 값을 계산하였다. 대표적인 데이터를 도 4a 및 도 4b에 도시하였다. 결합 EC50 값의 요약을 표 6에 제시하였다. 이들 분석을 위한 대조군 항체로서 아바스틴을 사용하였다. 이들 연구의 결과는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD137에 대한 클론 3712-IgG1v의 평균 결합 EC₅₀ 값이 각각 0.37 nM(즉, 52.9 ng/mL) 및 0.33 nM(즉, 47.4 ng/mL)임을 보여준다. 클론 3712-IgG1v는 마우스 또는 랫트 CD137 단백질에 대한 결합 친화성을 나타내지 않았다.

또한, 클론 3712-IgG1v 결합을 측정하기 위해 ELISA 분석을 사용하여 PD-1, LAG-3, VISTA, B7-H3, B7-H4, GITR, CD40, TIGIT, PD-L1, CD20, CD47, CD19, CD27 및 LTβR을 포함한 다른 인간 단백질을 시험하였다. 결합 친화성이 관찰되지 않았다. 이 연구는 인간 및 시노 CD137 수용체에 대한 클론 3712의 특이적 결합을 입증하였다.

CD137 결합 FACS

인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD137을 과발현하는 CHO 세포 및 CHO 모체 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 빙냉 분석 완충제에 2*10^6/mL로 재현탁시키고 96-웰 V-바닥 플레이트로 100 μL/웰로 옮겼다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 분석 완충제에 300 μg/mL로 희석한 다음 분석 완충제에서의 3배 연속 희석을 수행하여 300000, 100000, 33333.3, 11111.1, 3703.7, 1234.6, 411.5, 137.2, 45.7, 15.2, 5.08, 1.69, 0.56, 0.19 및 0.063 ng/mL인 3x 최종 농도의 농도를 갖는 15개의 포인트를 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고 암실에서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG - Fc(PE)를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 100 μL/웰로 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고 2% PFA를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 그런 다음, 세포를 유세포 분석기에 즉시 적용하였다.

클론 3712-IgG1v가 마우스 CD137 수용체 및 다른 인간 세포 표적, 예를 들어 인간 LAG-3, VISTA, B7-H3, B7-H4, GITR, CD40, TIGIT, PD-L1, CD20, CD47, CD19, CD27, LTBR, BTLA, CD160 및 CD200R1에 결합하는지 여부를 측정하기 위해, 이들 표적을 과발현하는 CHO 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 빙냉 분석 완충제에 2*10^6/mL로 재현탁시키고 96-웰 V-바닥 플레이트로 100 μL/웰로 옮겼다. 표적 특이적 항체를 30 μg/mL 또는 6 μg/mL로 분석 완충제에 희석하고, 클론 3712-IgG1v를 분석 완충제에 30 μg/mL 또는 3 μg/mL로 희석하고, 아바스틴을 분석 완충제에 30 μg/mL로 희석하였다. 희석된 표적 특이적 항체, 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고, 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG - Fc(PE) 또는 PE 염소 항-마우스 IgG 항체를 함유하는 100 μL의 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고, 2% PFA를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 재현탁시키고, 유세포 분석기에서 즉시 분석하였다.

평균 형광 강도(MFI: mean fluorescence intensity)는 FCM 실험에서 전체 세포 집단으로부터 계산되었다. 그래프패드 7.0, "[작용제] 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"를 사용하여 용량 반응에서의 결합 MFI를 도표화하고 FCM 결합 EC₅₀ 값을 계산하였다. FCM에 의해, 클론 3712-IgG1v는 CHO 상에서 과발현되는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD137 둘 모두에 대한 강력한 결합을 나타냈다. 모체 CHO 세포와의 결합은 관찰되지 않았다. CD137 결합의 특이성을 입증하기 위한 대조군으로서 참조 항체 아바스틴을 사용하였다. 대표적인 데이터를 도 5a 내지 도 5c에 표시하였고 결과를 표 7에 요약하였다.

CD137에 대한 클론 3712-IgG1v의 특이성을 입증하기 위해, LAG-3, VISTA, B7-H3, B7-H4, GITR, CD40, TIGIT, PD-L1, CD20, CD47, CD19, CD27, LTBR, BTLA, CD160, CD200R1 및 PD-1과 같은 다른 인간 수용체 단백질을 과발현하는 CHO 세포를 FCM에 의해 시험하였다. 결합 신호가 클론 3712에 대해 관찰되지 않았으며, 이는 상기에 기술된 단백질 ELISA 실험에서 입증된 특이성과 일치한다. ELISA 데이터로부터 예측되는 바와 같이 클론 3712-IgG1v는 쥐 세포 CD137에 결합하지 않았다.

활성화된 CD8+ T 세포 상의 내인성 CD137에 대한 결합

클론 3712-IgG1v가 내인성 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD137에 결합할 수 있음을 확인하기 위해, 고정된 항-CD3 항체에 의해 활성화된 PBMC에 대해 결합을 조사하였다. 인간 PBMC의 활성화된 T 세포를 얻기 위해, 24-웰 플레이트를 2 μg/mL의 Fcγ 단편 특이적 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG를 함유하는 300 μL DPBS로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 DPBS로 3회 세척하였다. 항체 OKT3를 플레이트에 1 μg/mL, 100 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 인간 PBMC의 갓 해동된 바이알을 25 mL의 사전 가온된 배양 배지(10% FBS를 함유하는 RPMI1640)를 함유하는 50 mL 튜브로 옮기고 250 g에서 10분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛을 2 mL 완전 배양 배지(50 uM 2-Me를 함유하는 배양 배지)에 재현탁시키고, 세포 밀도를 완전 배양 배지에서 3.3*10^6 세포/mL로 조정한 다음, 900 μL/웰의 세포 현탁액을 플레이트로 옮겼다. 배양물을 5% CO₂와 함께 37℃에서 약 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 수확하고 DPBS로 1회 세척하였다. 세포 펠렛을 저온 분석 완충제에 재현탁시키고 세포 밀도를 2*10^6 세포/mL로 조정하였다. 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 v-바닥 플레이트로 옮겼다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 분석 완충제에 300 μg/mL로 희석한 후, 분석 완충제에서의 10배 연속 희석을 수행하여 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3, 0.3 및 0.03 ng/mL인 3x 최종 농도의 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고 FITC 항-인간 CD3 항체, PE 항-인간 CD8a 항체 및 APC 항-인간 IgG Fc 항체를 함유하는 50 μL 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 30분 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고 7-AAD를 함유하는 100 μL 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 4℃에서 5분 동안 암실에서 배양한 후, 세포를 유세포 분석기에서 즉시 분석하였다.

시노몰구스 원숭이의 PBMC의 활성화된 T 세포를 얻기 위해, 24-웰 플레이트를 2 μg/mL의 Fcγ 단편 특이적 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG를 함유하는 300 μL DPBS로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 DPBS로 3회 세척하였다. 시노몰구스 원숭이 CD3에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 항-CD3 항체인 Ly305를 3 μg/mL, 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 시노몰구스 원숭이 PBMC의 갓 해동된 바이알을 15 mL의 사전 가온된 배양 배지(10% FBS를 함유하는 RPMI1640)를 함유하는 50 mL 튜브로 옮기고 250 g에서 10분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛을 2 mL 배양 배지에 재현탁시키고 완전 배양 배지에서 3.3*10^6 세포/mL의 세포 밀도로 조정하고 900 μL/웰의 세포 현탁액을 플레이트로 옮겼다. 배양물을 5% CO₂와 함께 37℃에서 약 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 수확하고 DPBS로 1회 세척하였다. 세포 펠렛을 저온 분석 완충제에 재현탁시키고 세포 밀도를 2*10^6 세포/mL로 조정하였다. 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 v-바닥 플레이트로 옮겼다. 클론 3712-IgG1v-비오틴 또는 아바스틴-비오틴 항체를 분석 완충제에 300 μg/mL로 희석한 후, 분석 완충제에서의 10배 연속 희석을 수행하여 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3, 0.3 및 0.03 ng/mL인 3x 최종 농도의 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v-비오틴 또는 아바스틴-비오틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 60분 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고, FITC 항-인간 CD8 항체(클론: SK1) 및 APC 스트렙타비딘을 함유하는 50 μL 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 60분 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고, 7-AAD를 함유하는 100 μL 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 암실에서 배양한 다음, 유세포 분석기에서 즉시 분석하였다.

도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 클론 3712-IgG1v는 활성화된 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD8+ T 세포에 대한 용량 의존적 결합을 나타냈다. 클론 3712-IgG1v는 유사한 EC₅₀ 값(37 내지 50 ng/mL 또는 약 0.3 nM)으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 세포 CD137 수용체에 결합한다는 것이 밝혀졌다. 클론 3712-IgG1v는 또한 용량 의존적 방식으로 인간 또는 시노몰구스 원숭이의 활성화된 CD8+ T 세포 상의 내인성 CD137에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 클론 3712는 본원에 기술된 ELISA 연구로부터 예측되는 바와 같이 FCM에 의한 CD137에 대한 높은 특이성을 나타낸다.

Fc 수용체 및 보체 C1q 결합

FcγRI 결합 분석

CHO-K1-huFcγRI 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 빙냉 분석 완충제에 2*10^6/mL로 재현탁시키고, 100 μL/웰로 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮겼다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 분석 완충제에 30 μg/mL로 희석한 다음, 분석 완충제에서의 2배 연속 희석을 수행하여 30000, 15000, 7500, 3750, 1875, 937.5, 468.8, 234.4, 117.2, 58.6, 29.3, 14.6, 7.32, 3.66 및 1.83 ng/mL인 3x 최종 농도의 농도를 갖는 15개의 포인트를 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고 암실에서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고 염소 F(ab')₂항-인간 IgG-Fc(PE) 2차 항체를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 100 μL/웰로 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고 2% PFA를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 세포에 즉시 유세포 분석을 적용하였다.

CHO-K1-huFcγRI 세포는 IgG1에 대해 높은 친화성을 갖는 인간 FcγRI를 높은 수준으로 발현하며(문헌[Ravetch and Bolland 2001, Roopenian and Akilesh 2007]), 클론 3712-IgG1v에 대한 FcγRI 결합 분석에 사용되었다. 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.1563, 0.078, 0.039, 0.0195, 0.0098, 0.0049, 0.0024, 0.0012 및 0.0006 μg/mL(최고 10 μg/mL부터, 2배 연속 희석, 15개의 희석 포인트)을 포함한 복수의 농도의 항체를 통해 결합을 검사하였다. PE 접합된 다중클론 항-인간 Fc F(ab')₂ 단편을 사용하여 유세포 분석에 의해 결합을 검출하였다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다. 도 7a는 FcγRI에 대한 결합을 나타내지 않는 클론 3712-IgG1v의 대표적인 데이터를 보여주는 반면, 참조 인간 IgG1 항체인 아바스틴은 32.2 ng/mL(약 0.2 nM)의 EC₅₀ 값으로 높은 결합 친화성을 나타냈다.

FcγRIIA 결합 분석

CHO-K1-huFcγRIIA-Arg131 및 CHO-K1-huFcγRIIA-His131를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 빙냉 분석 완충제에 2*10^6/mL로 재현탁시키고, 100 μL/웰로 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮겼다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 분석 완충제에 300 μg/mL로 희석한 다음 분석 완충제에서의 2배 연속 희석을 수행하여 300000, 150000, 75000, 37500, 18750, 9375, 4688, 2344, 1172, 586, 293, 146, 73.2, 36.6 및 18.3 ng/mL인 3x 최종 농도의 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고 암실에서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG - Fc(PE) 2차 항체를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 100 μL/웰로 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고 2% PFA를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 세포에 즉시 유세포 분석을 적용하였다.

CHO-K1-huFcγRIIA-Arg131 및 CHO-K1-huFcγRIIA-His131 세포는 IgG1에 대한 결합 친화성이 낮은 활성화 FcγRIIA 수용체를 발현한다. 둘 모두에 대해 FcγRIIA 결합 분석을 조사하였다. 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78, 0.39, 0.195, 0.098, 0.049, 0.024, 0.012 및 0.006 μg/mL(최고 100 μg/mL부터, 2배 연속 희석, 15개의 희석 포인트)을 포함한 다양한 농도에서 결합을 검사하였다. PE-접합된 다중클론 항-인간 Fc F(ab')₂ 단편을 사용하여 유세포 분석에 의해 결합을 다시 검출하였다. 적어도 3개의 독립적인 실험을 수행하였다. 도 7b 및 도 7c는 3712-IgG1v의 대표적인 데이터를 나타내며, 이는 huFcγRIIA-Arg131에 약한 결합을 나타내고 huFcγRIIA-His131에는 결합하지 않았다. 참조 대조군인 아바스틴은 정상 인간 IgG1에 대해 예측되는 바와 같이, 두 분석 모두에서 중간 정도의 결합을 나타냈다.

FcγRIIB 결합 분석

CHO-K1-huFcγRIIB-Ile232 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 빙냉 분석 완충제에 2*10^6/mL로 재현탁시키고, 100 μL/웰로 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮겼다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 분석 완충제에 300 μg/mL로 희석한 다음, 분석 완충제에서의 2배 연속 희석을 사용하여 300000, 150000, 75000, 37500, 18750, 9375, 4688, 2344, 1172, 586, 293, 146, 73.2, 36.6 및 18.3 ng/mL인 3x 최종 농도의 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고 암실에서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG-Fc(PE) 2차 항체를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 100 μL/웰로 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고 2% PFA를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 세포에 즉시 유세포 분석을 적용하였다.

높은 수준의 FcγRIIB를 발현하는 세포를 포함하는 형질감염된 CHO 세포주인 CHO-K1-huFcγRIIB-Ile-232를 FcγRIIB 결합 분석에 사용하였다. 시험 농도는 하기를 포함하였다: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78, 0.39, 0.195, 0.098, 0.049, 0.024, 0.012 및 0.006 μg/mL(최고 100 μg/mL부터, 2배 연속 희석, 15개의 희석 포인트). 시험 항체에 의한 결합은 다중클론 항-인간 Fc F(ab')₂ 단편에 의해 검출되었다. 적어도 3개의 독립적인 실험을 수행하였으며 대표적인 데이터를 도 7d에 도시하였다. 클론 3712-IgG1v 및 아바스틴은 인간 FcγRIIB에 대해 중간 정도의 결합 친화성을 나타낸 반면, 클론 3712-IgG1v는, 아바스틴과 대조적으로, 높은 농도(50 및 100 μg/mL)에서 포화를 나타내지 않았다.

FcγRIIIA 결합 분석

CHO-K1-huFcγRIIIA-Phe158 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 빙냉 분석 완충제에 2*10^6/mL로 재현탁시키고 100 μL/웰로 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮겼다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 분석 완충제에 300 μg/mL로 희석한 다음, 분석 완충제에서의 2배 연속 희석을 수행하여 300000, 150000, 75000, 37500, 18750, 9375, 4688, 2344, 1172, 586, 293, 146, 73.2, 36.6 및 18.3 ng/mL인 3x 최종 농도의 최종 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고 암실에서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 3회 세척하고 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG - Fc(PE) 2차 항체를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 100 μL/웰로 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 4℃에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 세포를 1000 g에서 3분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하고 2% PFA를 함유하는 빙냉 분석 완충제에 재현탁시켰다. 세포에 즉시 유세포 분석을 적용하였다.

CHO-K1-huFcγRIIIA-Phe158 세포는 IgG1에 대해 상대적으로 높은 친화성을 갖는 인간 FcγRIIIA를 높은 수준으로 발현한다. 따라서, 상기 세포를 FcγRIIIA 결합 분석에 사용하였다. 하기의 복수의 농도의 항체를 통해 결합을 검사하였다: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78, 0.39, 0.195, 0.098, 0.049, 0.024, 0.012 및 0.006 μg/mL(최고 100 μg/mL부터, 2배 연속 희석, 15개의 희석 포인트). PE-접합된 다중클론 항-인간 Fc F(ab')2 단편을 사용하여 유세포 분석에 의해 결합을 검출하였다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였다. 도 7e는 클론 3712-IgG1v가 FcγRIIIA에 대한 검출 가능한 결합을 갖지 않는 반면, 참조 인간 IgG1 항체인 아바스틴은 예측되는 중간 정도의 결합을 나타냈음을 입증하는 대표적인 데이터를 보여준다.

FcRn 결합 분석

클론 3712-IgG1v 및 대조군 IgG1 단일클론 항체(아바스틴)를 DPBS에 1 μg/mL로 희석하고 ELISA 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 9018, 높은 결합)에 100 μL/웰로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 경사분리하고 1회 세척하고; 분석 희석제를 200 μL/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST(pH 6.0)로 1회 세척하였다. 인간 FcRn 단백질을 분석 희석제(pH 6.0)에 10 μg/mL로 희석한 후, 분석 희석제(pH 6.0)에서의 2배 연속 희석을 수행하여 10000, 5000, 2500, 1250, 625, 312.5 및 156.25 ng/mL의 최종 농도들을 제조하였다. 희석된 FcRn 단백질을 분석 플레이트에 50 μL/웰로 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST(pH 6.0)로 3회 세척하였다. 1:20,000 희석된(pH 6.0) HRP-접합된 마우스 항-His 태그 항체를 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST(pH 6.0)로 4회 세척하였다. TMB 기질 용액을 100 μL/웰로 첨가하였다. 12분 동안 발색시킨 다음 100 μL/웰의 2 N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종료시켰다. Tecan F200 Pro 판독기로 450 nm 및 620 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

클론 3712-IgG1v 및 인간 IgG1 아바스틴에 대한 FcRn의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 클론 3712-IgG1v 및 아바스틴을 플라스틱 ELISA 플레이트에 별도로 코팅한 후, 10000, 5000, 2500, 1250, 625, 312.5, 및 156.3 ng/mL(2배 연속 희석, 7개의 희석 포인트)의 농도의 His 태그를 갖는 인간 FcRn 단백질과 함께 배양하였다. 코팅된 항체에 결합된 FcRn은 항-His 태그-HRP 항체에 의해 검출되었다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였으며 대표적인 데이터를 도 8a에 도시하였다. 클론 3712-IgG1v는, 참조 항체 아바스틴의 신호 강도와 비교하여 약한 신호 강도를 가졌지만, FcRn에 대한 예측된 결합을 나타냈다. 3712와 인간 FcRn의 Biacore 결합 또한 수행하였고, 그 결과는 인간 IgG1 및 IgG4와 유사한 동역학을 갖는 양성 결합을 확인하였다.

C1q ELISA

클론 3712 및 대조군 IgG1 단일클론 항체(아바스틴)를 DPBS에 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 및 0.125 μg/mL로 희석하고 ELISA 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 9018, 높은 결합)에 100 μL/웰로 4℃에서 밤새 이중으로 코팅하였다. 플레이트를 경사분리하고 1회 세척하고; 분석 희석제를 200 μL/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. 인간 C1q 단백질을 분석 희석제에 2 μg/mL로 희석하였다. 희석된 C1q 단백질을 분석 플레이트에 50 μL/웰로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 1:800 희석된 HRP-접합된 양 항-인간 C1q 항체를 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 4회 세척하였다. TMB 기질 용액을 100 μL/웰로 첨가하였다. 7분 동안 발색시키고, 100 μL/웰의 2 N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종료시켰다. Tecan F200 Pro 판독기로 450 nm 및 620 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

고전적 경로를 통한 세포의 보체 활성화 및 용해는 IgG 분자의 Fc 부분에 대한 C1q의 결합을 통해 개시된다. 클론 3712-IgG1v 및 인간 IgG1 아바스틴에 대한 C1q의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 클론 3712-IgG1v 및 아바스틴을 플라스틱 ELISA 플레이트에 복수의 농도, 즉, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 및 8 μg/mL로 별도로 코팅한 후, 2 μg/mL의 농도의 His 태그를 갖는 재조합 인간 C1q와 함께 배양하였다. 항체에 결합된 C1q는 항-인간 C1q-HRP 항체에 의해 검출되었다. 3개의 독립적인 실험을 수행하였으며 대표적인 데이터를 도 8b에 도시하였다. 클론 3712-IgG1v는 참조 항체 아바스틴과 비교하여 C1q에 대한 감소된 결합을 나타냈다.

클론 3712-IgG1v는, C1q 및 활성화 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시켜 Fc 효과기 활성을 최소화하도록 조작된 Fc 영역 내의 점 돌연변이를 갖는 인간화 재조합 IgG1/κ이다. 조작된 Fc는 FcRγIIB 및 FcRn에 대한 결합을 유지하도록 설계되었다. 여기에 기술된 실험은, 클론 3712는 인간 FcγRI, FcγRIIA-Arg131, FcγRIIA-His131, FcγRIIIa 및 보체 C1q에 대한 결합이 없거나 최소의 결합을 나타낸 반면, 참조 인간 IgG1 항체 아바스틴은 문헌으로부터 예측된 결합 프로파일을 나타냈음을 입증하였다. 클론 3712는 인간 FcγRIIB 및 FcRn에 대한 결합을 나타냈다. 상기 결과는 클론 3712-IgG1v의 조작된 Fc의 예측된 프로파일, 즉, 인간 FcγRIIB 및 FcRn에 대한 결합은 유지하지만 다른 Fc 수용체 및 C1q에 대한 결합은 손실되는 것과 일치한다.

리포터 분석에서의 CD137 신호전달의 활성화

CHO-K1 또는 CHO-K1-huFcγRIIB-Ile232 세포를 250 g에서 5분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 1% FBS를 함유하는 사전 가온된 F12K 배지에 2.5*10^6 세포/mL로 재현탁시키고, 100 μL/웰로 96-웰 세포 배양 플레이트로 옮겼다. 한편, 1% FBS를 함유하는 100 μL/웰의 F12K 배지를 제3 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. DPBS를 세포 배양 플레이트의 가장자리에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 배양하였다. 다음날, GS-H2-huCD137 세포를 250 g에서 5분 동안 원심분리한 후 수확하였다. GS-H2-huCD137 세포를 1% FBS를 포함하는 사전 가온된 MEM 배지에 6*10^4 세포/mL로 재현탁시키고, 50 μL/웰의 세포 현탁액을 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 1% FBS를 함유하는 MEM 배지에 25 μg/mL로 희석한 다음, 분석 완충제에서의 4배 연속 희석을 수행하여 25000, 6250, 1562.5, 390.625, 97.65625, 24.414, 6.104, 1.526, 0.381, 0.095, 및 0.024 ng/mL의 최종 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고 약 18시간 동안 5% CO₂에서 37℃에서 배양하였다. 배양 후, Cisbio의 인간 IL-8 분석 키트를 사용하여 세포 배양 상청액에 IL-8 검출을 수행하였다.

클론 3712-IgG1v는 가교 조건 하에서 용량 의존적 작용제 활성을 나타냈다. CD137 리포터 세포가 CHO-K1-huFcγRIIB 세포와 공동배양되었을 때, 클론 3712는 CD137 활성화를 유도하여, 리포터 세포로부터의 IL8 분비를 유도하였다. 클론 3712-IgG1v는 가교 없이 CD137을 활성화시키지 않았다(대조군 CHO 세포와 공동배양하거나 또는 공동배양하지 않음). CD137 활성화의 특이성을 입증하기 위한 대조군으로서 아바스틴을 사용하였다. CD137 리포터 세포의 활성화를 평가하기 위해 배양 상청액의 IL-8 농도를 정량화 및 사용하였다. 대표적인 데이터를 도 9에 도시하였다. 적어도 3개의 독립적인 실험을 수행했으며 결과는 유사하였다. 클론 3712-IgG1v의 CD137 리포터 용량 반응 곡선으로부터 계산된 평균 EC₅₀ 값은 44.4 ng/mL(약 0.31 nM; n=6)이었다.

인간 CD8+ T 세포 공동자극 분석

CHO-K1 또는 CHO-K1-huFcγRIIB-Ile232 세포를 250 g에서 5분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 세포를 10% FBS를 함유하는 사전 가온된 F12K 배지에 2.5*10^6 세포/mL로 재현탁시키고, 100 μL/웰로 96-웰 세포 배양 플레이트로 옮겼다. 한편, 10% FBS를 함유하는 100 μL/웰의 F12K 배지를 제3 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. DPBS를 세포 배양 플레이트의 가장자리에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 배양하였다. 다음날, 인간 CD8+ T 세포의 갓 해동된 바이알을 25 mL의 사전 가온된 배양 배지(10% FBS를 함유하는 RPMI1640)를 함유하는 50 mL 튜브로 옮기고, 250 g에서 10분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛을 2 mL 배양 배지에 0.5-1*10^6 세포/mL로 재현탁시키고, 50 μL/웰의 세포 현탁액을 플레이트에 첨가하였다. 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴 항체를 10% FBS 및 0.4 μg/mL OKT3를 함유하는 RPMI 배지에 100 μg/mL로 희석한 다음, 분석 완충제에서의 4배 연속 희석액을 제조하여, 100000, 25000, 6250, 1562.5, 390.6, 97.7, 24.4, 6.1, 1.53 및 0.38 ng/mL인 4x 최종 농도의 최종 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712-IgG1v 또는 아바스틴을 50 μL/웰로 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고 약 72시간 동안 5% CO₂에서 37℃에서 배양하였다. 배양 후, Cisbio의 인간 IFN-γ 분석 키트를 사용하여 세포 배양 상청액에 대해 IFN-γ 검출을 수행하였다.

CHO-K1-huFcγRIIB 세포와 공동배양되었을 때, 클론 3712-IgG1v는 인간 CD8+ T 세포를 활성화시키는 용량 의존적 작용제 활성을 나타냈다. 인간 CD8+ T 세포가 CHO-K1 세포 또는 배지와 공동배양되었을 때, 클론 3712에 대해 활성이 관찰되지 않았다. CD137 활성화의 특이성을 입증하기 위한 대조군으로서 아바스틴을 사용하였다. 적어도 3개의 독립적인 실험의 대표적인 데이터를 도 10에 도시하였다. 6명의 공여자로부터의 CD8+ T 세포를 시험했으며 결과는 유사하였다. 클론 3712의 CD8+ T 세포 공동자극 분석 용량 반응 곡선으로부터 계산된 평균 EC₅₀ 값은 30.6 ng/mL(약 0.21 nM; n=12)였다.

실시예 4: 인간화 항체의 약동학 연구

C57BL/6 마우스(6주령 내지 7주령, 19 내지 20 g, 수컷, SLAC Laboratory Animal Co. LTD로부터 구입함)를 연구에 사용하였다. 항체를 PBS에서 제형화하고 4 마리의 마우스의 군에서 꼬리 정맥 주사를 통해 3 mg/kg으로 투여하였다. 전체 연구 기간 동안 비정상적인 임상 증상은 관찰되지 않았다.

혈액 샘플링은 일련의 출혈에 의해, 투여 전, 1h, 2h, 4h, 8h, 1d, 2d, 3d, 5d, 8d, 11d, 15d 및 21d에 수행되었다. 시점당 10 μL의 혈액을 40 uL의 PBS-BSA 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 샘플을 잘 혼합하고 4℃에서 2000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액은 수집 직후 드라이아이스에 놓고 분석할 때까지 약 -70℃에서 보관하였다. 혈액 항체 농도는 ELISA에 의해 측정하였다. 도 11은 3 mg/kg의 단일 정맥내 주사 후 클론 3712-IgG1v의 혈액 항체 농도를 나타낸다. 결과 및 약동학 매개 변수를 하기 표 8에 요약하였다.

실시예 5: 인간화 항체의 생체내 효능 평가

물질 및 방법

마우스

인간 CD137 녹-인(knock-in) 마우스(C57BL/6, B-h4-1BB) 및 CD137/PD-1 이중 녹-인 마우스(C57BL/6, B-hPD-1/h4-1BB)를 Biocytogen, Inc(중국 베이징 소재)로부터 구입하였다. C57BL/6J 마우스를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(중국 베이징 소재)로부터 구입하였다. 모든 마우스는 특정 병원균이 없는 조건에서 유지되었다. 동물 관리 및 사용은 기관 및 NIH 프로토콜 및 지침에 따라 수행되었으며, 모든 연구는 관련 기관의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.

세포주

쥐 결장암 MC38 세포를 ShunRan Biotech(중국 상하이 소재)로부터 구입하였고, 5% CO₂에서 배양하고, 10% 열-비활성화된 소 태아 혈청이 보충된 DMEM에서 시험관내에서 유지하였다. B16-OVA를 5% CO₂에서 배양하고, 10% 열- 비활성화된 소 태아 혈청(Gibco), 2 mmol/L L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 시험관내에서 유지하였다.

효능 연구

쥐 결장암 MC38 세포(0.1 mL PBS 중의 0.5x10^6 세포)를 동형접합 B-h4-1BB 마우스 내로 피하 이식하였다. 종양 크기가 약 150±50 mm³일 때 마우스를 대조군 및 치료군(n=5 내지 6)으로 나누었다. 복강내 주사에 의해 치료를 투여하였다. 종양 크기는 캘리버로 주 2회 측정되었고 0.5×길이×너비²의 공식을 사용하여 종양 부피로서 계산되었다. 종양 크기의 평균±SEM을 도 12a 및 도 12b에 도시하였다.

종양 성장 억제(TGI: tumor growth inhibition)는 하기 공식에 의해 투여 기간 동안 측정되었으며: TGI = (Ct - Tt) / (Ct - C0) X 100, 상기 식에서 Ct = 시간 t에서 대조군의 평균 종양 부피이고, Tt = 시간 t에서의 치료군의 평균 종양 부피이고, C0 = 시간 0에서의 대조군의 평균 종양 부피이고, 이는 모든 무작위 그룹에 대해 동일한다.

동계 마우스 종양 모델에서의 항-CD137 항체의 항종양 효능은 잘 문서화되어 있다(문헌[Melero et al. 1997, Murillo et al. 2008]). 클론 3712는 쥐 CD137과 교차 반응하지 않으므로 쥐 서열을 대체하기 위해 인간 CD137 세포외 도메인이 녹-인된 마우스를 사용하여 클론 3712의 항종양 활성을 조사하였다.

투여 요법

제1 연구는 도 12a 및 12b에 나타난 바와 같이, 쥐 MC38 동계 종양 모델에서의 클론 3712-IgG1v의 투여 요법을 비교하였다. 3 mg/kg으로 1회만, 또는 주 2회 일정으로 복수의 용량으로, 복강내 투여되었을 때, 클론 3712는 확립된 종양에 대해 유사한 항종양 효과를 나타냈으며, 단일 용량 및 다중 용량 그룹 각각에 대해, 투여 후 21일째 실험 종료 시의 종양 성장 억제는 100% 및 103%였다(표 9). Excel에서 T-검정의 P 값을 수행하여 치료군과 비히클 대조군을 비교하였다.

개별 마우스 데이터를 도 12b에 도시하였다. 3 mg/kg의 클론 3712-IgG1v의 단일 주사는 이미 확립된 MC38 암종의 성장을 3주 동안 제어할 수 있었으며, 이는 전임상 종양 모델에서의 클론 3712-IgG1v의 강력한 항종양 활성을 입증한다.

우렐루맙 및 우토밀루맙 유사체에 대비한 클론 3712의 효능

다음 실험은 공개된 서열에 따라 사내에서 제조된 클론 3712-IgG1v 및 참조 항체 우렐루맙 및 우토밀루맙 유사체의 효능을 비교하였다. 7일째에 10 mg/kg으로 1회 투여되었을 때, 클론 3712 및 우렐루맙은 유사한 종양 성장 억제를 나타낸 반면, 우토밀루맙은 클론 3712와 비교하여 열등하였다(도 13a). 하기 표 6에 나타난 바와 같이, 10 mg/kg으로 투여된 우토밀루맙 유사체, 우렐루맙 유사체 및 클론 3712는 실험 종료 시(단일 용량의 주사 후 21일째)에 각각 61%, 80% 및 91%의 종양 성장 억제를 유발하였다.

클론 3712-IgG1v의 용량 적정 또한 연구에서 수행되었다. 도 13b에 나타난 바와 같이, 3, 5 및 10 mg/kg에서는 클론 3712-IgG1v를 1회만 투여하면 종양 성장의 유사한 억제를 나타내었지만, 1 mg/kg 용량은, TGI가 모든 시점에서 50% 미만이었기 때문에, 불충분하였다. TGI의 상세한 종양 부피 및 분석 데이터를 표 10에 제시하였다. Excel에서 T-검정의 P 값을 수행하여 치료군과 비히클 대조군을 비교하였다.

클론 3712와 항-PD-1 항체의 조합의 항종양 효과

CD137 작용제 항체와 PD-1 차단 항체 사이의 가능한 상승적 항종양 활성이 보고된 바 있다(문헌[Tolcher et al. 2017, Azpilikueta et al. 2016]). B16 흑색종 동계 종양 모델을 사용하여 클론 3712-IgG1v 및 항-PD-1 조합을 시험하였다. 7주령 내지 8주령의 WT B6 마우스에 950 rad의 단일 선량을 치사 조사하였다. 다음날, 조사된 마우스에 2 내지 3x10⁶개의 hPD-1/4-1BB 마우스 공여자 골수 세포를 입양 이식하였다. 종양 효능 실험이 시작되기 전에 재구성 후 4주 동안 음용수에 희석된 설파메톡사졸 및 트리메토프림(박트림(Bactrim)) 항생제를 마우스에 투여하였다. 약 1x10^6개의 B16-OVA 세포를 골수 키메라 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 부피는 3개의 직교 축(a, b 및 c)을 따라 측정되었고 종양 부피 = abc/2로서 계산되었다. 종양이 확립된 후(약 9일 내지 12일, 약 100 mm³), 14일, 21일 및 28일째에 100 μg(약 5 mg/kg)의 항-PD-1 항체로 치료하거나, 또는 14일째에 복강내 주사에 의해 투여된 100 μg(약 5 mg)의 항-4-1BB 항체, 또는 표시된 조합 치료로 마우스를 치료하였다. 종양 성장은 주 2회 측정되었다. 상대적 종양 크기는 14일째에 종양 크기를 초기 종양 크기로 나눔으로써 계산되었다. 도 14에 나타난 바와 같이, 클론 3712-IgG1v 및 항-PD-1의 조합은 단일 제제 치료군 중 어느 하나와 비교하여 종양 성장의 더 유의한 억제를 유발하였다. 단일 제제 항-PD-1, 클론 3712-IgG1v 및 조합 그룹에 대한 연구 종료의 52일째의 TGI 수치는 각각 42%, 66% 및 91%였다.

실시예 6: CD137 항체의 에피토프 매핑

CD137 수용체 단백질의 세포외 부분은 4개의 도메인으로 구성된다. CD137 수용체 인간/마우스 키메라의 유전자는 표준 실험실 기술을 사용하여 합성하였다. 상기 상이한 키메라들은 인간 CD137 수용체의 도메인 또는 모듈을 상응하는 마우스 CD137 수용체와 교환함으로써 설계되었다. 키메라는 인간 및 마우스 서열의 평가 및 인간 CD137 수용체의 3D 조사를 기반으로 설계되었다. 합성된 유전자에는 프로젝트 고유 ID 번호가 할당되었다(표 11 참조).

클론 3712-IgG1v와 키메라 CD137 수용체 단백질의 결합을 표준 ELISA 형식으로 분석하였다. 도 16a 및 도 16b에 표시된 데이터의 경우, 클론 3712-IgG1v를 DPBS에 1 μg/mL로 희석한 다음, ELISA 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 9018, 높은 결합)에 웰당 50 μL(0.05 μg)의 부피로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 경사분리하고 1회 세척하고; 분석 희석제를 200 μL/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. CD137 수용체 인간/마우스 키메라를 분석 희석제에 100 또는 10 μg/mL로 희석한 다음, 분석 희석제에서 11개의 포인트에 대해 4배 연속 희석을 수행하여 100000, 25000, 6250, 1562.5, 390.63, 97.66, 24.41, 6.10, 1.53, 0.38 및 0.095 ng/mL 또는 10000, 2500, 625, 156.25, 39.06, 9.77, 2.44, 0.61, 0.15, 0.038 및 0.0095 ng/mL의 최종 농도들을 제조하였다. 희석된 CD137 수용체를 분석 플레이트에 50 μL/웰로 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 1:100,000 20 희석된 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG-H+L를 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 4회 세척하였다. TMB 기질 용액을 100 μL/웰로 첨가하였다. 15분 동안 색이 발색되도록 하고 100 μL/웰의 2 N H2SO4로 중지시켰다. Tecan F200 Pro 판독기로 450 nm 및 620 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

도 16c 및 도 16d에 표시된 데이터의 경우, CD137 수용체 단백질 샘플을 DPBS에 5 μg/mL로 희석한 다음 ELISA 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 9018, 높은 결합)에 웰당 50 μL(0.25 μg)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 경사분리하고 1회 세척하고; 분석 희석제를 200 μL/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. 클론 3712를 분석 희석제에 100 또는 10 μg/mL로 희석한 다음, 분석 희석제에 11개의 포인트에 대해 4배 연속 희석하여 100000, 25000, 6250, 1562.5, 390.63, 97.66, 24.41, 6.10, 1.53, 0.38 및 0.095 ng/mL 또는 10000, 2500, 625, 156.25, 39.06, 9.77, 2.44, 0.61, 0.15, 0.038 및 0.0095 ng/mL의 최종 농도들을 제조하였다. 희석된 클론 3712를 분석 플레이트에 50 μL/웰로 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 1:100,000 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG-H+L 또는 1:50,000 희석된 염소 항-마우스 IgG(H+L) 2차 항체, HRP, 10을 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 4회 세척하였다. TMB 기질 용액을 100 μL/웰로 첨가하였다. 15분 동안 색이 발색되도록 한 다음 100 μL/웰의 2 N H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시켰다. Tecan F200 Pro 판독기로 450 nm 및 620 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

시험된 인간 CD137 항체 중 어느 것도 쥐 CD137에 결합하지 않았다. 따라서, 특정 항체가 특정 키메라에 결합하지 않는 경우, 이는 상기 항체가 해당 키메라에서 쥐 도메인으로 대체된 도메인 중 하나에 특이적임을 나타낸다.

클론 3712에 대한 결합 패턴은, 각각 CRD3 내지 4 및 CRD1 내지 2에 결합하는 우토밀루맙 및 우렐루맙(문헌[Chin et al., 2018; Li et al., 2018])과 달리, 결합에 중요한 아미노산 잔기가 도메인 2 및 3(CRD2 내지 3)에 위치할 가능성이 높음을 보여준다.

실시예 7: 추가적인 항-CD137 인간화 항체의 평가

(i) 결합 친화성

CD137 항원 결합의 KD 측정은 상기 실시예 2에 기술된 프로토콜에 따라 수행하였다. 결합 동역학을 추정하기 위해 Octet Red 96 상에서의 항원 결합 분석에서 키메라 및 인간화 항체를 시험하였다. 항-인간 Fc(AHC: anti-human Fc) 바이오센서에 항체를 로딩하였다. 분석 완충제(0.1% BSA, 0.02% 트윈-20을 갖는 PBS(pH 7.2)) 중의 CD137 단백질(300 nM, 1:3 아래로, 7 포인트)의 연속 희석액에, 로딩된 센서를 침지시켰다. 1가(1:1) 모델을 이용하여 계산된 동역학 상수를 하기 표 12에 제시하였다. 클론 3714를 제외하고, 모든 인간화 항체는 모체 키메라 참조 항체 371과 비교하여 유사하거나 또는 약간 더 낮지만 허용 가능한 친화성을 나타냈다.

T 세포 기능 분석에 의한 항체의 평가는 실시예 2에 기술된 프로토콜에 따라 수행하였다. 클론 3711, 3714 및 3717은 낮은 T 세포 자극 활성을 나타냈다(도 15).

(ii) CD137 수용체에 대한 클론 3712 및 CD137 리간드의 경쟁적 결합

CD137 수용체에 대한 결합을 위한 CD137L과 클론 3712 간의 경쟁은 표준 ELISA 형식에서 측정되었다. CD137 수용체에 대한 클론 3712의 경쟁적 결합 프로파일을 참조 항-CD137 항체 371, 370, 372, 375, 390 및 402의 것들과 비교하였다(관련 개시내용이 본원에 언급된 기술 요지 및 목적을 위해 원용에 의해 본원에 포함된 국제공개 WO2019/113039 참조). CD137 수용체를 DPBS에 1 μg/mL로 희석한 다음 ELISA 플레이트(Corning, 카탈로그 번호: 9018, 높은 결합)에 웰당 50 μL(0.05 μg)의 부피로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 경사분리하고 1회 세척하고; 분석 희석제를 200 μL/웰로 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 1회 세척하였다. 클론 3712, 371, 370, 372, 375, 390, 402 및 SSI-361(음성 대조군 항체)을 분석 희석제에 9 μg/mL로 희석한 다음, 분석 희석제에 11개의 포인트에 대해 연속 희석하여 9000, 3000, 900, 300, 90, 30, 9, 3, 0.9, 0.3 및 0.09 ng/mL의 최종 농도들을 제조하였다. 희석된 CD137 수용체를 분석 플레이트에 50 μL/웰로 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. CD137L을 분석 희석제에 6 μg/mL로 희석한 다음, 분석 희석제에 11개의 포인트에 대해 연속 희석하여 일련의 농도인 6000, 2000, 600, 200, 60, 20, 6, 2, 0.6, 0.2, 0.06 ng/ml의 최종 농도들을 제조하거나, 또는 희석하여 40 ng/ml의 최종 농도를 제조하였다. 희석된 CD137L을 분석 플레이트에 50 μL/웰로 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 3회 세척하였다. 1:100,000 20 희석된 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG-H+L를 100 μL/웰로 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 배양한 후 PBST로 4회 세척하였다. TMB 기질 용액을 100 μL/웰로 첨가하였다. 15분 동안 색이 발색되도록 하고 100 μL/웰의 2N H2SO4로 중지시켰다. Tecan F200 Pro 판독기로 450 nm 및 620 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

도 17에 표시된 결과는 CD137 수용체에 대한 클론 3712의 결합이 CD137L에 대한 CD137 수용체의 결합을 부분적으로 차단하였음을 시사한다.

실시예 8: A375 NPG 마우스 생체내 흑색종 모델에서의 클론 3712의 효능 평가

상기에 기술된 클론 3712의 인간화 V_H 및 V_L서열을 사용하여, 인간 IgG1의 Fc 변이체를 함유하는 인간 IgG1/카파(서열 번호 6 및 7)의 Fc 영역을 포함하는 항-CD137 항체(상기 실시예 3에 개시된 클론 3712-IgG1v)를 구축하였다. 상기 실시예 3에 개시된 방법에 따라, 일시적 발현 CHO 세포 및 안정한 CHO 세포주에서의 생산을 위한 발현 벡터로 3712-IgG1v를 클로닝하였다.

세포 배양

A375 세포주를 iCell Bioscience Inc로부터 입수하였고, 공기 중의 5% CO2의 분위기에서 37℃에서, 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 단층 배양물로서 시험관내에서 유지하였다. 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 3일 내지 5일마다 관례대로 계대배양하였다. 지수 성장 단계의 성장하는 세포를 수확하고, 종양 이식을 위해 계수하였다.

동물

Joinn-lab company에서 제공하는 NPG(NOD-Prkdc^scidIl2rg^null) 마우스를 연구에 사용하였고, 이들은 모든 수컷이고, 4주령이며, 약 19 내지 31 g 중량을 갖는다. 총 20마리의 마우스를 체중에 따라 3개의 그룹으로 무작위화하였다.

인간 면역 세포 및 종양 이식

G-CSF-동원된 말초 혈액 CD34(+) 조혈 줄기 세포를 말초 혈액 줄기 세포(PBSC: peripheral blood stem cell)로부터 자기 활성화 세포 분리(MACS: magnetic activated cell sorting)에 의해 단리한 후, 골수강 이식에 의해 준치사량의 X선을 조사한 NPG 마우스에 이식하였다. 이식 후 12주째에, 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 0.2 ml의 PBS 중의 2×10⁶개의 A375 세포를 피하 이식하였다.

면역조절제 치료

그룹 1의 마우스는 PBS로 치료하였고 그룹 2의 마우스는 총 9회의 용량에 대해 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 18일, 22일, 25일 및 29일째에 시작하여 정맥내 주사를 통해 매주 2회 5 mg/kg의 클론 3712-IgG1v로 치료하였다.

종점

4일째부터 버니어 캘리퍼스를 사용하여 2차원으로 매주 2회 종양을 측정하였고, 부피는 하기 공식 V=0.5 a×b²을 사용하여 mm3 단위로 표시했으며, 상기 식에서 a 및 b는 각각 종양의 장경 및 단경이다. 연구의 주요 종점은 종양 성장 억제(TGI)였다. TGI는 TGI(%)=100×(1―T/C)로서 표현된다. T 및 C는 각각 29일째에서의 치료군 및 대조군의 평균 종양 부피이다.

도 18에 나타난 바와 같이, 3712-IgG1v의 치료(그룹 2)는 PBS-치료된 대조군(그룹 1)과 비교하여 유의한 종양 성장 억제(TGI=41%, p=0.09)를 나타냈다.

실시예 9: 사이토카인 방출 활성 평가

인간 전혈과 PBMC를 사용한 시험관내 사이토카인 방출 분석은, 가용성 또는 고체 형태의 3712-IgG1v가 CD28 작용성 항체(TGN1412) 및 CD3 작용성 항체(OKT3)와 비교하여, 사이토카인 방출 폭풍을 유도할 위험이 낮음을 시사하였다.

(i) 가용성 3712-IgG1v에 의해 유도된 고밀도 사전 배양된 PBMC의 사이토카인 방출

가용성 3712-IgG1v에 의한 사이토카인 유도의 잠재적 위험을 평가하기 위해 4명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 고밀도 배양 실험에서 시험하였다. CD28 작용제 항체 TGN1412 및 CD3 항체 OKT3을 양성 대조군으로 사용하였고 아바스틴을 음성 대조군으로 사용하였다. 항체 치료 후 2시간 및 24시간째에서의 배양 상청액에 대해 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-2의 수준을 분석하였다. 2시간 시점에서, 시험된 항체 중 어느 것도 이들 사이토카인의 변화를 유도하지 않았다. 24시간째에, TGN1412 및/또는 OKT3는 모든 공여자에서 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-2의 상승을 일으켰지만, 3712-IgG1v뿐만 아니라 아바스틴은 광범위한 농도(3 ng/mL 내지 300 μg/mL)에서 뚜렷한 변화를 유도하지 않았다. 상기 데이터는 3712-IgG1v가 사이토카인 폭풍을 유발할 위험이 낮을 수 있음을 시사한다.

(ii) 플레이트-결합된 3712-IgG1v에 의해 유도된 PBMC의 사이토카인 방출

플레이트-결합된 3712-IgG1v가, 이것이 사이토카인 생산을 유도하는 능력을 평가하기 위해, 4명의 건강한 공여자로부터의 PBMC와의 배양에서 시험되었다. CD28 작용제 항체 TGN1412 및 CD3 항체 OKT3을 양성 대조군으로 사용하였고 아바스틴을 음성 대조군으로 사용하였다. 배양 후 2시간 및 24시간째에서의 배양 상청액에 대해 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-2의 수준을 분석하였다. 2시간 시점에서, 시험된 항체 중 어느 것도 이들 사이토카인의 변화를 유도하지 않았다. 24시간째에, TGN1412 및/또는 OKT3는, 공여자 1에서의 TNF-α 및 IL-6을 제외하고, 모든 공여자에서 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-2의 상승을 일으켰지만, 3712-IgG1v뿐만 아니라 아바스틴은 광범위한 농도(0.1 μg/웰 내지 100 μg/웰)에서 뚜렷한 변화를 유도하지 않았다. 상기 데이터는 3712-IgG1v가 사이토카인 폭풍을 유발할 위험이 낮을 수 있음을 시사한다.

(iii) 가용성 3712-IgG1v에 의해 유도된 전혈의 사이토카인 방출

15명의 건강한 공여자의 집단으로부터의 전혈 샘플을 사용하여 3712-IgG1v(LYV1)의 면역 조절 활성을 또한 조사하였다. 채혈 후 4시간 이내의 전혈을 3712-IgG1v 또는 대조군과 함께 배양하였다. Luminex 플랫폼을 사용하여 혈장 내 사이토카인 수준을 평가하였다. PWM과 함께 배양된 전혈을 양성 대조군으로 사용하였고, 배경 반응을 측정하기 위해, PBS와 함께 배양된 전혈을 사용하였다. 혈장 샘플에 대해 IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ 및 TNF-α을 조사하였다. 예측된 바와 같이, 양성 대조군 PWM과 함께 전혈을 배양한 경우, PBS와 함께 배양된 전혈과 비교하여 모든 사이토카인의 분비가 유의하게 증가하였다.

임상으로부터 보고된 데이터에 대비해 샘플에 대해 생성된 데이터를 벤치마킹하기 위해, 공지된 사이토카인 방출률을 갖는 2개의 임상 항체, 즉 렘트라다(Lemtrada)와 에르비툭스(Erbitux)를 동시에 실행하였다. 에르비툭스는 주입 관련 반응의 수준이 낮은 것으로 인식되어 있으며, 양성 사이토카인 방출에 대한 기준선을 설정하는 데 사용되었다. 대조적으로, 렘트라다는 임상에서의 높은 주입 반응률과 관련이 있으며(문헌[Bugelski, Achuthanandam, Capocasale, Treacy, & Bouman-Thio, 2009]) 높은 반응 임상 대조군을 확립하기 위해 사용되었다.

전혈을 렘트라다로 치료한 후의 IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ 및 TNF-α의 평균 수준은 3712-IgG1v 또는 Erbitux^®로 치료된 배양물보다 유의하게 높았다. 통계 분석은, 농도에 관계없이, 에르비툭스^®와 비교할 때 3712-IgG1v에 대한 반응으로 생성된 IL-6, IL-10, IFN-γ 및 TNF-α의 수준 사이에 유의한 차이가 없음을 보여주었다.

요약하면, 사이토카인 방출에 대한 3712-IgG1v의 효과는, 사이토카인 방출 분석 전의 인간 PBMC 및 건강한 공여자의 전혈의 24시간 동안의 고밀도 사전 배양을 포함한 시험관내 분석의 종합적인 세트에서 조사되었다. 3712-IgG1v를 배양 플레이트에 코팅한 후 인간 PBMC와 함께 2시간 및 24시간 동안 배양한 후 사이토카인 검출을 시험하였다. 3712-IgG1v뿐만 아니라 임상 참조 항체인 아바스틴^® 또는 에르비툭스^®는 이들 분석에서 사이토카인 방출을 유도하는 데 있어서의 뚜렷한 활성을 나타내지 않았으며, 이는 3712-IgG1v가 인간에서 사이토카인 폭풍을 유도할 위험이 낮을 것임을 시사한다.

실시예 10: 시노몰구스 원숭이에서의 약동학 및 독성학 연구

표적 서열 상동성, 보존된 결합 친화성 및 FcγRIIB-의존성 CD137 작용성에 기초하여, 시노몰구스 원숭이가 3712-IgG1v의 PK 및 안전성 프로파일을 평가하기 위한 유일한 약리학적으로 관련된 비임상 종으로 식별되었다.

약동학 연구

인간에서의 의도된 투여 경로인 정맥내 주입(들) 후의 3712-IgG1v의 PK 프로파일을 이해하기 위해, 2개의 단일 용량(3, 10 또는 30 mg/kg, 또는 0, 10, 30 또는 100 mg/kg) 연구 및 1개의 반복 용량 연구(0, 10, 30 또는 100 mg/kg)를 나이브 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다.

단일 용량 약동학

단일 정맥내 3712-IgG1v를 투여한 후, 모든 동물에서 전신 노출이 달성되었으며 유의한 성별 차이가 없었다. 용량 정규화된 전신 노출(AUC 및 C_max) 데이터는 3 내지 100 mg/kg의 용량 범위에서 선형 패턴의 동역학을 시사하였다. 3 내지 30 mg/kg의 용량 범위에서 평균 Vdss는 54.9 내지 69.7 mL/kg였고, CL은 0.355 내지 0.488 mL/hr/kg였고, 평균 T_1/2는 64.6시간 내지 133시간 범위였으며, 이는 3712-IgG1v가 혈액에 분포되어 천천히 순환으로부터 제거된 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 항-3712-IgG1v-항체(ADA)의 형성은 대부분의 동물에서 검출되었으며, 더 낮은 용량을 투여 받은 동물에서 더 높은 발병률이 나타났으며, 이는 3712-IgG1v가 원숭이에서 면역원성임을 시사한다.

반복 용량 약동학

반복 용량 PK가 시노몰구스 원숭이에서 반복 용량 독성학 연구와 함께 평가되었다. 3712-IgG1v의 반복되는 정맥내 용량(0, 10, 30 또는 100 mg/kg에서 QW × 5) 후에, 전신 노출의 유의한 감소가 10 및 30 mg/kg 그룹의 동물에서 관찰되었으며, 이는 제거율 증가 및 ADA의 영향의 결과일 가능성이 높다. 29일째에 10, 30 및 100 mg/kg 그룹의 동물에서 각각 10/10, 8/10 및 2/10이 양성으로 밝혀졌기 때문에, ADA의 형성은 저용량 그룹에서 주로 검출되었다. 10 및 30 mg/kg 그룹에서의 ADA의 높은 확산은 PK를 정확하게 평가하기 위한 본 발명자들의 능력을 손상시켰다. 대부분의 동물이 ADA 음성인 100 mg/kg 용량 그룹에서 가벼운 축적이 관찰되었으며, 축적비(AR: accumulation ratio)는 수컷의 경우 1.6, 암컷의 경우 1.7이었다.

독성학 연구

3712-IgG1v를 투여 받는 인간에 대한 잠재적 위험의 평가는 나이브 시노몰구스 원숭이에서의 2개의 US-GLP 준수 독성학 연구에서 수행되었다. 제1 연구는 3712-IgG1v(0, 10, 30 또는 100 mg/kg)의 정맥내 주입의 잠재적 급성 독성을 평가하고 최대 허용 용량(MTD: maximum tolerated dose)을 결정하기 위한 단일 용량 연구였다. 제2 연구인 중요한 29일 반복 용량 독성 연구는 0, 10, 30 또는 100 mg/kg의 5회의 정맥내 주입을 6주 회복 기간과 함께 29일 동안 QW 투여함으로써 수행되었다. 잠재적인 표적 장기와 아만성 독성뿐만 아니라 임의의 독성의 가역성, 지속성 또는 지연된 발생을 평가하였다. 안전성 약리학 및 주사 부위 반응도 반복 용량 일반 독성학 연구의 일부로서 평가되었다.

단일 용량 독성

나이브 시노몰구스 원숭이에서의 3712-IgG1v의 잠재적 급성 독성을 평가하기 위해, US-GLP 준수 단일 용량 독성학 연구를 수행하였다. 총 8마리의 원숭이를 4개 그룹에 할당하였고(1/성별/그룹), 60분의 정맥내 주입을 통해 0(비히클), 10, 30 또는 100 mg/kg의 3712-IgG1v를 투여하였다. 투여 후 14일 동안, 생존력, 임상적 관찰, 체중, 음식 소비, 임상 병리학(혈액학, 혈청 화학, 응고 및 소변 검사), 독성 역학(TK: toxicokinetics) 및 면역원성의 평가를 위해 동물을 관찰하였다. 또한, 면역독성(사이토카인), 림프구 표현형 결정 및 가용성 표적 항원에 대한 GLP 비준수 분석을 수행하였다. 15일째에, 모든 동물을 부검하고 육안(거시적) 및 조직병리학적(현미경) 조사를 수행하였다.

연구 기간 동안, 예정에 없던 사망은 없었다. 임상적 관찰, 체중, 음식 소비, 임상 병리학, 면역독성 또는 림프구 표현형 결정에 대한 치료-관련 영향은 관찰되지 않았다. 또한, 부검 조사에서, 시험 물품-관련된 거시적 또는 미시적 발견은 나타나지 않았다.

3712-IgG1v에 대한 전신 노출(C_max 및 AUC_0-168 둘 모두)은 용량 증가에 따라 비례적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 임의의 용량 수준에서 전신 노출에서 관찰된 뚜렷한 성별 차이는 없었다. ADA는 각각 0, 10, 30 및 100 mg/kg 3712-IgG1v를 투여 받은 동물의 1/2, 1/2, 1/2 및 1/2에서 양성이었다. 그러나, 역가는 10 mg/kg 그룹에서의 한 마리의 암컷 동물을 제외하고는 모두 매우 낮았다(그 값은 0, 10, 30 및 100 mg/kg 그룹에 대해 14일째에 각각 36, 1120, 70 및 12였다). 클론 3712-IgG1v의 정맥내 주입 후에, 혈청 CD137 단백질은 0.1 ng/mL의 기준선 수준에서 1.3 ng/mL로 용량 의존적 방식으로 증가했으며, 이는 3712-IgG1v가 시노몰구스 원숭이의 순환에서 CD137 단백질에 결합하고 안정화시킬 수 있음을 시사한다.

결론적으로, 10, 30, 100 mg/kg의 3712-IgG1v의 정맥내 주입은 내성이 좋았다. 따라서, 시노몰구스 원숭이에서의 3712-IgG1v의 단일 정맥내 용량의 MTD는 100 mg/kg 이상인 것으로 간주되었다.

반복 용량 독성

3712-IgG1v의 잠재적인 아만성 독성 효과를 시노몰구스 원숭이에서의 US-GLP 준수 29일 반복 용량 독성학 연구에서 조사하였다. 연구 설계는 부작용의 가역성, 지속성 또는 지연된 발생을 평가하기 위한 42일 회복 단계를 포함하였다. 총 40마리의 원숭이를 4개 그룹에 할당하였고(5/성별/그룹), 0(비히클), 10, 30, 및 100 mg/kg의 3712-IgG1v의 60분의 정맥내 주입을 29일 동안 주 1회 투여하였다(QW × 5). 투여 개시 시에, 원숭이의 나이는 약 2.5세 내지 3.5세였으며 체중은 2.0 내지 2.7 kg 범위였다. 30일째에, 주요 그룹 동물(3/성별/그룹)을 안락사시키고 부검한 반면, 회복 그룹 동물(2/성별/그룹)은 71일째에 안락사될 때까지 추가로 42일 동안 관찰하였다.

사망률, 임상적 관찰(주사 부위 관찰 포함), 체중, 음식 소비, 체온, 안전성 약리학(ECG, 심박수, 혈압, 호흡 매개 변수 및 신경학적 검사), 안과 검사, 임상 병리학(혈액학, 응고, 혈청 화학 및 소변 검사), TK, 면역원성(ADA 분석), 장기 중량 및 육안적 병리학적 및 조직병리학적 검사에 대해 동물을 평가하였다. 또한, 면역독성(사이토카인), 림프구 표현형 결정 및 가용성 표적 항원에 대한 GLP 비준수 분석을 수행하였다.

모든 동물에서 전신 노출이 달성되었다. 제1 정맥내 주입 후 전신 노출에는 성별 차이가 없었으며, 전신 노출(AUC0-168h 및 Cmax)은 용량에 비례하여 증가하였다. ADA의 형성은 29일째에 10, 30 및 100 mg/kg 그룹에서 각각 10/10, 8/10 및 2/10의 동물에서 검출되었다. 약물 노출에 대한 ADA 형성의 영향이 유의했던 10 mg/kg 그룹에서, 제4 용량 후의 감소된 전신 노출이 관찰되었다. 그러나, 대부분의 동물이 ADA 음성이었던 100 mg/kg 그룹에서는, 가벼운 축적이 관찰되었다.

연구 기간 동안, 예정에 없던 사망은 발생하지 않았다. 임상적 관찰, 주사 부위의 국소 자극, 체중, 음식 소비, 체온, 안전성 약리학, 안과 검사, 임상 병리학(혈액학, 응고, 응고 및 소변 검사), 안전성 약리학(심전도 기록, 혈압, 심박수, 호흡 및 신경학적 검사), 면역학(B 및 T 림프구 표현형 결정, 사이토카인 분석), 또는 병리학 변화(장기 중량, 거시적 및 미시적 관찰)에 관하여, 시험 물품-관련된 변화는 없었다. 임상 병리학 및 면역학 매개 변수에서 관찰된 모든 차이는 크기가 작았고/거나, 용량과 관련이 없었고/거나, 이 실험실의 과거 참조 범위 내에 있었기 때문에, 시험 물품-관련된 것으로 간주되지 않았다.

결론적으로 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이로의 10, 30, 또는 100 mg/kg으로의 29일 동안의 3712-IgG1v의 반복 정맥내 주입(QW×5)은 내성이 좋았다. 시험 물품-관련된 독성이나 독성 장기는 식별되지 않았다. 부작용이 관찰되지 않는 수준(NOAEL: no-observed-adverse-effect level)은 이 연구에서 100 mg/kg으로 간주되었다. 이 용량 수준에서, 제4 용량 후의 평균 Cmax 및 AUC_0-168은 수컷의 경우 각각 4930 μg/mL 및 355000 μgㆍh/mL였고, 암컷의 경우 각각 4010 μg/mL 및 300000 μgㆍh/mL였다.

다른 실시형태

본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적에 기여하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 명확히 달리 기술되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일뿐이다.

상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 이의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서, 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 다양한 변경 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시형태들 또한 청구범위 내에 속한다.

균등물

여러 본 발명 실시형태가 본원에 기술되고 예시되어 있지만, 당업자는 기능을 수행하고/거나, 결과를 획득하고/거나 본원에 기술된 이점 중 하나 이상을 획득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 이러한 변경 및/또는 변형 각각은 본원에 기술된 본 발명의 실시형태의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자는 본원에 기술된 모든 매개 변수, 치수, 물질 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제 매개 변수, 치수, 물질, 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 응용 분야 또는 응용 분야들에 따라 결정된다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 기술된 특정한 본 발명의 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시형태들이 오직 예로서 제시되며, 첨부된 청구범위 및 이의 균등물의 범위 내에서, 본 발명의 실시형태들은 구체적으로 기술되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시형태들은 본원에 기술된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법과 관련된다. 또한, 2개 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 경우, 본 개시내용의 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본원에 정의되고 사용된 모든 정의는 사전적 정의, 원용에 의해 포함된 문헌에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 보통의 의미에 우선하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에 개시된 모든 참조문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 기술 요지와 관련하여 원용에 의해 포함되며, 이는 일부 경우에서 문헌 전체를 포함할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수형은, 명확히 반대로 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 이렇게 결합된 요소들, 즉, 일부 경우에서는 접속적으로 존재하고 다른 경우에서는 분리적으로 존재하는 요소들 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 복수의 요소는 동일한 방식으로, 즉, 이렇게 결합된 요소들 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별된 요소들과 관련되든 관련되지 않든 간에, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소들 이외에 다른 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 경우, 일 실시양태에서는, A만(선택적으로, B 이외의 요소들을 포함함)을; 다른 실시양태에서는, B만(선택적으로, A 이외의 요소들을 포함함)을; 또 다른 실시양태에서는, A 및 B 둘 모두(선택적으로, 다른 요소들을 포함함) 등을 의미할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기에 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록 내의 항목을 분리할 경우, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로서, 즉 다수의 또는 한 목록의 요소들 중 적어도 하나(그러나 또한, 하나 초과도 포함함), 및 선택적으로, 열거되지 않은 추가적인 항목의 포함인 것으로서 해석되어야 한다. "~ 중 단지 하나" 또는 "~ 중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 경우, "~로 구성된"과 같은, 명확히 반대로 나타낸 용어만이 다수의 또는 한 목록의 요소들 중 정확히 하나의 요소의 포함을 의미한다. 일반적으로, 본원에서, 용어 "또는"은, "어느 하나", "~ 중 하나", "~중 오직 하나", 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배타성 용어가 선행될 경우 배타적인 대체표현(즉, "하나 또는 나머지 다른 하나이지만 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로만 이해되어야 한다. 청구범위에 사용될 경우 "~로 본질적으로 구성된"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 이의 통상적 의미를 갖는다.

본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용될 때, 하나 이상의 요소들의 목록과 관련하여 어구 "적어도 하나"는, 요소들의 목록 내의 요소들 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소들의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소들의 목록 내의 요소들의 임의의 조합을 배제하지 않는다. 이 정의는 또한, 구체적으로 식별된 요소들에 관련되든 관련되지 않든 간에, 어구 "적어도 하나"가 언급하는 요소들의 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외에 요소가 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 등가적으로 "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 등가적으로 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시양태에서는 B는 존재하지 않고 적어도 하나(선택적으로, 하나 초과를 포함함)의 A(및 선택적으로, B 이외의 요소들을 포함함); 다른 실시양태에서는 A는 존재하지 않고 적어도 하나(선택적으로, 하나 초과를 포함함)의 B(및 선택적으로, A 이외의 요소들을 포함함); 또 다른 실시양태에서는 적어도 하나(선택적으로, 하나 초과를 포함함)의 A, 및 적어도 하나(선택적으로, 하나 초과를 포함함)의 B(및 선택적으로, 다른 요소들을 포함함) 등을 의미할 수 있다.

또한, 명확히 반대로 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 작동을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 상기 방법의 단계 또는 작동의 순서는 상기 방법의 단계 또는 작동이 언급된 순서로 반드시 제한되는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Lyvgen Biopharma Co., Ltd. Lyvgen Biopharma (Suzhou) Co., Ltd. <120> HUMANIZED ANTI-CD137 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 103157-656466-70007WO01 <150> PCT/CN2019/086364 <151> 2019-05-10 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Gly Phe 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Gly Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Leu Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Leu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 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Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 20 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 21 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 23 Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gly Trp Met Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 24 Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 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20 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 36 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 37 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 38 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 39 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 40 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 40 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 41 <211> 11 <212> PRT 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Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Thr Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 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180 185 190 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 195 200 205 Gly Gly Ser Tyr Arg Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230

Claims

CD137에 결합하는 인간화 항체로서, 상기 항체는 (i) 중쇄 가변 도메인(V_H), 및 (ii) 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함하고, 상기 V_H는 참조 항체 371과 동일한 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1 내지 3을 포함하고, 상기 중쇄 CDR은 인간 IGHV1-2*2 프레임워크에 이식되며, 상기 V_L은 참조 항체 371과 동일한 경쇄 CDR 1 내지 3을 포함하고, 상기 경쇄 CDR은 이식됨 인간 IGKV1-39*01 프레임워크에 이식된, CD137에 결합하는 인간화 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HC CDR1), 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2, 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3, 및/또는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LC CDR1), 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2, 및 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는, 인간화 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 18의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 프레임워크 영역 1(HC FR1), 서열 번호 19의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 HC FR2, 서열 번호 20의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 HC FR3, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 HC FR4를 포함하는, 인간화 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 프레임워크 영역 1(LC FR1), 서열 번호 36의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 LC FR2, 서열 번호 37의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 LC FR3, 및 서열 번호 38의 아미노산 서열 또는 3개 이하의 역돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하는 LC FR4를 포함하는, 인간화 항체.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 4의 위치 K42, P44, F71, Y87, 및 V104에서 하나 이상의 역돌연변이를 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하고, 선택적으로, 상기 역돌연변이는 K42G, P44V, F71Y, Y87F, 및 V104L로 구성된 군으로부터 선택되는, 인간화 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 LC FR1, 서열 번호 36 또는 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 LC FR2, 서열 번호 37 및 서열 번호 40으로부터 선택된 서열을 포함하는 LC FR3, 및 서열 번호 38 또는 서열 번호 41의 서열을 포함하는 LC FR4를 포함하는, 인간화 항체.
제4항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 35의 서열을 포함하는 LC FR1, 서열 번호 39의 서열을 포함하는 LC FR2, 서열 번호 40의 서열을 포함하는 LC FR3, 및 서열 번호 38의 서열을 포함하는 LC FR4를 포함하는, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 상기 V_H는 서열 번호 3, 8, 또는 9의 아미노산 서열을 포함하고/거나 상기 VL은 서열 번호 4, 5, 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 인간화 항체.
제9항에 있어서, 상기 항체가 전장 항체이고, 선택적으로, 상기 항체가 IgG 분자인, 인간화 항체.
제10항에 있어서, 상기 항체가 IgG1 분자인, 인간화 항체.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 야생형 Fc 영역을 포함하는, 인간화 항체.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 변형된 효과기 활성을 갖는 Fc 변이체를 포함하는, 인간화 항체.
제13항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 42의 아미노산 서열을 갖는 Fc 영역을 포함하는, 인간화 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및/또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 인간화 항체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 FcγRIIB에 추가로 결합하는 다중특이적 항체의 일부인, 인간화 항체.
단리된 핵산 또는 핵산 세트로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 인간화 항-CD137 항체를 집합적으로 암호화하는 단리된 핵산 또는 핵산 세트.
제17항에 있어서, 상기 단리된 핵산 또는 핵산 세트가 하나의 벡터 또는 2개의 벡터 상에 위치하는, 단리된 핵산 또는 핵산 세트.
제18항에 있어서, 상기 하나 또는 2개의 벡터가 하나 또는 2개의 발현 벡터인, 단리된 핵산 또는 핵산 세트.
숙주 세포로서, 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 숙주 세포.
약학적 조성물로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 인간화 항-CD137 항체 또는 제19항의 핵산/핵산 세트, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 유효량의 제21항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 대상체는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 요법을 투여 받고 있는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 대상체에게 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 항-PD-1 항체인, 방법.
제25항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙인, 방법.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 암을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 위험을 갖는 인간 환자인, 방법.
제27항에 있어서, 상기 암이 전립선암, 결장암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
제28항에 있어서, 상기 암은 진행성, 전이성 또는 절제 불가능한 악성 종양인, 방법.
제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인되는, 방법.
제22항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 면역 장애 및/또는 감염을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 또는 이의 위험을 갖는 인간 환자인, 방법.
제31항에 있어서, 상기 면역 장애가 자가면역 장애이고, 이는 선택적으로, 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반 루푸스(SLE), 제I형 당뇨병, 다발성 경화증, 셀리악병 및 이식편대숙주(GVH) 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 상기 암 또는 상기 면역 장애를 위한 요법을 투여 받았거나 투여 받고 있는, 방법.
제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항-CD137 항체는 0.3 내지 10 mg/kg의 용량으로 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항-CD137 항체는 2주 내지 4주마다 1회, 선택적으로 3주마다 1회 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
인간화 항-CD137 항체를 생산하는 방법으로서,
(i) 상기 항-CD137 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 제20항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(ii) 이렇게 생산된 항-CD137 항체를 세포 배양물로부터 수확하는 단계를 포함하는, 인간화 항-CD137 항체를 생산하는 방법.