KR20220006409A - 자가조립 및 역자가조립 가능한 pH 감응성 펩타이드 분자를 포함하는 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

자가조립 및 역자가조립 가능한 pH 감응성 펩타이드 분자를 포함하는 접합체 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 접합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 의하면, 암 세포의 미토콘드리아를 표적하여 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

자가조립 및 역자가조립 가능한 pH 감응성 펩타이드 분자를 포함하는 접합체 및 이의 용도 {Conjugates comprising self-assembling and disassembling pH-sensitive peptide molecules and uses thereof}
자가조립 및 역자가조립 가능한 pH 감응성 펩타이드 분자를 포함하는 접합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
분자 자가조립 (Self-assembly)은 약물 전달, 조직공학, 유전자 치료 등의 다양한 생의학 분야에 적용될 수 있는 기능성 나노재료를 생성하는데 있어서 주목 받는 분야이다. 대부분 분자의 나노 구조로의 자가조립은 용매에서 연구되어 왔지만, 합성 양친매성 펩타이드의 세포 내부에서의 조립은 많은 연구가 되어 있지 않아서 세포 기능을 조절하기 위한 생체 모방의 조립 분야에 촉망 받는 연구 주제가 되고 있다.
미토콘드리아는 산화적 인산화를 통해 에너지를 생산하는 상당히 역동적인 세포소기관으로써, 지방산 산화, TCA 회로, 아미노산 대사작용뿐 아니라 세포 사멸 (apoptosis), 네크로시스(necrosis) 및 네크롭토시스(necroptosis)를 포함하는 세포 사멸 (cell death) 과정에 관련이 있다는 것이 알려져 있다. 미토콘드리아 기능의 이상은 뇌에 단백질 섬유의 축적과 연관이 있는 몇몇의 퇴행성 질병, 알츠하이머 (Alzheimer) 병, 파킨슨 (Parkinson) 병, 헌팅턴 (Huntington) 병, 및 루게릭 병 (Amyotrophic lateral sclerosis)에서 보고된 바 있다. 알츠하이머 질병인 환자의 미토콘드리아에서 Aβ와 같은 베타-쉬트 (beta-sheet) conformation이 풍부한 비정상적으로 folding된 단백질이 관찰되고, 이와 같은 비정상적으로 folding된 단백질은 세포 독성 효과를 나타낸다는 것이 알려져 있다.
최근 펩타이드 구조체의 경우 약물 전달로 인한 암세포 파괴뿐만 아니라 암세포 특이적인 변화 요인에 의한 구조 변화를 유도함으로써 세포를 파괴하는 방안이 제안되고 있으며, 이를 역-자가조립 구조체라고 통칭한다. 본 발명자들은 산성 pH에 감응하여 역-자가조립하는 펩타이드 접합체를 개발하였다.
일 양상은 미토콘드리아 표적화 모이어티 및 (Xaa)n-Lys로 표시되는 펩타이드를 포함하고, 상기 미토콘드리아 표적화 모이어티는 상기 펩타이드의 리신 아미노산에 연결되어 있는 것이고, 상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 Xaa의 개수로서, 2 내지 200의 정수이고, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 아미노산은 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것이고, 상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것이며, 상기 펩타이드는 숙신산 (succinic acid)를 포함하는 것인, 접합체 (conjugate)를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 미토콘드리아 표적화 모이어티 및 (Xaa)n-Lys로 표시되는 펩타이드를 포함하고, 상기 미토콘드리아 표적화 모이어티는 상기 펩타이드의 리신 아미노산에 연결되어 있는 것이고, 상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 Xaa의 개수로서, 2 내지 200의 정수이고, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 아미노산은 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것이고, 상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것이며, 상기 펩타이드는 숙신산 (succinic acid)를 포함하는 것인, 접합체 (conjugate)를 제공한다.
상기 펩타이드 (Peptide)는 3 내지 201개의 아미노산이 펩타이드 결합을 통해 연결된 것을 의미하고, 상기 펩타이드는 (Xaa)n-Lys로 표시될 수 있다. 상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 개수로서, 2 내지 200, 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 15, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4, 또는 2 내지 3의 정수일 수 있고, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 n은 2이고 상기 Xaa는 동일한 페닐알라닌, 알라닌, 사이클로헥실 알라닌, 또는 발린이 펩타이드 결합을 이루는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드 (Xaa)n-Lys는 아미노산의 N-말단에서 C-말단 순으로 각각의 아미노산 또는 아미노산의 R 그룹에 C3-C10 사이클로알킬기가 결합한 변이체 (C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체)가 펩타이드 결합으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드 (Xaa)n-Lys의 Lys의 C-말단의 카르복실기의 하이드록시기는 아민기, 알코올기, 에테르기, 및 아세틸기로 이루어진 군에서 선택된 것과 치환된 것일 수 있으며, 특정한 화학적 그룹이 결합되지 않을 수도 있으며, 이외에 다른 화학적 그룹이 화학적 결합을 이룬 것일 수도 있으며, 예컨대 아민기가 결합한 것일 수 있다.
상기 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체는 탄소의 숫자가 3 내지 10인 사이클로알킬이 상기 아미노산의 R 그룹에 결합한 것일 수 있으며, 예컨대 알라닌의 R 그룹인 메틸기의 탄소에 사이클로헥실이 결합한 사이클로헥실 알라닌 (Cyclohexyl alanine; CHA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 펩타이드는 펩타이드에 내부에 존재하거나 다른 펩타이드에 존재하는 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조는 단백질을 구성하는 아미노산 서열간의 상호작용으로 형성되는 2차 구조의 하나로서 수평적으로 연결되는 인정 분자간의 수소결합을 통해 형성된다. 상기 베타 쉬트 2차 구조는 많은 인간의 질병에서 단백질 엉김 (aggregates) 또는 섬유 형성과 관계 있는 것으로 알려져 있다.
상기 미토콘드리아 표적화 모이어티 (moiety)는 세포 내부의 미토콘드리아로 해당 물질을 표적화 시키는 기능을 하는 것을 의미하며, 예컨대 TPP (triphenylphosphonium)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 접합체를 구성하는 미토콘드리아 표적화 모이어티로 인하여 본 접합체가 세포 내부의 미토콘드리아로 표적화 될 수 있다. 상기 접합체의 숙신산이 산성 환경인 암 세포에서 분리되고, 숙신산이 분리된 접합체는 미토콘드리아의 이중막을 통과하여 미토콘드리아 내부로 들어갈 수 있는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙신산이 분리된 접합체는 상기 미토콘드리아 표적화 모이어티로 인하여 미토콘드리아로 들어갈 수 있으며, 상기 미토콘드리아 내부로 들어간 접합체는 암세포 특이적이게 암세포의 미토콘드리아 내부에서 합성된 펩타이드의 자가조립 (Self-assembly)체를 형성하여 세포 자멸을 유도할 수 있다.
상기 펩타이드에 연결된 미토콘드리아 표적화 모이어티의 개수는 1 내지 상기 (Xaa)n-Lys로 표시되는 펩타이드에 존재하는 아민기 개수 범위에서 선택된 정수일 수 있다. 상기 펩타이드의 C 말단에 아민기가 존재하는 경우, 상기 펩타이드에 연결된 미토콘드리아 표적화 모이어티의 개수는 1 내지 상기 리신 아미노산의 개수 (m)에 1을 더한 숫자인 m+1개 이내의 정수일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드에 연결된 미토콘드리아 표적화 모이어티의 개수는 1 개 또는 2개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 접합체의 펩타이드 N-말단은 형광단과 아마이드 결합으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형광단 (fluorophore)은 유기 화합물이　형광을 발하기 위해 필요한　원자단을 말한다. 본 발명에서 상기 형광단은 상기 펩타이드의 N-말단에 아마이드 결합으로 연결된 것으로, pyrene, NBD (4-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole), perylene, naphtalene, coronene, 및 방향족으로 이루어진 화합물로 평평한 구조를 가지고 있어 파이결합으로 서로 쌓이기 쉬운 형광단으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상이 될 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 펩타이드와 미토콘드리아 표적화 모이어티, 펩타이드와 형광단, 또는 이들 모두는 직접연결 된 것이거나, 링커를 통하여 연결된 것 일 수 있다. 상기 링커는 탄소수 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4, 또는 2 내지 3인 알킬기 (alkyl), 알켄기 (alkene), 알카인기 (alkyne)가 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 링커는 한 말단에 펩타이드와 아마이드 결합 등의 적절한 결합을 형성할 수 있는 관능기 (functional group)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 숙신산은 상기 펩타이드의 리신 아미노산에 연결된 것일 수 있고, 본 발명에서 상기 숙신산은 상기 펩타이드의 리신 아미노산의 아민에 결합된 것일 수 있다.
상기 접합체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 형광단을 의미하는 것으로, 수소, pyrene, NBD (4-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole), perylene, naphtalene, coronene, 및 방향족으로 이루어진 화합물로 평평한 구조를 가지고 있어 파이결합으로 서로 쌓이기 쉬운 형광단으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있고,
상기 링커 (linker)는 펩타이드의 N-말단과 형광단을 연결해주는 것으로, 존재하지 않거나, 탄소수 1 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 4, 또는 2 내지 3인 알킬기 (alkyl), 알켄기 (alkene), 알카인기 (alkyne)가 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 링커는 한 말단에 펩타이드와 아마이드 결합 등의 적절한 결합을 형성할 수 있는 관능기 (functional group)를 포함하는 것일 수 있으며, pyrene, NBD (4-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole), perylene, naphtalene, coronene, 및 방향족으로 이루어진 화합물로 평평한 구조를 가지고 있어 파이결합으로 서로 쌓이기 쉬운 형광단으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상과 상기 펩타이드를 아마이드 결합을 통해 연결해 주는 것을 수 있다.
다만, 상기 R1은 수소인 경우, 링커는 존재하지 않을 수 있으며,
R2는 펩타이드의 C-말단 (즉, 리신의 C 말단) 부위로서, 하이드록시기 (OH), 아민기, 알킬기, 알코올기, 에테르기, 및 아세틸기, (상기, 알킬기, 알코올기, 에테르기 및 아세틸기는 탄소수 1 내지 20, 탄소수 1 내지 10, 또는 탄소수 1 내지 5임)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 접합체는 자가조립되어 미셀 (micelle)구조를 형성하는 것일 수 있다. 상기 미셀은 음의 표면 전하를 가지고 있어 음의 전하를 갖는 혈장 세포막과의 반발로 인해 세포 내부로 들어갈 수 없다. 또한, 상기 접합체는 pH 감응성이 있어, pH에 따라 구조가 변화하는 것일 수 있다. 상기 접합체는 산성 환경에서 산-민감성 기인 숙신산이 분리되어, 미셀 구조를 이루었던 상기 접합체는 역자가조립 (disassembly) 되는 것일 수 있다. 역자가조립된 숙신산이 분리된 접합체는 양의 전하를 띠어 세포 내로 들어갈 수 있는 것일 수 있다. 이와 같이, 상기 접합체는 자가조립 및 역자가조립 구조 변화를 통해 산성 종양 미세 환경을 갖는 암 세포를 특이적으로 표적하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 2의 구조를 갖는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 화학식 2에서 상기 R이 아민기인 것은 하기 실시예에서 Mito-SA라고 불리는 것으로서, 미셀 (micelle)로 자가조립될 수 있고 이는 음의 표면 전하를 가진다. 이에 따라, 음의 전하를 갖는 혈장 세포막과의 반발로 Mito-SA 미셀은 세포 내부로 들어갈 수 없다. 그러나, 산성인 종양 미세 환경과 접촉하게 되면 산-민감성 기인 숙신산은 Mito-SA로부터 분리되고 미셀은 양의 전하를 갖는 Mito-FF 분자로 역자가조립된다. Mito-FF는 세포 내로 확산되어 미토콘드리아를 표적으로 하여 미토콘드리아 내부에서 자가조립에 의한 섬유를 형성함으로써 세포 자멸을 유도할 수 있다. 이와 같이 본 발명은 산성인 종양 미세 환경에서만 역자가조립되어 정상 세포에는 작용되지 않고 암 세포를 특이적으로 표적할 수 있다.
다른 양상은 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 접합체는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 산 또는 염기의 부가염 및 그의 입체화학적 이성체 형태를 모두 포함하며, 예컨대, 유기산 또는 무기산의 부가염일 수 있다. 상기 염에는 투여 대상에서 모화합물 (parent compound)의 활성을 유지하며 바람직하지 못한 효과를 유발하지 않는 염이라면 어느 것이든 포함되는 것으로, 특별히 제한되는 것이 아니다.
이러한 염에는 무기염과 유기염이 포함되며, 예를 들어, 아세트산, 질산, 아스파트산, 술폰산, 설퓨릭산, 말레산, 글루탐산, 포름산, 숙신산, 인산, 프탈산, 탄닌산, 타르타르산, 히드로브롬산, 프로피온산, 벤젠술폰산, 벤조산, 스테아르산, 락트산(lactic acid), 비카르본산, 비설퓨릭산, 비타르타르산, 옥살산, 부틸산, 칼슘 이데트, 카르보닉산, 클로로벤조산, 시트르산, 이데트산, 톨루엔술폰산, 푸마르산, 글루셉트산, 에실린산, 파모익산, 글루코닉산, 메틸니트릭산, 말론산, 히드로클로린산, 히드로요도익산, 히드록시나프톨산, 이세티온산, 락토비오닉산, 만델산, 점액산, 나프실릭산, 뮤코닉산, p-니트로메탄설포닉산, 헥사믹산, 판토테닉산, 모노히드로겐인산, 디히드로겐인산, 살리실산, 술파민산, 술파닐린산, 메탄술폰산일 수 있다.
또한, 상기 염의 형태로는, 암모늄염, 리튬염, 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염 및 칼슘염과 같은 알칼리 및 알칼리 토금속의 염, 예를 들어, 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염과 같은 유기 염기를 갖는 염, 및 아르기닌, 리신과 같은 아미노산을 갖는 염을 포함한다. 또한, 상기 염 형태는 적당한 염기 또는 산으로 처리함으로써 유리 형태로 전환될 수도 있다.
상기 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 표함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 암 세포 내 미토콘드리아에서 세포 자멸 (apoptosis)을 유도하는 것일 수 있다.
상기 세포 자멸 (apoptosis)은 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태로, 세포의 괴사나 병적인 죽음으로서 화상과 타박, 독극물 등의 자극에 의해 일어나는 세포의 죽음인 네크로시스와는 구별되는 것으로서, 세포가 축소되면서 시작되어, 이후 인접하는 세포 사이에 틈새가 생기고, 세포 내에서는　DNA가 규칙적으로 절단되어 단편화되는 방법으로 세포가 사망하는 것을 말한다.
상기 암 세포 내 미토콘드리아에서 자가조립체의 형성에 관하여, 암 세포의 경우 암 세포 미토콘드리아의 큰 음성 내부 막 전위에 의해서 상기 약학적 조성물에 포함되어 있는 숙신산이 분리된 역자가조립된 펩타이드가 축적되고 이를 통해 자가조립 과정이 가속되어 일어난다.
상기 약학적 조성물의 예방 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 원발성암 또는 전이암일 수 있다. 상기 암은 자궁경부암, 간암, 피부암, 전립선암, 유선암, 유방암, 비인두 선암, 폐암, 또는 뇌종양으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 의도한 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 있어서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학적 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
일 구현예는 경구 투여용 제형 또는 비경구 투여 제형으로 제형화된 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화 된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 유효성분 (즉, 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염) 이외에 제형화에 사용 가능한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제형화에 사용될 수 있는 부형제는 담체, 비히클, 희석제, 용매, 예를 들어 1가 알코올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리세롤 및 식용 오일, 예를 들어 대두유, 코코넛유, 올리브유, 잇꽃유, 면실유, 유성 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트; 결합제, 애주번트, 가용화제, 증점제, 안정화제, 붕해제, 활택제, 윤활제, 완충제, 유화제, 습윤제, 현탁제, 감미제, 착색제, 풍미제, 코팅제, 방부제, 항산화제, 가공제, 약물 전달 개질제 및 향상제(enhancer), 예를 들어 인산칼슘, 마그네슘 스테이트, 활석, 단당류, 이당류, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트로스, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 폴리비닐피롤리돈, 저융점 왁스, 이온 교환 수지 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 다양한 경구 투여 제형의 형태로 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 임의의 경구 투여용 제형으로 될 수 있다. 이러한 경구 투여용 제형은 각 제형의 통상적인 구성에 따라 상기 유효 성분 외에, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신 등의 희석제나, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 활택제 등의 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 경구 투여용 제형이 정제인 경우, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등의 결합제를 포함할 수 있고, 경우에 따라, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제나, 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 또는 감미제 등을 포함할 수도 있다.
그리고, 상기 약학적 조성물은 비경구투여 제형의 형태로 제형화 될 수도 있는데, 이러한 경우 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 비경구투여 방법에 의해 투여된다. 이때, 상기 비경구투여 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학적 조성물은 유효 성분이 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
상기 약학적 조성물 내의 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 함량은 약학 조성물의 사용 목적, 제형의 형태 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 약학 조성물의 전체 중량 기준으로 0.001 내지 99중량%, 0.001 내지 90중량%, 0.001 내지 50중량%, 0.01 내지 50중량%, 0.1 내지 50중량%, 또는 1 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 투여되는 유효성분의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 약물의 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 사람을 포함하는 포유류에 대하여, 하루에 0.01 내지 500 ㎎/㎏(체중)의 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 유효량은 원하는 효과, 예를 들어 암의 치료 및/또는 예방 효과를 얻을 수 있는 양에 따를 수 있다. 상기 약학적 유효량은 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로(예를 들어, 정맥 주사, 근육 주사 등)를 통해 투여될 수 있다.
일 양상에 따른 접합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 의하면, 암 세포의 미토콘드리아를 표적하여 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 Mito-SA와 Mito-SA의 숙신산이 분리된 후의 Mito-FF의 구조 및 이의 암 세포와 정상세포에서의 작용을 도식화한 그림이다.
도 2는 Mito-SA의 특성을 나타낸 결과이다:
도 2A는 Mito-SA의 pH 반응성으로 인한 Mito-FF로의 변환을 HPLC 분석으로 확인한 그래프이고; 도 2B는 미셀구조를 형성한 Mito-SA를 나타낸 이미지이며; 도 2C는 산성 pH에서 Mito-SA가 Mito-FF로 전환됨에 따라 섬유가 형성된 것을 나타낸 이미지이고; 도 2D는 Mito-SA 및 Mito-FF의 크기 분포를 나타낸 그래프이며; 도 2E는 Mito-SA의 임계 응집 농도 (CAC)를 나타낸 그래프이고; 도 2F는 Mito-SA의 전하를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Mito-SA의 pH-감응성을 분석한 결과이다:
도 3A는 TPP의 존재 또는 부존재하에서 Mito-SA에서 숙신산이 분리되어 Mito-FF가 형성되기까지의 에너지를 분석한 그래프이고; 도 3B는 Mito-SA에서 숙신산 무수물이 형성되는 메커니즘에서 Mito-SA의 초기 구조를 나타낸 이미지이며; 도 3C는 Mito-SA 분자 간 TPP 모이어티와 카보닐의 상호 작용을 나타낸 이미지이고; 도 3D는 쌍 분포 함수 (Pair distribution function)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 Mito-SA의 HeLa 및 NIH 3T3 세포의 미토콘드리아에 대한 영향을 나타낸 결과이다:
도 4A는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 Mito-Tracker Red FM으로 염색하여 미토콘드리아 단편화를 본 이미지이고; 도 4B는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 Mito-Tracker Red FM으로 염색하여 미토콘드리아 단편화를 본 이미지이며; 도 4C는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 미토콘드리아 내 ROS 발생을 본 이미지이고; 도 4D는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 미토콘드리아 내 ROS 발생을 본 이미지이며; 도 4E는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 DHE로 염색하여 세포질 내 ROS 발생을 본 이미지이고; 도 4F는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 DHE로 염색하여 세포질 내 ROS 발생을 본 이미지이며; 도 4G는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 TMRM으로 염색하여 미토콘드리아 막의 탈분극 발생 여부를 본 이미지이고; 도 4H는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 TMRM으로 염색하여 미토콘드리아 막의 탈분극 발생 여부를 본 이미지이다.
도 5는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 및 NIH 3T3 세포에 대한 영향을 FACS로 분석한 결과이다:
도 5A는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이고; 도 5B는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이며; 도 5C는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 DHE로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이고; 도 5D는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 DHE로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이며; 도 5E는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 TMRM으로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이고; 도 5F는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 TMRM으로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 및 NIH 3T3 세포의 미토콘드리아에서 섬유 형성을 하는 지 확인한 결과이다:
도 6A는 Mito-SA를 처리한 NIH 3T3 세포를 나타낸 이미지이고; 도 6B는 Mito-SA가 처리되지 않은 HeLa 세포를 나타낸 이미지이며; 도 6C는 Mito-SA를 처리한 HeLa 세포를 나타낸 이미지이고; 도 6D는 Mito-SA를 처리한 HeLa 세포의 미토콘드리아 내에서 Mito-FF가 섬유 형성을 한 것을 나타낸 이미지이다.
도 7은 Mito-SA를 처리한 후의 질량 스펙트럼을 나타낸 그래프 및 세포 독성을 분석한 결과이다:
도 7A는 Mito-SA를 처리한 HeLa 세포의 세포 용해물의 질량 스펙트럼을 분석한 그래프이고; 도 7B는 HeLa 세포에 대한 Mito-SA의 세포 독성을 분석한 그래프이며; 도 7C는 SaOS-2 세포에 대한 Mito-SA의 세포 독성을 분석한 그래프이고; 도 7D는 NIH 3T3 세포에 대한 Mito-SA의 세포 독성을 분석한 그래프이다.
도 8은 Mito-SA를 처리한 HeLa 및 NIH 3T3 세포를 FITC 아넥신/PI로 염색한 결과이다.
도 9는 인 비보(in vivo)에서의 Mito-SA의 항종양 효과를 나타낸 결과이다:
도 9A는 종양이 확립된 마우스에 Mito-SA를 처리한 뒤의 종양 부피를 나타낸 그래프이고; 도 9B는 종양이 확립된 마우스에 Mito-SA를 처리한 뒤의 종양을 나타낸 사진이며; 도 9C는 종양이 확립되지 않은 마우스에 Mito-SA를 처리하여 정상 조직에 대한 독성이 있는지 확인한 사진이고; 도 9D는 종양이 확립되지 않은 마우스에 Mito-SA를 처리하여 H&E, P/T, M/T 염색된 조직을 관찰한 이미지이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험재료
모든 펩티드를 0.25 μM 규모로 수동 합성하였다. 생성물을 ACN/물 혼합물 중 C-18 역 컬럼을 갖는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Agilent Technologies, USA)에 의해 정제하였다. 아미노산은 한국의 Bead Tech 및 미국 휴스턴의 APEX Bio에서 구입했다. Mito-SOX, Mitotracker Red FM, DHE는 한국의 Thermo Fisher Scientific에서 구입했다. 테트라메틸 로다민 메틸 에스테르 (tetramethyl rhodamine methyl ester: TMRM)는 한국의 Santa Cruz Biotechnologies로부터 구입했다. 펩티드의 성공적인 합성은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI-TOF/TOF, Ultraflex III)로 확인되었다. 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지는 LSM 780으로 촬영되었으며, TEM 이미지는 BioTEM 시스템 (JEM 1400)을 사용하여 얻었다.
실시예 1. Mito-SA의 합성
Mito-FF는 L-form 형태의 Phe-Phe-Lys (FFK)의 3개의 펩타이드를 기본 단위로 구성되어 있고, 9-fluorenylmethoxycarbonyl chemistry (Fmoc)를 기초로 표준 고체 상 합성 (standard solid phase synthesis (SSPS))방법을 이용하여 하기와 같이 합성하였다. Mito-SA는 Mito-FF에 숙신산 무수물 (succinic anhydride)가 결합된 것으로 하기와 같이 합성하였다.
펩티드 Mito-FF는 0.25 μM 규모로 표준 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 고체상 펩티드 합성에 의해 합성하였다. 합성된 FFK 펩티드를 디이소프로필 에틸 아민 (DIPEA, 500 μmol)의 존재 하에 1-피렌 카복실산 (500μmol) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) (500 μmol)로 처리하고, DMF에서 24 시간 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 수집하고 디메틸포름아미드 (DMF)로 세척하여 미반응 화학 물질을 제거하였다. 생성물을 절단 칵테일 (TFA/물/트리 이소프로필 아민 혼합물 (9.5:0.5:0.5))로 수지로부터 절단하고, 생성물을 차가운 에테르에 침전시키고, HPLC로 정제하여, MALDI-TOF/TOF를 사용한 질량 분석으로 확인하였다. 트리페닐 포스포늄 (TPP) 컨쥬게이션을 달성하기 위해, 합성된 펩티드 (0.02 mmol)를 DMF 중 트리에틸 아민 (0.02 mmol)과 함께 1-헥실 트리페닐포스포늄 브로마이드 염 (0.04 mmol)으로 처리하고 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 순수한 생성물을 HPLC를 사용하여 수집하고, 동결 건조시키고, 다음 연구에 사용하였다. 펩티드 Mito-FF를 90 % 수율로 수득하였다. 이어서 순수한 Mito-FF를 12 시간 동안 숙신산 무수물과 반응시켜 Mito-SA를 수득하였다.
실험예 1. Mito-SA의 특성 분석
Mito-FF 및 Mito-SA의 특성을 분석하기 위한 실험을 수행하였다.
먼저, HPLC 분석으로 Mito-SA의 pH 반응성을 실험하였다. Mito-SA를 산성 조건인 pH 6.4 인산 완충액으로 처리하고, 상이한 시점에서 HPLC에서의 피크 이동을 모니터링 하였다. 그 결과 대부분의 Mito-SA가 45 분 이내에 Mito-FF로 변환됨을 나타냈다 (도 2A).
산성 조건 하에서의 Mito-SA의 형태변화를 투과 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 관찰하였다. 구체적으로, 20 μM의 Mito-SA PBS 용액 및 100 μM의 Mito-FF PBS 용액 한 방울을 폼바르/탄소 코팅 구리 그리드에 놓고 대기 조건 하에서 증발시켰다. 샘플을 2 중량% 우라닐 아세테이트 용액으로 염색하고 1 분 동안 증발시키고, 과량의 용액은 여과지로 제거하였다. 120kV에서 작동하는 JEM-1400 TEM으로 샘플을 관찰하였다. 자가조립된 Mito-SA에 대한 구조 정보는 Image J 프로그램을 사용하여 현미경 사진으로 얻어졌다. 그 결과, TEM 이미지는 직경이 20.60 ± 0.145 nm 인 미셀 유사 구조를 나타냈다 (도 2B). TEM의 형태 변화에 의해 산성 pH 유도 Mito-SA의 Mito-FF 로의 전환을 확인하였다. 도 2C는 pH 6.4 산성 완충액으로 처리한 후의 TEM 이미지를 나타내며, 이는 ~ 10 nm 직경의 나노 섬유인 Mito-FF를 나타낸다. 이는 Mito-SA 미셀 용액에 기인한 ~ 50 nm 직경의 구조의 존재를 나타낸 동적 광 산란 (DLS)을 분석함으로써 추가로 확인되었으며, Mito-FF 분자는 나노섬유를 형성하기 때문에 더 큰 크기를 갖는 것으로 나타났다 (도 2D). 이러한 형태 변화는 산성 pH에 의해 유도된 Mito-SA의 Mito-FF 로의 전환을 나타낸다.
다음으로, 피렌 여기 방법을 사용하여 Mito-SA의 임계 응집 농도 (CAC)를 분석하였다. 구체적으로, 피렌은 응집하지 않은 분자 개체로 존재할때와, 응집하여 존재할때 여기 (excitation) 스펙트럼에서의 344 nm와 339 nm 의 빛의 강도가 달라지게 되는데, 상기 344 nm와 339 nm에서의 여기 스펙트럼을 측정하고 344 nm와 339 nm 여기 스펙트럼의 비율을 구하여 도 2E의 표준곡선을 통해 Mito-FF 및 Mito-SA의 CAC값을 결정하였다. 그 결과, Mito-SA의 CAC는 ~5 μM로 나타났으며 이는 Mito-FF의 CAC 값인 ~60 μM와 비교할 때 훨씬 낮았다 (도 2E). 이러한 Mito-SA에 대해 관찰된 낮은 CAC 값은 Mito-SA에서 양쪽 이온의 강한 분자 내 상호 작용, 즉 카르복실레이트의 음전하와 TPP 모이어티의 양전하 사이의 상호 작용으로 인한 것일 수 있다.
또한, Mito-FF 및 Mito-SA의 표면을 제타 전위 (zeta potential)로 측정하였다. 그 결과, 표면 전하는 Mito-SA 및 Mito-FF에 대해 각각 -3.48±0.6 및 +43±1.3mV의 전하를 보여 주었으며, 이는 Mito-SA가 약간 음의 표면 전하로 미셀을 형성함을 나타낸다 (도 2F).
도 2는 Mito-SA의 특성을 나타낸 결과이다:
도 2A는 Mito-SA의 pH 반응성으로 인한 Mito-FF로의 변환을 HPLC 분석으로 확인한 그래프이고; 도 2B는 산성 pH에서 Mito-SA가 Mito-FF로 전환됨에 따라 섬유가 형성된 것을 나타낸 이미지이며; 도 2C는 미셀구조를 형성한 Mito-SA를 나타낸 이미지이고; 도 2D는 Mito-SA 및 Mito-FF의 크기 분포를 나타낸 그래프이며; 도 2E는 Mito-SA의 임계 응집 농도 (CAC)를 나타낸 그래프이고; 도 2F는 Mito-SA의 전하를 나타낸 그래프이다.
실험예 2. Mito-SA의 pH-감응성 원인 분석
산성 조건 하에서의 Mito-SA로부터의 숙신 기의 절단 메커니즘을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
분자 역학 (MD) 시뮬레이션을 통해 Mito-SA 분자의 구성을 사용하여, 숙신산 무수물 형성에서 히드로늄 이온 (H3O+) 및 TPP의 역할을 조사하기 위해 H3O+ 및 TPP 모이어티의 존재 또는 부존재 하에 밀도 함수 이론 (DFT) 계산을 수행했다.
구체적으로, 분자 역학 (MD) 시뮬레이션을 사용하여 Mito-SA의 안정한 분자 구조 및 응집 형태를 조사하였다. MD 시뮬레이션에서, COMPASS II 힘의 장(force field) 및 이의 고유 전하가 결합 및 비결합 상호 작용을 설명하기 위해 사용되었다. 시간 적분(time-integration)에 대한 시간 단계는 1 fs로 설정되었다. Mito-SA의 안정적인 형태를 찾기 위해 Mito-SA 분자는 298 ~ 500K의 온도에서 500ps 동안 어닐링되었고, 다음으로 298K에서 1ns NVT MD 시뮬레이션이 수행되었다. TPP 모이어티가 없는 Mito-SA 분자는 -P(C6H5)3를 -H로 치환하여 모델링하였다.
이론적 접근법을 통해 Mito-SA 분자에서 TPP 기의 pH-감응성 반응 및 효과를 조사하기 위한 DFT 계산은 Dmol 프로그램을 사용하여 수행되었다. All Electron 중심 처리와 함께 Perdew-Burke-Ernzerhof (PBE) 교환-상관 기능 및 DNP 4.4 기준 세트를 사용하였다. 분산력 보정을 위해 Tkatchenko-Scheffler 방식을 사용했다. 에너지, 힘 및 변위에 대한 수렴 기준은 각각 1x10-5 Ha, 0.002 Ha/Å 및 0.005 Å으로 설정되었다. 용매의 정전기 기여는 물의 유전 상수 (ε = 78.54)와 함께 전도체 유사 스크리닝 모델 (Conductor-like Screening Model: COSMO) 방법을 사용하여 설명되었다. 과당 수소화 메커니즘에서 전이 상태를 계산하기 위해, 완전한 단일 선형 동기 운송 (linear synchronous transit: LST) 및 2 차 동기 운송 (quadratic synchronous transit: QST) 방법을 사용했으며 근 평균 제곱 힘의 수렴 기준은 0.002 Ha/Å로 설정되었다.
그 결과, 계산된 형성 메커니즘은 2 단계 반응, 즉 무수물 고리 형성 및 C-N 결합 절단 반응을 따랐다 (도 3A). 첫 번째 단계에서, 아미드 카보닐의 탄소는 i) 카보닐 산소와 TPP 사이의 쌍극자-양이온 상호 작용, 그리고 ii) 히드로늄 양이온과 아민 상호 작용의 두 가지 효과에 의해 더 친전자성이 되었다 (도 3B). 이들 두 상호 작용은 카복실레이트가 카보닐 탄소 원자를 공격하여 숙신산 무수물 고리를 형성할 수 있게한다. 이 반응 단계에 대한 활성화 에너지 및 반응열은 각각 3.47 및 -1.15 kcal/mol 인 것으로 계산되었다. 이어서, 숙신산 무수물이 Mito-SA로부터 자발적으로 분리되어 Mito-FF를 형성하였고 이는 9.96kcal/mol의 에너지를 방출하였다. 그러나, TPP가 없을 때 첫 번째 단계에 필요한 활성화 에너지는 3.47kcal/mol에서 5.89kcal/mol로 증가했다. 반응열 측면에서, 숙신산 무수물의 고리 형성 및 전체 반응은 각각 0.77kcal/mol 및 9.07kcal/mol의 소량의 에너지를 방출하였다. 따라서, 3 차 아민에 연결된 카보닐기가 TPP 모이어티와 분자 내 상호 작용을 형성한 것을 고려하면, 분자 내 상호 작용은 반응 에너지를 안정화시킴으로써 반응을 가속화시키는 것으로 나타났다. 또한, H3O+ 및 TPP가 없으면, 카복실레이트는 친전자성이 카복실레이트로부터 전자를 수용하기에 좋지 않은 아미드 카보닐과 반응할 수 없고, 숙신산 무수물은 만들어지지 않았다. 즉, 안정적인 IM 상태는 관찰되지 않았다. 또한, 여러 Mito-SA 분자가 미셀에서와 같이 응집된 구조를 형성할 때, 카보닐과 TPP 간의 추가적인 분자간 상호 작용에 의해 TPP의 안정화 효과가 더욱 향상될 수 있다 (도 3C). Mito-SA 분자의 가능한 스태킹 구성을 고려하여, 6 개의 분자로 구성된 군집 구조는 진공 및 실온 조건에서 완화되었고 수화된 주변 조건에서 추가로 완화되었다. 응집된 구조는 TPP에서 C=O 그룹과 P 원자 사이의 쌍 분포 함수 [g(r)]에 의해 분석되었다 (도 3D). DFT 계산 결과를 고려할 때, 총 g(r)의 첫 번째 피크 (3-7Å의 거리 범위)는 무수물 형성 반응의 영역을 나타낸다. 총 g(r)가 분자 내 및 분자간 성분에 의해 분리될 때, 분자간 상호 작용은 g(r)의 짧은 범위 (대략 3-4Å)의 상당 부분을 차지하며, 이는 응집된 Mito-SA가 이웃하는 TPP 모이어티에 의해 더 영향을 받았다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 TPP와 산성 조건의 상승 효과가 Mito-SA의 pH-감응성 반응을 초래함을 나타낸다.
도 3은 Mito-SA의 pH-감응성을 분석한 결과이다:
도 3A는 TPP의 존재 또는 부존재하에서 Mito-SA에서 숙신산이 분리되어 Mito-FF가 형성되기까지의 에너지를 분석한 그래프이고; 도 3B는 Mito-SA에서 숙신산 무수물이 형성되는 메커니즘에서 Mito-SA의 초기 구조를 나타낸 이미지이며; 도 3C는 Mito-SA 분자 간 TPP 모이어티와 카보닐의 상호 작용을 나타낸 이미지이고; 도 3D는 쌍 분포 함수 (Pair distribution function)를 나타낸 그래프이다.
실험예 3. Mito-SA의 HeLa 및 NIH 3T3 미토콘드리아에 대한 영향 분석
HeLa 및 NIH 3T3 미토콘드리아에 대한 Mito-SA의 영향을 확인하기 위해 공 초점 이미징 실험을 수행하였다.
구체적으로, HeLa 및 NIH 3T3 세포를 10 % FBS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Life Technologies)에서 80 % 밀도로 Lab Teck II 슬라이드 챔버에 시딩하고 5 % CO2 하의 37 ℃에서 배양하였다. 24 시간 후, 세포를 추가 12 시간 동안 20 μM의 Mito-SA와 함께 배양하였다. HeLa 및 NIH 3T3 세포를 Mito Tracker Red FM, Mito-SOX Red, DHE 및 TMRM으로 표지하여, 미토콘드리아 단편화, 미토콘드리아 ROS 생성, 세포성 ROS 생성 및 미토콘드리아 탈분극을 각각 관찰하였다.
그 결과, Mito Tracker Red FM로 표지하여 미토콘드리아 단편화를 관찰한 경우에는, 미처리된 대조군과 비교하여 미토콘드리아 단편화 및 미토콘드리아로부터 세포질로 Mitotracker Red FM의 누출에 의해 나타난 바와 같이, HeLa 세포 미토콘드리아는 12 시간의 인큐베이션 후 심각한 손상을 나타냈다 (도 4A). 대조적으로, NIH 3T3 세포의 미토콘드리아는 Mito-SA로 처리한 후에, 미처리된 대조군 NIH 3T3 세포의 것과 유사한 Mitotracker Red FM으로부터 안정하고 영향을받지 않는 형광에 의해 나타난 바와 같이, 영향을 받지 않았다 (도 4B).
또한, 미토콘드리아 내에서 ROS의 과잉 생산을 유발하는지 여부는 Mito-SOX Red로 표지하고, 세포질 내에서 ROS를 생산하는지 여부는 디하이드로에티디움 (DHE)으로 표지하여 관찰하였다. 그 결과, HeLa 세포는 대조군과 비교하여 Mito-SA-처리 세포로부터 Mito-SOX 및 DHE 둘 다에 대해 밝은 적색 형광을 나타냈지만 (도 4C, E), NIH 3T3는 Mito-SA-처리된 세포와 처리되지 않은 대조군 세포 사이에 차이를 보이지 않았다 (도 4D, F). 이러한 결과는 FACS (fluorescence-activated cell sorting) 분석에 의해 뒷받침되었다 (도 5A, B, C, D).
다음으로, Mito-SA가 미토콘드리아 막 완전성에 어떤 변화를 유발했는지 여부를 관찰하기 위해, 우리는 미토콘드리아 막-탈분극 동안 사라지는 적색 형광으로 건강한 미토콘드리아를 염색하는 테트라메틸로다민, 메틸 에스테르 (TMRM)로 세포를 표지하였다. 그 결과, Mito-SA는 TMRM 형광의 손실에 의해 입증되는 바와 같이 12 시간 처리 후 HeLa 세포 미토콘드리아 막을 탈분극시킨 반면, NIH 3T3 세포는 Mito-SA로 처리한 후에도 TMRM의 적색 형광을 유지하였다. 이러한 결과는 Mito-SA가 정상 세포의 미토콘드리아에는 손상을 유발하지 않음을 나타낸다 (도 4G, H). FACS 분석은 이러한 결과를 뒷받침하였다 (도 5E, F).
도 4는 Mito-SA의 HeLa 및 NIH 3T3 세포의 미토콘드리아에 대한 영향을 나타낸 결과이다:
도 4A는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 Mito-Tracker Red FM으로 염색하여 미토콘드리아 단편화를 본 이미지이고; 도 4B는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 Mito-Tracker Red FM으로 염색하여 미토콘드리아 단편화를 본 이미지이며; 도 4C는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 미토콘드리아 내 ROS 발생을 본 이미지이고; 도 4D는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 미토콘드리아 내 ROS 발생을 본 이미지이며; 도 4E는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 DHE로 염색하여 세포질 내 ROS 발생을 본 이미지이고; 도 4F는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 DHE로 염색하여 세포질 내 ROS 발생을 본 이미지이며; 도 4G는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 TMRM으로 염색하여 미토콘드리아 막의 탈분극 발생 여부를 본 이미지이고; 도 4H는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 TMRM으로 염색하여 미토콘드리아 막의 탈분극 발생 여부를 본 이미지이다.
도 5는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 및 NIH 3T3 세포에 대한 영향을 FACS로 분석한 결과이다:
도 5A는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이고; 도 5B는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 Mito-SOX Red로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이며; 도 5C는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 DHE로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이고; 도 5D는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 DHE로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이며; 도 5E는 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 세포를 TMRM으로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이고; 도 5F는 Mito-SA를 처리한 후 NIH 3T3 세포를 TMRM으로 염색하여 FACS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
실험예 4. Mito-SA가 Mito-FF로 역자가조립 된 후 미토콘드리아 내에서의 섬유 형성 확인
미토콘드리아 내에서 미토콘드리아 손상 및 Mito-FF의 섬유 형성을 가시화하기 위해, NIH 3T3 및 HeLa 세포의 TEM 이미지를 분석하였다.
구체적으로, HeLa 및 NIH 3T3 세포를 15 mm 직경의 Theramanox 커버슬립 (Nrage Nunc International, NY) 상의 24-웰 플레이트에서 1 mL 혈청 포함 배지 중 80 % 밀도로 성장시켰다. 세포를 2 μM의 Mito-SA로 24 시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 실온에서 30 분 동안 4 % 포름알데히드를 사용하여 고정한 다음, 2 % 오스뮴 테트록사이드(OsO4)를 이용해 염색하였다. 이후 실온에서 30 분에 걸쳐 0.1M Na-PO4 완충제 + 5 % 수크로오스 (1mL)로 3 회 세척하였다. 보고된 프로토콜에 따라 세포의 TEM 샘플을 제조하여 TEM 이미지를 분석하였다.
그 결과, NIH 3T3 세포의 TEM 이미지는 Mito-SA로 처리한 후 모든 세포의 구성이 안정하다는 것을 보여주었다. 미토콘드리아는 건강한 것으로 관찰되었으며, 미토콘드리아 내막은 명확하게 보였다 (도 6A). 그러나, Mito-SA를 갖는 HeLa 세포는 처리되지 않은 HeLa 세포 대조군의 미토콘드리아와 비교하여(도 6B) 단편화 및 파손에 의해 심각한 미토콘드리아 손상을 나타냈다 (도 6C). 또한, ~9nm 직경의 Mito-FF 나노 섬유가 HeLa 세포 미토콘드리아 내에서 관찰되었으며, 이는 Mito-SA 미셀의 pH-감응성 형태 변형 및 결과적으로 미토콘드리아 내에서 나노 섬유로 자가 조립되는 암 세포 내부의 Mito-FF 분자의 내재화를 나타낸다 (도 6D). 또한 나노 섬유는 미토콘드리아 전체에서 관찰되었으며 이는 Mito-FF가 미토콘드리아 막을 관통하는 것을 나타낸다.
종양성 pH가 Mito-SA의 Mito-FF로의 형질 전환을 유도한다는 것을 추가로 확인하기 위해, Mito-SA로 처리한 후 HeLa 세포 용해물의 질량 스펙트럼을 분석하였다. 질량 스펙트럼 분석 결과, Mito-FF의 분자 질량에 해당하는 1054 (m/z)에서 피크의 출현이 나타났으며 (도 7A) 이는 Mito-SA의 pH-감응성 분열 후 세포 내부로 유입된 Mito-FF에 의해 세포 섬유가 생성됨을 나타낸다.
도 6은 Mito-SA를 처리한 후 HeLa 및 NIH 3T3 세포의 미토콘드리아에서 섬유 형성을 하는 지 확인한 결과이다:
도 6A는 Mito-SA를 처리한 NIH 3T3 세포를 나타낸 이미지이고; 도 6B는 Mito-SA가 처리되지 않은 HeLa 세포를 나타낸 이미지이며; 도 6C는 Mito-SA를 처리한 HeLa 세포를 나타낸 이미지이고; 도 6D는 Mito-SA를 처리한 HeLa 세포의 미토콘드리아 내에서 Mito-FF가 섬유 형성을 한 것을 나타낸 이미지이다.
도 7A는 Mito-SA를 처리한 HeLa 세포의 세포 용해물의 질량 스펙트럼을 분석한 그래프이다.
실험예 5. Mito-SA의 세포 독성 확인
Mito-SA의 세포 독성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. Mito-SA의 세포 독성은 HeLa 및 SaOS-2 (인간 골육종) 세포주에서 평가되었고 Mito-FF의 독성과 비교되었다.
그 결과, Mito-SA (pH 6.4) 및 Mito-FF는 72 시간의 배양 기간 동안 1.5μM의 IC50과 유사한 독성을 나타냈다. 분석 결과, Mito-SA의 독성이 Mito-FF의 독성과 유사한 것으로 나타났으며, 이는 Mtio-SA의 pH-유도 절단이 암 세포에서 Mito-FF를 활성화시키는 것을 나타낸다 (도 7B, C). 그러나, NIH 3T3 세포는 Mito-FF에 대한 세포 독성을 나타내는 반면, Mito-SA에 대해서는 100 % 생존하였다 (도 7D).
세포 사멸의 형태는 Mito-SA-처리된 세포를 아폽토시스/괴사 검출 염료 FITC 아넥신/PI로 라벨링함으로써 조사하였다. 구체적으로, HeLa 세포를 5 % CO2 하의 37 ℃에서 10 % FBS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Life Technologies)에서 80 % 밀도로 Lab Tek II 슬라이드 챔버에 시딩하였다. 이어서, 세포를 24 시간 동안 20 μM의 Mito-SA와 배양하였다. 이어서, 세포 배양 배지를 1 ml의 아넥신 결합 완충액 중 Alexa Fluor 488-컨쥬게이션된 아넥신 V 및 PI로 교체하고 37 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. 이어서 세포를 부드럽게 세척하고, 배지를 DMEM 배지로 교체하고, LSM780 레이저 공 초점 스캐닝 현미경을 사용하여 세포를 분석하였다.
그 결과, Mito-SA 처리된 HeLa 세포로부터 FITC-아넥신의 녹색 형광의 출현을 나타내었고 이는 초기 아폽토시스를 나타낸다. 그러나, NIH 3T3 세포는 아폽토시스의 징후를 보이지 않았으며, 이는 정상적인 세포를 건강하게 유지하면서 Mito-SA가 선택적 암 세포 사멸을 유도함을 나타낸다 (도 8).
도 7B는 HeLa 세포에 대한 Mito-SA의 세포 독성을 분석한 그래프이며; 도 7C는 SaOS-2 세포에 대한 Mito-SA의 세포 독성을 분석한 그래프이고; 도 7D는 NIH 3T3 세포에 대한 Mito-SA의 세포 독성을 분석한 그래프이다.
도 8은 Mito-SA를 처리한 HeLa 및 NIH 3T3 세포를 FITC 아넥신/PI로 염색한 결과이다.
실험예 6. Mito-SA의 인 비보(in vivo) 항종양 효과 확인
생체 내에서 Mito-SA에 의한 치료 효능을 분석하기 위해 종양 억제 정도를 관찰하였다.
구체적으로, 마우스에 대한 모든 실험은 한국 과학 기술원 (KIST) 지침에 따라 수행되었다. 동물 실험의 경우, Balb/c 누드 마우스 (남성, 5 주령; 오리엔트바이오, 한국)를 복강 내 경로로 Zoletil-Rompun의 혼합물로 마취시켰다. HT-29 (인간 결장 직장 선암종) 세포 (1.0×107 세포)를 마우스에 피하 주사하여 종양을 확립하였다. 종양 확립 후 (70-100 mm3 부피, ~3 주), 10 %의 DMSO를 포함하는 60 μL의 PBS (pH7.4) 중 펩티드 (5 mg/kg)를 종양 조직의 주변 종양에 주사하였다. 이 작업은 2 일마다 2 주 동안 총 7 번 반복되었다. 종양 부피는 a×b2/2로 추산되고 계산되었으며, 여기서 a 및 b는 각각 가장 큰 직경 및 가장 작은 직경이다. 처리 기간 동안 마우스의 체중을 모니터링하여 펩티드의 생체 내 독성을 확인하였다.
그 결과, Mito-FF와 Mito-SA는 종양 성장을 억제했다. 그러나, Mito-SA는 Mito-FF와 비교하여 상당한 종양 성장 억제 및 종양의 완전한 제거를 나타냈다 (도 9A, B). 이러한 결과는 Mito-SA의 종양 표적화 효율이 높기 때문이다. 치료 기간 동안, 모든 실험군은 대조군과 비교하여 현저한 체중 감소를 나타내지 않았으며, 이는 국소 투여된 펩티드의 최소 전신 독성을 나타낸다.
Mito-SA의 높은 종양 감소 능력으로 인해 정상 조직에 대한 독성을 테스트 하기 위한 실험을 수행하였다. 조직학적 분석을 위해, 펩티드를 2 일 동안 동물 모델의 피부에 국소적으로 적용하였다. 염증 양성 대조군 마우스에는 PBS (pH 7.4) 중 5 % 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 용액을 처리했다. 대표적인 동물의 피부 조직을 절제하고, 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)에 고정시키고, 슬라이드상에서 10 μm로 절단하였다. 피부 조직을 절단한 후, 시료를 헤마톡실린 및 에오신 (hematoxylin and eosin: H&E), 플록신 및 타르트라진 (Phloxine & Tartrazine: P/T) 및 메이슨 트리크롬 (masson's trichrome: M/T) 염색을 하였다.
그 결과, 도 9C에 도시된 바와 같이, SDS 또는 Mito-FF 처리된 마우스의 피부 외관은 Mito-SA 처리된 피부와 달리 발적 및 딱지 형성과 같은 피부염의 현저한 징후를 나타냈다. 피부의 조직학적 검사 또한 Mito-SA 처리된 피부가 다른 군에 비해 염증성 조직 손상의 징후가 상당히 감소되었음을 보여주었다 (도 9D). 일반적인 형태 (H & E)는 Mito-SA가 SDS 및 Mito-FF에서 관찰된 결함있는 표피 장벽과 비교하여 피부에 가장 적은 손상을 일으킨다는 것을 나타냈다. P/T 염색은 혈관 신생이 SDS 또는 Mito-FF 처리된 군에서의 염증에 의해 촉진되었음을 나타냈으며, 이는 Mito-SA 처리된 군에서 현저하게 덜 두드러졌다. 또한, M/T 염색은 콜라겐 섬유가 결합 조직에서 결함을 일으킨 다른 군과 비교하여 Mito-SA 처리된 피부층에서 가장 풍부하고 온전한 것으로 나타났다.
이러한 결과는 정상 조직에 대한 Mito-SA의 최소 독성을 나타낸다.
도 9는 인 비보(in vivo)에서의 Mito-SA의 항종양 효과를 나타낸 결과이다:
도 9A는 종양이 확립된 마우스에 Mito-SA를 처리한 뒤의 종양 부피를 나타낸 그래프이고; 도 9B는 종양이 확립된 마우스에 Mito-SA를 처리한 뒤의 종양을 나타낸 사진이며; 도 9C는 종양이 확립되지 않은 마우스에 Mito-SA를 처리하여 정상 조직에 대한 독성이 있는지 확인한 사진이고; 도 9D는 종양이 확립되지 않은 마우스에 Mito-SA를 처리하여 H&E, P/T, M/T 염색된 조직을 관찰한 이미지이다.

Claims (18)

  1. 미토콘드리아 표적화 모이어티 및 (Xaa)n-Lys로 표시되는 펩타이드를 포함하고, 상기 미토콘드리아 표적화 모이어티는 상기 펩타이드의 리신 아미노산에 연결되어 있는 것이고,
    상기 n은 펩타이드 결합을 통하여 연결된 아미노산 Xaa의 개수로서, 2 내지 200의 정수이고,
    상기 Xaa는 각각 독립적으로 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판 및 이들의 C3-C10 사이클로알킬 결합 변이체로 이루어진 군에서 선택되며,
    상기 아미노산은 2개 이상의 아미노산 사이에 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 형성하는 것이고,
    상기 펩타이드는 베타 쉬트 (beta-sheet) 2차 구조를 포함하는 것이며,
    상기 펩타이드는 숙신산 (succinic acid)를 포함하는 것인, 접합체 (conjugate).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 n은 2이고, 상기 아미노산은 페닐알라닌, 알라닌, 사이클로헥실 알라닌, 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 것으로서, 서로 동일한 것인, 접합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 리신의 C-말단 카르복실기의 하이드록시기는 아민, 알킬기, 알코올기, 케톤기, 아실기, 에스터기, 에테르기, 아세틸기, 아실 할라이드기, 및 알데하이드기로 이루어진 군에서 선택된 것과 치환된 것인, 접합체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드에 연결된 미토콘드리아 표적화 모이어티의 개수는 1 내지 상기 (Xaa)n-Lys로 표시되는 펩타이드에 존재하는 아민기 개수 범위에서 선택된 정수인 것인, 접합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화 모이어티는 TPP (triphenylphosphonium)인 것인, 접합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드와 미토콘드리아 표적화 모이어티는 직접 또는 링커를 통하여 연결된 것인, 접합체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 형광단 (fluorophore)을 추가로 포함하고, 상기 형광단은 상기 펩타이드에 연결된 것인, 접합체.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 형광단은 상기 펩타이드의 N-말단에 아마이드 결합으로 연결된 것인, 접합체.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 형광단은 pyrene, NBD (4-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole), perylene, naphtalene, 및 coronene으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 접합체.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 숙신산은 상기 펩타이드의 리신 아미노산에 연결된 것인, 접합체.
  11. 청구항 7에 있어서, 화학식 2의 구조를 갖는 것인, 접합체.
    [화학식 2]
    Figure pat00003
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 접합체는 자가조립되어 미셀 (micelle)구조를 형성하는 것인, 접합체.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 접합체는 pH 감응성이 있어, pH에 따라 구조가 변화하는 것인, 접합체.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 접합체는 산성 조건에서 숙신산이 분리되는 것인, 접합체.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 미셀 구조는 산성 조건에서 역자가조립 되는 것인, 접합체.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 접합체는 자가조립 및 역자가조립 구조 변화를 통해 암 세포를 특이적으로 표적하는 것인, 접합체.
  17. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 접합체를 유효성분으로 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 약학적 조성물의 상기 접합체는 암 세포에서 역자가조립되어 암 세포 내 미토콘드리아에서 세포 자멸 (Apoptosis)을 유도하는 것인, 약학적 조성물.
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