KR20220005058A - 항-bcma 항체 접합체, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

항-bcma 항체 접합체, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 BCMA (BCMA) 및 그의 이소형 및 상동체에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 접합체, 및 항체 접합체를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)에 관한 것이다. 또한, 항체 접합체 및 조성물을 생산하는 방법 뿐만 아니라, 예컨대 치료 및 진단 방법에서 항체 접합체 및 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

항-BCMA 항체 접합체, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 제조 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/843,226의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2020년 4월 28일에 생성되고 30,207 바이트의 크기를 갖는, 본 출원과 함께 텍스트 파일명 14247-525-228_SEQ_LISTING.txt로 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.
발명의 분야
B-세포 성숙 항원 (BCMA)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 접합체 및 항체 접합체를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함), 접합체를 생산하는 방법, 및 요법을 위해 접합체 및 조성물을 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 접합체 및 조성물은 세포 증식 및 암의 치료 및 예방 방법, 세포 증식 및 암의 검출 방법, 및 세포 증식 및 암의 진단 방법에 유용하다. 접합체 및 조성물은 또한 자가면역 질환 및 감염성 질환의 치료, 예방, 검출, 및 진단 방법에 유용하다.
B-세포 성숙 항원 (BCMA)은 B-세포 활성화 인자를 인식하는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 인간에서의 단백질은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 17 (TNFRSF17) 유전자에 의해 코딩되고, 성숙 B 림프구에서 우선적으로 발현된다.
BCMA는 B-세포 성숙 및 형질 세포로의 분화를 조절하는데 중요한 역할을 한다. 이는 BAFF 수용체 (BAFF-R) 및 막횡단 활성화제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드 상호작용자 (TACI)와 밀접하게 관련된다. BCMA, BAFF-R, 및 TACI는 별개의 발생 단계에서 B-세포 생존을 촉진하는 유형 III 막횡단 단백질이지만, BCMA는 B-세포 계통 세포, 예컨대 예를 들어 형질모구 및 분화된 형질 세포에서 독점적으로 발현된다 (Avery et al., (2003) J. Clin. Invest. 112(2):286-297; O'Connor et al., (2004) J. Exp. Med. 199(1):91-98). 이는 형질 세포 분화 동안 선택적으로 유도되고, 이는 분화된 세포에서 BAFF-R 발현의 상실과 공동으로 발생한다 (Darce et al., (2007) J. Immunol. 178(9):5612-5622). BCMA 발현은 정상 형질 세포 및 형질모구의 생존을 지지하는 것으로 보이지만, 전형적으로 나이브 및 대부분의 기억 B 세포 상에는 부재한다. 따라서, 이는 전체 B-세포 항상성을 위해 필요한 것으로 보이지는 않지만, 골수 내의 수명이 긴 형질 세포의 최적 생존을 위해 요구된다 (O'Connor et al., (2004) 상기 문헌; Xu, S. and K.P. Lam (2001) Mol. Cell. Biol. 21(12):4067-4074).
다발성 골수종에서, BCMA는 악성 형질 세포에서 상승된 수준으로 보편적이고 폭넓게 발현되는 것으로 밝혀졌지만; 이는 전형적으로 형질 세포를 제외한 정상 인간 조직에서는 검출되지 않는다. 다발성 골수종 세포주 상에서의 세포-표면 수용체로서의 그의 선택적 발현으로 인해, BCMA는 다발성 골수종을 치료하기 위한 요법에서 잠재적으로 표적화될 수 있다. BCMA 발현은 또한 백혈병 및 림프종과 연관된다. 따라서, BCMA의 활성을 표적화 및/또는 조정하는 개선된 방법에 대한 필요가 존재한다. 형질 세포 상에서의 BCMA의 특이적 발현 및 비-암 조직에서의 보다 낮은 발현을 고려하면, BCMA를 발현하거나 과다발현하는 세포 및 조직을 특이적으로 표적화할 수 있는 개선된 치료에 대한 필요가 존재한다. BCMA에 대한 항체 접합체는 치료 또는 진단 페이로드 모이어티를 이러한 질환의 치료 또는 진단을 위해 BCMA를 발현하는 표적 세포에 전달하는데 사용될 수 있다.
B-세포 성숙 항원 (BCMA)에 선택적으로 결합하는 항체 접합체가 본원에 제공된다. 항체 접합체는 1개 이상의 페이로드 모이어티에 연결된, BCMA에 결합하는 항체를 포함한다. 항체는 링커에 의해 페이로드에 연결된다. BCMA 항체는 유용한 페이로드 모이어티 및 유용한 링커와 같이 본원에 상세히 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 항체 접합체를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다. 임의의 적합한 제약 조성물이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구 투여용 조성물이다. 추가 측면에서, 항체 접합체 또는 제약 조성물을 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 항-BCMA 항체 접합체를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 1개 이상의 페이로드 모이어티를 BCMA를 발현하는 표적 세포 또는 조직에 전달하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료 방법이다. 일부 실시양태에서, 방법은 진단 방법이다. 일부 실시양태에서, 방법은 분석 방법이다. 일부 실시양태에서, 항체 접합체는 질환 또는 상태를 치료하는데 사용된다. 일부 측면에서, 질환 또는 상태는 암, 자가면역 질환, 및 감염으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체 접합체는 인간 BCMA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 접합체는 또한 인간 BCMA의 상동체에 결합한다. 일부 측면에서, 항체 접합체는 또한 시노몰구스 원숭이 및/또는 마우스 BCMA에 결합한다.
특정 실시양태에서, 하기 화학식에 따른 항체 접합체가 본원에 제공되며:
Figure pct00001
여기서 n은 1 내지 4이고; 항체는 서열식별번호: 13의 VH 영역 및 서열식별번호: 14의 VL 영역을 포함하고; 항체는 EU 넘버링 스킴에 따른 각각의 부위 HC-F404 및 HC-Y180에서 치환된 p-아지도메틸-페닐알라닌의 잔기를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 화학식의 괄호 내의 각각의 구조는 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기 중 하나에서 항체에 결합된다. 다른 실시양태에서, 항체는 (i) 서열식별번호: 5 또는 6을 포함하는 CDR1; 서열식별번호: 7 또는 8을 포함하는 CDR2; 서열식별번호: 9를 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역; 및 (ii) 서열식별번호: 10을 포함하는 CDR1; 서열식별번호: 11을 포함하는 CDR2; 및 서열식별번호: 12를 포함하는 CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 항체 접합체의 보다 구체적인 실시양태에서, n은 1, 2, 3 또는 4이다. 특정한 실시양태에서, 항체 접합체는 적어도 1개의 불변 영역 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 구체적 실시양태에서, 항체 접합체는 예를 들어 인간 불변 영역 도메인을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 항체 접합체는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역, 인간 IgG1 카파 경쇄 영역, 또는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 IgG1 카파 경쇄 영역을 포함하는 불변 영역 도메인을 포함한다. 항체 접합체의 보다 구체적인 실시양태에서, 불변 영역은 서열식별번호: 19 및 20, 또는 서열식별번호: 19 및 서열식별번호: 20 둘 다로부터 선택된 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 접합체는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 예를 들어, 항체 접합체는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 EU 넘버링 스킴에 따른 HC-F404 및 HC-Y180에 상응하는 각각의 아미노산은 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기로 치환되었다. 다른 실시양태에서, 항체 접합체는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 접합체는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 예를 들어, 항체 접합체는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 EU 넘버링 스킴에 따른 중쇄 (HC)-F404 및 HC-Y180에 상응하는 각각의 아미노산은 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기로 치환되었다.
본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM이다. 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 항체는 인간화 또는 인간 항체이다. 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 항체는 비-글리코실화된다. 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, scFv (sFv) 단편, 또는 scFv-Fc 단편이다. 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 항체는 인간 BCMA 및 시노몰구스 BCMA에 특이적으로 결합한다. 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 항체는 인간 BCMA 및 마우스 BCMA에 특이적으로 결합한다.
추가로 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것 및 항체 접합체의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 구체적 실시양태에서, 항체 접합체는 동결건조된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 키트는 동결건조된 항체의 재구성을 위한 유체를 추가로 포함한다.
추가로 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다.
추가로 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것 또는 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 암이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 백혈병 또는 림프종이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 다발성 골수종이다. 구체적 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 국제 병기결정 시스템 또는 개정된 국제 병기결정 시스템에 따른 I기, II기, 또는 III기이다. 특정 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 새로 진단된 다발성 골수종이다. 다른 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 재발성 또는 불응성 다발성 골수종이다.
추가로 질환 또는 상태의 진단을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 상태를 진단하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 암이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 백혈병 또는 림프종이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 다발성 골수종이다. 구체적 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 국제 병기결정 시스템 또는 개정된 국제 병기결정 시스템에 따른 I기, II기, 또는 III기이다. 특정 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 새로 진단된 다발성 골수종이다. 다른 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 재발성 또는 불응성 다발성 골수종이다.
도 1은 CDR-H1에 대한 카바트 및 코티아 넘버링 시스템의 비교를 제공한다. 이는 문헌 [Martin A.C.R. (2010). Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In R. Kontermann & S. Duebel (Eds.), Antibody Engineering vol. 2 (pp. 33-51). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg]로부터 적합화되었다.
도 2는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 ARP-1 다발성 골수종 종양이 이식된 마우스에서의 체중 변화를 예시하는 그래프이다.
도 3a 및 3b는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 ARP-1 다발성 골수종 종양이 이식된 마우스에서의 종양 성장 곡선 및 종양 크기를 예시하는 그래프이다.
도 4는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 MM.1S 다발성 골수종 세포가 이식된 마우스에서의 체중 변화를 예시하는 그래프이다.
도 5는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 MM.1S 다발성 골수종 세포가 이식된 마우스에서의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시하는 그래프이다.
도 6은 본원에 개시된 바와 같은 BCMA 항체-약물 접합체, 다라투무맙, 벨케이드, 또는 그의 상이한 조합의 단일 용량의 투여 후 MM.1S 다발성 골수종 세포가 이식된 마우스에서의 카플란-마이어 생존 플롯을 예시하는 그래프이다.
도 7a-7c는 본원에 개시된 바와 같은 다라투무맙 또는 벨케이드와 함께 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 MM.1S 다발성 골수종 세포가 이식된 마우스에서의 생존 플롯을 예시하는 그래프이다.
도 8a 및 8b는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 농도의 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 MM.1S 다발성 골수종 세포가 이식된 마우스에서의 카플란-마이어 생존 플롯 및 생존 플롯을 예시하는 그래프이다.
도 9는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 용량의 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 ARP-1 다발성 골수종 종양이 이식된 마우스에서의 체중 변화를 예시하는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 용량의 BCMA 항체-약물 접합체의 단일 용량의 투여 후 ARP-1 다발성 골수종 종양이 이식된 마우스에서의 종양 성장 곡선 및 종양 크기를 예시하는 그래프이다.
도 11은 PBS, 인간, 마우스, 및 시노몰구스 혈장에서의 시간 경과에 따른 접합체 4의 평균 DAR을 예시하는 그래프이다.
도 12는 인간 BCMA, BAFF-R, 및 TACI 수용체를 발현하는 세포에 대한 접합체 4 및 접합체 1의 세포 결합을 예시하는 그래프를 제공한다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 관련 기술분야 용어, 표기법 및 다른 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에서 이러한 정의의 포함은 반드시 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것에 비해 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되고, 예를 들어 문헌 [Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed. (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons]에 기재된 널리 사용되는 분자 클로닝 방법론과 같은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 통상적인 방법론을 사용하여 통상적으로 사용된다. 적절하게는, 상업적으로 입수가능한 키트 및 시약의 사용을 수반하는 절차는 달리 나타내지 않는 한 제조업체-규정된 프로토콜 및 조건에 따라 일반적으로 수행된다.
본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
용어 "약"은 나타낸 값 및 그러한 값 초과 및 미만의 범위를 나타내고 포괄한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 10%, ± 5%, 또는 ± 1%를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 그러한 값의 1 표준 편차를 나타낸다.
용어 "그의 조합"은 용어가 지칭하는 요소의 모든 가능한 조합을 포함한다. 예를 들어, "α2가 A인 경우에, α3은 D가 아니거나; α5는 S가 아니거나; 또는 α6은 S가 아니거나; 또는 그의 조합이다"라고 언급된 문장은 α2가 A인 경우에 하기 조합을 포함한다: (1) α3은 D가 아니고; (2) α5는 S가 아니고; (3) α6은 S가 아니고; (4) α3은 D가 아니고; α5는 S가 아니고; α6은 S가 아니고; (5) α3은 D가 아니고, α5는 S가 아니고; (6) α3은 D가 아니고, α6은 S가 아니고; (7) α5는 S가 아니고, α6은 S가 아니다.
용어 "BCMA" 및 "B-세포 성숙 항원"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. BCMA는 또한, 특히 BCM, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 17 ("TNFRSF17"), CD269, TNFRSF13A, 및 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 17을 포함하는 동의어로도 공지되어 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어는 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 또는 BCMA 또는 BCMA 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현되는 인간 BCMA의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 포함한다. BCMA 단백질은, 예를 들어 인간 BCMA 이소형 1 (서열식별번호: 1) 및 인간 BCMA 이소형 2 (서열식별번호: 2)를 포함한다. 일부 실시양태에서, BCMA 단백질은 시노몰구스 원숭이 BCMA (서열식별번호: 3)를 포함한다. 일부 실시양태에서, BCMA 단백질은 뮤린 BCMA (서열식별번호: 4)를 포함한다.
용어 "이뮤노글로불린"은 일반적으로 2쌍의 폴리펩티드 쇄: 1쌍의 경쇄 (L) 및 1쌍의 중쇄 (H)를 포함하는 구조적으로 관련된 단백질의 부류를 지칭한다. "무손상 이뮤노글로불린"에서, 모든 4개의 이들 쇄는 디술피드 결합에 의해 상호연결된다. 이뮤노글로불린의 구조는 잘 특징화되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Paul, Fundamental Immunology 7th ed., Ch. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]를 참조한다. 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (VH 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH 또는 CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 CH1 (또는 CH1), CH2 (또는 CH2), 및 CH3 (또는 CH3)으로 약칭되는 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (VL 또는 VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 CL 또는 CL로 약칭되는 1개의 도메인을 포함한다.
용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자의 유형을 기재하고, 본원에서 그의 가장 넓은 의미로 사용된다. 항체는 구체적으로 무손상 항체 (예를 들어, 무손상 이뮤노글로불린) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 적어도 1개의 항원-결합 도메인을 포함한다. 항원-결합 도메인의 한 예는 VH-VL 이량체에 의해 형성된 항원 결합 도메인이다. "BCMA 항체", "항-BCMA 항체", "BCMA Ab", "BCMA-특이적 항체", "항-BCMA Ab", "BCMA 항체", "항-BCMA 항체", "BCMA Ab", "BCMA-특이적 항체", 또는 "항-BCMA Ab", 또는 "BCMA"가 "TNFSF17"에 의해 치환된 이들 어구의 임의의 반복은 BCMA에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 바와 같은 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 BCMA의 세포외 도메인에 결합한다.
VH 및 VL 영역은 보다 보존된 영역 사이에 배치된 초가변성의 영역 ("초가변 영역 (HVR);" 또한 "상보성 결정 영역" (CDR)으로도 불림)으로 추가로 세분될 수 있다. 보다 보존된 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 각각의 VH 및 VL은 일반적으로 하기 순서로 (N-말단에서 C-말단으로) 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. CDR은 항원 결합에 수반되고, 항체의 항원 특이성 및 결합 친화도에 영향을 미친다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]를 참조하고, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
임의의 척추동물 종으로부터의 경쇄는 불변 도메인의 서열에 기초하여 카파 및 람다로 불리는 2가지 유형 중 1가지에 배정될 수 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 중쇄는 5가지의 상이한 부류 (또는 이소형): IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 중 1가지에 배정될 수 있다. 이들 부류는 또한 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지정된다. IgG 및 IgA 부류는 서열 및 기능의 차이에 기초하여 하위부류로 추가로 분류된다. 인간은 하기 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
CDR의 아미노산 서열 경계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌 ("카바트" 넘버링 스킴); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948 ("코티아" 넘버링 스킴); MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 ("접촉" 넘버링 스킴); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 ("IMGT" 넘버링 스킴); 및 Honegge and Plueckthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70 ("AHo" 넘버링 스킴)]에 기재된 것을 포함한 다수의 공지된 넘버링 스킴 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
표 1은 카바트 및 코티아 스킴에 의해 확인된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 위치를 제공한다. CDR-H1의 경우, 잔기 넘버링은 카바트 및 코티아 넘버링 스킴 둘 다를 사용하여 제공된다.
표 1. 카바트 및 코티아 넘버링 스킴에 따른 CDR에서의 잔기.
Figure pct00002
* CDR-H1의 C-말단은, 카바트 넘버링 관례를 사용하여 넘버링되는 경우에, 도 1에 예시된 바와 같이 CDR의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 특정한 CDR의 확인에 사용된 넘버링 스킴은 카바트/코티아 넘버링 스킴이다. 이들 2개의 넘버링 스킴에 의해 포괄되는 잔기가 분기되는 경우에 (예를 들어, CDR-H1 및/또는 CDR-H2), 넘버링 스킴은 카바트 또는 코티아로서 명시된다. 편의상, CDR-H3은 때때로 본원에서 카바트 또는 코티아로서 지칭된다. 그러나, 이는 존재하지 않는 서열에서의 차이를 암시하는 것으로 의도되지 않으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 서열을 검사함으로써 서열이 동일한지 또는 상이한지를 용이하게 확인할 수 있다.
CDR은, 예를 들어 항체 넘버링 소프트웨어, 예컨대 www.bioinf.org.uk/abs/abnum/에서 입수가능하고 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Abhinandan and Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839]에 기재되어 있는 Abnum을 사용하여 배정될 수 있다.
"EU 넘버링 스킴"은 일반적으로 항체 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, [Kabat et al., 상기 문헌]에 보고된 바와 같음). 달리 언급되지 않는 한, EU 넘버링 스킴은 본원에 기재된 항체 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는데 사용된다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 예컨대 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, scFv (sFv) 단편, 및 scFv-Fc 단편을 포함한다.
"Fv" 단편은 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 비-공유-연결된 이량체를 포함한다.
"Fab" 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 더하여, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab 단편은 예를 들어 재조합 방법에 의해 또는 전장 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다.
"F(ab')2" 단편은 힌지 영역 근처에서 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 함유한다. F(ab')2 단편은 예를 들어 재조합 방법에 의해 또는 무손상 항체의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있다. F(ab') 단편은, 예를 들어 β-메르캅토에탄올에 의한 처리에 의해 해리될 수 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. VH 및 VL은 일반적으로 펩티드 링커에 의해 연결된다. 문헌 [Plueckthun A. (1994)]를 참조한다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 26이다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 27이다. 문헌 [Antibodies from Escherichia coli. In Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, New York], 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
"scFv-Fc" 단편은 Fc 도메인에 부착된 scFv를 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 scFv의 C-말단에 부착될 수 있다. Fc 도메인은 scFv 내의 가변 도메인의 배향에 따라 VH 또는 VL에 이어질 수 있다 (즉, VH-VL 또는 VL-VH). 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 적합한 Fc 도메인이 사용될 수 있다. 일부 경우에, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG1 Fc 도메인은 서열식별번호: 19 또는 그의 부분을 포함한다. 서열식별번호: 19는 인간 IgG1 불변 영역의 CH1, CH2, 및 CH3의 서열을 제공한다.
용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터의 항체를 지칭한다. 실질적으로 동종 항체의 집단은, 모노클로날 항체의 생산 동안 정상적으로 발생할 수 있는 변이체를 제외하고, 실질적으로 유사하고 동일한 에피토프(들)에 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 변이체는 일반적으로 단지 미량으로 존재한다. 모노클로날 항체는 전형적으로 복수의 항체로부터 단일 항체를 선택하는 것을 포함하는 과정에 의해 수득된다. 예를 들어, 선택 과정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론, 효모 클론, 박테리아 클론, 또는 다른 재조합 DNA 클론의 풀로부터의 고유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 항체는, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키기 위해 ("친화도 성숙"), 항체를 인간화하기 위해, 세포 배양물에서의 그의 생산을 개선시키기 위해, 및/또는 대상체에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해 추가로 변경될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 한편 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
비-인간 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 인간화 항체는 일반적으로 1개 이상의 CDR로부터의 잔기가 비-인간 항체 (공여자 항체)의 1개 이상의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 공여자 항체는 목적하는 특이성, 친화도, 또는 생물학적 효과를 갖는 임의의 적합한 비-인간 항체, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 닭, 또는 비-인간 영장류 항체일 수 있다. 일부 경우에, 수용자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여자 항체로부터의 상응하는 프레임워크 영역 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 기능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어질 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596]를 참조하고, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 인간 항체-코딩 서열 (예를 들어, 인간 공급원으로부터 수득되거나 신생 설계됨)을 이용한 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체는 구체적으로 인간화 항체를 제외한다.
"단리된 항체"는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 천연 환경의 성분은 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 쿠마시 블루 또는 은 염색에 의한 검출과 함께, 환원 또는 비환원 조건 하의 겔 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE)에 의해 균질하게 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 항체는 적어도 1개의 정제 단계에 의해 제조된다.
일부 실시양태에서, 단리된 항체는 적어도 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 또는 99 중량%로 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 적어도 80 부피%, 85 부피%, 90 부피%, 95 부피%, 또는 99 부피%로 정제된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 적어도 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 98 중량%, 99 중량% 내지 100 중량%를 포함하는 용액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 적어도 85 부피%, 90 부피%, 95 부피%, 98 부피%, 99 부피% 내지 100 부피%를 포함하는 용액으로서 제공된다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 해리 상수 (KD)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함한 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술, 예컨대 비아코어(Biacore)® 기기를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도는 25℃에서 결정된다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정한 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 표적) 또는 특정한 항원 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합한다", "특이적", "선택적으로 결합한다", 및 "선택적"은 비-특이적 또는 비-선택적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정될 수 있다. 특이적 결합은 또한 표적 상의 항체 결합 부위를 모방한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 그러한 경우에, 표적에 대한 항체의 결합이 대조군 분자에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에 특이적 결합이 표시된다.
본원에 사용된 용어 "kd" 또는 "kd" (sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율 상수를 지칭한다. 이 값은 또한 koff 값으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "ka" 또는 "ka" (M-1xsec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률 상수를 지칭한다. 이 값은 또한 kon 값으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "KD" (또한 "Kd" 또는 "KD"로도 지칭됨, M 또는 nM)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. KD = kd/ka. KD의 값은 전형적으로, 단백질 분자의 절반이 평형 상태에서 리간드에 결합되는 리간드의 농도와 크기상 동등하다.
본원에 사용된 용어 "KA" 또는 "Ka" (M-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭한다. KA = ka/kd.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 그의 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 발생시키는, 1개 이상의 CDR 또는 FR에서 1개 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 피코몰 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., (Bio/Technology, 1992, 10:779-783, 그 전문이 참조로 포함됨)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어, 문헌 [Barbas et al., (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91:3809-3813); Schier et al., Gene, 1995, 169:147-155; Yelton et al., J. Immunol., 1995, 155:1994-2004; Jackson et al., J. Immunol., 1995, 154:3310-33199; 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol., 1992, 226:889-896]에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
2종 이상의 항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "와 경쟁하다" 또는 "와 교차-경쟁하다"는 2종 이상의 항체가 항원 (예를 들어, BCMA)에 대한 결합에 대해 경쟁한다는 것을 나타낸다. 하나의 예시적인 검정에서, BCMA는 플레이트 상에 코팅되고, 제1 항체가 결합되도록 허용되며, 그 후 제2의, 표지된 항체가 첨가된다. 제1 항체의 존재가 제2 항체의 결합을 감소시키는 경우에, 항체는 경쟁한다. 또 다른 예시적인 검정에서, 제1 항체가 플레이트 상에 코팅되고, 항원이 결합되도록 허용되며, 이어서 제2 항체가 첨가한다. 용어 "와 경쟁하다"는 또한 하나의 항체가 또 다른 항체의 결합을 감소시키지만, 항체가 역순으로 첨가되는 경우에는 경쟁이 관찰되지 않는 항체의 조합을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항체는 이들이 첨가되는 순서에 관계없이 서로의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 하나의 항체는 또 다른 항체의 그의 항원에 대한 결합을 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 감소시킨다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 빈번하게 표면-접근가능한 아미노산 잔기 및/또는 당 측쇄로 이루어지고, 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 전자에 대한 결합은 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 수반되는 아미노산 잔기, 및 결합에 직접 수반되지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 항체가 결합하는 에피토프는 에피토프 결정을 위한 공지된 기술, 예컨대 예를 들어 상이한 점-돌연변이를 갖는 BCMA의 변이체에 대한 항체 결합에 대한 시험을 사용하여 결정될 수 있다.
폴리펩티드 서열과 참조 서열 사이의 퍼센트 "동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후의, 참조 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN), 메갈라인(MEGALIGN) (디엔에이스타(DNASTAR)), 클러스탈W(CLUSTALW), 클러스탈 오메가(CLUSTAL OMEGA), 또는 머슬(MUSCLE) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
"보존적 치환" 또는 "보존적 아미노산 치환"은 화학적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 지칭한다. 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 치환을 갖는 폴리펩티드 서열은 "보존적으로 변형된 변이체"로 공지되어 있다. 예로서, 표 2-4에 제공된 아미노산의 군은, 일부 실시양태에서, 서로에 대한 보존적 치환으로 간주된다.
표 2. 특정 실시양태에서, 서로에 대해 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 선택된 군.
Figure pct00003
표 3. 특정 실시양태에서, 서로에 대해 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 추가의 선택된 군.
Figure pct00004
표 4. 특정 실시양태에서, 서로에 대해 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 추가적인 선택된 군.
Figure pct00005
추가의 보존적 치환은, 예를 들어 문헌 [Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd ed. (1993) W. H. Freeman & Co., New York, NY]에서 찾아볼 수 있다. 모 항체에서 아미노산 잔기의 1개 이상의 보존적 치환을 만드는 것에 의해 생성되는 항체는 "보존적으로 변형된 변이체"로 지칭된다.
용어 "아미노산"은 20종의 통상적인 자연 발생 아미노산을 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 알라닌 (Ala; A), 아르기닌 (Arg; R), 아스파라긴 (Asn; N), 아스파르트산 (Asp; D), 시스테인 (Cys; C); 글루탐산 (Glu; E), 글루타민 (Gln; Q), 글리신 (Gly; G); 히스티딘 (His; H), 이소류신 (Ile; I), 류신 (Leu; L), 리신 (Lys; K), 메티오닌 (Met; M), 페닐알라닌 (Phe; F), 프롤린 (Pro; P), 세린 (Ser; S), 트레오닌 (Thr; T), 트립토판 (Trp; W), 티로신 (Tyr; Y), 및 발린 (Val; V)을 포함한다.
자연 코딩 아미노산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 단백질생성 아미노산이다. 이들은 20종의 통상적인 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 덜 통상적인 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함한다. 자연 코딩 아미노산은 22종의 자연 발생 아미노산의 번역후 변이체, 예컨대 프레닐화 아미노산, 이소프레닐화 아미노산, 미리소일화 아미노산, 팔미토일화 아미노산, N-연결 글리코실화 아미노산, O-연결 글리코실화 아미노산, 인산화 아미노산 및 아실화 아미노산을 포함한다.
용어 "비-천연 아미노산"은 단백질생성 아미노산 또는 그의 번역후 변형된 변이체가 아닌 아미노산을 지칭한다. 특히, 상기 용어는 20종의 통상적인 아미노산 또는 피롤리신 또는 셀레노시스테인 또는 그의 번역후 변형된 변이체 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭한다.
용어 "접합체" 또는 "항체 접합체"는 1개 이상의 페이로드 모이어티에 연결된 항체를 지칭한다. 항체는 본원에 기재된 임의의 항체일 수 있다. 페이로드는 본원에 기재된 임의의 페이로드일 수 있다. 항체는 공유 결합을 통해 페이로드에 직접적으로 연결될 수 있거나, 또는 항체는 링커를 통해 페이로드에 간접적으로 연결될 수 있다. 전형적으로, 링커는 항체에 공유 결합되고, 또한 페이로드에 공유 결합된다. 용어 "항체 약물 접합체" 또는 "ADC"는 적어도 1개의 페이로드가 치료 모이어티, 예컨대 약물인 접합체를 지칭한다.
용어 "페이로드"는 항체에 접합될 수 있는 분자 모이어티를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 페이로드는 치료 모이어티 및 표지 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "링커"는 2개 이상의 공유 결합을 형성할 수 있는 분자 모이어티를 지칭한다. 전형적으로, 링커는 항체에 대한 적어도 하나의 공유 결합 및 페이로드에 대한 적어도 또 다른 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 항체에 대해 1개 초과의 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 페이로드에 대해 1개 초과의 공유 결합을 형성할 수 있거나, 또는 1개 초과의 페이로드에 대해 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커가 항체 또는 페이로드 또는 둘 다에 대한 결합을 형성한 후에, 나머지 구조, 즉 1개 이상의 공유 결합이 형성된 후의 링커의 잔기는 본원에서 여전히 "링커"로 지칭될 수 있다. 용어 "링커 전구체"는 항체 또는 페이로드 또는 둘 다와 공유 결합을 형성할 수 있는 1개 이상의 반응성 기를 갖는 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 예를 들어, 절단가능한 링커는 생체-불안정성 기능에 의해 방출되는 것일 수 있으며, 이는 조작될 수 있거나 또는 조작되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 비-절단가능한 링커이다. 예를 들어, 비-절단가능한 링커는 항체의 분해 시 방출되는 것일 수 있다.
임의의 질환 또는 장애를 "치료하는 것" 또는 그의 "치료"는, 특정 실시양태에서, 대상체에 존재하는 질환 또는 장애를 호전시키는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는 것" 또는 "치료"는 대상체에 의해 식별불가능할 수 있는 적어도 1종의 물리적 파라미터를 호전시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는 것" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 물리적으로 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화) 또는 생리학적으로 (예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화) 또는 둘 다로 조정하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는 것" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키는 것 또는 예방하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여되는 경우에 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 항체 또는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 또는 유효량은 대상체에게 투여되는 경우에 질환 또는 질환의 진행을 예방하거나, 호전시키거나, 또는 증상의 호전을 발생시키는데 효과적인 항체 또는 조성물의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 (예를 들어 세포, 예컨대 종양 세포를 지칭하며) "성장을 억제한다"는 것은, BCMA 항체와 접촉되지 않은 동일한 세포의 성장과 비교하여, BCMA 항체와 접촉된 경우 세포 성장 (예를 들어, 종양 세포 성장)의 임의의 측정가능한 감소를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 성장은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, 또는 100% 억제될 수 있다. 세포 성장의 감소는 항체 내재화, 아폽토시스, 괴사, 및/또는 이펙터 기능-매개된 활성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 메카니즘에 의해 발생할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물 대상체를 의미한다. 예시적인 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 낙타, 조류, 염소, 및 양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 제공된 항체로 치료 또는 진단될 수 있는 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환은 백혈병, 림프종, 또는 다발성 골수종, 형질세포양 수지상 세포 종양, B-세포 계통 악성종양, 형질 세포 신생물, 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 저등급 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질모구성 림프종, 또는 여포성 림프종이다.
본원에 예시된 일부 화학 구조에서, 특정 치환기, 화학적 기, 및 원자는 치환기, 화학적 기, 및 원자가 결합되어 있는 원자를 나타내기 위해 결합 또는 결합들을 교차하는 곡선/파상선 (예를 들어,
Figure pct00006
)으로 도시된다. 예를 들어, 일부 구조, 예컨대 비제한적으로
Figure pct00007
에서, 이러한 곡선/파상선은 예시된 화학 물질이 결합되는 접합체 또는 링커-페이로드 구조의 백본 내의 원자를 나타낸다. 일부 구조, 예컨대 비제한적으로
Figure pct00008
에서, 이러한 곡선/파상선은 예시된 화학 물질이 결합되는 항체 또는 항체 단편 내의 원자 뿐만 아니라 접합체 또는 링커-페이로드 구조의 백본 내의 원자를 나타낸다.
용어 "부위-특이적"은 폴리펩티드 내의 미리 결정된 서열 위치에서의 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 변형은 변이가 거의 또는 전혀 없는 폴리펩티드의 단일의 예측가능한 잔기에서 이루어진다. 특정한 실시양태에서, 변형된 아미노산은 그러한 서열 위치에, 예를 들어 재조합적으로 또는 합성적으로 도입된다. 유사하게, 모이어티는 폴리펩티드 내의 특정한 서열 위치에서 잔기에 "부위-특이적으로" 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 1개 초과의 부위-특이적 변형을 포함할 수 있다.
2. 접합체
BCMA에 대한 항체의 접합체가 본원에 제공된다. 접합체는 링커를 통해 페이로드에 공유 연결된 BCMA에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 1개의 페이로드에 연결된다. 추가 실시양태에서, 항체는 1개 초과의 페이로드에 연결된다. 특정 실시양태에서, 항체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 초과의 페이로드에 연결된다.
본원에 제공된 접합체에서, 항체는 임의의 종으로부터의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, BCMA는 척추동물 BCMA이다. 특정 실시양태에서, BCMA는 포유동물 BCMA이다. 특정 실시양태에서, BCMA는 인간 BCMA이다. 특정 실시양태에서, BCMA는 마우스 BCMA이다. 특정 실시양태에서, BCMA는 시노몰구스 BCMA이다.
항체는 전형적으로 다중 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단백질이다. 특정 실시양태에서, 항체는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)를 포함하는 이종사량체이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결될 수 있다. 각각의 중쇄는 1개 이상의 공유 디술피드 결합에 의해 다른 중쇄에 연결될 수 있다. 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 또한 1개 이상의 쇄내 디술피드 결합을 가질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 각각의 중쇄는 전형적으로 가변 도메인 (VH)에 이어서 다수의 불변 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 전형적으로 하나의 단부에 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 항체는 전형적으로 그의 표적 분자, 즉 항원에 대한 선택적 친화도를 갖는다.
본원에 제공된 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 항체 형태를 가질 수 있다. 이들은 전장 또는 단편일 수 있다. 예시적인 전장 항체는 IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 등을 포함한다. 예시적인 단편은 Fv, Fab, Fc, scFv, scFv-Fc 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 접합체의 항체는 본원에 기재된 CDR 서열 중 6개를 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체의 항체는 본원에 기재된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체의 항체는 본원에 기재된 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체의 항체는 본원에 기재된 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 본원에 기재된 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체의 항체는 본원에 기재된 쌍형성된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다 (VH - VL 쌍).
특정 실시양태에서, 항체 접합체는 1개 이상의 반응성 기를 포함하는 항체로부터 형성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 접합체는 모든 자연 코딩 아미노산을 포함하는 항체로부터 형성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 여러 자연 코딩 아미노산이 페이로드 또는 링커에 접합될 수 있는 반응성 기를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 이들 반응성 기는 시스테인 측쇄, 리신 측쇄, 및 아미노-말단 기를 포함한다. 이들 실시양태에서, 항체 접합체는 항체 반응성 기의 잔기에 연결된 페이로드 또는 링커를 포함할 수 있다. 이들 실시양태에서, 페이로드 전구체 또는 링커 전구체는 항체 반응성 기와 결합을 형성할 수 있는 반응성 기를 포함한다. 전형적인 반응성 기는 말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트 (p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 활성화된 에스테르 (N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르, 및 알데히드를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함한다. 특히 유용한 반응성 기는 시스테인 및 리신 측쇄에 대한 결합을 형성하기 위한 말레이미드 및 숙신이미드, 예를 들어 N-히드록시숙신이미드를 포함한다. 추가의 반응성 기는 하기 섹션 및 실시예에 기재되어 있다.
추가 실시양태에서, 항체는 본원에 기재된 바와 같은 반응성 기를 갖는 1개 이상의 변형된 아미노산을 포함한다. 전형적으로, 변형된 아미노산은 자연 코딩 아미노산이 아니다. 이들 변형된 아미노산은 링커 전구체 또는 페이로드 전구체에 대한 공유 결합을 형성하는데 유용한 반응성 기를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리펩티드를 변형된 아미노산에 대한 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 분자 물질에 연결시키기 위해 반응성 기를 사용할 수 있다. 따라서, 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 페이로드에 연결된 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 포함하는 접합체가 본원에 제공된다. 예시적인 변형된 아미노산은 하기 섹션에 기재되어 있다. 일반적으로, 변형된 아미노산은 상보적 반응성 기를 갖는 링커 또는 페이로드에 대한 결합을 형성할 수 있는 반응성 기를 갖는다.
특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 항체의 폴리펩티드 쇄 내의 선택된 위치에 위치한다. 이들 위치는 비-천연 아미노산으로의 치환을 위한 최적 부위를 제공하는 것으로 확인되었다. 각각의 부위는 항체를 생산하기 위한 최적의 구조, 기능 및/또는 방법을 갖는 비-천연 아미노산을 보유할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 안정한 항체를 제공한다. 안정성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 임의의 기술에 의해 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 최적의 기능적 특성을 갖는 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 그의 표적 항원에 대한 결합 친화도의 손실을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 증진된 결합을 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리하게 제조될 수 있는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체는 하기 논의된 그의 합성 방법에서 유리한 특성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 생산에서 수율의 손실을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 생산에서 증진된 수율을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 tRNA 억제의 손실을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 생산에서 증진된 tRNA 억제를 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 용해도를 갖는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 용해도의 손실을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 증진된 용해도를 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 발현을 갖는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 발현의 손실을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 증진된 발현을 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 폴딩을 갖는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 적절한 폴딩의 손실을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 부위-특이적 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 증진된 폴딩을 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서, 치환을 위한 부위-특이적 위치는 유리한 접합이 가능한 항체를 제공한다. 하기 기재된 바와 같이, 여러 비-천연 아미노산은 직접적으로 또는 링커를 통해 제2 작용제에 대한 항체의 접합을 용이하게 하는 측쇄 또는 관능기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항체는 다른 위치에 동일한 또는 다른 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 증진된 접합 효율을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 다른 위치에 동일한 또는 다른 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 증진된 접합 수율을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 다른 위치에 동일한 또는 다른 비-천연 아미노산이 없는 항체와 비교하여 증진된 접합 특이성을 나타낼 수 있다.
1개 이상의 비-천연 아미노산은 항체의 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 내의 선택된 부위-특이적 위치에 위치한다. 폴리펩티드 쇄는 제한 없이 경쇄 또는 중쇄를 비롯한 항체의 임의의 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 부위-특이적 위치는 임의의 가변 도메인 및 임의의 불변 도메인을 비롯한 항체의 임의의 도메인에 있을 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 부위-특이적 위치에 1개의 비-천연 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 부위-특이적 위치에 2개의 비-천연 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 부위-특이적 위치에 3개의 비-천연 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 부위-특이적 위치에 3개 초과의 비-천연 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 각각 카바트 또는 코티아 또는 EU 넘버링 스킴에 따른 위치 HC-F404 및 HC-Y180에서 비-천연 아미노산 또는 그의 번역후 변형된 변이체를 포함한다. 이들 명칭에서, HC는 중쇄 잔기를 나타내고, LC는 경쇄 잔기를 나타낸다. 통상의 기술자는 비-천연 아미노산이 항체 아미노산 서열에서 잔기 HC-F404 및 HC-Y180을 치환한다는 것을 인식할 것이다. 특정 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 본원의 화학식 (30)의 잔기이다.
3. 접합 기 및 그의 잔기
접합 기는 제2 화합물, 예컨대 본원에 기재된 항체에 대한 본원에 기재된 페이로드의 접합을 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, 접합 기는 본원에서 R로 지정된다. 접합 기는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 반응 메카니즘을 통해 반응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합 기는 본원에 상세하게 기재된 바와 같이 [3+2] 알킨-아지드 고리화첨가 반응, 역-전자 요구 딜스-알더 라이게이션 반응, 티올-친전자체 반응, 또는 카르보닐-옥시아민 반응을 통해 반응한다. 특정 실시양태에서, 접합 기는 알킨, 예를 들어 변형된 알킨을 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합 기는:
Figure pct00009
이다. 추가의 접합 기는, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2014/0356385, 미국 특허 공개 번호 2013/0189287, 미국 특허 공개 번호 2013/0251783, 미국 특허 번호 8,703,936, 미국 특허 번호 9,145,361, 미국 특허 번호 9,222,940, 및 미국 특허 번호 8,431,558에 기재되어 있다.
접합 후에, 접합 기의 2가 잔기가 형성되고, 제2 화합물의 잔기에 결합된다. 2가 잔기의 구조는 접합체를 형성하는데 사용되는 접합 반응의 유형에 의해 결정된다.
특정 실시양태에서 접합체가 [3+2] 알킨-아지드 고리화첨가 반응을 통해 형성되는 경우에, 접합 기의 2가 잔기는 트리아졸 고리 또는 트리아졸 고리를 포함하는 융합된 시클릭 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체가 변형-촉진된 [3+2] 알킨-아지드 고리화첨가 (SPAAC) 반응을 통해 형성되는 경우에, 접합 기의 2가 잔기는:
Figure pct00010
이다.
한 실시양태에서, 화학식 101a-105b 중 임의의 것에 따른 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 항-BCMA 항체의 잔기를 나타내고, PAY는 페이로드 모이어티를 나타낸다:
Figure pct00011
.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, 접합체는 n개의 PAY 모이어티를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 8의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 2이다. 일부 실시양태에서, n은 3이다. 일부 실시양태에서, n은 4이다. 일부 실시양태에서, n은 5이다. 일부 실시양태에서, n은 6이다. 일부 실시양태에서, n은 7이다. 일부 실시양태에서, n은 8이다.
특정한 실시양태에서, 화학식 105a-105b 중 임의의 것에 따른 항-BCMA 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 하기 화학식 (30)에 따른 비-천연 아미노산의 잔기를 나타낸다. 특정한 실시양태에서, 화학식 105a-105b 중 임의의 것에 따른 항-BCMA 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 위치 404에서의 하기 화학식 (30)에 따른 비-천연 아미노산의 잔기를 나타낸다. 특정한 실시양태에서, 화학식 105a-105b 중 임의의 것에 따른 항-BCMA 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 위치 180에서의 하기 화학식 (30)에 따른 비-천연 아미노산의 잔기를 나타낸다.
Figure pct00012
통상의 기술자는 화학식 (30)과 같은 아미노산이 폴리펩티드 및 항체 내에 잔기로서 혼입된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 화학식 (30)의 잔기는 하기 화학식을 따를 수 있다:
Figure pct00013
예를 들어 -N3에서의 추가의 변형이 또한 본원의 용어 잔기 내에 포괄된다.
한 실시양태에서, 화학식 105c-105d 중 임의의 것에 따른 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 항-BCMA 항체의 잔기를 나타내고, PAY는 페이로드 모이어티를 나타낸다:
Figure pct00014
.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, 접합체는 n개의 PAY 모이어티를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 8의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 2이다. 일부 실시양태에서, n은 3이다. 일부 실시양태에서, n은 4이다. 일부 실시양태에서, n은 5이다. 일부 실시양태에서, n은 6이다. 일부 실시양태에서, n은 7이다. 일부 실시양태에서, n은 8이다.
특정한 실시양태에서, 화학식 105c-105d 중 임의의 것에 따른 항-BCMA 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 하기 화학식 (30)에 따른 비-천연 아미노산의 잔기를 나타낸다. 특정한 실시양태에서, 화학식 105c-105d 중 임의의 것에 따른 항-BCMA 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 위치 404에서의 하기 화학식 (30)에 따른 비-천연 아미노산의 잔기를 나타낸다. 특정한 실시양태에서, 화학식 105c-105d 중 임의의 것에 따른 항-BCMA 접합체가 본원에 제공되며, 여기서 COMP는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 위치 180에서의 하기 화학식 (30)에 따른 비-천연 아미노산의 잔기를 나타낸다.
Figure pct00015
통상의 기술자는 화학식 (30)과 같은 아미노산이 폴리펩티드 및 항체 내에 잔기로서 혼입된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 화학식 (30)의 잔기는 하기 화학식을 따를 수 있다:
Figure pct00016
예를 들어 -N3에서의 추가의 변형이 또한 본원의 용어 잔기 내에 포괄된다.
특정한 실시양태에서, 접합체 M의 구조를 갖는 항-BCMA 접합체가 본원에 제공되며:
Figure pct00017
여기서 n은 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 4의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 2이다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 항-BCMA 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00018
.
일부 실시양태에서, n은 4이다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 항-BCMA 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00019
.
항-BCMA 접합체가 접합체 M에 따른 구조를 갖는 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 괄호 안의 구조는 카바트 또는 카바트의 EU 넘버링 스킴에 따른 부위 HC-F404 및 HC-Y180에서 항체의 1개 이상의 비-천연 아미노산에 공유 결합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 각각의 비-천연 아미노산은 화학식 (30)에 따른 잔기이다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 접합체는 하기 구조를 갖는 접합체 4이며:
Figure pct00020
,
여기서 항체는 서열식별번호: 15에 제공된 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17에 제공된 경쇄 서열을 포함하고;
여기서 항체는 EU 넘버링 스킴에 따른 각각의 부위 HC-F404 및 HC-Y180에서 치환된 p-아지도메틸-페닐알라닌의 잔기를 추가로 포함하고;
화학식의 괄호 내의 각각의 구조는 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기 중 하나에서 항체에 결합된다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 접합체는 접합체 4이며, 여기서 우세한 종은 하기이고:
Figure pct00021
,
여기서 항체는 서열식별번호: 15에 제공된 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17에 제공된 경쇄 서열을 포함하고;
여기서 항체는 EU 넘버링 스킴에 따른 각각의 부위 HC-F404 및 HC-Y180에서 치환된 p-아지도메틸-페닐알라닌의 잔기를 추가로 포함하고;
화학식의 괄호 내의 각각의 구조는 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기 중 하나에서 항체에 결합된다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 접합체는 접합체 4이며, 여기서 우세한 종은 하기이고:
Figure pct00022
,
여기서 항체는 서열식별번호: 15에 제공된 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17에 제공된 경쇄 서열을 포함하고;
여기서 항체는 EU 넘버링 스킴에 따른 각각의 부위 HC-F404 및 HC-Y180에서 치환된 p-아지도메틸-페닐알라닌의 잔기를 추가로 포함하고;
화학식의 괄호 내의 각각의 구조는 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기 중 하나에서 항체에 결합된다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 접합체는 접합체 4이며, 여기서 우세한 종은 하기이고:
Figure pct00023
,
여기서 항체는 서열식별번호: 15에 제공된 중쇄 서열 및 서열식별번호: 17에 제공된 경쇄 서열을 포함하고;
여기서 항체는 EU 넘버링 스킴에 따른 각각의 부위 HC-F404 및 HC-Y180에서 치환된 p-아지도메틸-페닐알라닌의 잔기를 추가로 포함하고;
화학식의 괄호 내의 각각의 구조는 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기 중 하나에서 항체에 결합된다.
4. 항체 특이성
접합체는 인간 BCMA에 선택적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 인간 BCMA (인간 BCMA)의 세포외 도메인에 선택적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 BCMA의 상동체에 결합한다. 일부 측면에서, 항체는 원숭이, 마우스, 개, 고양이, 래트, 소, 말, 염소 및 양으로부터 선택된 종으로부터의 인간 BCMA의 상동체에 결합한다. 일부 측면에서, 상동체는 시노몰구스 원숭이 상동체이다. 일부 측면에서, 상동체는 마우스 또는 뮤린 상동체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 경쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 경쇄는 카파 경쇄이다. 일부 측면에서, 경쇄는 람다 경쇄이다. 구체적 실시양태에서, 카파 경쇄는 서열식별번호: 20에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgA이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgD이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgE이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgG이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgM이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgG1이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgG2이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgG3이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgG4이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgA1이다. 일부 측면에서, 중쇄는 IgA2이다.
일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 일부 측면에서, 항체 단편은 Fv 단편이다. 일부 측면에서, 항체 단편은 Fab 단편이다. 일부 측면에서, 항체 단편은 F(ab')2 단편이다. 일부 측면에서, 항체 단편은 Fab' 단편이다. 일부 측면에서, 항체 단편은 scFv (sFv) 단편이다. 일부 측면에서, 항체 단편은 scFv-Fc 단편이다.
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 친화도 성숙 항체이다. 일부 측면에서, 항체는 본 개시내용에 제공된 예시적인 서열로부터 유래된 친화도 성숙 항체이다.
본원에 제공된 항체 접합체는 암을 포함한 다양한 질환 및 상태의 치료에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 고형 종양의 암의 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 항체 접합체는 결장직장암의 치료에 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 13에 제공된 VH 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 14에 제공된 VL 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항체는 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다. 일부 측면에서, VH 서열은 서열식별번호: 13 중 어느 하나를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 VH 서열이고, VL 서열은 서열식별번호: 14 중 어느 하나를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 VL 서열이다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 15에 제공된 중쇄 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 구체적 실시양태에서, 중쇄 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 15에 제공된 중쇄 서열은 N-말단 메티오닌을 추가적으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 중쇄 서열은 서열식별번호: 16에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 17에 제공된 경쇄 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 구체적 실시양태에서, 경쇄 서열, 예를 들어 서열식별번호: 17에 제공된 경쇄 서열은 N-말단 메티오닌을 추가적으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쇄 서열은 서열식별번호: 18에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 항체는 하기 표 5에 나타낸 CDR 중 6개를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 코티아 CDR이 선택된다. 특정한 실시양태에서, 카바트 CDR이 선택된다.
표 5. 항체 2265-F02 CDR.
Figure pct00024
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 5 및 6 중 1개를 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 7 및 8 중 1개를 포함하는 CDR-H2; 서열식별번호: 9를 포함하는 CDR-H3 중 3개; 및 서열식별번호: 10을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 11을 포함하는 CDR-L2; 및 서열식별번호: 12를 포함하는 CDR-L3 중 1, 2, 또는 모든 3개를 포함한다. 특정한 실시양태에서, CDR은 코티아에 따른다. 특정한 실시양태에서, CDR은 카바트에 따른다.
5. 배선
일부 실시양태에서, BCMA에 특이적으로 결합하는 항체는 특정한 배선 유전자 또는 그의 변이체에 의해 코딩된 가변 영역을 포함하는 항체이다. 본원에 제공된 예시적인 항체는 중쇄 가변 영역 배선 유전자 VH1-18, VH3-33, VH2-5, VH2-70, 및 VH4-30-4, 또는 그의 변이체; 및 경쇄 가변 영역 배선 유전자 Vκ1-5, Vκ3-11, Vκ2-20, Vκ1-33, 및 Vκ1-16, 또는 그의 변이체에 의해 코딩된 가변 영역을 포함한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공된 CDR 서열이 또한, 다른 가변 영역 배선 유전자 또는 그의 변이체에 의해 코딩된 가변 영역과 조합되는 경우에 유용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 특히, 본원에 제공된 CDR 서열은 상기 언급된 가변 영역 배선 유전자와 구조적으로 유사한 가변 영역 배선 유전자 또는 그의 변이체에 의해 코딩된 가변 영역과 조합되는 경우에 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CDR-H 서열은 VH 1, VH 2, VH 3, 또는 VH 4 패밀리로부터 선택된 가변 영역 배선 유전자, 또는 그의 변이체에 의해 코딩된 가변 영역과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CDR-L 서열은 Vκ1, Vκ2, 또는 Vκ3으로부터 선택된 가변 영역 배선 유전자, 또는 그의 변이체에 의해 코딩된 가변 영역과 조합될 수 있다.
6. 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 항체는 글리코실화되는 정도를 증가, 감소 또는 제거하도록 변경될 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 "N-연결" 또는 "O-연결"된다.
"N-연결" 글리코실화는 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다.
"O-연결" 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스 중 1개가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다.
항체에 대한 N-연결 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 상기 기재된 트리펩티드 서열 중 1개 이상이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. O-연결 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 항체의 서열 내 또는 (경우에 따라) 항체의 서열에의 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실, 또는 치환에 의해 달성될 수 있다.
7. Fc 변이체
특정 실시양태에서, 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, Fc 영역 변이체는 전부는 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 항체의 생체내 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능은 불필요하거나 해로운 적용에 유용할 수 있다. 이펙터 기능의 예는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-지시된 보체-매개 세포독성 (ADCC)을 포함한다. 변경된 이펙터 기능을 갖는 수많은 치환 또는 치환 또는 결실은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, Fc는 CH3 서열 중 적어도 1개에서 1개 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc는 CH2 서열 중 적어도 1개에서 1개 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, Fc는 V262E, V262D, V262K, V262R, V262S, V264S, V303R, 및 V305R로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc는 단일 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Fc는 다중 펩티드, 예를 들어 2개의 폴리펩티드이다. Fc 영역에서의 예시적인 변형은, 예를 들어 2017년 6월 14일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2017/037545에 기재되어 있다.
CDC 및/또는 ADCC 활성의 변경은 시험관내 및/또는 생체내 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여 FcγR 결합을 측정할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 1991, 9:457-492]에 요약되어 있고, 그 전문은 참조로 포함된다.
관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 및 5,821,337; 문헌 [Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83:7059-7063; Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82:1499-1502; 및 Bruggemann et al., J. Exp. Med., 1987, 166:1351-1361]에 제공되며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델을 사용하여 생체내에서 평가될 수 있다.
C1q 결합 검정을 또한 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인할 수 있다. C1q 결합 검정의 예는 WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
보체 활성화 검정은, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 1996, 202:163-171; Cragg et al., Blood, 2003, 101:1045-1052; 및 Cragg and Glennie, Blood, 2004, 103:2738-2743]에 기재된 것을 포함하며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
FcRn 결합 및 생체내 클리어런스 (반감기 결정)는 또한, 예를 들어 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Petkova et al., Intl. Immunol., 2006, 18:1759-1769]에 기재된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
8. 변형된 아미노산
항체 접합체가 변형된 아미노산을 포함하는 경우에, 변형된 아미노산은 진료의에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 변형된 아미노산일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 변형된 아미노산은 p-아지도-메틸-L-페닐알라닌 (또한 p-메틸아지도 페닐알라닌으로도 지칭됨)이다. 특정한 실시양태에서, 비-천연 아미노산은 화합물 (30):
Figure pct00025
;
또는 그의 염이다. 이러한 비-천연 아미노산은 염의 형태일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 p-아지도-메틸-L-페닐알라닌 잔기의 아지도 모이어티가 접합 기와 반응하여, 본원에 기재된 특정 접합체를 제조하는데 사용되는 변형-촉진된 [3+2] 알킨-아지드 고리화첨가 반응을 통해 형성된 융합된 시클릭 기의 트리아졸을 형성한다는 것을 이해할 것이다.
9. 항체 접합체의 제조
9.1. 항원 제조
항체의 단리에 사용될 BCMA 단백질은 무손상 BCMA 또는 BCMA의 단편일 수 있다. 무손상 BCMA 단백질 또는 BCMA의 단편은 단리된 단백질 또는 세포에 의해 발현된 단백질의 형태일 수 있다. 항체를 생성하는데 유용한 BCMA의 다른 형태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
9.2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는, 예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 1975, 256:495-497] (그 전문은 참조로 포함됨)에 최초로 기재된 하이브리도마 방법 및/또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 4,816,567 참조)을 사용하여 수득될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어, 파지 또는 효모-기반 라이브러리를 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,258,082 및 8,691,730을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 이를 생산할 수 있는 림프구를 도출하기 위해 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다. 문헌 [Goding J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 3rd ed. (1986) Academic Press, San Diego, CA]를 참조하고, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
하이브리도마 세포는 비융합 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩되고 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
유용한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 높은-수준의 생산을 지지하고, 배지 조건, 예컨대 HAT 배지의 존재 또는 부재에 감수성인 것이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOP-21 및 MC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능함), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능함)이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되어 있다. 예를 들어, 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Kozbor, J. Immunol., 1984, 133:3001]를 참조한다.
목적하는 특이성, 친화도, 및/또는 생물학적 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 확인 후에, 선택된 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝될 수 있고, 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. [Goding, 상기 문헌]를 참조한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장될 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다. 따라서, 하이브리도마 세포는 목적하는 특성을 갖는 항체를 코딩하는 DNA의 유용한 공급원으로서 기능할 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내에 배치될 수 있고, 이어서 이것으로 달리 항체를 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 효모 (예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 피키아(Pichia) 종), COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포를 형질감염시켜 모노클로날 항체를 생산한다.
9.3. 인간화 항체
인간화 항체는 비-인간 모노클로날 항체의 구조적 부분의 대부분 또는 전부를 상응하는 인간 항체 서열로 대체함으로써 생성될 수 있다. 결과적으로, 항원-특이적 가변 또는 CDR만이 비-인간 서열로 구성된 하이브리드 분자가 생성된다. 인간화 항체를 수득하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Winter and Milstein, Nature, 1991, 349:293-299; Rader et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:8910-8915; Steinberger et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:36073-36078; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86:10029-10033]; 및 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,180,370에 기재된 것을 포함하며; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
9.4. 인간 항체
인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해, 예를 들어 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 인간화 마우스)을 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90:2551; Jakobovits et al., Nature, 1993, 362:255-258; Bruggermann et al., Year in Immuno., 1993, 7:33]; 및 미국 특허 번호 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807을 참조하고; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 1991, 227:381-388; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597]; 및 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905 참조; 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨). 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨). 인간 항체는 또한 효모-기반 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,691,730 참조, 그 전문은 참조로 포함됨).
9.5. 접합
항체 접합체는 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체로부터 페이로드로의 결합을 형성하는데 적합한 조건 하에 페이로드 전구체와 접촉되어, 항체-페이로드 접합체를 형성한다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체로부터 링커로의 결합을 형성하는데 적합한 조건 하에 링커 전구체와 접촉된다. 생성된 항체-링커는 항체-링커로부터 페이로드로의 결합을 형성하는데 적합한 조건 하에 페이로드 전구체와 접촉되어, 항체-링커-페이로드 접합체를 형성한다. 특정 실시양태에서, 페이로드 전구체는 페이로드로부터 링커로의 결합을 형성하는데 적합한 조건 하에 링커 전구체와 접촉된다. 생성된 페이로드-링커는 페이로드-링커로부터 항체로의 결합을 형성하는데 적합한 조건 하에 항체와 접촉되어, 항체-링커-페이로드 접합체를 형성한다. 항체 접합체를 제조하는데 적합한 링커는 본원에 개시되어 있고, 접합을 위한 예시적인 조건은 하기 실시예에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 항-BCMA 접합체는 본원에 개시된 바와 같은 항-BCMA 항체를 구조 (M)를 갖는 링커 전구체와 접촉시키는 것에 의해 제조된다:
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.
이러한 링커 전구체는 표준 기술에 의해 제조될 수 있거나, 또는 상업적 공급원, 예를 들어 각각 그 전문이 참조로 포함되는 WO 2019/055931, WO 2019/055909, WO 2017/132617, WO 2017/132615로부터 수득될 수 있다.
본원에 개시된 접합 반응으로부터의 접합체는 항체에 부착된 1종 이상의 약물 (예를 들어, PAY 모이어티)의 분포를 갖는 접합체의 혼합물을 생성할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 개별 접합체는 혼합물 중에서, 예를 들어 질량 분광분석법에 의해 확인될 수 있고, HPLC, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 이러한 방법을 포함한 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체의 혼합물은 우세한 접합체 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단일 약물 대 항체 비 (DAR) 값을 갖는 동종 접합체는 예를 들어 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
DAR은 접합체당 1 내지 8 단위의 범위일 수 있다. n의 관점에서 DAR의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다. 일부 경우에, n이 특정 값인 동종 접합체의 분리, 정제, 및 특징화는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 1 내지 8의 범위이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 2 내지 약 6; 약 3 내지 약 5의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 1이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 2이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 2.5이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 3이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 3.5이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 4이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 또는 약 3.9이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 5이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 6이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 7이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 8이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 접합체에 대한 DAR은 약 4이다.
10. 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
실시양태는 또한 항-BCMA 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체의 생산을 위한 재조합 기술의 제공에 관한 것이다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산(들)이 단리될 수 있고, 추가의 클로닝 (즉, DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일부 측면에서, 핵산은 예를 들어 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,204,244에 기재된 바와 같이 상동 재조합에 의해 생산될 수 있다.
많은 상이한 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 벡터 성분은 일반적으로, 예를 들어 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,534,615에 기재된 바와 같이, 하기: 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 1종 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 숙주 세포의 예시적인 예는 하기에 제공된다. 이들 숙주 세포는 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
적합한 숙주 세포는 임의의 원핵 (예를 들어, 박테리아), 하등 진핵 (예를 들어, 효모), 또는 고등 진핵 (예를 들어, 포유동물) 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 예컨대 에스케리키아(Escherichia) (이. 콜라이), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella) (에스. 티피뮤리움(S. typhimurium)), 세라티아(Serratia) (에스. 마르세스칸스(S. marcescans)), 시겔라(Shigella), 바실루스 (비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)), 슈도모나스(Pseudomonas) (피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 하나의 유용한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294이지만, 다른 균주, 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776, 및 이. 콜라이 W3110이 적합하다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모가 또한 항-BCMA 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵 효모는 통상적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (예를 들어, SF9), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) (케이. 락티스(K. lactis), 케이. 라길리스(K. fragilis), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) 케이. 위케라미이(K. wickeramii), 케이. 왈티이(K. waltii), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus)), 야로위아(Yarrowia), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다(Candida) (씨. 알비칸스(C. albicans)), 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 슈완니오미세스(Schwanniomyces) (에스. 옥시덴탈리스(S. occidentalis)), 및 사상 진균 예컨대, 예를 들어 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) (에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger))가 이용가능하고 유용하다.
유용한 포유동물 숙주 세포는 COS-7 세포, HEK293 세포; 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포; 차이니즈 햄스터 난소 (CHO); 마우스 세르톨리 세포; 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76) 등을 포함한다.
본 발명의 항-BCMA 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 예를 들어 햄(Ham) F10, 최소 필수 배지 (MEM), RPMI-1640, 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 1979, 58:44; Barnes et al., Anal. Biochem., 1980, 102:255]; 및 미국 특허 번호 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 및 5,122,469, 또는 WO 90/03430 및 WO 87/00195에 기재된 배지 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 상기 참고문헌 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
이들 배지 중 임의의 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제, 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다.
배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생산될 수 있거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편이 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al., (Bio/Technology, 1992, 10:163-167)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차를 기재한다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 무세포 시스템에서 생산된다. 일부 측면에서, 무세포 시스템은 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225]에 기재된 바와 같은 시험관내 전사 및 번역 시스템이다. 일부 측면에서, 무세포 시스템은 진핵 세포 또는 원핵 세포로부터의 무세포 추출물을 이용한다. 일부 측면에서, 원핵 세포는 이. 콜라이이다. 항체의 무세포 발현은, 예를 들어 항체가 세포에서 불용성 응집체로서 축적되는 경우, 또는 주변세포질 발현으로부터의 수율이 낮은 경우에 유용할 수 있다. 무세포 시스템에서 생산된 항체는 세포의 공급원에 따라 비-글리코실화될 수 있다.
항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액이 일반적으로 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon)® 또는 밀리포어(Millipore)® 펠콘(Pellcon)® 한외여과 유닛을 사용하여 농축된다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계 중 임의의 것에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 특히 유용한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기초한 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 1983, 62:1-13], 이는 그 전문이 참조로 포함됨). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 유용하다 (문헌 [Guss et al., EMBO J., 1986, 5:1567-1575], 이는 그 전문이 참조로 포함됨).
친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 세공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드 ABX(BakerBond ABX)® 수지가 정제에 유용하다.
단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(Sepharose)® 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적용될 수 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 일반적으로 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 약 0.25 M 염)에서 수행되는, 약 2.5 내지 약 4.5의 pH의 용리 완충제를 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
11. 제약 조성물 및 투여 방법
본원에 제공된 항체 접합체는 관련 기술분야에서 이용가능한 방법 및 본원에 개시된 것을 사용하여 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 항체 접합체는 적절한 제약 조성물로 제공될 수 있고, 적합한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본원에 제공된 방법은 본원에 제공된 적어도 1종의 항체 접합체 및 1종 이상의 상용성 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포괄한다. 이와 관련하여, 용어 "제약상 허용되는"은 동물, 보다 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트 (예를 들어, 프로인트 아주반트 (완전 및 불완전)), 부형제, 또는 비히클을 포함한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 물은 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 경우에 담체로서 사용될 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체로서, 특히 주사가능한 용액용으로 사용될 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 [Martin, E.W., Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기재되어 있다.
임상 실무에서, 본원에 제공된 제약 조성물 또는 항체 접합체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 흡입, 동맥내, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 비강, 비경구, 폐, 및 피하 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물 또는 항체 접합체는 비경구로 투여된다.
비경구 투여를 위한 조성물은 에멀젼 또는 멸균 용액일 수 있다. 비경구 조성물은, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 (예를 들어, 에틸 올레에이트)를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 또한 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 멸균은 여러 방식으로, 예를 들어 박테리아 필터를 사용하여, 방사선에 의해 또는 가열에 의해 수행될 수 있다. 비경구 조성물은 또한 사용 시 멸균수 또는 임의의 다른 주사가능한 멸균 매질 중에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 제약 조성물 또는 단일 단위 투여 형태이다. 본원에 제공된 제약 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 예방 또는 치료 유효량의 1종 이상의 예방 또는 치료 항체 접합체를 포함한다.
제약 조성물은 1종 이상의 제약 부형제를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 제약 부형제가 사용될 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적합한 제약 부형제를 선택할 수 있다. 적합한 부형제의 비제한적 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 특정한 부형제가 제약 조성물 또는 투여 형태로의 혼입에 적합한지 여부는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 인자, 예컨대 비제한적으로, 투여 형태가 대상체에게 투여될 방식 및 투여 형태 내의 특이적 항체에 좌우된다. 조성물 또는 단일 단위 투여 형태는, 원하는 경우에, 또한 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 따라서, 하기 제공된 제약 부형제는 예시적인 것으로 의도되며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 추가의 제약 부형제는, 예를 들어 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al., (Eds.) 6th Ed. (2009)]에 기재된 것을 포함하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 소포제를 포함한다. 임의의 적합한 소포제가 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 소포제는 알콜, 에테르, 오일, 왁스, 실리콘, 계면활성제, 및 그의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 소포제는 미네랄 오일, 식물성 오일, 에틸렌 비스 스테아르아미드, 파라핀 왁스, 에스테르 왁스, 지방 알콜 왁스, 장쇄 지방 알콜, 지방산 비누, 지방산 에스테르, 규소 글리콜, 플루오로실리콘, 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리디메틸실록산-이산화규소, 에테르, 옥틸 알콜, 카프릴 알콜, 소르비탄 트리올레에이트, 에틸 알콜, 2-에틸-헥산올, 디메티콘, 올레일 알콜, 시메티콘, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 공-용매를 포함한다. 공-용매의 예시적인 예는 에탄올, 폴리(에틸렌) 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디메틸아세트아미드, 글리세린, 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 완충제를 포함한다. 완충제의 예시적인 예는 아세테이트, 보레이트, 카르보네이트, 락테이트, 말레이트, 포스페이트, 시트레이트, 히드록시드, 디에탄올아민, 모노에탄올아민, 글리신, 메티오닌, 구아 검, 및 일나트륨 글루타메이트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 담체 또는 충전제를 포함한다. 담체 또는 충전제의 예시적인 예는 락토스, 말토덱스트린, 만니톨, 소르비톨, 키토산, 스테아르산, 크산탄 검, 및 구아 검을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 계면활성제를 포함한다. 계면활성제의 예시적인 예는 d-알파 토코페롤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 도큐세이트 소듐, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노올레에이트, 라우르산, 마크로골 15 히드록시스테아레이트, 미리스틸 알콜, 인지질, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 폴리옥실글리세리드, 소듐 라우릴 술페이트, 소르비탄 에스테르, 및 비타민 E 폴리에틸렌(글리콜) 숙시네이트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 케이킹방지제를 포함한다. 케이킹방지제의 예시적인 예는 인산칼슘 (삼염기성), 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 및 산화마그네슘을 포함한다.
제약 조성물과 함께 사용될 수 있는 다른 부형제는, 예를 들어 알부민, 항산화제, 항박테리아제, 항진균제, 생체흡수성 중합체, 킬레이트화제, 제어 방출제, 희석제, 분산제, 용해 증진제, 유화제, 겔화제, 연고 베이스, 침투 증진제, 보존제, 가용화제, 용매, 안정화제, 및 당을 포함한다. 이들 작용제 각각의 구체적 예는, 예를 들어 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al., (Eds.) 6th Ed. (2009), The Pharmaceutical Press]에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 용매를 포함한다. 일부 측면에서, 용매는 염수 용액, 예컨대 멸균 등장성 염수 용액 또는 덱스트로스 용액이다. 일부 측면에서, 용매는 주사용수이다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 미립자 형태, 예컨대 마이크로입자 또는 나노입자이다. 마이크로입자 및 나노입자는 임의의 적합한 물질, 예컨대 중합체 또는 지질로부터 형성될 수 있다. 일부 측면에서, 마이크로입자 또는 나노입자는 미셀, 리포솜, 또는 폴리머솜이다.
일부 실시양태에서, 물이 일부 항체의 분해를 용이하게 할 수 있기 때문에, 항체 접합체를 포함하는 무수 제약 조성물 및 투여 형태가 본원에 추가로 제공된다.
본원에 제공된 무수 제약 조성물 및 투여 형태는 무수 또는 저수분 함유 성분 및 저수분 또는 저습 조건을 사용하여 제조될 수 있다. 락토스, 및 1급 또는 2급 아민을 포함한 적어도 1종의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물 및 투여 형태는 제조, 포장, 및/또는 저장 동안 수분 및/또는 습도와의 실질적인 접촉이 예상되는 경우에 무수일 수 있다.
무수 제약 조성물은 그의 무수 성질이 유지되도록 제조 및 저장될 수 있다. 따라서, 무수 조성물은 이들이 적합한 규정 키트에 포함될 수 있도록 물에 대한 노출을 방지하는 것으로 공지된 물질을 사용하여 포장될 수 있다. 적합한 포장의 예는 기밀 호일, 플라스틱, 단위 투여 용기 (예를 들어, 바이알), 블리스터 팩, 및 스트립 팩을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 락토스-무함유 조성물은, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 예를 들어 미국 약전 (USP) SP (XXI)/NF (XVI)에 열거되어 있는 부형제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 락토스-무함유 조성물은 활성 성분, 결합제/충전제, 및 윤활제를 제약상 상용성이고 제약상 허용되는 양으로 포함한다. 예시적인 락토스-무함유 투여 형태는 활성 성분, 미세결정질 셀룰로스, 예비 젤라틴화 전분, 및 스테아르산마그네슘을 포함한다.
또한, 항체 또는 항체-접합체가 분해되는 속도를 감소시키는 1종 이상의 부형제를 포함하는 제약 조성물 및 투여 형태가 제공된다. 본원에서 "안정화제"로 지칭되는 이러한 부형제는 항산화제, 예컨대 아스코르브산, pH 완충제, 또는 염 완충제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
11.1. 비경구 투여 형태
특정 실시양태에서, 비경구 투여 형태가 제공된다. 비경구 투여 형태는 피하, 정맥내 (볼루스 주사 포함), 근육내, 및 동맥내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 그의 투여는 전형적으로 오염물에 대한 대상체의 자연 방어를 우회하기 때문에, 비경구 투여 형태는 전형적으로 멸균이거나 또는 대상체에게 투여하기 전에 멸균될 수 있다. 비경구 투여 형태의 예는 즉시 주사 용액, 주사용 제약상 허용되는 비히클 중에 즉시 용해 또는 현탁될 건조 제품, 즉시 주사 현탁액, 및 에멀젼을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
비경구 투여 형태를 제공하는데 사용될 수 있는 적합한 비히클은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예는 주사용수 USP; 수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사액, 및 락테이트화 링거 주사액; 수혼화성 비히클, 예컨대 비제한적으로 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜; 및 비-수성 비히클, 예컨대 비제한적으로 옥수수 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 참깨 오일, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 항체 중 1종 이상의 용해도를 증가시키는 부형제가 또한 비경구 투여 형태에 혼입될 수 있다.
11.2. 투여량 및 단위 투여 형태
인간 치료제에서, 의사는 예방적 또는 치유적 치료에 따라 및 치료될 대상체에 특이적인 연령, 체중, 상태 및 다른 인자에 따라 그가 가장 적절한 것으로 간주하는 약량학을 결정할 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 제약 조성물 또는 단일 단위 투여 형태이다. 본원에 제공된 제약 조성물 및 단일 단위 투여 형태는 예방 또는 치료 유효량의 1종 이상의 예방 또는 치료 항체를 포함한다.
장애 또는 그의 1종 이상의 증상의 예방 또는 치료에 효과적일 항체 접합체 또는 조성물의 양은 질환 또는 상태의 성질 및 중증도, 및 항체가 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 빈도 및 투여량은 또한 투여되는 구체적 요법 (예를 들어, 치료제 또는 예방제), 장애, 질환 또는 상태의 중증도, 투여 경로, 뿐만 아니라 대상체의 연령, 신체, 체중, 반응, 및 과거 의료 병력에 따라 각각의 대상체에 대해 특이적인 인자에 따라 달라질 것이다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물의 예시적인 용량은 대상체 또는 샘플 체중 킬로그램당 항체의 밀리그램 또는 마이크로그램 양 (예를 들어, 킬로그램당 약 10 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 50 밀리그램, 킬로그램당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 25 밀리그램, 또는 킬로그램당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 10 밀리그램)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 장애 또는 그의 1종 이상의 증상을 예방, 치료, 관리, 또는 호전시키기 위해 투여되는 본원에 제공된 항체 접합체의 투여량은, 항체의 중량에 기초하여, 대상체의 체중의 0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 15 mg/kg 또는 그 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에서 장애 또는 그의 1종 이상의 증상을 예방, 치료, 관리, 또는 호전시키기 위해 투여되는 조성물 또는 본원에 제공된 조성물의 투여량은 0.1 mg 내지 200 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 0.1 mg 내지 20 mg, 0.1 mg 내지 15 mg, 0.1 mg 내지 10 mg, 0.1 mg 내지 7.5 mg, 0.1 mg 내지 5 mg, 0.1 내지 2.5 mg, 0.25 mg 내지 20 mg, 0.25 내지 15 mg, 0.25 내지 12 mg, 0.25 내지 10 mg, 0.25 mg 내지 7.5 mg, 0.25 mg 내지 5 mg, 0.25 mg 내지 2.5 mg, 0.5 mg 내지 20 mg, 0.5 내지 15 mg, 0.5 내지 12 mg, 0.5 내지 10 mg, 0.5 mg 내지 7.5 mg, 0.5 mg 내지 5 mg, 0.5 mg 내지 2.5 mg, 1 mg 내지 20 mg, 1 mg 내지 15 mg, 1 mg 내지 12 mg, 1 mg 내지 10 mg, 1 mg 내지 7.5 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 1 mg 내지 2.5 mg이다.
용량은 적합한 스케줄에 따라, 예를 들어 매주 1회, 2회, 3회, 또는 4회 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 일부 경우에 본원에 개시된 범위 밖의 항체 접합체의 투여량을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 또한, 임상의 또는 치료 의사는 대상체 반응과 관련하여 어떻게 및 언제 요법을 중단, 조정, 또는 종결할 것인지 알 것이라는데 주목한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 공지되어 있을 바와 같이, 상이한 치료 유효량이 상이한 질환 및 상태에 적용가능할 수 있다. 유사하게, 이러한 장애를 예방, 관리, 치료 또는 호전시키기에 충분하지만, 본원에 제공된 항체와 연관된 유해 효과를 유발하기에는 불충분하거나 또는 감소시키기에는 충분한 양이 또한 본원에 기재된 투여량 및 용량 빈도 스케줄에 포괄된다. 추가로, 대상체에게 본원에 제공된 조성물의 다중 투여량이 투여되는 경우에, 모든 투여량이 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 투여량은 조성물의 예방 또는 치료 효과를 개선시키기 위해 증가될 수 있거나, 또는 특정한 대상체가 경험하고 있는 1종 이상의 부작용을 감소시키기 위해 감소될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료 또는 예방은 본원에 제공된 항체 접합체 또는 조성물의 1회 이상의 로딩 용량으로 개시될 수 있고, 이어서 1회 이상의 유지 용량이 이어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체 또는 조성물의 용량은 대상체의 혈액 또는 혈청 중 항체의 정상-상태 농도를 달성하기 위해 투여될 수 있다. 정상-상태 농도는 통상의 기술자에게 이용가능한 기술에 따른 측정에 의해 결정될 수 있거나, 또는 대상체의 신체 특징, 예컨대 신장, 체중 및 연령에 기초할 수 있다.
특정 실시양태에서, 동일한 조성물의 투여는 반복될 수 있고, 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 6개월만큼 분리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 동일한 예방제 또는 치료제의 투여는 반복될 수 있고, 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 6개월만큼 분리될 수 있다.
11.3. 조합 요법 및 제제
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것을 본원에 개시된 1종 이상의 화학요법제와 조합하여 포함하는 조성물, 치료 제제, 및 치료 방법 또는 용도, 및 이러한 조합을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 화학요법제의 예는 벤다무스틴 (트레안다(TREANDA)®, 세팔론), 베네토클락스 (벤클렉스타(VENCLEXTA)®, 아브비(Abbvie), 제넨테크(Genentech)), 데노수맙 (엑스제바(XGEVA)®, 암젠(Amgen); 프롤리아(PROLIA)®, 암젠), 카르필조밉 (키프롤리스(KYPROLIS)®, 암젠), 익사조밉 (닌라로(NINLARO)®, 다케다(Takeda)), 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)®, 제넨테크/오에스아이 팜.(OSI Pharm.)), 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®, 밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.)), 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®, 아스트라제네카(AstraZeneca)), 수텐트 (SU11248, 화이자(Pfizer)), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®, 노파르티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트 (글리벡(GLEEVEC)®, 노파르티스), PTK787/ZK 222584 (노파르티스), 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®, 사노피(Sanofi)), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®, 와이어쓰(Wyeth)), 라파티닙 (타이커브(TYKERB)®, GSK572016, 글락소 스미스 클라인(Glaxo Smith Kline)), 로나파르닙 (SCH 66336), 소라페닙 (BAY43-9006, 바이엘 랩스(Bayer Labs), 및 게피티닙 (이레사(IRESSA)®, 아스트라제네카), AG1478, AG1571 (SU 5271; 수젠), 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 운시알라마이신, 칼리케아미신 감마ll, 및 칼리케아미신 오메가ll (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); 디네미신, 예컨대 디네미신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® (독소루비신), 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 플라디에놀리드 B, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 예컨대 프롤린산 산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산 산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산 산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® (파클리탁셀; 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴, 아브락산(ABRAXANE)® (크레모포르-무함유), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샤움버그), 및 탁소테레(TAXOTERE)® (도세탁셀; 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니); 클로람부실; 겜자르(GEMZAR)® (겜시타빈); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® (비노렐빈); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것을 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제와 조합하여 포함하는 조성물, 치료 제제, 및 치료 방법 또는 용도, 및 이러한 조합을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제는 PD-1 또는 PD-L1 경로의 소분자 차단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제는 PD-1 또는 PD-L1 활성을 억제하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제는 CA-170, BMS-8, BMS-202, BMS-936558, CK-301, 및 AUNP12로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제는 아벨루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 두르발루맙, AMP-224 (글락소스미스클라인), MEDI0680/AMP-514 (아스트라제네카), PDR001 (노파르티스), 세미플리맙, TSR-042 (테사로, 글락소스미스클라인), 티즐리주맙/BGB-A317 (베이진(Beigene)), CK-301 (체크포인트 테라퓨틱스(Checkpoint Therapeutics)), BMS-936559 (브리스톨-마이어스 스큅), 세미플리맙 (레게네론(Regeneron)), 캄렐리주맙, 신틸리맙, 토리팔리맙, 게놀림주맙, 및 A167 (시추안 켈룬-바이오테크 바이오파마슈티칼(Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical))로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제는 MGA012 (인사이트(Incyte)/마크로제닉스(MacroGenics)), PF-06801591 (화이자/머크 카게아아(Merck KGaA)), LY3300054 (일라이 릴리(Eli Lilly)), FAZ053 (노파르티스), PD-11 (노파르티스), CX-072 (시톰엑스(CytomX)), BGB-A333 (베이진), BI 754091 (베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)), JNJ-63723283 (존슨 앤 존슨(Johnson and Johnson)/얀센(Jannsen)), AGEN2034 (아제누스(Agenus)), CA-327 (쿠리스(Curis)), CX-188 (시톰엑스), STI -A1110 (세르비에르(Servier)), JTX-4014 (조운세(Jounce)), AM0001 (아르모 바이오사이언시스(Armo Biosciences), 일라이 릴리), CBT-502 (CBT 파마슈티칼스(CBT Pharmaceuticals)), FS118 (에프-스타(F-Star)/머크 카게아아), XmAb20717 (젠코르(Xencor)), XmAb23104 (젠코르), AB122 (아르쿠스 바이오사이언시스(Arcus Biosciences)), KY1003 (키맙(Kymab)), RXI-762 (RXi)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제는 PRS-332 (피에리스 파마슈티칼스(Pieris Pharmaceuticals)), ALPN-202 (알파인 이뮨 사이언스(Alpine Immune Science)), TSR-075 (테사로(Tesaro)/아납티스 바이오(Anaptys Bio)), MCLA-145 (메루스(Merus)), MGD013 (마크로제닉스(Macrogenics)), MGD019 (마크로제닉스), RO7121661 (호프만-라 로슈(Hoffman-La Roche)), LY3415244 (일라이 릴리)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 PD-1 또는 PD-L1 억제제는, 예를 들어 WO 2016/077397, WO 2018/156777, 및 2018년 5월 23일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2013/034213에 기재된 항-PD1 단일-특이적 또는 이중-특이적 항체로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것을 1종 이상의 LAG3 억제제와 조합하여 포함하는 조성물, 치료 제제, 및 치료 방법 또는 용도, 및 이러한 조합을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 LAG3 억제제는 LAG3 경로의 소분자 차단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 LAG3 억제제는 LAG3 활성을 억제하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 LAG3 억제제는 IMP321 (에프틸라기모드 알파(Eftilagimod alpha), 이뮤텝(Immutep)), 렐라틸리맙 (브리스톨-마이어스 스큅), LAG525 (노파르티스), MK4280 (머크), BI 754111 (베링거 잉겔하임), REGN3767 (레게네론/사노피), Sym022 (심포겐(Symphogen)) 및 TSR-033 (테사로/GSK)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것을 1종 이상의 TIM3 억제제와 조합하여 포함하는 조성물, 치료 제제, 및 치료 방법 또는 용도, 및 이러한 조합을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 TIM3 억제제는 TIM3 경로의 소분자 차단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 TIM3 억제제는 TIM3 활성을 억제하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 TIM3 억제제는 TSR-022 (테사로), LY3321367 (일라이 릴리), Sym023 (심포겐) 및 MBG453 (노파르티스)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것을 1종 이상의 CD73 억제제와 조합하여 포함하는 조성물, 치료 제제, 및 치료 방법 또는 용도, 및 이러한 조합을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 CD73 억제제는 CD73 경로의 소분자 차단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 CD73 억제제는 CD73 활성을 억제하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 CD73 억제제는 MEDI9447 (메드이뮨(Medimmune)), AB680 (아르쿠스), 및 BMS-986179 (브리스톨-마이어스 스큅)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체 중 임의의 것을 1종 이상의 CD39 억제제와 조합하여 포함하는 조성물, 치료 제제, 및 치료 방법 또는 용도, 및 이러한 조합을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 CD39 억제제는 CD39 경로의 소분자 차단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 CD39 억제제는 CD39 활성을 억제하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 CD39 억제제는 CPI-444 (코르부스(Corvus)), PBF-509 (파블로비오(Pablobio), 노파르티스), MK-3814 (머크), 및 AZD4635 (아스트라제네카)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 벨케이드® (보르테조밉), 키프롤리스® (카르필조밉), 닌라로® (익사조밉)와 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 페리닥(FARYDAK)® (파노비노스타트)과 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 다르잘렉스(DARZALEX)® (다라투무맙)와 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 엠플리시티(EMPLICITI)® (엘로투주맙)와 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 아레디아(AREDIA)® (파미드로네이트) 또는 조메타(ZOMETA)® (졸렌드론산)와 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 엑스제바(XGEVA)® (데노수맙) 또는 프롤리아(PROLIA)® (데노수맙)와 조합되어 투여된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 감마 세크레타제 억제제 (GSI), 예를 들어 아바가세스타트 (BMS-708163; 브리스톨-마이어스 스큅), MK-0752 (머크 & 캄파니), R04929097 (로슈), 세마가세스타트 (LY-450139; 일라이 릴리 & 캄파니), DAPT (N-[N-(3,5-디플루오로페닐아세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르), L685,458, 화합물 E ((s,s)-2-(3,5-디플루오로페닐)-아세틸아미노1-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3- -디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-프로피온아미드), DBZ (디벤즈아제핀), JLK6 (7-아미노-4-클로로-3-메톡시이소쿠마린), 또는 [11-엔도]-N-(5,6,7,8,9,10-헥사히드로-6,9-메타노 벤조[9][8]아눌렌-11-일)-티오펜-2-술폰아미드와 조합되어 투여된다.
본원에 개시된 항체 접합체와 조합되어 투여되는 작용제는 항체 접합체의 투여 직전에, 그와 공동으로, 또는 그 직후에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 제1 투여 스케줄로 투여되고, 1종 이상의 제2 작용제는 그 자체의 투여 스케줄로 투여된다. 본 개시내용의 목적상, 이러한 투여 요법은 항체 접합체를 추가의 치료 활성 성분과 "조합하여" 투여하는 것으로 간주된다. 실시양태는 본원에 개시된 항체 접합체가 본원에 개시된 화학요법제, PD-1 억제제, 또는 PD-L1 억제제 중 1종 이상과 공동-제제화된 제약 조성물을 포함한다.
12. 치료 용도
치료 용도를 위해, 본 발명의 항체 접합체는 제약상 허용되는 투여 형태, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 것 및 상기 논의된 것으로 포유동물, 일반적으로 인간에게 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 접합체는 인간에게 볼루스로서 정맥내로 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 또는 종양내 경로에 의해 투여될 수 있다. 항체 접합체는 또한 국부 뿐만 아니라 전신 치료 효과를 발휘하기 위해 종양주위, 병변내, 또는 병변주위 경로에 의해 적합하게 투여된다. 복강내 경로는, 예를 들어 난소 종양의 치료에 특히 유용할 수 있다.
본원에 제공된 항체 접합체는 BCMA를 수반하는 임의의 질환 또는 상태의 치료에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 BCMA의 과다발현에 의해 진단될 수 있는 질환 또는 상태이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 항-BCMA 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 상태이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 암이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 백혈병, 림프종, 또는 다발성 골수종이다.
임의의 적합한 암은 본원에 제공된 항체 접합체로 치료될 수 있다. 예시적인 적합한 암은, 예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질 암종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 뇌 종양, 담관암, 방광암, 골암, 유방암, 기관지 종양, 원인불명 원발성 기원의 암종, 심장 종양, 자궁경부암, 척삭종, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 관 암종, 배아성 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 섬유성 조직구종, 유잉 육종, 안암, 배세포 종양, 담낭암, 위암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양, 임신성 영양막 질환, 신경교종, 두경부암, 간세포성암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 구순암 및 구강암, 간암, 소엽성 상피내 암종, 폐암, 마크로글로불린혈증, 악성 섬유성 조직구종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 잠재성 원발성인 전이성 편평 경부암, NUT 유전자를 수반하는 정중선관 암종, 구강암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 비강암 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비소세포 폐암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포암, 신우 및 요관암, 망막모세포종, 횡문근양 종양, 타액선암, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 소장암, 연부 조직 육종, 척수 종양, 위암, T-세포 림프종, 기형양 종양, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 외음부암, 및 윌름스 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체로 치료될 질환은 위암, 결장직장암, 신세포 암종, 자궁경부암, 비소세포 폐 암종, 난소암, 자궁암, 자궁내막 암종, 전립선암, 유방암, 두경부암, 뇌 암종, 간암, 췌장암, 중피종, 및/또는 상피 기원의 암이다. 특정한 실시양태에서, 질환은 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 난소암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 폐암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 두경부암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 신세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 질환은 뇌 암종이다. 일부 실시양태에서, 질환은 자궁내막 암종이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체로 치료될 질환은 다발성 골수종이다. 구체적 실시양태에서, 다발성 골수종은 국제 병기결정 시스템 또는 개정된 국제 병기결정 시스템에 따른 I기, II기, 또는 III기이다. 특정 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 새로 진단된 다발성 골수종이다. 다른 실시양태에서, 상기 다발성 골수종은 재발성 또는 불응성 다발성 골수종이다.
국제 병기결정 시스템 (ISS) 하에, 다발성 골수종의 병기는 하기와 같다: I기: 혈청 베타-2 마이크로글로불린 < 3.5 mg/L 및 혈청 알부민 ≥3.5g/dL; II기: I기 또는 III기가 아님; III기: 혈청 베타-2 마이크로글로불린 ≥ 5.5 mg/L. 개정된 국제 병기결정 시스템 (R-ISS) 하에, 다발성 골수종의 병기는 하기와 같다: I기: ISS I기 및 형광 계내 혼성화 (FISH)에 의한 표준-위험 염색체 이상 (즉, 고위험 없음) 및 정상 상한치 이하의 혈청 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준; II기: R-ISS I기 또는 III기가 아님; III기: ISS III기, 및 FISH에 의한 고위험 염색체 이상 (예를 들어, del(17p) 및/또는 전위 t(4;14) 및/또는 전위 t(14;16)의 존재) 또는 정상 상한치 초과의 혈청 LDH 수준.
다발성 골수종은 또한 듀리-살몬 시스템을 사용하여 병기결정될 수 있다. 이러한 시스템 하에, 다발성 골수종은 I기, II기, 또는 III기 (1기, 2기, 또는 3기)로 분류된다. 각각의 병기는 신장 기능이 영향을 받았는지에 따라 A 또는 B로 추가로 분류되며, B 분류는 유의한 신장 손상을 나타낸다. I기: 환자는 증상을 나타내지 않지만; 암이 신장 기능에 영향을 미치는 경우에, 예후는 병기에 관계없이 악화될 수 있다. I기의 특징적인 인자는 다음을 포함한다: 적혈구의 수가 정상 범위 내에 있거나 약간 아래임; 혈액 중 칼슘의 정상량; 혈액 또는 소변 중 M 단백질의 낮은 수준; M 단백질이 IgG의 경우 <5 g/dL; IgA의 경우 <3 g/dL; 소변 경쇄의 경우 <4 g/24h; 및/또는 X선 상 골 손상이 없거나 또는 단지 1개의 골 병변만이 가시적임. II기: II기에는 체내에 더 많은 암 세포가 존재하고, 신장 기능이 영향을 받을 경우, 병기에 관계없이 예후가 악화된다. 단계 II에 대한 기준은 단계 I 또는 단계 III에 적합하지 않은 것으로 정의된다. III기: III기에는 체내에 많은 암 세포가 존재한다. 이 병기의 특징적인 인자는 다음을 포함한다: 빈혈, 헤모글로빈이 <8.5 g/dL; 고칼슘혈증; 진행성 골 손상 (3개 이상의 골 병변); 혈액 또는 소변 중 M 단백질의 높은 수준; 및/또는 M 단백질이 IgG의 경우 >7 g/dL; IgA의 경우 >5 g/dL; 소변 경쇄의 경우 >12 g/24h.
13. 진단 용도
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 접합체는 진단 용도에 사용된다. 예를 들어, 항-BCMA 항체 접합체는 BCMA 단백질에 대한 검정에 유용할 수 있다. 일부 측면에서 항체 접합체는 다양한 세포 및 조직에서 BCMA의 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 이들 검정은, 예를 들어 질환, 예컨대 암에 대한 진단 및/또는 예후를 내리는데 유용할 수 있다.
일부 진단 및 예후 용도에서, 항체 접합체는 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있다. 적합한 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소, 형광 표지, 및 효소-기질 표지를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 항체 접합체는 표지될 필요가 없고, 항체 접합체의 존재는 항-BCMA 항체 접합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
14. 친화도 정제 시약
본원에 제공된 항체 접합체는 친화도 정제 작용제로서 사용될 수 있다. 이 과정에서, 항체 접합체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 고체 상, 예컨대 수지 또는 여과지 상에 고정될 수 있다. 고정된 항체 접합체는 정제될 BCMA 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉되고, 그 후 지지체는 고정된 항체에 결합된 BCMA 단백질을 제외한 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거할 적합한 용매로 세척된다. 마지막으로, 지지체는 항체로부터 BCMA 단백질을 방출할 또 다른 적합한 용매, 예컨대 글리신 완충제, pH 5.0으로 세척된다.
15. 키트
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-BCMA 항체 접합체는 키트, 즉 절차 수행에 대한 지침서와 함께 미리 결정된 양의 시약의 포장된 조합물의 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 절차는 진단 검정이다. 다른 실시양태에서, 절차는 치료 절차이다.
일부 실시양태에서, 키트는 항-BCMA 항체 접합체의 재구성을 위한 용매를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체 접합체는 제약 조성물의 형태로 제공된다.
실시예
실시예 1
항-BCMA 항체의 생성
생성 및 파지 디스플레이 선택
파지 디스플레이를 사용하여 초기 인간 항체 리드 2190-B01 및 2213-A06을 발견하였다. 변형된, 상업적으로 입수가능한 p3 파지미드 벡터 (안티바디 디자인 랩스(Antibody Design Labs))에서 코돈 최적화된, 최적화된 트라스투주맙 Fab 서열을 사용하여 항체 Fab 라이브러리를 구축하였다. 간략하게, 파지미드 벡터를 C-말단 p3 융합 단백질로서 Fab 중쇄를 발현하도록 변형시키고, 조절 영역 (개시 코돈, 제한 효소 부위, 주변세포질 리더 서열)을 Fab 디스플레이 수준에 대해 최적화하였다. 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)을 표적화하는 돌연변이유발 프라이머를 사용한 표준 중첩 연장 PCR 프로토콜을 사용하여 라이브러리를 구축하였다. 문헌 [Heckman and Pease, Nat. Protoc., 2007, 2:924-932]를 참조한다. 라이브러리를 M13-K07 감염된 SS320 이. 콜라이 세포에서 전기천공을 통해 채취하였다. 표준 파지 디스플레이 프로토콜을 사용하여 라이브러리 선택을 수행하였다. 문헌 [Rajan & Sidhu, Methods Enzymol., 2012, 502:3-23; Marks & Bradbury, Methods Mol Biol., 2004, 248:161-76]를 참조한다. 다중 선택 라운드 후에, His6 및 FLAG-태그부착된 IgG1로서의 발현을 위해 Fab 중쇄 풀을 무세포 발현 벡터 내로 전달하였다.
리보솜 디스플레이 선택
리보솜 디스플레이를 사용하여 초기 인간 항체 리드 2137-A05 및 2137-C07을 발견하였다. 특히 개선된 유도체 2265를 생성하기 위해 또한 리보솜 디스플레이를 사용하여 2137-C07, 2137-A05, 2190-B01, 및 2213-A06을 친화도 성숙시켰다.
상보성 결정 영역 (CDR)을 표적화하는 돌연변이유발 프라이머를 사용한 표준 중첩 연장 PCR 프로토콜을 사용하여 항체 Fab 라이브러리를 구축하였다. [Heckman & Pease, 상기 문헌]를 참조한다. 표준 리보솜 디스플레이 프로토콜을 사용하여 신규 항체에 대한 선택을 수행하였다. 문헌 [Hanes & Plueckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997, 94:4937-4942]를 참조한다. 구체적으로, 공개된 프로토콜에 따라 Fab-기반 리보솜 디스플레이 선택을 수행하였다. 문헌 [Stafford et al., 2014, Protein Eng. Des. Sel. 27:97-109; Dreier and Plueckthun, 2011, Methods Mol Biol 687:283-306]를 참조한다. 다중 라운드의 선택 후에, RT-PCR 산출물로부터의 DNA를 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 무세포 발현을 위한 최적화된 벡터 내로 클로닝하였다. 문헌 [Yin et al., 2012, mAbs 4:217-225]를 참조한다. 모든 구축물을 HIS- 및 FLAG-태그부착하여 스크리닝 동안 정제 및 시험을 간소화하였다.
예시적인 항체를 표 6에 보고한다. 항체 4는 본원에서 또한 "항체 2265-F02"로도 지칭된다.
표 6. 리보솜 및 파지-디스플레이에 의해 생산된 항체
Figure pct00027
실시예 2
항체의 1차 스크리닝
항체 변이체의 1차 ELISA 스크리닝
선택 작업흐름에 의해 생성된 항체 변이체의 라이브러리로 이. 콜라이를 형질전환시키고, 항생제 (카나마이신)가 존재하는 한천 플레이트 상에서 성장시켰다. 개별 콜로니를 액체 브로쓰 (TB + 항생제 카나마이신)에서 성장시키고, 롤링 서클 증폭 (RCA)을 통한 DNA 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 이어서, 변이체를 기재된 바와 같이 무세포 단백질 합성 반응에서 발현시켰다. 문헌 [Yin et al., mAbs, 2012, 4:217-225]를 참조한다. 간략하게, 무세포 추출물을 50 μM 아이오도아세트아미드로 RT (20℃)에서 30분 동안 처리하고, 무세포 성분 (문헌 [Cai et al., Biotechnol Prg, 2015, 3:823-831] 참조), 관심 HC 변이체에 대한 10% (v/v) RCA DNA 주형 (대략 10 μg/mL DNA), 및 2.5 μg/mL의 트라스투주맙 LC를 함유하는 프리믹스에 첨가하였다. 60 μL 무세포 (CF) 반응물을 96-웰 플레이트에서 650 rpm의 진탕기 상에서 30℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 상이한 선택 캠페인의 예측된 다양성에 따라 400-1500개의 콜로니를 스크리닝하였다. 합성 후, 각각의 반응물을 1:200으로 희석하고, ELISA에 의해 인간 또는 시노몰구스 BCMA-Fc 단백질에 대한 결합에 대해 시험하였다. 간략하게, BCMA-Fc (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 384-웰 맥시소르프 플레이트에 0.1M 중탄산염 (pH 8.9) 중에 코팅하고, PBST 중 1% BSA로 차단하였다. 1:200 희석된 CF 반응물로부터의 항체를 플레이트 상에서 인큐베이션하고, 세척하고, HRP-접합된 항-인간 Fab 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주 웨스트 그로브) 및 피어스 피코 슈퍼시그널(Pierce Pico Supersignal) ELISA 기질 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))로 검출하였다.
고처리량 세포 결합
고처리량 1차 스크린을 수행하여 소규모 (60 μL) 무세포 반응에서 생산된 항체의 세포 결합을 신속하게 평가하였다. 이러한 스크린에서, U-바닥 96-웰 플레이트 (그라이너 Cat #650201) 또는 편평 바닥 384-웰 플레이트 (그라이너 Cat #781201)에서 4종의 성분을 동일 부피로 100 μL/웰의 최종 부피로 합하였다. 이들 성분은 다음과 같다: 1) 500,000개 세포/웰의 최종 농도를 달성하도록 검정 완충제 (1X PBS + 0.2% BSA, 멸균 여과됨) 중에 희석된 BCMA-발현 NCI-H929 세포, 2) 셀트레이스 오레곤 그린 (인비트로젠 Cat #34555)으로 염색되고 500,000개 세포/웰의 최종 농도를 달성하도록 검정 완충제 중에 희석된 BCMA-음성 MOLT-4 세포, 3) 검정 완충제 중에 희석된 관심 항체를 생산하는 무세포 반응물의 1:50 희석물, 및 4) 검정 완충제 중에 1:100 희석된 2차 항-인간 항체 (알렉사플루오르 647 아피니퓨어 F(ab')2 당나귀 항-인간 IgG, Fc 특이적; 잭슨 이뮤노리서치 Cat#709-606-098). 이어서, 플레이트를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1500 x g에서 5분 동안 회전시킴으로써 펠릿화하고, 검정 완충제 중에 재현탁시켰다. 이어서, FACS 기기 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences) FACS칸토 II 또는 비디 바이오사이언시스 LSR II) 상에서 재현탁된 세포에 대해 고처리량 유동 세포측정법을 수행하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. MOLT-4 BCMA-음성 세포에 대한 신호와 비교하여 NCIH929 BCMA-양성 세포에 대한 2차 항체 신호 (아마도 관심 항체에 대한 결합으로 인함)의 비례 수준에 의해 항체 결합을 평가하였다.
실시예 3
항체의 2차 스크리닝
IgG의 제조
스크리닝의 초기 라운드로부터의 상위 리드를 배양하고, 제조업체의 지침서에 따라 퀴아프렙 96 터보(Qiaprep 96 Turbo) 미니프렙 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 통해 미니프렙하였다. 7.5 μg/mL 미니프렙 HC DNA 및 2.5 μg/mL의 트라스투주맙 LC를 4 mL 무세포 반응물에 첨가하고, 30℃, 650 rpm에서 12시간 동안 밤새 인큐베이션하였다. 정화된 무세포 반응물로부터 발현된 변이체를 IMAC 정제를 통해 반-자동화된 고처리량 배치 정제 방법을 사용하여 정제하였다. 간략하게, 정제를 96-웰 플레이트 포맷으로 수행하였으며, 여기서 50 μL/웰의 IMAC 수지 (Ni 세파로스 하이 퍼포먼스(Ni Sepharose High Performance), 지이 헬스케어(GE Healthcare))를 IMAC 결합 완충제 (50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸) 중에서 평형화하고, 1 mL 무세포 반응물과 함께 15분 동안 인큐베이션한 다음, IMAC 결합 완충제 중에서 2회 세척하였다. 이어서, His-태그부착된 항체 변이체를 200 μL IMAC 용리 완충제 (50 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸)를 사용하여 용리시키고, 96-웰 제바 플레이트 (7 kD MWCO, 써모피셔)를 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. 정제된 항체를 제조업체의 지침서에 따라 헤르셉틴 표준 곡선에 대해 랩칩 GXII (퍼킨 엘머)를 사용하여 고처리량 모세관 전기영동을 통해 정량화하였다.
scFv의 제조
단일-쇄 항체는 VHVL 또는 VLVH 배향으로 만들어지고, VH 및 VL 도메인 사이에 링커 서열이 존재한다. 전형적으로, scFv 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 28) 반복부로 구성되고, 여기서 15, 20, 25, 또는 30개 잔기의 링커에 대해 각각 n = 3, 4, 5, 또는 6이다. 무세포 발현을 위해, N-말단 Met이 부가되지만, 포유동물 발현을 위해 리더 펩티드가 부가된다. scFv의 C-말단 단부 상에, 생체내 반감기를 연장시키기 위해 Fc 서열이 부가될 수 있거나 또는 scFv가 직접 사용될 수 있다. 임의적인 링커 서열이 scFv와 Fc 사이에 혼입될 수 있다. 예시적인 scFv-Fc 링커 서열은 AAGSDQEPKSS (서열식별번호: 27)이다. C-말단 친화성 태그는 정제 및 검정 개발을 용이하게 하기 위해 임의로 부가될 수 있다. 예시적인 친화성 태그는 C-말단 FlagHis 태그 GSGDYKDDDDKGSGHHHHHH (서열식별번호: 25)이다. 정지 코돈은 전형적으로 서열의 단부에 삽입된다. 예시적인 scFv는 N-말단 Met 잔기, VH 도메인, GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 26) 링커, VL 도메인, AAGSDQEPKSS (서열식별번호: 27) 링커, Fc 도메인, FlagHis 태그, 및 정지 코돈을 포함할 수 있다.
시차 주사 형광측정법
단백질 열 이동 검정은 검정될 단백질을 포스페이트 완충 용액 (PBS) 중 환경 감수성 염료 (시프로 오렌지(SYPRO Orange), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) Cat #S-6650)와 혼합하고, 제어된 열 변성을 거침에 따른 혼합물의 형광을 실시간으로 모니터링함으로써 수행하였다. 0.2-2 mg/mL의 단백질 용액을 1:500 PBS-희석된 시프로 오렌지 용액 (시프로 오렌지 스톡 염료는 DMSO 중 5000X임)과 1:1 부피비로 혼합하였다. 단백질-염료 혼합물의 10 μL 분취물을 384-웰 마이크로플레이트 (바이오-라드 Cat #MSP-3852)에 사중으로 분배하고, 플레이트를 광학적으로 투명한 밀봉 필름 (바이오-라드 Cat #MSB-1001)으로 밀봉하고, 384-웰 플레이트 실시간 써모사이클러 (바이오-라드 CFX384 실시간 시스템)에 넣었다. 단백질-염료 혼합물을 사이클당 0.1℃ (분당 ~1.5℃)의 증분으로 25℃에서 95℃로 가열하여, 각각의 온도에서 3초의 평형을 허용한 후에 형광 측정을 수행하였다. 실험 말미에, 전이 용융 온도 (TM1 및 TM2)를 바이오-라드 CFX 매니저 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. TM1은 Fc 도메인의 용융 온도를 나타낸다. TM2는 Fab 도메인의 용융 온도를 나타낸다.
비아코어 오프-레이트 및 동역학적 분석
항-Fab 또는 항-Fc 폴리클로날 항체를 아민 커플링 화학 (아민 커플링 키트로부터, 지이 라이프 사이언시스)을 사용하여 CM5 칩 (지이 라이프 사이언시스) 상에 고정시켰다. 고정 단계를 1x HBS-EP+ 완충제 (지이 라이프 사이언시스; 10x 스톡은 사용 전 희석됨) 중에서 25 μL/분의 유량으로 수행하였다. 센서 표면을 NHS (0.05 M) 및 EDC (0.2 M)의 혼합물로 7분 동안 활성화시켰다. 항-Fab 또는 항-Fc 항체를 모든 4개의 유동 셀 상에 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.5 중 25 μg/ml의 농도로 7분 동안 주입하였다. 에탄올아민 (1 M, pH 8.5)을 7분 동안 주입하여 임의의 나머지 활성화된 기를 차단하였다. 평균 12,000 반응 단위 (RU)의 포획 항체를 각각의 유동 셀 상에 고정시켰다.
오프-레이트 및 동역학적 결합 실험을 25℃에서 1x HBS-EP+ 완충제를 사용하여 수행하였다. 시험 및 대조군 항체를 유동 셀 2, 3 및 4 상에 10 μL/분의 유량으로 12초 동안 5-10 μg/mL의 농도로 항-Fab 또는 항-Fc 표면 상에 주입한 후, 동일한 유량으로 30초 동안 완충제 세척하였다. 1-100 nM의 항원 농도 범위 및 0 nM 항원의 1회 주입 (예를 들어, 100, 50, 25, 6.25, 1.56 및 0 nM)으로 항체 샘플의 동역학적 특징화를 수행하였다. 항-Fab 또는 항-Fc 표면 상에 리간드 (항체)를 포획한 후, 분석물 (각각 알앤디 시스템즈, 맞춤 단백질 생산, 또는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터의 인간 BCMA-Fc, 시노 BCMA-Fc, 또는 인간 BCMA)을 180초 동안 결합시키고, 이어서 600초 해리 단계를 50 μL/분의 유량으로 수행하였다. 각각의 리간드 포획과 분석물 결합 사이클 사이에, 30 μL/분으로 30초 동안 10 mM 글리신 pH 2.0의 2회 주입에 이어서 30초 완충제 세척 단계를 사용하여 재생을 수행하였다.
데이터를 1-1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 비아코어 T200 평가 소프트웨어로 피팅하였다. KD (친화도, nM)를 회합 및 해리 단계의 피트로부터 계산된 동역학적 속도 상수의 비로서 결정하였다.
세포주 및 세포 배양 조건
NCI-H929, U266B1, MOLT-4 및 ARP-1을 ATCC 및 키츠 랩(Keats Lab) (티젠(Tgen), 애리조나주 포에닉스)으로부터 입수하였다. 293T 세포를 시노몰구스 또는 래트 BCMA cDNA 서열을 함유하는 플라스미드로 형질감염시키고, 세포 표면 상에서의 시노몰구스 BCMA 또는 래트 BCMA의 가장 높은 안정한 발현에 대해 선택함으로써 293T-시노BCMA 및 293T-래트BCMA 재조합 세포를 생성하였다. NCI-H929, U266B1, 및 MOLT-4 세포를 20% 열-불활성화 태아 소 혈청 (하이클론(Hyclone); 써모 사이언티픽; 매사추세츠주 월섬), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-미디어테크(Cellgro-Mediatech); 버지니아주 마나사스), 및 2 mmol/L-글루타맥스 (라이프 테크놀로지; 캘리포니아주 칼스배드)로 보충된 RPMI-1640 (셀그로-미디어테크; 버지니아주 마나사스) 중에 유지시켰다. 293T-시노BCMA 및 293T-래트BCMA 세포를 10% 열-불활성화 태아 소 혈청 (하이클론; 써모 사이언티픽; 매사추세츠주 월섬), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (셀그로-미디어테크; 버지니아주 마나사스), 및 2 mmol/L-글루타맥스 (라이프 테크놀로지; 캘리포니아주 칼스배드)로 보충된 햄 F-12- 고 글루코스 DMEM (50-50) (셀그로-미디어테크; 버지니아주 마나사스) 중에 유지시켰다.
세포 결합 실험
2차 스크리닝에서 충분한 단백질이 정제된 변이체를 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 세포-결합 검정에서 시험하였다. BCMA 양성 NCI-H929 및 293T-시노BCMA 세포 및 BCMA 음성 293T 세포를 사용하여 FACS 결합체를 스크리닝하였다. 293T 세포를 세포 결합 24시간 전에 1 μM DAPT로 처리하여 BCMA 쉐딩을 방지하였다. 약 100-200 nM 항체 농도로부터 출발한 항-BCMA 변이체의 6-12 포인트 희석물을 바이오멕FX (베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 각각의 웰에 분배하였다. 이어서, 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하고, FACS 완충제로 세척하고, 바이오멕FX (베크만 쿨터)를 사용하여 분배된 2.5 μg/ml 알렉사647-접합된 염소 항-인간 IgG를 함유하는 50 mL FACS 완충제와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충제로 2x 세척하고, 2% 파라포름알데히드 (PFA)를 함유하는 200 ml PBS 중에서 10분 동안 고정시킨 후 형광 검출하였다. 벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson) LSRII FACS를 사용하여 샘플을 획득하였다. BCMA 항체 결합의 기하 평균 형광 강도를 플로우조® 소프트웨어 (트리 스타, 인크.(Tree Star, Inc.))를 사용하여 분석하였다.
세포-사멸 분석
항체의 내재화를 BCMA 양성 세포에 대한 세포 사멸 검정에서 2차 항체에 접합된 약물에 의해 평가하였다. BCMA-양성 세포주 ARP-1 및 U266B1을 사용하여 내재화 리드를 스크리닝하였다. 세포를 칼슘 및 마그네슘-무함유 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS)로 2회 세척하고, 아큐타제(Accutase)® (이노베이티브 셀 테크놀로지스(Innovative Cell Technologies); 캘리포니아주 샌디에고)로 수거하고, 바이-셀(Vi-CELL) 세포 생존율 분석기 (베크만 쿨터, 캘리포니아주 브레아)로 계수하였다. 25 마이크로리터의 부피 중 총 12,500개 세포를 검정일에 384-웰 편평 바닥 백색 폴리스티렌 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One), 노스캐롤라이나주 먼로)에 시딩하였다. 리드 항체를 세포 배양 배지에서 4x 출발 농도로 제제화하고, 멀티스크린HTS 96-웰 필터 플레이트 (밀리포어; 매사추세츠주 빌러리카)를 통해 여과하였다. 연속 희석된 항체 12.5 μL (100 nM로부터 출발하여 1:3 연속 희석물)를 처리 웰에 첨가한 다음, 접합체 P에 따라 (절단가능한 링커를 통한 헤미아스텔린) 또는 접합체 M에 따라 (비-절단가능한 링커를 통한 메이탄시노이드) 접합된 항-인간 나노바디 12.5 μL를 20 nM의 고정된 최종 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 검정 플레이트를 검정 전에 72시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 세포 생존율 측정을 위해, 30 μL의 셀 타이터-글로(Cell Titer-Glo)® 시약 (프로메가 코포레이션(Promega Corp.), 위스콘신주 매디슨)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 제품 지침서에 따라 프로세싱하였다. 상대 발광을 엔비전(ENVISION)® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 매사추세츠주 월섬) 상에서 측정하였다. 대조군으로서 비처리 세포를 사용하여 상대 발광 판독치를 % 생존율로 전환시켰다. 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (그래프패드 v 5.0, 소프트웨어; 캘리포니아주 샌디에고)으로 log(억제제) vs. 반응-가변 기울기, 4 파라미터 피트를 사용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터를 상대 세포 생존율 (ATP 함량) % vs. 항체의 용량으로 표현하였다.
실시예 4
예시적인 항-BCMA 항체의 특징
표 7A 및 7B는 초기 리드 및 친화도 성숙 후에 리보솜 및 파지-디스플레이에 의해 생산된 항체로 수득된 결과를 보여준다.
표 7A. 리보솜 및 파지-디스플레이로부터의 항체.
Figure pct00028
NK = 사멸 없음
표 7B. 리보솜 및 파지-디스플레이로부터의 항체.
Figure pct00029
ND = 검출되지 않음
실시예 5
항체-약물 접합 및 DAR 비 결정
항체-약물 접합은 문헌 [Zimmerman ES, et al., 2014, Bioconjugate Chem., 25 (2), pp 351-361]에 기재되어 있다. 간략하게, 정제된 항-BCMA 항체 변이체를 세포독성제에 접합시켰다. 스톡 약물을 DMSO 중에 5 mM의 최종 농도로 용해시켰다. 화합물을 PBS로 1 mM로 희석한 다음, 정제된 단백질 샘플에 100 μM의 최종 약물 농도로 첨가하였다. 혼합물을 RT (20℃)에서 17시간 동안 인큐베이션하였다. 제제 완충제 중에 평형화된 제바(Zeba) 플레이트 (써모 사이언티픽)에서 7000 MWCO 수지를 통해 반응 샘플을 통과시킴으로써 비혼입 약물을 제거하였다. 이어서, 여과물을 무스탕(MUSTANG)® Q 플레이트 (폴 코포레이션(Pall Corp.))를 통해 통과시켜 내독소를 제거하였다.
정제 후에, 정제된 항체 또는 항체 약물 접합체 샘플을 동일한 프로테인 익스프레스 랩칩(Protein Express LabChip) (캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences) # 760499) 상에서 실행된 헤르셉틴® 질량 표준물과 비교함으로써 캘리퍼 GXII 시스템 상에서 정량화하였다. 샘플 (샘플 완충제 + 50mM NEM 중에 혼합됨)을 캘리퍼 시스템 상에서의 분석 전에 65℃에서 10분 동안 가열한 것을 제외하고는, 프로테인 익스프레스 시약 키트 (캘리퍼 라이프 사이언시스 # 760328)에 명시된 바와 같이 분석을 위해 샘플을 제조하였다.
항체 약물 접합체를 10mM TCEP (피어스(Pierce))로 37℃에서 10분 동안 환원시켰다. TA30 (30% 아세토니트릴, 70%의 0.1% 트리플루오로아세트산) 30uL를 환원된 샘플에 첨가하였다. 20mg의 슈퍼-DHB (시그마, 파트 번호 50862)를 TA50 (50% 아세토니트릴, 50%의 0.1% 트리플루오로아세트산)에 용해시켜 샘플 매트릭스를 생성하였다. 다음으로, TA30 중 샘플 0.5uL를 TA50 중 슈퍼-DHB 매트릭스 0.8uL에 첨가하고, MALDI 샘플 플레이트 상에 침착시켰다. 스펙트럼을 브루커 오토플렉스 스피드 MALDI 기기 상에서 하기 초기 설정으로 획득하였다: 질량 범위 7000 - 70000Da, 샘플 속도 및 디지타이저 설정 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 실시간 평활화 설정 높음, 및 기준선 오프셋 조정 없음. 고전압 스위치를 켜고 이온 공급원 1을 20kV로 조정하였다. 200ns에서 펄스 이온 추출, 편향에 대한 매트릭스 억제 및 최대 6000Da 억제. 피크 검출 알고리즘은 기준선 차감 TopHat와 함께 신호 대 노이즈 역치가 20, 150m/z 높이에서의 피크 너비가 80%인 중심점이다. 평활화 알고리즘은 폭이 10m/z이고 사이클이 10인 사비츠키골레이(SavtzkyGolay)이다. 모든 샘플에 대한 약물-항체 비 (DAR)를 각각의 접합체에 대한 곡선하 디컨볼루션된 질량 스펙트럼 면적의 가중 평균으로서 결정하였다.
실시예 6
시험관내 혈장 안정성
본 실시예에서, 접합체 4의 시험관내 안정성을 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스로부터의 혈장에서 평가하였다. 링커-워헤드 안정성을 친화도-포획 항체를 사용하여 LC/MS 기반-검정에 의해 측정하였다. ADC (50 μL, 100 μg/mL)를 PBS 또는 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 마우스로부터의 혈장 (리튬-헤파린) 샘플과 함께 상이한 길이의 시간 (0, 2, 24, 72, 168, 336 및 504시간) 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 미리 결정된 시점에 취하고, 비오틴- (Fab)2 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 (잭슨 이뮤노리서치, cat# 109-066-098) 항체 (PBS, 시노 및 마우스 혈장 샘플의 경우) 또는 비오티닐화된 인간 BCMA ECD (인간 혈장 샘플의 경우)로 코팅된 스트렙타비딘 매그 세파로스 비드 (지이 헬스케어, Cat# 28-9857-99)에 첨가하였다 (10ug/샘플). 혈장 샘플/비드 혼합물을 부드럽게 회전시키면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 1mL HBS-E 완충제 중에서 3회 세척한 다음, 1mL 물로 2회 세척하였다. 실온에서 5분 동안 1% 포름산 용액 25 μL를 첨가하여 포획된 ADC의 용리를 수행하였다. 방출된 항체를 비드로부터 제거하고, 1M 트리스-HCl (pH 9.0) 15 μL로 중화시켰다.
풀-다운 ADC의 DAR을 바이너리 SL 펌프를 갖는 애질런트(Agilent) 1200 시리즈 HPLC 시스템에 연결된 애질런트 6520A 어큐레이트 매스 Q-TOF MS 상에서 획득하였다. 추가의 크로마토그래피 추적을 애질런트 DAD 상에서 278 및 214 nm에서 획득하였다. 풀-다운 방법 로딩을 샘플의 전체 부피 (40 μL)가 80℃ 및 0.4 mL/분에서 애질런트 어드밴스 바이오 탈염 HPLC 카트리지 (2.1x12.50 mm) 상에 주입되도록 최적화하였다. LC-MS를 위한 표준 이동상을 사용하였다: A: 물 중 0.1% 포름산; B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산. 10% B에서의 1분 탈염 시간 후에, 단백질을 카트리지로부터 65 - 80% B로부터 1.5 - 4.5분 용리시켰다. 각각의 주입 사이에 세정 등급을 실행함으로써 연속 진행을 방지하였다.
애질런트로부터의 매스헌터 퀄리테이티브(MassHunter Qualitative) (B.06.00)를 사용하여 단일 TIC 피크로부터 모든 스펙트럼을 추출하고 합하였다. 매스헌터 퀄리테이티브의 최대 엔트로피 알고리즘을 사용하여 스펙트럼을 디컨볼루션하고, 관찰된 중성 질량으로부터 아이덴티티를 확인하였다. 디컨볼루션은 완전히 어셈블리된 항체로부터 기원한 이온으로 제한되었고, 1.0 Da의 질량 단계로 140,000-160,000 Da의 질량 범위를 검색하였다.
피크 면적을 DAR 칼큐레이터 B.1.0 (애질런트 테크놀로지스)에 배정하였다. 자동 피크 선별이 실패한 경우, 수동으로 피크를 규정하였다. 생성된 피크 표를 엑셀 워크시트로 보내고, DAR 값을 적절하게 재배정하였다. 약물-링커 분해가 관찰된 경우에, 생성물 종 상에 남아있는 약물만을 활성으로 계수하였다. 예를 들어, 하나의 완전한 약물-링커 및 단지 링커만 (2-약물 종으로부터 분해됨)을 갖는 항체는 1-약물 종과 동등한 것으로 간주하였다. 전체 DAR 값을 디컨볼루션된 피크 면적의 가중 평균으로서 계산하였다. 반복 샘플에 대한 전체 DAR 값을 함께 평균내었다.
접합체 4에 대한 예시적인 혈장 안정성 결과를 도 11에 제공한다.
실시예 7
ARP-1 다발성 골수종 종양에서의 BCMA ADC 변이체의 용량 반응 관계의 평가
피하 ARP-1 다발성 골수종 종양에서 접합체 4 (표 8에 기재됨)의 효능을 비교하기 위한 연구를 수행하였다.
표 8. 시험 물품의 목록
Figure pct00030
본원에 기재된 항체의 F404 부위에서 링커 페이로드를 파라-아지도-메틸-페닐알라닌 (pAMF)에 접합시킴으로써 항-BCMA ADC를 생성하였다. GSK2857916에 대한 대용물 ADC인 접합체 1 (GSK, Trudel et al., 2018, Lancet Oncol. 19:1641-1653; Trudel et al., 2019, Blood Cancer Journal 9:37)은 말레이미도-카프로일 모노메틸 아우티스타틴 F (mc-MMAF) 링커-워헤드를 항-BCMA 항체 J6M0에 접합시킴으로써 생성하였다. J6M0 항체를 CHO 세포주, CHOEBNALT (이코사겐)로 제조하고, ProA에 의해 정제하였다. mc-MMAF 링커-워헤드를 J6M0에 접합시켜 접합체 1을 생성하였다. GSK2857916과 달리, 접합체 1은 Fc-감마RIII 상호작용을 증진시킬 수 있는 비-푸코실화 항체를 사용하지 않는다.
9주령의 암컷 중증 복합 면역 결핍 (SCID) 베이지 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 1 x 107개의 인간 ARP-1 MM 세포 및 매트리겔의 1:1 혼합물을 우측 뒷쪽 측복부에 피하로 이식하였다. 평균 종양 크기가 대략 150 mm3 (이식 15일 후에 상응함)일 때 무작위화 및 처리 시작을 개시하였다. 처리군을 표 9에 요약한다. 모든 시험 물품은 10 mM 시트레이트 pH 6.0, 10% 수크로스 중에 제제화하였다. 체중 및 종양 크기를 1주에 1 - 2x 모니터링하였다. 1차 연구 종점은 비히클 대조군의 평균 종양 크기가 > 1,500 mm3일 때였다.
표 9. 처리군의 목록
Figure pct00031
체중 및 종양 크기를 일원 분산 분석 (ANOVA) 및 던넷 다중 비교 검정을 사용하여 분석하였다. 5% 미만의 확률 (p < 0.05)을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
본 연구에서, 확립된 ARP-1 종양을 보유하는 동물을 0.1 내지 8 mg/kg 범위의 4가지 용량 수준의 접합체 4 또는 2 mg/kg 접합체 1로 1회 처리하였다. 모든 시험 물품은 내약성이 우수하였고, 체중 감소에 기초하여 어떠한 독성도 나타내지 않았다 (도 2).
ARP-1 종양 성장에 대한 처리의 효과를 도 3a 및 도 3b에 예시하며, 이는 둘 다의 약물에 대한 증가하는 활성과 용량 사이의 양의 상관관계를 보여준다. 둘 다의 BCMA ADC 변이체는 2가지의 보다 낮은 용량 (0.1 및 0.5 mg)에서 비히클 대조군과 유사하게 활성을 거의 내지 전혀 갖지 않은 반면에, 2 mg/kg에서는 중간 정도의 활성이 관찰되었다 (도 3a). 8 mg/kg의 최고 접합체 4 용량은 종양 정체를 발생시켰고, 처리 대략 10일 후에 종양 재성장이 관찰되었다 (도 3a).
이러한 연구로부터의 결과는 접합체 4의 활성이 이러한 모델에서 접합체 1과 비교하여 통계적으로 상이하지 않았음을 보여준다.
실시예 8
파종성 MM.1S 다발성 골수종 모델에서의 BCMA ADC 변이체 접합체 4 및 5의 용량 반응 관계의 평가
NSG 마우스의 파종성 MM.1S 모델에서 접합체 4의 효능을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.
8-9주령의 암컷 NOD 중증 복합 면역 결핍 (SCID) 감마 (NSG) 마우스에게 5 x 106개 다발성 골수종 MM.1S 세포를 꼬리 정맥 내로 접종하였다. 종양 접종 7일 후에 체중별 무작위화 및 처리 시작을 개시하였다. 처리군을 표 10에 요약한다. 모든 임상시험용 시험 물품은 10 mM 시트레이트 pH 6.0, 10% 수크로스 중에 제제화하였다. 군 1-10 (n=6/군)을 > 20% 체중 감소, 및 기면, 뒷다리 마비 또는 빈사율을 포함한 임상 징후를 특징으로 하는 생존 종점에 대해 모니터링하였다. 군 11-20 (n=3/군)을 골수 수거 및 종양 세포 접종 후 제28일의 종양 부담의 분석에 사용하였다. 모든 군에 대해, 체중을 1 - 2x/주로 모니터링하였다.
표 10. 처리군의 목록
Figure pct00032
골수에서의 hCD138 양성 (hCD138+) 세포의 검출에 의해 종양 부담을 평가하고 정량화하였다. 마우스 대퇴골 및 경골로부터의 골수 세포를 풀링하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 알렉사 플루오르 647 마우스 항-인간 CD138 클론 MI15 (비디 바이오사이언시스 # 562097)를 사용하여 인간 CD138+ 발현에 대해 평가하였다. CD138은 골수에서의 MM 및 형질 세포에 대한 특이적 표면 항원이다 (Chilosi M et. Al. Mod. Pathol. Off. J. U. S. Can. Acad. Pathol. Inc (1999): 12, 1101-1106). LSRII 유동 세포측정기 및 FACS 디바 소프트웨어를 사용하여 직접 면역형광 유동 세포측정 분석을 수행하였다. 플로우조 (트리 스타, 인크., 오레곤주 앳슈랜드)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
연구 동안 및 연구 종점에서의 평균 생존, 생존 지연, 및 종양 부담을 일원 분산 분석 (ANOVA) 및 던넷 다중 비교 검정을 사용하여 분석하였다. 5% 미만의 확률 (p < 0.05)을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
본 연구에서, 확립된 MM.1S 종양을 보유하는 동물을 접종 후 제7일에 0.02 내지 2.5 mg/kg 범위의 4가지 용량 수준의 접합체 4, 또는 0.5 mg/kg의 대용물 접합체 1로 1회 처리하였다.
도 4는 모든 처리군이 최소 체중 감소 (~5% 체중 감소)를 유도하였고 내약성이 우수하였음을 보여준다. 비히클 대조군 동물에서의 체중 감소는 제30일에 시작하였고, 이어서 뒷다리 마비, 입모, 및 기면을 포함한 임상 징후의 발생과 동시에 진행성 체중 감소 (> 20%까지)가 이어졌다. 생존 곡선을 도 5에 예시한다. 비히클 군의 경우 평균 생존은 34.2일이었다. 접합체 4 용량이 대략 제43일에 0.1 mg/kg으로 출발하여 대략 77일까지 2.5 mg/kg으로 증가함에 따라 평균 생존의 선형 증가가 관찰되었다 (도 5). 모든 용량 ≥ 0.1 mg/kg은 비히클 대조군과 비교하여 생존을 유의하게 증가시켰다 (도 3).
본 연구로부터의 결과는 파종성 MM.1S 모델에서 접합체 4가 종양 부담을 감소시키고 생존을 연장시키는데 있어서 등가 용량의 접합체 1보다 유의하게 더 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 9
NSG 마우스의 파종성 MM.1S 모델에서 MM SOC 벨케이드/보르테조밉 또는 다르잘렉스/다라투무맙과 조합된 접합체 4의 효능의 평가
NSG 마우스의 파종성 MM.1S 모델에서 MM 표준 관리 (SOC) 작용제 벨케이드 및 다라투무맙과 조합된 접합체 4의 효능을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.
9-12주령의 암컷 NOD 중증 복합 면역 결핍 (SCID) 감마 (NSG) 마우스에게 5 x 106개 다발성 골수종 MM.1S 세포를 꼬리 정맥 내로 접종하였다. 종양 접종 7일 후에 체중별 무작위화 및 처리 시작을 개시하였다. 처리군을 표 11에 요약한다. 모든 수트로(Sutro) 임상시험용 시험 물품은 10 mM 시트레이트 pH 6.0, 10% 수크로스 중에 제제화하였다. 임상 등급 다라투무맙 및 벨케이드 (파마슈티칼 부이어스 인터내셔널(Pharmaceutical Buyers International))를 제조업체의 권장사항에 따라 제제화하였다. 시험 물품을 복강내 (IP) 또는 정맥내 (IV) 주사에 의해 투여하였다. 체중을 1 - 2x/주로 모니터링하였다. 연구 종점은 생존으로, 이는 > 20% 체중 감소, 및 기면, 뒷다리 마비 또는 빈사율을 포함한 임상 징후를 특징으로 하였다.
표 11. 처리군의 목록
Figure pct00033
평균 생존 (일)을 분석하여, 각각 일원 분산 분석 (ANOVA) 및 던넷 및 시닥 다중 비교 검정을 사용하여 처리 대 비히클 또는 관련 처리군의 효과를 서로 비교하였다. 5% 미만의 확률 (p < 0.05)을 유의한 것으로 간주하였다.
본 연구에서, 확립된 MM.1S 종양을 보유하는 동물을 접종 후 제7일에 0.25 mg/kg 접합체 4 (단일 용량), 3 mg/kg 다라투무맙 (단일 용량), 10 mg/kg 다라투무맙 (단일 용량), 0.8 mg/kg 벨케이드 (q7dx2), 또는 0.25 mg/kg 접합체 4와 각각의 용량의 다라투무맙 또는 벨케이드의 조합물로 처리하였다. 또한, 10 mg/kg의 접합체 4의 단일 고용량을 투여하였다.
도 6은 모든 처리가 초기에 최소 체중 감소 (~5% 체중 감소)를 유도하였고 내약성이 우수하였음을 보여준다. 이 모델에서 예상된 바와 같이, 비히클 대조군 동물에서의 체중 감소는 대략 제24일에 시작하였고, 이어서 뒷다리 마비, 입모, 및 기면을 포함한 임상 징후의 발생과 동시에 진행성 체중 감소 (> 20%까지)가 이어졌다. 도 7a-7c는 단일 작용제 또는 조합물로서의 0.25 mg/kg 접합체 4 및 MM SOC 치료에 대한 반응으로의 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 비히클 군에 대한 평균 생존은 30.6일이었다 (도 7a-7c). 0.25 mg/kg 접합체 4 또는 0.8 mg/kg 벨케이드로의 단일 작용제 처리는 비히클 대조군과 비교하여 유의하게 더 긴 평균 생존 (각각 50.2 및 40.6일)을 발생시켰다 (도 7a). 접합체 4 + 벨케이드의 공투여는 어느 하나의 단일 작용제와 비교하여 유의하게 상이한 61.2일의 평균 생존으로 상가적 효과를 갖는 것으로 보였다. 한편, 3 또는 10 mg/kg의 단일 작용제 다라투무맙은 비히클 대조군과 비교하여 생존에 대한 어떠한 유의한 효과도 갖지 않았다 (도 7a, 도 7b 및 도 7c). 그러나, 접합체 4 + 어느 하나의 용량의 다라투무맙은 단일 작용제 단독과 비교하여 유의하게 연장된 평균 생존 (각각 71.6일 및 75.6일)을 발생시켰다 (도 7b 및 도 7c). 단일 작용제 다라투무맙 효능의 결여는 접합체 4와의 조합의 상승작용적 효과를 시사한다.
도 8a는 10 mg/kg의 보다 높은 용량의 접합체 4에 대한 반응의 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 10 mg/kg 접합체 4로 처리된 동물의 평균 생존은 89.4일이었고, 이는 비히클 대조군 또는 0.25 mg/kg 접합체 4와 비교하여 유의하게 연장되었다 (도 8b).
본 연구로부터의 결과는 벨케이드 또는 다라투무맙과 조합된 접합체 4가 접합체 4 또는 MM SOC 단일 작용제 단독과 비교하여 효능을 유의하게 강화시켰음을 보여준다. NSG 마우스는 NK 세포가 결여되어 있기 때문에, 이 모델에서 다라투무맙에 의해 관찰된 조합 이익은 그의 NK-비의존성 기능에 기인할 수 있음을 주목하여야 한다 (Phipps C et al., 2015, Ther. Adv. Hem. 63:120-127). 또한, 10 mg/kg 접합체 4로의 처리는 비히클 또는 0.25 mg/kg 접합체 4와 비교하여 생존을 현저하게 연장시켰다.
실시예 10
피하 ARP-1 종양에서의 상이한 항-BCMA 항체를 갖는 BCMA ADC 변이체의 효능의 평가
본 실시예는 피하 ARP-1에서의 BCMA ADC 변이체의 활성을 평가한다.
10주령의 암컷 SCID 베이지 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 8 x 106개의 인간 ARP-1 MM 세포 및 매트리겔의 1:1 혼합물을 우측 뒷쪽 측복부에 피하로 이식하였다. 평균 종양 크기가 대략 150 mm3 (이식 14일 후)일 때 무작위화 및 처리 시작 (처리 후 제0일)을 개시하였다. 시험 물품 및 처리군을 표 12에 요약한다. 모든 임상시험용 시험 물품은 10 mM 시트레이트 pH 6.0, 10% 수크로스 중에 제제화하였다. 체중 및 종양 크기를 적어도 1-2x/주로 모니터링하였다. 1차 연구 종점은 비히클 대조군의 평균 종양 크기가 > 1,200 mm3일 때였다.
표 12. 처리군의 목록
Figure pct00034
종양 크기를 일원 분산 분석 (ANOVA) 및 던넷 다중 비교 검정을 사용하여 분석하였다. 5% 미만의 확률 (p < 0.05)을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
본 연구에서, 확립된 ARP-1 종양을 보유하는 동물을 상이한 항-BCMA 항체를 갖는 BCMA ADC 변이체 및 접합체 1의 3 mg/kg으로 1회 처리하였다. 모든 시험 물품은 내약성이 우수하였고, 체중의 >20% 감소로 정의되는 어떠한 실질적인 독성도 나타내지 않았다.
제14일 (비히클 대조군 종양의 평균이 > 1,200 mm3일 때)의 종양 크기의 통계적 분석은 모든 처리군이 대조군과 비교하여 유의하게 효과적임을 보여주었다. 접합체 4 (~70% TGI, p <0.001)는 p 값에 기초하여 효과적이었다. 계속된 모니터링은 접합체 4가 강력하였음을 보여주었다. 접합체 1은 ~제17일까지 종양 퇴행 및 정체를 유도하는 가장 강력한 것이었다.
실시예 11
보다 높은 용량의 접합체 4에 대한 피하 ARP-1 다발성 골수종 종양의 반응의 평가
보다 높은 용량의 접합체 4에 대한 피하 ARP-1 다발성 골수종 종양의 반응을 평가하기 위한 연구를 수행하였다.
9주령의 암컷 중증 복합 면역 결핍 (SCID) 베이지 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 1 x 107개의 인간 ARP-1 MM 세포 및 매트리겔의 1:1 혼합물을 우측 뒷쪽 측복부에 피하로 이식하였다. 평균 종양 크기가 대략 150 mm3 (이식 14일 후)일 때 무작위화 및 처리 시작 (처리 후 제0일)을 개시하였다. 처리군을 표 13에 요약한다. 모든 수트로 임상시험용 시험 물품은 10 mM 시트레이트 pH 6.0, 10% 수크로스 중에 제제화하였다. 체중 및 종양 크기를 1주에 1 - 2x 모니터링하였다. 1차 연구 종점은 비히클 대조군의 평균 종양 크기가 > 1,500 mm3일 때였다.
표 13. 처리군의 목록
Figure pct00035
체중 및 종양 크기를 일원 분산 분석 (ANOVA) 및 던넷 다중 비교 검정을 사용하여 분석하였다. 5% 미만의 확률 (p < 0.05)을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
본 연구에서, 확립된 ARP-1 종양을 보유하는 동물을 5 내지 20 mg/kg 범위의 4가지 용량 수준의 접합체 4 또는 5 mg/kg 접합체 1로 1회 처리하였다. 모든 시험 물품은 내약성이 우수하였고, 체중 감소에 기초하여 어떠한 독성도 나타내지 않았다 (도 9). 그러나, 연구가 진행됨에 따라, 나머지 모든 처리군에서 체중 증가가 관찰되었고, 5 mg/kg 접합체 1로 처리된 동물에서 가장 큰 체중 변화가 있었다. 일부 동물에서 체중뿐만 아니라 팽창된 복부의 계속적인 증가가 주목되었고, 이는 이러한 모델에서 전형적으로 관찰되는 내부 ARP-1 종양의 형성을 시사하였다. 이러한 이유로, 연구를 제52일에 종결하였다.
ARP-1 종양 성장에 대한 BCMA ADC 접합체 4 및 접합체 1 처리의 효과를 도 10a 및 10b에 예시한다. 접합체 4 용량을 상승시켰을 때 효력이 증가하는 것이 관찰되었고, 이는 선형 용량-반응 관계를 나타낸다 (도 10a). 비히클 군의 평균 종양 크기가 연구 종점에 도달했을 때인 (> 1,500 mm3) 제11일의 종양 크기의 분석은 접합체 4가 10 mg/kg에서 출발하여 비히클 대조군과 비교하여 유의한 효능을 나타내었음을 보였다 (도 10b). ≥ 10 mg/kg 접합체 4 및 5 mg/kg 접합체 1의 용량은 종양 퇴행을 유도하였다. 8마리의 동물 중 4마리에 대한 종양 재성장이 10 mg/kg 접합체 4 군에서 대략 제11일에 시작되어 관찰된 반면, 성장 억제는 보다 고용량의 접합체 4 또는 5 mg/kg 접합체 1에서 제52일까지 유지되었다 (도 10a 및 도 10b).
본 연구의 결과는 > 15 mg/kg 용량의 접합체 4가 처리 후 > 50일 동안 종양 퇴행 및 연장된 성장 억제를 유도하였음을 보여준다.
실시예 12
수용체 교차-반응성 분석
본 실시예는 조작된 안정한 293T 세포 상의 인간 BCMA, BAFF-R 및 TACI 수용체의 접합체 4 잠재적 교차-반응성 결합 및 인식을 평가한다. 결과는 접합체 4가 BMCA에 특이적으로 결합하지만, 조작된 293T 세포주 상의 BAFF-R 또는 TACI에는 결합하지 않는다는 것을 입증한다. 대조군은 접합체 1이었다.
BCMA, B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R, 또한 TNFRSF13C로도 지칭됨) 및 막횡단 활성화제 및 칼슘-조정제 및 시클로필린 리간드 상호작용자 (TACI, 또한 TNFRSF13B로도 지칭됨)는 TNF (종양 괴사 인자) 리간드, B-세포 활성화 인자 (BAFF, 또한 BLyS로도 지칭됨) 및 B 세포 생존 및 성숙을 촉진하는 a 증식-유도 리간드 (APRIL)에 대한 차등 발현 프로파일 및 친화도를 갖는 상동성-관련 유형 III 막횡단 수용체이다 (Hengeveld and Kerstan, 2015, Blood Cancer Journal 2015 Feb 27; 5:e282).
293T 세포를 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)로부터 구입하고, 플러스(PLUS) 시약과 함께 리포펙타민 LTX 시약 (써모피셔 사이언티픽)을 사용하여 인간 BCMA, BAFF-R 및 TACI를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 안정한 세포주 상에서의 인간 BCMA, BAFF-R 및 TACI의 발현을 바이오레전드(BioLegend)로부터의 상업용 항체, 항-BCMA (클론 19F2), BAFF-R (클론 11C1) 및 TACI (클론 1A1)로 확인하였다.
인간 BCMA를 안정하게 발현하는 조작된 293T 세포를 세포 결합 연구 전에 세크레타제 억제제인 DAPT (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)) 1 μM로 밤새 처리하여 BCMA 발현의 높은 수준을 유지시켰다. 모 293T 세포 및 BCMA, BAFF-R 및 TACI를 안정하게 발현하는 조작된 293T 세포를 수집하고, 세척하고, FACS 완충제 (1% 소 혈청 알부민 및 0.05% v/v 아지드화나트륨을 함유하는 DPBS 완충제) 중에 재현탁시켰다. 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (웰당 100K), Ab와 함께 인큐베이션하였다. 67nM의 항-인간 BCMA ADC를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ADC 결합을 피코에리트린-접합된 항-인간 Fc Ab (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 1시간 동안 얼음 상에서 검출하였다. 비디 FACS 칸토 시스템을 사용하여 세포를 분석하였다. FACS 데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하여 세포 결합 히스토그램을 생성하였다.
포화 농도 (67nM)에서 시험된 접합체 4 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC 둘 다는 인간 BCMA를 발현하는 293T 세포에 대해 특이적 결합을 나타내었지만, BAFF-R 및 TACI에 대해서는 그렇지 않았다 (도 12). 이들 결과는 접합체 4가 BCMA에 특이적으로 결합하지만, BAFF-R 및 TACI에는 그렇지 않다는 것을 나타내었다.
실시예 13
ADC 대 유리 약물 이화대사물의 시험관내 세포독성
본 실시예는 상이한 다발성 골수종 세포주 패널에 대한 접합체 4 및 접합체 1 (말레이미도카프로일 모노메틸아우리스타틴 F) 및 그의 각각의 유리-약물 이화대사물의 상대 세포 사멸 활성을 비교한다.
ADC 및 그의 각각의 유리-약물 이화대사물의 세포독성 효과를 종양 세포 증식 검정에서 2회의 별개의 실험으로 평가하였다. 웰당 20000개의 세포를 96-웰 편평-바닥 반-면적 플레이트에 플레이팅하고, ADC 또는 유리-약물 이화대사물을 세포 배양 배지 중의 세포에 12.5 nM에서 출발하여 0.049 nM까지 (2-배 희석) 및 유리-약물 이화대사물의 경우 2 μM에서 출발하여 0.03 nM까지 (4-배 희석) 첨가하였다 (각각의 실험에 대해 n = 3 반복). 세포를 3일 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 세포 생존율 측정을 위해, 셀 타이터-글로® 시약 (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨)을 첨가하고, 플레이트를 프로세싱하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 판독하였다. 상대 발광을 엔비전® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 매사추세츠주 월섬) 상에서 측정하였다. 대조군으로서 비처리 세포를 사용하여 상대 발광 판독치를 % 생존율로 전환시켰다. 데이터를 그래프패드 프리즘 통계 소프트웨어를 사용하여 log (억제제) vs. 반응, 가변 기울기, 4-파라미터 피트 방정식을 사용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터는 비처리 대조군 세포 대비 % 생존율 vs. ADC의 용량 (nM)으로 표현하였고, 오차 막대는 삼중의 표준 편차 (SD)를 나타낸다.
2개의 독립적 실험에서, 접합체 4 (표 14)는 EC50 값이 0.8 내지 1.8 nM의 범위로, 3종의 BCMA-양성 MM 세포주 (NCI-H929, OPM2 및 U266B1) (표 14)에 대해 유사한 강력한 활성을 나타낸다. 비교상, 접합체 1, J6M0-mcMMAF 대용물 벤치마크 ADC (표 14)는 EC50 값 (0.2 내지 0.9 nM)에 기초하여 약간 더 큰 세포 사멸 효력을 나타내지만, 접합체 4와 유사한 % 스팬 세포 사멸을 갖는다. 둘 다의 ADC는 BCMA-음성 K562 세포주에 대해서는 활성을 나타내지 않는다.
유리-약물 화합물, 4-1 및 4-2로서의 접합체 4의 활성 이화대사물 (표 14)은 BCMA-음성 K562 세포주를 포함하여 모든 3종의 BCMA-양성 MM 세포주에 대해 접합체 4보다 훨씬 더 약한 활성을 나타내었다. 또한, 유리-약물 화합물 1-1로서의 접합체 1의 활성 이화대사물 (표 14)도 또한 4종의 모든 세포주에 대해 접합체 4와 비교하여 더 약한 세포 사멸 활성을 나타내었다.
이들 실험으로부터의 데이터는 항-BCMA ADC 접합체 4가 방출된 이화대사물보다 더 강력하다는 것을 나타내며, 이는 접합체 4의 세포독성이 주로 MM 세포에서의 BCMA-표적화 및 내재화로 인한 것임을 시사한다.
표 14: 시험관내 세포-사멸: ADC 및 이화대사물
Figure pct00036
* : 추정된 값
NC: 불완전 희석 곡선으로 인해 계산가능하지 않음
NK: 사멸이 관찰되지 않음
ADC: 항체 약물 접합체
실시예 14
다발성 골수종 세포주에 대한 GFP 대조군 대비 시험관내 세포독성 비교
본 실시예는 3종의 BCMA-양성 MM 세포주 (NCI-H929, U266B1 및 OPM-2) 및 1종의 BCMA-음성 세포주 (K562)에 대한 DAR4의 각각의 항-GFP 음성 대조군 접합체 접합체 20과 비교하여 접합체 4의 세포 사멸 활성을 평가한다.
본 실험을 위한 음성 대조군 ADC로서, 항-GFP IgG를 무세포 (CF)-생산 항체로서 생성하였다. 항체를 항-GFP 중쇄 상의 동일한 Y180 및 F404 부위에서 동일한 약물 링커 (접합체 M 참조)에 접합시켜 접합체 20을 수득하였다.
접합체 4 및 각각의 항-GFP 음성 대조군 ADC, 접합체 20의 세포독성 효과를 종양 세포 증식 검정에서 2회의 별개의 실험으로 평가하였다. 둘 다의 실험에서, 접합체 4는 모든 3종의 BCMA-양성 MM 세포주 (NCI-H929, OPM-2 및 U266B1)에 대해 0.7 내지 2.0 nM 범위의 EC50 값으로 강력한 세포 사멸 활성을 나타내었다 (표 15). 접합체 4의 경우 BCMA-음성 K562 세포주에 대한 세포 사멸은 관찰되지 않았다. 비교상, 항-GFP 접합체 20 음성 대조군 ADC는 시험된 4종의 세포주 중 임의의 것에 대해 어떠한 세포 사멸 활성도 나타내지 않았다. 이들 실험으로부터의 데이터는 접합체 4의 시험관내 세포 사멸 효과가 BCMA-양성 MM 세포주에서 ADC의 BCMA-표적 매개된 내재화를 통해 매개된다는 것을 시사한다.
표 15: 상이한 세포주에 대한 세포 사멸 EC50 및 스팬의 요약
Figure pct00037
NK=사멸 없음
실시예 15
접합체 세포 사멸 활성의 특이성
실시예는 BCMA-발현 다발성 골수종 세포에 대한 접합체 4의 특이적 세포 사멸 활성을 평가한다.
과량의 비접합된 항-BCMA 항체, 2265-F02, 및 재조합 인간 BCMA 세포외 도메인 (ECD) 단백질 (카탈로그 310-16, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주)의 부재 또는 존재 하의 ADC (접합체 4, 접합체 1)의 세포독성 효과를 종양 세포 증식 검정에서 평가하였다. 웰당 20000개의 세포를 96-웰 편평-바닥 반-면적 플레이트에 플레이팅하였다. 2 μM 농도 (최고 ADC 농도의 100-배 과량)의 재조합 인간 BCMA ECD 단백질을 ADC와 함께 실온에서 1시간 동안 사전-인큐베이션한 후, 이를 세포에 첨가하여 ADC 상의 BCMA 결합 부위를 차단하였다. 비접합된 항-BCMA 항체, 2265-F02를 세포에 500 nM 농도 (최고 ADC 농도의 25-배 과량)로 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 이어서, ADC의 2-배 연속 희석물을 20nM의 출발 농도 및 0.078nM의 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 세포를 3일 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 세포 생존율 측정을 위해, 셀 타이터-글로® 시약 (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨)을 첨가하고, 플레이트를 프로세싱하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 판독하였다. 상대 발광을 엔비전® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 매사추세츠주 월섬) 상에서 측정하였다. 대조군으로서 비처리 세포를 사용하여 상대 발광 판독치를 % 생존율로 전환시켰다. 데이터 (이중의 평균)를 그래프패드 프리즘 통계 소프트웨어를 사용하여 log (억제제) vs. 반응, 가변 기울기, 4-파라미터 피트 방정식을 사용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터를 비처리 대조군 웰 대비 % 세포 생존율 vs. ADC의 나노몰 용량 (nM)으로 플롯팅하였고, 오차 막대는 이중의 표준 편차 (SD)를 나타낸다.
접합체 4 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC (표 16)는 시험된 모든 4종의 BCMA-양성 MM 세포주 (표 16)에 대해 0.4 내지 3.3 nM 범위의 EC50 값으로 강력한 세포 사멸 활성을 나타내었다 (표 16). 모든 4종의 BCMA-양성 세포주에 걸쳐 과량의 비접합된 항-BCMA Ab, 2265-F02, 또는 재조합 인간 BCMA ECD 단백질의 존재 하의 접합체 4 또는 접합체 1에 대해서는 어떠한 세포 사멸도 관찰되지 않았다. 본 실험으로부터의 데이터는 접합체 4의 시험관내 세포 사멸 효과가 BCMA에 특이적이라는 것을 나타낸다.
표 16: 상이한 세포주에 대한 세포 사멸 EC50 및 스팬의 요약
Figure pct00038
NK=사멸 없음
실시예 16
시험관내 세포 결합 및 세포 사멸: 다발성 골수종 세포주
본 실시예는 BCMA를 발현하는 다발성 골수종 (MM) 세포주의 대형 패널에 걸쳐 접합체 4 대 접합체 1 (말레이미도카프로일 모노메틸아우리스타틴 F) 대용물 벤치마크 ADC의 시험관내 세포 결합 및 세포 사멸 효력을 비교한다. 이러한 실험에서, 접합체 4는 대용물 벤치마크 ADC와 비교하여 더 우수한 세포 결합 및 유사한 강력한 세포 사멸을 나타낸다.
NCI-H929, U266B1, RPMI-8226, MM.1S, MC/CAR 및 K-562 세포를 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 버지니아주 마나사스)로부터 구입하였다. OPM-2 세포는 더 라이프니츠 인스티튜트 DSMZ(The Leibniz Institute DSMZ) (독일 브라운슈바이크 소재의 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스 게엠베하(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH))로부터 구입하였다. ARP-1 세포는 트랜스레이셔널 게노믹스 리서치 인스티튜트(Translational Genomics Research Institute) (미국 애리조나주 포에닉스)의 조나탄 제이. 키츠(Jonathan J. Keats) 박사 실험실로부터 허가받았다. 모든 세포주를 20% 열-불활성화 태아 소 혈청 (써모 사이언티픽, 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 2mM 글루타맥스 (써모 사이언티픽, 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (코닝(Corning), 뉴욕주 코닝)으로 보충된 RPMI 고 글루코스 배지 (코닝, 뉴욕주 코닝) 중에 유지시켰다.
종양 세포를 수집하고, 세척하고, FACS 완충제 (1% 소 혈청 알부민 및 0.05% v/v 아지드화나트륨을 함유하는 DPBS 완충제) 중에 재현탁시켰다. 실온에서 10분 동안 2.5μg의 인간 Fc 블록 (비디 바이오사이언시스, cat 564220)과 함께 사전-인큐베이션한 MM 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (웰당 100-200K), 항체 (66.7nM로부터 3-배 연속 희석으로 적정됨)와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체 결합을 피코에리트린-접합된 항-인간 Fc Ab (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 1시간 동안 얼음 상에서 검출하였다. 비디 FACS 칸토 시스템을 사용하여 세포를 분석하였다. 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하여 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하였고 (n=3 반복), 데이터 (평균 MFI +/- 평균의 표준 오차 [SEM] 대 항체의 nM)를 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 생성하였다.
접합체 4, 2265-F02 (접합체 4의 음성 비접합된 항체 버전으로서) 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC의 세포독성 효과를 종양 세포 증식 검정에서 평가하였다.
접합체 4 및 그의 비접합된 항체 버전인 2265-F02 둘 다는 6종의 MM 세포주 (NCI-H929, ARP-1, OPM-2, U266B1, MM.1S 및 RPMI-8226)에 대해 0.9 내지 3.9 nM 범위의 KD로 유사하게 높은 친화도 결합을 나타냈다. 비교상, 접합체 1 mcMMAF 대용물 벤치마크 ADC는 보다 약한 결합을 나타냈다. 2265-F02에 대한 결합 곡선은 66.7nM에서 포화되지 않았다. 시험된 모든 3종의 Ab는 BCMA-음성 골수종 MC/CAR 세포에 대해서는 유의한 결합을 나타내지 않았다 (표 17). 결과는 F404/Y180 부위에서의 약물-링커 접합이 항-BCMA 항체의 결합에 영향을 미치지 않고, 접합체 4 ADC는 BCMA-발현 MM 세포주에 대해 높은 친화도 결합을 갖는다는 것을 나타낸다.
접합체 4 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC 둘 다는 BCMA를 발현하는 6종의 MM 세포주 중 5종에 걸쳐 유사한 강력한 세포 사멸 활성을 나타내었다. 세포 사멸 효력 EC50은 각각 접합체 4 ADC에 대해 0.70 내지 2.1의 범위였고, 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC에 대해 0.29 내지 1.4 nM의 범위였다 (표 18). 낮은 BCMA-발현 RPMI-8226 MM 세포주에 대해서는 ADC 둘 다에 대해 낮은 세포 사멸 활성이 관찰되었다. 결과는 접합체 4가 다중 MM 세포주에 대해 강력한 세포 사멸 잠재력을 갖는다는 것을 나타낸다.
접합체 4는 BCMA-발현 MM 세포주에 높은 친화도로 결합하고, 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC와 유사하게, BCMA를 발현하는 6종의 MM 세포주 중 5종에 걸쳐 강력한 세포 사멸 활성을 나타낸다.
표 17: 상이한 MM 세포주에 대한 KD 및 Bmax 결합의 요약
Figure pct00039
<LOD = 검출 한계 미만
NC = 결합이 관찰되지만, KD 및 Bmax는 불완전 희석 곡선으로 인해 계산가능하지 않음
NSB = 유의한 결합 없음
표 18: 상이한 MM 세포주에 대한 EC50 및 세포 사멸 스팬의 요약
Figure pct00040
<LOD = 검출 한계 미만
NC = 세포 사멸이 관찰되지만, EC50 및 스팬은 불완전 희석 곡선으로 인해 계산가능하지 않음
NK = 사멸 없음
실시예 17
시험관내 세포 결합 및 세포 사멸:
종 교차-반응성
본 실시예는 인간, 시노몰구스 영장류, 래트, 또는 마우스 BCMA를 과다발현하는 안정한 293T 세포에 대한 접합체 4 대 접합체 1 (말레이미도카프로일 모노메틸아우리스타틴 F) 대용물 벤치마크 ADC의 시험관내 세포 결합 및 세포 사멸 효력을 비교한다.
293T 세포를 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)로부터 구입하고, 플러스 시약과 함께 리포펙타민 LTX 시약 (써모피셔 사이언티픽)을 사용하여 인간, 시노몰구스 영장류 또는 래트 BCMA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 퓨진(FUGENE) HD 시약 (프로메가)을 사용하여 HEK293T 세포를 마우스 BCMA를 코딩하는 플라스미드 (인비보젠(Invivogen))로 형질감염시켜 293T-마우스 BCMA 세포를 생성하였다.
인간, 시노몰구스 영장류 또는 래트 BCMA를 안정하게 발현하는 조작된 293T 세포를 세포 결합 연구 전에 γ-세크레타제 억제제인 DAPT (산타 크루즈 바이오테크놀로지) 1 μM로 밤새 처리하여 BCMA 발현의 높은 수준을 유지시켰다. 세포를 수집하고, 세척하고, FACS 완충제 (1% 소 혈청 알부민 및 0.05% v/v 아지드화나트륨을 함유하는 DPBS 완충제) 중에 재현탁시켰다. 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (웰당 100K), Ab (200 nM로부터 2-배 연속 희석으로 적정됨)와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Ab 결합을 피코에리트린-접합된 항-인간 Fc Ab (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 1시간 동안 얼음 상에서 검출하였다. 비디 FACS 칸토 시스템을 사용하여 세포를 분석하였다.
293T-마우스 BCMA 세포를 수집하고, 세척하고, FACS 완충제 (1% 소 혈청 알부민 및 0.05% v/v 아지드화나트륨을 함유하는 DPBS 완충제) 중에 현탁시켰다. 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (웰당 100k), 항체 (200nM로부터 반-로그 연속 희석으로 적정됨)와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 다음, 항체 결합을 피코에리트린-접합된 항-인간 Fc 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 1시간 동안 얼음 상에서 검출하였다. 비디 LSR-포르테사 X-20 유동 세포측정 시스템을 사용하여 세포를 분석하였다. FACS 데이터를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하여 기하 형광 강도 (gMFI)를 계산하였고 (n=3 반복), 데이터 (기하 평균 MFI +/- SEM 대 log nM Ab)를 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 생성하였다.
SP8919 ADC 및 J6M0-mcMMAF 대용물 벤치마크 ADC의 세포독성 효과를 종양 세포 증식 검정에서 평가하였다. 웰당 500개의 세포를 96-웰 편평-바닥 반-면적 플레이트에 밤새 플레이팅하고, 다음날 ADC를 세포 배양 배지 중의 세포에 20 nM (2-배 희석)에서 출발하여 첨가하였다 (n = 3 반복). 세포를 5일 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 세포 생존율 측정을 위해, 셀 타이터-글로® 시약 (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨)을 첨가하고, 플레이트를 프로세싱하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 판독하였다. 상대 발광을 엔비전® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 매사추세츠주 월섬) 상에서 측정하였다. 대조군으로서 비처리 세포를 사용하여 상대 발광 판독치를 % 생존율로 전환시켰다. 데이터를 그래프패드 프리즘 통계 소프트웨어를 사용하여 log (억제제) vs. 반응, 가변 기울기, 4-파라미터 피트 방정식을 사용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 피팅하였다. 데이터를 % 상대 세포 생존율 vs. ADC의 용량 (평균 +/- SEM)으로 표현하였다.
접합체 4 및 그의 비접합된 Ab 버전, 2265-F02 Y180/F404 둘 다는 인간 및 시노몰구스를 과다발현하는 293T 세포에 대해 유사하게 높은 친화도 결합을 나타내었지만, 모 293T 세포 또는 래트 BCMA 또는 마우스 BCMA를 발현하도록 안정하게 형질감염된 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 인간 및 시노몰구스 BCMA-발현 293T 세포에 대한 Kd 결합은 1.4 내지 2.8 nM 범위였다 (표 19). 비교상, 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC는 7.1 내지 8.6 nM 범위의 Kd 값으로 약간 더 약한 결합 활성을 나타냈다 (표 19). 결과는 F404/Y180 부위에서의 링커 페이로드 접합이 비접합된 Ab 대조군과 비교하여 항-BCMA 접합체 4의 결합에 영향을 미치지 않고, 접합체 4가 인간 및 시노몰구스 영장류 BCMA에 결합하지만 래트 또는 마우스 BCMA에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
양성 종 교차-반응성 세포 결합 결과에 기초하여, 접합체 4 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC의 세포 사멸 활성을 인간 또는 시노몰구스 영장류 BCMA를 발현하는 293T 세포에 대해 비교하였다. 접합체 4 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC 둘 다는 인간 및 시노몰구스 영장류 BCMA를 발현하는 안정하게-형질감염된 293T 세포에 대해 유사한 세포 사멸 활성을 나타내었지만, 모 293T 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 결과는 접합체 4가 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC와 유사한 시노몰구스 영장류 BMCA 결합 반응성을 갖는다는 것을 나타내며, 이는 세포 사멸 검정에 의해 확인되었다.
전반적으로, 이 실험으로부터의 결과는 접합체 1 및 접합체 4가 인간 및 시노몰구스 영장류 BCMA를 과다발현하는 293T 세포에 대해 특이적 세포 결합 인식 및 세포 사멸 감수성을 나타내었지만, 래트 또는 마우스 BCMA에는 결합하지 않았음을 나타낸다. 이는 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC와 유사하게, 접합체 4가 시노몰구스 영장류에서 독성 평가에 대해 시험될 수 있다는 것을 시사한다.
표 19: 인간, 시노몰구스 영장류, 래트 또는 마우스 BCMA를 안정하게 발현하는 293T 세포에 대한 Kd 및 Bmax 결합의 요약
Figure pct00041
hBCMA: 인간 BCMA, cBCMA: 시노몰구스 BCMA, rBCMA: 래트 BCMA, mBCMA: 마우스 BCMA, NB: 결합 없음
실시예 18
BAFF 및 APRIL 리간드에 대한 BCMA 결합의 ADC 차단
본 실시예는 리간드 BAFF (B 세포 활성화 인자) 및 APRIL (a 증식 유도 리간드)에 대한 BCMA 수용체 결합을 차단하는데 있어서 접합체 4 ADC 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC를 비교한다.
BCMA는 리간드, BAFF 및 APRIL에 결합하여 골수 형질 세포 및 형질모구의 생존, 뿐만 아니라 MM 세포 성장 및 생존을 매개한다. 문헌 [Tai et al., 2014, Blood 123(20):3128-38]. J6M0 Ab는 BCMA-발현 MM 세포를 표적화하는 ADC인 것에 더하여, 추가의 치료 작용 메카니즘으로서 BAFF 및 APRIL 결합을 차단하는 것으로 보고되어 있다. [Tai et al., 상기 문헌].
재조합 인간 BCMA ECD 단백질 (아크로 바이오시스템즈(Acro Biosystems))을 96-웰 눈크 맥시소르프(Nunc MaxiSorp) 플레이트에서 4℃에서 밤새 카르보네이트/비카르보네이트 pH 9.6 완충제 (시그마-알드리치) 중 0.5 μg/ml로 코팅하였다. 모든 하기 단계는 실온에서 수행하였다. 플레이트를 PBST 완충제 (DPBS + 0.05% 트윈-20)로 세척하고, ELISA 차단 완충제 (DPBS + 1% BSA)로 1시간 동안 차단하였다. Ab 및 리간드를 ELISA 희석제 완충제 (DPBS + 0.5% BSA + 0.05% 트윈-20) 중에 희석하고, 200nM의 최종 농도에서 출발한 시험 Ab에 대한 2-배 연속 희석물과 각각 1 ng/ml 및 10 ng/ml 최종 농도의 재조합 리간드, BAFF 또는 APRIL를 1:1 부피 비로 혼합하였다. 혼합된 Ab 및 리간드를 인간 BCMA 코팅된 플레이트에 결합을 위해 2시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-접합된 HRP Ab (잭슨 이뮤노리서치)를 ELISA 희석제 완충제 중에 1,000-배 희석하고, 암실에서 1시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, TMB 기질 (슈어블루 리저브(SureBlue Reserve), KPL)을 암실에서 20분 동안 첨가하였다. 기질 반응을 동일 부피의 1M 인산으로 켄칭하고, 플레이트를 M5 스펙트라맥스 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 상에서 450 nm에서 판독하였다. OD 값을 플롯팅하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 힐 기울기 곡선 (로그 변환)으로 1개의 부위, 특이적 결합을 생성하여 IC50 값 (평균 ± SEM, n = 2)을 결정하였다.
접합체 4 ADC 및 접합체 1 대용물 벤치마크 ADC 둘 다는 재조합 BCMA에 대한 BAFF (표 20) 및 APRIL (표 21) 리간드 결합 둘 다를 차단하는데 있어서 ELISA에 의하면 6.8 내지 8.9 nM 범위의 IC50 값으로 동등한 활성을 나타내었다. 항-Her2 항체 트라스투주맙을 검정에서 음성 대조군으로서 첨가하였고, 이는 BCMA에 대한 BAFF 또는 APRIL 결합을 차단하지 않았다.
결과는 접합체 4 ADC가 BCMA에 대한 BAFF 및 APRIL 리간드 결합 둘 다를 차단한다는 것을 나타내고, 이는 접합체 4 ADC가 MM 세포 증식을 잠재적으로 감소시키는데 있어서 접합체 1과 동일한 추가의 작용 메카니즘을 공유할 수 있다는 것을 시사한다.
표 20: 요약 BAFF IC50
Figure pct00042
표 21: 요약 APRIL IC50
Figure pct00043
실시예 19
접합체 4의 화학적 특징
접합체 4는 항체 및 약물-링커의 접합체이다. 접합체 4는 EU 넘버링에 의하면 공칭 위치 180 및 404 (실제 위치 186 및 410)에서 비-천연 아미노산 (nnAA) 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌 (pAMF) 잔기에서 20-메틸-1-(3-메틸-3,9-디히드로-8H디벤조[b,f][1,2,3]트리아졸로[4,5-d]아조신-8-일)-1,5,21-트리옥소-8,11,14,17-테트라옥사-4,20- 디아자펜타코산-25-오일 (데스아세틸) 메이탄시노이드 약물-링커에 공유 접합된 항-BCMA IgG1 인간화 항체 (비-글리코실화 2265-F02)로 구성된 비-글리코실화 항-B-세포 성숙 항원 (항-BCMA) 인간화 IgG1 항체 약물 접합체 (ADC)이다. ADC, 접합체 4는 약물 대 항체 비 (DAR)가 4인 단일의 우세한 접합된 종이다 (2종의 위치이성질체의 ~1:1 혼합물로서 존재함). 접합체 4의 분자량은 대략 151 kDa이다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 접합체 4의 샘플은 본원에 기재된 방법을 사용하여 측정되고 계산된 바와 같이 3.9 내지 4의 DAR을 나타내었다 (예를 들어, 실시예 6 참조).
접합체 4에서의 디술피드 결합은 하기와 같다: 쇄간 (LC1): Cys 24-Cys 89; Cys 135-Cys 195. 쇄간 (HC1): Cys 23-Cys 97; Cys 150-Cys 206; Cys 267-Cys 327; Cys 373-Cys 431. 쇄간 (HC2): Cys 23-Cys 97; Cys 150-Cys 206; Cys 267-Cys 327; Cys 373-Cys 431. 쇄간 (LC2): Cys 24-Cys 89; Cys 135-Cys 195. 쇄내-LC1-HC-1: Cys 215-Cys 226. 쇄내-LC2-HC-2: Cys 215-Cys 226. 쇄내-HC-HC-힌지-1: Cys 232-Cys 232. 쇄내-HC-HC-힌지-2: Cys 235 - Cys 235.
실시예 20
서열
표 22는 본원에 언급된 서열을 제공한다.
표 22. 서열
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
등가물
상기 제시된 개시내용은 독립적 유용성을 갖는 다수의 별개의 발명을 포괄할 수 있다. 각각의 이들 발명이 그의 바람직한 형태(들)로 개시되었지만, 본원에 개시되고 예시된 바와 같은 그의 구체적 실시양태는 수많은 변형이 가능하기 때문에 제한적 의미로 간주되어서는 안된다. 본 발명의 대상은 본원에 개시된 다양한 요소, 특색, 기능, 및/또는 특성의 모든 신규하고 비자명한 조합 및 하위조합을 포함한다. 하기 청구범위는 특히 신규하고 비자명한 것으로 간주되는 특정 조합 및 하위조합을 지적한다. 특색, 기능, 요소, 및/또는 특성의 다른 조합 및 하위조합으로 구현된 발명은 본 출원에서, 본 출원으로부터 우선권을 주장하는 출원에서, 또는 관련 출원에서 청구될 수 있다. 이러한 청구범위는, 상이한 발명에 관한 것이든 또는 동일한 발명에 관한 것이든, 및 원래 청구범위와 비교하여 범주가 보다 넓든, 보다 좁든, 동일하든, 또는 상이하든, 본 개시내용의 발명의 대상에 또한 포함되는 것으로 간주된다.
본원 또는 도면에 기재된 임의의 실시양태로부터의 하나 이상의 특색은 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 본원 또는 도면에 기재된 임의의 다른 실시양태의 하나 이상의 특색과 조합될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어진 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 상기 발명은 이해의 명확성을 위해 예시 및 예에 의해 일부 상세히 기재되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 청구범위의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 그에 대해 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> SUTRO BIOPHARMA, INC. <120> ANTI-BCMA ANTIBODY CONJUGATE, COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> 14247-525-228 <140> <141> <150> US 62/843,226 <151> 2019-05-03 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human BCMA (Isoform1) <400> 1 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 50 55 60 Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 65 70 75 80 Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 100 105 110 Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys 115 120 125 Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His 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Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 16 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2265-F02, Heavy Chain <400> 16 gaagttcagt tagtggaatc aggcggcggt ttagttcaac caggcggttc attgcgtctg 60 tcatgcgcgg cttccggttt caacatcagt gcgcctggga tccattgggt gcgtcaggcc 120 ccaggcaagg gtctggagtg ggtcggtttt atcaatcctg ctggcggtta taccgactat 180 gcggactctg tgaagggtcg cttcaccatt agcgcggata cctcgaagaa tacggcgtat 240 ttacagatga attccctgcg tgcagaggac actgccgtct actattgtgc gcgcgattac 300 attcggcagt actggaccta cgttcttgac tactggggcc agggtacgct ggtcaccgtg 360 tcgtcggcgt caaccaaggg tccgtcggtt tttccgctgg cgccgtcgtc aaaatctacg 420 tccggtggta ccgccgctct gggttgcctg gttaaagact actttccgga gccggtcacg 480 gtttcgtgga actctggtgc cctgacttct ggcgtccaca cgttcccagc cgttttgcag 540 tcatccggtc tgtagtcgtt gtcctctgtg gtcacggtgc cgtcatcgtc tctgggcacc 600 caaacctata tctgcaatgt caaccacaaa ccgtccaata cgaaagttga caaaaaagtc 660 gagccgaaat cttgcgacaa gacccacacg tgccctccgt gcccggcacc ggaactgctg 720 ggcggtccgt cggtgttcct gttcccgccg aagccgaaag atactctgat gatctcacgt 780 accccggaag tcacgtgtgt tgttgttgac gtgtcacacg aagatccaga ggtgaaattc 840 aattggtatg tggacggtgt cgaagtgcat aatgccaaaa ccaaaccgcg cgaggaacag 900 tacaactcca cctaccgcgt cgtgtcggtg ttgaccgtcc tgcatcaaga ctggctgaac 960 ggtaaagagt acaagtgcaa ggtttcaaat aaggcactgc ctgcgccgat tgaaaagacc 1020 atctctaagg caaagggcca gccgcgtgag ccacaggtgt ataccctgcc gccgtcgcgt 1080 gaagaaatga ccaagaacca agtttcactg acgtgtctgg tcaagggctt ttatccgtcc 1140 gatattgcgg tggagtggga gtctaatggc cagccggaaa acaattacaa aacgactccg 1200 ccggtgctgg attccgacgg ttcgtagttc ctgtattcca agctgaccgt tgacaaatca 1260 cgttggcagc aaggcaacgt tttttcttgt tcggtaatgc acgaagcgct gcacaatcat 1320 tacacccaga aatcactgtc gttgtctccg ggcaaa 1356 <210> 17 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2265-F02, Light Chain <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 18 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2265-F02, Light Chain <400> 18 gacattcaaa tgacccagtc tccgtcgtca ctgtccgcat ccgttggcga ccgcgttacc 60 atcacgtgcc gtgcgtcgca agatgtgaac accgccgtgg cgtggtatca gcaaaaaccg 120 ggcaaagctc cgaagctgct gatctattca gcctctttcc tgtactcggg tgttccgtcc 180 cgtttctcag gctctcgctc gggtacggat ttcaccctga ctatttcttc actgcaaccg 240 gaagattttg cgacgtacta ctgtcagcag cattacacga ctccgccgac ctttggtcag 300 ggtaccaagg tcgagattaa gcgtaccgtg gctgcaccat ccgtgtttat cttccctccg 360 tctgatgagc agctgaaatc cggtacggcg tcggtcgtct gcttgctgaa taacttctat 420 ccgcgtgaag cgaaggtgca atggaaggtt gacaatgccc tgcagtcagg taactcccaa 480 gagtctgtta ccgaacaaga ttcgaaagac tcaacctact ccctgtcttc gacgctgacg 540 ttgtccaaag cggactatga gaaacacaag gtttacgcat gtgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtcatctc cggtcaccaa atcatttaat cgcggtgagt gc 642 <210> 19 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IgG1 HC Constant <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IgG LC Constant Ckappa <400> 20 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 21 <211> 323 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Mouse IgG1 HC Constant <400> 21 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Mouse IgG LC Constant Ckappa <400> 22 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kappa LC <400> 23 His Met Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 1 5 10 15 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 20 25 30 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 35 40 45 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 50 55 60 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 85 90 95 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 24 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lambda LD <400> 24 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FlagHis Tag <400> 25 Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly His His 1 5 10 15 His His His His 20 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 27 Ala Ala Gly Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(30) <223> "Gly Gly Gly Gly Ser" may or may not be present <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30

Claims (32)

  1. 하기 화학식에 따른 항체 접합체:
    Figure pct00050

    여기서 n은 1 내지 4이고;
    항체는 서열식별번호: 13의 VH 영역 및 서열식별번호: 14의 VL 영역을 포함하고;
    항체는 EU 넘버링 스킴에 따른 각각의 부위 HC-F404 및 HC-Y180에서 치환된 p-아지도메틸-페닐알라닌의 잔기를 추가로 포함하고;
    화학식의 괄호 내의 각각의 구조는 p-아지도메틸-페닐알라닌 잔기 중 하나에서 항체에 결합된다.
  2. 제1항에 있어서, n이 1인 항체 접합체.
  3. 제1항에 있어서, n이 2인 항체 접합체.
  4. 제1항에 있어서, n이 3인 항체 접합체.
  5. 제1항에 있어서, n이 4인 항체 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 불변 영역 도메인을 추가로 포함하는 항체 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 불변 영역이 서열식별번호: 19 및 20, 또는 둘 다로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 항체 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항체 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM인 항체 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화 또는 인간 항체인 항체 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 비-글리코실화된 것인 항체 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 단편인 항체 접합체.
  13. 제12항에 있어서, 항체 단편이 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, scFv (sFv) 단편, 및 scFv-Fc 단편으로부터 선택된 것인 항체 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 항체가 scFv 단편인 항체 접합체.
  15. 제13항에 있어서, 항체가 scFv-Fc 단편인 항체 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 시노몰구스 BCMA 수용체에 특이적으로 결합하는 것인 항체 접합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 마우스 BCMA 수용체에 특이적으로 결합하는 것인 항체 접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 접합체 및 항체 접합체의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  19. 제18항에 있어서, 항체 접합체가 동결건조된 것인 키트.
  20. 제19항에 있어서, 동결건조된 항체의 재구성을 위한 유체를 추가로 포함하는 키트.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  22. 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 접합체 또는 제21항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법.
  23. 질환 또는 상태의 진단을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 접합체 또는 제21항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 상태를 진단하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 질환 또는 상태가 암인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상태가 백혈병인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상태가 림프종인 방법.
  27. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상태가 다발성 골수종인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 다발성 골수종이 국제 병기결정 시스템 또는 개정된 국제 병기결정 시스템에 따른 I기인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 다발성 골수종이 국제 병기결정 시스템 또는 개정된 국제 병기결정 시스템에 따른 II기인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 다발성 골수종이 국제 병기결정 시스템 또는 개정된 국제 병기결정 시스템에 따른 III기인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 다발성 골수종이 새로 진단된 다발성 골수종인 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 다발성 골수종이 재발성 또는 불응성 다발성 골수종인 방법.
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