KR20220003563A - 진핵 세포용 세포 배양 배지 - Google Patents

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존 천
캐롤린 스콧
시어도어 로니
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

세포 배양 배지, 세포 배양용 배지의 사용 방법, 및 세포로부터 단백질의 생산 방법이 본원에 제공된다.

Description

진핵 세포용 세포 배양 배지
본 발명은 전체적으로 진핵 세포용 세포 배양 배지, 및 이로부터 유래한 천연 및 재조합 산물의 생산에 관한 것이다.
세포 배양액 제조 기술은 바이오의약품의 생산에 널리 이용되고 있다. 바이오의약품에 대한 요구가 증가함에 따라, 세포 성장, 생존능 및 단백질 생산의 증가에 대한 요구도 또한 상당히 증가하였다. 현재 세포를 성장시키고, 영양을 공급하고, 세포 배양액을 유지하기 위한 방법 및 전략에 대해 많은 노력을 기울이고 있다.
대규모 세포 배양 공정의 난제와 비용, 그리고 더 많은 양과 더 낮은 비용의 생물학적 산물에 대한 요구의 증가를 고려할 때, 재조합 단백질 생산에 대한 꾸준한 개선책을 제공하는 새로운 세포 배양　방법도 가치가 있다. 더 높은 생산 수준을 유도할 수 있는 세포 배양 공정, 재조합 폴리펩티드 발현,　역가 및　세포 생존능에 대한 개선, 및 이로 인한 단백질 치료제 제조 관련 비용의 절감이 필요하다.
개요
단백질-기반 바이오의약 제품의 개발, 제조 및 판매가 성장함에 따라, 바이오의약 제품의 생산을 개선시킬 수 있는 생산 방법에 대한 요구가 증가하였다.
본원에 개시된 구현예들은 이러한 바이오의약 제품의 제조 방법 및 배지를 제공함으로써, 상기 언급된 요구 사항을 해결한다.
본 개시 내용은 적어도 부분적으로 진핵 세포용 세포 배양 배지를 제공한다.
하나의 예시적인 구현예에서, 진핵 세포용 세포 배양 배지는 기초 배지를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 추가로 5-메틸티오아데노신(methylthioadenosine)을 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 nM의 5-메티티오아데노신을 포함할 수 있다. 이 실시예의 또 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 약 10 nM 내지 약 200 nM의 5-메티티오아데노신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 추가로 니코틴아미드(nicotineamide)를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 이 실시예의 또 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 약 2000 nM의 5-니코틴아미드를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지에서 성장한 단백질의 역가는 적어도 약 10 nM의 5-메틸티오아데노신을 포함하지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 크다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지에서 성장한 단백질의 역가는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 포함하지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 크다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 선택적으로 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시-페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 선택적으로 당, 아미노산, 비타민, 염, 미량 금속 이온, 퓨린, 및/또는 피리미딘을 추가로 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 5-메티티오아데노신의 염 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 니코틴아미드의 염 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 약 6.5 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청 배지(serum free medium)일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지(chemically-defined media)일 수 있다.
하나의 예시적인 구현예에서, 진핵 세포용 세포 배양 배지는 영양 공급 배지를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 추가로 5-메틸티오아데노신을 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 nM의 5-메티티오아데노신을 포함할 수 있다. 이 실시예의 또 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 약 10 nM 내지 약 200 nM의 5-메티-티오아데노신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 추가로 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 이 실시예의 또 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 약 50 nM 내지 약 2000 nM의 5-니코틴아미드를 포함할 수 있다. 이 구현예의 대안적인 양태에서, 세포 배양 배지는 추가로 5-메틸티오아데노신 및 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 선택적으로 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시-페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 선택적으로 당, 아미노산, 비타민, 염, 미량 금속 이온, 퓨린, 및/또는 피리미딘을 추가로 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 5-메티티오아데노신의 염 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 니코틴아미드의 염 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 약 6.5 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 선택적으로 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지에서 성장한 단백질의 역가는 적어도 약 10 nM의 5-메틸티오아데노신을 포함하지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 크다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지에서 성장한 단백질의 역가는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 포함하지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 크다.
본 개시 내용은, 적어도 부분적으로, 단백질의 생산 방법을 제공한다.
하나의 예시적인 구현예에서, 단백질의 생산 방법은 세포 배양 생산 배지에서 단백질을 암호화하는 핵산을 갖는 진핵 세포를 배양하는 단계, 및 특정 시기 동안 5-메틸티오아데노신을 갖는 영양 강화 배지(enriched media)를 사용하여 진핵 세포에 영양을 공급하는(feeding) 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 영양 강화 배지는 적어도 약 1 nM의 5-메틸티오아데노신을 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시-페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 당, 아미노산, 비타민, 염, 미량 금속 이온, 퓨린, 및/또는 피리미딘을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 5-메티티오아데노신의 염 또는 에스테르을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 약 6.5 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않을 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 화학적-구명 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 진핵 세포는 새끼 햄스터 신장 세포주, 중국 햄스터 난소 세포주, 쥣과 골수종 세포주, 마우스 골수종 세포주, 인간 배아 신장 세포주, 인간-망막-유래 세포주 및/또는 양수 세포주로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 단백질은 항체 또는 이의 절편 또는 유도체, 융합 단백질, 및 생리학적 활성 비-항체 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 상기 방법은 적어도 약 10 nM의 5-메티티오아데노신을 갖지 않는 세포 배양 생산 배지에서의 단백질의 역가보다 적어도 약 2% 더 큰 단백질의 역가를 생산할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 영양 강화 배지는 선택적으로 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 단백질의 생산 방법은 유가-배양(fed-batch) 방법일 수 있다.
하나의 예시적인 구현예에서, 단백질의 생산 방법은 세포 배양 생산 배지에서 단백질을 암호화하는 핵산을 갖는 진핵 세포를 배양하는 단계, 및 특정 시기 동안 니코틴아미드를 갖는 영양 강화 배지를 사용하여 진핵 세포에 영양을 공급하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 영양 강화 배지는 적어도 약 5 nM의 니코틴아미드를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시-페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 당, 아미노산, 비타민, 염, 미량 금속 이온, 퓨린, 및/또는 피리미딘을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 니코틴아미드의 염 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 약 6.5 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 동물 유래 단백질을 포함하지 않는다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 생산 배지는 화학적-구명 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 진핵 세포는 새끼 햄스터 신장 세포주, 중국 햄스터 난소 세포주, 쥣과 골수종 세포주, 마우스 골수종 세포주, 인간 배아 신장 세포주, 인간-망막-유래 세포주 및/또는 양수 세포주로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 단백질은 항체 또는 이의 절편 또는 유도체, 융합 단백질, 및 생리학적 활성 비-항체 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 상기 방법은 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 갖지 않는 세포 배양 생산 배지에서의 단백질의 역가보다 적어도 약 2% 더 큰 단백질의 역가를 생산할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 영양 강화 배지는 선택적으로 5-메틸티오아데노신을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 단백질의 생산 방법은 유가-배양 방법일 수 있다.
본 개시 내용은 적어도 부분적으로, 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
하나의 예시적인 구현예에서, 단백질의 생산을 증가시키는 방법은 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 배양하는 단계, 세포 배양 배지에 5-메티티오아데노신을 보충하는 단계, 및 단백질을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 5-메티티오아데노신의 농도는 적어도 약 10 nM일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 5-메티티오아데노신의 농도는 약 10 nM 내지 약 200 nM일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 당, 아미노산, 비타민, 염, 미량 금속 이온, 퓨린, 및/또는 피리미딘을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 5-메티티오아데노신의 염 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 약 6.5 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 진핵 세포는 새끼 햄스터 신장 세포주, 중국 햄스터 난소 세포주, 쥣과 골수종 세포주, 마우스 골수종 세포주, 인간 배아 신장 세포주, 인간-망막-유래 세포주 및/또는 양수 세포주로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 단백질은 항체 또는 이의 절편 또는 유도체, 융합 단백질, 및 생리학적 활성 비-항체 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 5-메티티오아데노신에 의한 보충은 재조합 단백질의 역가를 적어도 약 2% 증가시킨다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지에는 선택적으로 니코틴아미드가 보충될 수 있다.
하나의 예시적인 구현예에서, 단백질의 생산을 증가시키는 방법은 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 배양하는 단계, 세포 배양 배지에 니코틴아미드를 보충하는 단계, 및 단백질을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 니코틴아미드의 농도는 적어도 약 50 nM일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 5-메티티오아데노신의 농도는 약 50 nM 내지 약 2000 nM일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 당, 아미노산, 비타민, 염, 미량 금속 이온, 퓨린, 및/또는 피리미딘을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 니코틴아미드의 염 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 약 6.5 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 진핵 세포는 새끼 햄스터 신장 세포주, 중국 햄스터 난소 세포주, 쥣과 골수종 세포주, 마우스 골수종 세포주, 인간 배아 신장 세포주, 인간-망막-유래 세포주 및/또는 양수 세포주로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 단백질은 항체 또는 이의 절편 또는 유도체, 융합 단백질, 및 생리학적 활성 비-항체 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 니코틴아미드에 의한 보충은 재조합 단백질의 역가를 적어도 약 2% 증가시킨다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 선택적으로 5-메틸아데노신에 의해 보충될 수 있다.
본 개시 내용은 적어도 부분적으로, 단백질의 생산 방법을 제공한다.
하나의 예시적인 구현예에서, 상기 단백질의 생산 방법은 세포(들)에게 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 도입하는 단계, 및 세포 배양 배지에서 세포(들)을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 nM의 5-메티티오아데노신에 의해 강화될 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드에 의해 강화될 수 있다. 이 실시예의 또 다른 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 nM의 5-메티티오아데노신 및 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드에 의해 강화될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 상기 단백질의 생산 방법은 세포(들)에서 더 높은 역가의 단백질을 발현하도록 세포 배양 배지를 유지하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 상기 단백질의 생산 방법은 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 상기 세포(들)은 새끼 햄스터 신장 세포주, 중국 햄스터 난소 세포주, 쥣과 골수종 세포주, 마우스 골수종 세포주, 인간 배아 신장 세포주, 인간-망막-유래 세포주 및/또는 양수 세포주로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 추가로 당, 아미노산, 비타민, 염, 미량 금속 이온, 퓨린, 및/또는 피리미딘을 포함할 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 약 6.5 내지 약 8의 pH를 가질 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지일 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 단백질은 항체 또는 이의 절편 또는 유도체, 융합 단백질, 및 생리학적 활성 비-항체 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이 구현예의 일 양태에서, 방법은 적어도 약 10 nM의 5-메티티오아데노신을 갖지 않는 세포 배양 배지에서 성장한 세포(들)에 비해, 2% 더 높은 역가의 단백질을 세포(들)에서 발현시킬 수 있다. 본 구현예의 다른 양태에서, 단백질의 생산 방법은 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 갖지 않는 세포 배양 배지에서 성장한 세포(들)에 비해, 2% 더 높은 역가의 단백질을 세포(들)에서 발현하도록 세포 배양 배지를 유지하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 콩 가수분해물에 존재하는 성분들의 연구에 대한 다변량 분석(MVA, multovariate anaysis) 결과를 나타낸다.
도 2는 하나의 예시적인 구현예에 의한 단백질 역가 (g/L)에 대한, 세포 배양 배지를 보충하는데 사용된 강화 배지 내의 5-메티티오아데노신 농도의 효과의 연구로부터 얻은 연관성 데이터를 나타낸다.
도 3은 하나의 예시적인 구현예에 의한 단백질 역가 (g/L)에 대한, 세포 배양 배지 내의 5-메티티오아데노신의 농도의 효과를 평가하는데 사용된 변수 (N= 70)에 관한 회귀선을 나타낸다.
도 4는 하나의 예시적인 구현예에 의한 단백질 역가 (g/L)에 대한, 세포 배양 배지를 보충하는데 사용된 강화 배지 내의 니코틴아미드 농도의 효과의 연구로부터 얻은 연관성 데이터를 나타낸다.
도 5는 하나의 예시적인 구현예에 의한 단백질 역가 (g/L)에 대한, 세포 배양 배지 내의 니코틴아미드의 농도의 효과를 평가하는데 사용된 변수 (N= 70)에 관한 회귀선을 나타낸다.
바이오의약 제품은 진단 및 치료적 응용에 매우 효과적이었다 (Dawn M Ecker, Susan Dana Jones & Howard L Levine,　The therapeutic monoclonal antibody market, 7　mAbs　9-14 (2014); Brian A. Baldo,　Chimeric Fusion binding molecules Used for Therapy: Indications, Mechanisms, and Safety, 38　Drug Safety　455-479 (2015)). 바이오의약 제품을 생산하기 위해 세포를 배양하는데 사용된 일부 세포 배양 배지는 문헌에 잘 기록되어 있으며, 다수의 배지가 시판되고 있다. 세포 배양 배지의 전형적인 성분은 아미노산, 유기 및 무기 염, 비타민, 미량 금속, 당, 액체 및 핵산을 포함하며, 이들의 종류와 양은 소정의 세포 또는 조직 타입의 특정 요건에 따라 달라질 수 있다
단백질 생산의 하나의 목표는 최대량의 단백질을 얻기 위한 세포 배양의 최적화와 가장 효율적인 생산성 수단일 수 있다. 꾸준한(incremental) 개선을 포함하는 어떠한 개선도 경제학적으로 큰 잇점을 가질 수 있다. 약학 산업에서, 질병의 치료를 위한 치료 용도의 생물학제용 단백질 생산의 최적화는, 생물학제가 대규모로 제조될 때, 어떠한 개선도 유의한 영향력을 가질 수 있으므로 유리하다. 정말로, 의약 용도를 위한 생물학제 단백질을 발현하는 세포 배양액으로부터 단백질 생산을 최대화할 필요성이 남아 있다.
달리 기재된 바 없는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 숙련자가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 균등한 임의의 방법과 물질도 실제로 또는 시험적으로 사용될 수 있기는 하지만, 특정한 방법 및 물질을 이하에 기재한다. 언급된 모든 간행물들은 본원에 참조로서 포함된다.
"a"라는 용어는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고; "약" 및 "대략"이라는 용어는 당업계의 통상의 숙련자들이 이해하는 바와 같이 표준 오차를 허용하는 것으로 이해하여야 하며; 범위가 제공되는 경우, 종점도 포함된다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시 내용은 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본원에 사용된 "단백질"이라는 용어는, 공유적으로 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 당업계에 일반적으로 "폴리펩티드"로 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기들, 자연 발생적인 관련 구조적 변형체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 이들의 비-자연 발생적인 합성 유사체, 자연 발생적인 관련 구조적 변형체, 및 이들의 비-자연 발생적인 합성 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드'는 비-자연 발생적인 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 자동 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체상 펩티드 합성 방법들이 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다. 단백질은 하나 또는 다수의 폴리펩티드를 함유하여, 단일 기능 생체물질을 형성할 수 있다. 단백질은 생체-치료(biotherapeutic) 단백질, 연구 또는 치료에 사용된 재조합 단백질, 트랩(trap) 단백질 및 다른 키메라 수용체 Fc-융합 결합 분자, 키메라 단백질, 항체, 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 인간 항체 및 이중 특이적 항체 중 어느 것을 포함할 수 있다. 다른 예시적인 양태에서, 단백질은 항체 절편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 재조합 세포-기반 생산 시스템, 예컨대 곤충 배큘로바이러스 시스템, 효모 시스템 (예를 들어, 피치아(Pichia) 종), 포유류 시스템 (예를 들어, CHO 세포 및 CHO 유도체 유사 CHO-K1 세포)을 사용하여 생산될 수 있다. 생체 치료 단백질 및 이들의 생산을 논의하기 위한 최근의 검토에 대해서는 Darius Ghaderi 등,　Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28　Biotechnology and Genetic Engineering Reviews147-176 (2012)을 참고한다. 일부 구현예에서, 단백질은 변형체, 부가체, 및 다른 공유적으로 연결된 모이어티를 포함한다. 이들 변형체, 부가체 및 모이어티는 예를 들어 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 글리칸(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 퓨코스, 만노스, 및 다른 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAG 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP), 키틴 결합 단백질 (CBP), 글루타티온-S-전달효소 (GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 다른 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성과 용해도에 기초하여 분류될 수 있어서, 단순 단백질, 예컨대, 구형 단백질 및 섬유상 단백질; 접합된 단백질, 예컨대, 핵단백질, 당단백질, 점액 단백질, 색소 단백질, 인단백질, 메탈로 단백질, 및 지질단백질; 및 유도된 단백질, 예컨대, 1차 유도된 단백질 및 2차 유도된 단백질을 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질 또는 단백질, 또는 재조합 단백질 또는 재조합 단백질은, 항체, 이중 특이적 항체, 다중 특이적 항체, 항체 절편, 단일 클론 항체, Fc-융합 결합 분자, F(ab')2 절편, Fc 절편 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 "항체"라는 용어는, 4개의 폴리펩티드 사슬인 디설파이드 결합으로 상호-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄 (L), 뿐만 아니라 이들의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함하는 이뮤노글로빈 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH라고 약칭됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL라고 약칭됨)과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 부위 (CDR)라고 부르는 다변성 영역들로 추가로 세분될 수 있는데, 이들은 프레임워크(framework) 영역(FR)이라고 부르는 더욱 보존된 영역들에 사이에 배치되어 있다. 각각의 VH와 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 이하의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4로 배열된 3개의 CDR와 4개의 FR로 구성될 수 있다. 본 발명의 상이한 구현예들에서, 항-big-ET-1 항체 (또는 이의 항원-결합 부위)의 FR은 인간 생식 계열 서열과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통(consensus) 서열은 둘 이상의 CDR의 병치(side-by-side) 분석에 기초하여 정의될 수 있다. 본원에 사용된 "항체"라는 용어는, 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 절편도 포함한다. 본원에 사용된 항체의 "항원-결합 부위", 항체 등의 "항원-결합 절편" 등의 용어는, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생적인, 효소에 의해 얻을 수 있는, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 절편은 임의의 적합한 표준 기술, 예컨대 단백질 용해성 소화, 또는 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현과 관련된 재조합 유전자 조작 기술을 사용하여, 예를 들어, 전체 항체 분자로부터 유래할 수 있다. 이러한 DNA는 알려져 있고/거나, 예를 들어, 상업적인 공급원인 DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 용이하게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는 서열 분석되고, 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 조작되어, 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인 및/또는 불변 도메인을 적합한 배치로 배열하거나, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하고, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키는 등을 할 수 있다.
본원에 사용된 "단일 클론 항체"라는 용어는, 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 단일 클론 항체는 당업계에서 이용가능하거나 알려진 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시 내용에 대해 유용한 단일 클론 항체는, 당업계에 알려진 매우 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있는데, 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이(phage display) 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질" 또는 "Fc 융합 단백질"은, 둘 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는데, 이들 중 하나는 이들의 자연적 상태에서는 융합되지 않는 이뮤노글로빈 분자의 Fc 부위일 수 있다. 융합 단백질의 제조는 항체-유래 폴리펩티드의 다양한 부위(Fc 도메인 포함)에 융합된 특정 이종 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 예를 들어, A. Ashkenazi 등,　Protection against endotoxic shock by a tumor necrosis factor receptor immunoadhesin., 88　Proceedings of the National Academy of Sciences　10535-10539 (1991); Randal A. Byrn 등,　Biological properties of a CD4 immunoadhesin, 344　Nature　667-670 (1990); Diane Hollenbaugh & Alejandro Aruffo,　Construction of Immunoglobulin Fusion binding molecules,　Current Protocols in Immunology　(2002)에 기재되어 있다. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들) 중 하나 이상을 포함하며, 이는 일부 구현예에서 힌지와, 이후 이뮤노글로빈의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서,
Figure pct00001
단백질은 단일 또는 하나 초과의 리간드(들)에 결합하는 둘 이상의 개별적인 수용체 사슬을 함유할 수 있다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 트랩, 예컨대 IL-1 트랩 (예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 IL-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1 RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트(Rilonacept); 미국 특허 제6,927,004호를 참고하며, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 포함됨), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유하는 아플리버셉트; 예를 들어, 미국 특허 제7,087,411호 및 제7,279,159호를 참고하며, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 포함됨)일 수 있다.
본원에 사용된 "항체 절편"은, 무손상 항체의 부위, 예컨대, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예는 Fab 절편, Fab' 절편, F(ab')2 절편, scFv 절편, Fv 절편, dsFv 디아바디, dAb 절편, Fd' 절편, Fd 절편, 및 분리된 상보성 결정 부위 (CDR) 영역, 뿐만 아니라 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 항체 절편들로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Fv 절편은 이뮤노글로빈 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들의 조합이며, ScFv 단백질은 이뮤노글로빈 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자이다. 일부 예시적인 구현예에서, 항체 절편은 모 항체(parent antibody)의 충분한 아미노산 서열을 함유하는데, 이는 모 항체와 동일한 항원에 결합하는 절편이고; 일부 예시적인 구현예에서, 절편은 모 항체와 견줄만한 친화성으로 항원에 결합하고/거나, 항원에 결합하기 위해 모 항체와 경쟁한다. 항체 절편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 절편은 무손상 항체의 절편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/거나, 이는 부분적인 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합에 의해 생산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 절편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체 절편은 선택적으로 단일 사슬 항체 절편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 절편은 예를 들어, 디설파이드 연결기에 의해 함께 연결된 다수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체 절편은 선택적으로 다-분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능성 항체 절편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고, 더욱 전형적으로는 적어도 약 200 개의 아미노산을 포함한다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질 또는 단백질, 또는 재조합 단백질 또는 재조합 단백질은 항체 변형체 또는 결합 분자 변형체일 수 있다.
본원에 사용된 "변형체" 또는 "결합 분자 변형체"는, 적어도 하나의 아미노산 변형 또는 번역-후 변형에 의해 목표 결합 분자와 달라진 결합 분자를 포함할 수 있다. 변형체는 결합 분자 그 자체, 결합 분자를 포함하는 조성물, 또는 이를 암호화하는 아미노 서열을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 결합 분자 변형체는 모 결합 분자에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 모 결합 분자에 비해 약 1개 내지 10개의 아미노산 변형체, 바람직하게는 약 1개 내지 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 본원에서 결합 분자 변형체 서열은 바람직하게는 모 결합 분자 서열과 적어도 약 80%의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 92%의 상동성을 가질 것이다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질 또는 단백질, 또는 재조합 단백질 또는 재조합 단백질은 특정한 번역-후 변형을 갖는 단백질일 수 있다.
본원에 사용된 "번역-후 변형" 또는 "PTM"라는 일반적인 용어는, 폴리펩티드가 (공동-번역 변형) 또는 (번역-후 변형) 동안 이들의 리보좀 합성을 수행하는 공유적 변형을 지칭한다. PTM는 일반적으로 특정 효소 또는 효소 경로에 의해 도입된다. 단백질 골격 내의 특정한 특징적인 단백질 서열 (예를 들어, 대표(signature) 서열)의 부위에서 많이 일어난다. 수백 건의 PTM가 보고되었고, 이러한 변형들은 단백질의 구조 또는 기능의 일부 양태에 비가역적으로 영향을 미친다 (Walsh, G. "Proteins" (2014) 2판, Wiley and Sons, Ltd. 출판, ISBN: 9780470669853). 다양한　번역-후 변형은 절단, N-말단 신장, 단백질 분해, N-말단의 아실화, 비오틴화(비오틴에 의한 리신 잔기들의 아실화), C-말단의 아미드화, 글리코실화, 요오드화, 보결 분자단(prosthetic group)의 공유적 부착, 아세틸화 (보통 단백질의 N-말단에 대한 아세틸 기의 부가), 알킬화(리신 또는 아르기닌 잔기에 대한 알킬기(예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필)의 부가), 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩티드 사슬 내 또는 폴리펩티드 사슬들 사이의 공유적 가교, 설폰화, 프레닐화, 비타민 C 의존성 변형 (프롤린 및 리신 하이드록실화 및 카르복시 말단 아미드화), 비타민 K가 γ-카르복시글루타메이트 (glu 잔기)를 형성하는 글루탐산 잔기들의 카르복실화에서의 보조인자인 비타민 K 의존성 변형, 글루타밀화 (글루탐산 잔기들의 공유적 연결), 글리실화(공유적 연결기 글리신 잔기들), 글리코실화 (아스파라긴, 하이드록시리신, 세린, 또는 티로신 중 하나에 대해 글리코실 기가 첨가되어, 당단백질을 생성함), 이소프레닐화 (이소프레노이드기, 예컨대 파르네솔 및 게라닐게라니올의 부가), 리포일화(lipoylation)(리포에이트 관능기의 부착), 포스포판테테이닐화(phosphopantetheinylation) (지방산, 폴리케티드, 비-리보좀 펩티드 및 류신 생합성에서와 같이, 조효소 A로부터의 4'-포스포판테테이닐 모이어티의 부가), 인산화 (보통 세린, 티로신, 트레오닌 또는 히스티딘에 대한 인산기의 부가), 및 황산화(보통 티로신 잔기에 대한 황산기의 부가)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아미노산의 화학적 특성을 변화시키는 번역-후 변형은 시트룰린화(예를 들어, 탈이민화에 의한 아르기닌에서 시트룰린으로의 변환) 및 탈아미드화 (예를 들어, 글루타민에서 글루탐산으로의 변환, 또는 아스파라긴에서 아스파르트산으로의 변환)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구조적 변화와 관련된 번역-후 변형은 디설파이드 다리의 형성(2개의 시스테인 아미노산의 공유적 연결) 및 단백질 용해성 절단(펩티드 결합에서의 단백질의 절단)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 번역-후 변형은 다른 단백질 또는 펩티드의 첨가, 예컨대 ISG화 (ISG15 단백질 (Interferon-Stimulated Gen)에 대한 공유적 연결), SUMO화 (SUMO 단백질 (Small Ubiquitin-related MOdifier)에 대한 공유적 연결) 및 유비퀴틴화(단백질 유비퀴틴에 대한 공유적 연결)과 관련된다. UniProt가 제시한 PTM에 대한 더욱 상세한 통제 어휘집(controlled vocabulary)에 대해서는, http://www.uniprot.org/docs/ptmlist를 참고한다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시 내용은 기초 배지 또는 영양 공급 배지 및 5-메틸티오아데노신 및/또는 니코틴아미드를 포함하는 진핵 세포용 세포 배양 배지를 제공한다.
본원에 사용된 "세포 배양 배지"라는 용어는, 인공적인 (예를 들어, 시험관내) 환경에서 성장한 세포를 지칭한다. 그러나, "세포 배양"이라는 용어는 일반 용어이며, 개별적인 원핵 (예를 들어, 박테리아) 또는 진핵 (예를 들어, 동물, 식물 및 진균) 세포의 배양을 포함할 뿐만 아니라, 조직, 기관, 기관계 또는 전체 유기체의 배양도 포함하도록 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이며, 이에 대해 "조직 배양(tissue culture)", "기관 배양(organ culture)", "기관계 배양(organ system culture)" 또는 "기관형 배양(organotypic culture)"이라는 용어는, 때때로 "세포 배양"이라는 용어와 상호 교환하여 사용될 수 있다. 진핵 세포에 적합한 배양 조건은, 선행 기술, 예를 들어 Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)에서 찾아볼 수 있다. 세포 배양 배지는 예를 들어, 세포 성장을 촉진하도록 제제화될 수 있는 세포 배양 성장 배지, 또는 재조합 단백질 생산을 촉진하도록 제제화될 수 있는 세포 배양 생산 배지를 포함하는 특정 세포 배양 용도를 위해 최적화될 수 있다. 영양소, 재료(ingredient) 및 성분은 본원에서 세포 배양 배지를 구성하는 구성 성분을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "기초 배지(basal medium)"라는 용어는, 세포의 성장을 지원할 수 있는 임의의 배지를 지칭할 수 있다. 기초 배지는 아미노산, 비타민, 유기 및 무기 염, 탄수화물의 공급원을 포함하는 다수의 재료들을 포함할 수 있는데, 각 재료는 시험관내 세포의 배양(cultivation)을 지원하는 양으로 존재한다. 배지는 보조 물질(auxiliary substance), 예컨대 중탄산나트륨과 같은 완충 물질, 산화 안정화제, 기계적 스트레스를 상쇄시키는 안정화제, 또는 프로테아제 저해제를 함유할 수 있다. 기초 배지의 예는 둘베코 개질 이글스 배지(DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's medium), DME/F12, 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글스 (BME, Basal Medium Eagle), 배지 199, RPMI 1640, F-10, F-12, α-최소 필수 배지 (α-MEM), 글라스고우(Glasgow)의 최소 필수 배지 (G-MEM), PF CHO (SAFC Biosciences), 이스코브의 개질 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's medium) 또는 이들의 조합, 및 문헌에 알려져 있거나 상업적으로 이용가능한 다른 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "영양 공급 배지(feed medium)"라는 용어는, 접종 후 어느 시점에서 시작하여 배양액에 첨가될 수 있는 하나 이상의 영양소들을 함유하는 배지를 포함한다. 영양 공급 배지는 또한 기초 배지 및 적어도 한 종의 가수분해물, 예를 들어, 콩-기반, 가수분해물, 효모-기반 가수분해물, 또는 상기 두 타입의 가수분해물들의 조합을 포함하는 조합 영양 공급물일 수도 있다. 추가로, 공급 배지는 또한 단지 기초 배지, 예컨대 농축된 기초 배지만을 포함할 수도 있거나, 또는 단지 가수분해물 또는 농축된 가수분해물만을 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 "진핵 세포"라는 용어는, 개별적인 세포, 조직, 기관, 곤충 세포, 조류 세포, 포유류 세포, 1차 세포, 연속 세포주, 줄기 세포 및/또는 유전자 조작 세포, 예컨대 이종 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 재조합 세포를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지에서 배양하기에 적합한 일부 포유류 세포는, 인간 기원 또는 비-인간 기원의 세포일 수 있으며, 1차 상피 세포 (예를 들어, 각질세포, 자궁 경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포), 확립된 세포주 및 이들의 균주 (예를 들어, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁 경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK (NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, Chang 세포, Detroit 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LSI80 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-l 세포, LLC-PKi 세포, PK(15) 세포, GHi 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MHiCi 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, BSC-1 세포, RAf 세포, RK-세포, PK-15 세포 또는 이의 유도체), 임의의 조직 또는 기관 (심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관조직 (동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직 (림프샘, 인두편두(adenoid), 구개편도(tonsil), 골수 및 혈액을 포함하나, 이에 제한되지 않음)으로부터의 섬유아세포 세포, 비장, 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주 (예를 들어, CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증(citrullinemia) 세포, Dempsey 세포, Detroit 551 세포, Detroit 510 세포, Detroit 525 세포, Detroit 529 세포, Detroit 532 세포, Detroit 539 세포, Detroit 548 세포, Detroit 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, Midi 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDMiC3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 균주 2071 (마우스 L) 세포, L-M 균주 (마우스 L) 세포, L-MTK' (마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, Swiss/3T3 세포, Indian muntjac 세포, SIRC 세포, Cn 세포, 및 Jensen 세포, Sp2/0, NS0, NS1 세포 또는 이의 유도체)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "니코틴아미드"는, 또한 니아신아미드, 니코틴산 아미드, 피리딘-3-카르복실산 아미드, 비타민 B3, 비타민 PP, 3-피리딘카르복사미드, CAS 넘버 98-92-0, 또는 C6H6N2O으로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "5-메틸티오아데노신"은 또한 5-데옥시-5'-메틸-티오아데노신, CAS 넘버 2457-80-9,
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, MTA, MeSAdo, NSC 335422, 비타민 L2, 5-메틸티오아데노신의 염, 또는 5-메틸티오아데노신의 에스테르로도 지칭될 수 있다. 5-메틸티오아데노신에 적합한 염의 비-제한적 예는, 예를 들어, 산 첨가 염을 포함한다. 산 첨가 염은 무기 및 유기 산 첨가 염, 예를 들어, 하이드로클로라이드, 설페이트, 니트레이트, 카보네이트, 포스페이트, 포르메이트, 옥살레이트, 시트레이트, 아스코르브산, 메탄술폰산, 1,4-부탄 설포네이트, 1,5-펜탄 설포네이트 및 p- 톨루엔설포네이트 염일 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시 내용은 세포 배양 생산 배지에서 단백질을 암호화하는 핵산을 갖는 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 생산 방법을 제공한다.
세포 배양 배지 또는 세포 배양 생산 배지는 영양소와 아미노산과 같은 성분을 함유하는 영양 강화 배지로 보충될 수 있는데, 이는 세포 배양의 생산기의 과정 동안 소모된다.
본원에 사용된 "세포 배양 생산 배지"라는 용어는, 세포 배양의 생산기 동안 사용되도록 고안된 세포 배양 배지를 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 생산 배지 또는 세포 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다.
본원에 사용된 "무혈청 배지"라는 용어는, 동물 혈청, 예컨대 소 태아 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청 배지는 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 운반체 단백질 및 부착 인자를 함유할 수도 있거나, 함유하지 않을 수도 있다. 알려진 무혈청 배지의 예는, CHO-S-SFM II (Gibco) 및 293 SFM II (Gibco)를 포함한다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 생산 배지 또는 세포 배양 배지는 동물-유래 단백질이 없는 배지일 수 있다.
본원에 사용된 "동물-유래 단백질이 없는 배지"라는 용어는, 고등 다세포 비-식물 진핵 생물 (즉, 척추 동물)로부터의 단백질과 단백질 성분을 함유하지 않는 배지를 지칭할 수 있는데, 이는 이들이 자연에서 발생한 단백질의 2차, 3차 및 4차 구조 특징들을 갖는다. 이러한 배지는 알부민, 트랜스페린, 인슐린 및 다른 성장 인자들과 같은 단백질을 함유하지 않는다. 그러나, 동물-유래 단백질 및 단백질 성분은 비-동물 단백질, 식물, 예컨대 대두 및 하급 진핵 생물, 예컨대 효모로부터 얻은 작은 폴리펩티드 및 올리고펩티드(보통 약 10-30 개 아미노산 길이)와 다르다. 세포를 동물-유래 단백질 배지와 접촉시키거나 이에 접종할 때, 배지는 이들 세포에서 탈락하거나 이들이 분비한 동물 단백질을 함유할 것이고, 이는 이러한 세포가 배양된 경우 유전자 변형된 세포에 의해 발현된 임의의 재조합 단백질을 포함한다. 따라서, 동물 단백질 불포함 배지 및 이에 의해 생산된 생물학적 물질 및 제제라는 용어는, 배지 내에 번식한 세포에서 탈락하거나 이들이 분비한 단백질이 없을 것을 필요로 한다고 해석되지 않을 것이고, 오히려 동물 단백질 및 재조합에 의해 생산된 동물 공급원 등으로부터 얻은 단백질 성분에 의한 배지의 직접 보충이 결핍된 것을 지칭한다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 생산 배지 또는 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지일 수 있다.
본원에 사용된 "화학적-구명 배지"는 측정된 농도의 순수한 성분들로 구성된 배지를 포함할 수 있다. 화학적-구명 배지는 탄소원 및 에너지원으로서의 단순 당, 무기 질소 공급원, 다양한 염, 및 필요하다면 성장 인자들(정제된 아미노산, 비타민, 퓨린 및 피리미딘)을 함유할 수 있다. 구명 배양 배지를 포함하는 다양한 조직 배양 배지들이 시판되고 있는데, 그 중에서도 예를 들어, 이하의 세포 배양 배지들 중 어느 하나 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다: RPMI-1640 배지, 배지 199, RPMI-1641 배지, 둘베코 개질 이글스 배지(DMEM), 최소 필수 배지 이글스, F-12K 배지, 햄(Ham)의 F12 배지, 이스코브의 개질 둘배코 배지, 맥코이(McCoy)의 5A 배지, 레이보비츠(Leibovitz)의 L-15 배지, 및 무혈청 배지, 예컨대 EX-CELL™ 300 시리즈 (JRH Biosciences, 캔사스주 레넥사 소재).
일부 예시적인 구현예에서, 단백질의 생산 방법은 유가-배양 방법일 수 있다.
본원에 사용된 "유가-배양 방법"이라는 용어는, 유가 배양 세포 배양액에 부가적인 영양소를 공급하는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 방법은 결정된 영양 공급 일정에 따라 소정의 시기 내에 보충 배지를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "유가 배양식 세포 배양"은, 세포와 배양 배지를 초기에 배양 용기에 공급하고, 부가적인　배양　영양소를 연속적으로 또는 개별적으로 증량하여, 주기적 세포(periodic　cell)와 함께 또는 이의 부재 하에, 성장 동안 배양액에 공급하고/거나, 배양의 종결 전에 수확물을 생산하는 세포 배양을 지칭한다.
본 발명은 상기 언급된 진핵 세포, 단백질, 기초 배지, 영양 공급 배지, 세포-배양 배지, 세포-배양 생산 배지, 세포의 번식 방법, 단백질을 발현시키는 방법, 단백질을 수확하는 방법, 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 세포에 도입하는 방법, 및 배지에 성분을 부가 또는 보충하는 시기 중 어느 것에 제한되지 않으며, 임의의 적합한 배지는 임의의 적합한 수단에 의해 선택될 수 있다고 이해된다.
본원에 사용된 포함하다("include", "includes") 및 "포함하는(including)"이라는 용어는, 비-제한적인 것으로 의도되고, 각각 포함하다("comprise", "comprises") 및 "포함하는(comprising)"을 의미하는 것으로 이해된다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시 내용은 진핵 세포용 세포 배양 배지를 제공한다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시 내용은 단백질의 생산 방법을 제공한다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시 내용은 단백질의 생산을 증가시키기 위한 진핵 세포의 배양 방법을 제공한다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.05 nM, 적어도 약 1 nM, 적어도 약 2 nM, 적어도 약 3 nM, 적어도 약 4 nM, 적어도 약 5 nM, 적어도 약 6 nM, 적어도 약 7 nM, 적어도 약 8 nM, 적어도 약 9 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 15 nM, 적어도 약 20 nM, 적어도 약 25 nM, 적어도 약 30 nM, 적어도 약 35 nM, 적어도 약 40 nM, 적어도 약 45 nM, 적어도 약 50 nM, 적어도 약 55 nM, 적어도 약 60 nM, 적어도 약 65 nM, 적어도 약 70 nM, 적어도 약 75 nM, 적어도 약 80 nM, 적어도 약 85 nM, 적어도 약 90 nM, 적어도 약 95 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 105 nM, 적어도 약 110 nM, 적어도 약 115 nM, 적어도 약 120 nM, 적어도 약 125 nM, 적어도 약 130 nM, 적어도 약 135 nM, 적어도 약 140 nM, 적어도 약 145 nM, 적어도 약 150 nM, 적어도 약 155 nM, 적어도 약 160 nM, 적어도 약 165 nM, 적어도 약 170 nM, 적어도 약 175 nM, 적어도 약 180 nM, 적어도 약 195 nM, 적어도 약 200 nM, 약 205 nM, 적어도 약 210 nM, 적어도 약 215 nM, 적어도 약 220 nM, 적어도 약 225 nM, 적어도 약 230 nM, 적어도 약 235 nM, 적어도 약 240 nM, 적어도 약 245 nM, 적어도 약 250 nM, 적어도 약 255 nM, 적어도 약 260 nM, 적어도 약 265 nM, 적어도 약 270 nM, 적어도 약 275 nM, 적어도 약 280 nM, 적어도 약 295 nM, 또는 적어도 약 300 nM의 농도의 5-메틸-티오 아데노신을 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.05 nM, 적어도 약 1 nM, 적어도 약 2 nM, 적어도 약 3 nM, 적어도 약 4 nM, 적어도 약 5 nM, 적어도 약 6 nM, 적어도 약 7 nM, 적어도 약 8 nM, 적어도 약 9 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 15 nM, 적어도 약 20 nM, 적어도 약 25 nM, 적어도 약 30 nM, 적어도 약 35 nM, 적어도 약 40 nM, 적어도 약 45 nM, 적어도 약 50 nM, 적어도 약 55 nM, 적어도 약 60 nM, 적어도 약 65 nM, 적어도 약 70 nM, 적어도 약 75 nM, 적어도 약 80 nM, 적어도 약 85 nM, 적어도 약 90 nM, 적어도 약 95 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 105 nM, 적어도 약 110 nM, 적어도 약 115 nM, 적어도 약 120 nM, 적어도 약 125 nM, 적어도 약 130 nM, 적어도 약 135 nM, 적어도 약 140 nM, 적어도 약 145 nM, 적어도 약 150 nM, 적어도 약 155 nM, 적어도 약 160 nM, 적어도 약 165 nM, 적어도 약 170 nM, 적어도 약 175 nM, 적어도 약 180 nM, 적어도 약 195 nM, 적어도 약 200 nM, 약 205 nM, 적어도 약 210 nM, 적어도 약 215 nM, 적어도 약 220 nM, 적어도 약 225 nM, 적어도 약 230 nM, 적어도 약 235 nM, 적어도 약 240 nM, 적어도 약 245 nM, 적어도 약 250 nM, 적어도 약 255 nM, 적어도 약 260 nM, 적어도 약 265 nM, 적어도 약 270 nM, 적어도 약 275 nM, 적어도 약 280 nM, 적어도 약 295 nM, 적어도 약 300 nM, 적어도 약 305 nM, 적어도 약 310 nM, 적어도 약 315 nM, 적어도 약 320 nM, 적어도 약 325 nM, 적어도 약 330 nM, 적어도 약 335 nM, 적어도 약 340 nM, 적어도 약 345 nM, 적어도 약 350 nM, 적어도 약 355 nM, 적어도 약 360 nM, 적어도 약 365 nM, 적어도 약 370 nM, 적어도 약 375 nM, 적어도 약 380 nM, 적어도 약 395 nM, 적어도 약 400 nM, 약 405 nM, 적어도 약 410 nM, 적어도 약 515 nM, 적어도 약 420 nM, 적어도 약 425 nM, 적어도 약 430 nM, 적어도 약 435 nM, 적어도 약 440 nM, 적어도 약 445 nM, 적어도 약 450 nM, 적어도 약 455 nM, 적어도 약 460 nM, 적어도 약 465 nM, 적어도 약 470 nM, 적어도 약 475 nM, 적어도 약 480 nM, 적어도 약 495 nM, 적어도 약 500 nM, 적어도 약 510 nM, 적어도 약 520 nM, 적어도 약 530 nM, 적어도 약 540 nM, 적어도 약 550 nM, 적어도 약 560 nM, 적어도 약 570 nM, 적어도 약 580 nM, 적어도 약 590 nM, 적어도 약 600 nM, 적어도 약 610 nM, 적어도 약 620 nM, 적어도 약 630 nM, 적어도 약 640 nM, 적어도 약 650 nM, 적어도 약 660 nM, 적어도 약 670 nM, 적어도 약 680 nM, 적어도 약 690 nM, 적어도 약 700 nM, 적어도 약 710 nM, 적어도 약 720 nM, 적어도 약 730 nM, 적어도 약 740 nM, 적어도 약 750 nM, 적어도 약 760 nM, 적어도 약 770 nM, 적어도 약 780 nM, 적어도 약 790 nM, 적어도 약 800 nM, 적어도 약 810 nM, 적어도 약 820 nM, 적어도 약 830 nM, 적어도 약 840 nM, 적어도 약 850 nM, 적어도 약 860 nM, 적어도 약 870 nM, 적어도 약 880 nM, 적어도 약 890 nM, 적어도 약 900 nM, 적어도 약 910 nM, 적어도 약 920 nM, 적어도 약 930 nM, 적어도 약 940 nM, 적어도 약 950 nM, 적어도 약 960 nM, 적어도 약 970 nM, 적어도 약 980 nM, 적어도 약 990 nM, 적어도 약 1000 nM, 적어도 약 1050 nM, 적어도 약 1100 nM, 적어도 약 1150 nM, 적어도 약 1200 nM, 적어도 약 1250 nM, 적어도 약 1300 nM, 적어도 약 1350 nM, 적어도 약 1400 nM, 적어도 약 1450 nM, 적어도 약 1500 nM, 적어도 약 1550 nM, 적어도 약 1600 nM, 적어도 약 1650 nM, 적어도 약 1700 nM, 적어도 약 1750 nM, 적어도 약 1800 nM, 적어도 약 1850 nM, 적어도 약 1900 nM, 적어도 약 1950 nM, 적어도 약 2000 nM, 적어도 약 2050 nM, 적어도 약 2100 nM, 적어도 약 2150 nM, 적어도 약 2200 nM, 적어도 약 2250 nM, 적어도 약 2300 nM, 적어도 약 2350 nM, 적어도 약 2400 nM, 적어도 약 2450 nM, 적어도 약 2500 nM, 적어도 약 2550 nM, 적어도 약 2600 nM, 적어도 약 2650 nM, 적어도 약 2700 nM, 적어도 약 2750 nM, 적어도 약 2800 nM, 적어도 약 2850 nM, 적어도 약 2900 nM, 적어도 약 2950 nM, 또는 적어도 약 3000 nM의 농도의 5-니코틴아미드를 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 6.5 내지 약 8.0의 pH를 가질 수 있다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 또는 약 8.0의 pH를 가질 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 진핵 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 성장한다. 일부 특정 예시적인 구현예에서, 진핵 세포는 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃의 온도에서 성장한다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 nM의 5-메틸티오아데노신을 포함할 수 있는데, 여기에서 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 10 nM의 5-메틸티오아데노신을 갖지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 높을 수 있다. 일 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 20 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 30 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 40 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 50 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 60 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 70 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 80 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 90 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 100 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 110 nM의 5-메틸티오아데노신 적어도 약 120 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 130 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 140 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 150 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 160 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 170 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 180 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 190 nM의 5-메틸티오아데노신 또는 적어도 약 200 nM의 5-메틸티오아데노신을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 또는 적어도 약 30% 더 높을 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 포함할 수 있는데, 여기에서 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 갖지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 2% 더 크다. 일 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 100 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 150 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 200 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 250 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 300 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 350 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 400 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 450 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 500 nM의 니코틴아미드 적어도 약 550 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 600 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 650 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 700 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 750 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 800 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 850 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 900 nM의 니코틴아미드 또는 적어도 약 1000 nM의 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 또는 적어도 약 30% 더 클 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.05 nM, 적어도 약 1 nM, 적어도 약 2 nM, 적어도 약 3 nM, 적어도 약 4 nM, 적어도 약 5 nM, 적어도 약 6 nM, 적어도 약 7 nM, 적어도 약 8 nM, 적어도 약 9 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 11 nM, 적어도 약 12 nM, 적어도 약 13 nM, 적어도 약 14 nM, 적어도 약 15 nM, 적어도 약 20 nM, 적어도 약 25 nM, 적어도 약 30 nM, 적어도 약 35 nM, 적어도 약 40 nM, 또는 적어도 약 50 nM의 농도의 5-메틸티오아데노신을 갖는 영양 강화 배지를 사용하여 진핵 세포에 영양을 공급하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 1 nM, 적어도 약 2 nM, 적어도 약 3 nM, 적어도 약 4 nM, 적어도 약 5 nM, 적어도 약 6 nM, 적어도 약 7 nM, 적어도 약 8 nM, 적어도 약 9 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 15 nM, 적어도 약 20 nM, 적어도 약 25 nM, 적어도 약 30 nM, 적어도 약 35 nM, 적어도 약 40 nM, 적어도 약 50 nM, 적어도 약 55 nM, 적어도 약 60 nM, 적어도 약 65 nM, 적어도 약 70 nM, 적어도 약 75 nM, 적어도 약 80 nM, 적어도 약 85 nM, 적어도 약 90 nM, 적어도 약 95 nM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 105 nM, 적어도 약 110 nM, 적어도 약 115 nM, 적어도 약 120 nM, 적어도 약 125 nM, 적어도 약 130 nM, 적어도 약 135 nM, 적어도 약 140 nM, 적어도 약 145 nM, 적어도 약 150 nM, 적어도 약 155 nM, 적어도 약 160 nM, 적어도 약 165 nM, 적어도 약 170 nM, 적어도 약 175 nM, 적어도 약 180 nM, 적어도 약 195 nM, 또는 적어도 약 200 nM의 농도의 니코틴아미드를 갖는 영양 강화 배지를 사용하여 진핵 세포에 영양을 공급하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 1 nM의 농도의 5-메틸티오아데노신을 갖는 영양 강화 배지를 사용하여 진핵 세포에 영양을 공급하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기에서 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 10 nM의 5-메틸티오아데노신을 갖지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 크다. 일 양태에서, 영양 강화 배지는 적어도 약 2 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 3 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 4 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 5 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 6 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 7 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 8 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 9 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 10 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 11 nM의 5-메틸티오아데노신 적어도 약 12 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 13 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 14 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 15 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 16 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 17 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 18 nM의 5-메틸티오아데노신, 적어도 약 19 nM의 5-메틸티오아데노신 또는 적어도 약 20 nM의 5-메틸티오아데노신을 가질 수 있다. 일 양태에서, 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 또는 적어도 약 30% 더 클 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 5 nM 농도의 니코틴아미드를 갖는 영양 강화 배지를 사용하여 진핵 세포에 영양을 공급하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기에서 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 갖지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 클 수 있다. 일 양태에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 5 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 10 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 15 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 20 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 25 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 30 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 35 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 400 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 45 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드 적어도 약 55 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 60 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 65 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 70 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 75 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 80 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 85 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 90 nM의 니코틴아미드, 적어도 약 95 nM의 니코틴아미드 또는 적어도 약 100 nM의 니코틴아미드를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 세포 배양 배지에서 생산된 단백질의 역가는 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 또는 적어도 약 30% 더 클 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 자연 발생적인 단백질일 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 재조합 단백질일 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 생체-치료 단백질일 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 재조합 단백질일 수 있는데, 여기에서 재조합 단백질은 트랩 단백질, 키메라 수용체 Fc-융합 결합 분자, 키메라 단백질, 항체, 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 인간 항체, 이중 특이적 항체, 항체 절편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 또는 펩티드 호르몬일 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 변형체, 부가체, 및 다른 공유적으로 연결된 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 번역-후 변형을 포함할 수 있다.
숫자 및/또는 문자로 된 본원에 제공된 방법 단계들의 연속적인 표시는, 방법 또는 이의 임의의 구현예가 특정한 지정 순서로 제한된는 것을 의미하지 않는다.
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본 개시 내용은 본 개시 내용을 더욱 상세히 설명하기 위해 제공된 이하의 실시예를 참고하여 더욱 완전히 이해될 것이다. 이들은 본 개시 내용의 범주를 설명하기 위한 의도이며, 이에 대한 제한으로 해석해서는 안될 것이다.
실시예
세포 배양 배지의 함량 및 단백질의 생산에 대한 이의 효과를 연구하기 위하여, VEGFR 결합 단백질 1을 생성하기 위한 콩 가수분해물을 포함하는 세포 배양액을 선택하였다.
실시예 1.
콩 가수분해물 내용물 분석은 3개의 개별적인 선적(shipment) - 1, 2 및 3으로부터 얻은 9개의 상이한 로트를 사용하여 실시하였다. 이러한 3개의 개별적인 선적으로부터 얻은 샘플들을 Metabolon (미국 노스캐롤라니아 더럼 소재)으로 보냈다. 콩 가수분해물 내용물 분석은 액체 크로마토그래피-질량 분광계를 사용하여 Metabolon에서 수행하였다. 콩 가수분해물 내의 300개 초과의 성분들을 측정하였다. 단지 중간 규모의 결과들만이 제공되어 있다.
VEGFR (혈관상피 성장 인자 수용체) 결합 단백질 1의 역가에 대한 생화학물질의 역할을 연구하기 위해, 직각 부분 최소 제곱(OPLS: orthogonal partial least squares) 모델을 다변량 분석(MVA: multivariate Analysis)에 사용하였다. 70개의 콩 가수분해물 로트를 본 연구에 포함하였다.
성분과 역가 사이의 의존성은, 연관성 및 공분산을 연구함으로써 평가하였다. 양의 의존성은 생화학 물질이 증가함에 따라 역가가 증가한다는 것을 암시하고, 음의 의존성은 생화학 물질이 증가함에 따라 역가가 감소한다는 것을 암시한다. 주요한 성분에 대한 최종 역가 평가에 대해, R2X, R2Y 및 Q2에 대한 값은 각각 0.315, 0.672, 및 0.493인 것으로 나타났다. 양의 의존성을 나타낸 성분들은 표 1에 나타나 있고, 음의 의존성을 나타낸 성분들은 표 2에 나타나 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
단위 길이에 대해 정규화된 MVA 결과가 도 1에 나타나 있다. 실시예 2로부터의 이러한 발견에 기초하여, 니코틴아미드 및 5-메티티오아데노신을 추가적인 분석을 위한 양성 마커로 선택하였다.
실시예 2.
재조합 단백질 (VEGFR 결합 단백질 1)의 생산에 대한 5-메티티오아데노신의 영향은, 세포 배양 배지에 존재하는 상이한 농도의 5-메티티오아데노신에서의 단백질 역가 (g/L)를 조사함으로써 연구하였다.
5-메티티오아데노신을 포함하는 강화 배지 (콩 가수분해물)를 세포 배양 배지에 첨가하였다. 도 2는 세포 배양 배지에 첨가된 콩 가수분해물에 존재하는 5-메틸티오아데노신의 농도와 VEGFR 결합 단백질 1의 역가 사이의 연관성을 나타낸다.
도 2에 나타난 바와 같이, 외삽된 변수 (N= 70)에 관한 회귀선은 역가가 세포 배양 배지에 첨가된 콩 가수분해물 내의 5-메티티오아데노신의 농도에 따라서 선형으로 가변된다는 것을 암시하며, 이는 세포 배양 배지 내의 5-메티티오아데노신 농도가 증가할 때 더 높은 역가를 얻을 수 있다는 사실을 암시한다.
실시예 3.
세포 배양 배지에 보충된 강화 배지 (콩 가수분해물) 내의 5-메티티오아데노신 농도의 효과를 연구함으로써 얻은 연관성 데이터(실시예 2, 도 2)에 기초하여, 세포 배양액 내의 5-MTA의 최적 농도를 추정하였다. 도 3은, 외삽된 변수 (N= 70)에 관한 회귀선이 세포 배양 배지 내의 5-메티티오아데노신의 농도에 따라서 선형으로 가변될 수 있다는 사실을 보여주며, 이는 세포 배양 배지 내의 5-메티티오아데노신 농도가 증가할 때 더 높은 역가를 얻을 수 있다는 사실을 나타낸다.
실시예 4.
재조합 단백질 (VEGFR 결합 단백질 1) 역가에 대한 니코틴아미드의 영향은, 또한 세포 배양 배지 내에 존재하는 상이한 농도의 니코틴아미드에서의 단백질 역가 (g/L)를 조사함으로써 연구하였다.
니코틴아미드를 포함하는 강화 배지 (콩 가수분해물)를, 가변 농도로 세포 배양 배지에 첨가하였다. 도 4는 세포 배양 배지에 첨가된 콩 가수분해물에 존재하는 니코틴아미드와 VEGFR 결합 단백질 1의 역가 사이의 연관성을 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, 외삽된 변수 (N= 70)에 관한 회귀선은 역가가 콩 가수분해물 내의 니코틴아미드의 농도에 따라서 선형으로 가변된다는 것을 암시하며, 이는 세포 배양 배지 내의 니코틴아미드 농도가 증가될 때 더 높은 역가를 얻을 수 있다는 사실을 암시한다.
실시예 5.
세포 배양 배지에 보충된 강화 배지 (콩 가수분해물) 내의 니코틴아미드 농도의 효과를 연구함으로써 얻은 연관성 데이터 (실시예 4, 도 4)에 기초하여, 세포 배양액 내의 니코틴아미드의 최적 농도를 추정하였다. 도 5는, 외삽된 변수 (N= 70)에 관한 회귀선은 역가가 세포 배양 배지 내의 니코틴아미드의 농도에 따라서 선형으로 가변될 수 있다는 사실을 암시한다는 것알 나타내며, 이는 세포 배양 배지 내의 니코틴아미드 농도를 증가시킴으로써 더 높은 역가를 얻을 수 있다는 사실을 암시한다

Claims (28)

  1. 아플리버셉트를 발현하는 진핵 세포용 세포 배양 배지로서,
    기초 배지 또는 영양 공급 배지; 및
    5-메틸티오아데노신 또는 니코틴아미드를 포함하는, 세포 배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 배지 내의 5-메틸티오아데노신의 농도는 적어도 약 10 nM인, 세포 배양 배지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 배지 내의 니코틴아미드의 농도는 적어도 약 50 nM인, 세포 배양 배지.
  4. 제1항에 있어서, 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함하는, 세포 배양 배지.
  5. 제2항에 있어서, 상기 세포 배양 배지에서 생산된 아플리버셉트의 역가는 적어도 약 10 nM의 5-메틸티오아데노신을 갖지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 큰, 세포 배양 배지.
  6. 제3항에 있어서, 상기 세포 배양 배지에서 생산된 아플리버셉트의 역가는 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 갖지 않는 다른 세포 배양 배지에서보다 적어도 약 2% 더 큰, 세포 배양 배지.
  7. 제1항에 있어서, 상기 5-메틸티오아데노신 또는 상기 니코틴아미드는 이의 염 또는 에스테르의 형태일 수 있는, 세포 배양 배지.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배지의 pH는 약 6.5 내지 약 8의 범위 내에서 유지되는, 세포 배양 배지.
  9. 제1항에 있어서, 상기 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는, 세포 배양 배지.
  10. 제1항에 있어서, 상기 배지는 무혈청 배지인, 세포 배양 배지.
  11. 제1항에 있어서, 상기 배지는 화학적-구명 배지인, 세포 배양 배지.
  12. 아플리버셉트의 생산을 증가시키기 위한 진핵 세포의 배양 방법으로서,
    세포 배양 배지에서 진핵 세포를 배양하는 단계;
    상기 세포 배양 배지에 5-메티티오아데노신을 보충하되, 상기 5-메틸티오아데노신의 농도는 약 10 nM 내지 약 200 nM인 단계; 및
    진핵 세포에서 아플리버셉트를 생산하는 단계를 포함하되,
    상기 5-메틸티오아데노신에 의한 보충은 아플리버셉트의 역가를 증가시키는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아플리버셉트의 역가는 적어도 약 10 nM의 5-메티-티오아데노신을 갖지 않는 세포 배양 배지에 의한 다른 방법에서보다 적어도 약 2% 더 큰, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 진핵 세포는 새끼 햄스터 신장 세포주, 중국 햄스터 난소 세포주, 쥣과 골수종 세포주, 마우스 골수종 세포주, 인간 배아 신장 세포주, 인간-망막-유래 세포주 및 양수 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 아플리버셉트는 배지에 분비되는, 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는, 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 무혈청 배지인, 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지인, 방법.
  20. 아플리버셉트의 생산을 증가시키기 위한 진핵 세포의 배양 방법으로서,
    세포를 구명 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
    상기 세포 배양 배지에 니코틴아미드를 보충하되, 상기 니코틴아미드의 농도는 약 50 nM 내지 약 2000 nM인 단계; 및
    진핵 세포에서 아플리버셉트를 생산하는 단계를 포함하고, 상기 니코틴아미드에 의한 보충은 아플리버셉트의 역가를 증가시키는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아플리버셉트의 역가가 적어도 약 50 nM의 니코틴아미드를 갖지 않는 세포 배양 배지에 의한 다른 방법에서보다 적어도 약 2% 더 큰, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 락트산, 페닐 락트산, 인돌락트산, 숙신산, 알파-하이드록시이소발레르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 2-(4-하이드록시페닐)락트산, 또는 2-하이드록시-3-메틸발레르산, 이 산들의 염, 이 산들의 에스테르 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 진핵 세포는 새끼 햄스터 신장 세포주, 중국 햄스터 난소 세포주, 쥣과 골수종 세포주, 마우스 골수종 세포주, 인간 배아 신장 세포주, 인간-망막-유래 세포주 및 양수 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 아플리버셉트는 배지에 분비되는, 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 동물 유래 단백질을 갖지 않는, 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 무혈청 배지인, 방법.
  27. 제20항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 화학적-구명 배지인, 방법.
  28. 아플리버셉트의 생산 방법으로서,
    아플리버셉트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 세포에 도입하는 단계;
    적어도 약 50 nM의 니코틴아미드 또는 적어도 약 10 nM의 5-메티티오아데노신을 포함하는 세포 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포에서 아플리버셉트를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1312030C (en) * 1987-11-18 1992-12-29 Brian Maiorella Method to increase antibody titer
JP2000517188A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
US7087411B2 (en) * 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US20030096414A1 (en) * 2001-03-27 2003-05-22 Invitrogen Corporation Culture medium for cell growth and transfection
US6927004B2 (en) 2002-03-08 2005-08-09 Asml Netherlands B.V. Mask for use in lithography, method of making a mask, lithographic apparatus, and device manufacturing method
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ES2761692T5 (es) * 2010-07-08 2023-07-05 Takeda Pharmaceuticals Co Método de producción de vWF recombinante de alto peso molecular en cultivo celular
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法

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