KR20210151794A - 다량체 - Google Patents

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KR20210151794A
KR20210151794A KR1020217030747A KR20217030747A KR20210151794A KR 20210151794 A KR20210151794 A KR 20210151794A KR 1020217030747 A KR1020217030747 A KR 1020217030747A KR 20217030747 A KR20217030747 A KR 20217030747A KR 20210151794 A KR20210151794 A KR 20210151794A
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KR1020217030747A
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하니프 알리
테런스 래빗츠
재스퍼 클루브
크리스천 그뢴달
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쿼드루셉 바이오 리미티드
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Abstract

본 발명은 폴리펩티드의 사량체; 및 에피토프 또는 이펙터 도메인, 예컨대 항원 결합 부위(예를 들어, 항원 또는 pMHC, 또는 이의 가변 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 TCR 결합 부위) 또는 펩티드 예컨대 인크레틴, 인슐린 또는 호르몬 펩티드의 사량체, 팔량체, 십이량체 및 십육량체와 같은 다량체에 관한 것이다.

Description

다량체
본 발명은 폴리펩티드의 사량체; 및 에피토프 또는 이펙터 도메인, 예컨대 항원 결합 부위(예를 들어, 항원 또는 pMHC, 또는 이의 가변 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 TCR 결합 부위) 또는 펩티드, 예컨대 인크레틴, 인슐린 또는 호르몬 펩티드의 사량체, 팔량체, 십이량체 및 십육량체와 같은 다량체에 관한 것이다.
이펙터 도메인의 다량체는 예를 들어, 항원 결합의 더 높은 결합력을 제공하기 위해(예를 들어, 항체 또는 TCR 결합 도메인인 이펙터 도메인의 경우) 이펙터 도메인의 활성 및 존재를 조합 및 증대시키거나 또는 생체내 또는 시험관내 표적 리간드와 상호작용하거나 또는 이중특이적 또는 다중특이적 표적화를 제공하기 위한 것과 같은 생물학적 또는 결합 활성을 향상시키기 위한 의학적 및 비의학적 적용에서 유용성이 인식되고 있다.
단백질 단량체를 다량체로 자기-어셈블리하게 하는 다량체화 도메인은 당업계에 알려져 있다. 예는 p53, p63 및 p73과 같은 전사 인자에서 발견된 도메인, 뿐만 아니라 TRP 양이온 채널과 같은 이온 채널에서 발견된 도메인을 포함한다. 전사 인자 p53은 다음과 같은 상이한 기능적 도메인으로 나눌 수 있다: N-말단 전사활성화 도메인, 단백질-풍부 도메인, DNA-결합 도메인, 사량체화 도메인 및 C-말단 조절 영역. 인간 p53의 사량체화 도메인은 잔기 325에서 356까지 연장되고, 4-나선형 다발 접힘을 갖는다(Jeffrey et al., Science (New York, N.Y.) 1995, 267(5203): 1498-1502). TRPM 사량체화 도메인은 일시적 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리 M 구성원 단백질 1-8의 짧은 역평행 코일형 코일 사량체화 도메인이다. 이는 광범위한 코어 패킹 및 가닥간 극성 상호작용에 의해 함께 유지된다(Fujiwaraet al., Journal of Molecular Biology 2008, 383(4):854-870). 일시적 수용체 전위(TRP) 채널은 다양한 형태의 감각 입력에 반응하는 사량체성 양이온 선택적 이온 채널의 큰 패밀리를 포함한다. 또 다른 예는 칼륨 채널 BTB 도메인이다. 이 도메인은 전압 개폐 칼륨 채널 단백질의 N 말단에서 찾을 수 있으며, 이는 알파-서브유닛을 기능적 사량체성 채널로 어셈블리하는 데 수반되는 세포질 사량체화 도메인(T1)을 나타낸다(Bixbyet al., Nature Structural Biology 1999, 6(1):38-43). 이 도메인은 또한 KCTD1(칼륨 채널 사량체화 도메인-함유 단백질 1; Ding et al., DNA and Cell Biology 2008, 27(5):257-265)과 같이 칼륨 채널이 아닌 단백질에서 찾을 수 있다.
비오틴, dHLX, ZIP 및 BAD 도메인, 뿐만 아니라 p53을 포함한 다량체성 항체 단편은 다양한 다량체화 기술을 사용하여 생성되었다(Thie et al., Nature Boitech., 2009:26, 314-321). 생성에 효율적인 비오틴은 인간에서 면역 반응을 유도하는 박테리아 단백질이다.
인간 p53(UniProtKB - P04637 (P53_HUMAN))은 많은 종양 유형에서 종양 억제인자로서 작용하여, 생리학적 상황 및 세포 유형에 따라 성장 저지 및 세포자멸사를 유도한다. 이는 이 과정에 필요한 유전자 세트를 제어함으로써 세포 분열을 부정적으로 조절하도록 작용하는 트랜스-활성인자로서 세포 주기 조절에 수반된다. 인간 p53은 매우 다양한 형질전환된 세포에서 증가된 양으로 발견된다. 암의 약 60%에서 빈번하게 돌연변이되거나 또는 비활성화된다. 인간 p53 결함은 하부 식도의 정상적으로 층을 이루는 편평 상피가 화생성 원주 상피로 대체된 상태인 바렛 화생에서 발견된다. 이 상태는 만성 위식도 역류 질환 환자의 대략 10%에서 합병증으로 전개되며 식도 선암종으로 발달하는 성향이 있다.
p53의 9 개 이소형은 자연적으로 발생하며 광범위한 정상 조직에서 조직 의존적 방식으로 발현된다. 이소형 2는 대부분의 정상 조직에서 발현되지만 뇌, 폐, 전립선, 근육, 태아 뇌, 척수 및 태아 간에서는 검출되지 않는다. 이소형 3은 대부분의 정상 조직에서 발현되지만 폐, 비장, 고환, 태아 뇌, 척수 및 태아 간에서는 검출되지 않는다. 이소형 7은 대부분의 정상 조직에서 발현되지만 전립선, 자궁, 골격근 및 유방에서는 검출되지 않는다. 이소형 8은 결장, 골수, 고환, 태아 뇌 및 장에서만 검출된다. 이소형 9는 대부분의 정상 조직에서 발현되지만 뇌, 심장, 폐, 태아 간, 침샘, 유방 또는 장에서는 검출되지 않는다.
본 발명은 Fc 영역이 항체 CH2 및 항체 CH3을 포함하는, 항체 Fe 영역을 포함하는 폴리펩티드; 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)을 제공하며, 여기서 CH2는 항체 힌지 서열을 포함하고 코어 힌지 영역이 없다. 유리하게는, Fc는 또 다른 Fc와 직접 쌍을 이루지 않으며, 이는 SAM 도메인을 사용한 다량체화에 의해 다량체를 생성하는 데 유용하다. 예를 들어, 이점은 원하는 다량체 형성을 돕고/돕거나 이러한 다량체화에 의해 형성된 다량체 순도를 향상시키는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 각 Fc가 각 폴리펩티드에 의해 포함되고(comprised by) 또 다른 Fc 영역와 쌍을 이루지 않는, 복수의 항체 Fc 영역의 다량체를 제공하며; 임의적으로 여기서 다량체는 의학적 용도를 위한 것이다.
본 발명은 또한 다음을 제공한다:-
제1 구성에서
이펙터 도메인(예를 들어, 단백질 도메인 또는 펩티드)의 적어도 제1, 제2, 제3 및 제4 카피의 단백질 다량체로, 여기서 다량체는 함께 회합된 제1, 제2, 제3 및 제4 자기-회합 사량체화 도메인(TD)에 의해 다량체화되며, 여기서 각 사량체화 도메인은 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하는 각각의 조작된 폴리펩티드에 의해 포함된다.
제2 구성에서
TCR 결합 부위, 인슐린 펩티드, 인크레틴 펩티드 또는 펩티드 호르몬의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer; 또는 복수의 상기 사량체 또는 팔량체.
항체 결합 부위 또는 항체 가변 도메인(예를 들어, 단일 가변 도메인)의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer; 또는 복수의 상기 사량체 또는 팔량체.
일 예에서 사량체 또는 팔량체는 수용액(예를 들어, 수성 진핵생물 세포 배양 배지)에서 가용성이다. 일 예에서 사량체 또는 팔량체는 진핵생물 세포에서 발현가능하다. 예시는 아래에 제공되어 있다.
제3 구성에서
다음의 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체):
(a) TCR V 도메인 또는 TCR 결합 부위로, 여기서 사량체 또는 팔량체는 수용액(예를 들어, 수성 진핵생물 세포 성장 배지 또는 완충액)에서 가용성임;
(b) 항체 단일 가변 도메인으로, 여기서 사량체 또는 팔량체는 수용액(예를 들어, 수성 진핵생물 세포 성장 배지 또는 완충액)에서 가용성임;
(c) TCR V 도메인 또는 TCR 결합 부위로, 여기서 사량체 또는 팔량체는 HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음; 또는
(d) 항체 가변 도메인(예를 들어, 항체 단일 가변 도메인)으로, 여기서 사량체 또는 팔량체는 HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음.
제4 구성에서
본 발명의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체)의 조작된 폴리펩티드 또는 단량체.
제5 구성에서
(N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하는 조작된 (및 임의적으로 단리된) 조작된 폴리펩티드(P1):-
(a) TCR V1 -TCR C1 - 항체 CH1(예를 들어, IgG CH1) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이고 C1은 Cα이거나;
(ii) V1은 Vβ이고 C1은 Cβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이고 C1은 Cγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ이고 C1은 Cδ임;
또는
(b) TCR V1 - 항체 CH1(예를 들어, IgG CH1) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이거나;
(ii) V1은 Vβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ임;
또는
(c) 항체 V1 - 항체 CH1(예를 들어, IgG CH1) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(d) 항체 V1 - 임의적 항체 CH1(예를 들어, IgG CH1) - 항체 Fe(예를 들어, IgG Fc) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(e) 항체 V1 - 항체 CL(예를 들어, Cλ 또는 Cκ) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(f) TCR V1 -TCR Cl - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이고 C1은 Cα이거나;
(ii) V1은 Vβ이고 C1은 Cβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이고 C1은 Cγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ이고 C1은 Cδ임.
제6 구성에서
본 발명의 조작된 폴리펩티드 또는 단량체를 암호화하는 핵산으로, 임의적으로 여기서 핵산은 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 벡터에 의해 포함된다.
제7 구성에서
세포내로 발현되고/되거나 분비된 다량체를 생성하기 위한 단백질 다량체의 제조 방법에서 본 발명의 핵산 또는 벡터의 용도로, 여기서 방법은 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 세포에서 다량체를 발현하고/하거나 이로부터 다량체를 분비하는 단계를 포함한다.
제8 구성에서
다음을 생성하는 방법:
(a) TCR V 도메인 다량체로, 방법은 진핵생물 세포에서 발현된 TCR V-TD(예를 들어, NHR2 TD 또는 TCR V-p53 TD) 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며, 방법은 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함;
(b) 항체 V 도메인 다량체로, 방법은 진핵생물 세포에서 발현된 항체 V(예를 들어, 단일 가변 도메인)-TD(예를 들어, V-NHR2 TD 또는 V-p53 TD) 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며, 방법은 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함;
(c) 인크레틴 펩티드(예를 들어, GLP-1, GIP 또는 인슐린) 다량체로, 방법은 HEK293T 세포와 같은 진핵생물 세포에서 발현된 인크레틴 펩티드-TD(예를 들어, 인크레틴 펩티드-NHR2 TD 또는 인크레틴 펩티드-p53 TD) 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며; 방법은 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함; 또는
(d) 펩티드 호르몬 다량체로, 방법은 HEK293T 세포와 같은 진핵생물 세포에서 발현된 펩티드 호르몬-TD(예를 들어, 펩티드 호르몬-NHR2 TD 또는 펩티드 호르몬- p53 TD) 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며; 방법은 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함.
제9 구성에서
핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 세포에서 글리코실화된 다량체를 생성하기 위한 단백질 다량체의 제조 방법에서 본 발명의 핵산 또는 벡터의 용도.
제10 구성에서
단량체 및/또는 이량체 폴리펩티드에 비해 더 높은 수율의 사량체를 생성하기 위한, 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그(orthologue))의 용도.
제11 구성에서
단량체 및/또는 이량체 폴리펩티드에 비해 더 높은 수율의 사량체를 생성하기 위한, 단백질 도메인 또는 펩티드의 다중 카피를 포함하는 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 조작된 폴리펩티드의 용도로, 여기서 조작된 폴리펩티드는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하고 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 상동체 또는 오솔로그)을 추가로 포함한다.
제12 구성에서
단량체, 이량체 또는 삼량체와 혼합되지 않은 복수의 사량체를 생성하기 위한, 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그)의 용도.
제13 구성에서
본 발명의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체), 조작된 폴리펩티드 또는 단량체의 세포내 및/또는 분비된 발현을 위한 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 숙주 세포.
제14 구성에서
단량체, 이량체 또는 삼량체와 혼합되지 않은 복수의 사량체를 생성하기 위한, 단백질 도메인 또는 펩티드의 다중 카피를 포함하는 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 조작된 폴리펩티드의 용도로, 여기서 조작된 폴리펩티드는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하고 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 상동체 또는 오솔로그)을 추가로 포함한다.
제15 구성에서
다음을 포함하는 pMHC 복합체에 결합할 수 있는 다가 이종이량체성 가용성 T 세포 수용체:
(i) TCR 세포외 도메인;
(ii) 면역글로불린 불변 도메인; 및
(iii) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
제16 구성에서
다음을 포함하는, 다량체성 면역글로불린:
(i) 면역글로불린 가변 도메인; 및
(ii) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
제17 구성에서
다음 단계를 포함하는, 가용성 다량체성 폴리펩티드를 어셈블리하는 방법:
(a) ETO의 NHR2 도메인에 융합된 상기 다량체성 폴리펩티드의 단량체를 제공하는 단계;
(b) 상기 단량체의 다중 카피를 회합시켜, 다량체성 가용성 폴리펩티드를 수득하는 단계.
제18 구성에서
(i) 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 세포주(예를 들어, 진핵생물, 포유동물 세포주, 예를 들어, HEK293, CHO 또는 Cos 세포주); 및 (ii) 본 발명의 사량체를 포함하는 혼합물.
제19 구성에서
단백질 이펙터 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인 또는 결합 부위)의 사량체의 수율을 향상시키는 방법으로, 상기 방법은 세포주(예를 들어, 포유동물 세포, CHO, HEK293 또는 Cos 세포주)로부터 폴리펩티드의 사량체를 발현시키며, 여기서 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드이고 하나 이상의 이펙터 도메인을 포함하는 것인, 단계; 및 임의적으로 상기 발현된 사량체를 단리하는 단계를 포함한다.
제20 구성에서
다음을 (N-말단에서 C-말단 방향으로; 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로) 포함하는 폴리펩티드:
(i) 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인;
(ii) 임의적 링커; 및
(iii) 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)(임의적으로 자기-회합 사량체화 도메인(TD)).
본 발명은 또한 본 발명의 다량체(들), 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체(들) 또는 팔량체(들))를 포함하는 약제학적 조성물, 화장품, 식료품, 음료, 세정 제품, 세제를 제공한다.
본원에서 다량체는 예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer이다.
실시예 22에서 입증된 바와 같이, 십이량체 및 십육량체 다량체는 놀랍게도 증가하는 결합력 효과로 인해 항원 결합에 대한 매우 높은 기능적 친화도를 나타낸다. 8 개에서 12 개 결합 부위(표 15 및 16 비교) 또는 8 개에서 16 개 결합 부위로 행해지는 이들에 대한 기능적 친화도는 첨가제보다 훨씬 더 크며; 향상된 결합력의 결과로 상승적 증가가 보여진다. 따라서, 일 구현예에서, 항원에 대해 12-가인 다량체(즉, 본원에 기재된 바와 같은 십이량체)가 바람직하며; 또 다른 구현예에서 항원에 대해 16-가인 다량체(즉, 본원에 기재된 바와 같은 십육량체)가 바람직하다.
도 1: NHR2 사량체화 도메인에 의해 도움을 받는, 단량체 및 동종이량체를 통한 4가 이종이량체 가용성 TCR 단백질 복합체의 단계적 자기-어셈블리를 나타내는 개략도.
도 2: NHR2 사량체화 도메인 및 면역글로불린 힌지 도메인의 의해 도움을 받는, 단량체2 및 동종이량체2를 통한 8가 이종이량체 가용성 TCR 단백질 복합체의 단계적 자기-어셈블리를 나타내는 개략도.
도 3: ts-NY-ESO-1 TCR을 발현 및 어셈블리하는 데 사용되는 α 및 β 쇄에서 도메인 배열의 개략도.
도 4: os-NY-ESO-1 TCR을 발현 및 어셈블리하는 데 사용되는 α 및 β 쇄에서 도메인 배열의 개략도.
도 5: ts-NY-ESO-1 TCR 단백질 복합체의 α 및 β 쇄의 아미노산 서열. 대체 도메인의 아미노산 서열은 밑줄이 그어져 있다.
도 6: os-NY-ESO-1 TCR 단백질 복합체의 α 및 β 쇄의 아미노산 서열. 대체 도메인의 아미노산 서열은 밑줄이 그어져 있다.
도 7: ts-NY-ESO-1 TCR-IL2 융합 단백질 복합체를 발현 및 어셈블리하는 데 사용되는 α 및 β 쇄에서 도메인 배열의 개략도.
도 8: os-NY-ESO-1 TCR-IL2 융합 단백질 복합체를 발현 및 어셈블리하는 데 사용되는 α 및 β 쇄에서 도메인 배열의 개략도.
도 9: ts-NY-ESO-1 TCR-IL2 융합 단백질 복합체의 α 및 β 쇄의 아미노산 서열. 대체 도메인의 아미노산 서열은 밑줄이 그어져 있다.
도 10: os-NY-ESO-1 TCR-IL2 융합 단백질 복합체의 α 및 β 쇄의 아미노산 서열. 대체 도메인의 아미노산 서열은 밑줄이 그어져 있다.
도 11a: NHR2 사량체화 도메인에 의해 도움을 받는, 단량체 및 동종이량체를 통한 4가 단일 도메인 항체(dAb) 복합체의 단계적 자기-어셈블리를 나타내는 개략도.
도 11b: 링커 및 NHR2 도메인을 포함한, 4가 dAb의 어셈블리를 위한 도메인 배열의 개략도.
도 12a: NHR2 사량체화 도메인에 의해 도움을 받는, 단량체 및 동종이량체를 통한 4가 Fab 복합체의 단계적 자기-어셈블리를 나타내는 개략도.
도 12b: 중쇄, 및 경쇄 가변 및 불변 도메인에 링커 및 NHR2 도메인을 포함하는, 4가 FAb의 어셈블리를 위한 도메인 배열의 개략도.
도 13a: NHR2 사량체화 도메인 및 CH1 도메인에 연결된 항체 힌지 영역에 의해 도움을 받는, 단량체 및 동종이량체를 통한 8가 Fab 복합체의 단계적 자기-어셈블리를 나타내는 개략도.
도 13b: 중쇄, 및 경쇄 가변 및 불변 도메인에 힌지, 링커 및 NHR2 도메인을 포함한, 8가 Fab의 어셈블리를 위한 도메인 배열의 개략도.
도 14: Quad 16 및 Quad 17의 개략도이다.
도 15: (A) Quad 16 및 (B) Quad 17 단량체 서열 및 구성을 나타낸다.
도 16: 항-Ig 웨스턴 블롯을 사용한 분비된 단백질의 분석을 나타낸다: (A) SDS 변성 조건 하의 PAGE 겔 - 16=Quad16; 17=Quad17; 및 (B) 고유(즉, 비변성) 조건 하의 PAGE 겔 - 16=Quad16; 17=Quad17.
도 17: 항-인간 IgG HRP 검출 항체로 프로빙된 변성 SDS-PAGE 겔로부터 제조된 웨스턴 블롯 (A) Quad 3 및 4로부터의 단백질 샘플을 전체 세포 추출물로부터 준비하고 각각 레인 1 및 2에 로딩하였다. Quad 3 및 4에 대한 예상된 Mw는 각각 46.1 및 46.4 kDa이다. (B) Quad 12 및 13으로부터의 단백질 샘플을 전체 세포 추출물로부터 준비하고 각각 레인 1 및 2에 로딩하였다. Quad 12 및 13에 대한 예상된 Mw는 각각 47.8 및 48.1 kDa이다.
도 18: 항-인간 IgG HRP 검출 항체로 프로빙된 변성 SDS-PAGE 겔로부터 제조된 웨스턴 블롯 (A) Quad 3 및 4로부터의 단백질 샘플을 세포 상청액을 농축시켜 준비하고 각각 레인 1 및 2에 로딩하였다. Quad 3 및 4에 대한 예상된 Mw는 각각 46.1 및 46.4 kDa이다. (B) Quad 12 및 13으로부터의 단백질 샘플을 세포 상청액을 농축시켜 준비하고 각각 레인 1 및 2에 로딩하였다. Quad 12 및 13에 대한 예상된 Mw는 각각 47.8 및 48.1 kDa이다.
도 19: 항-HIS HRP 검출 항체로 프로빙된 변성 SDS-PAGE 겔로부터 제조된 웨스턴 블롯 (A) Quad 14, 15, 18 및 19로부터의 단백질 샘플을 전체 세포 추출물로부터 준비하고 각각 레인 1 - 4에 로딩하였다. Quad 14, 15, 18 및 19에 대한 예상된 Mw는 각각 22.0, 22.3, 37.4 및 37.7 kDa이다. (B) Quad 23, 24, 26 및 27로부터의 단백질 샘플을 전체 세포 추출물로부터 준비하고 각각 레인 1 - 4에 로딩하였다. Quad 23, 24, 26 및 27에 대한 예상된 Mw는 각각 32.1, 32.4, 33.7 및 34.0 kDa이다. (C) Quad 34, 및 38로부터의 단백질 샘플을 전체 세포 추출물로부터 준비하고 각각 레인 1 - 2에 로딩하였다. Quad 34, 및 38에 대한 예상된 Mw는 각각 25.5 및 25.4 kDa이다. (D) Quad 40, 42, 44 및 46으로부터의 단백질 샘플을 전체 세포 추출물로부터 준비하고 각각 레인 1 - 4에 로딩하였다. Quad 40, 42, 44 및 46에 대한 예상된 Mw는 각각 25.4, 37.6, 25.5 및 38.0 kDa이다. 레인 U는 형질감염되지 않은 HEK293T 세포(음성 대조군)로부터 제조된 농축 혈청을 함유하고 C는 항-His HRP 검출 항체에 대한 양성 대조군으로서 사용된 His-태그된 단백질이다. 혈청 항-His 배경 밴드는 검정색 화살표로 강조되며, 이는 모든 블롯에 대해 일시적으로 검출될 수 있다.
도 20: 변성 SDS-PAGE 겔(a)로부터 제조되고 항-인간 IgG HRP 검출 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯. Quad 14 및 15로부터의 단백질 샘플을 전체 세포 추출물로부터 준비하고 각각 레인 1 및 2에 로딩하였다. Quad 14 및 15에 대한 예상된 Mw는 각각 22.0 및 22.3 kDa이다. (b) 고유 PAGE 겔로부터 제조되고 및 항-인간 IgG HRP 검출 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯. 레인 1 및 2는 전체 세포 추출물로부터 준비된 Quad 14 및 15로부터의 단백질 샘플을 함유한다.
도 21: 리더 및 태그 서열에 융합된 Quad 폴리펩티드. 링커가 존재하는 경우, 링커는 G4S(오직 1 개의 G4S)이다. *는 TCR 알파 및 베타 쇄 사이에 S-S 결합 형성을 허용하는 도입된 시스테인 잔기를 갖는 TCR 불변 도메인을 나타낸다. 인간 IgG1 힌지를 사용하였다. 모든 C 영역은 인간이다. TCR V 도메인은 NY-ESO-1에 특이적이다. GFP=녹색 형광 단백질.
도 22: Quad 형식 A - AC의 다량체성 구조의 도시적 표시. 4가 Quad 분자가 어셈블리되는 것의 설명 및 단량체성 빌딩 블록은 표 8에 기재되어 있다.
도 23: 배양 상청액으로부터 정제된 단일특이적 4가 dAb Quad 57 단백질의 SDS-PAGE 분석. Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다.
도 24: 배양 상청액으로부터 정제된 이중특이적 4가 dAb Quad 54 단백질의 SDS-PAGE 분석(a). Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다 (b) 연속으로 희석된 Quad 54 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 TNFa 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 54는 용량 의존적 방식으로 TNFa 단백질에 결합한다.
도 25: 단일특이적 4가 scFv Quad의 SDS-PAGE 분석. Quad 51 및 63 단백질을 배양 상청액으로부터 정제하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(a). Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다 (b) 연속으로 희석된 Quad 51 및 63 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 TNFa 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 51 및 63은 둘 다 용량 의존적 방식으로 유사한 결합 강도로 TNFa 단백질에 결합한다. (c) W51ScFv 1가 항-TNFa 대조군 단백질의 SDS-PAGE 분석. (d) Quad 51, Humira(Hum) 및 W51ScFv의 존재 하에 TNFa-매개 카스파제-3 신호전달의 웨스턴 블롯 분석. 배양 배지(CM)를 단독으로 또는 액티노마이신 D(AD)와 함께 음성 대조군으로서 사용하였다. 각 블롯에 사용된 검출 항체는 각 블롯 옆에 표시되어 있다. 항-튜불린에 의해 검출된 웨스턴 블롯은 내부 로딩 대조군을 나타낸다. (e) 배양 상청액으로부터 정제된 Quad 53 Tet 단백질의 SDS-PAGE 분석. Quad 단백질은 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다. (f). 연속으로 희석된 Quad 53 Tet 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 CD20 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 53 Test는 단백질 용량 의존적 방식으로 CD20에 결합한다.
도 26: 배양 상청액으로부터 정제된 단일특이적 8가 scFv Quad 53 단백질의 SDS-PAGE 분석(a). Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다 (b) 연속으로 희석된 Quad 53 Oct 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 CD20 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 53 Oct는 용량 의존적 방식으로 CD20 단백질에 결합한다. (c) SDS-PAGE에 의해 분석된 Quad 53의 1가, 4가 및 8가 버전. (d) 재조합 CD20에 대한 Quad 53의 1가, 4가 및 8가 버전의 결합 강도를 비교하는 직접 결합 ELISA. Quad 53의 원자가가 증가함에 따라 결합 강도의 증가를 볼 수 있다.
도 27: 배양 상청액으로부터 정제된 이중특이적 4가 scFv Quad 55 단백질의 SDS-PAGE 분석(a). Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다 (b) 연속으로 희석된 Quad 55 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 TNFa 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 55는 용량 의존적 방식으로 TNFa 단백질에 결합한다.
도 28: 이중특이적 4가 Quad의 SDS-PAGE 분석. 배양 상청액으로부터 정제되고 SDS-PAGE에 의해 분석된 이중특이적 scFv x dAb Quad 56 단백질(a). Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다 (b) 연속으로 희석된 Quad 56 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 TNFa 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 56은 용량 의존적 방식으로 TNFa 단백질에 결합한다. (c) 재조합 CD20에 대한 3 개의 상이한 이중특이적 4가 Quad 형식(Quad 54: dAb x dAb, Quad 55: scFv x scFv 및 Quad 56: ScFv x dAb)의 결합 강도를 비교하는 직접 결합 ELISA. 모든 3 개의 이중특이적 4가 Quad 형식은 유사한 결합 강도로 용량 의존적 방식으로 CD20에 결합한다.
도 29: 배양 상청액으로부터 정제된 단일특이적 4가 단량체성 Ig scFv Quad 64 버전 1 단백질의 SDS-PAGE 분석(a). "단량체성 Ig"는 Fc를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 다량체를 지칭하며, 여기서 CH2는 힌지 서열을 포함하지만 코어 힌지 영역이 결여되어 있고; 이는 유리하게는 Fc 영역이 함께 다량체화되는 것을 방지하여 다량체화가 다량체에서 폴리펩티드의 SAM(예를 들어, TD) 도메인에 의해 대신 야기되게 한다. Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표에 의해 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다 (b) 연속으로 희석된 Quad 64 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 CD20 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 64는 용량 의존적 방식으로 CD20 단백질에 결합한다.
도 30: 배양 상청액으로부터 정제된 단일특이적 4가 단량체성 Ig scFv Quad 65 버전 2 단백질의 SDS-PAGE 분석(a). Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다 (b) 연속으로 희석된 Quad 65 단백질과 플레이트 상에 코팅된 고정된 농도의 재조합 CD20 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA. Quad 65는 용량 의존적 방식으로 CD20 단백질에 결합한다.
도 31: Quad 68 및 Quad 69의 도시적 표시(A 및 B). PD-L1 및 4-1BB에 대한 dAb의 특이성은 화살표로 나타낸다. (C 및 D) 배양 상청액으로부터 정제된 Quad 68 및 Quad 69 단백질의 SDS-PAGE 분석. Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 MW에 따라 이동하였다.
도 32: 상이한 종으로부터의 p53 사량체화 도메인(TD)의 정렬. 인간 TD로부터의 서열 변이는 볼드체로 강조되어 있고 밑줄이 그어져 있다.
도 33. 4가 및 8가 항-TNF 알파 dAb 단량체성 Ig Quad의 분자(a) 및 구조적(b 및 c) 배열의 도시적 표시. 정제된 Quad 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(d). 4가 및 8가 Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 나타낸 바와 같이 예상된 분자량에 따라 이동하였다. 코어 힌지 영역은 이러한 형식에서 제거되었고 이는 도면에서 * 또는 CH2'로 나타낸다. Q92 쇄는 C-말단에 위치한 His-태그를 함유하며, 이는 도면에 제시되어 있지 않다.
도 34. 배양 상청액으로부터 정제된 8가 이중특이적 항-PDL1/4-1BB dAb 단량체성 Ig Quad(A) 및 8가 단일특이적 항-PDL1 dAb 단량체성 Ig Quad(B) 단백질의 SDS-PAGE 분석. Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 분자량에 따라 이동하였다.
도 35. 배양 상청액으로부터 정제된 아벨루맙(avelumab) Fab 단량체성 Ig Quad(a) 및 Humira Fab 단량체성 Ig Quad(b) 단백질의 SDS-PAGE 분석. Quad 단백질은 가시적 불순물 없이 화살표로 나타낸 바와 같이 예상된 분자량에 따라 이동하였다. Humira(아달리무맙(adalimumab)) Fab 단량체성 Ig Quad를 SEC에 의해 추가로 분석하였으며, 완전히 어셈블리된 사량체성 단백질이 이량체성 또는 단량체성 형태의 가시적 검출 없이 예상된 분자량(315.8 kDa)에서 단일 피크로서 융출되었다.
도 36. 아플리버셉트(aflibercept) 단량체성 Ig Quad(Q96)의 구조적 배열의 도시적 표시. *는 힌지 영역에 코어 힌지 영역이 없음을 나타낸다. Q96 Quad 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였으며 예상된 분자량에서의 단일 단백질 밴드를 볼 수 있었다(b). VEGF-A에 대한 Q96의 결합 프로파일을 ELISA 결합 검정에 의해 분석하였으며 용량 의존적 결합을 볼 수 있었다.
도 37. 1가, 4가 및 8가 항-TNF 알파 dAb Quad의 분자 배열의 도시적 표시(a). 모든 작제물은 C-말단에 위치한 His-태그를 함유하며, 이는 도면에 제시되어 있지 않다. 정제된 Quad 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였으며 1가, 4가 및 8가 버전에 대한 예상된 분자량에서 단일 단백질 밴드(각각 레인 1-3)를 볼 수 있었다(b). Q88 1가, 4가 및 8가 Quad 단백질(c) 이외에 Q92 및 Q92+Q93(d) Quad 단백질을 사용한 TNF 알파 결합 검정을 ELISA에 의해 수행하였으며 용량 의존적 결합을 볼 수 있었다. Quad 단백질의 각 TNF 알파 중화 효능을 WEHI 세포 기반 생물검정을 사용하여 분석하였다(각각 e 및 f). 항-TNF 알파 dAb 결합 도메인의 수가 증가함에 따라 Quad에서 TNF 알파 중화 효능의 향상을 볼 수 있었다.
도 38. 도데카 및 헥사데카 항-TNF 알파 dAb 다량체(본 발명자들은 대안적으로 다량체, Quad라고 함)의 분자(a) 및 구조적(b) 배열의 도시적 표시. 경쇄 불변 영역은 CL로 나타내며, 카파 불변 영역 또는 람다 불변 영역으로 구성될 수 있다. Q142 작제물은 C-말단에 위치한 His-태그를 함유하며, 이는 도면에 제시되어 있지 않다. 정제된 Quad 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(c). 람다(레인 1) 또는 카파(레인 2) 불변 영역이 있는 12가 항-TNF 알파 dAb Quad는 예상된 분자량에 따라 SDS-PAGE 겔 상에서 이동하였다. 람다(레인 3) 또는 카파(레인 4) 불변 영역이 있는 16가 항-TNF 알파 dAb Quad는 또한 예상된 분자량에 따라 SDS-PAGE 겔 상에서 이동하였다. WEHI 세포 기반 생물검정을 사용하여 분석된 카파(d) 또는 람다(e) 경쇄 불변 영역이 있는 도데카 및 헥사데카 항-TNF 알파 dAb Quad 단백질의 TNF 알파 중화 효능. 항-TNF 알파 dAb 결합 도메인이 증가함에 따라 효능 향상을 볼 수 있었다.
도 39. 12가 삼중특이적(a) 및 16가 사중특이적(b) 다량체의 도시적 구조적 표시. 각 형식의 경우, 단량체성 빌딩 블록의 도시적 구조가 또한 제시되어 있다. 임의적 가요성 링커를 함유하는 이들 분자 내의 영역은 화살표로 나타낸다. CL 도메인은 카파 또는 람다 C 영역일 수 있다. 12가 삼중특이적 Quad는 1-3으로 표지된 3 개의 상이한 dAb를 함유하며, 3 개의 상이한 세포에서 3 개의 상이한 항원에 결합하거나 또는 동일한 세포에서 3 개의 항원 또는 동일한 항원에서 3 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이 형식은 4 + 4 + 4 삼중특이적 12가 Quad를 나타낸다. 16가 사중특이적 Quad는 1-4로 표지된 4 개의 상이한 dAb를 함유하며, 4 개의 상이한 세포에서 4 개의 상이한 항원에 결합하거나 또는 동일한 세포에서 4 개의 항원 또는 동일한 항원에서 4 개의 에피토프에 결합할 수 있다. 이 형식은 4 + 4 + 4 + 4 사중특이적 16가 Quad를 나타낸다.
도 40. 4가 비 Ig-유사 Humira Fab-TD Quad의 도시적 구조적 표시(a). 단량체성 빌딩 블록의 도시적 구조가 또한 제시되어 있다. 임의적 가요성 링커를 함유하는 이 분자 내의 영역은 화살표로 나타낸다(예를 들어, 각 링커는 본원에 기재된 바와 같은 (G4S 링커이다). *는 코어 힌지 영역의 부재(즉, 하부 힌지 서열 및 임의적으로 또한 상부 힌지 영역의 존재)를 나타낸다. 정제된 Humira Fab-TD 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분석하였으며 예상된 분자량에서 단일 단백질 밴드를 볼 수 있었다(b). Humira Fab-TD 및 Humira Fab 1가 대조군 단백질을 사용한 TNFα 결합 검정을 ELISA에 의해 수행하였으며 용량 의존적 결합을 볼 수 있었다(c). Quad 단백질의 각각의 TNFα 중화 효능을 WEHI 세포 기반 생물검정을 사용하여 분석하였다(d). TNFα 중화 효능의 향상은 Humira Fab 1가 대조군과 비교하여 Humira Fab-TD에서 볼 수 있었다.
도 41. 비 Ig-유사 Quad a) 또는 Ig-유사 Quad(b)로서 8가 Fab의 도시적 구조적 표시. 각 형식의 경우, 단량체성 빌딩 블록의 도시적 구조가 또한 제시되어 있다. 임의적 가요성 링커를 함유하는 이들 분자 내의 영역은 화살표로 나타낸다(예를 들어, 각 링커는 본원에 기재된 바와 같은 (G4S 링커이다).
도 42. 도 22에 요약된 바와 같은 형식 A-AC의 단량체성 빌딩 블록의 도식.
본원의 모든 폴리펩티드 도식 및 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 기재되어 있다. 본원의 모든 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3'으로 기재되어 있다.
본 발명은 폴리펩티드의 사량체 및 에피토프 또는 이펙터 도메인(예컨대 항원 결합 부위(예를 들어, 항원 또는 pMHC, 또는 이의 가변 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 TCR 결합 부위)) 또는 펩티드, 예컨대 인크레틴, 인슐린 또는 호르몬 펩티드의 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 및 팔량체)와 같은 다량체에 관한 것이다. 구현예에서, 본 발명의 다량체는 진핵생물 시스템에서 유용하게 생성가능하고 가용성 형태로 진핵생물 세포로부터 분비될 수 있으며, 약제품, 진단제, 영상화제로서, 세제 등을 생성하는 것과 같은 다양한 산업적 적용에 유용하다. 이펙터 도메인 또는 펩티드의 사량체 또는 팔량체와 같은 고차 다량체는 항원 또는 pMHC 결합 결합력을 향상시키는 데 유용하다. 이는 효과적인 의약품을 생산하거나 또는 사량체 또는 팔량체와 같은 다량체를 포함하는 진단 시약의 민감도를 향상시키는 데 유용할 수 있다. 추가적 또는 대안적 이점은 본 발명의 다량체가 예를 들어, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 예방하기 위해 인간 또는 동물 대상체에게 투여될 때 향상된 생체내 반감기이다. 유용하게는, 본 발명은 또한 다중특이적(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적) 다가 결합 단백질을 제공할 수 있다. 특이성은 항원 또는 pMHC 결합의 특이성에 관한 것이다. 결합 도메인 또는 펩티드를 포함하는 단일 조작된 폴리펩티드를 사용함으로써, 본 발명은 특정 예에서 다가(예를 들어, 이중특이적) 단백질을 고순도로 생산하기 위한 수단을 유용하게 제공한다. 조작된 폴리펩티드 단량체의 단일 종을 사용하면 2 개 이상의 상이한 폴리펩티드 종을 사용하여 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 또는 다가 단백질을 생성할 때 제시된 혼합된 생성물의 문제를 피한다.
본 발명은 하기 조항, 측면, 단락 및 개념(이는 "청구범위"를 나타내도록 의도되지 않으며; 청구범위는 실시예 및 표 이후에 본 개시내용의 마지막에 제시됨)을 제공한다. 본원의 임의의 조항은 본원의 임의의 측면 또는 개념과 조합될 수 있다. 본원의 임의의 측면은 본원의 임의의 개념과 조합될 수 있다.
측면:
1. 이펙터 도메인(예를 들어, 단백질 도메인) 또는 펩티드의 적어도 제1, 제2, 제3 및 제4 카피의 단백질 다량체로, 여기서 다량체는 함께 회합된 제1, 제2, 제3 및 제4 자기-회합 사량체화 도메인(TD)에 의해 다량체화되며, 여기서 각 사량체화 도메인은 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하는 각각의 조작된 폴리펩티드에 의해 포함되는 것인, 다량체.
일 예에서, 각 TD는 표 2에 나열된 단백질 1 내지 119 중 임의의 하나의 TD이다. 일 예에서, 각 TD는 p53 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이다. 일 예에서, 각 TD는 NHR2 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이다. 일 예에서, 각 TD는 p63 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이다. 일 예에서, 각 TD는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이다. 일 예에서, 각 TD는 NHR2 TD가 아니다. 일 예에서, 각 TD는 p53 TD가 아니다. 일 예에서, 각 TD는 p63 TD가 아니다. 일 예에서, 각 TD는 p73 TD가 아니다. 일 예에서, 각 TD는 p53, 63 또는 73 TD가 아니다. 일 예에서, 각 TD는 NHR2, p53, 63 또는 73 TD가 아니다.
"함께 회합됨"으로써, 측면 1의 TD는 조작된 폴리펩티드의 제1, 제2, 제3 및 제4 카피를 다량체화하여 다량체 단백질, 예를 들어, 진핵생물 또는 포유동물 세포(예를 들어, HEK293 세포)에서 세포내로 발현될 수 있고/있거나 진핵생물 또는 포유동물 세포(예를 들어, HEK293 세포)로부터 세포외로 분비될 수 있고/있거나 수성 배지(예를 들어, 진핵생물 또는 포유동물 세포(예를 들어, HEK293 세포) 배양 배지)에서 가용성인 다량체를 제공한다. 예는 NHR TD, p53 TD, p63 TD 및 p73 TD(예를 들어, 인간 NHR TD, p53 TD, p63 TD 및 p73 TD) 또는 이의 오솔로그 또는 상동체이다.
일 예에서, TD는 p53 TD(또는 이의 상동체 또는 오솔로그)가 아니며, 예를 들어, 인간 p53 TD(또는 이의 상동체 또는 오솔로그)가 아니다. 일 예에서, TD는 NHR2 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이지만, p53 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그는 제외된다. 일 예에서, TD는 인간 NHR2 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이지만, 인간 p53 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그는 제외된다. 일 예에서, TD는 인간 NHR2이다. 일 예에서, TD의 아미노산 서열은 인간 NHR2의 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다. 일 예에서, 도메인 또는 펩티드는 NHR2 TD를 또한 포함하는 폴리펩티드에 의해 자연적으로 포함되지 않는다.
일 예에서, 폴리펩티드의 모든 도메인은 인간이다.
조작된 폴리펩티드는 상기 TD의 카피에 상기 도메인 또는 펩티드 N-말단의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조작된 폴리펩티드는 상기 TD의 카피에 상기 도메인 또는 펩티드 C-말단의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 일 예에서, 조작된 폴리펩티드는 제1 상기 도메인 또는 펩티드 및 TD를 포함하며, 여기서 제1 도메인 또는 펩티드는 TD로부터 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 개의 인접한 아미노산만큼 이격되어 있으며, 제1 도메인 또는 펩티드 및 TD 사이에 추가로 상기 도메인 또는 펩티드가 존재하지 않는다.
일 예에서, 다량체(예를 들어, 상기 조작된 폴리펩티드의 사량체)는 4 개(그러나 4 개 이하)의 TD(예를 들어, 동일한 TD) 및상기 도메인 또는 펩티드의 4, 8, 12 또는 16 개(그러나 각각 상기 4, 8, 12 또는 16 개 이하)의 카피를 포함한다. 일 예에서, 각 TD 및 각 상기 도메인 또는 펩티드는 인간이다.
일 예에서, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체)는 조작된 폴리펩티드의 제1, 제2, 제3 및 제4 동일한 카피를 포함하며, 폴리펩티드는 TD 및 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 1 개(그러나 1 개 이하), 2 개(그러나 2 개 이하), 또는 그 이상의 카피를 포함한다. 예를 들어, 에피토프 또는 이펙터 도메인의 사량체는 TD를 포함하는 폴리펩티드의 4 개의 동일한 카피를 가지며 각 폴리펩티드는 1 개의 이러한 에피토프 또는 이펙터 도메인을 갖는다. 예를 들어, 에피토프 또는 이펙터 도메인의 팔량체는 TD를 포함하는 폴리펩티드의 4 개의 동일한 카피를 가지며 각 폴리펩티드는 2 개의 이러한 에피토프 또는 이펙터 도메인을 갖는다. 예를 들어, 에피토프 또는 이펙터 도메인의 십이량체는 TD를 포함하는 폴리펩티드의 4 개의 동일한 카피를 가지며 각 폴리펩티드는 3 개의 이러한 에피토프 또는 이펙터 도메인을 갖는다. 예를 들어, 에피토프 또는 이펙터 도메인의 십육량체는 TD를 포함하는 폴리펩티드의 4 개의 동일한 카피를 가지며 각 폴리펩티드는 4 개의 이러한 에피토프 또는 이펙터 도메인을 갖는다. 예를 들어, 에피토프 또는 이펙터 도메인의 20-mer는 TD를 포함하는 폴리펩티드의 4 개의 동일한 카피를 가지며 각 폴리펩티드는 5 개의 이러한 에피토프 또는 이펙터 도메인을 갖는다. 일반적으로, 예를 들어, 에피토프 또는 이펙터 도메인의 X-mer는 TD를 포함하는 폴리펩티드의 4 개의 동일한 카피를 가지며 각 폴리펩티드는 X/4 개의 이러한 에피토프 또는 이펙터 도메인을 가지며, 여기서 X는 4의 임의의 배수, 예를 들어, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 또는 32이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다량체, 예를 들어, 사량체 또는 팔량체를 형성하기 위해 단지 하나의 유형의 조작된 폴리펩티드를 필요로 함으로써, 본 발명은 유리하게는 순수한(또는 고도로 순수한, 즉 >90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 순도) 형식으로 용이하게 단리될 수 있는 형식, 뿐만 아니라 이러한 형식을 순수한 (또는 고도로 순수한) 형식으로 생성하는 방법을 제공한다. 순도는 본 발명의 다량체가 임의의 다른 다량체 또는 폴리펩티드 단량체와의 조성물에서 혼합물로 존재하지 않거나, 또는 본 발명의 다량체가 본 발명의 다량체 및 조작된 폴리펩티드를 포함하는 다른 다량체 및/또는 폴리펩티드 단량체를 포함하는 조성물에서 종의 >90, 95, 96, 97, 98 또는 99%를 포함하는 경우에 의해 표시한다. 따라서, 이러한 구현예에서 상이한 유형의 폴리펩티드의 혼합물은 회피되거나 또는 최소화된다. 따라서, 이는 유리하게는 또한 단지 1 개(그리고 1 개 이하) 유형의 조작된 폴리펩티드를 포함하는 복수의 다량체(예를 들어, 복수의 사량체 또는 팔량체 또는 십이량체 또는 십육량체)를 제공하며, 여기서 다량체는 항원 결합에 대해 단일특이적(그러나 다가)이거나, 또는 대안적으로 항원 결합에 대해 이중특이적 또는 다중특이적이다. 따라서, 본 발명은 복수의 다량체(예를 들어, 복수의 사량체 또는 팔량체 또는 십이량체 또는 십육량체를 제공하며, 각 폴리펩티드는 항원 결합에 대해 적어도 4가이고 (i) 이중특이적(즉, 2 개의 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있음) 또는 (ii) 단일특이적 및 항원 결합에 대해 적어도 4가이다. 본원에서, 항원 결합이 언급된 경우 도메인이 TCR V 도메인인 경우 이는 대신 pMHC 결합일 수 있다. 유리하게는, 복수는 하나 초과 유형의 폴리펩티드 단량체를 포함하는 순수한 형태(즉, 다량체(예를 들어, 사량체 또는 팔량체 또는 십이량체 또는 십육량체)와 혼합되지 않음)이다. 일 예에서, 다량체는 적어도 2 개의 상이한 유형의 항원 결합 부위를 포함한다. 일 예에서, 다량체는 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적이다. 일 예에서, 다량체는 4, 6, 8, 10 또는 12 개, 바람직하게는 4 또는 8 개의 항원 결합 부위 또는 pMHC 결합 부위 원자가를 갖는다.
일 예에서, 펩티드 MHC(pMHC)는 클래스 I 또는 클래스 II pMHC이다.
예를 들어, 도메인, 항체 또는 결합 부위와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적으로 결합한다"란 SPR에 의해 결정된 바와 같이 1mM 이하의 결합 친화도로 특이적 항원(또는 pMHC)을 인식하는 도메인, 항체 또는 결합 부위를 의미한다
표적 결합 능력, 특이성 및 친화도(KD(또한 Kd라고도 함), Koff　및/또는 Kon)는 당업계의 임의의 일상적인 방법, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "KD"는 특정 결합 부위/리간드, 수용체/리간드 또는 항체/항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 일 구현예에서, 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 25℃에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, SPR은 37℃에서 수행된다. 일 구현예에서, SPR은 약 pH7 또는 pH7.6과 같은 생리학적 pH에서 수행된다(예를 들어, pH7.6에서 Hepes 완충 염수(또한 HBS-EP라고도 지칭됨) 사용). 일 구현예에서, SPR은 생리학적 염 수준, 예를 들어, 150 mM NaCl에서 수행된다. 일 구현예에서, SPR은 0.05 부피% 이하의 세제 수준에서, 예를 들어, 0.05%의 P20(폴리소르베이트 20; 예를 들어, Tween-20™) 및 3 mM의 EDTA의 존재 하에 수행된다. 일 예에서, SPR은 pH7.6, 150 mM NaCl, 0.05% 세제(예를 들어, P20) 및 3 mM EDTA의 완충액에서 25℃ 또는 37℃에서 수행된다. 완충액은 10 mM Hepes를 함유할 수 있다. 일 예에서, SPR은 HBS-EP에서 25℃ 또는 37℃에서 수행된다. HBS-EP는 Teknova Inc(캘리포니아주 소재; 카탈로그 번호 H8022)로부터 입수가능하다. 일 예에서, 친화도(예를 들어, VH/VL 결합 부위의 친화도)는 Biacore™와 같은 임의의 표준 SPR 장치를 사용하거나 또는 ProteOn XPR36™(Bio-Rad®)을 사용함으로써 SPR을 사용하여 결정된다. 결합 데이터는 예를 들어, ProteOn XPR36™ 분석 소프트웨어에 고유한 모델을 사용하여 표준 기술을 사용한 고유한 1:1 모델에 맞출 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 다량체, 사량체 또는 팔량체 또는 십이량체 또는 십육량체 또는 20-mer는 단리된 다량체, 사량체 또는 팔량체 또는 십이량체 또는 십육량체 또는 20-mer이다. 일 예에서, 본 발명의 다량체, 사량체 또는 팔량체는 상기 조작된 폴리펩티드의 카피로 이루어진다. 임의적으로 본 발명의 다량체, 사량체 또는 팔량체 또는 십이량체 또는 십육량체 또는 20-mer는 조작된 폴리펩티드의 각각 4 또는 8 또는 12 또는 16 또는 20 개 카피 그러나 4 또는 8 또는 12 또는 16 또는 20 개 이하의 카피를 포함한다.
"조작된"이란 폴리펩티드가 자연 발생하지 않음을 의미하며, 예를 들어 단백질 도메인 또는 펩티드는 상기 TD를 또한 포함하는 폴리펩티드에 의해 자연적으로 포함되지 않는다.
각 상기 단백질 도메인 또는 펩티드는 생물학적으로 활성 도메인 또는 펩티드(예를 들어, 인간 또는 동물에서 생물학적으로 활성), 예컨대 항원 또는 펩티드-MHC(pMHC)에 특이적으로 결합하는 도메인일 수 있거나, 또는 여기서 도메인은 항원 또는 pMHC 결합 부위에 의해 포함된다. 대안으로, 도메인 또는 펩티드는 탄수화물, 글루코스 또는 당 조절제, 예컨대 인크레틴 또는 인슐린 펩티드이다. 대안으로, 도메인 또는 펩티드는 억제제 또는 효소 또는 인간 또는 동물에서 생물학적 기능 또는 경로의 억제제이다. 대안으로, 도메인 또는 펩티드는 철 조절제이다. 따라서, 일 예에서, 각 단백질 도메인 또는 펩티드는 항원 또는 pMHC 결합 도메인 또는 펩티드; 호르몬; 탄수화물, 글루코스 또는 당 조절제; 철 조절제; 및 효소 억제제로부터 선택된다.
2. 측면 1에 있어서, 상기 다량체가 상기 도메인 또는 펩티드의 사량체, 팔량체, 12-mer, 16-mer 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체, 12-mer 또는 16-mer)인, 다량체.
3. 측면 1 또는 2에 있어서, 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 부위(예를 들어, 항체 또는 TCR 결합 부위, 예컨대 scFv 또는 scTCR)의 사량체, 팔량체, 12-mer, 16-mer 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체, 12-mer 또는 16-mer)를 포함하는, 다량체.
면역글로불린 슈퍼패밀리(IgSF)는 세포의 인식, 결합, 또는 접착 과정에 수반되는 세포 표면 및 가용성 단백질의 큰 단백질 슈퍼패밀리이다. 분자는 면역글로불린(또한 항체로도 알려짐)과 공유된 구조적 특징을 기반으로 한 이 슈퍼패밀리의 구성원으로 분류되며; 이들은 모두 면역글로불린 도메인 또는 접힘으로 알려진 도메인을 보유한다. IgSF의 구성원은 세포 표면 항원 수용체, 면역계의 공-수용체 및 공-자극 분자, 림프구에 대한 항원 제시에 수반되는 분자, 세포 접착 분자, 특정 사이토카인 수용체 및 세포내 근육 단백질을 포함한다. 이들은 통상적으로 면역계에서의 역할과 연관된다.
T-세포 수용체(TCR) 도메인은 Vα(예를 들어 Vβ와 쌍을 이룸), Vβ(예를 들어 Vα와 쌍을 이룸), Vγ(예를 들어, Vδ와 쌍을 이룸) 또는 Vδ(예를 들어, Vγ와 쌍을 이룸)일 수 있다.
4. 측면 3에 있어서, 상기 결합 부위가 제2 가변 도메인과 쌍을 이룬 제1 가변 도메인을 포함하는, 다량체.
제1 예에서, 제1 및 제2 가변 도메인은 조작된 폴리펩티드에 의해 포함된다. 또 다른 예에서, 제1 도메인은 조작된 폴리펩티드에 의해 포함되고 제2 도메인은 조작된 폴리펩티드와 상이한(그리고 임의적으로 TD를 포함하거나 또는 TD가 없는) 추가의 폴리펩티드에 의해 포함된다.
대안으로, 도메인은 불변 영역 도메인이다. 대안으로, 도메인은 FcAb이다. 대안으로, 도메인은 비-Ig 항원 결합 부위이거나 또는 비-Ig 항원 결합 부위, 예를 들어, 아피바디(affibody)에 의해 포함된다.
항원 결합 부위 및 이펙터 도메인
일 예에서, 또는 각 항원 결합 부위(또는 이펙터 도메인)는 항체 가변 도메인(예를 들어, VL 또는 VH, 항체 단일 가변 도메인(도메인 항체 또는 dAb), 낙타과 VHH 항체 단일 가변 도메인, 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인(NA V), Nanobody™ 또는 낙타화된 VH 단일 가변 도메인); T-세포 수용체 결합 도메인; 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인; 무악류 가변 림프구 수용체(J Immunol; 2010 Aug l;185(3):1367-74; "Alternative adaptive immunity in jawless vertebrates; Herrin BR & Cooper M D.); 피브로넥틴 도메인(예를 들어, Adnectin™); scFv; (scFv)2; sc-디아바디(diabody); scFab; CTLA-4(Evibody™)로부터 선택된 스캐폴드로부터 유도된 센티린 및 항원 결합 부위; 리포칼린 도메인; 단백질 A 예컨대 단백질 A의 Z-도메인(예를 들어, Affibody™ 또는 SpA); A-도메인(예를 들어, Avimer™ 또는 Maxibody™); 열 충격 단백질(예컨대 GroEI 및 GroES로부터 유도된 에피토프 결합 도메인); 트랜스페린 도메인(예를 들어, 트랜스바디(trans-body)); 안키린 반복 단백질(예를 들어, DARPin™); 펩티드 압타머; C-유형 렉틴 도메인(예를 들어, Tetranectin™); 인간 γ- 결정질 또는 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 전갈 독소; 및 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠(kunitz) 유형 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항원 결합 부위의 추가의 공급원은 WO2007024715의 40 페이지, 23 행 내지 43 페이지, 23 행에 개시된 가변 도메인 및 항체의 VH/VL 쌍이다. 이 특정 개시내용은 본 발명에 사용하기 위한 에피토프 결합 모이어티에 대한 기초 및 본원의 청구범위에 포함될 가능성을 제공하기 위해 본원에 명시적으로 작성된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
"도메인"은 나머지 단백질과 관계없이 3차 구조를 갖는 접힌 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며 많은 경우에 나머지 단백질 및/또는 도메인의 기능 상실 없이 다른 단백질에 첨가되거나, 제거되거나 또는 전달될 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는 접힌 폴리펩티드 도메인이다. 따라서 이는 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인을 포함하며, 예를 들어, 여기서 하나 이상의 루프는 항체 가변 도메인의 특성이 아닌 서열, 또는 절두되었거나 또는 N-말단 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 접힌 단편으로 대체되었다.
어구 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "항체 단일 가변 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 관계 없이 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 영역 또는 도메인이 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의해 항원 결합에 필요하지 않는(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과 관계 없이 항원에 결합하는 경우) 다른 상이한 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 형식(예를 들어, 동종-다량체 또는 이종-다량체)으로 존재할 수 있다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 용어가 본원에 사용된 바와 같이 항원에 결합할 수 있는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있지만, 또한 설치류(예를 들어, WO 00/29004에 개시된 바와 같음), 수염 상어 및 낙타과 VHH 면역글로불린 단일 가변 도메인과 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 낙타과 VHH는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함한 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이며, 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄 항체를 생성한다. 이러한 VHH 도메인은 당업계에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 여전히 본 발명에 따른 "도메인 항체"로 간주된다. 본원에 사용된 바와 같이 "VH는 낙타과 VHH 도메인을 포함한다. NA V는 수염 상어를 포함한 연골 어류에서 식별된 또 다른 유형의 면역글로불린 단일 가변 도메인이다. 이들 도메인은 또한 신규 항원 수용체 가변 영역(통상적으로 V(NAR) 또는 NARV로 약칭됨)으로 알려져 있다. 추가의 상세한 내용에 대해 Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) 및 US20050043519A를 참조한다. CTLA-4(세포독성 T 림프구 연관 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포 상에서 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 접힘을 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 특성을 부여하기 위해 이종 서열로 치환될 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디(Evibody)로 알려져 있다. 추가의 상세한 내용에 대해 Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)을 참조한다. 리포칼린은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 작은 소수성 분자를 수송하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원뿔형 구조의 개방 말단에 다수의 루프가 있는 견고한 β-시트 2차 구조를 갖는다. 안티칼린은 160-180 개 아미노산 크기이며, 리포칼린으로부터 유래된다. 추가의 상세한 내용에 대해 Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 및 US20070224633을 참조한다. 아피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이다. 도메인은 대략 58 개 아미노산의 3-나선형 번들로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위화에 의해 생성되었다. 추가의 상세한 내용에 대해 Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) 및 EP1641818A1을 참조한다. Avimer™는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 대략 35 개 아미노산의 고유 도메인은 정의된 디술피드 결합된 구조를 채택한다. 다양성은 A-도메인의 패밀리에 의해 나타낸 자연적 변이의 뒤섞임에 의해 생성된다. 추가의 상세한 내용에 대해 Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 및 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)을 참조한다. 트랜스페린은 단량체성 혈청 수송 당단백질이다. 트랜스페린은 관용적 표면 루프에 펩티드 서열을 삽입함으로써 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예는 트랜스바디를 포함한다. 추가의 상세한 내용에 대해 J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)을 참조한다. 고안된 안키린 반복 단백질(DARPins™)은 내재 막 단백질을 세포골격에 부착시키는 것을 매개하는 단백질의 패밀리인 안키린으로부터 유래된다. 단일 안키린 반복부는 2 개의 a-나선 및 β-회전으로 이루어진 33 개 잔기 모티프이다. 이들은 각 반복부의 첫번째 a-나선 및 β-회전에서 잔기를 무작위화함으로써 상이한 표적 상원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 계면은 모듈의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다(친화도 성숙 방법). 추가의 상세한 내용에 대해 J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 및 J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 및 US20040132028A1을 참조한다. 피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. Adnectin™은 인간 피브로넥틴 유형 III(FN3)의 15 개 반복 단위 중 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 백본으로 이루어진다. β-샌드위치의 한쪽 끝에 있는 3 개의 루프는 애드넥틴(Adnectin)이 관심 치료 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가의 상세한 내용에 대해 Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005), US20080139791 , WO2005056764 및 US6818418B1을 참조한다. 펩티드 압타머는 활성 부위에 삽입된 속박된 가변 펩티드 루프를 함유하는 전형적으로 티오레독신(TrxA)인 불변 스캐폴드 단백질로 이루어진 조합 인식 분자이다. 추가의 상세한 내용에 대해 Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)을 참조한다. 마이크로바디(Microbody)는 3-4 개의 시스테인 가교를 함유하는 25-50 개 아미노산 길이의 자연 발생 미세단백질로부터 유래되며 - 미세단백질의 예는 KalataBI 및 코노톡신(conotoxin) 및 노트틴(knottin)을 포함한다. 미세단백질은 미세단백질의 전반적인 접힘에 영향을 미치지 않으면서 최대 25 개 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 노트틴 도메인의 추가의 상세한 내용에 대해, WO2008098796을 참조한다. 다른 에피토프 결합 모이어티 및 도메인은 상이한 표적 항원 결합 특성을 조작하기 위한 스캐폴드로서 사용된 단백질을 포함하며 인간 γ-결정질 및 인간 유비퀴틴(아필린), 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 전갈 독소(카리브도톡신), C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴)을 포함하고, Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)의 7 장 - 비-항체 스캐폴드 및 Protein Science 15:14-27 (2006)에서 검토된다.
일 예에서, 또는 각 항원 결합 부위(또는 이펙터 도메인)은 비-Ig 스캐폴드를 포함하며, 예를 들어, 아피바디, 아필린, 안티칼린, 아트리머, 아비머, 비사이클 펩티드, Cys-knot, DARpin, 피브로넥틴 유형 III, Fyomer, 쿠니츠 도메인, 오바디(OBody), 압타머, 애드넥틴, 아르마딜로 반복 도메인, 베타-헤어핀 모방체 및 리포칼린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5. 측면 1 내지 4 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 각 폴리펩티드가 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 제1 및 제2 카피를 포함하며, 여기서 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) 상기 제1 카피 - TD - 상기 제2 카피; (ii) TD - 및 제1 및 제2 카피; 또는 (iii) 상기 제1 및 제2 카피 - TD를 포함하는, 다량체.
6. 측면 1 내지 5 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 TD가 NHR2 TD이고 도메인 또는 펩티드가 NHR2 도메인 또는 펩티드가 아니거나; 또는 TD가 p53 TD이고 도메인 또는 펩티드가 p53 도메인 또는 펩티드가 아닌, 다량체.
7. 측면 1 내지 6 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드가 제2 유형의 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하며, 여기서 제2 유형의 단백질 도메인 또는 펩티드는 제1 단백질 도메인 또는 펩티드와 상이한 것인, 다량체.
예를 들어, 폴리펩티드는 N-말단 방향으로 (i) P1- TD -P2; 또는 (ii) TD -P1-P2를 포함하며, 여기서 P1은 제1 유형의 도메인 또는 펩티드의 카피(즉, 측면 1의 다량체의 도메인 또는 펩티드 유형)이고; P2는 상기 제2 유형의 도메인 또는 펩티드의 카피이다.
8. 측면 1 내지 7 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 도메인이 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인인, 다량체.
9. 측면 1 내지 8 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 도메인 또는 펩티드가 항체 가변 또는 불변 도메인(예를 들어, 항체 단일 가변 도메인), TCR 가변 또는 불변 도메인, 인크레틴, 인슐린 펩티드, 또는 호르몬 펩티드인, 다량체.
10. 측면 1 내지 9 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 다량체가 상기 조작된 폴리펩티드의 1, 제2, 제3 및 제4 동일한 카피를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 TD 및 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 1 개(그러나 1 개 이하), 2 개(그러나 2 개 이하) 또는 그 이상의 카피를 포함하는 것인, 다량체.
11. 측면 1 내지 10 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드가 항체 또는 TCR 가변 도메인(V1) 및 NHR2 TD를 포함하는, 다량체.
12. 측면 11에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) V1-임의적 링커-NHR2 TD; (ii) V1-임의적 링커-NHR2 TD-임의적 링커-V2; 또는 (iii) V1-임의적 링커-V2 - 임의적 링커 - NHR2 TD를 포함하며, 여기서 V1 및 V2는 TCR 가변 도메인이고 동일하거나 또는 상이하거나, 또는 V1 및 V2는 항체 가변 도메인이고 동일하거나 또는 상이한 것인, 다량체.
13. 측면 12에 있어서, 상기 V1 및 V2가 항체 단일 가변 도메인인, 다량체.
14. 측면 11에 있어서, 상기 각 조작된 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) V1-임의적 링커-NHR2 TD를 포함하며, 여기서 V1은 항체 또는 TCR 가변 도메인이고, 각 조작된 폴리펩티드가 V2를 포함하는 각각의 제2 조작된 폴리펩티드와 쌍을 이루며, 여기서 V2는 항원 또는 pMHC 결합 부위를 형성하기 위해 V1과 쌍을 이루는 각각 항체 또는 TCR 가변 도메인이고, 임의적으로 하나의 폴리펩티드는 항체 Fc를 포함하거나, 또는 항체 CH1을 포함하고 다른 폴리펩티드는 CH1과 쌍을 이루는 항체 CL을 포함하는 것인, 다량체.
15. 측면 1 내지 14 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 TD가 (i) 서열번호: 10 또는 126과 동일하거나 또는 이에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호: 120 또는 123과 동일하거나 또는 이에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다량체.
16. 측면 1 내지 15 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 다량체가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 항원 결합 부위의 사량체, 팔량체, 12-mer, 16-mer 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체, 12-mer 또는 16-mer; 또는 사량체 또는 팔량체)를 포함하는 것인, 다량체: ReoPro™; 압식시맙(Abciximab); Rituxan™; 리툭시맙(Rituximab); Zenapax™; 다클리주맙(Daclizumab); Simulect™; 바실릭시맙(Basiliximab); Synagis™; 팔리비주맙(Palivizumab); Remicade™; 인플릭시맙(Infliximab); Herceptin™; Mylotarg™; 겜주투맙(Gemtuzumab); Campath™; 알렘투주맙(Alemtuzumab); Zevalin™; 이브리투모맙(Ibritumomab); Humira™; 아달리무맙(Adalimumab); Xolair™; 오말리주맙(Omalizumab); Bexxar™; 토시투모맙(Tositumomab); Raptiva™; 에팔리주맙(Efalizumab); Erbitux™; 세툭시맙(Cetuximab); Avastin™; 베바시주맙(Bevacizumab); Tysabri™; 나탈리주맙(Natalizumab); Actemra™; 토실리주맙(Tocilizumab); Vectibix™; 파니투무맙(Panitumumab); Lucentis™; 라니비주맙(Ranibizumab); Soliris™; 에쿨리주맙(Eculizumab); Cimzia™; 서톨리주맙(Certolizumab); Simponi™; 골리무맙(Golimumab), Ilaris™; 카나키누맙(Canakinumab); Stelara™; 우스테키누맙(Ustekinumab); Arzerra™; 오파투무맙(Ofatumumab); Prolia™; 데노수맙(Denosumab); Numax™; 모타비주맙(Motavizumab); ABThrax™; 락시바쿠맙(Raxibacumab); Benlysta™; 벨리무맙(Belimumab); Yervoy™; 이필리무맙(Ipilimumab); Adcetris™; 브렌툭시맙(Brentuximab); Vedotin™; Perjeta™; 퍼투주맙(Pertuzumab); Kadcyla™; 아도-트라스투주맙(Ado-trastuzumab); Keytruda™, Opdivo™, Gazyva™ 및 오비누투주맙(Obinutuzumab). 임의적으로, 다량체의 폴리펩티드의 결합 부위는 항체의 결합 부위의 VH 및 또한 항체의 CH1(즉, N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1 및 SAM)을 포함한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL, 예를 들어, 여기서 CL은 항체의 CL임) 포함하는 추가의 폴리펩티드와 쌍을 이룰 수 있다.
예를 들어, 조작된 폴리펩티드의 상기 단백질 도메인은 상기 군으로부터 선택된 항체의 항체 결합 부위의 V 도메인(VH 또는 VL)이며, 여기서 다량체는 선택된 항체의 항원 결합 부위를 형성하기 위해 조작된 폴리펩티드의 V 도메인과 쌍을 이루는 추가의 V 도메인(각각 VL 또는 VH)을 포함한다. 따라서, 유리하게는, 본 발명은 상기 선택된 항체의 결합 부위의 사량체, 팔량체, 12-mer, 16-mer 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체, 12-mer 또는 16-mer; 또는 사량체 또는 팔량체)를 제공하며, 유익하게는 이의 동족 항원에 결합하기 위해 또는 다량체가 생체내에서 동족 항원에 결합하도록 투여된 인간 또는 동물에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 개선된 친화도, 결합력 및/또는 효능을 가질 수 있다.
예를 들어, 다량체, 사량체, 팔량체, 12-mer, 16-mer 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체, 12-mer 또는 16-mer; 또는 사량체 또는 팔량체)는 항체의 항원 결합 부위의 4 개(또는 상기 기재된 바와 같이 상기 X/4 개)의 카피를 포함하며, 여기서 항체는 아달리무맙, 사릴루맙(sarilumab), 듀필루맙(dupilumab), 베바시주맙(예를 들어, AVASTIN™), 세툭시맙(예를 들어, ERBITUX™), 토실리주맙(예를 들어, ACTEMRA™) 또는 트라스투주맙(HERCEPTIN™)이다. 대안으로 항체는 항-CD38 항체, 항-TNFa 항체, 항-TNFR 항체, 항-IL-4Ra 항체, 항-IL-6R 항체, 항-IL-6 항체, 항-VEGF 항체, 항-EGFR 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체, 항-PCSK9 항체, 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-CD138 항체, 항-IL-1 항체이다. 대안으로 항체는 WO2007024715의 40 페이지, 23 행 내지 43 페이지, 23 행에 개시된 항체로부터 선택되며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 결합 부위는 예를 들어, 수용체(예를 들어, KDR 또는 Flt)의 리간드 (예를 들어, 사이토카인 또는 성장 인자, 예를 들어, VEGF 또는 EGFR) 결합 부위일 수 있다. 본원에서 결합 부위는 예를 들어, 인간 또는 동물에서 안구 또는 종양학 의학적 용도를 위한 예를 들어, Eyelea™ , Avastin™ 또는 Lucentis™의 결합 부위일 수 있다. 리간드 또는 항원이 VEGF인 경우, 다량체, 사량체 또는 팔량체는 암 또는 안구 병태(예를 들어, 습성 또는 건성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증)의 치료 또는 예방을 위한 것이거나 또는 인간 또는 동물 대상체에서 혈관형성의 억제제일 수 있다.
17. TCR 결합 부위, 인슐린 펩티드, 인크레틴 펩티드 또는 펩티드 호르몬의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer; 또는 복수의 상기 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
여러 중요한 펩티드 호르몬은 뇌하수체로부터 분비된다. 뇌하수체 전엽은 다음의 3 가지 호르몬을 분비한다: 유선에서 작용하는 프로락틴; 부신 피질에서 작용하여 글루코코르티코이드의 분비를 조절하는 부신 피질 자극 호르몬(ACTH); 및 골, 근육, 및 간에서 작용하는 성장 호르몬. 뇌하수체 후엽은 바소프레신이라고도 불리는 항이뇨 호르몬, 및 옥시토신을 분비한다. 그러나, 펩티드 호르몬은 심장(심방-나트륨이뇨 펩티드(ANP) 또는 심방 나트륨이뇨 인자(ANF)) 및 췌장(글루카곤, 인슐린 및 소마토스타틴), 위장관(콜레키스토키닌, 가스트린), 및 지방 조직 저장소(렙틴)를 포함한 많은 상이한 기관 및 조직에 의해 생성된다. 일 예에서, 본 발명의 펩티드 호르몬은 프로락틴, ACTH, 성장 호르몬(소마토트로핀), 바소프레신, 옥시토신, 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴, 콜레키스토키닌, 가스트린 및 렙틴으로부터 선택된다(예를 들어, 인간 프로락틴, ACTH, 성장 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴, 콜레키스토키닌, 가스트린 및 렙틴으로부터 선택됨).
일 예에서, 인크레틴은 GLP-1, GIP 또는 엑센딘-4 펩티드이다.
본 발명은 구현예에서, 다음의 조작된 다량체를 제공한다:-
인크레틴의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
인슐린 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
GLP-1(글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
GIP(글루코스-의존적 인슐린 분비성 폴리펩티드) 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
엑센딘(예를 들어, 엑센딘-4) 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
펩티드 호르몬의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
프로락틴 또는 프로락틴 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
ACTH 또는 ACTH 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
성장 호르몬 또는 성장 호르몬 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
바소프레신 또는 바소프레신 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
옥시토신 또는 옥시토신 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
글루카곤 또는 글루카곤 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
인슐린 또는 인슐린 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
소마토스타틴 또는 소마토스타틴 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
콜레키스토키닌 또는 콜레키스토키닌 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
가스트린 또는 가스트린 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
렙틴 또는 렙틴 펩티드의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
항체 결합 부위(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
TCR 결합 부위(예를 들어, scTCR)의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
TCR Vα/Vβ 결합 부위의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
TCR Vγ/Vδ 결합 부위의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
항체 단일 가변 도메인 결합 부위의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
FcAb 결합 부위의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
이들 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer 중 임의의 것의 일 예에서, 도메인 또는 펩티드는 인간이다. 이들 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer 중 임의의 것의 일 예에서, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 NHR2 TD(예를 들어, 인간 NHR2)를 포함한다. 이들 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer 중 임의의 것의 일 예에서, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 p53 TD(예를 들어, 인간 p53 TD)를 포함한다. 이들 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer 중 임의의 것의 일 예에서, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 p63 TD(예를 들어, 인간 p63 TD)를 포함한다. 이들 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer 중 임의의 것의 일 예에서, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 p73 TD(예를 들어, 인간 p73 TD)를 포함한다. 이들 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer 중 임의의 것의 일 예에서, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 TD(예를 들어, 인간 NHR2 TD)의 사량체를 포함하여, 도메인 또는 펩티드는 4 또는 8 개 도메인 또는 펩티드의 다량체를 형성한다.
일 예에서, 복수는 순수하며, 예를 들어, 상기 결합 부위 또는 펩티드의 다량체와 혼합되지 않으며, 여기서 다량체는 하나 초과 유형의 폴리펩티드 단량체를 포함한다.
18. 측면 1 내지 17 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer가 다음과 같은 것인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer:
(a) 수용액(예를 들어, 수성 진핵생물 세포 성장 배지 또는 완충액)에서 가용성;
(b) 진핵생물 세포로부터 분비가능; 및/또는
(c) 진핵생물 세포의 발현 생성물.
일 예에서 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 HEK293T(또는 다른 진핵생물, 포유동물, CHO 또는 Cos) 세포로부터의 상청액 샘플을 사용하여 PAGE 겔 상에서 상기 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer에 대해 예상되고 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된 분자량에서 단일 밴드에 의해 표시된 바와 같이 안정한 형태로 상기 세포로부터 분비가능하다.
19. 다음의 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체):
(a) TCR V 도메인 또는 TCR 결합 부위, 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 수용액(예를 들어, 수성 진핵생물 세포 성장 배지 또는 완충액)에서 가용성임;
(b) 항체 단일 가변 도메인, 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 수용액(예를 들어, 수성 진핵생물 세포 성장 배지 또는 완충액)에서 가용성임;
(c) TCR V 도메인 또는 TCR 결합 부위, 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음; 또는
(d) 항체 가변 도메인(예를 들어, 항체 단일 가변 도메인), 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음.
배지의 예는 L-글루타민이 보충된 SFMII 성장 배지(예를 들어, 4 mM L-글루타민이 보충된 완전 SFMII 성장 배지)이다. 일 예에서, 배지는 무혈청 HEK293 세포 배양 배지이다. 일 예에서, 배지는 무혈청 CHO 세포 배양 배지이다.
예를 들어, 본원에서 세포는 인간 세포, 예를 들어, HEK293 세포(예컨대 HEK293T 세포)이다.
20. 측면 1 내지 19 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer가 항원 또는 pMHC 결합에 이중특이적인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
21. 측면 1 내지 20 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 도메인이 동일한 것인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
22. 측면 1 내지 21 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer가 진핵생물 세포 글리코실화를 포함하는 것인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
예를 들어, 글리코실화는 CHO 세포 글리코실화이다. 예를 들어, 글리코실화는 HEK(예를 들어, HEK293, 예컨대 HEK293T) 세포 글리코실화이다. 예를 들어, 글리코실화는 Cos 세포 글리코실화이다. 예를 들어, 글리코실화는 피키아(Picchia) 세포 글리코실화이다. 예를 들어, 글리코실화는 사카로마이세스(Sacchaaromyces) 세포 글리코실화이다.
23. 측면 22에 있어서, 상기 세포가 HEK293 세포인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
24. 측면 1 내지 23 중 어느 한 측면의 복수의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
25. 측면 1 내지 24 중 어느 한 측면의 다량체(들), 사량체(들), 팔량체(들), 십이량체(들), 십육량체(들) 또는 20-mer(들) 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
26. 측면 1 내지 24 중 어느 한 측면의 다량체(들), 사량체(들), 팔량체(들), 십이량체(들), 십육량체(들) 또는 20-mer(들)을 포함하는 화장품, 식료품, 음료, 세정 제품, 세제.
27. 측면 1 내지 24 중 어느 한 측면의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer의 상기 조작된 (및 임의적으로 단리된) 폴리펩티드 또는 (임의적으로 단리된) 단량체.
단량체는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드를 포함하고 TD를 추가로 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 조작된 폴리펩티드이다.
임의적으로, 조작된 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 가변 도메인(V1) - 불변 도메인(C)(예를 들어, CH1 또는 Fc) - 임의적 링커 - TD를 포함한다.
28. (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하는 조작된 (및 임의적으로 단리된) 조작된 폴리펩티드(P1):-
(a) TCR V1 -TCR C1 - 항체 C(예를 들어, CH, CH1(예컨대 IgG CH1) 또는 CL(예컨대 Cλ 또는 Cκ)) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이고 C1은 Cα이거나;
(ii) V1은 Vβ이고 C1은 Cβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이고 C1은 Cγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ이고 C1은 Cδ임;
또는
(b) TCR V1 - 항체 C(예를 들어, CH, CH1(예컨대 IgG CH1) 또는 CL(예컨대 Cλ 또는 Cκ)) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이거나;
(ii) V1은 Vβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ임;
또는
(c) 항체 V1 - 항체 C(예를 들어, CH, CH1(예컨대 IgG CH1) 또는 CL(예컨대 Cλ 또는 Cκ)) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(d) 항체 V1 - 임의적 항체 C(예를 들어, CH, CH1(예컨대 IgG CH1) 또는 CL(예컨대 Cλ 또는 Cκ)) - 항체 Fc(예를 들어, IgG Fc) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(e) 항체 V1 - 항체 CL(예를 들어, Cλ 또는 Cκ) - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(f) TCR V1 -TCR C1 - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이고 C1은 Cα이거나;
(ii) V1은 Vβ이고 C1은 Cβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이고 C1은 Cγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ이고 C1은 Cδ임.
(a) 또는 (b)에서, 일 예에서, TCR V는 pMHC에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 TCR 결합 부위(scTCR)에 의해 포함되며, 여기서 결합 부위는 TCR V-링커 - TCRV를 포함한다. 일 예에서, 조작된 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) V1 - 링커 - V - 임의적 C - 임의적 링커 - TD, 또는 (ii) Va - 링커 - V1 - 임의적 C - 임의적 링커 - TD를 포함하며, 여기서 Va는 TCR V 도메인이고 C는 항체 C 도메인(예를 들어, CH1 또는 CL) 또는 TCR C이다.
바람직하게는, 항체 C는 CH1(예를 들어, IgG CH1)이다.
일 예에서 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer의 크기는 155 kDa 이하이며, 예를 들어, 여기서 상기 단백질 도메인은 낙타과 CDR3 또는 소 CDR3와 같은 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 개 아미노산의 CDR3을 포함하는 항체 가변 도메인이다.
일 예에서, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 TCR 결합 부위 및 항체 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 각 폴리펩티드는 TCR V(예를 들어, pMHC에 특이적으로 결합하는 scTCR에 의해 포함됨) 및 항체 V(예를 들어, scFv에 의해 포함되거나 또는 항원에 특이적으로 결합하는 V/V 쌍을 이루는 결합 부위를 형성하기 위해 상기 제2 폴리펩티드에 의해 포함된 제2 V 도메인과 쌍을 이룸)를 포함한다. 일 예에서, pMHC는 RAS 펩티드를 포함한다. 일 예에서 항원은 PD-1, PD-L1 또는 본원에 개시된 임의의 다른 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 항원은 PD-1이고 pMHC는 RAS 펩티드를 포함한다.
29. 측면 28에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드 P1이 추가의 폴리펩티드(P2)와 쌍을 이루며, 여기서 P2는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:-
(g) TCR V2 -TCR C2 - 항체 CL(예를 들어, Cλ 또는 Cκ), 여기서 P1은 측면 28에 인용된 (a)에 따르고
(i) P1이 (a)(ii)에 따른 경우 V2는 Vα이고 C2는 Cα이거나;
(ii) P1이 (a)(i)에 따른 경우 V2는 Vβ이고 C2는 Cβ이거나;
(iii) P1이 (a)(iv)에 따른 경우 V2는 Vγ이고 C2는 Cγ이거나; 또는
(iv) P1이 (a)(iii)에 따른 경우 V2는 Vδ이고 C2는 Cδ임;
또는
(h) TCR V2 - 항체 CL(예를 들어, Cλ 또는 Cκ), 여기서 P1은 측면 28에 인용된 (b)에 따르고
(i) P1이 (b)(ii)에 따른 경우 V2는 Vα이거나;
(ii) P1이 (b)(i)에 따른 경우 V2는 Vβ이거나;
(iii) P1이 (b)(iv)에 따른 경우 V2는 Vγ이거나; 또는
(iv) P1이 (b)(iiii)에 따른 경우 V2는 Vδ임;
또는
(i) 항체 V2 - CL(예를 들어, Cλ 또는 Cκ), 여기서 P1는 측면 28에 인용된 (c)에 따르고
(i) P1이 (c)(ii)에 따른 경우 V2는 VH이거나; 또는
(ii) P1이 (c)(i)에 따른 경우 V2는 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(j) 항체 V2 - 임의적 CL(예를 들어, Cλ 또는 Cκ), 여기서 P1은 측면 28에 인용된 (d)에 따르고
(i) P1이 (d)(ii)에 따른 경우 V2는 VH이거나; 또는
(ii) P1이 (d)(i)에 따른 경우 V2는 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(k) 항체 V2 - CH1(예를 들어, IgG CH1), 여기서 P1은 측면 28에 인용된 (e)에 따르고
(i) P1이 (e)(ii)에 따른 경우 V2는 VH이거나; 또는
(ii) P1이 (e)(i)에 따른 경우 V2는 VL(예를 들어, Vλ 또는 Vκ)임;
또는
(l) TCR V2 -TCR C2, 여기서 P1은 측면 28에 인용된 (f)에 따르고
(i) P1이 (f)(ii)에 따른 경우 V2는 Vα이고 C2는 Cα이거나;
(ii) P1이 (f)(i)에 따른 경우 V2는 Vβ이고 C2는 Cβ이거나;
(iii) P1이 (f)(iii)에 따른 경우 V2는 Vγ이고 C2는 Cγ이거나; 또는
(iv) P1이 (f)(iv)에 따른 경우 V2는 Vδ이고 C2는 Cδ임.
임의적으로, V1 및 V2는 항원 또는 pMHC에 특이적으로 결합할 수 있는 쌍을 이룬 가변 도메인 결합 부위를 형성한다. 일 예에서, V1 및 V2는 예를 들어, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 가변 도메인이다: ReoPro™; 압식시맙; Rituxan™; 리툭시맙; Zenapax™; 다클리주맙; Simulect™; 바실릭시맙; Synagis™; 팔리비주맙; Remicade™; 인플릭시맙; Herceptin™; Mylotarg™; 겜주투맙; Campath™; 알렘투주맙; Zevalin™; 이브리투모맙; Humira™; 아달리무맙; Xolair™; 오말리주맙; Bexxar™; 토시투모맙; Raptiva™; 에팔리주맙; Erbitux™; 세툭시맙; Avastin™; 베바시주맙; Tysabri™; 나탈리주맙; Actemra™; 토실리주맙; Vectibix™; 파니투무맙; Lucentis™; 라니비주맙; Soliris™; 에쿨리주맙; Cimzia™; 서톨리주맙; Simponi™; 골리무맙, Ilaris™; 카나키누맙; Stelara™; 우스테키누맙; Arzerra™; 오파투무맙; Prolia™; 데노수맙; Numax™; 모타비주맙; ABThrax™; 락시바쿠맙; Benlysta™; 벨리무맙; Yervoy™; 이필리무맙; Adcetris™; 브렌툭시맙; Vedotin™; Perjeta™; 퍼투주맙; Kadcyla™; 아도-트라스투주맙; Keytruda™, Opdivo™, Gazyva™ 및 오비누투주맙. 임의적으로, 다량체의 폴리펩티드의 결합 부위는 항체의 결합 부위의 VH 및 또한 항체의 CH1(즉, N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1 및 SAM)을 포함한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL, 예를 들어, 여기서 CL은 항체의 CL임) 포함하는 추가의 폴리펩티드와 쌍을 이룰 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 아바스틴(Avastin)이다.
일 구현예에서, 항체는 악템라(Actemra)이다.
일 구현예에서, 항체는 얼비툭스(Erbitux)이다.
일 구현예에서, 항체는 루센티스(Lucentis)이다.
일 구현예에서, 항체는 사릴루맙이다.
일 구현예에서, 항체는 듀필루맙이다.
일 구현예에서, 항체는 아릴로쿠맙(alirocumab)이다.
일 구현예에서, 항체는 보코시주맙(bococizumab)이다.
일 구현예에서, 항체는 에볼로쿠맙(evolocumab)이다.
일 구현예에서, 항체는 펨브롤리주맙(pembrolizumab)이다.
일 구현예에서, 항체는 니볼루맙(nivolumab)이다.
일 구현예에서, 항체는 이필리무맙이다.
일 구현예에서, 항체는 레미카드(remicade)이다.
일 구현예에서, 항체는 골리무맙이다.
일 구현예에서, 항체는 오파투무맙이다.
일 구현예에서, 항체는 벤리스타(Benlysta)이다.
일 구현예에서, 항체는 캄파쓰(Campath)이다.
일 구현예에서, 항체는 리툭시맙이다.
일 구현예에서, 항체는 허셉틴(Herceptin)이다.
일 구현예에서, 항체는 더발루맙(durvalumab)이다.
일 구현예에서, 항체는 다라투무맙(daratumumab)이다.
일 예에서, 본원에서 임의의 결합 도메인(예를 들어, dAb 또는 scFv 또는 Fab) 또는 V1은 (단일 가변 도메인인 경우 그 자체로, 또는 V2와 쌍을 이루는 경우) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다: ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AWI; AIG1; AKAP1; AKAP2; AIYIH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1(아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRl(MDR15); BlyS; BM Pl; BMP2; BMP3B(GDFIO); BMP4; BMP6; BM P8; BMPRIA; BMPRIB; BM PR2; BPAG1(플렉틴); BRCA1; CI9orflO(IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2(D6 / JAB61); CCL1(1-309); CCL11(에오탁신); CCL13(MCP-4); CCL15(MIP-id); CCL16(HCC-4); CCL17(TARC); CCL18(PARC); CCL19(M IP-3b); CCL2(MCP-1); MCAF; CCL20(MIP-3a); CCL21(MIP-2); SLC; 엑소더스-2; CCL22(MDC / STC-1); CCL23(M PIF-1); CCL24(MPIF-2 I 에오탁신-2); CCL25(TECK); CCL26(에오탁신-3); CCL27(CTACK /ILC); CCL28; CCL3(MIP-la); CCL4(M IP-lb); CCL5(RANTES); CCL7(MCP-3); CCL8(mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1(CKR1 / HM145); CCR2(mcp-1RB / RA);CCR3(CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5(CM KBR5 / ChemR13); CCR6(CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7(CKR7 / EBI1); CCR8(CM KBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9(GPR-9-6); CCRL1(VSHK1); CCRL2(L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1(E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A(p2IWapl/Cipl); CDKN1B(p27Kipl); CDKNIC; CDKN2A(pl6INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7(클라우딘-7); CLN3; CLU(클러스테린); CMKLR1; CMKOR1(RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFl(M-CSF); CSF2(GM-CSF); CSF3(GCSF); CTLA4; CTNNBl(b-카테닌); CTSB(카텝신 B); CX3CL1(SCYDi); CX3CR1(V28); CXCL1(GROl); CXCLIO(IP-10); CXCL11(l-TAC / IP-9); CXCL12(SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2(GR02); CXCL3(GR03); CXCL5(ENA-78 I LIX); CXCL6(GCP-2); CXCL9(MIG); CXCR3(GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6(TYMSTR ISTRL33 I Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; EN01; EN02; EN03; EPHB4; EPO; ERBB2(Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3(TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1(aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2(bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3(int-2); FGF4(HST); FGF5; FGF6(HST-2); FGF7(KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF(VEGFD); FILl(엡실론); FILl(ZETA); FU12584; FU25530; FLRTl(피브로넥틴); FLTl; FOS; FOSLl(FRA-I); FY(DARC); GABRP(GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-65T; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRHl; GPR2(CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81(FKSG80); GRCCIO(CIO); GRP; GSN(겔솔린); GSTPl; HAVCR2; HDAC4; EDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; TFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; 1L13; IL13RA1; IL13RA2; 1L14; 1L15; IL15RA; IL16; 1L17; IL17B; IL17C; IL17R; 1L18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; 1L19; ILIA; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1;IL1RL2 IL1RN; 1L2; 1L20; IL20RA; IL21R; 1L22; 1L22R; 1L22RA2; 1L23; 1L24; 1L25; 1L26; 1L27; 1L28A; 1L28B; 1L29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; 1L3; 1L30; IL3RA; 1L4; IL4R; 1L5; IL5RA; 1L6; IL6R; IL6ST(당단백질 130); 1L7; TL7R; 1L8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; 1L9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; IRAK2; ITGA1; ITGA2; 1TGA3; ITGA6(a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4(b 4 인테그린); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; MTLG; KLF5(GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19(케라틴 19); KRT2A; KRTHB6(모발-특이적 유형 II 케라틴); LAMA5; LEP(렙틴); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA(TNF-b); LTB; LTB4R(GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp; MAP2K7(c-Jun); MDK; M IB1; 미드카인; M IF; M IP-2; MK167(Ki-67); MMP2; M MP9; MS4A1; MSMB; MT3(메탈로티오넥틴-ifi); MTSS 1; M UC 1(뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKB 1; NFKB2; NGFB(NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66(Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NM E1(NM23A); NOX5; NPPB; NROB1; NROB2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4(CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU(uPA); PLG; PLXDC1; PPBP(CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2(COX-2); PTN; RAC2(p2IRac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110(ZNF144); ROB02; S100A2; SCGB1D2(리포필린 B); SCGB2A1(맘마글로빈 2); SCGB2A2(맘마글로빈 1); SCYE1(내피 단핵구-활성화 사이토카인); SDF2; SERPINA1; SERPINIA3; SERPINB5(마스핀); SERPINE1(PAT-i); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPl; SPRRIB(Spri); ST6GAL1; STABl; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1(트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE(Tie-i); T]MP3; 조직 인자; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a(또한 본원에서 TNF 알파 또는 TNFα로 지칭됨); TNFAIP2(B94); TNFAIP3; TNFRSF1 1A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6(Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO(TRAIL); TNFSF1 1(TRANCE); TNFSF12(AP03L); TNFSF13(April); TNFSF13B; TNFSF14(HVEM-L); TNFSF1 5(VEGI); TNFSF1 8; TNFSF4(0X40 리간드); TNFSF5(CD40 리간드); TNFSF6(FasL); TNFSF7(CD27 리간드); TNFSF8(CD30 리간드); TNFSF9(4-lBB 리간드); TOLLIP; Toll-유사 수용체; TOP2A(토포이소머라제 lia); TP53; TPM 1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM 1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1(림포택틴); XCL2(SCM-lb); XCR1(GPR5 / CCXCR1); YY1; 및 ZFPM2.
예를 들어 본 발명의 임의의 구성에서, 다량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 제1 및 제2(예를 들어, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer의 경우); 임의적으로, 제1, 제2 및 제3(예를 들어, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer의 경우); 또는 임의적으로, 제1, 제2, 제3 및 제4(예를 들어, 십육량체 또는 20-mer의 경우); 또는 임의적으로, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5(예를 들어, 20-mer의 경우) 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합하며, 이들 각각은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: EpCAM 및 CD3; CD19 및 CD3; VEGF 및 VEGFR2; VEGF 및 EGFR; CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD20 및 CD3; CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD19 및 CD20; CD-8 및 IL-6; PDL-1 및 CTLA-4; CTLA-4 및 BTN02; CSPGs 및 RGM A; IGF1 및 IGF2; IGF1 및/또는 2 및 Erb2B; IL-12 및 IL-18; IL-12 및 TWEAK; IL-13 및 ADAM8; IL-13 및 CL25; IL-13 및 IL-l베타; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 LHR 작용제; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MIF; IL-13 및 PED2; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 TARC; IL-13 및 TGF-베타; IL-1 알파 및 IL-1 베타; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; RGM A 및 RGM B; Te38 및 TNF 알파; TNF 알파 및 IL-12; TNF 알파 및 IL-12p40; TNF 알파 및 IL-13; TNF 알파 및 IL-15; TNF 알파 및 IL-17; TNF 알파 및 IL-18; TNF 알파 및 IL-1 베타; TNF 알파 및 IL-23; TNF 알파 및 M IF; TNF 알파 및 PEG2; TNF 알파 및 PGE4; TNF 알파 및 VEGF; 및 VEGFR 및 EGFR; TNF 알파 및 RANK 리간드; TNF 알파 및 Blys; TNF 알파 및 GP130; TNF 알파 및 CD-22; 및 TNF 알파 및 CTLA-4
예를 들어, 제1 에피토프 또는 항원은 CD3; CD16; CD32; CD64; 및 CD89로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 에피토프 또는 항원은 EGFR; VEGF; IGF-1R; Her2; c-Met(일명 HGF); HER3; CEA; CD33; CD79a; CD19; PSA; EpCAM; CD66; CD30; HAS; PSMA; GD2; ANG2; IL-4; IL-13; VEGFR2; 및 VEGFR3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예에서, 본원의 임의의 결합 도메인(예를 들어, dAb 또는 scFv 또는 Fab) 또는 V1은 (단일 가변 도메인인 경우 그 자체로, 또는 V2와 쌍을 이룬 경우) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며: 인간 IL-1A, IL-1β, IL-1RN, IL-6, BLys, APRIL, 액티빈 A, TNF 알파, BMP, BMP2, BMP7, BMP9, BMP10, GDF8, GDF11, RANKL, TRAIL, VEGFA, VEGFB 또는 PGF; 임의적으로 다량체는 IL-2 또는 IL2-펩티드와 같은 사이토카인 아미노산 서열(예를 들어, TD에 대한 C-말단)을 포함하고; 다량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 인간 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 일 예에서 상기 이펙터 또는 단백질 도메인은 이러한 항원에 결합할 수 있으며; 임의적으로 다량체는 IL-2 또는 IL2-펩티드와 같은 사이토카인 아미노산 서열(예를 들어, TD에 대한 C-말단)을 포함하고; 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 인간 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
30. 측면 28에 정의된 바와 같은 P1의 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer); 또는 측면 29에 정의된 바와 같은 P2와 쌍을 이룬 P1의 다량체; 또는 복수의 상기 다량체로, 임의적으로 여기서 다량체는 측면 1 내지 24 중 임의의 한 측면에 따른 것인, 다량체.
바람직하게는 다량체는 조작된 폴리펩티드 및/또는 이펙터 도메인의 사량체다. 일 예에서, 복수의 사량체는 폴리펩티드의 단량체, 이량체 또는 삼량체와 혼합되지 않는다.
일 예에서 다량체, 예를 들어 사량체는 2 개의 상이한 pMHC에 특이적으로 결합할 수 있다.
31. 측면 27 내지 29 중 어느 한 측면의 조작된 폴리펩티드 또는 단량체를 암호화하는 핵산으로, 임의적으로 여기서 핵산은 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 벡터에 의해 포함되는 것인, 핵산.
일 예에서, 핵산은 폴리펩티드 또는 단량체의 발현을 위한 프로모터에 임의적으로 작동가능하게 연결되거나 또는 이를 포함하는 DNA이다. 또 다른 예에서 핵산은 RNA(예를 들어, mRNA)이다.
32. 측면 1 내지 24 중 어느 한 측면의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer, 조작된 폴리펩티드 또는 단량체의 세포내 및/또는 분비된 발현을 위한 측면 31의 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 숙주 세포.
33. 세포내로 발현 및/또는 분비된 다량체를 생성하기 위한 단백질 다량체의 제조 방법에서 측면 31에 따른 핵산 또는 벡터의 용도로, 여기서 상기 방법은 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 세포에서 다량체를 발현하고/하거나 이로부터 다량체를 분비하는 단계를 포함하는 것인, 용도.
34. 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 세포에서 글리코실화된 다량체를 생성하기 위한 단백질 다량체의 제조 방법에서 측면 31에 따른 핵산 또는 벡터의 용도.
본 발명의 포유동물 글리코실화는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 질환 또는 병태의 의학적 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer를 포함하거나 또는 이로 이루어진 의약품을 생산하는 데 유용하다. 따라서 본 발명은 이 목적을 위한 본 발명의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer 뿐만 아니라 이러한 사용 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명에 따른 포유동물인 하나 이상의 숙주 세포(또는 이의 세포주)에서 세포내 및/또는 분비된 발현은 이러한 의약품을 생산하는 데 유용하다. HEK293, CHO 또는 Cos 세포에서 이러한 발현이 특히 유용한 데, 이들이 의약의 생산에 통상적으로 사용되기 때문이다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer를 포함하는 세제 또는 개인 건강 관리 제품을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer를 포함하는 식료품 또는 음료를 포함한다.
일 예에서, 본 발명의 다량체, 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer, 폴리펩티드, 조성물, 혼합물, 용도 또는 방법은 산업용 또는 가정용을 위한 것이거나, 또는 이러한 용도를 위한 방법에 사용된다. 예를 들어, 농업, 오일 또는 석유 산업, 식품 또는 음료 산업, 의류 산업, 포장 산업, 전자 산업, 컴퓨터 산업, 환경 산업, 화학 산업, 항공 우주 산업, 자동차 산업, 생명공학 산업, 의료 산업, 건강 관리 산업, 치과 산업, 에너지 산업, 소비재 산업, 약제학적 산업, 광업, 청소 산업, 임업, 어업, 레저 산업, 재활용 산업, 화장품 산업, 플라스틱 산업, 펄프 또는 제지 산업, 섬유 산업, 의류 산업, 가죽 또는 스웨이드 또는 동물 가죽 산업, 담배 산업 또는 강철 산업을 위한 것이거나 이에 사용된다.
35. (i) 측면 27 내지 29 중 어느 한 측면에 따른 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 진핵생물 세포주; 및 (ii) 측면 1 내지 24 중 어느 한 측면에 정의된 바와 같은 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer를 포함하는 혼합물.
36. 측면 35에 있어서, 상기 세포주가 세포의 분비 생성물을 포함하는 배지 내에 있으며, 여기서 분비 생성물은 상기 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer를 포함하는 것인, 혼합물.
37. 의학적 용도를 위한 측면 1 내지 24 중 어느 한 측면의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
38. 다음을 생성하는 방법:
(a) TCR V 도메인 다량체로, 방법은 진핵생물 세포에서 발현된 TCR V-NHR2 TD 또는 TCR V- p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며, 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함;
(b) 항체 V 도메인 다량체로, 방법은 진핵생물 세포에서 발현된 항체 V(예를 들어, 단일 가변 도메인)-NHR2 TD 또는 V- p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며, 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함;
(c) 인크레틴 펩티드(예를 들어, GLP-1, GIP 또는 인슐린) 다량체로, 방법은 진핵생물 세포, 예컨대 HEK293T 세포에서 발현된 인크레틴 펩티드-NHR2 TD 또는 인크레틴 펩티드-p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며; 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함; 또는
(d) 펩티드 호르몬 다량체로, 방법은 진핵생물 세포, 예컨대 HEK293T 세포에서 발현된 펩티드 호르몬-NHR2 TD 또는 펩티드 호르몬- p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며; 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함.
39. 단량체 및/또는 이량체 폴리펩티드에 비해 더 높은 수율의 사량체를 생성하기 위한, 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그)의 용도.
40. 단량체 및/또는 이량체 폴리펩티드에 비해 더 높은 수율의 사량체를 생성하기 위한, 단백질 도메인 또는 펩티드의 다중 카피를 포함하는 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 조작된 폴리펩티드의 용도로, 여기서 조작된 폴리펩티드는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하고 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 상동체 또는 오솔로그)을 추가로 포함하는 것인, 용도.
41. 단량체, 이량체 또는 삼량체와 혼합되지 않은 복수의 사량체를 생성하기 위한, 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그)의 용도.
42. 단량체, 이량체 또는 삼량체와 혼합되지 않은 복수의 사량체를 생성하기 위한, 단백질 도메인 또는 펩티드의 다중 카피를 포함하는 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 조작된 폴리펩티드의 용도로, 여기서 조작된 폴리펩티드는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하고 자기-회합 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, NHR2 TD, p53 TD, p63 TD 또는 p73 TD 또는 상동체 또는 오솔로그)을 추가로 포함하는 것인, 용도.
43. 측면 39 내지 42 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 사량체의 수율이 단량체 및/또는 이량체의 수율의 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50 배인, 용도.
44. 측면 39 내지 43 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 방법으로 생성된 사량체:생성된 단량체 및/또는 이량체의 비가 적어도 90:10(예를 들어, 적어도 95:5 또는 98:2, 또는 99:1)인, 용도.
45. 측면 39 내지 44 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 각 단량체의 크기가 40, 35, 30, 25 또는 20 kDa 이하인, 용도.
46. 측면 39 내지 45 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 각 사량체의 크기가 200, 160, 155 또는 150 kDa 이하인, 용도.
47. 측면 39 내지 46 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 방법이 진핵생물 세포주로부터 사량체를 발현시키는 단계를 포함하는, 용도.
48. 다음을 포함하는 pMHC 복합체에 결합할 수 있는 다가 이종이량체성 가용성 T 세포 수용체:
(i) TCR 세포외 도메인;
(ii) 면역글로불린 불변 도메인; 및
(iii) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
49. 다음을 포함하는, 다량체성 면역글로불린:
(i) 면역글로불린 가변 도메인; 및
(ii) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
50. 다음 단계를 포함하는, 가용성 다량체성 폴리펩티드를 어셈블리하는 방법:
(a) ETO의 NHR2 도메인에 융합된 상기 다량체성 폴리펩티드의 단량체를 제공하는 단계;
(b) 상기 단량체의 다중 카피를 회합시켜, 다량체성 가용성 폴리펩티드를 수득하는 단계.
본 발명은 다음을 추가로 제공한다:
(i) 도 1에 도시된 바와 같은 단량체;
(ii) 도 1에 도시된 바와 같은 동종이량체;
(iii) 도 1에 도시된 바와 같은 동종사량체;
(iv) 도 2에 도시된 바와 같은 단량체2;
(v) 도 2에 도시된 바와 같은 동종이량체2;
(vi) 도 2에 도시된 바와 같은 동종사량체2;
(vii) 도 11a에 도시된 바와 같은 단량체;
(viii) 도 11a에 도시된 바와 같은 동종이량체;
(ix) 도 11a에 도시된 바와 같은 동종사량체;
(x) 도 12a에 도시된 바와 같은 단량체;
(xi) 도 12a에 도시된 바와 같은 동종이량체;
(xii) 도 12a에 도시된 바와 같은 동종사량체;
(xiii) 도 13a에 도시된 바와 같은 단량체2;
(xiv) 도 13a에 도시된 바와 같은 동종이량체2;
(xv) 도 13a에 도시된 바와 같은 동종사량체2; 또는
(xvi) (i) 내지 (xv) 중 임의의 하나(예를 들어, Quad 3, 4, 12, 13, 14, 15, 16 및 17 중 임의의 하나)를 포함하는 다량체성 단백질 또는 도 21에 도시된 임의의 단백질의 다량체(임의의 리더 또는 태그 제외);
(xvii) (xvi)의 복수의 다량체; 또는
(xviii) (i) 내지 (xvii) 중 임의의 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
본 발명은 또한 다음을 제공한다:
(i) 4가 또는 8가 항체 V 분자;
(ii) 4가 또는 8가 항체 Fab 분자;
(iii) 4가 또는 8가 항체 dAb 분자;
(iv) 4가 또는 8가 항체 scFv 분자;
(v) 4가 또는 8가 항체 TCR V 분자; 또는
(vi) 4가 또는 8가 항체 scFv 분자;
여기서 분자는 다음과 같다:
(a) 수용액(예를 들어, 본원에 개시된 용액 또는 세포 배양 배지)에서 가용성이고/이거나;
(b) HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음.
본 발명은 NHR2 서열이 아닌 아미노산 서열(예를 들어, 펩티드, 단백질 도메인 또는 단백질)의 N- 및/또는 C-말단에서 융합된 NHR2 또는 p53(또는 본원에 개시된 또 다른 TD)의 청구항 다량체(예를 들어, 사량체)를 제공한다. 예를 들어, 서열은 TCR(예를 들어, TCRα, TCRβ, Cα 또는 Cβ), 사이토카인(예를 들어, 인터류킨, 예를 들어, IL-2, IL-12, IL-12 및 IFN), 항체 단편(예를 들어, scFv, dAb 또는 Fab) 및 항체 도메인(예를 들어, V 또는 C 도메인, 예를 들어, VH, VL, Vκ, Vλ, CH, CH1, CH2, CH3, 힌지, Cκ 또는 Cλ 도메인)으로부터 선택된다. 임의적으로, 다량체는 다음과 같은 분자이다:
a) 수용액(예를 들어, 본원에 개시된 용액 또는 세포 배양 배지)에서 가용성이고/이거나;
b) HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음.
본 발명은 다음을 제공한다:-
(i) 세포, 예를 들어, 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물, HEK293, CHO 또는 Cos 세포로부터 폴리펩티드의 다량체의 가용성 발현을 위한 폴리펩티드의 제조를 위한 NHR2 또는 p53(또는 본원에 개시된 또 다른 TD)의 용도.
(ii) 세포, 예를 들어, 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물, HEK293, CHO 또는 Cos 세포에서 폴리펩티드의 다량체의 세포내 발현을 위한 폴리펩티드의 제조를 위한 NHR2 또는 p53(또는 본원에 개시된 또 다른 TD)의 용도.
(iii) 세포내 발현 생성물을 포함하는 세포로, 여기서 생성물은 NHR2 서열이 아닌 아미노산 서열(예를 들어, 펩티드, 단백질 도메인 또는 단백질)의 N- 및/또는 C-말단에서 융합된 NHR2 또는 p53(또는 본원에 개시된 또 다른 TD)을 포함하는 폴리펩티드의 다량체를 포함함.
(iv) 숙주 세포로부터 세포내로 및/또는 가용성으로 발현되는 다량체의 제조에서 펩티드, 단백질 도메인, 폴리펩티드 또는 단백질을 사량체화하기 위한 무차별 사량체화 도메인으로서 NHR2의 용도.
임의적으로, 아미노산은 인간 펩티드, 단백질 도메인 또는 단백질, 예를 들어, TCR(예를 들어, TCRα, TCRβ, Cα 또는 Cβ), 사이토카인(예를 들어, 인터류킨, 예를 들어, IL-2, IL-12, IL-12 및 IFN), 항체 단편(예를 들어, scFv, dAb 또는 Fab), 또는 항체 도메인(예를 들어, V 또는 C 도메인, 예를 들어, VH, VL, Vκ, Vλ, CH, CH1, CH2, CH3, 힌지, Cκ 또는 Cλ 도메인)의 아미노산 서열이다.
임의적으로, 또는 각 폴리펩티드는 Quad 1-46으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드(즉, 도 21에 도시된 바와 같지만 임의의 리더 또는 태그 서열은 제외한 폴리펩티드)를 포함한다. 임의적으로, 본 발명은 예를 들어, 의학적 또는 진단적 용도, 예를 들어, 인간 또는 동물(예를 들어, 인간)에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의학적 용도를 위한, 이러한 Quad 1-46으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드의 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체 또는 팔량체, 바람직하게는 사량체 또는 팔량체)(즉, 이러한 폴리펩티드의 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개 카피)를 제공한다.
임의적으로, 또는 각 폴리펩티드는 서열번호: 13-50으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드(임의의 리더 또는 태그 서열 제외)를 포함한다. 임의적으로, 또는 각 폴리펩티드는 서열번호: 83-115로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(임의의 리더 또는 태그 서열 제외)를 포함한다. 임의적으로, 본 발명은 예를 들어, 의학적 또는 진단적 용도, 예를 들어, 인간 또는 동물(예를 들어, 인간)에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의학적 용도를 위한, 이러한 폴리펩티드의 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체 또는 팔량체, 바람직하게는 사량체 또는 팔량체)를 제공한다.
일 예에서, TD는 서열번호: 1-9 중 임의의 하나에 의해 포함된 TD이다. 일 예에서, TD는 서열번호: 10 또는 126을 포함하는 TD이다. 일 예에서, TD는 서열번호: 124 또는 125에 의해 암호화된다. 일 예에서, 각 TD의 아미노산 서열은 서열번호: 10 또는 126이거나 또는 서열번호: 10 또는 126과 적어도 80, 85, 90, 95, 96m 97, 98 또는 99% 동일하다.
일 예에서, TD는 서열번호: 120 또는 123을 포함하는 TD이다. 일 예에서, TD는 서열번호: 116 또는 119에 의해 암호화된다. 일 예에서, 각 TD의 아미노산 서열은 서열번호: 120 또는 123이거나 또는 서열번호: 120 또는 123과 적어도 80, 85, 90, 95, 96m 97, 98 또는 99% 동일하다.
임의적으로, 조작된 폴리펩티드 또는 단량체에 의해 포함된 도메인 또는 펩티드는 서열번호: 51-82로부터 선택된 아미노산을 포함한다.
고순도 사량체
본원에 예시된 바와 같이, 본 발명은 하나의 구성에서 사량체화 도메인(TD), 예를 들어, p53 사량체화 도메인(p53 TD)을 사용하여 이량체 및 단량체와 같은 저차 구조의 생산에 비해 이펙터 도메인의 사량체를 우선적으로 생성할 수 있다는 놀라운 인식에 기초한다. 이는 CHO, HEK293 및 Cos 세포주와 같은 포유동물 발현 세포주로부터 바람직한 수율인 사량체의 분비에 특히 유용하다. 본 발명은 또한 크기가 200, 160, 155 또는 150 kDa 이하인 사량체의 생성에 특히 유용하다.
따라서, 본 발명은 다음 개념을 제공한다:-
개념
1. 단량체 및/또는 이량체 폴리펩티드에 비해 더 높은 수율의 사량체를 생성하기 위한, 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, p53 사량체화 도메인(p53 TD) 또는 NHR2 TD) 또는 이의 상동체 또는 오솔로그의 용도.
단량체 및 이량체는 각각 TD, 상동체 또는 오솔로그의 1 또는 2 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, TD, 오솔로그 또는 상동체는 인간 도메인이다.
본원에서, TD는 인간 TD 또는 상동체, 예를 들어, UniProt(www.uniprot.org)에 개시된 p53 TD 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 TD이며, 예를 들어 p53 TD는 표 13에 개시된 TD이다. 일 예에서, 상동체는 비-인간 동물 종의 p53TD, 예를 들어, 마우스, 래트, 말 고양이 또는 개 p53TD이다. 도 32를 참조하며, 이는 상이한 종의 p53 TD 사이의 높은 보존 수준을 나타내며, 인간 p53 TD에 대한 대안으로 비-인간 p53 TD의 사용을 지지한다. 일 예에서, 상동체는 비-인간 포유동물 종의 p53TD이다. 일 예에서, 상동체는 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산 변화(들)를 제외하고 인간 p53 TD와 동일하다.
일 예에서, 사량체의 수율은 단량체의 수율보다 더 높고; 일 예에서, 사량체의 수율은 이량체의 수율보다 더 높고; 일 예에서, 사량체의 수율은 삼량체의 수율보다 더 높고; 일 예에서, 사량체의 수율은 단량체 및 이량체의 수율보다 더 높고; 일 예에서, 사량체의 수율은 단량체 및 삼량체의 수율보다 더 높고; 일 예에서, 사량체의 수율은 단량체, 이량체 및 삼량체의 수율보다 더 높다.
예를 들어, TD는 p53 이소형 1의 TD이다. 일 예에서, TD는 인간 p53(예를 들어, 이소형 1)의 위치 325 내지 356(또는 319-360; 또는 321-359)과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 임의적으로, TD, 오솔로그 또는 상동체는 서열번호: 10, 126, 11 또는 12와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 예를 들어 서열은 상기 선택된 서열과 동일하다. 임의적으로, TD, 오솔로그 또는 상동체는 서열번호: 120, 121, 122 또는 123과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 예를 들어 서열은 상기 선택된 서열과 동일하다.
2. 개념 1에 있어서, 상기 동일한 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그의 제1, 제2, 제3 및 제4 카피가 사용되는, 용도.
3. 개념 1 또는 2에 있어서, 상기 TD가 NHR2, p53, p63 또는 p73 사량체화 도메인인, 용도.
예를 들어, TD는 p53 TD이다. 일 예에서, TD는 p53 TD, 예를 들어, 인간 p53 TD의 오솔로그 또는 상동체이다.
4. 개념 1 내지 3 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 사량체의 수율이 단량체 및/또는 이량체 수율의 적어도 10 배인, 용도.
임의적으로, 수율은 단량체 및/또는 이량체 수율의 적어도 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 또는 10 배이다. 임의적으로, 생성된 사량체:단량체 및/또는 이량체의 비는 적어도 90:10, 예를 들어, 적어도 95:5; 또는 96:4; 또는 97:3; 또는 98:2; 또는 99:1이다. 임의적으로 사량체만이 생성된다.
일 구현예에서, 각 단량체, 이량체 또는 사량체에 의해 포함된 각 도메인은 인간 도메인이고; 임의적으로 단량체, 이량체 또는 사량체는 비-인간 아미노산 서열 또는 링커를 포함하지 않는다.
5. 개념 1 내지 4 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 방법으로 생성된 사량체:생성된 단량체 및/또는 이량체의 비가 적어도 90:10(즉, 단량체 양의 9 배; 이량체 양의 9 배; 또는 단량체 및 이량체 조합의 양의 9 배)인, 용도.
6. 개념 4 또는 5에 있어서, 상기 수율 또는 비가 사량체 제조 방법의 생성물의 샘플을 수득하는 단계, 샘플에 단백질 분리 기술을 사용하여 사량체, 단량체 및 이량체를 분해하는 단계, 및 사량체의 양과 단량체 및 이량체의 양을 비교하는 단계에 의해 결정가능하거나 또는 결정되는, 용도.
사량체, 단량체, 이량체 및 삼량체의 양은 예를 들어, 본원에 기재된 겔, 예를 들어, 고유 겔, 즉, SDS의 부재와 같은 변성 조건 하에 있지 않은 겔의 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
7. 개념 4 또는 5에 있어서, 상기 수율 또는 비가 다음 단계에 의해 결정가능하거나 또는 결정되는, 용도:
(a) 사량체 제조 방법의 생성물의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 비-환원 조건 하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 수행하여 샘플을 상기 사량체에 상응하는 밴드 및 상기 단량체에 상응하는 밴드 및/또는 상기 이량체에 상응하는 밴드로 분해하는 단계; 및
(c) 사량체 밴드와 단량체 및/또는 이량체 밴드(들)를 비교하여, 예를 들어, 상대적 밴드 강도 및/또는 밴드 크기를 비교함으로써 상기 수율 또는 비를 결정하는 단계.
8. 개념 4 또는 5에 있어서, 상기 수율 또는 비가 다음 단계에 의해 결정가능하거나 또는 결정되는, 용도:
(d) 사량체 제조 방법의 생성물의 샘플을 수득하는 단계;
(e) 비-환원 조건 하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 수행하여 샘플을 상기 사량체에 상응하는 밴드로 분해하는 단계로, 예를 들어, 여기서 겔은 비-변성 조건 하에(예를 들어, 나트륨 도데실술페이트(SDS)의 부재 하에) 있는 것인, 단계;
(f) 상기 단량체에 상응하는 밴드가 없고/없거나 상기 이량체에 상응하는 밴드가 없음을 결정하는 단계.
9. 개념 7 또는 8에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 용도:
(g) 사량체 제조 방법의 생성물의 제2 샘플을 수득하는 단계;
(h) 환원 조건 하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 수행하여 제2 샘플을 상기 단량체에 상응하는 밴드 및/또는 상기 이량체에 상응하는 밴드로 분해하는 단계로, 예를 들어, 여기서 겔은 비-변성 조건 하에(예를 들어, 나트륨 도데실술페이트 (SDS)의 부재 하에) 있는 것인, 단계; 및
(i) 단계 (h)에 의해 생성된 겔을 단계 (b) 또는 (e)의 겔과 비교하여 단계 (b)의 겔에서 단량체 및/또는 이량체 밴드(들)의 위치 또는 이러한 겔이 단계 (e)의 겔에서 예상되는 위치를 결정하는 단계.
10. 개념 1 내지 9 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 각 단량체의 크기가 40 kDa 이하인, 용도.
예를 들어, 단량체의 크기는 35, 30, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20 kDa 이하이다.
11. 개념 1 내지 10 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 각 사량체의 크기가 150 kDa 이하인, 용도.
예를 들어, 사량체의 크기는 80, 90, 100, 110, 120, 130 또는 140 kDa 이하이다.
12. 개념 1 내지 11 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 방법이 포유동물 세포주, 예를 들어, HEK293, CHO 또는 Cos 세포주로부터 사량체를 발현시키는 단계를 포함하는, 용도.
예를 들어, 세포주는 HEK293(예를 들어, HEK293T) 세포주이다. 대안으로, 세포주는 효모(예를 들어, 사카로마이세스 또는 피키아, 예를 들어, 피 파스토리스(P pastoris)) 또는 박테리아 세포주이다.
13. 개념 1 내지 12 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 방법이 포유동물 세포주, 예를 들어, HEK293, CHO 또는 Cos 세포주로부터 사량체를 분비하는 단계를 포함하는, 용도.
따라서, 유리하게는 일 예에서, 용도 또는 사량체는 포유동물 세포주(예를 들어, HEK293, CHO 또는 Cos 세포주) 또는 진핵생물 세포주로부터 발현을 위한 것이다. 이는 본 발명의 생성물, 예를 들어, 사량체의 대규모 제조에 유용하다.
예를 들어, 세포주는 HEK293(예를 들어, HEK293T) 세포주이다. 대안으로, 세포주는 효모(예를 들어, 사카로마이세스 또는 피키아, 예를 들어, 피 파스토리스) 또는 박테리아 세포주이다.
14. 개념 1 내지 13 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 각 폴리펩티드 또는 단량체가 상기 TD, 상동체 또는 오솔로그 및 하나 이상의 단백질 이펙터 도메인, 예컨대 하나 이상의 항체 도메인, 예를 들어, 항원 결합 부위를 형성하는 하나 이상의 항체 도메인을 포함하는, 용도.
15. 개념 14에 있어서, 상기 폴리펩티드가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 용도:
(i) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단일 가변 도메인(dAb 또는 VHH 또는 Nanobody™);
(ii) 항원에 결합할 수 있는 scFv 또는 pMHC에 결합할 수 있는 scTCR;
(iii) 항원에 결합할 수 있는 Fab; 또는
(iv) TCR 가변 도메인 또는 pMHC 결합 부위.
16. 개념 1 내지 15 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 각 폴리펩티드 또는 단량체가 상기 TD, 상동체 또는 오솔로그 및 하나 이상의 인크레틴, 인슐린, GLP-1 또는 엑센딘-4 도메인을 포함하는, 용도.
17. 개념 1 내지 16 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 각 폴리펩티드 또는 단량체가 상기 TD, 상동체 또는 오솔로그; 및 제1 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 용도.
18. 개념 17에 있어서, 상기 각 결합 부위가 다음에 의해 제공되는, 용도:
(i) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단일 가변 도메인(dAb 또는 VHH 또는 Nanobody™);
(ii) 항원에 결합할 수 있는 scFv 또는 pMHC에 결합할 수 있는 scTCR;
(iii) 항원에 결합할 수 있는 Fab; 또는
(iv) TCR 가변 도메인 또는 pMHC 결합 부위.
19. 개념 18에 있어서, 상기 각 결합 부위가 항체 단일 가변 도메인에 의해 제공되는, 용도.
20. 개념 14 내지 18 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 TD, 상동체 또는 오솔로그가 상기 추가의 도메인(들)에 직접 융합되는, 용도.
21. 개념 20에 있어서, 상기 각 단량체 또는 폴리펩티드가 상기 추가의 도메인의 C-말단에 직접 또는 펩티드 링커를 통해 융합된 TD, 상동체 또는 오솔로그를 포함하는, 용도.
22. 폴리펩티드의 사량체로, 여기서 각 폴리펩티드는 다음을 포함하며:
(i) 사량체화 도메인(TD)(예를 들어, p53 TD 또는 NHR2 TD) 또는 이의 상동체 또는 오솔로그;
(ii) 하나 이상의 단백질 이펙터 도메인; 및
(iii) 임의적으로 (i)을 (ii)에 연결하는(예를 들어, (i)의 N-말단에 (ii)의 C-말단을 연결하는) 링커;
임의적으로 각 사량체의 크기는 150 또는 200 kDa 이하인, 사량체.
예를 들어, 사량체의 크기는 80, 90, 100, 110, 120, 130 또는 140 kDa 이하이다. 일 예에서, 본원에서 임의의 다량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer의 크기는 적어도 60 또는 80 kDa이며; 이는 예를 들어 다량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer가 투여된 인간 또는 동물 대상체에서 반감기를 증가시키는 데 유용할 수 있다(예를 들어, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위함). 이들 범위의 크기는 신장 여과 크기를 초과할 수 있다.
대안으로, 본 발명은 사량체 대신에 단량체, 이량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer를 제공한다.
23. 개념 22에 있어서, 상기 각 폴리펩티드가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 사량체:
(i) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단일 가변 도메인(dAb 또는 VHH 또는 Nanobody™);
(ii) 항원에 결합할 수 있는 scFv 또는 pMHC에 결합할 수 있는 scTCR;
(iii) 항원에 결합할 수 있는 Fab; 또는
(iv) TCR 가변 도메인 또는 pMHC 결합 부위.
24. 개념 22 또는 23에 있어서, 상기 각 폴리펩티드가 상기 TD, 상동체 또는 오솔로그 및 하나 이상의 인크레틴, 인슐린, GLP-1 또는 엑센딘-4 도메인을 포함하는, 사량체.
25. 개념 22 또는 23에 있어서, 상기 각 폴리펩티드가 상기 TD, 상동체 또는 오솔로그; 및 제1 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 사량체.
26. 개념 25에 있어서, 상기 각 결합 부위가 다음에 의해 제공되는, 사량체:
(i) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단일 가변 도메인(dAb 또는 VHH 또는 Nanobody™);
(ii) 항원에 결합할 수 있는 scFv 또는 pMHC에 결합할 수 있는 scTCR;
(iii) 항원에 결합할 수 있는 Fab; 또는
(iv) TCR 가변 도메인 또는 pMHC 결합 부위.
27. 개념 26에 있어서, 상기 각 결합 부위가 항체 단일 가변 도메인에 의해 제공되는, 사량체.
28. 개념 22 내지 27 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 TD, 상동체 또는 오솔로그가 상기 이펙터 도메인(들)에 직접 융합되는, 사량체.
29. 개념 22 내지 27 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 각 폴리펩티드가 상기 이펙터 도메인의 C-말단에 직접 또는 펩티드 링커를 통해 융합된 TD, 상동체 또는 오솔로그를 포함하는, 사량체.
일 구현예에서, 각 폴리펩티드는 단지 2 개(즉, 제1 및 제2만, 제3은 제외)의 이펙터 도메인 또는 단지 2 개의 dAb, VHH, scFv, scTCR, Fab 또는 항원 결합 부위를 포함한다.
30. 개념 22 내지 29 중 어느 한 개념의 사량체 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
임의적으로 조성물은 멸균 의료 용기 또는 장치, 예를 들어, 주사기, 바이알, 흡입기 또는 주사 장치에 의해 포함된다.
31. 개념 22 내지 30 중 어느 한 개념의 사량체를 포함하는 화장품, 식료품, 음료, 세정 제품, 세제.
32. 개념 1 내지 21 중 어느 한 개념에 인용된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 세포주(예를 들어, 포유동물 세포주, 예를 들어, HEK293, CHO 또는 Cos 세포주); 및 개념 22 내지 31 중 어느 한 개념에 정의된 바와 같은 사량체를 포함하는 혼합물.
임의적으로, 혼합물을 멸균 용기에 의해 포함된다.
33. 개념 32에 있어서, 상기 세포주가 세포의 분비 생성물을 포함하는 배지 내에 있으며, 여기서 분비 생성물은 상기 사량체를 포함하는 것인, 혼합물.
34. 개념 33에 있어서, 상기 분비 생성물이 개념 1 내지 31 중 어느 한 개념에 정의된 바와 같은 단량체 및/또는 이량체를 포함하지 않는, 혼합물.
35. 개념 33에 있어서, 상기 분비 생성물이 단량체 및/또는 이량체 양의 적어도 10 배의 양으로 상기 사량체를 포함하는, 혼합물.
36. 개념 33에 있어서, 상기 분비 생성물이 적어도 90:10의 사량체:단량체 및/또는 이량체의 비로 상기 사량체를 포함하는, 혼합물.
37. 단백질 이펙터 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인 또는 결합 부위)의 사량체의 수율을 향상시키는 방법으로, 상기 방법은 폴리펩티드의 세포주(예를 들어, 포유동물 세포, CHO, HEK293 또는 Cos 세포주) 사량체로부터 발현시키는 단계이며, 여기서 폴리펩티드는 개념 1 내지 36 중 어느 한 개념에 정의된 바와 같고 하나 이상의 이펙터 도메인을 포함하는 것인, 단계; 및 임의적으로 상기 발현된 사량체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
상동체, 오솔로그 또는 등가물은 다량체화 또는 사량체화 기능을 갖는다.
상동체: 공통 조상 DNA 또는 단백질 서열로부터 내려온 제2 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열에 관련된 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열. 용어 상동체는 사건에 의해 분리된 유전자 사이의 관계 또는 유전적 복제 사건에 의해 분리된 유전자 사이의 관계에 적용될 수 있다.
오솔로그: 오솔로그는 종분화에 의해 공통 조상 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열로부터 진화된 상이한 종의 유전자, 뉴클레오티드 또는 단백질 서열이다. 일반적으로, 오솔로그는 진화 과정에서 동일한 기능을 유지한다.
일 예에서, TD, 오솔로그 또는 상동체는 표 2에 나열된 단백질 1 내지 119 중 임의의 하나의 TD이다. 일 예에서, 오솔로그 또는 상동체는 표 2에 나열된 단백질 1 내지 119 중 임의의 하나의 TD의 오솔로그 또는 상동체이다. 일 구현예에서, p53 사량체화 도메인(p53-TD) 또는 이의 상동체 또는 오솔로그를 사용하는 대신에, 본 발명의 모든 측면은 본원에서 표 2에 나열된 단백질 1 내지 119 중 임의의 하나의 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그의 폴리펩티드, 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체에서 사용 또는 포함과 관련된 것으로 읽을 수 있다. TD는 NHR2(예를 들어, 인간 NHR2) TD 또는 이의 오솔로그 또는 상동체일 수 있다. TD는 p63(예를 들어, 인간 p63) TD 또는 이의 오솔로그 또는 상동체일 수 있다. TD는 p73(예를 들어, 인간 p73) TD 또는 이의 오솔로그 또는 상동체일 수 있다. 이는 다음과 같은 하나 이상의 이점을 가질 수 있다:-
- 포유동물 또는 다른 진핵생물 세포, 예를 들어, CHO, HEK293 또는 Cos와 같이 본원에 개시된 포유동물 세포로부터 사량체의 분비;
- 단량체에 비해 분비된 사량체의 향상된 수율;
- 이량체에 비해 분비된 사량체의 향상된 수율;
- 삼량체에 비해 분비된 사량체의 향상된 수율;
- 조합된 단량체 및 이량체에 비해 분비된 사량체의 향상된 수율;
- 조합된 단량체, 이량체 및 삼량체에 비해 분비된 사량체의 향상된 수율;
- 항원 결합 부위를 포함하는 사량체에서 항원 결합의 향상된 친화도 또는 결합력;
- 향상된 사량체 생산 및/또는 발현, 여기서 사량체의 크기는 200 이하 또는 160 또는 150 kDa 이하이다.
일 구현예에서, 각 폴리펩티드 또는 단량체는 다음으로부터 선택된 항체의 하나 이상의 VH, VL 또는 VH/VL 결합 부위를 포함한다: ReoPro™; 압식시맙; Rituxan™; 리툭시맙; Zenapax™; 다클리주맙; Simulect™; 바실릭시맙; Synagis™; 팔리비주맙; Remicade™; 인플릭시맙; Herceptin™; 트라스투주맙; Mylotarg™; 겜주투맙; Campath™; 알렘투주맙; Zevalin™; 이브리투모맙; Humira™; 아달리무맙; Xolair™; 오말리주맙; Bexxar™; 토시투모맙; Raptiva™; 에팔리주맙; Erbitux™; 세툭시맙; Avastin™; 베바시주맙; Tysabri™; 나탈리주맙; Actemra™; 토실리주맙; Vectibix™; 파니투무맙; Lucentis™; 라니비주맙; Soliris™; 에쿨리주맙; Cimzia™; 서톨리주맙; Simponi™; 골리무맙, Ilaris™; 카나키누맙; Stelara™; 우스테키누맙; Arzerra™; 오파투무맙; Prolia™; 데노수맙; Numax™; 모타비주맙; ABThrax™; 락시바쿠맙; Benlysta™; 벨리무맙; Yervoy™; 이필리무맙; Adcetris™; 브렌툭시맙; Vedotin™; Perjeta™; 퍼투주맙; Kadcyla™; 아도-트라스투주맙; Gazyva™ 및 오비누투주맙. 대안으로, (예를 들어, 인간에서 암을 치료 또는 예방하기 위해) 각 폴리펩티드 또는 단량체는 이필리무맙(또는 YERVOY™), 트레멜리무맙(tremelimumab), 니볼루맙(또는 OPDIVO™), 펨브롤리주맙(또는 KEYTRUDA™), 피딜리주맙(pidilizumab), BMS-936559, 더발루맙 및 아테졸리주맙(atezolizumab)으로부터 선택된 항체의 하나 이상의 VH, VL 또는 VH/VL 결합 부위를 포함한다. 임의적으로, 다량체의 폴리펩티드의 결합 부위는 항체의 결합 부위의 VH 및 또한 항체의 CH1(즉, N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1 및 SAM)을 포함한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL, 예를 들어, 여기서 CL은 항체의 CL임) 포함하는 추가의 폴리펩티드와 쌍을 이룰 수 있다.
일 예에서, 사량체는 이필리무맙(또는 YERVOYTM), 트레멜리무맙, 니볼루맙(또는 OPDIVOTM), 펨브롤리주맙(또는 KEYTRUDATM), 피딜리주맙, BMS-936559, 더발루맙 및 아테졸리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 항체의 항원 결합 부위의 4 개의 카피 및 임의적으로 상기 군으로부터 선택된 제2 항체의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항체는 상이하다. 예를 들어, 제1 항체는 이필리무맙(또는 YERVOYTM)이고 임의적으로 제2 항체는 니볼루맙(또는 OPDIVOTM) 또는 펨브롤리주맙(또는 KEYTRUDATM)이다. 이는 인간에서 암을 치료 또는 예방하는 데 유용하다.
일 예에서, 사량체는 아바스틴의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 Humira의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 얼비툭스의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 Actemra™ 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 사릴루맙의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 듀필루맙의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 아릴로쿠맙 또는 에볼로쿠맙의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다 일 예에서, 사량체는 레미카드의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 루센티스의 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 Eylea™ 항원 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다. 이러한 사량체는 암을 치료 또는 예방하기 위해 인간에게 투여하기에 유용하다. 이러한 사량체는 안구 병태(예를 들어, 습성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증, 예를 들어, 결합 부위가 아바스틴, 루센티스 또는 아일리아 부위인 경우)를 치료 또는 예방하기 위해 인간에게 투여하기에 유용하다. 이러한 사량체는 혈관형성을 치료 또는 예방하기 위해 인간에게 투여하기에 유용하다.
일 예에서, 사량체는 인슐린의 4 개 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 GLP-1의 4 개 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 GIP의 4 개 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 엑센딘-4의 4 개 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 인슐린의 4 개 카피 및 GLP-1의 4 개 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 인슐린의 4 개 카피 및 GIP의 4 개 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 인슐린의 4 개 카피 및 엑센딘-4의 4 개 카피를 포함한다. 일 예에서, 사량체는 GLP-1의 4 개 카피 및 엑센딘-4의 4 개 카피를 포함한다. 이러한 사량체는 당뇨병(예를 들어, II형 당뇨병) 또는 비만을 치료 또는 예방하기 위해 인간에게 투여하기에 유용하다.
예시적 항원
폴리펩티드, 다량체는 하나 이상의 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 본원에서 본원의 결합 부위(예를 들어, dAb 또는 scFv 결합 부위) 각각은 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 일 예에서, 본원의 (또는 각각의) 항원은 다음 목록으로부터 선택된다. 일 예에서, 본원의 (또는 각각의) 에피토프는 다음 목록으로부터 선택된 항원의 에피토프이다.
액티빈 유형-II 수용체; 액티빈 유형-IIB 수용체; ADAM11; ADAM12; ADAM15; ADAM17; ADAM18; ADAM19; ADAM1A; ADAM1B; ADAM2; ADAM20; ADAM21; ADAM22; ADAM23; ADAM24P; ADAM28; ADAM29; ADAM30; ADAM32; ADAM33; ADAM3A; ADAM3B; ADAM5; ADAM6; ADAM7; ADAM8; ADAM9; ADORA2A; AKT; ALK; 알파-4 인테그린; 알파 시누클레인; 탄저균 보호 항원; BACE1; BCMA; 베타 아밀로이드; BRAF; BTLA; BTNL2; CCR4; CCR5; CD126; CD151; CD16; CD160; CD19; CD20; CD22; CD226; CD244; CD27; CD274(PDL1); CD276; CD28; CD3; CD30; CD300A; CD300C; CD300E; CD300LB; CD300LF; CD33; CD38; CD3; CD3 엡실론; CD3 델타; CD3 감마; CD40; CD40L; CD47; CD48; CD5; CD52; CD59; CD6; CD70; CD72; CD73; CD80; CD81; CD84; CD86; CD96; CDK4/6; CEA; CEACAM1; CEACAM3; CGRP 수용체; CLEC12A; CLEC1B; CLEC4A; CLEC5A; CLEC7A; 클로스트리듐 디피실 독소; cMET; 보체 C5 인자; 보체 인자 D; CSF1R; CSF2RA; CTAG1B; CTLA4; CXCL12; CXCR2; CXCR4; DR4; DR5; EDA; EDA2R; EGFR; EGFRvIII; EMR1; ENTPD1; EpCAM; 인자 IX; 인자 X; 인자 VII; FAP; FAS; FCAR; FCER1G; FCER2; TFR2; 4-1BB; FCGR2A; FCGR2B; FCGR3A; FCGR3B; FCRL1; FCRL3; FCRL4; FCRL6; FGRF1/2/3; FLT3; GAL; GEM; GITR; GITRL; GM-CSF; GM-CSF 수용체; GP IIb IIIa; gpNMB; TIM3; HDAC1; HER-2; HER3; HFE; HHLA2; 히스톤 H1 조절인자; HLA-C; HLA-G; HMGB1; HMMR; HVEM; ICAM-1; ICOS; ICOSL; IDO1; IFNG; IL-1 베타; IL-12; IL-13; IL-2; IL-22R; IL-23; IL-23a; IL-24; IL-2R; IL-34; IL-8; IL10; IL11; IL13; IL17A; IL17D; IL22; IL2RA; IL36G; IL4; IL4a; IL5; IL6; 면역글로불린 E; 면역글로불린 E; 면역글로불린 G; INHBA; INHBB; 인터페론 유형 I 수용체; INF-a-2a/2b; INF-b-1a/1b; ITGA2B; ITGB3; KIR; KIR2DL1; KIR2DL2; KIR2DL3; KIR2DL4; KIR2DL5A; KIR3DL1; KIR3DL3; KIR3DS1; KIT; KLRC1; KLRC2; KLRF1; KLRG1; KLRK1; KRAS; LAG3; LAIR1; LAIR2; LFA-1; LIGHT; LILRA1; LILRA2; LILRA3; LILRA4; LILRA5; LILRA6; LILRB1; LILRB2; LILRB3; LILRB4; LILRB5;LILRP1; LILRP2; LTA; LTBR; LY9; MadCam; MAGE-C1; MAGE-C2; MARCO; MEK-1/2; MIA3; MIC; MICA; MICB; MMP9; MS4A1; MS4A2; mTOR; MUC1; 뮤신-1; Nav1.7; Nav1.8; NCR1; NCR2; NCR3; NGF; NGFR; NT5E; NY-ESO-1; OX40; OX40L; p53; PARP; PCSK9; PD-1; PDCD1LG2; PDCD6; PDGF 수용체 알파; PECAM1; PI3K 델타; PILRA; PPP1R1B; PSMA; PTPN6; PVR; PVRL2; PVRL3; RANKL; 호흡기 세포융합 바이러스 단백질; SIGLEC10; SIGLEC12; SIGLEC15; SIGLEC5; SIGLEC6; SIGLEC7; SIGLEC9; SIRPA; SIRPB1; SLAMF1; SLAMF6; SLAMF7; SLAMF8; SNCA; SOD1; STAT3; STING; 서비빈; TARM1; Tau; TDP43; TfR1; TGF-b; TGM2; TIGIT; TIM-3; TLR-4; TLR03; TMEM30a; TMIGD2; TNFa; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF10C; TNFRSF10D; TNFRSF11A; TNFRSF11B; TNFRSF12A; TNFRSF13B; TNFRSF13C; TNFRSF14; TNFRSF17; TNFRSF18; TNFRSF19; TNFRSF21; TNFRSF4; TNFRSF6B; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10; TNFSF11; TNFSF12; TNFSF13; TNFSF13B; TNFSF14; TNFSF15; TNFSF18; TNFSF4; TNFSF8; TNFSF9; 막횡단 당단백질 NMB 조절인자; TREML1; TREML2; TSLP; VEGF; VEGF-2R; VEGF1; VEGFA; VEGFL; VEGFR; 바이러스 외피 당단백질; 바이러스 단백질 헤마글루티닌; VISTA; VSIG4; VSTM1; VTCN1; 및 WEE-1. 일 예에서, 본원의 항원은 PCSK9, 예를 들어, 인간 PCSK9이며; 임의적으로 다량체는 항-PCSK9 결합 부위(예를 들어, dAb)의 4, 8, 12 또는 16 개 카피를 갖는다.
예시적 항원은 뱀독 독소와 같은 독소이며, 예를 들어, 여기서 본 발명의 다량체는 인간 또는 동물 대상체에게 (예컨대 전신으로 또는 IV 주사에 의해) 투여되고 항원 결합 부위는 대상체의 독소에 특이적으로 결합하는 다량체에 의해 포함된다. 바람직하게는, 다량체의 각 결합 부위 또는 도메인은 dAb(예를 들어, Nanobody™)이다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 PLoS One. 2013 Jul 22;8(7):e69495. doi: 10.1371/journal.pone.0069495; "In vivo neutralization of α-cobratoxin with high-affinity llama single-domain antibodies (VHHs) and a VHH-Fc antibody", Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C33 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C15 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C7 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C13 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C19 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C34 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C31 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C20 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C2 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C29 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C42 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 다량체의 각 뱀독 독소 항원 결합 부위는 Richard 등의 도 4에 개시된 바와 같은 C43 단일 도메인 VH이며, 상기 도 4에 개시된 바와 같은 이의 아미노산은 결합 부위 또는 도메인 또는 dAb 또는 나노바디 또는 VHH 또는 VH로서 본 발명에서 가능한 사용을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 뱀독 독소의 예는 3FTx, 덴드로톡신 또는 PLA2 독소이다. 임의적으로, 독소는 예를 들어, 코브라로부터의 알파-신경독이다.
독소의 또 다른 예는 혈액 독소이며, 예를 들어, 여기서 본 발명의 다량체는 인간 또는 동물 대상체에게 (예컨대 전신으로 또는 IV 주사에 의해) 투여되고 항원 결합 부위는 대상체의 혈액내 독소에 특이적으로 결합하는 다량체에 의해 포함된다. 이들 예는 독소를 격리하거나 또는 대상체에 대한 독소의 독성 효과를 감소시키거나 또는 독소의 배설 또는 대사를 촉진하는 데 유용하다.
일 예에서, 항원은 각각이 캡시드 단백질 또는 탄수화물(예를 들어, 당)인 바이러스 항원이다. 일 예에서, 본 발명의 다량체는 바이러스 또는 바이러스 항원, 예를 들어, 표 19로부터 선택된 바이러스에 결합하며 여기서 바이러스는 다량체에 의해 결합된 표면 항원을 포함하거나; 또는 본 발명의 다량체는 예를 들어, 표 20에 개시된 항원으로부터 선택된 세포 또는 바이러스 항원에 결합한다. 바이러스에 대한 결합은 예를 들어, 숙주 세포에 바이러스의 부착 또는 바이러스에 의한 세포의 감염을 줄이거나 또는 억제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 인간 또는 동물 또는 식물 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 바이러스 또는 세포 감염을 치료 또는 예방(예를 들어, 위험 감소)하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 바이러스의 표면 항원에 결합하는 본 발명의 다량체를 대상체에게 투여하여, 바이러스가 숙주 세포에 부착하는 것을 억제하고/하거나; 바이러스에 의해 숙주 세포의 감염을 억제하고/하거나 대상체에서 바이러스를 격리하는 단계(예를 들어, 대상체의 전신 순환 또는 조직으로부터 클리어런스를 위해 결합된 바이러스를 표시하기 위함)를 포함한다. 대안으로, 예를 들어, 본 발명은 인간 또는 동물 또는 식물 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 박테리아 또는 고세균 감염을 치료 또는 예방(예를 들어, 위험 감소)하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포의 표면 항원에 결합하는 본 발명의 다량체를 대상체에게 투여하여, 세포에 의한 대상체의 감염을 억제하고/하거나 대상체에서 세포를 격리하는 단계(예를 들어, 대상체의 전신 순환 또는 조직으로부터 클리어런스를 위해 결합된 세포를 표시하기 위함)를 포함한다. 대안으로, 예를 들어, 본 발명은 인간 또는 동물 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 암을 치료 또는 예방(예를 들어, 위험 감소)하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 종양 세포의 표면 항원에 결합하는 본 발명의 다량체를 대상체에게 투여하여, 대상체에서 세포를 격리하거나(예를 들어, 대상체의 전신 순환 또는 조직으로부터 클리어런스를 위해 결합된 세포를 표시하기 위함) 또는 대상체에게 투여된 면역계 또는 또 다른 요법(예를 들어, 면역 체크포인트 요법 또는 CAR-T 요법)에 의해 표적화하기 위한 세포를 표시하는 단계를 포함한다.
일 예에서, 항원은 CXCR2, CXCR4, GM-CSF, ICAM-1, IFN-g, IL-1, IL-10, IL-12, IL-1R1, IL-1R2, IL-1Ra, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, MIF, TGF-β, TNF-α, TNFR1, TNFR2 및 VCAM-1로부터 선택된다. 이들 항원 중 하나 이상의 표적화는 대상체에서 패혈증을 치료 또는 예방하는 데 유용할 수 있다. 따라서, 일 예에서 본 발명의 다량체는 하나 이상의 항원 결합 부위(예를 들어, dAb에 의해 제공된 각각의 것)를 포함하며, 여기서 다량체는 인간 또는 동물 대상체에서 패혈증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 다량체는 (예를 들어, 전신으로 또는 정맥내로) 대상체에게 투여된다. 임의적으로, 다량체는 항원 결합에 대해 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적이다. 예를 들어, 다량체는 CXCR2, CXCR4, GM-CSF, ICAM-1, IFN-g, IL-1, IL-10, IL-12, IL-1R1, IL-1R2, IL-1Ra, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, MIF, TGF-β, TNF-α, TNFR1, TNFR2 및 VCAM-1로부터 선택된 항원에 대해 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적이다. 또한 이러한 다량체 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 또한 인간 또는 동물 대상체에서 패혈증을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다량체를 예를 들어, 전신으로 또는 정맥내로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
질환 및 병태
본 발명의 폴리펩티드 단량체 또는 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 팔량체)는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 인간 또는 동물 대상체에게 투여하는 방법에 사용될 수 있다.
임의적으로, 질환 또는 병태는 다음으로부터 선택된다:
(a) 신경변성 질환 또는 병태;
(b) 뇌 질환 또는 병태;
(c) CNS 질환 또는 병태;
(d) 기억 상실 또는 손상;
(e) 심장 또는 심혈관 질환 또는 병태, 예를 들어, 심장 마비, 뇌졸중 또는 심박 세동;
(f) 간 질환 또는 병태;
(g) 신장 질환 또는 병태, 예를 들어, 만성 신장 질환(CKD);
(h) 췌장 질환 또는 병태;
(i) 폐 질환 또는 병태, 예를 들어, 낭포성 섬유증 또는 COPD;
(j) 위장관 질환 또는 병태;
(k) 인후 또는 구강 질환 또는 병태;
(l) 안구 질환 또는 병태;
(m) 생식기 질환 또는 병태, 예를 들어, 질, 음순, 음경 또는 음낭 질환 또는 병태;
(n) 성매개 질환 또는 병태, 예를 들어, 임질, HIV 감염, 매독 또는 클라미디아 감염;
(o) 귀 질환 또는 병태;
(p) 피부 질환 또는 병태;
(q) 심장 질환 또는 병태;
(r) 코 질환 또는 병태
(s) 혈액학적 질환 또는 병태, 예를 들어, 빈혈, 예를 들어, 만성 질환 또는 암의 빈혈;
(t) 바이러스 감염;
(u) 병원성 박테리아 감염;
(v) 암;
(w) 자가면역 질환 또는 병태, 예를 들어, SLE;
(x) 염증 질환 또는 병태, 예를 들어, 류마티스 관절염, 건선, 습진, 천식, 궤양성 대장염, 대장염, 크론병 또는 IBD;
(y) 자폐증;
(z) ADHD;
(aa) 양극성 장애;
(bb) ALS [근위축성 측색 경화증];
(cc) 골관절염;
(dd) 선천적 또는 발달적 결함 또는 상태;
(ee) 유산;
(ff) 혈액 응고 상태;
(gg) 기관지염;
(hh) 건성 또는 습성 AMD;
(ii) 신혈관 형성(예를 들어, 종양 또는 눈);
(jj) 감기;
(kk) 간질;
(ll) 섬유증, 예를 들어, 간 또는 폐 섬유증;
(mm) 균성 질환 또는 병태, 예를 들어, 구강칸디다증;
(nn) 대사성 질환 또는 병태, 예를 들어, 비만, 거식증, 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병.
(oo) 궤양(들), 예를 들어, 위 궤양화 또는 피부 궤양화;
(pp) 건성 피부;
(qq) 쇼그렌 증후군;
(rr) 사이토카인 폭풍;
(ss) 난청, 청력 상실 또는 손상;
(tt) 느리거나 빠른 대사(즉, 대상체의 체중, 성별 및 연령에 대한 평균보다 더 느리거나 더 빠름);
(uu) 임신 장애, 예를 들어, 불임 또는 저출산;
(vv) 황달;
(ww) 피부 발진;
(xx) 가와사키병;
(yy) 라임병;
(zz) 알레르기, 예를 들어, 견과류, 풀, 꽃가루, 집먼지 진드기, 고양이 또는 개 털 또는 비듬 알레르기;
(aaa) 말라리아, 장티푸스, 결핵 또는 콜레라;
(bbb) 우울증;
(ccc) 정신 지체;
(ddd) 소두증;
(eee) 영양실조;
(fff) 결막염;
(ggg) 폐렴;
(hhh) 폐색전;
(iii) 폐동맥 고혈압;
(jjj) 골 질환;
(kkk) 패혈증 또는 패혈성 쇼크;
(lll) 축농증;
(mmm) 스트레스(예를 들어, 직업적 스트레스);
(nnn) 지중해빈혈, 빈혈, 폰 빌레브란트병, 또는 혈우병;
(ooo) 대상포진 또는 입술 포진;
(ppp) 월경;
(qqq) 적은 정자 수.
치료 또는 예방을 위한 신경변성 또는 CNS 질환 또는 병태
일 예에서, 신경변성 또는 CNS 질환 또는 병태는 알츠하이머병 , 노년기 정신병, 다운 증후군, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병, 당뇨병성 신경병증, 파킨슨 증후군, 헌팅턴병, 마카도-조셉병, 근위축성 측색 경화증, 당뇨병성 신경병증, 및 크로이츠펠트 크로이츠펠트- 야콥병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 질환은 알츠하이머병이다. 예를 들어, 질환은 파킨슨 증후군이다.
본 발명의 방법이 CNS 또는 신경변성 질환 또는 병태를 치료하기 위해 인간 또는 동물 대상체에서 실시되는 예에서, 방법은 대상체에서 Treg 세포의 하향조절을 유발하여, 맥락막망을 걸쳐 대상체의 뇌로 전신 단핵구-유래 대식세포 및/또는 Treg 세포의 진입을 촉진하여, 질환 또는 병태(예를 들어, 알츠하이머병)가 치료되거나, 예방되거나 또는 이의 진행이 감소된다. 일 구현예에서 방법은 대상체의 CNS 시스템(예를 들어, 뇌 및/또는 CSF)에서 IFN-감마의 증가를 유발한다. 일 예에서, 방법은 신경 섬유를 회복시키고//시키거나 신경 섬유 손상의 진행을 감소시킨다. 일 예에서, 방법은 신경 미엘린을 회복시키고//시키거나 신경 미엘린 손상의 진행을 감소시킨다. 일 예에서, 본 발명의 방법은 WO2015136541에 개시된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하고/하거나 방법은 WO2015136541에 개시된 임의의 방법으로 사용될 수 있다(본 서류의 개시내용은 예를 들어, CNS 및 신경변성 질환 및 병태의 치료 및/또는 예방을 실행하기 위해 대상체에게 투여될 수 있는 이러한 방법, 질환, 병태 및 잠재적 치료제, 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제와 같은 제제, 예를 들어, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-TIM3 또는 본원에 개시된 다른 항체의 개시내용 제공하기 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
치료 또는 예방을 위한 암
치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않은 종양, 또는 실질적으로 혈관화되지 않은 종양, 뿐만 아니라 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양(예컨대 혈액학적 종양, 예를 들어, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 또는 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명으로 치료될 암의 유형은 암종, 모세포종, 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성종양 예를 들어, 육종, 암종, 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적(또는 혈행성) 암의 예는 급성 백혈병(예컨대 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수모세포, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병(예컨대 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 다혈구증, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종(무통성 및 고등급 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄병, 근위축소 증후군, 모발 세포 백혈병 및 골수이형성을 포함한 백혈병을 포함한다.
고형 종양은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 그들을 형성하는 세포의 유형을 따서 명명된다(예컨대 육종, 암종, 및 림프종). 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 악성 림프종, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선암종, 갑상선 수질 암종, 갑상선 유두 암종, 크롬 친화성 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모막암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양(예컨대 신경교종(예컨대 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교아모세포종(교아모세포종 다형성으로도 알려짐) 성상세포종, CNS 림프종, 배세포종, 수모세포종, 슈반세포종 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종 및 뇌 전이)을 포함한다.
치료 또는 예방을 위한 자가면역 질환
ㆍ 급성 파종성 뇌척수염(ADEM)
ㆍ 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염
ㆍ 애디슨병
ㆍ 감마글로불린혈증
ㆍ 원형 탈모증
ㆍ 아밀로이드증
ㆍ 강직성 척추염
ㆍ 항-GBM/항-TBM 신염
ㆍ 항인지질 증후군(APS)
ㆍ 자가면역 혈관부종
ㆍ 자가면역 재생불량성 빈혈
ㆍ 자가면역 자율신경이상증
ㆍ 자가면역 간염
ㆍ 자가면역 고지혈증
ㆍ 자가면역 면역결핍증
ㆍ 자가면역 내이 질환(AIED)
ㆍ 자가면역 심근염
ㆍ 자가면역 난소염
ㆍ 자가면역 췌장염
ㆍ 자가면역 망막증
ㆍ 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP)
ㆍ 자가면역 갑상선 질환
ㆍ 자가면역 두드러기
ㆍ 축삭 및 뉴런 신경병증
ㆍ 발로병
ㆍ 베체트병
ㆍ 수포성 유사천포창
ㆍ 심근증
ㆍ 캐슬맨병
ㆍ 셀리악병
ㆍ 샤가스병
ㆍ 만성 피로 증후군
ㆍ 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(CIDP)
ㆍ 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO)
ㆍ 처그-스트라우스 증후군
ㆍ 흉터 유사천포창/양성 점막 유사천포창
ㆍ 크론병
ㆍ 코간 증후군
ㆍ 저온 응집병
ㆍ 선천적 심장 차단
ㆍ 콕사키 심근염
ㆍ CREST병
ㆍ 본태성 혼합 한냉글로불린혈증
ㆍ 탈수초성 신경병증
ㆍ 포진상 피부염
ㆍ 피부근염
ㆍ 데빅병(시신경 척수염)
ㆍ 원판상 낭창
ㆍ 드레슬러 증후군
ㆍ 자궁내막증
ㆍ 호산구성 식도염
ㆍ 호산구성 근막염
ㆍ 결절성 홍반
ㆍ 실험적 알레르기성 뇌척수염
ㆍ 에반스 증후군
ㆍ 섬유근육통
ㆍ 섬유성 폐포염
ㆍ 거대 세포 동맥염(측두 동맥염)
ㆍ 거대 세포 심근염
ㆍ 사구체신염
ㆍ 굿파스처 증후군
ㆍ 육아종 다발혈관염(GPA)(이전에 베게너 육아종이라고 명명됨)
ㆍ 그레이브스병
ㆍ 길랭-바레 증후군
ㆍ 하시모토 뇌염
ㆍ 하시모토 갑상선염
ㆍ 용혈성 빈혈
ㆍ 헤노흐-쇤라이 자반병
ㆍ 임신성 포진
ㆍ 저감마글로불린혈증
ㆍ 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP)
ㆍ IgA 신장병증
ㆍ IgG4-관련 경화성 질환
ㆍ 면역조절 지단백질
ㆍ 봉입체 근염
ㆍ 간질성 방광염
ㆍ 소아 관절염
ㆍ 소아 당뇨병(1형 당뇨병)
ㆍ 소아 근염
ㆍ 가와사키 증후군
ㆍ 람베르트-이튼 증후군
ㆍ 백혈구파쇄성 맥관염
ㆍ 편평 태선
ㆍ 경화성 태선
ㆍ 목질 결막염
ㆍ 선형 IgA 질환(LAD)
ㆍ 낭창(SLE)
ㆍ 만성 라임병
ㆍ 메니에르병
ㆍ 현미경 다발혈관염
ㆍ 혼합 결합 조직 질환(MCTD)
ㆍ 무렌 궤양
ㆍ 무하-하버만병
ㆍ 다발성 경화증
ㆍ 중증 근무력증
ㆍ 근염
ㆍ 기면증
ㆍ 시신경 척수염(데빅)
ㆍ 호중구감소증
ㆍ 안구 흉터 유사천포창
ㆍ 시신경염
ㆍ 회문형 류머티즘
ㆍ PANDAS(연쇄상구균(Streptococcus)과 연관된 소아기 자가면역성 신경정신과적 장애)
ㆍ 방종양성 소뇌 변성
ㆍ 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH)
ㆍ 안면편측 위축증
ㆍ 파소나지-터저 증후군
ㆍ 평면부염(말초 포도막염)
ㆍ 천포창
ㆍ 말초 신경병증
ㆍ 정맥주위성 뇌척수막염
ㆍ 악성 빈혈
ㆍ POEMS 증후군
ㆍ 결절성 다발성 동맥염
ㆍ 유형 I, II, 및 III 자가면역 다선성 증후군
ㆍ 류마티스성 다발근통
ㆍ 다발근염
ㆍ 심근경색후 증후군
ㆍ 심막절개후 증후군
ㆍ 프로게스테론 피부염
ㆍ 원발성 담즙 간경화증
ㆍ 원발성 경화성 담관염
ㆍ 건선
ㆍ 건선성 관절염
ㆍ 특발성 폐 섬유증
ㆍ 괴저성 농피증
ㆍ 순수 적혈구 형성부전증
ㆍ 레이노 현상
ㆍ 반응성 관절염
ㆍ 반사 교감신경 이상증
ㆍ 라이터 증후군
ㆍ 재발성 다발연골염
ㆍ 하지 불안 증후군
ㆍ 후복막 섬유증
ㆍ 류마티스성 열
ㆍ 류마티스 관절염
ㆍ 유육종증
ㆍ 슈미트 증후군
ㆍ 공막염
ㆍ 경피증
ㆍ 쇼그렌 증후군
ㆍ 정자 및 고환 자가면역
ㆍ 강직 인간 증후군
ㆍ 아급성 세균성 심내막염(SBE)
ㆍ 스삭 증후군
ㆍ 교감성 안염
ㆍ 타카야 수동맥염
ㆍ 측두 동맥염/거대 세포 동맥염
ㆍ 혈소판감소성 자반병(TTP)
ㆍ 톨로사-헌트 증후군
ㆍ 횡단성 척수염
ㆍ 1형 당뇨병
ㆍ 궤양성 대장염
ㆍ 미분화 결합 조직 질환(UCTD)
ㆍ 포도막염
ㆍ 맥관염
ㆍ 대소수포성 피부병
ㆍ 백반증
ㆍ 베게너 육아종(지금은 육아종 다발혈관염(GPA)이라고 명명됨.
치료 또는 예방을 위한 염증 질환
ㆍ 알츠하이머
ㆍ 강직성 척추염
ㆍ 관절염(골관절염, 류마티스 관절염(RA), 건선성 관절염)
ㆍ 천식
ㆍ 아테롬성동맥경화증
ㆍ 크론병
ㆍ 대장염
ㆍ 피부염
ㆍ 게실염
ㆍ 섬유근육통
ㆍ 간염
ㆍ 과민성 대장 증후군(IBS)
ㆍ 전신 홍반성 낭창(SLE)
ㆍ 신염
ㆍ 파킨슨병
ㆍ 궤양성 대장염.
다가 가용성 TCR
본 구성은 다가 가용성 TCR 단백질에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 4가 및 8가 가용성 TCR 유사체에 관한 것이다. 본 발명의 TCR 단백질은 단량체로부터 자기-어셈블리할 수 있고 전적으로 인간 기원이다. 단백질은 ETO NHR2 다량체화 도메인을 포함하는 다량체이다. 본 발명은 또한 다량체성 가용성 TCR을 구축하는 방법, 및 이러한 단백질을 사용하는 방법에 관한 것이다.
치료 분자로서 대안적인 가용성 TCR 형식을 이용하려는 시도는 과다한 항체 형식과 비교하여 훨씬 뒤쳐져 있다. 이는 일단 세포외 TCR α/β 쇄가 막횡단 및 세포질 도메인으로부터 해리되면 용해도의 본질적인 문제를 갖는 이종이량체성 막횡단 단백질인 TCR에 주로 기인한다. 둘째로 표적 부위에서 동족 리간드에 대한 이들 분자의 본질적인 낮은 친화도 및 결합력은 치료 분자로서 발달을 큰 정도로 방해하였다.
이러한 결점을 극복하기 위해, 본 발명의 본 구성은 다가이고 가용성인 TCR 단백질을 제공한다. 다중원자가는 동족 pMHC에 대한 TCR의 결합력을 증가시키며, 용해도는 TCR이 막횡단 환경의 외부에서 사용되게 한다. 따라서, 제1 측면에서는 다음을 포함하는 pMHC 복합체에 결합할 수 있는 다가 이종이량체성 가용성 T 세포 수용체가 제공된다:
(i) TCR 세포외 도메인;
(ii) (ii) 면역글로불린 불변 도메인; 및
(iii) (iii) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
Ig 불변 도메인의 사용은 안정성 및 용해도를 갖는 TCR 세포외 도메인을 제공하며; NHR2 도메인을 통한 다량체화는 다중원자가 및 증가된 결합력을 제공한다. 유리하게는, 모든 도메인은 인간 기원이거나 또는 인간 단백질 서열에 부합한다.
TCR을 안정화하고 가용성을 만들기 위해 Ig 불변 도메인을 사용하면 비-고유 디술피드 결합의 사용을 피한다. 따라서, 유리하게는, 본 발명의 TCR은 비-고유 디술피드 결합을 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 상기 복합체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 각 경쇄는 TCR Vα 도메인 및 면역글로불린 Cα 도메인을 포함하고, 각 중쇄는 TCR Vβ 도메인 및 면역글로불린 CH1 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 각 경쇄는 추가적으로 TCR Cα 도메인을 포함하고, 각 중쇄는 추가적으로 TCR Cβ 도메인을 포함한다.
구현예에서, TCR 및 면역글로불린 도메인은 가요성 링커에 의해 분리될 수 있다.
NHR2 다량체화 도메인은 유리하게는 면역글로불린 도메인의 C-말단에 부착된다. 따라서, 중쇄 및 경쇄의 각 이량체는 하나의 다량체화 도메인에 부착되어, 중쇄-경쇄 이량체가 다가 올리고머로 회합되게 할 것이다.
구현예에서, 다량체화 도메인 및 면역글로불린 도메인은 가요성 링커에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 이는 다량체화 도메인이 면역글로불린 도메인(들)의 방해 없이 다량체화되도록 한다.
구현예에서, TCR 단백질은 면역글로불린 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 중쇄-경쇄 이량체의 이량체화를 허용하며; 이는 TCR 단백질의 추가의 다량체화를 허용한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사량체를 형성하는 다량체화 도메인은 면역글로불린 힌지 도메인을 사용하여 폴리펩티드 팔량체까지의 다량체를 형성할 수 있다. 유사하게, 이량체화 다량체화 도메인은 힌지 도메인의 존재 하에 사량체를 형성할 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 TCR 단백질은 4가이다.
구현예에서, 본 발명의 TCR 단백질은 8가이다
본 발명은 인간의 ETO 패밀리 단백질에서 발견된 신경 상동성 영역 2(NHR2) 도메인을 사용하여 4가 이종이량체성 형식으로 안정하게 어셈블리된 가용성 TCR을 제공한다(Liu et al. 2006). NHR2 도메인은 동종사량체를 형성하기 위해 자연적으로 발견되며, 이는 2 개의 NHR2 동종이량체 쌍으로부터 형성된다. 세포외 TCRα 또는 TCRβ 쇄에 작동가능하게 연결된 NHR2는 우선적으로 단량체 이어서 동종이량체로부터 순차적으로 자기-어셈블리된 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자를 형성할 것이다(도 1).
팔량체로 어셈블리하는 TCR 단백질은 면역글로불린 힌지 도메인을 이용함으로써, NHR2 도메인을 사용하여 생성될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명의 TCR 단백질은 생물학적으로 활성 폴리펩티드/이펙터 분자에 결합될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 예는 사이토카인과 같은 면역학적으로 활성 모이어티, 항체 또는 표적화된 폴리펩티드와 같은 결합 단백질 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 4가 및 8가 이종이량체성 가용성 TCR을 제조하는 방법, 관심 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 벡터 및 이들 신규의 고로도 민감한 다가 가용성 TCR 단백질 분자의 용도에 관한 것이다. 사용하기 위한 적용은 치료제, 진단제 및 신약 개발을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
추가의 측면에서, 본 발명은 비-인간 작제물 구성요소를 이용하지 않고, 효율적인 방식으로 다가 면역글로불린 분자를 구축하는 방법을 제공한다.
따라서, 다음을 포함하는 다량체성 면역글로불린이 제공된다:
(i) 면역글로불린 가변 도메인; 및
(ii) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
면역글로불린 가변 도메인은 바람직하게는 항체 가변 도메인이다. 이러한 도메인은 ETO NHR2 다량체화 도메인에 융합되며, 이는 면역글로불린 가변 도메인의 사량체를 형성하기 위한 수단을 제공한다.
ETO NHR2 도메인은 면역글로불린 다량체의 생성에서 p53 및 유사한 다량체화 도메인보다 더 효율적이고, 작제물에서 비-인간 구성요소를 사용하지 않고 다량체성 면역글로불린 분자의 생성을 허용한다.
또한 ETO의 NHR2 도메인과 융합하여 면역글로불린 가변 도메인을 발현시키는 단계, 및 가변 도메인을 다량체로 어셈블리하는 단계를 포함하는, 다량체성 면역글로불린을 생성하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 면역글로불린 가변 도메인은 하나 이상의 면역글로불린 불변 도메인에 부착된다.
유리하게는, 면역글로불린 도메인은 항체 도메인이다. 예를 들어, 가변 도메인은 VH 및 VL 항체 도메인일 수 있다. 예를 들어, 불변 도메인은 항체 CH1 도메인이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 다량체성 면역글로불린 분자, TCR 및 비-TCR 면역글로불린 둘 다는 파지 디스플레이 또는 또 다른 디스플레이 기술에 의한 스크리닝을 위해 생성된다. 따라서, 예를 들어, 다가 면역글로불린은 파지 코트 단백질과 융합하여 생성된다. 코트 단백질에 융합되어 생성된 각 면역글로불린에 대해, 다른 면역글로불린 분자는 코트 단백질 없이 생성되어, NHR2 다량체화의 결과로서 파지 표면 상에서 어셈블리될 수 있도록 한다.
상기 상세하게 기재된 바와 같이 본 발명의 본 구성은 신규 다가, 예를 들어 4가 및 8가 가용성 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 일 측면에서 특히 가용성 단백질은 높은 민감도, 친화도 및 특이성으로 4 개의 pMHC에 결합할 수 있는 4가 이종이량체성 형식으로 어셈블리된 TCR이다. 가용성 4가 이종이량체성 TCR은 전체적 또는 부분적으로 세포외 TCR α/β 쇄로 구성된 독특한 단백질 분자이다. 세포외 TCR α/β 쇄는 면역글로불린 CH1 및 CL(Cκ 또는 Cλ) 도메인에 연결된다. 이 연결은 이종이량체성 TCR α/β의 안정한 형성을 허용한다. 가용성 4가 TCR의 맥락에서 독특한 특징은 단백질의 ETO 패밀리의 NHR2 동종사량체 도메인이며, 이는 CH1의 C-말단 또는 CL의 C-말단에 작동가능하게 연결된다. 이 방식으로 NHR2 도메인을 이종이량체성 α/βTCR에 연결하면 세포 내부에서 4가 형식으로 자기-어셈블리하고 이후에 가용성 단백질로서 상층액으로 분비될 수 있다.
TCR 세포외 도메인
TCR 세포외 도메인은 가변 및 불변 영역으로 구성된다. 이들 도메인은 항체 및 다른 면역글로불린 도메인에 존재하는 것과 동일한 방식으로 T-세포 수용체에 존재한다. TCR 레퍼토리는 항체 중쇄 및 경쇄 유전자에서 사용된 동일한 유전자 재배열 메커니즘에 의해 생성된 광범위한 다양성을 갖는다(Tonegawa, S. (1988) Biosci. Rep. 8:3-26). 대부분의 다양성은 α 및 β 쇄의 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 암호화하는 가변(V) 및 연결(J)(또는 다양성, D) 영역의 접합부에서 생성된다(Davis and Bjorkman (1988) Nature 334:395-402). IMGT LIGM 데이터베이스와 같은 TCR 유전자의 데이터베이스가 이용가능하며, TCR을 클로닝하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, Bentley and Mariuzza (1996) Ann. Rev. Immunol. 14:563-590; Moysey et al., Anal Biochem. 2004 Mar 15;326(2):284-6; Walchli, et al. (2011) A Practical Approach to T-Cell Receptor Cloning and Expression. PLoS ONE 6(11): e27930을 참조한다.
면역글로불린 가변 도메인
항체 가변 도메인은 당업계에 알려져 있고 매우 다양한 공급처로부터 입수가능하다. IMGT 및 Kabat와 같은 항체 가변 도메인 서열의 데이터베이스가 존재하고, 가변 도메인은 천연 서열의 클로닝 및 발현, 또는 확립된 기술에 따른 인공 핵산의 합성에 의해 생성될 수 있다.
박테리오파지 항체 디스플레이 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리의 구축 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci USA., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; 상기 Marks et al. (1991); 상기 Barbas et al. (1992); Hawkins and Winter (1992) J Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J Bioi. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313, 본원에 참조로 포함됨).
하나의 특히 유리한 접근법은 scFv 파지 라이브러리의 사용이었다(Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; 상기 McCafferty et al. (1990); Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks et al. (1991) J Mol. Bioi., 222: 581; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) J Bioi. Chem., 267). 박테리오파지 코트 단백질 상에 나타낸 scFv 라이브러리의 다양한 구현예가 기재되었다. 파지 디스플레이 접근법의 개선은 또한 예를 들어 W096/06213 및 W092/01047(Medical Research Council et al.) 및 W097/08320(Morphosys)에 기재된 바와 같이 알려져 있으며, 본원에 참조로 포함된다.
이러한 기술은 항체 가변 도메인에 NHR2 다량체화 도메인을 융합함으로써 다량체성 면역글로불린의 생산에 적합할 수 있다
면역글로불린 불변 도메인
본원에 언급된 바와 같은 면역글로불린 불변 도메인은 바람직하게는 항체 불변 도메인이다. 불변 도메인은 항체 하위유형 사이에서 서열이 다양하고; 바람직하게는, 불변 도메인은 IgG 불변 도메인이다. 바람직하게는, 불변 도메인은 CH1 불변 도메인이다. 항체 불변 도메인은 당업계에 잘 알려져 있고 다수의 공급처 및 IMGT 및 Kabat 데이터베이스를 포함한 데이터베이스로부터 입수가능하다.
면역글로불린 가변 도메인에 항체 불변 도메인의 융합은 또한 예를 들어 조작된 Fab 항체 단편의 구축에서 당업계에 알려져 있다.
링커
가요성 링커를 사용하여 TCR 가변 도메인 - Ig 불변 도메인을 NHR2 다량체화 도메인에 연결할 수 있다. 이는 TCR 도메인 및 다량체화 도메인이 다량체성 복합체에서 서로 또는 다른 분자로부터 입체 장애 없이 기능하게 한다. 적합한 링커는 예를 들어, Reddy Chichili et al., 2012 Protein Science 22:153-167에 제시된 바와 같이 글리신 반복부, 글리신-알라닌 반복부, Gly(4)Ser 링커, 또는 가요성 폴리펩티드 링커를 포함한다.
면역글로불린 힌지 도메인
본원에서 바람직하게는 항체 힌지 도메인인 Ig 힌지 도메인은 천연 항체에서 항체 불변 영역에 연결하는 도메인이다. 따라서 이 도메인은 항체 불변 도메인을 포함하는 분자의 천연 이량체화를 제공한다. 이는 예를 들어, F(ab)2 항체 단편, 뿐만 아니라 IgG와 같은 전체 항체에 존재한다. 이 영역은 2 개의 천연 쇄간 디술피드 결합을 포함하며, 이는 2 개의 CH1 불변 도메인을 함께 연결한다.
일 구현예에서, 다량체화 도메인은 Ig 불변 도메인 또는 힌지 도메인에 부착될 수 있다. 힌지 도메인이 존재하는 경우, 다량체화 도메인은 힌지 영역에서 결합된 TCR 가변-Ig 불변 도메인의 4 개의 이량체를 포함하는 TRC 팔량체를 형성할 것이다. 힌지 영역이 없으면, 다량체화 도메인은 사량체의 형성으로 이어질 것이다. 바람직하게는, 다량체화 도메인은 불변 도메인의 C-말단 단부 또는 힌지 영역에 부착된다.
생물학적으로 활성 분자
하나 이상의 생물학적으로 활성 분자 또는 이펙터 분자(EM)가 본 발명의 다량체, 예를 들어, 다량체성 TCR 단백질에 부착될 수 있다. 이러한 분자는 예를 들어, 항체, 특히 항-CD3 항체 또는 항체 단편과 같은 TCR의 면역 인식 및 기능을 보조할 수 있는 항체일 수 있다.
일부 측면에서, 생물학적으로 활성 분자는 세포독성 약물, 독소 또는 아래에 보다 상세하게 기재된 바와 같은 사이토카인과 같은 생물학적으로 활성 분자일 수 있다. 생물학적으로 활성 분자의 예는 MIP-1b와 같은 케모카인, IL-2와 같은 사이토카인, GM-CSF 또는 G-CSF와 같은 성장 인자, 리신과 같은 독소, 독소루비신(doxorubicin) 또는 탁산(taxane)과 같은 세포독성제, 방사성 및 형광 표지를 포함한 표지 등을 포함한다. TCR에 접합가능한 생물학적으로 활성 분자의 예는 US20110071919를 참조한다.
다른 측면에서, 생물학적으로 활성 분자는 예를 들어, 생체내에서 폴리펩티드 리간드의 반감기를 연장하는 분자에 결합할 수 있는 군, 및 생체내에서 폴리펩티드 리간드의 반감기를 연장하는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 분자는 예를 들어, HSA 또는 세포 기질 단백질일 수 있으며, 생체내에서 TCR 분자의 반감기를 연장하는 분자에 결합할 수 있는 군은 HSA에 특이적인 항체 또는 항체 단편 또는 세포 기질 단백질이다.
일 구현예에서, 생물학적으로 활성 분자는 결합 분자, 예를 들어 항체 단편이다. 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 항체 단편은 적합한 링커를 사용하여 함께 연결될 수 있다. 이들 항체 단편 중 임의의 2 개 이상의 특이성은 동일하거나 또는 상이할 수 있으며; 이들이 동일한 경우, 다가 결합 구조가 형성될 것이며, 1가 항체 단편과 비교하여 표적에 대한 결합력이 증가된다.
더욱이 생물학적으로 활성 분자는 이펙터 그룹, 예를 들어 항체 Fc 영역일 수 있다.
N 또는 C 말단에 대한 부착은 TCR 분자 또는 조작된 폴리펩티드를 다량체에 어셈블리 하기 전에, 또는 이후에 이루어질 수 있다. 따라서, Ig 불변 도메인과의 TCR 융합은 이미 제자리에 있는 N 또는 C 말단 생물학적으로 활성 분자와 함께 (합성적으로, 또는 핵산의 발현에 의해) 생성될 수 있다. 그러나, 특정 측면에서, N 또는 C 말단에 첨가는 TCR 융합이 생성된 후에 발생한다. 예를 들어, 플루오레닐메틸옥시카보닐 클로라이드를 사용하여 TCR 융합의 N-말단에 Fmoc 보호기를 도입할 수 있다. Fmoc는 HSA를 포함하는 혈청 알부민에 높은 친화도로 결합하고, Fmoc-Trp 또는 FMOC-Lys는 증가된 친화도로 결합한다. 펩티드는 Fmoc 보호기가 남아있는 상태로 합성된 다음, 시스테인을 통해 스캐폴드와 결합될 수 있다. 대안은 또한 HSA에 결합하는 팔미토일 모이어티이며, 예를 들어 이 GLP-1 유사체의 반감기를 연장하기 위해 리라글루티드(Liraglutide)에서 사용되었다.
대안적으로, TCR 융합은 N-말단에서, 예를 들어 아민- 및 술프히드릴-반응성 링커 N-e-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드 에스테르(EMCS)로 변형될 수 있다. 이 링커를 통해 TCR은 다른 폴리펩티드, 예를 들어 항체 Fc 단편에 연결될 수 있다.
NHR2 도메인
AML1/ETO는 M2 하위유형의 급성 골수성 백혈병(AML)에서 발견된 t(8;21)로부터 생성된 융합 단백질이다. AML1/ETO는 대부분의 ETO(575 개 aa)와 프레임 내에서 융합된 RUNX1의 N-말단 177 개 아미노산을 함유한다. ETO의 신경 상동성 도메인 2는 올리고머화 및 단백질-단백질 상호작용을 포함하여, AML1/ETO와 연관된 많은 생물학적 활성을 담당한다. 이 도메인은 Liu et al (2006)에 상세하게 특성화되어 있다. Genbank 수탁 번호 NG_023272.2 참조.
본 발명의 일 측면에서, 가용성 다가 형식으로 어셈블리된 단백질은 TCR α 및 β 쇄의 세포외 도메인의 일부 또는 전부로 구성된 TCR이다. TCR α 및 β 쇄는 면역글로불린 CH1 및 CL 도메인에 의해 안정화되며 다음 구성으로 배열될 수 있다:
1. Vα-CL 및 VβCH1
2. Vα-CH1 및 Vβ-CL
3. VαCα-CL 및 VβCβ-CH1
4. VαCαCH1 및 VβCβCL
본 발명의 일 측면에서, 세포외 TCR 도메인은 임의적 펩티드 링커(L)를 통해 면역글로불린 CH1 및 CL 도메인에 연결되어 단백질 유연성을 촉진하고 최적의 단백질 접힘을 용이하게 한다.
1. Vα-(L)-CL 및 Vβ-(L)-CH1
2. Vα-(L)-CH1 및 Vβ-(L)-CL
3. VαCα-(L)-CL 및 VβCβ-(L)-CH1
4. VαCα-(L)-CH1 및 VβCβ-(L)-CL
본 발명의 또 다른 측면에서, NHR2 동종사량체 도메인과 같은 사량체화 도메인(TD)은 세포외 TCR α 및 β 쇄에 연결된 면역글로불린 CH1 또는 CL 도메인의 C-말단에 연결된다. NHR2 도메인은 펩티드 링커를 통해 CH1 또는 CL 도메인에 임의적으로 연결될 수 있다. 생성된 4가 이종이량체성 TCR 단백질은 다음 구성으로 배열될 수 있으며 여기서 (L)은 임의적 펩티드 링커이다:
1. Vα-(L)-CL 및 Vβ-(L)-CH1-(L)-TD
2. Vα-(L)-CH1 -(L)-TD 및 Vβ-(L)-CL
3. VαCα-(L)-CL 및 VβCβ-(L)-CH1-(L)-TD
4. VαCα-(L)-CH1-(L)-TD 및 VβCβ-(L)-CL
5. Vα-(L)-CL-(L)-TD 및 Vβ-(L)-CH1
6. Vα-(L)-CH1 및 Vβ-(L)-CL-(L)-TD
7. VαCα-(L)-CL-(L)-TD 및 VβCβ-(L)-CH1
8. VαCα-(L)-CH1 및 VβCβ-(L)-CL-(L)-TD
동족 pMHC에 대한 가용성 TCR의 민감도는 결합력 효과를 증가시킴으로써 향상될 수 있다. 이는 사량체화 도메인에 의해 용이하게 된 항원 부위의 수를 증가시킴으로써 달성된다. 이것은 또한 차례로 1가 가용성 TCR과 비교하여 단백질 분자의 분자량을 증가시키고 따라서 순환 시 혈청 체류를 연장한다. 혈청 반감기를 증가시키면 또한 이들 분자가 동족 표적 항원과 상호작용할 가능성을 향상시킨다.
4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 단일 세포 상에 나타낸 1, 2, 3 또는 4 개의 pMHC에 동시에 결합할 수 있거나 또는 동족 pMHC를 나타내는 1, 2, 3 또는 4 개의 상이한 세포에 동시에 결합한다.
본 발명에 사용되는 TCR α 및 β 쇄 서열은 특정 pMHC에 특이적인 알려진 TCR 또는 파지 디스플레이같이 당업계에 알려진 기술을 사용하여 스크리닝함으로써 새롭게 식별된 TCR로부터 유래될 수 있다. 또한, TCR 서열은 본 발명에서 α 및 β 쇄로 제한되지 않지만 또한 인간 T 세포로부터 직접 클로닝되거나 재조합 DNA 기술을 사용하여 지시된 진화에 의해 식별된 TCRδ 및 γ 또는 ε 쇄 및 이의 서열 변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 가용성이고 안정하고 정확하게 접힌 단백질 분자의 최적 생산을 위해 포유동물 세포에서 우선적으로 생성된다.
본 발명에 따른 다량체(예를 들어, 사량체 또는 팔량체), 또는 다가 TCR은 임의의 적합한 벡터 시스템을 사용하여 포유동물 세포와 같은 세포에서 발현될 수 있다. pTT5 발현 벡터는 다가 가용성 TCR을 발현하는 데 사용되는 발현 시스템의 일 예이다. pTT5 발현 시스템은 현탁액-적응된 HEK293 EBNA 세포에서 재조합 단백질의 높은 수준의 일시적 생산을 허용한다(Zhang et al. 2009). 이는 바이러스 단백질 엡스타인-바 핵 항원 1(EBNA-1)에 의해 인식된 복제 기점(oriP)을 함유하며, 숙주 세포 복제 인자와 함께 DNA 플라스미드의 에피솜 복제를 매개하여 재조합 단백질의 향상된 발현을 허용한다. 당업계에 알려져 있고 상업적으로 입수가능한 포유동물 세포 발현을 위한 다른 적합한 벡터 시스템이 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자 또는 다른 다량체는 발현 벡터로부터 유전자를 일시적으로 발현함으로써 생성될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자 또는 다른 다량체는 조작된 안정한 세포주로부터 생성될 수 있다. 세포주는 단백질 분자를 암호화하는 유전자(들)가 단일 카피 또는 다중 카피로서 숙주 세포의 게놈에 통합되는 경우 당업계에 알려진 게놈-조작 기술을 사용하여 단백질 분자를 생성하도록 조작될 수 있다. DNA 통합 부위는 숙주 게놈 내에 정의된 위치이거나 또는 원하는 단백질 분자의 최대 발현을 산출하기 위해 무작위로 통합될 수 있다. 게놈 조작 기술은 상동성 재조합, PiggyBac 트랜스포존 시스템과 같은 트랜스포존 매개 유전자 전달, 재조합효소-매개 카세트 교환을 포함한 부위 특이적 재조합효소, CRISPR/Cas9, TALEN, 아연-핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제와 같은 엔도뉴클레아제 매개 유전자 표적화 및 렌티바이러스와 같은 바이러스 매개 유전자 전달을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 대한 또 다른 측면에서, 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자 또는 다른 다량체가 봉입체로서 이. 콜라이(E. coli)의 세포질에서 과발현됨으로써 생성되고 친화성 크로마토그래피에 의한 정제 후에 시험관내에서 재접힘되어 동족 pMHC 또는 항원에 정확하게 결합할 수 있는 기능적 단백질 분자를 생성한다.
본 발명에 대한 또 다른 측면에서, 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자 또는 다른 다량체의 발현은 포유동물 또는 박테리아 세포로 제한되지 않지만 또한 곤충 세포, 식물 세포 및 효모 세포와 같은 하등 진핵생물 세포에서 발현 및 생성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 이종이량체성 가용성 TCR 분자 또는 다른 다량체는 예를 들어, 동족 pMHC에 대해 최대 8 개의 결합 부위를 갖는 8가 단백질 복합체로서 생성된다(도 2). 다중 항원 결합 부위는 이 분자가 하나의 세포 상에 나타낸 최대 8 개의 pMHC에 결합하거나 또는 최대 8 개의 상이한 세포 상에 나타낸 pMHC에 결합하게 하여 매우 민감한 가용성 TCR을 생성한다.
분자의 이종이량체성 가용성 TCR 부분은 그 자체가 TCR α 또는 β 쇄에 연결된, CH1 또는 CL 도메인의 C-말단에 면역글로불린 힌지 도메인을 융합시킴으로써 2가 분자로 만들어진다. 힌지 도메인은 IgG와 유사한 구조를 제공하는 2 개 중쇄의 연결을 허용한다. 힌지 도메인의 C-말단에, NHR2와 같은 사량체화 도메인이 임의적 펩티드 링커를 통해 연결된다. 각각 Ig CH1 또는 CL 도메인 및 NHR2 도메인의 C-말단 및 N-말단에 면역글로불린 힌지를 연결함으로써, 단량체2로서 지칭되는 2 개의 NHR2 단량체의 어셈블리를 허용한다. 이 형태에서 본 발명자들은 2 개의 NHR2 도메인이 힌지 및 NHR2 도메인 사이에 긴 가요성 링커가 제공되는 한 구조적 제약으로 인해 역평행 회합에 의해 동종이량체를 형성할 가능성이 가장 높을 것이라고 예측한다. 사량체화 및 힌지 도메인을 면역글로불린 CH1 또는 CL 도메인을 통해 이종이량체성 가용성 TCR에 연결하는 것은 NHR2 동종사량체2를 통해 형성된 8가 가용성 TCR의 단계적 자기-어셈블리를 허용한다. 8가 가용성 TCR의 자기-어셈블리는 NHR2 단량체2 및 동종이량체2를 통해 단백질 복합체를 중재한다(도 2). 생성된 8가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 동족 pMHC에 대해 뛰어난 민감도를 가지며 따라서 자연적으로 볼 수 있는 친화도를 훨씬 능가하는 pMHC 리간드에 대한 TCR을 친화도 성숙을 가질 필요 없이 알려지지 않은 항원 또는 pMHC를 식별하는 독특한 이점을 제공할 것이다. 특히 특성화되지 않은 종양-특이적 T 세포 및 자가면역 질환과 같은 다른 질환에 수반되는 T 세포에 의해 인식된 pMHC를 식별하는 데 유용할 것이다. 8가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자의 다수의 상이한 구성이 생성될 수 있다. 일부 예는 다음에 제시되어 있다.
1. Vα-(L)-CL 및 Vβ-(L)-CH1-힌지-(L)-TD
2. Vα-(L)-CH1-힌지-(L)-TD 및 Vβ-(L)-CL
3. Vα-Cα-(L)-CL 및 Vβ-Cβ-(L)-CH1-힌지-(L)-TD
4. VαCα(L)-CH1-힌지-(L)-TD 및 VβCβ-(L)-CL
5. Vα-(L)-CL-(L)-TD 및 Vβ-(L)-CH1-힌지
6. Vα-(L)-CH1-힌지 및 Vβ-(L)-CL-(L)-TD
7. Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD 및 Vβ-Cβ(L)-CH1-힌지
8. Vα-Cα-(L)-CH1-힌지 및 Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD
본 발명의 또 다른 측면에서, 자기-어셈블리된 다가 단백질 우선적으로 4가 및 8가 이종이량체성 가용성 TCR은 생물학적으로 활성제/이펙터 분자에 융합 또는 접합되어 이들 분자가 암 세포와 같은 원하는 세포 집단으로 유도되도록 하고 치료 효과를 특이적으로 발휘한다. 세포독성 약물, 독소 또는 사이토카인과 같은 생물학적으로 활성 분자와 같은 이펙터 분자를 유도하는 단클론 항체의 종양 표적화 능력은 잘 확립되어 있다(Perez et al. 2014; Young et al. 2014). 유사한 방식으로 본 발명에 요약된 다가 가용성 TCR 분자는 또한 이펙터 단백질 및 폴리펩티드와 융합되거나 또는 세포독성제에 접합될 수 있다. 본 발명에 요약된 다가 단백질 복합체와의 융합 단백질로서 사용하기에 적합한 이펙터 단백질 분자의 예는 IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-2, IL-11, IL-13, 과립구 콜로니 자극 인자[G-CSF], 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자[GM-CSF], 및 종양 괴사 인자[TNF]α, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, CD40L, 및 TRAIL을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 공자극 리간드는 B7.1 또는 B7.2, 케모카인 DC-CK1, SDF-1, 프랙탈카인, 리포탁틴, IP-10, Mig, MCAF, MlP-lα, MIP-1/3, IL-8, NAP-2, PF-4, 및 RANTES 또는 이의 활성 단편이다. 융합 단백질로서 사용하기에 적합하거나 또는 본 발명에 기재된 다가 단백질 복합체에 접합된 독성제의 예는 디프테리아 독소, 리신, 슈도모나스 엑소톡신(Pseudomonas exotoxin)과 같은 독소, 아우리스타틴(auristatin), 메이탄신(maytansines), 칼리케아미신(calicheamicin), 안트라사이클린(anthracycline), 듀오카마이신(duocarmycin), 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepines)과 같은 세포독성 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 세포독성 약물은 프로테아제에 의해 절단불가능하거나 또는 절단가능하거나 또는 산-불안정한 선택 링커에 의해 접합될 수 있다.
이질성을 제거하고 접합체 안정성을 개선하기 위해 세포독성 약물은 부위-특이적 방식으로 접합될 수 있다. 특정 시스테인 잔기를 조작하거나 또는 글리코트랜스퍼라제 및 트랜스글루타미나제를 통한 효소적 접합을 사용함으로써 달성될 수 있다(Panowski et al. 2014).
본 발명의 또 다른 측면에서, 다가 단백질 복합체는 형광, 방사성 또는 전자 전달제와 같은 검출을 허용하는 분자에 공유적으로 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 이펙터 분자(EM)는 임의적 펩티드 링커를 통해 NHR2와 같은 사량체와 도메인의 C-말단을 통해 다가 단백질 복합체에 융합된다. NHR2 도메인을 통한 융합은 다수의 상이한 구성에서 다가 단백질 복합체를 생성하도록 배열될 수 있다. 4가 이종이량체성 가용성 TCR을 사용하여 생성될 수 있는 단백질 구성 중 일부의 예는 아래에 제시되어 있다:
1. Vα-(L)-CL 및 Vβ-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM
2. Vα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CL
3. Vα-Cα-(L)-CL 및 Vβ-Cβ-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM
4. Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-Cβ-(L)-CL
5. Vα- (L)-CL-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CH1
6. Vα-(L)-CH1 및 Vβ-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM
7. Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-Cβ-(L)-CH1
8. Vα-Cα-(L)-CH1 및 Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM
본 발명의 또 다른 측면에서, 이펙터 분자(EM)는 임의적 펩티드 링커를 통해 면역글로불린 CH1 또는 CL1 도메인의 C-말단에서 다가 단백질 복합체에 융합된다. 면역글로불린 도메인을 통한 EM의 융합은 다수의 상이한 구성에서 다가 단백질 복합체를 생성하도록 배열될 수 있다. 4가 이종이량체성 가용성 TCR을 사용하여 생성될 수 있는 단백질 구성 중 일부의 예는 아래에 제시되어 있다:
9. Vα- (L)-CL-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CH1-(L)-TD
10. Vα- (L)-CH1-(L)-TD 및 Vβ-(L)-CL-(L)-EM
11. Vα-Cα-(L)-CL-(L)-EM 및 Vαβ-Cβ-(L)-CH1-(L)-TD
12. Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-TD 및 Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-EM
13. Vα-(L)-CL-(L)-TD 및 Vβ-(L)-CH1-(L)-EM
14. Vα-(L)-CH1-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CL-(L)-TD
15. Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD 및 Vβ-Cβ-(L)-CH1-(L)-EM
16. Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-EM 및 Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD
본 발명의 또 다른 측면에서, 이펙터 분자(EM)는 임의적 펩티드 링커를 통해 면역글로불린 CH1 또는 CL1 도메인의 C-말단 및 또한 사량체화 도메인(예를 들어 NHR2)의 C-말단에서 다가 단백질 복합체에 융합된다. 이 접근법은 TCR 이종이량체 복합체 당 융합될 2 개의 이?z터 분자의 융합을 허용한다. 면역글로불린 도메인 및 사량체화 도메인을 통한 EM의 융합은 다수의 상이한 구성에서 다가 단백질 복합체를 생성하도록 배열될 수 있다. 4가 이종이량체성 가용성 TCR을 사용하여 생성될 수 있는 단백질 구성 중 일부의 예는 아래에 제시된다:
17. Vα- (L)-CL-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM
18. Vα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CL-(L)-EM
19. Vα-Cα-(L)-CL-(L)-EM 및 VβCβ-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM
20. Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-EM
21. Vα-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CH1-(L)-EM
22. Vα-(L)-CH1-(L)-EM 및 Vβ-(L)-CL-(L-)TD-(L)-EM
23. Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM 및 Vβ-Cβ-(L)-CH1-(L)-EM
24. Vα-(L)-CH1-(L)-EM 및 Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM
본 발명의 또 다른 측면에서, 다가 단백질 복합체는 단백질 태그에 융합되어 정제를 용이하게 한다. 정제 태그는 당업계에 알려져 있고, 이들은 다음 태그를 포함하나 이에 제한되지 않는다: His, GST, TEV, MBP, Strep, FLAG.
비-TCR 다량체
본 발명은 단백질을 다중 상호작용 도메인 또는 항원에 결합할 가능성이 있는 가용성 다가 형식으로 어셈블리하는 독특한 방법을 제공한다. 단백질은 면역계에서 직접적으로 또는 간접적으로 우선적으로 수반되거나, 또는 면역 반응을 조절할 가능성이 있는 단량체, 동종이량체, 이종이량체 또는 올리고머일 수 있다. 예는 TCR, 펩티드 MHC 클래스 I 및 클래스 II, 항체 또는 이의 항원-결합 부분 및 대체 비-항체 단백질 스캐폴드를 갖는 결합 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상호작용 도메인 또는 항원은 임의의 세포 표면 발현 또는 분비된 단백질, MHC 클래스 I 또는 II와 회합된 펩티드 또는 바이러스 및 박테리아 단백질을 포함한 병원체와 회합된 임의의 단백질일 수 있다.
비-TCR 다량체는 Fab의 dAb와 같은 항체 또는 항체 단편의 다량체일 수 있다. 본 발명에 따른 dAb 및 Fab의 예는 다음을 포함한다:
다가 dAb의 예
25. VH-(L)-NHR2
26. VL(λ 또는 κ)-(L)-NHR2
27. VH-(L)-NHR2-(L)-EM
28. VL(λ 또는 κ)-(L)-NHR2-(L)-EM
29. VH-CH1-(L)-NHR2
30. VL(λ 또는 κ)-CL-(L)-NHR2
31. VH-CH1-(L)-NHR2-(L)-EM
32. VL(λ 또는 κ)-CL-(L)-NHR2-(L)-EM
다가 Fab의 예
33. VH-CH1-(L)-NHR2 및 VL(λ 또는 κ)-CL
34. VL(λ 또는 κ)-CL-(L)-NHR2 및 VH-CH1
35. VH-CH1-힌지-(L)-NHR2 및 VL(λ 또는 κ)-CL
36. VL(λ 또는 κ)-CL-힌지-(L)-NHR2 및 VH-CH1
37. VH-CH1-(L)-NHR2-(L)-EM 및 VL(λ 또는 κ)-CL
38. VL(λ 또는 κ)-CL-(L)-NHR2-(L)-EM 및 VH-CH1
39. VH-CH1-힌지-(L)-NHR2-(L)-EM 및 VL(λ 또는 κ)-CL
40. VL(λ 또는 κ)-CL-힌지-(L)-NHR2-(L)-EM 및 VH-CH1
41. VH-CH1-(L)-NHR2 및 VL(λ 또는 κ)-CL-(L)-EM
42. VL(λ 또는 κ)-CL-(L)-NHR2 및 VH-CH1-(L)-EM
43. VH-CH1-힌지-(L)-NHR2 및 VL(λ 또는 κ)-CL-(L)-EM
44. VL(λ 또는 κ)-CL-힌지-(L)-NHR2 및 VH-CH1-(L)-EM
상기 예에서, (L)은 임의적 펩티드 링커를 나타내는 반면, EM은 생물학적으로 활성제 또는 독소, 약물 또는 사이토카인과 같은 이펙터 분자를 나타내고, 항체, Fab 및 ScFv와 같은 결합 분자를 포함한다.
가변 경쇄는 Vλ 또는 Vκ일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 일 예에서 어셈블리된 사량체화 단백질 분자는 동물 약물 개발 플랫폼(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 닭)을 사용한 약물 개발에 적용하기 위한 인간 pMHC일 수 있다. 이러한 맥락에서, 사량체화 도메인은 의도된 동물종으로부터 유래하는 유전자로부터 우선적으로 발현 및 생성된다. 이러한 약물 개발 적용의 일 예는 예를 들어 래트에서 면역화를 위한 항원으로서 사량체화 인간 pMHC를 사용하는 것이다. 래트가 pMHC로 면역화되면, 면역 반응은 단백질 복합체의 사량체화 도메인이 아니라 인간 pMHC를 향해 특이적으로 지시된다.
다가 항체는 예를 들어 NHR2 다량체화 도메인에 융합된 단일 도메인 항체 서열을 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명과 관련된 측면에서, 4가 단백질은 종양 항원의 분자 영상화를 위한 프로브로서 사용된 펩티드일 수 있다. 이러한 프로브의 다가 결합은 생체내에서 친화도, 결합력 및 체류 시간을 향상시킬 것이고 차례로 생체내 종양 표적화를 향상시킬 것이므로 1가 분자 프로브에 비해 독특한 이점을 가질 것이다.
다량체화 도메인은 상기 제시된 NHR2 도메인이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 폴리펩티드에 융합된 Ig 불변 도메인의 사용에 의해 안정화되고/되거나 가용성으로 만들어져서, 융합이 폴리펩티드의 사량체를 제공하도록 한다. Ig 힌지 도메인을 사용하여 팔량체를 제공할 수 있다.
다량체의 용도
본 발명에 따른 다량체성 TCR 단백질은 가용성 TCR 단백질이 지시되는 임의의 적용에서 유용하다. 본 발명의 TCR 단백질의 특정 이점은 선택된 표적에 대한 증가된 결합력, 및/또는 복수의 표적에 결합하는 능력을 포함한다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명의 다가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 면역 반응의 선택적 억제, 예를 들어 자가면역 반응의 억제에 사용될 수 있다. 이들 가용성 단백질 분자의 다가, 예를 들어 4가 성질은 T 세포 및 항원 제시 세포 사이의 항원-특이적 상호작용을 경쟁하기 위해 정교한 민감도 및 결합 친화도를 제공한다. 이러한 종류의 중화 효과는 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 건선, 염증성 장 질환, 그레이브스병, 맥관염 및 1형 당뇨병과 같은 자가면역 질환에서 치료적으로 유리할 수 있다.
유사하게, 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 표적 분자에 결합하는 특이적 이식 항원 및 자기 항원의 T 세포 인식을 선택적으로 억제하고 따라서 세포간 상호작용을 억제함으로써 조직 이식 거부를 예방하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 독성, 감염성 질환 연구, 신경학적 연구, 행동 및 인지 연구, 번식, 유전학 및 이종이식 연구와 같은 임상 연구에서 사용될 수 있다.
동족 pMHC에 대한 향상된 민감도를 갖는 4가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 인간 환자로부터 직접 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 진단 목적으로 사용될 수 있다. 4가 이종이량체성 가용성 TCR의 향상된 민감도는 MHC 상에 나타낸 잠재적 질환-관련 펩티드의 검출을 허용하며, 이는 저밀도에서 발현되는 것으로 자연적으로 발견된다. 이들 분자는 또한 환자를 관련 임상 시험에 등록하기 위한 환자 계층화에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 8가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 다양한 질환의 치료를 위한 약제학적 제제에 사용될 수 있다.
본 발명에 대한 또 다른 관련 측면에서, 8가 이종이량체성 가용성 TCR 단백질 분자는 종양 분자 영상화를 위한 프로브로서 사용되거나 또는 치료 단백질로서 제조될 수 있다.
임의적으로, 폴리펩티드(제1 폴리펩티드)는 표 8에 개시된 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 예에서 본 발명은 이러한 폴리펩티드의 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체, 바람직하게는 사량체)를 제공한다. 일 예에서, 표 8에서, 다량체화 도메인(SAM)은 p53 도메인(예를 들어, 인간 p53 도메인)이다. 일 예에서, 표 8에서, 다량체화 도메인(SAM)은 p53 도메인(예를 들어, 인간 p53 도메인)의 오솔로그 또는 상동체이다.
임의적으로, 본 발명은 폴리펩티드(예를 들어, 상기 폴리펩티드 또는 상기 제1 폴리펩티드)를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로*) 다음을 포함하거나 또는 이로 이루어진다;
A. dAb 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
G. 제1 scFv, CH2, CH3 및 SAM;
H. VH, CH1, CH2 CH3 및 SAM;
I. VL, CL, CH2, CH3 및 SAM;
J. dAb; SAM, CH2 및 CH3;
K. scFv; SAM, CH2 및 CH3;
L. VH, CH1, SAM, CH2 및 CH3;
M. VL, CL, SAM, CH2 및 CH3;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb.
*대안으로 구성요소는 C-말단에서 N-말단 방향으로 기재되어 있다.
일 구현예에서, 폴리펩티드 H, L, O 또는 Q는 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) VL 및 CL을 포함하며, 여기서 CL은 제1 폴리펩티드의 CH1과 회합된다.
일 구현예에서, 폴리펩티드 I, M, P 또는 R은 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) VH 및 CH1을 포함하며, 여기서 CH1은 제1 폴리펩티드의 CL과 회합된다.
일 예에서, 폴리펩티드는 표 9에 개시된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일 예에서, 폴리펩티드는 표 10에 개시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일 예에서 (i) 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함한다;
A. dAb 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
G. 제1 scFv, CH2, CH3 및 SAM;
H. VH, CH1, CH2 CH3 및 SAM;
I. VL, CL, CH2, CH3 및 SAM;
J. dAb; SAM, CH2 및 CH3;
K. scFv; SAM, CH2 및 CH3;
L. VH, CH1, SAM, CH2 및 CH3;
M. VL, CL, SAM, CH2 및 CH3;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb.
또는 (ii) 폴리펩티드는 (C-말단에서 N-말단 방향으로) 다음을 포함한다;
A. dAb 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
G. 제1 scFv, CH2, CH3 및 SAM;
H. VH, CH1, CH2 CH3 및 SAM;
I. VL, CL, CH2, CH3 및 SAM;
J. dAb; SAM, CH2 및 CH3;
K. scFv; SAM, CH2 및 CH3;
L. VH, CH1, SAM, CH2 및 CH3;
M. VL, CL, SAM, CH2 및 CH3;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb.
임의적으로, SAM은 사량체화 도메인, 예를 들어, p53 TD이다.
일 예에서 제1, 제2, 제3(존재하는 경우) 및 제4(존재하는 경우) dAb는 동일한 항원 결합 특이성을 갖는다. 일 예에서 제1, 제2, 제3(존재하는 경우) 및 제4(존재하는 경우) dAb는 동일한 상이한 결합 특이성을 갖는다.
일 예에서 제1 및 제2 scFv는 동일한 항원 결합 특이성을 갖는다. 일 예에서 제1 및 제2 scFv는 동일한 상이한 항원 결합 특이성을 갖는다.
일 예에서 제1 dAb, 제2 dAb 및 제1 scFv는 동일한 항원 결합 특이성을 갖는다. 일 예에서 제1 dAb, 제2 dAb 및 제1 scFv는 동일한 상이한 항원 결합 특이성을 갖는다.
본원에서, dAb가 폴리펩티드에 제공되는 경우, 대안으로 scFv 또는 Fab 또는 비-Ig 결합 도메인(예를 들어, 아피바디, 아비머 또는 피브로넥틴 도메인)과 같은 임의의 상이한 유형의 항원 결합 도메인이 대신 제공될 수 있다.
본원에서, scFv가 폴리펩티드에 제공되는 경우, 대안으로 dAb 또는 Fab 또는 비-Ig 결합 도메인(예를 들어, 아피바디, 아비머 또는 피브로넥틴 도메인)과 같은 임의의 상이한 유형의 항원 결합 도메인이 대신 제공될 수 있다.
본원에서, Fab가 폴리펩티드에 제공되는 경우, 대안으로 scFv 또는 dAb 또는 비-Ig 결합 도메인(예를 들어, 아피바디, 아비머 또는 피브로넥틴 도메인)과 같은 임의의 상이한 유형의 항원 결합 도메인이 대신 제공될 수 있다.
각 항원은 본원에 개시된 임의의 항원일 수 있다.
일 예에서, CH1(존재하는 경우), CH2 및 CH3은 인간 Ig CH1, CH2 CH3, 예를 들어, IgG1 CH1, CH2 및 CH3이다. 일 예에서, CH2는 CH2 도메인을 포함하고, CH3은 CH3 도메인을 포함하고 CH2는 힌지 아미노산 서열을 포함한다. 이 예에서, CH2는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 힌지 아미노산 서열 및 CH2 도메인을 포함한다. 일 예에서 힌지 아미노산 서열은 (i) 완전한 힌지이거나; (ii) 폴리펩티드를 또 다른 이러한 폴리펩티드와 이량체화하는 비-기능적인 힌지 아미노산 서열이거나; (iii) 아미노산 모티프 CXXC를 포함하는 힌지 코어가 없는(그리고 임의적으로 또한 상부 힌지 아미노산 서열이 없는) 힌지 아미노산 서열; 또는 (iv) 하부 힌지에 융합되지만, 아미노산 모티프 CXXC를 포함하는 힌지 코어가 없는 상부 힌지; 또는 (v) 아미노산 모티프 CXXC를 포함하는 힌지 코어가 없는(그리고 임의적으로 또한 상부 힌지 아미노산 서열이 없는) 하부 힌지이다. 상부, 코어 및 하부 힌지 서열의 예는 표 12에 개시되어 있다. 일 예에서, CH2는 기능적 힌지 영역이 없으며, 즉, 여기서 힌지 영역은 폴리펩티드를 또 다른 이러한 폴리펩티드와 이량체화하는 비-기능적이다. 일 예에서, CH2는 힌지 영역이 없다. 일 예에서, CH2는 완전한 힌지 영역 서열이 없다. 일 예에서, CH2는 코어 힌지 영역 서열이 없다.
일 예에서, CH2는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 임의적 상부 힌지 영역, 하부 힌지 영역 및 CH2 도메인을 포함하며 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 폴리펩티드를 또 다른 상기 폴리펩티드와 이량체화하는 기능을 하는 코어 힌지 영역이 없다.
일 예에서, CH2는 N-말단에서 C-말단 방향으로) 임의적 상부 힌지 영역, 하부 힌지 영역 및 CH2 도메인을 포함하며 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CXXC가 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다(임의적으로 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택된다).
일 예에서, CH2는 N-말단에서 C-말단 방향으로) 서열번호: 163-178로부터 선택된 아미노산 및 CH2 도메인을 포함하며 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CXXC가 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다(임의적으로 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택된다).
일 구현예에서, 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180-182로부터 선택된다. 일 구현예에서, CH2(폴리펩티드)는 서열번호: 183-187의 아미노산 서열이 없다.
일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG1 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG1 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDKTHT(서열번호: 183) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다.
일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG2 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG2 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ERKCCVE(서열번호: 184) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다.
일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG3 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 181이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG3 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT(서열번호: 185) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPRC(서열번호: 181)가 없다. 임의적으로, 대안적으로 CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDTPPP(서열번호: 186) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPRC(서열번호: 181)가 없다.
일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG4 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 182이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG4 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ESKYGPP(서열번호: 187) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPSC(서열번호: 182)가 없다.
일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 CH2는 코어 힌지(및 임의적으로 또한 상부 힌지) 아미노산 서열이 없다. 일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 CH2는 코어 힌지 CXXC 아미노산 서열이 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 P, R 또는 S, 가장 바람직하게는 P이다. 일 예에서, CH2는 APELLGGPSV 아미노산 서열, 또는 PAPELLGGPSV 아미노산 서열을 포함한다. 일 예에서, CH2는 APPVAGPSV 아미노산 서열, 또는 PAPPVAGPSV 아미노산 서열을 포함한다. 일 예에서, CH2는 APEFLGGPSV 아미노산 서열, 또는 PAPEFLGGPSV 아미노산 서열을 포함한다.
일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 CH2 및 CH3은 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인이며, 여기서 CH2는 코어 힌지(및 임의적으로 또한 상부 힌지) 아미노산 서열이 없고, 예를 들어, 여기서 CH2는 CPPC 서열이 없다. 일 예에서, CH2는 APELLGGPSV 아미노산 서열, 또는 EPKSCDKTHT[P]APELLGGPSV 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적이다.
일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 CH2 및 CH3은 인간 IgG2 CH2 및 CH3 도메인이며, 여기서 CH2는 코어 힌지(및 임의적으로 또한 상부 힌지) 아미노산 서열이 없고, 예를 들어, 여기서 CH2는 CPPC 서열이 없다. 일 예에서, CH2는 APPVAGPSV 아미노산 서열, 또는 ERKCCVE[P]APPVAGPSV 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적이다.
일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 CH2 및 CH3은 인간 IgG3 CH2 및 CH3 도메인이며, 여기서 CH2는 코어 힌지(및 임의적으로 또한 상부 힌지) 아미노산 서열이 없고, 예를 들어, 여기서 CH2는 CPRC 서열이 없다. 일 예에서, CH2는 APELLGGPSV 아미노산 서열, 또는 ELKTPLGDTTHT[P]APELLGGPSV 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적이다. 일 예에서, CH2는 EPKSCDTPPP[P]APELLGGPSV 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적이다.
일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 CH2 및 CH3은 인간 IgG4 CH2 및 CH3 도메인이며, 여기서 CH2는 코어 힌지(및 임의적으로 또한 상부 힌지) 아미노산 서열이 없고, 예를 들어, 여기서 CH2는 CPSC 서열이 없다. 일 예에서, CH2는 APEFLGGPSV 아미노산 서열, 또는 ESKYGPP[P]APEFLGGPSV 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적이다.
폴리펩티드가 V-CH1을 포함하는 경우, CH2가 또한 존재할 수 있지만, 이 경우에 임의적으로 코어 힌지 영역(또는 적어도 본원에 개시된 바와 같은 CXXC 및 서열번호: 180-182로부터 선택된 서열)이 결여되어 있고 임의적으로 F(ab')2 형성을 방지하기 위해 상부 및/또는 하부 힌지 영역이 결여되어 있다.
측면:
예로서 본 발명은 다음 측면을 제공하며, 이 중 일부는 본원에 예시되었다.
1. (N-말단에서 C-말단 방향으로; 또는 C-말단에서 N-말단 방향으로) 다음을 포함하는 폴리펩티드:
(a) 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인;
(b) 임의적 링커; 및
(c) 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)(임의적으로 자기-회합 사량체화 도메인(TD)).
일 예에서, 각 링커는 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 개 또는 아미노산을 포함하는(또는 최대로 포함하거나, 또는 이로 이루어진) 펩티드 링커이다.
대안으로, (a)의 도메인은 비-Ig 도메인이거나 또는 비-Ig 스캐폴드를 포함한다.
본원의 대안으로, TD 또는 TD의 카피를 사용하는 대신에, 일 구현예에서 임의의 다른 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)이 사용될 수 있다. 일 예에서, SAM(예를 들어, TD)은 인간, 개, 고양이, 말, 원숭이(예를 들어, 시노몰구스 원숭이), 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 토끼, 조류(예를 들어, 닭) 또는 어류 SAM(또는 TD)이다.
임의적으로, (a)의 도메인은 다음으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다: PD-L1, PD-1, 4-1BB, CTLA-4, 4-1BB, CD28, TNF 알파, IL17(예를 들어, IL17A), CD38, VEGF-A, EGFR, IL-6, IL-4, IL-6R, IL-4R(예를 들어, IL-4Ra), OX40, OX40L, TIM-3, CD20, GITR, VISTA, ICOS, 사멸 수용체 5(DR5), LAG-3, CD40, CD40L, CD27, HVEM, KRAS, 헤마글루티닌, 트랜스페린 수용체 1, 아밀로이드 베타, BACE1, Tau, TDP43, SOD1, 알파 시누클레인 및 CD3.
일 예에서, 항원은 펩티드-MHC이다.
일부 구현예(예를 들어, 아래의 측면 16 또는 아래의 측면 17의 일부 구현예)에서, 폴리펩티드는 적어도 2 개의 결합 모이어티, 예를 들어, 2 개의 dAb, 2 개의 scFv, 또는 dAb 및 scFv를 포함한다. 일 예에서, 이들 결합 모이어티는 동일한 항원(예를 들어, 본원 또는 본원의 직전 단락에 개시된 항원)에 결합한다. 또 다른 예에서, 모이어티는 상이한 항원(예를 들어, 본원 또는 본원의 직전 단락에 개시된 항원)에 결합한다. 예를 들어, 측면 16B, D, E 또는 F에서 가변 도메인 또는 scFv는 TNF 알파, CD38, IL17a, CD20, PD-1, PD-L1, CTLA-4 및 4-1BB로부터 선택된 동일하거나 또는 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 모이어티 중 하나는 TNF 알파에 결합하고 다른 모이어티는 IL17에 결합하거나; 모이어티 중 하나는 PD-1에 결합하고 다른 모이어티는 4-1BB에 결합하거나; 또는 모이어티 중 하나는 PD-L1에 결합하고 다른 모이어티는 4-1BB에 결합하거나; 모이어티 중 하나는 PD-1에 결합하고 다른 모이어티는 CTLA-4에 결합하거나; 또는 모이어티 중 하나는 PD-L1에 결합하고 다른 모이어티는 CTLA-4에 결합한다.
2. 측면 1에 있어서, 상기 (a)의 도메인이 항체 가변 도메인인, 폴리펩티드.
예를 들어, 본원의 가변 도메인은 VH(예를 들어, scFv 또는 Fab 폴리펩티드 쇄에 의해 포함)이다. 또 다른 예에서, 이는 VHH(예를 들어, scFv 또는 Fab 폴리펩티드 쇄에 의해 포함)이다. 또 다른 예에서, 이는 인간화 VH, 인간화 VHH 또는 인간 VH(예를 들어, scFv 또는 Fab 폴리펩티드 쇄에 의해 포함)이다. 또 다른 예에서, 이는 VL(예를 들어, scFv 또는 Fab 폴리펩티드 쇄에 의해 포함)이다. 또 다른 예에서, 이는 Vκ이다. 또 다른 예에서, 이는 Vλ이다.
또 다른 예에서, (a)의 도메인은 TCR 가변 도메인(예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ)이다.
일 예에서 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인은 항체 단일 가변 도메인(dAb)이다.
3. 측면 1 또는 2에 있어서, 상기 (a)의 도메인이 항체 단일 가변 도메인, VH 및 VL로부터 선택되거나; 또는 상기 도메인이 scFv에 의해 포함되는, 폴리펩티드.
일 예에서, 본원의 단일 가변 도메인은 인간 또는 인간화 dAb 또는 나노바디이거나; 또는 낙타과 VHH 도메인이다.
일 예에서, (a)의 도메인은 단일-쇄 TCR(scTCR)에 의해 포함된다.
4. 측면 1 내지 3 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 (a)가 (c)에 직접 결합되거나; 또는 상기 (b)가 (a) 및 (c)에 직접 결합되는, 폴리펩티드.
5. 측면 1 내지 4 중 어느 한 측면에 있어서, (N-말단에서 C-말단 방향으로) SAM, (d) 임의적 제2 링커 및 (e) 제2 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
6. 측면 5에 있어서, 상기 제2 도메인이 항체 단일 가변 도메인, VH 및 VL로부터 선택되거나; 또는 상기 도메인이 scFv에 의해 포함되는, 폴리펩티드.
일 예에서, 단일 가변 도메인은 인간 또는 인간화 dAb 또는 나노바디이거나; 또는 낙타과 VHH 도메인이다.
7. 측면 5에 있어서, 상기 제2 도메인이 항체 단일 가변 도메인 또는 항체 불변 도메인인, 폴리펩티드.
8. 측면 7에 있어서, 상기 불변 도메인이 항체 Fc 영역에 의해 포함되는, 폴리펩티드.
9. 측면 5 내지 8 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 (c)가 (e)에 직접 결합되거나; 또는 상기 (d)가 (c) 및 (e)에 직접 결합되는, 폴리펩티드.
10. 측면 1 내지 9 중 어느 한 측에 있어서, 상기 TD가 p53, p63 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이거나; 또는 상기 TD가 NHR2 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그인, 폴리펩티드.
임의적으로, 본원의 TD는 표 2에 개시된 단백질의 TD이다.
11. 측면 1 내지 10 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 TD가 서열번호: 10 또는 126과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
12. 측면 1 내지 11 중 어느 한 측면에 있어서, (a) 및 (c) 사이에 (f) 항체 가변 도메인, 항체 불변 영역 또는 항체 Fc 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
13. 측면 12에 있어서, 상기 (f)가 (i) 항체 CH1 불변 도메인; 또는 (ii) 항체 Fc 영역(즉, CH2-CH3 포함)을 포함하는, 폴리펩티드.
14. 측면 13에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 (iii) 제2 폴리펩티드는 (i)의 CH1 도메인과 쌍을 이루는 항체 CL 불변 도메인을 포함하거나; 또는 (iv) 제2 폴리펩티드는 (ii)의 Fc 영역과 쌍을 이루는 제2 항체 Fc 영역을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
15. 측면 12에 있어서, 상기 (f)의 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인인, 폴리펩티드.
16. 측면 1 내지 15 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 폴리펩티드(제1 폴리펩티드)가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인, 폴리펩티드;
A. 제1 항체 단일 가변 도메인(dAb), 임의적 링커 및 상기 SAM;
B. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 항체 단일 가변 도메인;
C. 제1 scFv, 임의적 링커 및 상기 SAM;
D. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 scFv;
F. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
G. 제1 항체 가변 도메인, 임의적 제1 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 상기 SAM;
H. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
I. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 scFv;
J. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 가변 도메인; 또는
K. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 가변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 불변 도메인.
임의적으로, 각 가변 도메인은 VH 또는 VL(예를 들어, Vκ 또는 Vλ)이다.
임의적으로, 본원의 폴리펩티드의 각 도메인은 인간 도메인이다. 임의적으로, 본원의 폴리펩티드의 각 도메인은 인간 또는 인간화 도메인이다.
17. 측면 1 내지 15 중 어느 한 측면에 있어서,
(i) 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나:
A. dAb 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
G. 제1 scFv, CH2, CH3 및 SAM;
H. VH, CH1, CH2 CH3 및 SAM;
I. VL, CL, CH2, CH3 및 SAM;
J. dAb; SAM, CH2 및 CH3;
K. scFv; SAM, CH2 및 CH3;
L. VH, CH1, SAM, CH2 및 CH3;
M. VL, CL, SAM, CH2 및 CH3;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
또는
(ii) 폴리펩티드가 (C-말단에서 N-말단 방향으로) 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:
A. dAb 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
G. 제1 scFv, CH2, CH3 및 SAM;
H. VH, CH1, CH2 CH3 및 SAM;
I. VL, CL, CH2, CH3 및 SAM;
J. dAb; SAM, CH2 및 CH3;
K. scFv; SAM, CH2 및 CH3;
L. VH, CH1, SAM, CH2 및 CH3;
M. VL, CL, SAM, CH2 및 CH3;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, CH2, CH3, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb.
따라서, 일부 구현예에서 폴리펩티드는 항체 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
18. 측면 16B, 16D, (i) 17B, (i) 17D, (i) 17N, (i) 17S, (i) 17T, (i) 17U, (i) 17X, (i) 17Y, (i) 17Z, (i) 17AA, (ii) 17B, (ii) 17D, (ii) 17N, (ii) 17S, (ii) 17T, (ii) 17U, (ii) 17X, (ii) 17Y, (ii) 17Z 또는 (ii) 17AA에 있어서, 상기 단일 가변 도메인(dAb)이 동일하거나; 또는 상기 scFv가 동일한, 폴리펩티드.
19. 측면 16B, 16D, (i) 17B, (i) 17D, (i) 17N, (i) 17S, (i) 17T, (i) 17U, (i) 17X, (i) 17Y, (i) 17Z, (i) 17AA, (ii) 17B, (ii) 17D, (ii) 17N, (ii) 17S, (ii) 17T, (ii) 17U, (ii) 17X, (ii) 17Y, (ii) 17Z 또는 (ii) 17AA에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 상이하거나; 또는 상기 scFv가 상이한, 폴리펩티드.
20. 측면 16G, 16J, 16K, (i) 17H, (i) 17I, (i) 17L, (i) 17M, (i) 17O, (i) 17P, (i) 17Q, (i) 17R, (ii) 17H, (ii) 17I, (ii) 17L, (ii) 17M, (ii) 17O, (ii) 17P, (ii) 17Q 또는 (ii) 17R에 있어서, 상기 (i) 제1 가변 도메인이 VH 도메인이고 제1 불변 도메인이 CH1 도메인이고, 및 임의적으로 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CH1 도메인과 쌍을 이룬 항체 CL 불변 도메인을 포함하거나; (ii) 제1 가변 도메인이 VH 도메인이고 제1 불변 도메인이 CL 도메인이고, 임의적으로 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CL 도메인과 쌍을 이룬 항체 CH1 불변 도메인을 포함하거나; (iii) 제1 가변 도메인이 VL 도메인이고 제1 불변 도메인이 CH1 도메인이고, 임의적으로 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CH1 도메인과 쌍을 이룬 항체 CL 불변 도메인을 포함하거나; 또는 (iv) 제1 가변 도메인이 VL 도메인이고 제1 불변 도메인이 CL 도메인이고, 임의적으로 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CL 도메인과 쌍을 이룬 항체 CH1 불변 도메인을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
21. 측면 16 내지 측면 20 중 어느 한 측면에 있어서, (v) 제1 가변 도메인 또는 scFv 및 (vi) SAM 사이에 항체 Fc 영역 또는 추가의 항체 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 Fc는 CH2 및 CH3을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
이 추가의 가변 도메인은 제1 단일 가변 도메인과 상이할 수 있거나 또는 제1 단일 가변 도메인 또는 scFv의 표적 결합 특이성과 상이한 표적 결합 특이성을 가질 수 있다.
22. 측면 16 내지 21 중 어느 한 측면에 있어서, (vii) SAM 및 (viii) 대부분의 C-말단 가변 도메인 사이에 항체 Fc 영역 또는 항체 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 Fc는 CH2 및 CH3을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
23. 측면 16 내지 22 중 어느 한 측면에 있어서, N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 Fc 영역 및 대부분의 N-말단 가변 도메인 또는 scFv를 포함하며, 여기서 Fc는 CH2 및 CH3을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
24. 측면 16 내지 23 중 어느 한 측면에 있어서, N-말단에서 C-말단 방향으로 SAM 및 항체 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc는 CH2 및 CH3을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
25. 측면 17 내지 24 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 CH2가 아미노산 서열 CXXC 또는 서열번호: 180-182로부터 선택된 아미노산 서열이 없고; 임의적으로 서열번호: 183-187의 아미노산 서열이 없는, 폴리펩티드.
일 예에서, CH2는 본원에 개시된 CH2'이다. 임의적으로, CH2는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 임의적 상부 힌지 영역, 하부 힌지 영역 및 CH2 도메인을 포함하고 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 폴리펩티드를 또 다른 상기 폴리펩티드와 이량체화하는 기능을 하는 코어 힌지 영역이 없다. 임의적으로, CH2는 N-말단에서 C-말단 방향으로) 임의적 상부 힌지 영역, 하부 힌지 영역 및 CH2 도메인을 포함하고 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CXXC가 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다(임의적으로 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택된다). 임의적으로, CH2는 N-말단에서 C-말단 방향으로) 서열번호: 163-178 및 CH2 도메인으로부터 선택된 아미노산을 포함하고 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CXXC가 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다(임의적으로 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택된다). 일 구현예에서, 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180-182로부터 선택된다. 일 구현예에서, CH2(폴리펩티드)는 서열번호: 183-187의 아미노산 서열이 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG1 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG1 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDKTHT(서열번호: 183) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG2 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG2 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ERKCCVE(서열번호: 184) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG3 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 181이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG3 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT(서열번호: 185) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPRC(서열번호: 181)가 없다. 임의적으로, 대안적으로 CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDTPPP(서열번호: 186) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPRC(서열번호: 181)가 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG4 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 182이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG4 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ESKYGPP(서열번호: 187) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPSC(서열번호: 182)가 없다.
26. 측면 1 내지 25 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 제1 또는 각 링커가 (G4S)n 링커이며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인, 폴리펩티드.
일 예에서, n은 3이다. 일 예에서, n은 4이다. 일 예에서, n은 5이다.
27. 측면 1 내지 26 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 각 도메인 및 SAM이 각각 인간 도메인 및 SAM인, 폴리펩티드.
28. 측면 1 내지 27 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 각 가변 도메인 또는 scFv가 항원에 결합할 수 있는, 폴리펩티드.
일 예에서, 결합은 항원을 길항시킨다. 또 다른 예에서, 결합은 항원을 작용시킨다.
29. 측면 1 내지 28 중 어느 한 측면에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하나 초과의 항원, 임의적으로 2, 3 또는 4 개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
예를 들어, 폴리펩티드는 적어도 하나의 항-CTLA-4 결합 도메인(예를 들어, dAb 또는 scFv) 및 적어도 하나의 항-4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 적어도 하나의 항-CTLA-4 결합 도메인(예를 들어, dAb 또는 scFv) 및 적어도 하나의 항-PD-L1 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 적어도 하나의 항-CTLA-4 결합 도메인(예를 들어, dAb 또는 scFv) 및 적어도 하나의 항-PD-1 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 적어도 하나의 항-TNF 알파 결합 도메인(예를 들어, dAb 또는 scFv) 및 적어도 하나의 항-IL-17A 결합 도메인을 포함한다.
예를 들어, 폴리펩티드는 SAM의 N-말단인 제1 항원 결합 도메인(예를 들어, 상기 VH, VL, VHH, dAb, scFv 또는 Fab 가변 영역) 및 SAM의 C-말단인 제2 항원 결합 도메인(예를 들어, 상기 VH, VL, VHH, dAb, scFv 또는 Fab 가변 영역)을 포함한다. 일 예에서, 폴리펩티드는 SAM의 N-말단(예를 들어, 및 또한 제1 도메인의 N-말단; 또는 제1 도메인 및 SAM 사이)인 제3 항원 결합 도메인(예를 들어, 상기 VH, VL, VHH, dAb, scFv 또는 Fab 가변 영역)을 포함하고; 임의적으로 폴리펩티드는 SAM의 C-말단(예를 들어, 및 또한 제2 도메인의 C-말단; 또는 제2 도메인 및 SAM 사이)인 제4 항원 결합 도메인(예를 들어, 상기 VH, VL, VHH, dAb, scFv 또는 Fab 가변 영역)을 포함한다.
일 구현예에서, 제1 도메인은 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있고 제2 결합 부위는 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 예에서, 도메인은 동일한 항원 결합 특이성을 갖는다. 일 예에서, 도메인은 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는다. 일 예에서, 도메인은 상이한 항원 결합 특이성을 갖는다. 일 예에서, 도메인은 동일한 항원에 대한 상이한 에피토프 결합 특이성을 갖는다. 일 예에서, 도메인은 TNF 알파에 결합한다. 일 예에서, 도메인은 CD20에 결합한다. 일 예에서, 도메인은 PD-1에 결합한다. 일 예에서, 도메인은 PD-L1에 결합한다. 일 예에서, 도메인은 CTLA-4에 결합한다.
일 구현예에서, 제1 도메인은 4-1BB, PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고 제2 결합 부위는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 도메인은 4-1BB, PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고 제1 결합 부위는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 예에서, 제1 도메인은 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 결합 부위는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, 제3 결합 부위는 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있고 제4 결합 부위는 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 예에서, 제1 도메인은 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 결합 부위는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, 제3 결합 부위는 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있고 제4 결합 부위는 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 예에서, 제1 도메인은 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 결합 부위는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있고, 제3 결합 부위는 CTLA-4, PD-L1, CD3 또는 CD28에 특이적으로 결합할 수 있고 제4 결합 부위는 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 제1 도메인은 TNF 알파에 특이적으로 결합할 수 있고 제2 결합 부위는 IL-17(예를 들어, IL-17A)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 도메인은 TNF 알파에 특이적으로 결합할 수 있고 제1 결합 부위는 IL-17(예를 들어, IL-17A)에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 예에서, 폴리펩티드는 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-15 또는 IL-21을 포함한다. 일 예에서, 사이토카인은 절두된 사이토카인, 예를 들어, 절두된 IL-2, IL-15 또는 IL-21이다. 일 예에서, 사이토카인은 SAM의 C-말단(예를 들어, C-말단 대부분의 항원 결합 도메인의 C-말단)이다. 일 예에서, 사이토카인은 SAM의 N-말단(예를 들어, N-말단 대부분의 항원 결합 도메인의 N-말단)이다. 이들 예의 일 구현예에서, 제1 도메인은 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 예의 일 구현예에서, 제1 도메인은 4-1BB, PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 예의 일 구현예에서, 제2 도메인은 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 예의 일 구현예에서, 제2 도메인은 4-1BB, PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 예의 일 구현예에서, 제3 도메인은 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 예의 일 구현예에서, 제3 도메인은 4-1BB, PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 예의 일 구현예에서, 제4 도메인은 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, OX40, GITR, VISTA, CD40, CD28, LAG3 및 TIM-3으로부터 선택됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 예의 일 구현예에서, 제4 도메인은 4-1BB, PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있다.
30. 측면 1 내지 29 중 어느 한 측면에 따른 폴리펩티드의 다량체(임의적으로 사량체).
일 예에서, 다량체는 폴리펩티드 이량체이다.
일 예에서, 다량체는 폴리펩티드 삼량체이다.
일 예에서, 다량체는 폴리펩티드 사량체이다.
31. 측면 1 내지 30 중 어느 한 측면에 있어서, 진핵생물 세포 글리코실화를 포함하는, 폴리펩티드 또는 다량체.
32. 측면 31에 있어서, 상기 세포가 HEK293, CHO 또는 Cos 세포인, 폴리펩티드 또는 다량체.
33. 측면 1 내지 32 중 어느 한 측면에 있어서, 의학적 용도를 위한, 폴리펩티드 또는 다량체.
34. 측면 1 내지 33 중 어느 한 측면의 폴리펩티드 또는 다량체를 포함하는, 약제학적 조성물.
35. 측면 1 내지 29 및 31 내지 33 중 어느 한 측면의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
36. 측면 35의 핵산을 포함하는 진핵생물 세포 또는 벡터.
37. 항원의 다중 카피를 결합하는 방법으로, 상기 방법은 카피를 측면 30 내지 33 중 어느 한 측면의 다량체와 조합하는 단계를 포함하며, 여기서 카피는 다량체의 폴리펩티드에 의해 결합되고, 임의적으로 상기 방법은 항원 카피에 결합된 다량체를 단리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
38. 측면 37에 있어서, 상기 방법이 샘플에서 물질의 존재를 검출하기 위한 진단 방법이며, 여기서 물질은 항원을 포함하고, 상기 방법은 샘플(예를 들어, 체액, 식품, 식품 성분, 음료, 음료 성분, 토양 또는 법의학 샘플)을 제공하는 단계, 샘플을 측면 30 내지 33 중 어느 한 측면에 따른 다량체와 혼합하는 단계 및 샘플에서 항원에 대한 다량체의 결합을 겸출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
일 예에서 체액은 혈액, 타액, 정액 또는 소변 샘플이다.
일 예에서, 방법은 샘플이 이전에 수득된 대상체에서 임신 테스트하거나 또는 질환 또는 병태를 진단하기 위한 것이다.
39. 측면 34의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 또는 동물 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 이의 위험을 감소시키는 방법으로, 여기서 조성물에 의해 포함된 다량체는 대상체에서 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 결합은 치료 또는 위험 감소를 매개하는 것인, 방법.
40. 측면 39에 있어서, 상기 항원이 면역 체크포인트 또는 T-세포 공-자극 항원(예를 들어, PD-L1, PD-1 또는 CTLA4)이거나; 또는 항원이 TNF 알파 또는 IL-17A인, 방법.
41. 측면 39에 있어서, 상기 항원이 대상체에서 질환 또는 병태를 매개하고; 임의적으로 결합이 항원을 길항시키는, 방법.
또 다른 구현예에서, 결합은 항원을 작용시킨다.
42. 측면 1 내지 29 및 31 내지 33 중 어느 한 측면에 따른 복수의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로, 여기서 폴리펩티드의 적어도 90%는 상기 폴리펩티드의 사량체에 의해 포함되는 것인, 조성물.
임의적으로, 폴리펩티드의 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%는 상기 폴리펩티드의 사량체에 의해 포함된다.
43. 측면 42에 있어서, 상기 폴리펩티드의 적어도 98%가 상기 폴리펩티드의 사량체에 의해 포함되는, 조성물.
44. 측면 42 또는 43에 있어서, 상기 나머지(즉, 폴리펩티드의 100%에 대한 나머지) 폴리펩티드가 폴리펩티드 단량체, 이량체 및 삼량체 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
45. 측면 1 내지 29 및 31 내지 33 중 어느 한 측면에 따른 복수의 폴리펩티드를 포함하는 조성물(임의적으로 측면 42 내지 44 중 어느 한 측면에 따른 조성물)을 생산하는 방법으로, 상기 방법은 측면 34에 따른 진핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 폴리펩티드의 사량체의 세포로부터 발현 및 분비시키는 단계, 및 임의적으로 사량체를 단리 또는 정제하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
이들 측면 중 임의의 것은 본원의 임의의 다른 개시내용, 예를 들어, 조항 또는 단락 중 임의의 것과 조합가능하다.
FC를 포함하는 폴리펩티드 및 다량체
본 발명은 또한 항체 Fc 영역(들)을 포함하는 폴리펩티드 및 다량체를 제공한다. 이는 예를 들어, 인간 또는 동물과 같은 대상체에게 투여될 때 FcRn 재순환을 활용하는 데 유용하며, 생체내에서 바람직한 반감기에 기여할 수 있다. Fc 영역은 또한 Fc 이펙터 기능을 제공하는 데 유용하다. 예를 들어, IgG1 Fc는 다량체를 사용하여 암을 치료하는 경우 또는 세포 사멸이 예를 들어, ADCC에 의해 바람직한 경우 유용할 수 있다.
이를 위해, 본 발명은 다음을 제공한다:
항체 CH2 및 항체 CH3을 포함하는, 항체 Fc 영역; 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM)을 포함하는 폴리펩티드로; 여기서 CH2는 항체 힌지 서열을 포함하고 코어 힌지 영역이 없다.
일 구현예에서, 폴리펩티드는 에피토프 결합 부위, 예를 들어, 항체 VH 단일 가변 도메인 또는 에피토프에 결합하는 항체 VH/VL 쌍을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 폴리펩티드는 항체에 동족인 에피토프를 포함한다. 이는 예를 들어, 다량체가 항체를 포함하는 샘플과 접촉되는 경우와 같이(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 의학적 용도를 위해), 폴리펩티드가 항체의 카피에 결합하는 다량체를 형성할 수 있을 때 유용하다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 다량체는 샘플에서 항체의 존재 및/또는 양(또는 상대량)을 결정하기 위한 진단 또는 시험 방법에 사용될 수 있다. 다량체가 에피토프의 다중 카피(다량체에 의해 포함된 각 폴리펩티드에 대해 적어도 하나)를 제공하므로, 이는 샘플에 상대적으로 소량으로 존재할 수 있는 항체의 많은 카피에 결합하는 데 유용하며, 이에 의해 항체의 존재를 나타내는 양성 신호를 검출(또는 증폭)할 가능성을 향상시키는 효과를 가질 수 있다. 따라서, 검정 민감도는 샘플에서 상대적으로 희귀한 항체를 검출할 수 있도록 향상될 수 있다.
임의적으로, CH2는 (i) 코어 힌지 CXXC 아미노산 서열, 여기서 X는 임의의 아미노산이거나 또는 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택되는 것; 및/또는 (ii) 상부 힌지 아미노산 서열이 없다. CH2의 경우 (i) 코어 힌지 CXXC 아미노산 서열이 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이거나 또는 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택되고 Fc는 또 다른 Fc와 직접 쌍을 이루지 않는다.
임의적으로, CXXC 서열은 서열번호: 180-182로부터 선택되거나; 또는 CH2는 서열번호: 183-187의 아미노산 서열이 없다.
임의적으로, CH2는 다음을 포함한다:
A. 아미노산 서열 APELLGGPSV(서열번호: 163), 또는 PAPELLGGPSV(서열번호: 164);
B. 아미노산 서열 APPVAGPSV(서열번호: 165), 또는 PAPPVAGPSV(서열번호: 166);
C. 아미노산 서열 APEFLGGPSV(서열번호: 175), 또는 PAPEFLGGPSV(서열번호: 176);
D. 아미노산 서열 EPKSCDKTHT[P]APELLGGPSV(서열번호: 167 또는 168), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
E. 아미노산 서열 ERKCCVE[P]APPVAGPSV(서열번호: 169 또는 170), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
F. 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT[P]APELLGGPSV(서열번호: 171 또는 172), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
G. 아미노산 서열 EPKSCDTPPP[P]APELLGGPSV(서열번호: 173 또는 174), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임; 또는
H. 아미노산 서열 ESKYGPP[P]APEFLGGPSV(서열번호: 177 또는 178), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임.
임의적으로, CH2는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 임의적 상부 힌지 영역, 하부 힌지 영역 및 CH2 도메인을 포함하고 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 폴리펩티드를 또 다른 상기 폴리펩티드로 이량체화하는 기능을 하는 코어 힌지 영역이 없다. 임의적으로, CH2는 N-말단에서 C-말단 방향으로) 임의적 상부 힌지 영역, 하부 힌지 영역 및 CH2 도메인을 포함하고 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CXXC가 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다(임의적으로 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택됨). 임의적으로, CH2는 N-말단에서 C-말단 방향으로) 서열번호: 163-178로부터 선택된 아미노산 및 CH2 도메인을 포함하고 여기서 CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CXXC가 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다(임의적으로 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택됨). 일 구현예에서, 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180-182로부터 선택된다. 일 구현예에서, CH2(폴리펩티드)는 서열번호: 183-187의 아미노산 서열이 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG1 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG1 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDKTHT(서열번호: 183) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG2 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG2 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ERKCCVE(서열번호: 184) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPPC(서열번호: 180)가 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG3 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 181이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG3 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT(서열번호: 185) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPRC(서열번호: 181)가 없다. 임의적으로, 대안적으로 CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDTPPP(서열번호: 186) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPRC(서열번호: 181)가 없다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG4 CH2 도메인이고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 182이다. 임의적으로, 폴리펩티드에 존재하는 임의의 CH1 및 CH3은 각각 인간 IgG4 CH1 및 CH3이다. 임의적으로, CH2(및 폴리펩티드)는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ESKYGPP(서열번호: 187) 및 코어 힌지 영역 아미노산 서열 CPSC(서열번호: 182)가 없다.
임의적으로, 폴리펩티드는 코어 영역-CH2-CH3이 없는 항체 CH1-힌지 서열을 포함한다.
임의적으로, CH2 및 CH3은 다음을 포함한다:
A. 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인;
B. 인간 IgG2 CH2 및 CH3 도메인;
C. 인간 IgG3 CH2 및 CH3 도메인; 또는
D. 인간 IgG4 CH2 및 CH3 도메인.
임의적으로, CH2 및 CH3은 다음을 포함한다:
(a) 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인 및 힌지 서열 및 코어 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 서열 및 힌지 영역임;
(b) 인간 IgG2 CH2 및 CH3 도메인 및 힌지 서열 및 코어 힌지 영역은 인간 IgG2 힌지 서열 및 힌지 영역임;
(c) 인간 IgG3 CH2 및 CH3 도메인 및 힌지 서열 및 코어 힌지 영역은 인간 IgG31 힌지 서열 및 힌지 영역임; 또는
(d) 인간 IgG4 CH2 및 CH3 도메인 및 힌지 서열 및 코어 힌지 영역은 인간 IgG4 힌지 서열 및 힌지 영역임
임의적으로,
A. CH2 도메인은 인간 IgG1 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDKTHT(서열번호: 183)가 없거나;
B. CH2 도메인은 인간 IgG2 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 180이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ERKCCVE(서열번호: 184)가 없거나;
C. CH2 도메인은 인간 IgG3 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 181이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT(서열번호: 185) 또는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDTPPP(서열번호: 186)가 없거나; 또는
D. CH2 도메인은 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열은 서열번호: 182이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ESKYGPP(서열번호: 187)가 없다.
임의적으로, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) Fc 영역 및 SAM을 포함하며, Fc 영역은 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 힌지 서열, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
임의적으로, 폴리펩티드는 하나 이상의 에피토프 결합 부위, 예를 들어, 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 가변 도메인을 포함한다. 임의적으로, 제1 에피토프는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원(예를 들어, 인간 항원)에 의해 포함된다: ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AWI; AIG1; AKAP1; AKAP2; AIYIH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1(아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRl (MDR15); BlyS; BM Pl; BMP2; BMP3B(GDFIO); BMP4; BMP6; BM P8; BMPRIA; BMPRIB; BM PR2; BPAG1(플렉틴); BRCA1; CI9orflO(IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2(D6 / JAB61); CCL1(1-309); CCL11(에오탁신); CCL13(MCP-4); CCL15(MIP-id); CCL16(HCC-4); CCL17(TARC); CCL18(PARC); CCL19(M IP-3b); CCL2(MCP-1); MCAF; CCL20(MIP-3a); CCL21(MIP-2); SLC; 엑소더스-2; CCL22(MDC / STC-1); CCL23(M PIF-1); CCL24(MPIF-2 I 에오탁신-2); CCL25(TECK); CCL26(에오탁신-3); CCL27(CTAC /ILC); CCL28; CCL3(MIP-la); CCL4(M IP-lb); CCL5(RANTES); CCL7(MCP-3); CCL8(mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1(CKR1 / HM145); CCR2(mcp-1RB / RA);CCR3(CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5(CM KBR5 / ChemR13); CCR6(CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7(CKR7 / EBI1); CCR8(CM KBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9(GPR-9-6); CCRL1(VSHK1); CCRL2(L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1(E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p2IWapl/Cipl); CDKN1B(p27Kipl); CDKNIC; CDKN2A(pl6INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7(클라우딘-7); CLN3; CLU(클러스테린); CMKLR1; CMKOR1(RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFl(M-CSF); CSF2(GM-CSF); CSF3(GCSF); CTLA4; CTNNBl(b-카테닌); CTSB(카텝신 B); CX3CL1(SCYDi); CX3CR1(V28); CXCL1(GROl); CXCLIO(IP-10); CXCL11(l-TAC / IP-9); CXCL12(SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2(GR02); CXCL3(GR03); CXCL5(ENA-78 I LIX); CXCL6(GCP-2); CXCL9(MIG); CXCR3(GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6(TYMSTR ISTRL33 I Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; EN01; EN02; EN03; EPHB4; EPO; ERBB2(Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3(TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1(aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2(bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3(int-2); FGF4(HST); FGF5; FGF6(HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF(VEGFD); FILl(엡실론); FILl(ZETA); FU12584; FU25530; FLRTl(피브로넥틴); FLTl; FOS; FOSLl(FRA-I); FY(DARC); GABRP(GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-65T; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRHl; GPR2(CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81(FKSG80); GRCCIO(CIO); GRP; GSN(겔솔린); GSTPl; HAVCR2; HDAC4; EDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; TFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; 1L13; IL13RA1; IL13RA2; 1L14; 1L15; IL15RA; IL16; 1L17; IL17B; IL17C; IL17R; 1L18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; 1L19; ILIA; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1;IL1RL2 IL1RN; 1L2; 1L20; IL20RA; IL21R; 1L22; 1L22R; 1L22RA2; 1L23; 1L24; 1L25; 1L26; 1L27; 1L28A; 1L28B; 1L29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; 1L3; 1L30; IL3RA; 1L4; IL4R; 1L5; IL5RA; 1L6; IL6R; IL6ST(당단백질 130); 1L7; TL7R; 1L8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; 1L9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; IRAK2; ITGA1; ITGA2; 1TGA3; ITGA6(a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4(b 4 인테그린); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; MTLG; KLF5(GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19(케라틴 19); KRT2A; KRTHB6(모발-특이적 유형 II 케라틴); LAMA5; LEP(렙틴); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA(TNF-b); LTB; LTB4R(GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp; MAP2K7(c-Jun); MDK; M IB1; 미드카인; M IF; M IP-2; MK167(Ki-67); MMP2; M MP9; MS4A1; MSMB; MT3(메탈로티오넥틴-ifi); MTSS 1; M UC 1(뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKB 1; NFKB2; NGFB(NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66(Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NM E1(NM23A); NOX5; NPPB; NROB1; NROB2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4(CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU(uPA); PLG; PLXDC1; PPBP(CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2(COX-2); PTN; RAC2(p2IRac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110(ZNF144); ROB02; S100A2; SCGB1D2(리포필린 B); SCGB2A1(맘마글로빈 2); SCGB2A2(맘마글로빈 1); SCYE1(내피 단핵구-활성화 사이토카인); SDF2; SERPINA1; SERPINIA3; SERPINB5(마스핀); SERPINE1(PAT-i); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPl; SPRRIB(Spri); ST6GAL1; STABl; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1(트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE(Tie-i); T]MP3; 조직 인자; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAIP2(B94); TNFAIP3; TNFRSF1 1A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6(Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO(TRAIL); TNFSF1 1(TRANCE); TNFSF12(AP03L); TNFSF13(April); TNFSF13B; TNFSF14(HVEM-L); TNFSF1 5(VEGI); TNFSF1 8; TNFSF4(0X40 리간드); TNFSF5(CD40 리간드); TNFSF6(FasL); TNFSF7(CD27 리간드); TNFSF8(CD30 리간드); TNFSF9(4-lBB 리간드); TOLLIP; Toll-유사 수용체; TOP2A(토포이소머라제 lia); TP53; TPM 1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM 1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1(림포택틴); XCL2(SCM-lb); XCR1(GPR5 / CCXCR1); YY1; 및 ZFPM2. 임의적으로, 제2 에피토프(아래에 논의된 바와 같음)는 제1 에피토프(예를 들어, 동일한 항원 분자에 의해 포함됨)와 동일한 항원에 의해 포함된다. 또 다른 예에서, 제2 항원은 상기 군에 의해 포함된다. 일 예에서, 제1 및 제2 에피토프는 상기 군으로부터 선택된 상이한 항원에 의해 포함된다.
예를 들어, 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4 또는 5 개 에피토프 결합 부위를 갖는다(임의적으로 여기서 폴리펩티드는 상이한 에피토프에 결합하는 2 개 이상의 결합 부위(예를 들어, 단일 가변 도메인)를 포함하거나, 또는 여기서 폴리펩티드 결합 부위는 동일함). 일 구현예에서, SAM은 TD(예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD)이고 폴리펩티드는 2, 3 또는 4 개의 결합 부위, 예컨대 3 개의 부위 또는 예컨대 4 개의 부위를 갖는다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 3 개의 결합 부위를 갖는다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 4 개의 결합 부위를 갖는다. 예를 들어, 결합 부위 각각은 TNF 알파에 결합한다(예를 들어, 여기서 결합 부위는 동일하며, 예를 들어, 동일한 항체 단일 가변 도메인임).
일 예에서, 다량체는 항-PD-L1 결합 부위의 4 개의 카피(예를 들어, dAb) 및 항-4-1BB 결합 부위의 4 개의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 이중특이적 다량체이다.
일 예에서, 다량체는 항-PD-L1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-PD-L1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-PD-L1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-PD-L1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 일 예에서, 항-PD-L1 결합 부위는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 아벨루맙 또는 아테졸리주맙 결합 부위를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, 다량체는 항-PD-1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-PD-1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-PD-1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-PD-1 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 일 예에서, 항-PD-1 결합 부위는 PD-1에 특이적으로 결합하는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 결합 부위를 포함한다. 바람직하게는, 이들 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, 다량체는 항-DR5(사멸 수용체 5) 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-DR5 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-DR5 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-DR5 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 바람직하게는, 이러한 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, 다량체는 항-OX40 또는 OX40L 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-OX40 또는 OX40L 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-OX40 또는 OX40L 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-OX40 또는 OX40L 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 바람직하게는, 이러한 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, 다량체는 항-글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR) 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-GITR 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-GITR 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-GITR 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 바람직하게는, 이러한 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, 다량체는 항-항체 카파 경쇄(KLC) 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-KLC 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-KLC 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-KLC 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 바람직하게는, 이러한 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, 다량체는 항-VEGF 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-VEGF 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-VEGF 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-VEGF 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 일 예에서, 항-VEGF 결합 부위는 VEGF(예를 들어, 인간 flt(예를 들어, flt-1) 또는 KDR의 VEGF 결합 부위, 예를 들어, VEGFR1로부터의 Ig 도메인 2 또는 VEGFR2로부터의 Ig 도메인 3))에 특이적으로 결합하는 VEGF 수용체 도메인을 포함한다. 일 예에서, 항-VEGF 결합 부위는 VEGF에 특이적으로 결합하는 아플리버셉트, 베바시주맙 또는 라니비주맙 결합 부위를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
일 예에서, 다량체는 항-TNF 알파 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-TNF 알파 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 4가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-TNF 알파 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 8가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-TNF 알파 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 12-가 다량체이다. 일 예에서, 다량체는 항-TNF 알파 결합 부위의 카피(예를 들어, dAb)를 포함하는 16-가 다량체이다. 바람직하게는, 이러한 예에서 SAM 도메인은 TD, 예를 들어, p53 TD, 예컨대 인간 p53 TD이다. 사량체의 경우, 각 폴리펩티드는 결합 부위의 하나의 카피를 포함한다. 팔량체의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 2 개의 카피를 포함한다. 12-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 3 개의 카피를 포함한다. 16-mer의 경우 각 폴리펩티드는 결합 부위의 4 개의 카피를 포함한다.
임의적으로, 가변 도메인은 항체 단일 가변 도메인, VH 및 VL로부터 선택되거나; 또는 여기서 도메인은 scFv에 의해 포함된다. 임의적으로, 도메인은 상기 제1 에피토프에 결합하는 항체 VH/VL 쌍에 의해 포함된다. 일 예에서, 본원에서 에피토프 결합은 본원에 정의된 바와 같은 특이적 결합이다.
임의적으로, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함한다:
A. 가변 도메인, SAM 및 Fc 영역;
B. Fc 영역, SAM 및 가변 도메인;
C. 가변 도메인, Fc 영역 및 SAM;
D. SAM, 가변 도메인 및 Fc 영역; 또는
E. SAM, Fc 영역 및 가변 도메인.
임의적으로, 폴리펩티드는 SAM에 대한 2 항체 가변 도메인 N-말단 또는 C-말단을 포함하며, 여기서 제2 가변 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 동일하거나 또는 상이하다.
임의적으로, SAM은 자기-회합 사량체화 도메인(TD)이며; 임의적으로 여기서 TD는 p53, p63 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이거나; 또는 여기서 TD는 NHR2 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이거나; 또는 여기서 TD는 서열번호: 10 또는 126과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
임의적으로,
(i) 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나:
A. 제1 항체 단일 가변 도메인(dAb), 임의적 링커 및 상기 SAM;
B. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 항체 단일 가변 도메인;
C. 제1 scFv, 임의적 링커 및 상기 SAM;
D. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 scFv;
F. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
G. 제1 항체 가변 도메인, 임의적 제1 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 상기 SAM;
H. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
I. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 scFv;
J. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 가변 도메인; 또는
K. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 가변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 불변 도메인;
또는
(ii) 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나:
A. dAb 및 SAM;
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb;
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, Fc 영역 및 SAM;
G. 제1 scFv, Fc 영역 및 SAM;
H. VH, CH1, Fc 영역 및 SAM;
I. VL, CL, Fc 영역 및 SAM;
J. dAb; SAM 및 Fc 영역;
K. scFv; SAM 및 Fc 영역;
L. VH, CH1, SAM 및 Fc 영역;
M. VL, CL, SAM 및 Fc 영역;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
또는
(iii) 폴리펩티드는 (C-말단에서 N-말단 방향으로) 다음을 포함한다:
A. dAb 및 SAM;
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb;
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, Fc 영역 및 SAM;
G. 제1 scFv, Fc 영역 및 SAM;
H. VH, CH1, Fc 영역 및 SAM;
I. VL, CL, Fc 영역 및 SAM;
J. dAb; SAM 및 Fc 영역;
K. scFv; SAM 및 Fc 영역;
L. VH, CH1, SAM 및 Fc 영역;
M. VL, CL, SAM 및 Fc 영역;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb.
임의적으로, 본원에서 임의의 단일 가변 도메인 또는 dAb는 Nanobody™ 또는 낙타과 VHH(예를 들어, 인간화 낙타과 VHH)이다.
일 구현예에서, 다량체의 각 폴리펩티드는 추가의 폴리펩티드의 카피와 쌍을 이루며, 여기서 추가의 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드의 Fc와 쌍을 이루는 항체 경쇄 불변 영역(예를 들어, Cκ 또는 Cλ)을 포함한다. 일 예에서, 제1 폴리펩티드는 항체 VH 도메인을 포함하고, 추가의 폴리펩티드는 항체 VL 도메인(예를 들어, Vκ 또는 Vλ)을 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 에피토프 결합 부위를 형성한다. 이 방식으로, 다량체는 하기 실시예에 예시된 바와 같이 아달리무맙(Humira) 또는 아벨루맙(Bavencio) 결합 부위의 다중 카피를 포함하는 것과 같은, Fab-유사 구조의 다량체일 수 있다. 이러한 다량체에서 모든 항체 도메인은 예를 들어, 인간일 수 있고, 임의적으로 SAM은 인간 도메인이다. SAM이 TD(예를 들어, p53 TD)인 경우, 다량체는 VH/VL 에피토프 결합 부위의 사량체를 포함한다. 제1 폴리펩티드 또는 추가의 폴리펩티드는 제2 에피토프 결합 부위를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 다량체는 8가이다. 8 개의 결합 부위가 동일한 항원에 결합할 수 있는 경우; 대안적으로 4 개의 VH/VL 결합 부위가 제1 항원에 결합하고 다른 4 개의 결합 부위가 제2 항원에 결합하며, 여기서 항원은 상이하다. 따라서, 다량체는 8가 및 이중특이적일 수 있다. 제1 또는 추가의 폴리펩티드가 또한 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 경우, 다량체는 12-가(및, 예를 들어, 항원 결합에 대해 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적)일 수 있다. 제1 또는 추가의 폴리펩티드가 또한 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 경우, 다량체는 16-가(및, 예를 들어, 항원 결합에 대해 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적)일 수 있다.
본 발명은 추가로 다음을 제공한다:-
본 발명에 따른 폴리펩티드의 다량체(임의적으로 사량체)로; 임의적으로 여기서 다량체는 의학적 용도를 위한 것이다. 일 예에서, 본원의 의학적 용도는 암, 자가면역 질환 또는 병태 또는 본원에 개시된 임의의 다른 질환 또는 병태의 치료 또는 예방이다.
복수의 항체 Fc 영역의 다량체로, 여기서 각 Fc는 각각의 폴리펩티드에 의해 포함되고 또 다른 Fc 영역과 쌍을 이루지 않으며; 임의적으로 여기서 다량체는 의학적 용도를 위한 것이다. 임의적으로, 각 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같은 에피토프 결합 도메인 또는 부위를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 다량체를 포함하는 약제학적 조성물.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로; 임의적으로 여기서 핵산은 진핵생물 세포 또는 벡터에 의해 포함된다.
항원의 다중 카피에 결합하는 방법으로, 상기 방법은 카피를 본 발명의 다량체 또는 조성물과 조합하는 단계를 포함하며, 여기서 카피는 다량체의 폴리펩티드에 의해 결합되고, 임의적으로 상기 방법은 항원 카피에 결합된 다량체를 단리하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 다량체는 항원의 카피를 포함하는 샘플과 접촉되고 항원의 카피는 다량체에 대한 결합에 의해 샘플에서 격리된다. 예를 들어, 다량체는 인간 또는 동물 환자에게 투여되고(또는 환경이 다량체에 노출됨) 항원 카피는 인간(예를 들어, 상기 의학적 용도를 위해), 동물(예를 들어, 상기 의학적 용도를 위해) 또는 환경에서 격리된다. 예를 들어, 환경은 예를 들어, 항원이 환경 오염물질 또는 오염물에 의해 포함되는 경우와 같은, 환경 복원을 위해 토양, 수원, 수로 또는 산업용 유체에 의해 포함된다. 일 예에서, 상기 방법은 샘플을 정제하기 위한 것 또는 샘플에 의해 포함된 항원을 단리하기 위한 것이다.
인간 또는 동물 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 이의 위험을 감소시키는 방법으로, 상기 방법은 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물에 의해 포함된 다량체는 대상체에서 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 결합은 질환 또는 병태의 치료 또는 위험의 감소를 매개한다.
본 발명에 따른 복수의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 생성하는 방법으로, 여기서 SAM은 자기-회합 사량체화 도메인(TD)이며, 상기 방법은 본 발명에 따른 진핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 숙주 세포를 배양하는 단계, 폴리펩티드의 사량체의 세포로부터 발현 및 분비를 허용하는 단계, 및 임의적으로 사량체를 단리 또는 정제하는 단계를 포함한다.
단락:
본 발명은 다음 단락을 제공한다.
1. 다음을 포함하는 (임의적으로 본원의 임의의 폴리펩티드에 따른) 폴리펩티드로서:
(a) Fc 영역이 항체 CH2 도메인 및 항체 CH3 도메인을 포함하는, 항체 Fc 영역; 및
(b) 자기-회합 다량체화 도메인(SAM);
여기서 CH2는 코어 힌지 CXXC 아미노산 서열이 없으며, 여기서 X는 임의의 아미노산인, 폴리펩티드.
2. 단락 1에 있어서, 상기 각 아미노산 X가 P, R 및 S로부터 선택되는, 폴리펩티드.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 CH2가 완전한 상부 힌지 서열이 없는, 폴리펩티드.
4. 단락 1 내지 3 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CH2가 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
(a) APELLGGPSV 아미노산 서열, 또는 PAPELLGGPSV 아미노산 서열;
(b) APPVAGPSV 아미노산 서열, 또는 PAPPVAGPSV 아미노산 서열; 또는
(c) APEFLGGPSV 아미노산 서열, 또는 PAPEFLGGPSV 아미노산 서열.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CH2 및 CH3이 다음과 같은 것인, 폴리펩티드:
(a) 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인;
(b) 인간 IgG2 CH2 및 CH3 도메인;
(c) 인간 IgG3 CH2 및 CH3 도메인; 또는
(d) 인간 IgG4 CH2 및 CH3 도메인.
6. CH2에 CPPC 서열이 없는 단락 5(a) 또는 (b)의 폴리펩티드; 또는 CH2에 CPRC 서열이 없는 단락 5(c)의 폴리펩티드; 또는 CH2에 CPSC 서열이 없는 단락 5(d)의 폴리펩티드.
7. 단락 1 내지 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CH2가 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
(a) APELLGGPSV 아미노산 서열;
(b) EPKSCDKTHT[P]APELLGGPSV 아미노산 서열, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
(c) APPVAGPSV 아미노산 서열;
(d) ERKCCVE[P]APPVAGPSV 아미노산 서열, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
(e) ELKTPLGDTTHT[P]APELLGGPSV 아미노산 서열, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
(f) EPKSCDTPPP[P]APELLGGPSV 아미노산 서열, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임; 또는
(g) APEFLGGPSV 아미노산 서열; 또는
(h) ESKYGPP[P]APEFLGGPSV 아미노산 서열, 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 CH2가 본원에 개시된 CXXC 및 서열번호: 180-182로부터 선택된 서열이 없는 것인, 폴리펩티드.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 가변 도메인을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
10. 단락 9에 있어서, 상기 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인, VH 및 VL로부터 선택되거나; 또는 도메인이 scFv에 의해 포함되는, 폴리펩티드.
11. 단락 1 내지 10 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 Fc 영역이 SAM의 3'인, 폴리펩티드.
12. 단락 9, 10 또는 11에 있어서,
(a) 가변 도메인이 SAM의 5'이고 Fc 영역이 SAM의 3'이거나;
(b) 가변 도메인이 SAM의 3'이고 Fc 영역이 SAM의 5'이거나;
(c) 가변 도메인 및 Fc가 SAM의 5'이거나; 또는
(d) 가변 도메인 및 Fc가 SAM의 3'인, 폴리펩티드.
13. 단락 12에 있어서, SAM의 제2 가변 도메인 5' 또는 3'을 포함하며, 여기서 제2 가변 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 동일하거나 또는 상이한 것인, 폴리펩티드.
14. 단락 13에 있어서, 상기 에피토프가 동일한 항원의 상이한 에피토프이거나, 또는 상이한 항원의 에피토프인, 폴리펩티드.
15. 단락 13 또는 14에 있어서, 상기 제2 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인, VH 및 VL로부터 선택되거나; 또는 상기 도메인이 scFv에 의해 포함되는, 폴리펩티드.
16. 단락 15에 있어서, 상기 제2 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인 또는 항체 불변 도메인인, 폴리펩티드.
17. 단락 1 내지 16 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 SAM이 자기-회합 사량체화 도메인(TD)인, 폴리펩티드.
18. 단락 17에 있어서, 상기 TD가 p53, p63 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이거나; 또는 상기 TD가 NHR2 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그인, 폴리펩티드.
19. 단락 17 또는 18에 있어서, 상기 TD가 서열번호: 10 또는 126과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
20. 단락 1 내지 19 중 어느 한 단락에 있어서, 항체 CH1 불변 도메인, 임의적으로 CH1-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 CH2 및 CH3은 상기 Fc 영역에 의해 포함되는 것인, 폴리펩티드.
21. 단락 1 내지 20 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리펩티드(제1 폴리펩티드)가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 폴리펩티드:
A. 제1 항체 단일 가변 도메인(dAb), 임의적 링커 및 상기 SAM;
B. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 항체 단일 가변 도메인;
C. 제1 scFv, 임의적 링커 및 상기 SAM;
D. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 scFv;
F. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
G. 제1 항체 가변 도메인, 임의적 제1 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 상기 SAM;
H. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
I. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 scFv;
J. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 가변 도메인; 또는
K. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 가변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 불변 도메인.
22. 단락 1 내지 20 중 어느 한 단락에 있어서,
(i) 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나:
A. dAb 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM);
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb;
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, Fc 영역 및 SAM;
G. 제1 scFv, Fc 영역 및 SAM;
H. VH, CH1, Fc 영역 및 SAM;
I. VL, CL, Fc 영역 및 SAM;
J. dAb; SAM 및 Fc 영역;
K. scFv; SAM 및 Fc 영역;
L. VH, CH1, SAM 및 Fc 영역;
M. VL, CL, SAM 및 Fc 영역;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
또는
(ii) 폴리펩티드가 (C-말단에서 N-말단 방향으로) 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:
A. dAb 및 자기-회합 다량체화 도메인(SAM);
B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb;
C. 제1 scFv 및 SAM;
D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
F. 제1 dAb, Fc 영역 및 SAM;
G. 제1 scFv, Fc 영역 및 SAM;
H. VH, CH1, Fc 영역 및 SAM;
I. VL, CL, Fc 영역 및 SAM;
J. dAb; SAM 및 Fc 영역;
K. scFv; SAM 및 Fc 영역;
L. VH, CH1, SAM 및 Fc 영역;
M. VL, CL, SAM 및 Fc 영역;
N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
O. VH, CH1 및 SAM;
P. VL, CL 및 SAM;
Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
V. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제2 dAb;
W. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv;
X. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역 및 SAM;
Y. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제3 dAb;
Z. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv; 또는
AA. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb.
23. 단락 21B, 21D, (i) 22B, (i) 22D, (i) 22N, (i) 22S, (i) 22T, (i) 22U, (i) 22X, (i) 22Y, (i) 22Z, (i) 22AA, (ii) 22B, (ii) 22D, (ii) 22N, (ii) 22S, (ii) 22T, (ii) 22U, (ii) 22X, (ii) 22Y, (ii) 22Z 또는 (ii) 22AA에 있어서, 상기 단일 가변 도메인(dAb)이 동일하거나; 또는 상기 scFv가 동일한 것인, 폴리펩티드.
24. 단락 21B, 21D, (i) 22B, (i) 22D, (i) 22N, (i) 22S, (i) 22T, (i) 22U, (i) 22X, (i) 22Y, (i) 22Z, (i) 22AA, (ii) 22B, (ii) 22D, (ii) 22N, (ii) 22S, (ii) 22T, (ii) 22U, (ii) 22X, (ii) 22Y, (ii) 22Z 또는 (ii) 22AA에 있어서, 상기 단일 가변 도메인이 상이하거나; 또는 상기 scFv가 상이한 것인, 폴리펩티드.
25. 단락 21G, 21J, 21K, (i) 22H, (i) 22I, (i) 22L, (i) 22M, (i) 22O, (i) 22P, (i) 22Q, (i) 22R, (ii) 22H, (ii) 22I, (ii) 22L, (ii) 22M, (ii) 22O, (ii) 22P, (ii) 22Q 또는 (ii) 22R에 있어서, 상기 (i) 제1 가변 도메인이 VH 도메인이고 제1 불변 도메인이 CH1 도메인이고, 임의적으로 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CH1 도메인과 쌍을 이루는 항체 CL 불변 도메인을 포함하거나; (ii) 제1 가변 도메인이 VH 도메인이고 제1 불변 도메인이 CL 도메인이고, 임의적으로 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CL 도메인과 쌍을 이루는 항체 CH1 불변 도메인을 포함하거나; (iii) 제1 가변 도메인이 VL 도메인이고 제1 불변 도메인이 CH1 도메인이고, 임의적으로 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CH1 도메인과 쌍을 이루는 항체 CL 불변 도메인을 포함하거나; 또는 (iv) 제1 가변 도메인은 VL 도메인이고 제1 불변 도메인은 CL 도메인이고, 임의적으로 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 회합되며, 여기서 제2 폴리펩티드는 CL 도메인과 쌍을 이루는 항체 CH1 불변 도메인을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
26. 단락 21 내지 25 중 어느 한 단락에 있어서, (v) 제1 가변 도메인 또는 scFv 및 (vi) SAM 사이에 항체 Fc 영역 또는 항체 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기서 Fc는 CH2 및 CH3을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
27. 단락 21 내지 26 중 어느 한 단락에 있어서, (i) SAM 및 (ii) 대부분의 C-말단 가변 도메인 사이에 Fc 영역 또는 항체 단일 가변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
28. 단락 21 내지 27 중 어느 한 단락에 있어서, N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 Fc 영역 및 대부분의 N-말단 가변 도메인 또는 scFv를 포함하는, 폴리펩티드.
29. 단락 21 내지 28 중 어느 한 단락에 있어서, N-말단에서 C-말단 방향으로 SAM 및 항체 Fc 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
30. 단락 21 내지 29 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 제1 또는 각 링커가(G4S)n 링커이며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인, 폴리펩티드.
31. 단락 1 내지 30 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 각 도메인 및 SAM이 각각 인간 도메인 및 SAM인, 폴리펩티드.
32. 단락 1 내지 31 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하나 초과의 항원, 임의적으로 2, 3 또는 4 개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
33. 단락 1 내지 32 중 어느 한 단락에 따른 폴리펩티드의 다량체(임의적으로 사량체).
34. 복수의 항체 Fc 영역의 다량체로, 여기서 각 Fc는 각각의 폴리펩티드에 의해 포함되고 또 다른 Fc 영역과 쌍을 이루지 않는 것인, 다량체.
35. 단락 34에 있어서, 상기 다량체가 적어도 4 개의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 사량체인, 다량체.
36. 단락 34 또는 35에 있어서, 상기 각 Fc 영역이 동일한 것인, 다량체.
37. 단락 33 내지 36 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 각 Fc가 CH2 및 CH3을 포함하며, 여기서 각 CH2는 단락 1 내지 32 중 어느 한 단락에 인용된 바와 같은 CH2인, 다량체.
38. 단락 1 내지 37 중 어느 한 단락에 있어서, 진핵생물 세포 글리코실화를 포함하는, 폴리펩티드 또는 다량체.
39. 단락 38에 있어서, 상기 세포가 HEK293, CHO 또는 Cos 세포인, 폴리펩티드 또는 다량체.
40. 의학적 용도를 위한 단락 1 내지 39 중 어느 한 단락의 폴리펩티드 또는 다량체.
41. 단락 1 내지 40 중 어느 한 단락의 폴리펩티드 또는 다량체를 포함하는 약제학적 조성물.
42. 단락 1 내지 32 및 38 내지 40 중 어느 한 단락의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
43. 단락 42의 핵산을 포함하는 진핵생물 세포 또는 벡터.
44. 항원의 다중 카피에 결합하는 방법으로, 상기 방법은 카피를 단락 33 내지 40 중 어느 한 단락의 다량체와 조합하는 단계를 포함하며, 여기서 카피는 다량체의 폴리펩티드에 의해 결합되고, 임의적으로 상기 방법이 항원 카피에 결합된 다량체를 단리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
45. 단락 37에 있어서, 상기 방법이 샘플에서 물질의 존재를 검출하는 진단 방법이며, 여기서 물질은 항원을 포함하며, 상기 방법은 샘플(예를 들어, 체액, 식품, 식품 성분, 음료, 음료 성분, 토양 또는 법의학 샘플)을 제공하는 단계, 샘플을 단락 33 내지 40 중 어느 한 단락에 따른 다량체와 혼합하는 단계 및 샘플에서 항원에 대한 다량체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
46. 인간 또는 동물 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 이의 위험을 감소시키는 방법으로, 상기 방법은 단락 41의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물에 의해 포함된 다량체는 대상체에서 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 결합은 치료 또는 위험 감소를 매개하는 것인, 방법.
47. 단락 46에 있어서, 상기 항원이 면역 체크포인트 항원(예를 들어, PD-L1, PD-1 또는 CTLA4)이거나; 또는 상기 항원이 TNF 알파 또는 IL-17A인, 방법.
48. 단락 46에 있어서, 상기 항원이 대상체에서 질환 또는 병태를 매개하고; 임의적으로 상기 결합이 항원을 길항시키는 것인, 방법.
49. 단락 1 내지 32 및 38 내지 40 중 어느 한 단락에 따른 복수의 폴리펩티드를 포함하는 조성물로, 여기서 폴리펩티드의 적어도 90%는 상기 폴리펩티드의 사량체에 의해 포함되는, 조성물.
50. 단락 49에 있어서, 상기 폴리펩티드의 적어도 98%가 상기 폴리펩티드의 사량체에 의해 포함되는, 조성물.
51. 단락 49 또는 50에 있어서, 상기 나머지 폴리펩티드가 폴리펩티드 단량체, 이량체 및 삼량체 중 하나 이상으로부터 선택되는, 조성물.
52. 단락 1 내지 32 및 38 내지 40 중 어느 한 단락에 따른 복수의 폴리펩티드를 포함하는 조성물(임의적으로 단락 49 내지 51 중 어느 한 단락에 따른 조성물)을 생성하는 방법으로, 상기 방법은 단락 34에 따라 진핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 폴리펩티드의 사량체의 세포로부터 발현 및 분비를 허용하는 단계, 및 임의적으로 사량체를 단리 또는 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
개념:
특정 구현예에서, 본 발명은 인간 또는 동물에서 암을 치료하기 위한 다량체를 제공하는 데 유용하다. 이와 관련하여, 종양-회합 항원에 결합함으로써 종양을 표적화하고/하거나 T-세포에 결합하여 활성을 조절하는 다량체를 사용하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어 다량체는 T 조절 세포(Treg) 상의 항원에 결합하여 활성을 하향조절할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다량체는 T 이펙터(Teff) 세포에 결합하여 활성을 상향조절할 수 있다. 다량체의 폴리펩티드에서 항체 Fc 영역을 제공하는 것은 Fc 이펙터 기능 및/또는 종양 세포를 사멸시키기 위한 세포독성을 제공하는 데 유리할 수 있다. 하나의 유리한 구성에서, 본 발명은 종양 세포 상의 동일한 항원 또는 에피토프의 여러 카피에 결합하는 데 사용될 수 있는 다중 동일한 항원 또는 에피토프 결합 부위를 제공하는 능력을 활용하여, 다량체가 임의의 비-표적 또는 정상 세포에 비해 종양 세포에 우선적으로 결합하는 결합력 효과를 제공하며, 이는 종양 세포가 정상 세포보다 더 많은 항원 카피를 표면-발현하기 때문이다. 하나의 구성에서, 다량체는 또한 면역 체크포인트 조절인자에 대한 결합 부위를 포함한다. 일 예에서 조절인자는 면역 체크포인트 억제제이고 결합 부위는 억제제를 길항시킨다. 이는 예를 들어 억제제가 Teff 세포에 의해 발현되는 경우, 다량체에 의해 표적화된 종양 세포 부근에서(예를 들어, 종양 세포 상의 TAA 결합에 의해) Teff 활성을 샹향조절하는 데 유용하다. 또 다른 예에서 조절인자는 면역 체크포인트 자극인자이고 결합 부위는 제제를 작용시킨다. 이는 예를 들어 억제제가 Teff 세포에 의해 발현되는 경우, 다량체에 의해 표적화된 종양 세포 부근에서(예를 들어, 종양 세포 상의 TAA에 결합에 의해) Teff 활성을 상향조절하는 데 유용하다. 따라서, T-세포 활성의 상향조절은 비-표적(예를 들어, 정상 또는 비-암성) 세포 부근에서 보다는 종양 세포 부근에서 자극될 수 있다. 이를 위해, 본 발명은 다음 개념을 제공한다.
1. 자기-회합 다량체화 도메인(SAM), 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드로, 여기서 제1 부위는 제1 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하고, 제2 결합 부위는 제2 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 각 항원 또는 에피토프는 종양-회합 항원(TAA) 또는 에피토프, 또는 면역 체크포인트 조절인자(예를 들어, 억제제) 항원 또는 에피토프인, 폴리펩티드.
2. 개념 1에 있어서, 상기 제1 항원이 TAA이고 제2 항원이 면역 체크포인트 조절인자(예를 들어, 억제제)인, 폴리펩티드.
3. 개념 1에 있어서, 상기 제1 항원이 TAA이고 제2 항원이 TAA인, 폴리펩티드.
4. 개념 1에 있어서, 상기 제1 항원이 면역 체크포인트 억제제이고 제2 항원이 면역 체크포인트 조절인자(예를 들어, 억제제)인, 폴리펩티드.
5. 개념 3 또는 4에 있어서, 상기 결합 부위가 동일한 항원의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는, 폴리펩티드.
6. 개념 3 또는 4에 있어서, 상기 결합 부위가 동일한 항원의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는, 폴리펩티드.
7. 개념 1 내지 6 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 제1 항원이 4-1BB, 4-1BBL, CD28, OX40, OX40L, ICOS, ICOSL, GITR, CD40, CD27, CD27L, CD40L, LIGHT, CD70, CD80, CD86, HER2, HER3, PSMA, WT1, MUC1, LMP2, EGFRvIII, MAGE A3, GD2, CEA, 멜란 a/MART1, Bcr-Abl, 서비빈, PSA, hTERT, EphA2, PAP, EpCAM, ERG, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, RhoC, GD3, PSCA, PAX5, LCK, VEGFR2, MAD CT-1, FAP, MAD CT-2, PDGFR-베타, Fos 관련 항원 1, NY-BR-1, ETV6-AML, RGS5, SART3, SSX2, XAGE-1, STn, PAP 및 BCMA로부터 선택되는, 폴리펩티드.
8. 개념 1 내지 7 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 제2 항원이 PDL1, PD1, CTLA4, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, A2aR, HVEM, GAL9, VISTA, SIRPa, CD47, CD160, CD155, IDO, CEACAM1, 2B4, CD48 및 TIGIT로부터 선택되는, 폴리펩티드.
9. 개념 1 내지 8 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제3 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항원 결합 부위를 포함하는, 폴리펩티드.
10. 개념 9에 있어서, 상기 제3 항원이 TAA인, 폴리펩티드.
11. 개념 9에 있어서, 상기 제3 항원이 면역 체크포인트 조절인자(예를 들어, 억제제)인, 폴리펩티드.
12. 개념 9 내지 11 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 제3 항원이 제1 또는 제2 항원과 동일한 것인, 폴리펩티드.
13. 개념 9 내지 12 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 제3 항원이 CD3(예를 들어, CD3e) 또는 CD28인, 폴리펩티드.
14. 개념 9 내지 13 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제4 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제4 항원 결합 부위를 포함하는, 폴리펩티드.
15. 개념 14에 있어서, 상기 제4 항원이 TAA인, 폴리펩티드.
16. 개념 14에 있어서, 상기 제4 항원이 면역 체크포인트 조절인자(예를 들어, 억제제)인, 폴리펩티드.
17. 개념 1 내지 16 중 어느 한 개념에 있어서, 상기 폴리펩티드가 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드에 따르는 것인, 폴리펩티드.
일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 상기 제1 dAb 또는 제1 scFv는 이들 개념의 제1 항원 결합 부위이고; 임의적으로 추가의 dAb 또는 scFv 결합 부위가 존재하는 경우 이는 개념의 제2 항원 결합 부위이다.
일 예에서, 본원의 폴리펩티드의 상기 제1 dAb 또는 제1 scFv는 폴리펩티드 이들 개념의 제2 항원 결합 부위이고; 임의적으로 추가의 dAb 또는 scFv 결합 부위가 존재하는 경우 이는 개념의 제1 항원 결합 부위이다.
18. 개념 1 내지 17 중 어느 한 개념의 폴리펩티드의 다량체.
19. 개념 18에 있어서, 암의 치료를 위한 면역 체크포인트 억제제 및 면역 공-자극 분자의 표적화를 위해 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한, 다량체.
20. 인간 또는 동물 대상체에서 암을 치료하는 방법으로, 상기 방법은 대상체에게 제18항의 다량체를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
조항(Clauses):
구성에서, 본 발명은 다음 조항을 제공한다.
1. 이펙터 도메인(예를 들어, 단백질 도메인) 또는 펩티드의 적어도 제1, 제2, 제3 및 제4 카피의 단백질 다량체로, 여기서 다량체는 함께 회합된 제1, 제2, 제3 및 제4 자기-회합 사량체화 도메인(TD)에 의해 다량체화되며, 여기서 각 사량체화 도메인은 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하는 각각의 조작된 폴리펩티드에 의해 포함되는 것인, 다량체.
2. 조항 1에 있어서, 상기 다량체가 상기 도메인 또는 펩티드의 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체)인, 다량체.
3. 조항 1 또는 2에 있어서, 면역글로불린 슈퍼패밀리 결합 부위의 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체)를 포함하는, 다량체.
4. 조항 3에 있어서, 상기 결합 부위가 제2 가변 도메인과 쌍을 이룬 제1 가변 도메인을 포함하는, 다량체.
5. 조항 1 내지 4 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 각 폴리펩티드가 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 제1 및 제2 카피를 포함하고, 상기 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) 상기 제1 카피 - TD - 상기 제2 카피; (ii) TD - 및 제1 및 제2 카피; 또는 (iii) 상기 제1 및 제2 카피 - TD를 포함하는, 다량체.
6. 조항 1 내지 5 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 TD가 NHR2 TD이고 도메인 또는 펩티드가 NHR2 도메인 또는 펩티드가 아니거나; 또는 상기 TD가 p53 TD이고 도메인 또는 펩티드가 p53 도메인 또는 펩티드가 아닌, 다량체.
7. 조항 1 내지 6 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드가 제2 유형의 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하며, 여기서 제2 유형의 단백질 도메인 또는 펩티드는 제1 단백질 도메인 또는 펩티드와 상이한 것인, 다량체.
8. 조항 1 내지 7 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 도메인이 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인인, 다량체.
9. 조항 1 내지 8 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 도메인 또는 펩티드가 항체 가변 또는 불변 도메인, TCR 가변 또는 불변 도메인, 인크레틴, 인슐린 펩티드, 또는 호르몬 펩티드인, 다량체.
10. 조항 1 내지 9 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 다량체가 상기 조작된 폴리펩티드의 제1, 제2, 제3 및 제4 동일한 카피를 포함하며, 폴리펩티드는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 1 개(그러나 1 개 이하), 2 개(그러나 2 개 이하) 또는 그 이상의 카피를 포함하는, 다량체.
11. 조항 1 내지 10 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드가 항체 또는 TCR 가변 도메인(V1) 및 NHR2 TD를 포함하는, 다량체.
12. 조항 11에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) V1-임의적 링커-NHR2 TD; (ii) V1-임의적 링커-NHR2 TD-임의적 링커-V2; 또는 (iii) V1-임의적 링커-V2-임의적 링커-NHR2 TD를 포함하며, 여기서 V1 및 V2는 TCR 가변 도메인이고 동일하거나 또는 상이하거나, 또는 여기서 V1 및 V2는 항체 가변 도메인이고 동일하거나 또는 상이한 것인, 다량체.
13. 조항 12에 있어서, 상기 V1 및 V2가 항체 단일 가변 도메인인, 다량체.
14. 조항 11에 있어서, 상기 각 조작된 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) V1-임의적 링커-TD를 포함하며, 여기서 V1은 항체 또는 TCR 가변 도메인이고 각 조작된 폴리펩티드는 V2를 포함하는 각각의 제2 조작된 폴리펩티드와 쌍을 이루며, 여기서 V2는 항원 또는 pMHC 결합 부위를 형성하기 위해 V1과 쌍을 이룬 각각 항체 또는 TCR 가변 도메인이고, 임의적으로 하나의 폴리펩티드는 항체 Fc를 포함하거나, 또는 항체 CH1을 포함하고 다른 폴리펩티드는 CH1과 쌍을 이룬 항체 CL을 포함하는 것인, 다량체.
15. 조항 1 내지 14 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 TD가 (i) 서열번호: 10 또는 126과 동일하거나 또는 이에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호: 120 또는 123과 동일하거나 또는 이에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다량체.
16. 조항 1 내지 15 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 다량체가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 항원 결합 부위의 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체)를 포함하는 것인, 다량체: ReoPro™; 압식시맙; Rituxan™; 리툭시맙; Zenapax™; 다클리주맙; Simulect™; 바실릭시맙; Synagis™; 팔리비주맙; Remicade™; 인플릭시맙; Herceptin™; Mylotarg™; 겜주투맙; Campath™; 알렘투주맙; Zevalin™; 이브리투모맙; Humira™; 아달리무맙; Xolair™; 오말리주맙; Bexxar™; 토시투모맙; Raptiva™; 에팔리주맙; Erbitux™; 세툭시맙; Avastin™; 베바시주맙; Tysabri™; 나탈리주맙; Actemra™; 토실리주맙; Vectibix™; 파니투무맙; Lucentis™; 라니비주맙; Soliris™; 에쿨리주맙; Cimzia™; 서톨리주맙; Simponi™; 골리무맙, Ilaris™; 카나키누맙; Stelara™; 우스테키누맙; Arzerra™; 오파투무맙; Prolia™; 데노수맙; Numax™; 모타비주맙; ABThrax™; 락시바쿠맙; Benlysta™; 벨리무맙; Yervoy™; 이필리무맙; Adcetris™; 브렌툭시맙; Vedotin™; Perjeta™; 퍼투주맙; Kadcyla™; 아도-트라스투주맙; Keytruda™, Opdivo™, Gazyva™ 및 오비누투주맙.
17. TCR 결합 부위, 인슐린 펩티드, 인크레틴 펩티드 또는 펩티드 호르몬의 단리된 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer; 또는 복수의 상기 사량체 또는 팔량체.
18. 조항 1 내지 17 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer가 다음과 같은 것인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체):
(a) 수용액에서 가용성;
(b) 진핵생물 세포로부터 선택 가능; 및/또는
(c) 진핵생물 세포의 발현 생성물.
19. 다음의 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체):
(a) TCR V 도메인 또는 TCR 결합 부위로, 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 수용액에서 가용성임;
(b) 항체 단일 가변 도메인으로, 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 수용액에서 가용성임;
(c) TCR V 도메인 또는 TCR 결합 부위로, 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음; 또는
(d) 항체 가변 도메인으로, 여기서 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer는 HEK293 세포에 의해 세포내로 및/또는 세포외로 발현될 수 있음.
20. 조항 1 내지 19 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer가 항원 또는 pMHC 결합에 이중특이적인 것인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
21. 조항 1 내지 20 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 도메인이 동일한 것인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
22. 조항 1 내지 21 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer가 진핵생물 세포 글리코실화를 포함하는 것인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
23. 조항 22에 있어서, 상기 세포가 HEK293 세포인, 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer.
24. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항의 복수의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체).
25. 조항 1 내지 24 중 어느 한 조항의 다량체(들), 사량체(들), 팔량체(들), 십이량체(들), 십육량체(들) 또는 20-mer(들)(예를 들어, 사량체(들) 또는 팔량체(들))및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
26. 조항 1 내지 24 중 어느 한 조항의 다량체(들), 사량체(들), 팔량체(들), 십이량체(들), 십육량체(들) 또는 20-mer(들)(예를 들어, 사량체(들) 또는 팔량체(들))를 포함하는 화장품, 식료품, 음료, 세정 제품, 세제.
27. 조항 1 내지 26 중 어느 한 조항의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer의 상기 조작된 (및 임의적으로 단리된) 폴리펩티드 또는 (임의적으로 단리된) 단량체.
28. (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하는 조작된 (및 임의적으로 단리된) 폴리펩티드(P1):-
(a) TCR V1 -TCR C1 - 항체 CH1 - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이고 C1은 Cα이거나;
(ii) V1은 Vβ이고 C1은 Cβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이고 C1은 Cγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ이고 C1은 Cδ임;
또는
(b) TCR V1 - 항체 CH1- 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이거나;
(ii) V1은 Vβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ임;
또는
(c) 항체 V1 - 항체 CH1- 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL임;
또는
(d) 항체 V1 - 임의적 항체 CH1- 항체 Fc - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL임;
또는
(e) 항체 V1 - 항체 CL - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 VH이거나; 또는
(ii) V1은 VL임;
또는
(f) TCR V1 -TCR C1 - 임의적 링커 - TD, 여기서
(i) V1은 Vα이고 C1은 Cα이거나;
(ii) V1은 Vβ이고 C1은 Cβ이거나;
(iii) V1은 Vγ이고 C1은 Cγ이거나; 또는
(iv) V1은 Vδ이고 C1은 Cδ임.
29. 조항 28에 있어서, 상기 조작된 폴리펩티드 P1이 추가의 폴리펩티드(P2)와 쌍을 이루며, 여기서 P2가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:-
(g) TCR V2 -TCR C2 - 항체 CL, 여기서 P1은 조항 28에 인용된 (a)에 따르고
(i) P1이 (a)(ii)에 따른 경우 V2는 Vα이고 C2는 Cα이거나;
(ii) P1이 (a)(i)에 따른 경우 V2는 Vβ이고 C2는 Cβ이거나;
(iii) P1이 (a)(iv)에 따른 경우 V2는 Vγ이고 C2는 Cγ이거나; 또는
(iv) P1이 (a)(iii)에 따른 경우 V2는 Vδ이고 C2는 Cδ임;
또는
(h) TCR V2 - 항체 CL, 여기서 P1은 조항 28에 인용된 (b)에 따르고
(i) P1이 (b)(ii)에 따른 경우 V2는 Vα이거나;
(ii) P1이 (b)(i)에 따른 경우 V2는 Vβ이거나;
(iii) P1이 (b)(iv)에 따른 경우 V2는 Vγ이거나; 또는
(iv) P1이 (b)(iii)에 따른 경우 V2는 Vδ임;
또는
(i) 항체 V2 - CL, 여기서 P1은 조항 28에 인용된 (c)에 따르고
(i) P1이 (c)(ii)에 따른 경우 V2는 VH이거나; 또는
(ii) P1이 (c)(i)에 따른 경우 V2는 VL임;
또는
(j) 항체 V2 - 임의적 CL, 여기서 P1은 조항 28에 인용된 (d)에 따르고
(i) P1이 (d)(ii)에 따른 경우 V2는 VH이거나; 또는
(ii) P1이 (d)(i)에 따른 경우 V2는 VL임;
또는
(k) 항체 V2 - CH1, 여기서 P1은 조항 28에 인용된 (e)에 따르고
(i) P1이 (e)(ii)에 따른 경우 V2는 VH이거나; 또는
(ii) P1이 (e)(i)에 따른 경우 V2는 VL임;
또는
(l) TCR V2 -TCR C2, 여기서 P1은 조항 28에 인용된 (f)에 따르고
(i) P1이 (f)(ii)에 따른 경우 V2는 Vα이고 C2는 Cα이거나;
(ii) P1이 (f)(i)에 따른 경우 V2는 Vβ이고 C2는 Cβ이거나;
(iii) P1이 (f)(iii)에 따른 경우 V2는 Vγ이고 C2는 Cγ이거나; 또는
(iv) P1이 (f)(iv)에 따른 경우 V2는 Vδ이고 C2는 Cδ임.
30. 조항 28에 정의된 바와 같은 P1의 다량체; 또는 조항 29에 정의된 바와 같은 P2와 쌍을 이룬 P1의 다량체; 또는 복수의 상기 다량체로, 임의적으로 여기서 다량체는 조항 1 내지 24 중 어느 한 조항에 따른 것인, 다량체.
31. 조항 27 내지 29 중 어느 한 조항의 조작된 폴리펩티드 또는 단량체를 암호화하는 핵산으로, 임의적으로 여기서 핵산은 폴리펩티드를 발현하기 위한 발현 벡터에 의해 포함되는 것인, 핵산.
32. 조항 1 내지 24 중 어느 한 조항의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체), 조작된 폴리펩티드 또는 단량체의 세포내 및/또는 분비된 발현을 위한 조항 31의 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 숙주 세포.
33. 세포내로 발현된 및/또는 분비된 다량체를 생성하기 위한 단백질 다량체의 제조 방법에서 조항 31에 따른 핵산 또는 벡터의 용도로, 여기서 방법은 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 세포에서 다량체를 발현하고/하거나 이로부터 다량체를 분비하는 단계를 포함하는, 용도.
34. 핵산 또는 벡터를 포함하는 진핵생물 세포에서 글리코실화된 다량체의 생성을 위한 단백질 다량체의 제조 방법에서 조항 31에 따른 핵산 또는 벡터의 용도.
35. (i) 조항 27 내지 29 중 어느 한 조항에 따른 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 진핵생물 세포주; 및 (ii) 조항 1 내지 24 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체)를 포함하는 혼합물.
36. 조항 35에 있어서, 상기 세포주가 세포의 분비 생성물을 포함하는 배지 내에 있으며, 여기서 분비 생성물은 상기 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체 또는 팔량체)를 포함하는 것인, 혼합물.
37. 의학적 용도를 위한 조항 1 내지 24 중 어느 한 조항의 다량체, 사량체, 팔량체, 십이량체, 십육량체 또는 20-mer(예를 들어, 사량체, 팔량체).
38. 다음을 생성하는 방법:
(a) TCR V 도메인 다량체로, 방법은 진핵생물 세포에서 발현된 TCR V-NHR2 TD 또는 TCR V- p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며, 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함;
(b) 항체 V 도메인 다량체로, 방법은 진핵생물 세포에서 발현된 항체 V -NHR2 TD 또는 V- p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며, 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함;
(c) 인크레틴 펩티드 다량체로, 방법은 진핵생물 세포, 예컨대 HEK293T 세포에서 발현된 인크레틴 펩티드-NHR2 TD 또는 인크레틴 펩티드-p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며; 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함; 또는
(d) 펩티드 호르몬 다량체로, 방법은 진핵생물 세포, 예컨대 HEK293T 세포에서 발현된 펩티드 호르몬-NHR2 TD 또는 펩티드 호르몬- p53 TD 융합 단백질의 가용성 및/또는 세포내 발현을 포함하며; 임의적으로 복수의 상기 다량체를 단리하는 단계를 포함함.
39. 단량체 및/또는 이량체 폴리펩티드에 비해 더 높은 수율의 사량체를 생성하기 위한, 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 자기-회합 사량체화 도메인(TD)의 용도.
40. 단량체 및/또는 이량체 폴리펩티드에 비해 더 높은 수율의 사량체를 생성하기 위한, 단백질 도메인 또는 펩티드의 다중 카피를 포함하는 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 조작된 폴리펩티드의 용도로, 여기서 조작된 폴리펩티드는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하고 자기-회합 사량체화 도메인(TD)을 추가로 포함하는 것인, 용도.
41. 단량체, 이량체 또는 삼량체와 혼합되지 않은 복수의 사량체를 생성하기 위한, 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 자기-회합 사량체화 도메인(TD)의 용도.
42. 단량체, 이량체 또는 삼량체와 혼합되지 않은 복수의 사량체를 생성하기 위한, 단백질 도메인 또는 펩티드의 다중 카피를 포함하는 폴리펩티드의 사량체의 제조 방법에서 조작된 폴리펩티드의 용도로, 여기서 조작된 폴리펩티드는 상기 단백질 도메인 또는 펩티드의 하나 이상의 카피를 포함하고 자기-회합 사량체화 도메인(TD)을 추가로 포함하는 것인, 용도.
43. 조항 39 내지 42 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 사량체의 수율이 단량체 및/또는 이량체 수율의 적어도 10 배인, 용도.
44. 조항 39 내지 43 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 방법에서 생성된 사량체:생성된 단량체 및/또는 이량체의 비가 적어도 90:10인, 용도.
45. 조항 39 내지 44 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 각 단량체의 크기가 40 kDa 이하인, 용도.
46. 조항 39 내지 45 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 각 사량체의 크기가 150 kDa 이하인, 용도.
47. 조항 39 내지 46 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 방법이 진핵생물 세포주로부터 사량체를 발현하는 단계를 포함하는, 용도.
48. 다음을 포함하는 pMHC 복합체에 결합할 수 있는 다가 이종이량체성 가용성 T 세포 수용체:
(a) TCR 세포외 도메인;
(b) 면역글로불린 불변 도메인; 및
(c) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
49. 다음을 포함하는, 다량체성 면역글로불린:
(i) 면역글로불린 가변 도메인; 및
(ii) ETO의 NHR2 다량체화 도메인.
50. 다음 단계를 포함하는, 가용성 다량체성 폴리펩티드를 어셈블리하는 방법:
(a) ETO의 NHR2 도메인에 융합된 상기 다량체성 폴리펩티드의 단량체를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 단량체의 다중 카피를 회합시켜, 다량체성 가용성 폴리펩티드를 수득하는 단계.
본원의 임의의 개시내용에서, 또는 각 불변 영역 또는 도메인, CH2, CH3, CH2 및 CH3 또는 Fc는 각각 불변 영역 또는 도메인, 인간 불변 영역의 CH2, CH3, CH2 및 CH3 또는 Fc이다. 예를 들어, 불변 영역은 그룹 IGHA1*01, IGHA1*02, IGHA1*03, IGHA2*01, IGHA2*02, IGHA2*03, IGHD*01, IGHD*02, IGHE*01, IGHE*02, IGHE*03, IGHE*04, IGHEP1*01, IGHEP1*02, IGHEP1*03, IGHEP1*04, IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04, IGHG1*05, IGHG1*06, IGHG1*07, IGHG1*08, IGHG1*09, IGHG1*10, IGHG1*11, IGHG1*12, IGHG1*13, IGHG1*14, IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05, IGHG2*06, IGHG2*07, IGHG2*08, IGHG2*09, IGHG2*10, IGHG2*11, IGHG2*12, IGHG2*13, IGHG2*14, IGHG2*15, IGHG2*16, IGHG2*17, IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18, IGHG3*19, IGHG3*20, IGHG3*21, IGHG3*22, IGHG3*23, IGHG3*24, IGHG3*25, IGHG3*26, IGHG3*27, IGHG3*28, IGHG3*29, IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03, IGHG4*04, IGHG4*05, IGHG4*06, IGHG4*07, IGHG4*08, IGHGP*01, IGHGP*02, IGHGP*03, IGHM*01, IGHM*02, IGHM*03 및 IGHM*04로부터 선택된다(예를 들어, 불변 영역은 상기 그룹에 나열된 *01 대립유전자이며, 바람직하게는 불변 영역은 인간 IGHG1*01 또는 IGHM*01 불변 영역임). 대안으로, 불변 영역은 비-인간(예를 들어, 포유동물, 설치류, 마우스, 래트, 개, 고양이 또는 말) 불변 영역, 예컨대 상기 그룹에 나열된 인간 불변 영역의 상동체이다.
일 구현예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 제1 항원 결합 부위(예를 들어, dAb), 항체 CH1(예를 들어, 인간 IgG1 CH1), 하부 힌지를 포함하고 코어 힌지 영역이 없는(그리고 임의적으로 상부 힌지 영역이 없는) 힌지 서열, 항체 Fc 영역 및 SAM(예를 들어, TD, 예컨대 p53 TD)을 포함한다. 예를 들어, 코어 힌지 영역 서열은 CXXC 아미노산 서열이다. 폴리펩티드는 제1 결합 부위 및 CH1 사이, Fc 및 SAM 및/또는 SAM에 대한 C-말단 사이에 또 다른 항원 결합 부위(예를 들어 dAb 또는 scFv)를 포함할 수 있다. 임의적으로, 다량체는 복수(예를 들어, 4 개 카피)의 이러한 폴리펩티드를 포함하며, 예를 들어 여기서 각 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 제2 항원 결합 부위(예를 들어, dAb), 항체 CL(예를 들어, 인간 Cκ) 및 임의적으로 제3 항원 결합 부위를 포함하는 추가의 폴리펩티드와 쌍을 이룬다. 임의적으로 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다(예를 들어, 모두 TNF 알파에 결합함). 또 다른 옵션에서, 제1 및 제2(및 임의적으로 상기 또 다른 결합 부위)는 상이한 항원에 결합한다. 또는 각 결합 부위는 본원에 개시된 임의의 항원에 결합할 수 있으며, 예를 들어, 각 결합 부위는 TNF 알파에 결합한다(실시예 17에 제시된 바와 같음). 또 다른 예에서, 제1 항원 결합 부위는 항원에 특이적으로 결합하는 미리 결정된 항체의 항원 결합 부위의 VH이고(그리고 CH1은 임의적으로 항체의 CH1임), 추가의 폴리펩티드의 제2 결합 부위는 미리 결정된 항체의 항원 결합 부위의 VL이며(그리고 CL은 임의적으로 항체의 CL임), 여기서 VH 및 VL은 쌍을 이루어 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 VH/VL 결합 부위를 형성한다. 미리 결정된 항체는 예를 들어, 실시예 19에 제시된 바와 같은 시판중인 항체일 수 있다. 예를 들어, VH/VL 결합 부위는 CTLA-4에 특이적으로 결합하며, 예를 들어, 여기서 미리 결정된 항체는 이필리무맙(또는 Yervoy™)이다. 예를 들어, VH/VL 결합 부위는 TNF 알파에 특이적으로 결합하며, 예를 들어, 여기서 미리 결정된 항체는 아달리무맙, 골리무맙, 인플릭시맙(또는 Humira™, Simponi™ 또는 Remicade™)이다. 예를 들어, VH/VL 결합 부위는 PD-L1에 특이적으로 결합하며, 예를 들어, 여기서 미리 결정된 항체는 아벨루맙(또는 Bavencio™) 또는 아테졸리주맙(또는 Tecentriq™)이다. 예를 들어, VH/VL 결합 부위는 PD-1에 특이적으로 결합하며, 예를 들어, 여기서 미리 결정된 항체는 니볼루맙(또는 Opdivo™) 또는 펨브롤리주맙(또는 Keytruda™)이다. 예를 들어, VH/VL 결합 부위 VEGF에 특이적으로 결합하며, 예를 들어, 여기서 미리 결정된 항체는 베바시주맙(또는 Avastin™) 또는 라니비주맙(또는 Lucentis™)이다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 제1 VEGF 결합 부위, 임의적 제2 VEGF 결합 부위, 항체 CH1(예를 들어, 인간 IgG1 CH1), 하부 힌지를 포함하고 코어 힌지 영역이 없는(그리고 임의적으로 상부 힌지 영역이 없는) 힌지 서열, 항체 Fc 영역 및 SAM(예를 들어, TD, 예컨대 p53 TD)을 포함한다. 일 예에서, 제1 결합 부위는 VEGFR1로부터의 Ig 도메인 2이고 제2 결합 부위는 VEGFR2로부터의 Ig 도메인 3이다(실시예 20에 제시된 바와 같음). 또 다른 예에서, 제1 결합 부위는 VEGFR2로부터의 Ig 도메인 3이고 제2 결합 부위는 VEGFR2로부터의 Ig 도메인 2이다. 일 예에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 아플리버셉트(또는 Eylea™)의 제1 및 제2 VEGF 결합 부위이다.
적합한 미리 결정된 항체는 다음과 같다: ReoPro™; 압식시맙; Rituxanh™; 리툭시맙; Zenapaxh™; 다클리주맙; Simulecth™; 바실릭시맙; Synagis™; 팔리비주맙; Remicadeh™; 인플릭시맙; Herceptinh™; 트라스투주맙; Mylotargh™; 겜주투맙; Campathh™; 알렘투주맙; Zevalinh™; 이브리투모맙; Humirah™; 아달리무맙; Xolair™; 오말리주맙; Bexxarh™; 토시투모맙; Raptivah™; 에팔리주맙; Erbituxh™; 세툭시맙; Avastinh™; 베바시주맙; Tysabrih™; 나탈리주맙; Actemrah™; 토실리주맙; Vectibixh™; 파니투무맙; Lucentish™; 라니비주맙; Solirish™; 에쿨리주맙; Cimziah™; 서톨리주맙; Simponih™; 골리무맙, Ilaris™; 카나키누맙; Stelara™; 우스테키누맙; Arzerrah™; 오파투무맙; Prolie™; 데노수맙; Numaxh™; 모타비주맙; ABThraxh™; 락시바쿠맙; Benlystah™; 벨리무맙; Yervoyh™; 이필리무맙; Adcetrish™; 브렌툭시맙; Vedotin™; Perjeta™; 퍼투주맙; Kadcyla™; 아도-트라스투주맙; Gazyva™ 및 오비누투주맙. 또한 이들의 일반 버전 및 상응하는 INN 명칭이 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 발명에서 사용하기 위한 항원 결합 부위의 공급원으로서 사용하기에 적합한 미리 결정된 항체이다. 미리 결정된 항체의 VH 및 VL 도메인의 적합한 서열은 표 4에 개시되어 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 다량체는 이들 항체 중 임의의 것의 VH/VL 항원 결합 부위의 복수(예를 들어, 4, 8, 12, 16 또는 20 개)의 카피를 포함하며, 예를 들어, 여기서 결합 부위의 VH는 SAM(예를 들어, TD)을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 포함되고 각 폴리펩티드는 VH와 쌍을 이루는 VL을 포함하는 추가의 폴리펩티드와 쌍을 이루며, 따라서 항원 결합 부위를 형성한다. 일 예에서, SAM을 포함하는 폴리펩티드는 또한 추가의 폴리펩티드의 CL과 쌍을 이루는 CH1을 포함한다. 임의적으로, 다량체의 폴리펩티드의 결합 부위는 항체의 결합 부위의 VH 및 또한 항체의 CH1(즉, N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1 및 SAM)을 포함한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로 VL-CL, 예를 들어, 여기서 CL은 항체의 CL임) 포함하는 추가의 폴리펩티드와 쌍을 이룰 수 있다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 아바스틴이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 악템라이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 얼비툭스이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 루센티스이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 사릴루맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 듀필루맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 아릴로쿠맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 에볼로쿠맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 펨브롤리주맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 니볼루맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 이필리무맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 레미카드이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 골리무맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 오파투무맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 벤리스타이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 캄파쓰이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 리툭시맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 허셉틴이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 더발루맙이다.
일 구현예에서, 미리 결정된 항체는 다라투무맙이다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 제1 항원 결합 부위, 임의적 링커(예를 들어, G4Sn, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8, 바람직하게는 3임), 제2 항원 결합 부위, 하부 힌지를 포함하고 코어 힌지 영역이 없는(그리고 임의적으로 상부 힌지 영역이 없는) 힌지 서열, 항체 Fc(예를 들어, IgG1 Fc) 및 SAM(예를 들어, TD, 예컨대 p53 TD)을 포함한다. 예를 들어, 코어 힌지 영역 서열은 CXXC 아미노산 서열이다. 폴리펩티드는 Fc 및 SAM 및/또는 SAM에 대한 C-말단 사이에 또 다른 항원 결합 부위(예를 들어 dAb 또는 scFv)를 포함할 수 있다. 임의적으로, 다량체는 복수(예를 들어, 4 개 카피)의 이러한 폴리펩티드를 포함한다. 임의적으로 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다(예를 들어, 모두 TNF 알파에 결합함). 또 다른 옵션에서, 제1 및 제2(및 임의적으로 상기 또 다른 결합 부위)는 상이한 항원에 결합한다. 또는 각 결합 부위는 본원에 개시된 임의의 항원에 결합할 수 있으며, 예를 들어, 각 결합 부위는 PD-L1에 결합하거나, 또는 제1 결합 부위는 PD-L1에 결합하고 제2 결합 부위는 41-BB에 결합하거나, 또는 제1 결합 부위는 4-1BB에 결합하고 제2 결합 부위는 PD-L1에 결합한다(실시예 18에 제시된 바와 같음).
일 구현예에서, 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 제1 항원 결합 부위(예를 들어, dAb), 임의적 링커(예를 들어, G4Sn, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8, 바람직하게는 3임), 제2 항원 결합 부위(예를 들어, dAb), 항체 CH1(예를 들어, 인간 IgG1 CH1) 및 SAM(예를 들어, TD, 예컨대 p53 TD)를 포함한다. 폴리펩티드는 SAM에 대한 또 다른 항원 결합 부위(예를 들어 dAb 또는 scFv) C-말단을 포함할 수 있다. 임의적으로, 다량체는 복수(예를 들어, 4 개 카피)의 이러한 폴리펩티드를 포함하며, 예를 들어 여기서 각 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 제3 항원 결합 부위(예를 들어, dAb), 임의적으로 제4 항원 결합 부위(예를 들어, dAb), 항체 CL(예를 들어, 인간 Cκ 또는 Cλ) 및 임의적으로 추가의 항원 결합 부위를 포함하는 추가의 폴리펩티드와 쌍을 이룬다. 예를 들어, 제4 및 추가의 결합 부위는 생략된다. 또 다른 예에서, 제3 및 제4 결합 부위는 존재하지만, 추가의 결합 부위는 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, 제3 및 추가의(제4는 아님) 결합 부위가 존재한다. 임의적으로 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다(예를 들어, 모두 TNF 알파에 결합함). 또 다른 옵션에서, 제1 및 제2(및 임의적으로 상기 또 다른 상기 결합 부위)는 상이한 항원에 결합한다. 또는 각 결합 부위는 본원에 개시된 임의의 항원에 결합할 수 있으며, 예를 들어, 각 결합 부위는 TNF 알파에 결합한다(실시예 21 및 22에 제시된 바와 같음). 일 예에서, 제1 및 제3, 또는 제2 및 제3 결합 부위는 쌍을 이루어 아달리무맙, 골리무맙, 인플릭시맙(또는 Humira™, Simponi™ 또는 Remicade™)과 같은 항-TNF 알파 항체의 VH/VL 결합 부위와 동일한 VH/VL 쌍을 형성한다. 일 예에서, 제1 및 제3, 또는 제2 및 제3 결합 부위는 쌍을 이루어 아벨루맙(또는 Bavencio™) 또는 아테졸리주맙(또는 Tecentriq™)과 같은 항-PD-L1 항체의 VH/VL 결합 부위와 동일한 VH/VL 쌍을 형성한다. 일 예에서, 제1 및 제3, 또는 제2 및 제3 결합 부위는 쌍을 이루어 니볼루맙(또는 Opdivo™) 또는 펨브롤리주맙(또는 Keytruda™)과 같은 항-PD-1 항체의 VH/VL 결합 부위와 동일한 VH/VL 쌍을 형성한다. 일 예에서, 제1 및 제3, 또는 제2 및 제3 결합 부위는 쌍을 이루어 베바시주맙(또는 Avastin™) 또는 라니비주맙(또는 Lucentis™)과 같은 항-VEGF 항체의 VH/VL 결합 부위와 동일한 VH/VL 쌍을 형성한다. 상기 논의된 바와 같은 미리 결정된 항체는 VH/VL 쌍의 공급원으로서 사용될 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 본원의 표 중 임의의 것에 제시된 Quad 아미노산(예를 들어, 서열번호: 81-115, 151-162, 190, 191, 209-224 및 179 중 임의의 하나) 또는 본원의 표(예를 들어, 표 9, 14 또는 17) 중 임의의 것에서 Quad 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 의해 암호화되거나, 또는 표 8에 제시된 폴리펩티드의 구조를 갖는 본원에 개시된 임의의 Quad 폴리펩티드이다. SAM은 본원에 개시된 임의의 SAM, 예를 들어, 본원의 임의의 표에 개시된(예를 들어, 표 7에 제시된 바와 같거나 또는 표 13의 단백질에 의해 포함된) 임의의 p53 또는 상동체 TD일 수 있다.
아미노산 서열이 C-말단에서 복수의 히스티딘으로 제시되는 경우(예를 들어, "HHHHHH" 임의적으로 이어서 "..AAA"), 이러한 히스티딘 및 임의적..AAA는 일 구현예에서 생략되고 이를 암호화하는 상응하는 뉴클레오티드는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산으로부터 생략된다. 아미노산 서열이 DYKDDDDK 모티프로 제시되는 경우(예를 들어, DYKDDDDKHHHHHH 또는 DYKDDDDKHHHHHH..AAA), 이러한 모티프는 일 구현예에서 생략되고 이를 암호화하는 상응하는 뉴클레오티드는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산으로부터 생략된다.
본원의 임의의 예, 구성, 측면, 개념, 조항 또는 단락 또는 개시내용은 본원의 임의의 추가의 예, 구성, 측면, 개념, 조항 또는 단락 또는 개시내용의 임의의 특징과 조합가능하다.
본원에 기재된 임의의 구현예는 예시로서 제시되며 본 발명을 제한하려는 것이 아님이 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 구현예에서 이용될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 특정 절차에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 일상적인 연구만을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되며 청구범위에 의해 포괄된다. 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원(언급된 모든 특허 출원 및 특허의 미국 등가물 포함)은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 단수형 단어의 사용은 청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상," "적어도 하나," 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 지칭하거나 또는 대안이 상호 배타적임을 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 개시내용은 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지한다. 본 출원 전반에 결쳐, 용어 "약"은 값이 장치에 대한 고유한 오차 변동, 값을 결정하는 데 이용되는 방법, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구범위(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"(및 복수형의 "포함하다" 및 3인칭 단수형의 "포함한다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 복수형의 "갖다" 및 3인칭 단수형의 "갖는다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하여"(및 "포함한다" 및 "포함하다"와 같은 포함하여의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유한다" 및 "함유하다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)는 포괄적이거나 또는 개방적이고 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는 이의 조합"은 용어 앞에 나열된 항목의 모든 순열 및 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 특정 맥락에서 순서가 중요한 경우 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 적어도 하나를 포함하도록 의도된다. 이 예를 계속하면, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등과 같은 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 함유하는 조합이 명시적으로 포함된다. 당업자는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 전형적으로 항목 또는 용어의 수가 임의의 조합으로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
본 개시내용의 임의의 부분은 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 개시내용의 임의의 다른 부분과 조합하여 이해할 수 있다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 변동이 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
실시예
실시예 1: 4가 및 8가 가용성 이종이량체성 NY-ESO-1 TCR 분자의 생성
이 실시예는 각각 ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR로 지칭되는 4가 및 8가 가용성 이종이량체성 TCR 분자를 생성하는 방법을 입증한다. 이들 형식은 표적 부위에서 동족 리간드에 대한 용해도 및 결합력과 관련된 문제를 극복한다.
안정하고 가용성인 분자로서 ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR을 예시하기 위해, 면역글로불린 불변 도메인 및 NHR2 사량체화 도메인과 함께 NY-ESO-1에 대한 높은 친화도를 갖는 TCR αβ 가변 서열이 이 실시예에서 사용된다.
이 실시예에서 사용된 SLLMWITQC-HLA-A*0201에 특이적인 높은-친화도 NY-ESO TCR αβ 쇄(각각 TCR Vα-Cα 및 Vβ-Cβ로 구성)는 신호 펩티드 서열(MGWSCIILFLVATATGVHS)을 포함한 WO 2005/113595 A2에 보고되어 있다. 단백질 정제를 돕기 위해, 히스티딘 태그를 NHR2 도메인의 C-말단에 혼입하였다.
ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR의 구성요소를 암호화하는 DNA 작제물은 포유동물 세포에서 가용성 발현 및 기능성 어셈블리를 허용하는 2-벡터 시스템으로서 합성적으로 구축된다. DNA 서열이 발현 벡터에 클로닝하기 위해 합성된 2 개의 어셈블리된 TCR 쇄(α 및 β 쇄)의 개략도는 도 3 및 4에 제시되어 있고 이의 아미노산 서열은 도 5 및 6에 제시되어 있다.
pTT5 벡터 시스템은 현탁액-적응된 HEK293 EBNA 세포에서 재조합 단백질의 고수준 일시적 생산을 허용한다(Zhang et al., 2009). 이는 바이러스 단백질 엡스타인-바 핵 항원 1(EBNA-1)에 의해 인식된 복제 기점(oriP)을 함유하며, 숙주 세포 복제 인자와 함께 DNA 플라스미드의 에피솜 복제를 매개하여 재조합 단백질의 발현을 향상시킨다. 따라서 pTT5 발현 벡터는 ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR 분자에 대한 구성요소를 클로닝하기 위해 선택된다.
TCR αβ 쇄를 함유하는 합성된 DNA 단편은 제한 부위(RS)에서 제한 효소로 분해되고(FastDigest, Fermantas) DNA는 1% 아가로스 겔 상에서 분리된다. 정확한 크기의 DNA 단편을 절제하고 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제하였다. pTT5 벡터를 또한 동일한 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드 DNA를 절제된 아가로스 겔로부터 정제한다. 분해된 TCR αβ 쇄를 분해된 pTT5 벡터로 클로닝하여 4 개의 발현 벡터(pTT5-ts-NY-ESO-1-TCRα, pTT5-ts-ESO-1-TCRβ, pTT5-os-NY-ESO-1-TCRα 및 pTT5-os-ESO-1-TCRβ)를 생성한다.
4가 및 8가 가용성 NY-ESO TCR의 발현
ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR의 기능적 발현을 현탁액-적응된 HEK293 EBNA 세포에서 수행한다. HEK293-EBNA 세포를 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 무혈청 듈베코의 변형된 이글 배지(DMEM, 2 mM L-글루타민을 함유하는 고 글루코스(4.5 g/L))에서 배양한다.
각 형질감염을 위해, HEK293-EBNA 세포(3 x 107 개 세포)를 ~60% 합류 세포로부터 250 mL Erlenmeyer 진탕기 플라스크(Corning)에 새로 시딩한다. 형질감염은 공급처의 지침에 따라 FreeStyle MAX 양이온성 지질 염기 시약(Life Technologies)을 사용하여 수행한다. ts-NY-ESO-1 TCR의 발현을 위해, 37.5 μg의 총 플라스미드 DNA(pTT5-ts-NY-ESO-1-TCRα 및 pTT5-ts-ESO-1-TCRβ 벡터 각각 18.75 μg 플라스미드 DNA를 사용하거나 또는 2 개의 발현 플라스미드의 양이 달라짐)를 형질감염 당 사용한다. 유사하게 os-NY-ESO-1 TCR의 발현을 위해, pTT5-os-NY-ESO-1-TCRα 및 pTT5-os-ESO-1-TCRβ 각각 18.75 μg 플라스미드 DNA를 형질감염에 사용한다. 형질감염 후, 세포를 신선한 배지에서 회수하고 4 - 8 일 동안 110 rpm으로 오비탈 쉐이커에서 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 더 작은 규모의 형질감염을 6 웰 또는 24 웰 플레이트에서 유사하게 수행한다.
발현된 가용성 eTCR 2 -BiTE의 분석
상청액으로 분비된 ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR 단백질 분자를 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 직접 또는 단백질 정제 후 분석한다. 단백질 샘플 및 표준물질을 환원 및 비-환원 조건 둘 다 하에 제조한다. SDS-PAGE를 Mini-PROTEAN Tetra 세포 전기영동 시스템(Bio-Rad)에서 단백질 전기영동을 위한 캐스트 미니 겔을 사용하여 수행하였다. 쿠마시 블루 염료를 사용하여 SDS-PAGE 겔에서 단백질을 염색하였다.
ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR 단백질 분자의 정제
세포 상청액으로부터 가용성 ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR을 2 단계로 정제한다. 제1 단계에서 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 니켈이 로딩된 니트릴로트리아세트산(NTA) 아가로스 수지(HisPur Ni-NTA Superflow 아가로스 - Thermo fisher)와 함께 사용한다. 결합 및 세척 완충액은 저농도의 이미다졸(10-25mM)을 함유하는 pH7.2의 Tris-완충 염수(TBS)로 이루어진다. IMAC 칼럼으로부터 His-태그된 ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR의 용출 및 회수를 고농도의 이미다졸(>200mM)로 세척하여 달성한다. 용출된 단백질 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 관심 단백질을 함유하는 분획을 풀링한다. 풀링된 단백질 분획을 결합 검정에 직접 사용하거나 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수반하는 제2 단계에서 추가로 정제한다. Superdex 200 증가 사전 패킹된 칼럼(Gelifesciences)을 사용하여 단량체, 올리고머 및 표적 단백질의 임의의 응집된 형태를 분리한다.
표면 플라즈몬 공명
ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR의 pMHC에 대한 특이적 결합 및 친화도 분석을 BIAcore를 사용하여 수행한다. 간단히 말해서, 정제된 히스티딘-태그된 ts-NY-ESO-1 TCR 및 os-NY-ESO-1 TCR 단백질을 니트릴로트리아세트산(NTA)의 Ni2+ 킬레이트화를 통해 센서 표면 위에 캡쳐한다. NY-ESO pep(SLLMWITQV)-MHC(ProImmune)를 함유하는 다양한 농도의 분석물 용액을 주입하고 결합 신호를 모니터링하였다.
실시예 2: 4가 및 8가 가용성 NY-ESO TCR-IL2 융합 분자의 생성
ts-NY-ESO-1 TCR-IL2 및 os-NY-ESO-1 TCR-IL2 단백질 복합체를 발현하는 데 필요한 도메인을 암호화하는 DNA를 상기 기재된 바와 같이 합성하고 발현 벡터 pTT5로 클로닝한다. ts-NY-ESO-1 TCR-IL2 및 os-NY-ESO-1 TCR-IL2에 대한 TCR αβ 쇄 내의 도메인의 개략도는 도 7 및 8에 제시되어 있고 아미노산 서열은 도 9 및 10에 제시되어 있다.
ts-NY-ESO-1 TCR-IL2 및 os-NY-ESO-1 TCR-IL2의 발현, 정제 및 특성화를 상기 기재된 바와 같이 수행한다.
실시예 3: 고수율 사량체 분비
간단히 말해서, 통상적인 유전자 조작 기술을 사용하여, Quad 16을 암호화하는 HEK293-T 세포주를 제조하였고(도 14 및 15) Quad 17을 암호화하는 또 다른 HEK293-T 세포주를 제조하였다(도 14 및 15).
단백질 발현이 일어나고 단백질이 세포주로부터 분비되었다. 세포가 인큐베이션된 배지의 샘플을 변성 조건(SDS-PAGE) 하에 또는 고유 조건(SDS 없음) 하에 PAGE에 적용하였다. 전자는 추가로 환원 조건(머캅토에탄올 사용) 하에 있었지만, 후자는 그렇지 않았다.
환원된 겔은 예상된 단량체 크기에서 뚜렷한 밴딩(도 16)을 나타내었다. 놀랍게도, 비환원된 고유 겔은 단량체, 이량체 또는 삼량체 크기에서 검출가능한 밴딩이 나타나지 않았지만, 대신에 무거운 밴딩이 사량체 크기에서 보여졌으며 이는 매우 고수율의 사량체를 수득하였음을 나타내고, 이는 SEC에 의해 고순도인 것으로 확인되었다.
Quad 16의 경우, SEC로부터의 사량체 피크를 SDS-PAGE 상에서 실행하고 수득된 밴드를 질량 분광법을 위해 잘라내었다. 트립신을 분해하여 데이터를 수득하고 단백질의 100%에서 p53을 검출하였다. 이는 분비된 Quad 16이 다량체화되었다는 결정적인 증거였다.
실시예 4: NHR2 TD에 융합된 TCR의 세포외 부분의 세포내 단백질 발현
발현 벡터
모든 DNA 단편을 합성하고 Twist Bioscience(California)에 의해 발현 벡터 pEF/myc/cyto(Invitrogen)로 클로닝하였다. 합성된 DNA 단편 및 Quad 폴리펩티드의 도식 및 서열은 도 21, 및 본원의 서열 표에 제시되어 있다.
DNA 제조
Twist Bioscience에 의해 합성된 동결건조된 플라스미드 DNA를 MQ 물로 50 ng/μl의 농도로 재현탁하였다. 50 ng의 DNA를 통상적인 열 충격 방법을 사용하여 50μl의 적격 DH5α 세포로 형질전환하였다. 세포를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 개별 콜로니를 선별하고 37℃, 220 rpm에서 밤새 성장시켰다. DNA를 제조업체의 설명서에 따라 QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)를 사용하여 세포로부터 정제하였다.
HEK293T 세포의 형질감염
간단히 말해서, HEK293T 세포를 10% FBS 및 Pen/Strep이 보충된 고 글루코스 DMEM에서 유지하였다. 세포를 2ml 배지에서 6-웰 플레이트의 웰 당 6 x 105 개 세포로 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 부착시켰다. 7.5 μl의 Lipofectamine 2000을 150 μl의 OptiMem에 희석하고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA(2.5 μg)를 150 μl의 OptiMem에 희석하였다. 희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine 2000 과 조합하고, 부드럽게 혼합하고 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 300 μl의 복합체를 6-웰 플레이트의 1 개 웰에 첨가하였다. 분석 시 배지가 무혈청이어야 하는 경우, 배지를 흡인하고 형질감염 6 시간 후에 CD293 배지로 교체하였다. 세포를 분석 전에 37℃, 5% CO2에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다.
따라서, TCR-연결된 NHR2 사량체화 도메인(TD) 작제물(Quads)의 상이한 형식을 HEK293T 세포로 형질감염시켰다. TCR 4가 형식을 닮은 Quad 3 및 4(구조는 도 1 및 3에 도시적으로 나타냄) 및 TCR 8가 형식을 닮은 Quad 12 및 13(구조는 도 2 및 4에 도시적으로 나타냄)을 단백질 발현 분석을 위해 형질감염시켰다. 세포내로 발현된 단백질을 확인하기 위해 다음과 같이 형질감염된 HEK293T 세포로부터 단백질 샘플을 제조하였다. 간단히 말해서 세포를 2ml PBS로 1 회 세척하고, 이후에 흡인하였다. 150 μl의 트립신-EDTA(0.05%)를 각 웰에 첨가하고 세포를 실온에서 ~1 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 탭핑하여 임의의 강하게 부착된 세포를 떨어뜨렸다. 850 μl의 배지를 각 웰에 첨가하여 트립신을 비활성화시켰다. 세포를 1.5 ml 에펜도르프로 옮기고 1,000 rpm으로 5 분 동안 회전시켰다. 상청액을 흡인하고 펠릿을 얼음에서 저장하였다. 세포를 프로테아제 억제제 Cocktail Set III(Calbiochem)을 함유하는 400 μl 세포 용해 완충액(10 mM Tris pH 7.5, 1% SDS)에 재현탁하고 1/200으로 희석하였다. 샘플을 격렬하게 볼텍싱하고 얼음 위에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 Branson Ultrasonics Sonifier™(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 초음파처리하였다. 진폭을 30%로 설정하고 세포를 총 24 초 동안 초음파처리하였다(6 초 켜기, 3 초 끄기 x4). 총 단백질 농도를 제조업체의 설명서에 따라 Pierce BCA Protein Assay Kit™를 사용하여 정량화하였다. 100μg을 MQ 물로 희석하여 80μl의 부피를 수득하였다. 그런 다음 20μl의 5x SDS 로딩 완충액을 첨가하여 1 mg/ml의 샘플을 수득하였다. 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 전에 5 분 동안 95℃에서 인큐베이션하였다.
단백질 샘플을 변성 조건 하에 SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 전형적으로, 웨스턴 블롯 분석을 위해 25 μg의 전체 세포 용해물(25μl)을 겔 상에 로딩하였다. 5 μl의 PageRule 미리 염색된 10-180 kDa 단백질 래더를 단백질 샘플과 나란히 겔에 로딩하였다. 겔을 0.1% SDS를 함유하는 Tris-글리신 완충액에서 실행하였다. 150 볼트의 일정한 전압을 사용하고 염료 전면이 완전히 이동할 때까지 겔을 ~70 분 동안 실행하였다.
하기 용해 및 적층 겔을 사용하여 SDS-PAGE(15% Bis-Tris) 겔을 제조하였다.
용해 겔:
ㆍ 5 ml 30% 비스-아크릴아미드
ㆍ 2.6 ml 1.5 M Tris(pH 8.8)
ㆍ 50 μl 20% SDS
ㆍ 100 μl 10% APS
ㆍ 10 μl TEMED
ㆍ 2.2 ml MQ 물
적층 겔:
ㆍ 0.75 ml 30% 비스-아크릴아미드
ㆍ 1.25 ml 1.5 M Tris(pH 8.8)
ㆍ 25 μl 20% SDS
ㆍ 50 μl 10% APS
ㆍ 5 μl TEMED
ㆍ 2.9 ml MQ 물
Quad 3, 4, 12 및 13으로부터 TCR-NHR2 TD 융합 단백질의 단백질 발현의 특이적이고 민감한 검출을 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질을 다음과 같이 Amersham Hybond™ 0.45 μM PVDF 막 위로 옮겼다. 간단히 말해서, Amersham Hybond 0.45 μM PVDF 막을 MeOH로 ~1 분 동안 활성화시키고 사용 전에 트랜스퍼(transfer) 완충액(25 mM Tris, 190 mM 글리신, 20% MeOH)으로 헹궜다. 스폰지, 여과지, 겔, 막, 여과지, 스폰지 스택을 준비하고 트랜스퍼용 카세트에 넣었다. 트랜스퍼를 75 분 동안 280 mA에서 얼음 위에서 수행하였다. 막을 차단 완충액(TBST, 5% 분말 우유)에서 ~2 시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 TBST로 잠시 세척한 후 TBST, 1% 분말 우유에 1/2500으로 희석된 항-인간 IgG HRP(Thermo, 31410)과 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 막을 철저하게 세척한 후(TBST로 3 회 세척, 각각 15 분) Pierce ECL 웨스턴 블롯팅 기질을 사용하여 현상하였다.
항-인간 IgG 검출 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 프로빙하기 위해, 예상된 분자량에서의 특이적 단백질 밴드를 Quad 3(46.1 kDa), 4(46.4 kDa), 12(47.8 kDa) 및 13(48.1 kDa)으로부터 제조된 샘플로부터 검출할 수 있다(도 17a 및 17b). 이들 데이터는 HEK293T 세포에서 TCR-NHR2 TD 융합 단백질의 세포내 단백질 발현을 확인한다.
분석된 모든 Quad에 대해, NHR2 TD와의 TRVβ-TRCβ-IgG1-CH1(+/- IgG 힌지 도메인) 융합이 안정됨을 나타내는 명확한 단일 밴드가 검출될 수 있다. 이들 발현 데이터는 또한 이 실시예에서 예시된 바와 같이 4가(Quad 3 및 4) 및 8가(Quad 12 및 13) 분자를 어셈블리할 가능성을 확인한다.
Quad 3 및 4 사이의 차이는 IgG1 CH1 도메인 및 NHR2 TD 사이에 위치한 작은 펩티드 링커(G4S)의 존재이다. 이는 또한 Q13이 IgG1 CH1 도메인 및 NHR2 TD 사이에 펩티드 링커를 함유하는 경우 Quad 12 및 13의 경우에도 사실이다. 발현 데이터로부터, 펩티드 링커는 단백질 발현에 영향을 미치지 않음을 볼 수 있다. 그러나, 이들 TCR-NHR2 TD 형식에서 항원 결합을 돕고/돕거나 다량체화 복합체를 안정화시키기 위해 펩티드 링커를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
실시예 5: NHR2 TD에 융합된 TCR의 세포외 부분의 가용성 단백질 발현
TCR-NHR2 TD 융합 단백질은 HEK293T 세포에서 세포내로 발현되는 것으로 실시예 4에 제시되었다. 여기에서 다시 Quad 3, 4, 12 및 13을 사용하여 이들 융합 단백질의 가용성 발현을 입증하였다. 상기 기재된 바와 같이, Quad 3, 4, 12 및 13을 HEK293T 세포에 형질감염시키고 세포 상청액으로부터 가용성 단백질을 농축하였다. 간단히 말해서, 배지를 형질감염 48 시간 후에 수확하고 2,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 임의의 세포 또는 파편을 제거하였다. 전형적으로, 500 μl의 배지를 MWCO가 10 kDa인 Amicon™ Ultra 0.5 Centrifugal Units를 사용하여 100 μl로 농축하였다. 25 μl의 5x SDS 로딩 완충액을 샘플에 첨가한 다음, 겔/웨스턴 블롯 분석 전에 95℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 농축된 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고 Amersham Hybond 0.45 μM PVDF 막 위로 옮겼다. 상기 기재된 방법을 사용하여 웨스턴 블롯팅 및 단백질 검출을 항-인간 IgG HRP를 사용하여 수행하였다.
세포 상청액으로부터 농축되고 제조된 단백질 샘플은 Quad 3(46.1 kDa), 4(46.4 kDa), 12(47.8 kDa) 및 13(48.1 kDa)에 상응하는 웨스턴 블롯에서 예상된 분자량으로 특이적 단백질 밴드를 제시한다(도 18a 및 18b). 웨스턴 블롯 발현 데이터는 HEK293T에서 TCR-NHR2 TD 융합 단백질의 가용성 발현을 명백히 제시한다. 이들 데이터는 HEK293T 세포와 같은 진핵생물 세포에서 발현된 TCR-NHR2 TD 융합 단백질의 가용성 발현을 입증하는 첫번째 보고서이다.
사량체성(Quad 3 및 4) 및 팔량체성(Quad 12 및 13) TCR-NHR2 TD 형식 둘 다로부터 가용성 단백질 발현의 검출은 광범위한 설정에서 NHR2 TD의 잠재적인 적용 가능성을 강조한다. NHR2 TD 융합 분자의 사용은 진단 및 영상화에서 사용하기 위한 치료 분자 및 단백질 분자의 제조에 사용될 수 있다.
실시예 6: NHR2 TD에 융합된 항체 단편의 세포내 단백질 발현
NHR2 TD의 다양성을 추가로 예시하기 위해, HEK293T 세포에서 발현을 시험하기 위해 NHR2 TD에 융합된 여러 상이한 항체 단편 형식을 구축하였다.
Quad 14 및 15는 도 11 및 21에 도시적으로 도시된 바와 같이 VH 및 NHR2 TD 사이에 위치한 펩티드 링커와 관계 없이 NHR2 TD에 융합된 항체 VH 도메인을 함유한다. Quad 14 및 15에서 VH 도메인은 GFP(녹색 형광 단백질)에 특이적이다. 이 형식의 여러 다른 버전이 또한 구축되고 치료적으로 유용한 약물 표적에 특이적인 VH로 시험되었다. 결합 도메인의 서열은 표 4에 나열되어 있다. 이들 중 일부는 Quad 34(TNFα에 특이적), Quad 38(VEGF에 특이적), Quad 40(EGFR에 특이적) 및 Quad 44(CD38에 특이적)를 포함한다.
Quad 38 및 44는 각각 EGFR 및 CD138에 특이적인 제2 VH 도메인을 포함하는 추가의 결합 아암(arm)을 포함하도록 추가로 개발되어 Quad 42 및 46을 생성하였다. Quad 42 및 46은 NHR2 TD 도메인을 통해 다량체화하여 이중특이적 사량체를 형성하는 능력을 갖는 이중특이적 분자를 나타낸다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자(인간 IL2)는 Quad 14 및 15의 C-말단에 연결되어 Quad 18 및 19를 생성하며, 이에 의해 VH-NHR2-IL2 분자는 4가 및 이중특이적이다.
또 다른 예에서, 항체 Fab 단편(VH-CH1)을 NHR2 TD(Quad 23 및 24)에 연결하였고 도 12에 도시적으로 도시된 바와 같다. Quad 23 및 24는 면역글로불린 경쇄를 함유하는 제2 쇄와 시험관내에서 공-발현되거나 또는 혼합되고 어셈블리되는 경우 4가 Fab 분자를 나타낸다(예를 들어 Quad 25).
또한 또 다른 예에서, 인간 IgG1 힌지 도메인은 Quad 23 및 24에 포함되었으며, 이는 Quad 26 및 27로 지칭되고 도 13에 도시적으로 도시된 바와 같다. Quad 26 및 27은 면역글로불린 경쇄 도메인을 함유하는 제2 쇄와 시험관내에서 공-발현되거나 또는 혼합되고 어셈블리되는 경우 8가 Fab 분자를 나타낸다(예를 들어 Quad 25).
다음 Quad 벡터, Quad 14, 15, 18, 19, 23, 24, 26, 27, 34, 38, 40, 42, 44 및 46은 모두 His-태그되었으며 HEK293T 세포에서 형질감염시켰다. 단백질 샘플을 상기 기재된 바와 같이 전체 세포 추출물로부터 준비하고, SDS-PAGE 상에서 분리하고 Amersham Hybond 0.45 μM PVDF 막 위로 옮겼다. 특이적 단백질 발현을 TBST, 1% 분말 우유에 1/2500으로 희석된 항-His HRP(Sigma, A7058)를 사용하여 프로빙하였다.
전체 세포 추출물에서의 특이적 단백질 발현은 Quad 14, 15, 18, 19, 23, 24, 26, 27, 34, 38, 40, 42, 44 및 46을 사용하여 시험된 모든 상이한 항체-NHR2 TD 융합 단백질에 대해 검출될 수 있었다(도 19a-d). 흥미롭게도, NHR2 TD의 N-말단에 융합된 VH 결합 도메인 이외에, NHR2 TD 도메인의 C-말단에 융합된 이펙터 도메인(IL2)을 함유하는 Quad 18 및 19는 우수한 단백질 발현을 나타내었다.
Quad 23 및 24 폴리펩티드의 발현은 NHR2 TD를 사용하여 파트너 가용성 Quad 분자(예를 들어 Quad 25)와 시험관내에서 공-발현되거나 또는 혼합되는 경우 4가 항체 Fab 분자를 형성할 가능성을 강조한다. 유사하게 인간 IgG1 힌지 도메인을 포함하는 Quad 26 및 27의 발현은 NHR2 TD를 사용하여 파트너 가용성 제2 파트너 쇄(예를 들어 Quad 25)와 시험관내에서 공-발현되거나 또는 혼합되는 경우 8가 항체 Fab 분자를 형성할 가능성을 강조한다.
NHR2 TD 도메인의 C-말단에 융합된 추가의 VH 도메인을 함유하는 Quad 42 및 46 이중특이적 분자가 또한 우수한 단백질 발현을 나타내었다. 이들 데이터는 NHR2 TD 도메인의 다양성 및 엄청나게 많은 단백질 형식을 개발하기 위한 상이한 결합 및 이펙터 분자에 융합되는 능력을 강조한다. 데이터는 또한 NHR2 TD의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 단백질 분자를 융합하는 것이 가능함을 시사하며, 이는 이중특이적 다가 단백질 분자의 개발을 허용한다.
실시예 7: NHR2 TD에 융합된 항체 단편의 다가 어셈블리
NHR2 TD는 ETO의 사량체성 복합체로의 올리고머화를 담당한다. NHR2 TD 도메인을 사용하여, 실시예 4-6에 제시된 바와 같이 발현에 영향을 미치지 않으면서 N-말단 또는 C-말단 또는 N-말단 및 C-말단 둘 다에 결합 도메인 및 이펙터 분자를 융합하는 것이 가능하다. 결합 도메인은 TCR 가변 및 불변 도메인, 항체 및 항체 단편 또는 이펙터 분자 예컨대 IL2일 수 있다. 또한 NHR2 TD가 자연적으로 세포 내부에서만 발현되는 세포내로 발현된 단백질의 일부임에도 불구하고 NHR2 TD에 융합되는 경우 가용성 형식으로 단백질을 발현하는 것이 가능하다(도 18).
NHR2 TD가 결합 도메인에 융합되면 올리고머화할 가능성을 유지하는지 여부를 입증하기 위해, Quad 14 및 15를 HEK293T 세포에서 발현시키고 단백질 샘플을 상기 기재된 바와 같이 전체 세포 추출물로부터 제조하였다. 단백질 샘플을 변성 및 비-변성(고유) 조건 하에 PAGE 겔 상에서 분리하였다. 고유 겔을 상기 기재된 프로토콜을 사용하여 제조하였지만, SDS는 사용하지 않았다. PAGE 겔로부터의 단백질을 Amersham Hybond 0.45 μM PVDF 막 위로 옮겼다. 특이적 단백질 발현은 항-인간 IgG HRP 검출 항체로 프로빙하였다.
변성 조건 하에 예상된 바와 같이, Quad 14 및 15로부터 VH-NHR2 TD의 발현은 특이적 단백질 밴드가 예상된 분자량(22 및 22.3 kDa)에서 검출될 수 있는 경우 단량체로 볼 수 있다(도 20a). 비-변성 및 따라서 고유 조건 하에, 흥미롭게도 Quad 14 및 15로부터 VH-NHR2 TD의 단량체 또는 이량체를 검출할 수 없었다(도 20b). Quad 14 및 15로부터 VH-NHR2 TD의 사량체인 것으로 여겨지는 높은 분자량 단백질 밴드만이 검출될 수 있다. 사량체의 어셈블리는 단백질 강도 및 Quad 14 및 15의 임의의 검출가능한 단량체 및 이량체의 부재에 의해 판단하여 매우 효율적이고 순수한 것으로 보인다.
실시예 4-7의 데이터와 함께, NHR2 TD가 다양한 단백질 결합 도메인 및 이펙터 분자의 융합을 허용하는 매우 다재다능하다는 결정적인 증거가 있다. NHR2 TD는 HEK293T 세포와 같은 진핵생물 세포로부터 단백질의 가용성 발현을 허용하고 매우 안정하고 순수한 사량체성 분자를 형성한다.
추가 실시예
방법
발현 벡터
모든 DNA 단편을 Twist Bioscience(캘리포니아 소재)에 의해 합성하고 발현 벡터, pEF/myc/cyto(Invitrogen)에 클로닝하였다. 합성된 DNA 단편의 개략도 및 서열은 각각 도 22 및 표 8 -10에 제시되어 있다.
플라스미드 DNA 제조
Twist Bioscience에 의해 합성된 동결건조된 플라스미드 DNA를 MQ 물에 50 ng/μl의 농도로 재현탁하였다. 적격 이. 콜라이 DH5α 세포를 통상적인 열 충격 방법을 사용하여 50 ng의 DNA로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 개별 콜로니를 선별하고 LB 브로쓰에서 37℃, 220 rpm에서 밤새 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 제조업체의 설명서(Qiagen)에 따라 Qiagen 플라스미드 추출 키트를 사용하여 세포로부터 정제하였다.
Expi293F 세포에서 Quad 단백질의 발현
Expi293F™ 세포(Thermo Fisher Scientific)를 제조업체의 권고에 따라 Expi293™ 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. 유일한 예외는 세포가 분열되고 비-통기 캡이 사용되었을 때 5% CO2가 플라스크에 직접 첨가되었다는 점이었다.
상이한 형질감염 시약을 수반하는 2가지 방법을 단백질 발현을 위해 활용하였다. 30ml 배양물에 대한 방법이 아래에 기재되어 있고 프로토콜은 실험적 요건에 따라 확대 또는 축소되도록 채택하였다.
PEI 형질감염을 위해 세포를 NC-3000™(ChemoMetec)을 사용하여 형질감염 하루 전에 계수하고 Expi293™ 발현 배지를 사용하여 1.5 x 106 개 세포/ml로 희석하였다. 세포를 5% CO2에서 37℃, 125 rpm로 밤새 배양하였다. 다음 날 세포를 계수하고, 5 분 동안 1000 rpm으로 스핀 다운시키고 30 ml의 신선한 배지에 2 x 106 개 세포/ml로 재현탁하였다. 33 ug의 플라스미드 DNA를 900 ul 배지에 첨가하고 90 ul의 PEI Max(Polysciences Inc.)를 900 ul 배지에 첨가하였다. DNA 및 형질감염 시약 샘플을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. DNA/형질감염 시약 혼합물을 세포에 첨가하고, 이를 이전과 같이 배양하고 추가 72 시간 동안 인큐베이션하였다.
Expifectamine™ 293 시약(Thermo Fisher Scientific)으로 형질감염시키기 위해 세포를 또한 형질감염 하루 전에 Expi293™ 발현 배지에서 1.5 x 106 개 세포/ml로 희석하였다. 형질감염 당일에 세포를 원심분리하고 30 ml의 신선한 배지에 2.5 x 106 개 세포/ml로 재현탁하였다. 1.5 ml의 Gibco™ Opti-MEM™(Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 튜브 2 개를 준비하였다. 30ug의 플라스미드 DNA를 하나의 튜브에 첨가하고 80 ul의 Expifectamine을 나머지 튜브에 첨가하였다. 용액을 혼합하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. DNA-형질감염 시약 복합체를 세포에 첨가하고, 이를 5% CO2에서 37℃, 125 rpm으로 배양하였다. 16-18 시간 인큐베이션 후, 형질감염 인핸서 1 및 2를 제조업체 프로토콜에 따라 세포에 첨가하였다. 세포를 추가 96 시간 동안 인큐베이션하였다.
His-태그된 단백질의 정제
세포를 4000 rpm으로 10 분 동안 원심분리하여 수확하였다. ~30ml 상청액을 0.22 mm 필터를 통해 여과하고 Complete™ EDTA-무함유 프로테아제 억제제(Roche)를 함유하는 결합 완충액(50mM HEPES, pH 7,4, 250mM NaCl, 20mM 이미다졸)으로 50ml까지 희석하여 칼럼에 결합을 용이하게 하였다. 1ml HisTrap™ HP 칼럼(GE Healthcare)을 AKTA Start(GE Healthcare)에 연결하고 결합 완충액으로 미리 평형화하였다. 단백질-함유 배지를 1 ml/분의 유속을 사용하여 칼럼 위에 로딩하였다. 칼럼을 >10 CV의 결합 완충액으로 세척한 후 단백질을 12ml에 걸쳐 20-300 mM 이미다졸 구배를 사용하여 용출시켰다. 0.5ml 분획을 수집하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질 함유 분획을 풀링하고 Amicon® Ultra 원심분리 필터 장치(Millipore)를 사용하여 농축하였다.
친화성 크로마토그래피 후 단백질을 급속 동결시키고 -80℃에서 저장하고, 여과된 겔의 특이적 적용을 위한 대체 완충액으로 투석하여 다양한 Quad 형식의 분자량을 평가하였다. 나중 분석을 위해, 단백질 샘플을 1.5-2 ml로 농축하고 10 mM HEPES, pH 7.4, 250 mM NaCl을 사용하여 Superdex 75 16/600 칼럼(GE Healthcare) 상에서 겔 여과하였다.
SDS-PAGE
정제된 단백질을 변성 조건 하에 SDS-PAGE 상에서 분리하여 분석하였다. 전형적으로, 1-2 μg의 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔 상의 레인 당 로딩하였다. 겔을 0.1% SDS를 함유하는 Tris-글리신 완충액에서 실행하였다. 150 볼트의 일정한 전압을 사용하고 염료 전면이 완전히 이동될 때까지 겔을 ~70 분 동안 실행하였다.
SDS-PAGE(15% Bis-Tris) 겔은 다음 용해 및 적층 겔을 사용하여 제조하였다.
용해 겔:
ㆍ 5 ml 30% 비스-아크릴아미드
ㆍ 2.6 ml 1.5 M Tris(pH 8.8)
ㆍ 50 μl 20% SDS
ㆍ 100 μl 10% APS
ㆍ 10 μl TEMED
ㆍ 2.2 ml MQ 물
적층 겔:
ㆍ 0.75 ml 30% 비스-아크릴아미드
ㆍ 1.25 ml 1.5 M Tris(pH 8.8)
ㆍ 25 μl 20% SDS
ㆍ 50 μl 10% APS
ㆍ 5 μl TEMED
ㆍ 2.9 ml MQ 물
일반적인 직접 결합 ELISA 검정
정제된 Quad 단백질이 표적 단백질에 결합할 가능성을 직접 결합 ELISA에 의해 확인하였다. 간단히 말해서, 고결합 96 웰 플레이트(Corning)를 재조합 표적 단백질(PBS에 희석되거나 또는 나타낸 바와 같이 1-5 ug/ml)을 코팅하는 데 사용하였으며, 전형적으로 4oC에서 밤새 저장하였다. 그런 다음 플레이트를 200ul 세척 완충액(PBS + 0.1% Tween)으로 3 회 세척하고 200ul 차단 완충액(PBS + 1% BSA)을 사용하여 1 시간 동안 실온에서 차단하였다. 정제된 단백질 샘플을 전형적으로 희석 완충액(PBS + 0.1% BSA)에서 연속적으로 희석하고 100ul/웰에 첨가한다. 샘플을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 200ul 세척 완충액을 사용하여 다시 3 회 세척한다. 제조업체의 권고에 따라 희석된 항-His HRP(Abcam) 검출 항체를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 3x 200ul 세척 완충액을 사용하여 마지막으로 세척하고 50 ul 미리 가온된 검출 시약(TMB - Sigma)을 웰 당 첨가하고 플레이트를 어둠 속에서 10-30 분 동안 인큐베이션한다. 25 ul/웰의 1M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. CLARIOstar 마이크로플레이트 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
실시예 8: 단일특이적 4가 dAb Quad의 발현
p53 사량체화 도메인에 융합된 항체 가변 단편(dAb)(VH 또는 VL, V 또는 V)의 단일 도메인인 다량체 형식("Quad" 형식)이 이 실시예에 예시되어 있다.
항-IL17A에 대한 dAb VH 서열(WO 2010/142551 A2에서 채택된 서열)을 4가 dAb Quad 형식(Quad 57)(서열번호: 146)으로 조작하였다. Quad 57에 대한 발현 벡터를 Twist Bioscience에 의해 합성하고 상기 기재된 바와 같이 HEK293 세포에서 발현시켰다. 분비된 Quad 57 단백질을 세포 상청액으로부터 수집하고 HisTrap HP 칼럼을 사용하여 정제하였다. Quad 57의 가용성 발현 및 순도를 입증하기 위해, 정제된 단백질의 작은 부분(1.5 ug)을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다(도 23). Quad 57에 상응하는 예상된 크기(18 kDa)에서 순수한 단백질을 검출하여 4가 dAb Quad 단백질의 가용성 발현을 확인할 수 있다. 4가 단일특이적 dAb Quad의 도시적 표시는 도 22-A(즉, 도 22a의 구현예 A)에 제시되어 있다.
실시예 9: 이중특이적 4가 dAb Quad의 발현 및 결합 분석
2 개의 상이한 dAb 결합 도메인이 N-말단 및 C-말단을 통해 p53 사량체화 도메인에 연결되고 도 22-C(즉, 도 22a의 구현예 C)에 도시적으로 나타낸 바와 같은 이중특이적 4가 dAb Quad가 이 실시예에 예시되어 있다.
이중특이적 4가 dAb Quad의 특정 예에서, 오조랄리주맙(Ozoralizumab)으로부터 항-TNFa dAb VH 결합 도메인은 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 연결되었고 항-IL17A dAb VH 결합 도메인(WO2010/142551 A2에서 채택된 서열)은 p53 사량체화 도메인(Quad 54)(서열번호: 143)의 C-말단에 연결되었다. 이 특정 예에서 dAb 결합 도메인은 모두 VH였지만, dAb 결합 도메인은 Vκ 또는 Vλ 또는 상이한 dAb 형식의 조합일 수 있다.
이러한 이중특이적 4가 dAb Quad 형식이 가용성 단백질로서 발현될 수 있는지 여부를 입증하기 위해, 이중 항-TNFa 및 항-IL17A dAb 결합 도메인을 함유하는 발현 작제물을 Quad 형식으로 합성하고 HEK293 세포에서 발현시켰다. HisTrap HP 칼럼을 사용하여 세포 상청액으로부터 단백질 정제 후, ~1.5 ug의 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다(도 24a). SDS-PAGE 겔로부터, 예상된 크기(30.7 kDa)의 순수한 생성물을 볼 수 있었으며, 가용성 이중특이적 4가 dAb Quad의 발현을 확인한다.
이러한 이중특이적 4가 항-TNFa x 항-IL17A dAb Quad의 기능성을 추가로 예시하기 위해, 직접 결합 ELISA 검정을 수행하였다. 높은 단백질 결합 96 웰 플레이트(corning)를 1 ug/ml 재조합 인간 TNFa 단백질(Abcam)로 코팅하고 직접 결합 ELISA 검정을 상기 기재된 방법을 사용하여 연속으로 희석된 Quad 54 단백질로 수행하였다. 전형적인 S자형 용량 반응 곡선을 낮은 pM 범위(~10 pM)에서 절반 최대 결합으로 재조합 인간 TNFa 단백질을 사용한 Quad 54 직접 결합 ELISA로부터 산출하였다(도 24b). 이는 이중특이적 4가 항-TNFa x 항-IL17A dAb Quad가 가용성 단백질로서 발현될 수 있을 뿐만 아니라, 높은 결합 강도로 표적 단백질에 결합할 수 있다는 점에서 또한 기능적임을 확인한다. 높은 결합 강도는 4가 결합을 통해 얻은 증가된 결합력의 척도일 가능성이 있고 이는 Quad 다가 분자의 중요한 특징을 강조한다.
실시예 10: 단일특이적 4가 scFv Quad의 발현, 결합 및 기능적 분석
이 실시예에서, 2 개의 상이한 표적에 대한 scFv 결합 도메인을 선택하고 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 개별적으로 연결하여 도 22-D(즉, 도 22b의 구현예 D)에 도시적으로 나타낸 바와 같은 단일특이적 4가 scFv Quad를 생성하였다.
일 예에서 scFv 결합 도메인은 VH 및 Vκ 서열이 Humira로부터 scFv Quad 형식으로 채택된 항-TNFa였다. 펩티드 링커의 존재가 표적 단백질에 대한 Quad 분자의 발현 및 결합에 영향을 미쳤는지 여부를 분석하기 위해, 이 실시예에서 항-TNFa scFv 결합 도메인을 (G4S)3 펩티드 링커(Quad 63)(서열번호: 147)를 통해 또는 펩티드 링커(Quad 51)(서열번호: 139) 없이 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 연결하였다.
또 다른 예에서, scFv 결합 도메인은 Wu 등(Wu et al. 2001)으로부터 채택된 항-CD20이었다. 항-CD20 scFv 결합 도메인을 펩티드 링커(Quad 53 Tet)(서열번호: 141) 없이 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 결합 도메인을 직접 연결함으로써 4가 Quad 형식으로 조작하였다.
모든 4가 scFv Quad를 HEK293 세포로 형질감염시키고 배양 상청액으로부터의 가용성 단백질을 상기 기재된 바와 같이 HisTrap™ HP 칼럼을 사용하여 정제하였다. 소량의 정제된 단백질(~1.5 ug)을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하여 발현 및 순도를 확인하였다.
항-TNFa scFv Quad(Quad 51 및 63)는 가용성 단백질을 잘 발현시키는 것으로 밝혀졌고 scFv를 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 연결하는 펩티드 링커의 존재 또는 부재는 발현에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다(도 25a). 또한 분비된 가용성 Quad 단백질의 순도는 매우 순수한 것으로 보인다(>99%). 이들 Quad를 추가로 특성화하기 위해, Quad 51 및 Quad 63을 둘 다 재조합 인간 TNFa(Abcam)를 사용하여 직접 결합 ELISA 검정으로 분석하였다. 고결합 96 웰 플레이트(Costar)를 1 ug/ml의 인간 TNFa 단백질로 코팅하고 ELISA 결합 검정을 상기 기재된 바와 같은 연속으로 희석된 Quad 51 및 Quad 63 단백질을 사용하여 수행하였다. 결합 시 용량 의존적 증가는 Quad 51 및 Quad 63 둘 다에서 관찰되었으며 이들 항-TNFa scFv가 올바르게 어셈블리되었고 이들의 고유 결합 기능성이 이 Quad 형식으로 유지되었음을 확인하였다. 또한, Quad 51 및 Quad 63에 대한 결합 프로파일은 낮은 pM 범위(~30 pM)에서 절반 최대 결합 농도를 갖는 두 Quad와 매유 유사한 것으로 밝혀졌다(도 25b). 종합하면, 이들 데이터는 펩티드 링커의 존재 또는 부재가 표적 단백질에 대한 단백질 발현 또는 Quad 결합 강도에 영향을 미치지 않음을 입증한다.
TNFa를 중화하는 항-TNFa Quad 51 분자의 활성을 추가로 기능적으로 특성화하기 위해, TNFa에 고도로 민감한 WEHI-13VAR 세포(ATCC)를 사용하여 세포 기반 검정을 수행하였다. WEHI 세포를 사용한 생물검정을 아래에 기재된 바와 같이 설정하였다. 1가 항-TNFa(W51ScFv)를 대조군(서열번호: 150)으로서 검정에 포함하였고 Humira를 양성 대조군으로 사용하였다. p53 사량체화 도메인이 제거된 경우 Quad 51을 변형시켜 W51ScFv를 생성하였다. W51ScFV의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다(도 25c).
간단히 말해서, WEHI-13VAR 세포를 RPMI-1640, 10% FBS에서 96-웰 플레이트의 웰 당 1 x 104 개 세포로 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 배지를 세포로부터 흡인하고 2 ug/ml 악티노마이신 D, 0.1 ng/ml 재조합 인간 TNFα(ab9649, Abcam) 및 0-2400 pM Q51, Q35, W51ScFV 및 Humira를 함유하는 배지로 교체하였다. 샘플을 TNFα 및 항체 대조군 없이 사중으로 설정하였다. 세포를 추가 20-22 시간 동안 표준 배양 조건 하에 인큐베이션하였다.
세포 생존력을 평가하기 위해, 대사적으로 활성 세포에 의해 생성된 ATP를 제조업체의 설명서에 따라 CellTiterGlo 발광 세포 생존력 검정(Promega)을 사용하여 정량화하였다. 발광 신호를 CLARIOstar 마이크로플레이트 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 측정하였다. 화합물 처리된 세포로부터 수득된 발광 신호를 대조군의 배지에 대해 정규화하였다. WEHI 세포의 50%가 생존력을 유지하는 유효 용량(ED)을 계산하였고 Quad 51, Humira 및 W51ScFV에 대한 ED50은 표 11에 요약되어 있다.
예상된 바와 같이, 4 개의 항-TNFa 결합 도메인을 갖는 Quad 51은 TNFa에 대한 2 개의 결합 도메인을 갖는 Humira와 비교하여 WEHI 세포에 대한 재조합 인간 TNFa 단백질의 세포독성 효과를 중화하는 데 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. TNFα에 대한 단일 결합 도메인만을 갖는 W51ScFv 대조군은 가장 높은 ED50을 가졌다. TNFa에 대한 항-TNFa 분자의 원자가 증가는 ED50 값의 감소와 역으로 상관관계가 있었다. 이들 데이터는 원자가가 증가함에 따라 Quad 분자의 기능적 효능이 향상됨을 강조하며 이는 다양한 연구에 의해 보고된 바와 같이 결합력 대 효능의 일반적인 개념과 일치한다(Alam et al. 2018; Rudnick & Adams 2009; Adams et al. 2006; Bru　nker et al. 2016). 또한, Quad 분자의 결합력 증가는 종양 세포에서 고도로 발현되는 종양 연관된 항원을 선택적으로 유도하여 Slaga 등(Slaga et al. 2018)에 의해 요약된 실시예에서 보고된 바와 같이 건강한 세포에 대한 표적외 종양 효과를 제한하는 데 사용될 수 있다.
카스파제 3의 TNFa 유도된 활성화를 차단하는 항-TNFa Quad 51의 능력을 추가로 입증하기 위해, 대조군으로서 Humira 및 W51ScFv와 함께 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, WEHI-13VAR 세포를 배양 배지(RPMI-1640, 10% FBS)에서 6-웰 플레이트의 웰 당 2.5 x 106 개 세포로 시딩하고 밤새 인큐베이션하였다. 배지를 2 ug/ml 악티노마이신 D, 1 ng/ml 재조합 인간 TNFα 및 500 pM의 Quad 51, W51ScFV 및 Humira를 함유하는 배지로 교체하였다. 배양 배지 단독 및 2 ug/ml 악티노마이신 D를 함유하는 배양 배지를 대조군으로서 포함하였다. 세포를 TNFα 및 +/- 항-TNFa 분자와 함께 10 시간 동안 인큐베이션하였다.
세포를 1 mM DTT 및 Complete™ EDTA-무함유 프로테아제 억제제(Roche)를 함유하는 RIPA 완충액(50mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS)을 사용하여 용리하였다. 세포 용리물을 Bioruptor® Pico Sonication System(Diagenode)을 사용하여 초음파처리하고 각 샘플의 단백질 농도를 Pierce BCA 단백질 검정 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량화하였다. 10ug의 단백질을 12% Bis-Tris 겔 상에서 전기영동하고 이후에 밴드를 Amersham™ Hybond® P 0.45 mm PVDF 막(GE Healthcare)으로 옮겼다. 막을 10%-BSA-TBST 또는 5%-우유-TBST로 차단한 후에 적절한 항체(항 카스파제-3(1/1000, CST, 9665) 및 항-절단된 카스파제-3(1/100, CST, 9664)과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 TBST로 세척하고 항-토끼 IgG HRP-결합(1/2500, CST, 7074S) 2차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 철저하게 세척한 후, 막을 Pierce™ ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Fisher Scientific) 및 CL-XPosure™ 필름(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 현상하였다.
웨스턴 블롯으로부터, Quad 51이 Humira와 유사하게, 검출가능한 절단된 카스파제-3 없이 카스파제-3의 TNFa 매개된 활성화를 효과적으로 중화할 수 있음을 알 수 있다(도 25d). 반면에 ED50 값이 높은 1가 W51ScFv 항-TNFa 대조군 분자는 카스파제-3의 TNFa 매개된 활성화를 완전히 중화할 수 없고 이는 이 샘플에서 절단된 카스파제-3의 존재에 의해 나타낸다. 이들 데이터는 Quad 51의 작용 메커니즘이 Humira™과 유사한 신호전달 메커니즘을 통한 것임을 확인한다.
두번째 실시예에서, 항-CD20 scFv Quad(Quad 53 Tet)를 HEK293 세포에서 발현시켰고 정제 후, 단백질 발현 분석 및 단백질 결합 검정을 수행하였다. SDS-PAGE 분석은 Quad 53 Tet의 가용성 발현을 고도로 순수한 단백질(>99%)로 확인하였다(도 25e). 연속으로 희석된 Quad 53 Tet 단백질을 사용하여 재조합 인간 CD20 단백질(Abcam)을 사용한 ELISA 결합 검정은 결합 시 용량 의존적 증가를 확인하였다. CD20에 대한 결합을 유지하는 항-CD20 scFv Quad의 능력은 이 Quad 형식의 기능적 분자로 정확한 어셈블리를 다시 한번 확인하였다(도 25f).
실시예 11: 단일특이적 8가 scFv Quad의 발현 및 결합 분석
이 실시예에서, scFv 결합 도메인의 원자가는 4(4가)에서 8(8가)로 증가하였다. 이는 도 22-E에 도시적으로 나타낸 바와 같이 p53 사량체화 도메인의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 scFv를 연결함으로써 달성되었다.
실시예 10에 기재된 바와 같이, 단일특이적 8가 항-CD20 scFv Quad(Quad 53 Oct)(서열번호: 142)를 구축하기 위해 이 실시예에서 항-CD20 scFv 결합 도메인을 사용하였다. 이 특정 예에서, scFv는 펩티드 링커 없이 p53 사량체화 도메인의 N-말단 및 C-말단에 연결되었지만, 이 형식의 다른 예에서, 펩티드 링커는 결합 도메인의 유연성을 돕기 위해 한쪽 또는 양쪽 끝에 도입될 수 있었다.
배양 상청액으로부터 Quad 53 Oct 단백질의 발현 및 정제 후, 단백질 발현 분석 및 ELISA 결합 검정을 수행하였다. SDS-PAGE 겔 상에서 분리된 단백질은 Quad 53 Oct의 가용성 발현을 고순도(>99%)로 확인하였다(도 26a). ELISA 결합 검정을 또한 재조합 CD20 및 연속으로 희석된 Quad 53 Oct 단백질을 사용하여 수행하였다(도 26b). 결합 시 용량 의존적 증가를 볼 수 있었으며 이는 8가 형식에서 항-CD20 scFv의 정확한 어셈블리를 확인하였다.
표적 단백질 결합에 대한 원자가 증가의 효과를 분석하기 위해, 사량체화 도메인이 없는 scFv 항-CD20을 1가 대조군(Quad 53 Mon)(서열번호: 140)으로 작용하도록 구축하였다. 단백질 발현 및 정제 후, 모든 3 개의 Quad 53 항-CD20 scFv 분자(1가, 4가 및 8가)를 SDS-PAGE 겔 상에서 나란히 분리하고(도 26c) ELISA 결합 검정을 수행하였다(도 26d). 모든 3 개의 Quad 53 분자에 따라, 결합 시 용량 의존적 증가를 볼 수 있었고 결합 강도의 전반적인 증가는 원자가 증가에 의해 반영되었다. 8가 항-CD20 scFv 버전이 가장 높은 전반적인 결합 강도를 갖는 것으로 밝혀졌고, 이어서 4가 및 그 다음에 1가 버전이 뒤를 이었다. 표적 단백질이 96 웰 플레이트에 조밀하게 코팅되어 CD20에 대한 빠른 Quad 53 결합 포화를 초래하는 직접 결합 ELISA의 성질로 인해, 실제 결합력(총 결합 강도)은 이 방법을 사용하여 정확하게 결정할 수 없다는 점에 주목할만하다. 직접 결합 ELISA의 이러한 제한에도 불구하고, 결합 시 대표적인 증가가 도 26d에서 볼 수 있는 바와 같이 원자가 증가에 따라 여전히 관찰될 수 있다.
실시예 12: 이중특이적 4가 scFv Quad의 발현 및 결합 분석
이 실시예에서, 2 개의 상이한 표적 단백질에 대한 특이성을 갖는 2 개의 상이한 scFv 결합 도메인을 N-말단 및 C-말단을 통해 p53 사량체화 도메인에 연결하여 도 22-F에 도시적으로 예시된 바와 같은 이중특이적 4가 scFv Quad를 제공하였다.
이 실시예에서 사용된 특이적 scFv 결합 도메인은 항-TNFa 및 항-IL17A에 대한 특이성을 갖는다. 항-TNFa scFv 서열은 Humira로부터 채택되었고 항-IL17A scFv 서열은 익세키주맙(Ixekizumab)(Eli Lilly)으로부터 이중특이적 Quad 형식(Quad 55)(서열번호: 144)으로 채택되었다. 가용성 발현을 확인하기 위해, Quad 55를 HEK293 세포에서 발현시키고 분비된 단백질을 배양 상청액으로부터 정제한 후 단백질 분석하였다. (도 27a). SDS-PAGE에 의해 분석된 단백질은 이 이중특이적 scFv Quad 형식의 가용성 발현을 고순도(>99%)로 확인하였다. 이 형식이 기능적이었는지 여부를 추가로 분석하기 위해, 항-TNFa scFv 아암에 대한 ELISA 결합 검정을 수행하였다(도 6b). Quad 55의 재조합 인간 TNFa에 대한 결합 시 용량 의존적 증가를 볼 수 있었으며 이는 Quad 55가 정확하게 어셈블리되었음을 확인하였다. 또한, Q55는 낮은 pM 범위에서 실시예 10에 상세히 설명된 Quad 51의 것과 유사한 절반 최대 결합을 갖는 것으로 보인다.
실시예 13: 이중특이적 4가 scFv x dAb Quad의 발현 및 결합 분석
이 실시예에서, 2 개의 상이한 표적 단백질에 대한 특이성을 갖는 2 개의 상이한 결합 도메인 형식을 도 22-G에 도시적으로 예시된 바와 같이, 각각 p53 사량체화 도메인의 N-말단 및 C-말단에 연결하였다.
제1 결합 도메인은 실시예 12에 상세히 기재된 바와 같은 항-TNFa scFv이며, N-말단을 통해 p53 사량체화 도메인에 연결되었다. 제2 결합 도메인은 서열분석된 항-IL17A dAb였으며, 실시예 9에 상세히 기재된 바와 같이 C-말단을 통해 p53 사량체화 도메인에 연결되었다(Quad 56)(서열번호: 145).
이 이중특이적 4가 scFv x dAb Quad 형식의 가용성 발현은 SDS-PAGE 겔 상에서 정제된 단백질을 분석함으로써 확인하였다(도 28a). 추가의 ELISA 결합 검정에서 항-TNFa 결합 아암에 대해 수행되었으며(도 28b), 여기서 결합 시 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 이는 이 이중특이적 scFv x dAb Quad 형식의 정확한 발현 및 어셈블리를 확인하였다.
상기 실시예(실시예 10, 12 및 13)에서 항-TNFa x 항-IL17A에 대한 특이성을 갖는 상이한 이중특이적 Quad 형식(Quad 54-56)을 생성하고 항-TNFa 결합 아암에 대한 ELISA 결합 검정에 의해 발현 및 기능성에 대해 분석하였다. 지금까지 제시된 데이터로부터, p53 사량체화 도메인은 매우 다재다능하고 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 둘 다에서 상이한 결합 도메인과 융합할 수 있음이 분명하다. Quad 54-56의 기능적 결합 강도를 비교하기 위해, 상이한 이중특이적 Quad의 항-TNFa 결합 아암에 대한 ELISA 결합 검정 데이터를 나란히 플롯팅하였다(도 28c). 모든 3 개의 이중특이적 Quad 형식에 대한 용량 반응 곡선은 결합 도메인 형식(scFv 또는 dAb)이 결합에 영향을 미치지 않음을 나타내는 것과 매유 유사한 것으로 보인다. 이는 높은 결합 강도를 갖는 고도로 순수한 다가 가용성 단백질을 생성하는 p53 사량체화 도메인의 다양성 및 유용성을 추가로 강조한다.
실시예 14: 4가 단일특이적 Ig scFv Quad v1의 발현 및 결합 분석
이 실시예에서, scFv 결합 도메인을 코어 및 상부 힌지 영역 없이 IgG1 Fc의 하부 힌지/CH2 도메인에 연결하여 scFv 단량체성 Ig Fc(scFv-mFc)를 생성하였으며, 즉 여기서 Fc는 다량체가 폴리펩티드 단량체를 사용하여 형성되었을 때 또 다른 Fc와 쌍을 이루지 않는다. 전형적으로 코어 힌지 영역에 존재하는 시스테인 잔기를 포함하는 CXXC 모티프는 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 것을 담당한다. 따라서, 코어 힌지 영역을 배제함으로써, Fc 영역은 고유 IgG 항체에서 전형적으로 발견되는 단단히 패킹된 동종이량체 구조를 형성하는 것이 억제된다. 하부 힌지/CH2 도메인은 온전하게 유지되어 이펙터 기능에 필요한 Fcγ-수용체와의 적절한 상호작용을 허용하였다.
scFv-mFc를 N-말단을 통해 p53 사량체화 도메인에 연결함으로써 Quad 형식으로 조작하여 도 22-I(즉, 도 22d에 제시된 구현예 I)에 도시적으로 나타낸 바와 같이 버전 1로 명명된 4가 단일특이적 Ig scFv Quad를 생성하였다.
이 실시예에서 상부 힌지가 또한 제거되었지만, 다른 실시예에서 상부 힌지 영역은 임의적으로 완전히 유지되거나 또는 단지 부분적으로 온전하게 유지되어 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 특이성을 갖는 dAb 단량체성 Ig Quad(도 22-H, L, W, X, Y, Z, AA, AB 및 AC에 도시적으로 예시됨), scFv 단량체성 Ig Quad(도 22-I, M, X, 및 AA에 도시적으로 예시됨) 및 Fab 단량체성 Ig Quad(도 22-J, K, N 및 O에 도시적으로 예시됨)를 생성할 수 있다. 이 특정 실시예에서 , 인간 IgG1이 예로서 사용되었지만, Fc 영역은 IgG2, IgG3, gG4 또는 이의 유도체를 포함한 다른 IgG 이소형 중 임의의 것일 수 있다. 인간 IgG 힌지 영역을 암호화하는 아미노산 서열은 표 12에 제시되어 있다.
이 특정 실시예에 사용되는 scFv 결합 도메인은 실시예 10에 기재된 항-CD20의 것이었다. 항-CD20 scFv를 펩티드 (G4S)3 링커를 통해 Fc의 하부 힌지/CH2 도메인에 연결하였다. p53 사량체화 도메인을 임의의 펩티드 링커 없이 CH3 도메인의 C-말단에 직접 연결하였다(Quad 64)(서열번호: 148). 임의적 링커는 유연성을 제공하기 위해 CH3 도메인 및 다량체화 도메인 사이의 이 접합부에 포함될 수 있다.
Quad 64 발현 및 정제 후, 단백질을 정량화하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 29a). Nanospec을 사용한 단백질 정량화는 HisTrap HP 칼럼 정제 후 130 mg/L에 등가인 단백질 수율로 높은 단백질 수율을 확인하였다. 또한, SDS-PAGE 겔 상에서 볼 수 있는 예상된 크기(58.2 kDa)에서의 단일 단백질 밴드는 고도로 순수한(>99%) 4가 단량체성 Ig scFv Quad 단백질의 발현을 확인하였다. 발현된 Ig Quad 단백질이 정확하게 어셈블리되었는지를 분석하기 위해, ELISA 결합 검정을 수행하였다(도 29b). Quad 64는 용량 의존적 방식으로 재조합 인간 CD20에 대한 결합을 유지하는 것으로 밝혀졌으며 이는 정확하게 어셈블리되고 기능적으로 활성이었음을 확인하였다.
실시예 15: 4가 단일특이적 Ig scFv Quad v2의 발현 및 결합 분석
이 실시예에서, 항-CD20 scFv 결합 도메인이 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 직접 연결된 경우 실시예 14에 기재된 4가 단량체성 Ig scFv Quad의 상이한 버전을 구축하였다. 하부 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 mFc를 p53 사량체화 도메인의 C-말단에 직접 연결하였다. 4가 단량체성 Ig scFv Quad의 이러한 버전은 버전 2라고 명명되며 도 22-M(즉, 도 22f에 제시된 구현예 M)에 도시적으로 나타낸다.
아래에 기재된 특정 실시예에서, 상부 힌지는 포함되지 않았지만, 다른 실시예에서 상부 힌지 영역은 임의적으로 완전히 유지되거나 또는 단지 부분적으로 온전하게 유지될 수 있다.
다른 실시예에서, 버전 2 구성은 도 1-L, X, Z 및 AA에 도시적으로 예시된 바와 같은 dAb 결합 도메인을 함유할 수 있으며, 이는 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적 특이성을 갖는 Quad 분자를 생성한다. 또 다른 예에서, 결합 도메인은 도 22-N 및 O에 도시적으로 예시된 바와 같이 Fab일 수 있다. 또한 또 다른 예에서, 버전 2는 mFc 없이 제조되어 단일특이적(도 22-Q 및 R에 도시적으로 예시됨) 또는 이중특이적(도 22-S에 도시적으로 예시됨)으로 4가 Fab를 제공할 수 있다.
CD20에 특이적인 4가 단량체성 Ig scFv Quad 버전 2에 대한 발현 작제물(Quad 65)(서열번호: 149)을 HEK293 세포에서 발현시키고 가용성 분비된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. Nanospec을 사용한 단백질 정량화는 HisTrap HP 칼럼 정제 후 160 mg/L에 등가인 단백질 수율로 높은 단백질 수율을 확인하였다. 또한, SDS-PAGE 겔 상에서 볼 수 있는 예상된 크기(57.2 kDa)에서의 단일 단백질 밴드는 고순도(>99%)로 발현을 확인하였다(도 30a). 발현된 단백질의 무결성은 ELISA 결합 검정에 의해 분석하였다. 재조합 인간 CD20 단백질을 연속으로 희석된 Quad 65 단백질을 사용한 직접 결합 ELISA에 사용하였다. Quad 65는 용량 의존적 방식으로 CD20에 결합하는 것으로 밝혀졌으며(도 30b) 이는 정확하게 어셈블리하고 기능적으로 활성이었음을 확인하였다.
상기 및 실시예 14에 요약된 데이터는 4가 단량체성 Ig 분자의 가용성 및 기능적 발현의 첫번째 예를 나타낸다. 이러한 다가 단량체성 Fc 형식은 Fc가 결여되어 있는 스캐폴드 및 항체 단편 기반 분자에 비해 여러 이점을 가질 수 있다. 먼저, 단량체성 Quad 형식에서 Fc 영역의 존재는 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합을 허용하여 생체내에서 이들 분자의 연장된 반감기를 제공할 것이다. 두번째로, Fc 영역의 존재는 1가 단량체성 Ig Fc 분자에 대해 보고된 바와 같이 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(CDC)과 같은 이펙터 기능을 유도하기 위해 다중 Fc 수용체에 결합하는 능력을 가질 것이다(Ying et al. 2017; Ying et al. 2012). 세번째로, 이 실시예에 요약된 개념 증명 데이터는 임의의 주어진 단클론 IgG 항체가 도 22- J, K, N 및 O에 도시적으로 나타낸 바와 같이 다가 단량체성 Ig Quad 형식으로 빠르게 형식화될 수 있음을 시사한다). IgG 항체의 고유 결합 도메인 구조를 유지하는 이들 형식에 따라, 다가 단량체성 Ig Quad 형식은 다중원자가를 통해 얻은 결합력 증가로 인해 표적 단백질에 대한 결합 강도가 실질적으로 증가될 것이다. 이러한 단량체성 Ig Quad 형식은 표적 단백질 중화 가능성이 향상된 치료 분자의 신규 부류를 제공하고(Boruah et al. 2013; Shen et al. 2019) 뿐만 아니라 세포 표면 수용체에 교차 연결하여 세포자멸사를 유도하는 효율성이 향상되고(Li et al. 2018) 향상된 작용적 가능성을 갖는 수용체 슈퍼-클러스터링을 통해 신호전달을 유도할 것이다(Mayes et al. 2018).
실시예 16 8가 이중특이적 Quad의 발현
8가 이중특이적 Quad의 특정 실시예에서, PD-L1 및 4-1BB에 대한 dAb 결합 도메인은 암의 치료를 위한 면역 체크포인트 억제제 및 면역 공-자극 분자의 이중 표적화를 위해 사용되었다. 다른 실시예에서, dAb 결합 도메인은 이중 체크포인트 억제제 이중특이적 다량체(예를 들어 PD-L1 x CTLA-4) 또는 이중 체크포인트 억제제 및 면역 공-자극 이중특이적 다량체(예를 들어 PD-L1 x 4-1BB) 또는 이중 면역 공-자극 이중특이적 다량체(예를 들어 4-1BB x OX40)를 제공하기 위해 임의의 면역 체크포인트 억제제 및 임의의 공-자극 분자 또는 이의 혼합물에 대한 특이성을 가질 수 있다.
8가 이중특이적 Quad를 예시하기 위해, 2 개의 상이한 버전을 구축하여 가용성 Quad 단백질 발현을 입증하였다. 하나의 형식에서, PD-L1 및 4-1BB dAb 결합 도메인을 도 31-A에 도시적으로 나타낸 바와 같이 N-말단 또는 C-말단에서 탠덤 dAb로서 p53 다량체화 도메인에 연결하였다.
8가 이중특이적 다량체의 두번째 실시예에서, PD-L1 및 4-1BB에 대한 dAb 결합 도메인을 도 31-B에 도시적으로 나타낸 바와 같이 각각 반대쪽 끝에서 p53 사량체화 도메인에 연결하였다.
PD-L1 및 4-1BB에 대한 dAb 결합 도메인 서열은 WO2017/123650A2로부터 채택되었다. 8가 이중특이적 Quad의 첫번째 버전에서, N-C 말단 방향으로 항-PD-L1 및 항-4-1BB를 함유하는 탠덤 dAb를 임의의 펩티드 링커 없이 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 연결하였다. 이 버전을 Quad 68(서열번호: 190)이라고 지칭한다. 그러나, 다른 실시예에서, 탠덤 dAb는 임의적 펩티드 링커를 통해 표 8-P에 추가로 기재된 바와 같이 사량체화 도메인에 연결될 수 있다.
8가 이중특이적 Quad 다량체의 두번째 버전에서, 항-PD-L1 dAb를 p53 사량체화 도메인의 N-말단에 연결하고 항-4-1BB dAb를 C-말단에 연결하였다. 이 버전을 Quad 69(서열번호: 191)라고 지칭한다. 이 특정 실시예에서 dAb를 임의의 펩티드 링커 없이 사량체화 도메인에 연결하였다. 그러나, 다른 실시예에서, dAb는 임의적 링커를 통해 표 8-C에 추가로 기재된 바와 같이 사량체화 도메인에 연결될 수 있다.
Quad 68 및 69에 대한 발현 작제물을 HEK293에서 발현시켰고 분비된 가용성 단백질을 배양된 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 Quad 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 31-C 및 D). Nanospec를 사용한 Quad 68 및 Quad 69의 단백질 정량화는 HisTrap HP 칼럼 정제 후 각각 297 mg/L 및 360 mg/L에 등가인 단백질 수율로 높은 단백질 수율을 확인하였다. SDS-PAGE 겔 상에서 볼 수 있는 예상된 크기(32 kDa)에서 Quad 68 및 Quad 69 둘 다에 대한 단일 단백질 밴드의 존재는 고순도(>99%)로 발현을 확인하였다(도 31-C 및 D).
탠덤(Quad 68에서와 같이) 또는 반대 방향에서(Quad 69에서와 같이) dAb의 구성은 4-1BB를 발현하는 T 세포보다 더 높은 효능 및 선택적으로 PD-L1을 통해 암 세포와 결합할 것으로 예상된다. 따라서, T 세포는 암 세포가 Quad 분자와 결합되어 안전성 프로파일이 개선된 선택적 T 세포 활성화를 허용하는 경우에만 암 세포에 우선적으로 동원될 것이다.
실시예 17: 4가 단량체성 Ig dAb Quad 및 8가 Fab-유사 dAb 단량체성 Ig Quad의 발현
실시예 9에 상세히 기재된 바와 같은 TNFα에 대한 특이성을 갖는 dAb VH를 또한 이 실시예에 사용하여 단량체성 Ig dAb Quad의 2 개의 새로운 버전을 생성하였다. 첫번째 버전에서, 항-TNFα dAb VH를 IgG CH1에 직접 연결하였다. CH1 영역을 힌지 영역이 코어 힌지가 제거되도록 변형된(서열번호: 168 힌지 서열 사용) IgG1 Fc에 연결하였다. Fc 영역을 p53 TD 도메인의 N-말단에 연결하여 Quad 92를 생성하였다. Q92에서 CH1 영역의 존재는 Q92가 항-TNFα dAb와 공-발현될 때 카파 경쇄 불변 도메인에 연결되는 단량체성 Ig Quad의 두번째 버전의 생성을 허용하여 도 33a에 도시적으로 나타낸 바와 같은 8가 항-TNFα Fab-유사 dAb 단량체성 Ig Quad(Q93)를 생성하였다. Q92 및 Q93의 분자 설계는 도 33b 및 c에 도시적으로 나타낸다.
Q92 단독 또는 Q92 + Q93을 HEK293 세포에서 발현시키고 Quad 단백질을 세포 상청액으로부터 직접 정제하였다. 정제된 단백질을 예상된 분자량(Q92 (4가) - 55 kDa 및 Q92+Q93 (8가) - 79 kDa)에서 순수한 생성물을 볼 수 있는 SDS-PAGE에 의해 분석하여 이들 Quad 형식의 가용성 발현을 확인하였다(도 33d). 이 특정 실시예에서, dAb 4가 버전이 CH1 영역에서 유지되었지만, 또 다른 예에서 CH1 도메인이 제거되어 도 22f에 도시적으로 나타낸 바와 같이(도면에 L로 포함) 4가 dAb Quad의 약간 변형된 버전을 생성할 수 있었다.
실시예 18: 단일특이적 및 이중특이적 8가 탠덤 dAb 단량체성 Ig Quad의 발현
이 실시예에서, 실시예 14에 예시된 것과 유사하게 단량체성 Ig Quad의 2 개의 상이하 버전을 생성하였다. 그러나, 결합 도메인으로 scFv를 사용하는 대신에, 이 특정 실시예에서 항체 단일 도메인(VH)을 PDL1 단독 또는 PDL1 + 4-1BB에 대한 특이성과 탠덤으로 연결하였다. 이들 실시예 중 첫번째에서, 탠덤 항-PDL1 dAb를 가요성 링커에 의해 분리된 항-4-1BB dAb와 연결함으로써 이중특이적 8가 항-PDL1/4-1BB 단량체성 Ig dAb Quad(Q113)를 생성하였다. 이 탠덤 이중특이적 결합 분자를 코어 힌지 영역 없이 IgG1 Fc의 하부 힌지/CH2 영역에 연결하여 탠덤 dAb 단량체성 Ig Fc를 생성하였다(즉, 생성된 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 항-PDL1 dAb, 항-4-1BB dAb, 코어 힌지 영역이 없이 IgG1 Fc의 하부 힌지/CH2 영역 및 IgG1 CH3을 포함함). Fc 영역을 p53-TD 도메인의 N-말단에 연결하여 도 22o에 도시적으로 나타낸 바와 같은 이중특이적 탠덤 dAb 단량체성 Ig Fc Quad를 생성하였다. 이 실시예에서, 항-PDL1 및 항-4-1BB dAb 도메인 둘 다의 결합 원자가는 표적 단백질에 대해 4가였다. 이는 Ig Fc 영역을 함유하는 다가 4 + 4 (8가) 이중특이적 항체의 예이다. 두번째 예는 탠덤 dAb가 8가 항-PDL1 단량체성 Ig Quad(Q114)를 생성하는 항-PDL1 dAb 도메인으로만 이루어진다는 점을 제외하고, Q113과 정확하게 동일하였다.
HEK293 세포에서 Quad 113 및 Q114를 발현하고 세포 상청액으로부터 단백질을 정제한 후, 회수된 단백질을 SDS- PAGE에 의해 분석하였다(도 34a 및 b). Q113 및 Q114 둘 다에 대해, 예상된 분자량에서의 단일 순수한 단백질 밴드를 관찰하였으며 이는 고도로 순수한(>99%) 가용성 Quad 단백질로서 이들 단량체성 Ig Quad의 발현은 확인하였다.
실시예 19: Fab 단량체성 Ig Quad의 발현
이 특정 실시예에서, 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 고유 쌍형성이 온전하게 유지된 IgG 단클론 항체로부터 단량체성 Ig Quad를 생성하였다. 이는 IgG 단클론 항체의 Fab 단편을 취하고 도 22e에 도시적으로 나타낸 바와 같이(도면에 J로 포함) 단량체성 Ig Quad로 전환함으로써 달성되었다. 이러한 Quad 형식을 예시하기 위해, 2 개의 임상적으로 승인된 단클론 항체로부터의 Fab 단편을 사용하였다(아달리무맙(Humira™) 및 아벨루맙(Bavencio™)). Humira 또는 아벨루맙의 VH-CH1 도메인을 코어 힌지 영역 없이 IgG1 Fc의 하부 힌지/CH2 영역에 연결하였다. Fc 영역을 p53-TD 도메인의 N-말단에 연결하여 단량체성 Ig Quad 쇄를 생성하였다. Humira 및 아벨루맙 Fab 단량체성 Ig Quad를 생성하기 위해, 고유 경쇄 VL-CL을 HEK293 세포에서 각각의 단량체성 Ig Quad 쇄와 공-발현시켰다.
Fab 단량체성 Ig Quad 단백질을 세포 상청액으로부터 정제하고 초기에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 35a 및 b). Humira 또는 아벨루맙 Fab 단량체성 Ig Quad에 상응하는 비-환원된 변성 SDS-PAGE 겔 상의 예상된 분자량에서의 단일 단백질 밴드의 검출은 이들 단량체성 Ig 형식의 가용성 발현 및 고순도 둘 다를 확인하였다. 이러한 Fab 단량체성 Ig Quad 단백질 프렙에서 임의의 검출가능한 유리 HC 또는 유리 LC의 부재는 이들 형식의 높은 안정성을 추가로 확인하였다. 이들 Fab 단량체성 Ig Quad 단백질의 고유 분자 질량 및 올리고머성 상태를 확인하기 위해, Humira Fab 단량체성 Ig Quad 단백질을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다(도 35c). Humira Fab 단량체성 Ig Quad 단백질에 대한 크기 배제 크로마토그래피 프로파일은 315.8 kDa의 사량체성 분자량과 일치하는 예상된 부피에서 용출된 명확한 우세 피크를 가졌다. 이들 데이터는 이러한 Quad 단백질의 고순도를 추가로 확인하며, 이는 안정하고 임의의 응집체가 존재하지 않는 균일한 사량체성 형태로 존재한다. Fab 단량체성 Ig Quad의 추가의 예는 온전한 Fab를 사용하여 고유 VH 및 VL 쌍 또는 이의 고유 항원 결합 잠재력을 변경하지 않고 Quad를 생성하는 경우 임의의 주어진 단클론 항체로부터 생성될 수 있다.
실시예 20: 단량체성 Ig Quad(Q96)로서 세포외 단백질 도메인의 발현
상기 실시예에서, 항체 단편을 생성하여 Quad를 생성하였다. 이 특정 실시예에서 p53 TD 도메인의 다양성은 세포 표면 수용체의 세포외 도메인이 천연 리간드에 결합하는 능력에 영향을 미치지 않으면서 Quad 형식으로 다량체화됨으로써 추가로 입증되었다. 이를 예시하기 위해, VEGF 트랩 아플리버셉트(Eylea™)에 사용된 가용성 세포외 도메인을 예로 사용하였다. Eylea와 유사한 VEGFR1로부터의 Ig 도메인 2 및 VEGFR2로부터의 Ig 도메인 3을 실시예 17-19에 예시된 것과 유사하고 도 36a(Q96)에 도시적으로 나타낸 바와 같이 단량체성 Ig Quad에 연결하였다.
Q96을 HEK293 세포에서 발현시키고 가용성 단백질을 배양 상청액으로부터 직접 정제하였다. SDS-PAGE 분석은 예상된 분자량에서 단일 단백질 밴드를 갖는 고도로 순수한 Quad로서 Q96의 발현을 확인하였다(도 36b). Q96의 무결성을 상기 기재된 바와 같이 ELISA 결합 검정에 의해 추가로 분석하여 VEGF-A 리간드에 대한 결합을 확인하였다. ELISA 플레이트를 0.5 ug/ml의 VEGF-A로 코팅하고 연속으로 희석된(5 nM에서 시작하여 3 배 희석된 것 중 하나) Q96 단백질을 코팅된 VEGF-A 플레이트에 첨가하였다. VEGF-A에 결합하는 Q96의 검출을 위해 항-His HRP 검출 항체를 사용하였다. Q96은 용량 의존적 방식으로 VEGF-A에 결합하였으며 이는 VEGFR1 및 VEGFR2의 세포외 도메인을 함유하는 이 형식이 정확하게 어셈블리되고 고유 리간드 결합 가능성을 유지함을 확인하였다(도 36c).
실시예 21: 비-Ig 4가 및 비-Ig 8가 항-TNFα dAb Quad의 발현, 결합 및 기능적 효능
실시예 8과 유사하게, 항체 단일 도메인을 사용하여 IgG Fc 없이(본원에서 약칭 "비-Ig"로 지칭됨) 단일특이적 4가 및 8가 Quad를 생성하였다. 항-TNFα dAb VH를 p53 TD에 직접 연결하여 도 22a에 도시적으로 나타낸 바와 같이(도면에 각각 A 및 B로 포함) N-말단에서 4가 Quad(Q88 4가)를 생성하거나 또는 N-말단 및 C-말단 둘 다에서 8가 항-TNFα dAb Quad(Q88 8가)를 생성하였다. TD 도메인이 없는 원래의 항-TNFα dAb를 또한 1가 대조군(Q88 1가)으로 사용하기 위해 생성하였다. 분자 설계는 도 37a에 도시적으로 제시되어 있으며, 또한 이들 Quad의 모듈식 설계를 강조한다.
HEK293 세포에서 발현하고 배양 상청액으로부터 직접 Quad 단백질을 정제한 후, 초기 단백질 분석을 SDS-PAGE에 의해 수행하였다. 다가 항-TNFα dAb Quad는 예상된 분자량에 상응하는 SDS-PAGE 겔 상의 단일 밴드를 판단할 때 고도로 순수한 단백질로 표현된다(도 37b). 이들 다가 Quad 및 TNFα 결합 및 TNFα 중화에 대한 결합력 효과를 추가로 분석하기 위해, ELISA 결합 검정 및 WEHI 세포 기반 생물검정을 실시예 9 및 10에 기재된 바와 같이 수행하였다. TNFα 결합 강도의 증가는 ELISA 결합 검정에서 항-TNFα 1가 대조군과 비교하여 4가 및 8가 항-TNFα dAb Quad 둘 다에 대해 볼 수 있었다(도 37c). 놀랍게도, 8가 및 4가 버전 사이의 TNFα 결합 잠재력은 ELISA 결합 검정에서 해결될 수 없었다. 유사하게, 놀랍게도 실시예 17에 상세히 기재된 4가 및 8가 항-TNFα dAb 단량체성 Ig Quad 버전에 대한 결합 강도는 해결될 수 없었고 TNFα 결합 강도에서의 작은 증가만이 ELISA 결합 검정에서 관찰되었다(도 37d). 이는 결합 강도가 크게 향상되고 테트라메틸벤지딘-기반 비색 신호가 이들 다가 Quad에 의해 빠르게 포화되어, 따라서 이 ELISA 결합 검정에 대한 동적 검출 범위가 특정 지점 이상으로 향상된 결합 강도를 구별하기에 적절하지 않기 때문일 수 있다.
TNFα 결합 도메인 원자가의 증가를 WEHI 세포의 TNFα-매개된 세포독성을 중화하는 항-TNFα Quad 분자의 효능을 비교한 WEHI 생물검정에서 추가로 조사하였다. WEHI 생물검정을 비-Ig 및 Ig-유사 항-TNFα dAb Quad 둘 다를 사용하여 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하였다(도 37e 및 f). ELISA 결합 검정과 달리, 이 세포 기반 생물검정에서, 놀랍게도 4가 및 8가 버전 사이의 효능에서 주요 차이를 포함하여 항-TNFα 결합 도메인이 증가함에 따라 효능의 실질적인 증가를 볼 수 있었다. EC50 값 및 이들 분자 효능의 배수 향상은 표 15에 요약되어 있다.
실시예 22: 비-Ig 12가 및 16가 항-TNFα dAb Quad의 발현 및 기능적 효능
다중원자가의 개념을 추가로 및 4가 및 8가 이상으로 확장하기 위해, 항-TNFα dAb Quad의 2 개의 추가 형식을 비-Ig 형식으로 12(본원에서 도데카, 12-가 또는 12-mer로도 알려짐) 또는 16(본원에서 헥사데카, 16-가 또는 16-mer) 항-TNFα dAb 결합 도메인으로 생성하였다. 이들 Quad의 모듈식 설계 및 구조 배열은 도 38a및b의 개략도에서 볼 수 있었다.
도데카 버전에서, 제1 쇄는 IgG CH1에 연결되고, 차례로 TD 도메인(Q142)에 연결된 탠덤 항-TNFα dAb를 함유하였다. 제2 쇄는 카파(Q135) 또는 람다(Q136) 경쇄 불변 영역에 연결된 단일 항-TNFα dAb를 함유하였다. 2개 쇄의 이종이량체화가 CH1 및 C-카파 또는 C-람다 불변 영역 사이의 상호작용을 통해 발생된 HEK293 세포에서 2 개 쇄를 공-발현시켜 12가 Quad를 생성하였다. TD 도메인은 이러한 2 개의 어셈블리된 쇄의 사량체로의 사량체화를 허용하였다.
16가 항-TNFα dAb Quad의 경우, 제1 쇄는 12가 형식과 정확히 동일하였지만, 제2 쇄는 카파(Q145) 또는 람다(Q144) 경쇄 불변 영역에 연결된 탠덤 항-TNFα dAb를 함유하였다. 이러한 2 개의 쇄의 공-발현은 16가 항-TNFα Quad의 생성을 허용하였다.
도데카- 및 헥사데카 항-TNFα dAb Quad를 HEK293 세포에서 발현시키고 Quad 단백질을 배양 상청액으로부터 직접 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 38c). 예상된 분자량에서 우세한 단백질 밴드의 존재는 이들 다가 항-TNFα dAb Quad가 고도로 순수한 가용성 Quad 단백질로 발현될 수 있음을 확인하였다. 또한, 이들 다가 Quad가 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 사용하여 생성될 수 있음을 확인하였다.
WEHI 생물검정을 정제된 도데카- 및 헥사데카 항-TNFα dAb Quad를 사용하여 수행하고 TNFα 중화 효능을 1가 항-TNFα dAb 대조군과 비교하였다(도 38d 및 e). 12가 및 16가 Quad 형식에서 항-TNFα dAb 결합 도메인 원자가의 증가는 TNFα 중화 효능을 실질적으로 증가시켰다. 이들 Quad의 EC50은 표 16에 요약되어 있다.
따라서, 본 발명의 작제물은 놀랍게도 항원 결합 효능에서 매우 유의한 증가를 달성할 수 있고(예를 들어, 표 16에서 762-배) 유리하게는 항체 Fc 존재 여부에 관계 없이 상이한 유형의 결합 부위(예를 들어, dAb 또는 Fab-유사)를 사용하여 달성될 수 있으며, 임상적으로 승인된 항체의 용도를 변경하여 시험된 결합 부위를 매우 높은 순도 수준(거의 100% 순도)으로 유지할 가능성을 입증하였다.
실시예 23: 비-Ig 4가 Fab Quad의 발현
실시예 19에서 4가 Humira Fab 단량체성 Ig Quad의 생성을 예시하였다. 이 특정 실시예에서, 온전한 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)를 갖지만 Fc 영역이 없는(비-Ig 버전) Humira Fab를 생성하였다. p53 TD 도메인을 힌지 영역이 코어 힌지가 없도록 변형된(즉, 코어 또는 하부 힌지 서열이 없는 상부 힌지 서열; 서열번호: 183이 사용됨) Humira HC CH1 도메인의 C-말단에 연결하였다. 이 변형된 HC와 고유 Humira LC의 공-발현은 Humira Fab 단량체성 Ig-TD 버전과 비교하여 유의하게 감소된 분자 크기를 갖는 4가 Humira Fab-TD의 생성을 허용하였다. Humira Fab-TD의 도시적인 구조적 표현은 도 40a에 제시되어 있다. "비-Ig" 다량체는 출발 단량체성 빌딩 블록이 Fc를 함유하는 "Ig-유사" 다량체로 가정된 바와 같이, 출발 단량체성 빌딩 블록이 Fc를 함유하지 않는 Quad 다량체를 지칭한다.
Humira Fab-TD Quad를 HEK293 세포에서 발현시키고 Quad 단백질을 배양 상청액으로부터 직접 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 40b). 예상된 분자량에서 단일 단백질 밴드의 존재는 Humira Fab-TD가 고순도(>99% 순수)의 가용성 단백질로 발현될 수 있음을 확인하였다.
이 Quad 단백질을 추가로 특성화하기 위해, ELISA를 사용한 TNFα 결합 검정 및 WEHI 생물검정을 사용한 TNFα 중화 잠재력을 수행하였다. 대조군으로서 Humira Fab를 1가 대조군으로 사용하였다. ELISA 결합 검정으로부터, Humira Fab-TD가 Humira Fab 1가 대조군보다 더 높은 결합 강도로 TNFa에 결합할 수 있음을 볼 수 있었다(도 40c). TNFα 중화 생물검정에서와 유사하게, Humira Fab-TD는 Humira Fab 1가 대조군보다 더 높은 효능으로 TNFα 매개된 독성을 중화할 수 있었다(도 40d). 이들 데이터는 원자가를 증가시킴으로써, 기능적 친화도가 증가되어 더 강한 결합을 초래하고 이는 또한 1가 대조군에 비해 Quad의 기능적 효능을 향상시킴을 확인한다.
실시예 24: 비-Ig 및 Ig-유사 Quad로서 8가 Fab
상기 실시예에서, 항체로부터의 Fab를 사용하여 Ig-유사(실시예 19) 또는 비 Ig-유사(실시예 23)로서 4가 Quad를 생성하였다. Fab Quad의 추가 반복은 Ig-유사 또는 비 Ig-유사로서 8가 원자가를 갖는 Fab를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
8가 비 Ig-유사 Fab Quad를 생성하기 위해, p53 TD 도메인이 임의적으로 가요성 펩티드 링커를 통해 힌지 영역에 직접 연결된 온전한 힌지 영역을 갖는 Fab를 사용할 것이다. 온전한 코어 힌지 영역은 고유 LC과 공-발현되어 F(ab')2를 생성하는 경우 Fab-TD의 동종이량체화를 허용할 것이며 이와 같이 단량체성 빌딩 블록은 2가일 것이다. 차례로, TD 도메인은 F(ab')2의 사량체화를 허용하여 도 41a에 도시적으로 제시된 바와 같은 8가 Fab Quad를 생성할 것이다.
유사하게, 8가 Ig-유사 Fab Quad를 생성하기 위해, TD, 예를 들어, p53 TD 도메인을 임의적 펩티드 링커를 통해 미리 결정된 항체의 비변형된 HC의 CH3 도메인 C-말단에 직접 연결할 것이다. 이것이 항체로부터 고유 LC와 공-발현된 경우, 단량체성 빌딩 블록은 어셈블리된 항체의 HC의 C-말단에서 p53 TD 도메인이 연결된 완전히 어셈블리된 Ig 항체와 효과적으로 유사할 것이다. TD 도메인은 차례로 단량체성 빌딩 블록의 사량체화를 허용하여 도 41b에 도시적으로 제시된 바와 같은 8가 Fab Ig-유사 Quad를 생성할 것이다. 이 구현예는 본원에 개시된 임의의 미리 결정된 항체와 같은 임의의 미리 결정된 항체를 사량체화하는 데 유용하다. 따라서, 예를 들어, 임상적으로 승인된 항체는 SAM(예를 들어, TD) 다량체화를 사용하여 본 발명에 따라 형식화되어 동족 항원에 대해 2 개 초과의 결합 부위를 갖는 다량체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 항체는 보코시주맙, 아릴로쿠맙 또는 에볼로쿠맙일 수 있다. 대안으로, SAM(예를 들어, TD)이 있는 항체를 사용하는 대신에, 하나 이상의 항원 결합 부위 및 Fc를 포함하는 항원-결합 트랩을 사용할 수 있다. 예를 들어, 단량체로서 아플리버셉트-SAM 또는 아플리버셉트-TD(예컨대 본원에 개시된 바와 같은 p53 또는 상동체 TD)를 사용할 수 있다. 따라서, 아플리버셉트의 사량체는 TD의 다량체화에 의해 형성될 것이다.
따라서, 구현예는 중쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 중쇄는 SAM, 예를 들어, TD(예컨대 본원에 개시된 바와 같은 p53 또는 상동체 TD)를 포함한다. TD는 중쇄의 C-말단에 있을 수 있다. 예를 들어, 중쇄는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) VH, 항체 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 SAM(예를 들어, TD)을 포함한다. 일 예에서, 중쇄는 경쇄와 쌍을 이루며(예를 들어, 여기서 경쇄는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) VL 및 항체 CL을 포함함), 여기서 중쇄 및 경쇄 쌍에 의해 포함된 VH 및 VL은 항원 결합 부위를 형성한다. 일 예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 쌍의 제1 및 제2 카피(즉, 제1 경쇄와 쌍을 이룬 제1 중쇄, 제2 경쇄와 쌍을 이룬 제2 중쇄, 여기서 각 쌍은 VH/VL 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서 중쇄는 (예컨대 불변 영역에서 디술피드 결합을 통해) 함께 쌍을 이룸)를 포함하는 것과 같은 4-쇄 항체이다. 일 예에서, 이러한 항체의 사량체가 제공되며, 여기서 각 항체의 중쇄는 C-말단에서 TD를 포함하고 항체의 4 개 카피는 TD에 의해 사량체화된다. 예를 들어, 도 41b 참조.
일 예에서, N-말단에서 C-말단 방향으로) 항체 V 도메인(예를 들어, VL, 예컨대 Vκ 또는 Vλ; 또는 VH), 항체 CL 및 SAM, 예를 들어, TD(예컨대 본원에 개시된 바와 같은 p53 또는 상동체 TD)를 포함하는 항체 경쇄가 제공된다. 예를 들어, 이러한 경쇄의 다량체(예를 들어, 사량체)가 제공되며, 임의적으로 여기서 경쇄(또는 다랑체에서 각 경쇄)는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 또 다른 V 도메인 및 CH1을 포함하는 제2 항체 쇄와 쌍을 이루며, 여기서 경쇄의 V 도메인 및 CL은 다른 V 도메인 및 CH1과 각각 쌍을 이룬다.
참고문헌
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표 1: p53 서열
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표 2: 사량체화 도메인을 포함하는 예시적인 인간 단백질
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이들 단백질 및 이의 TD 각각의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 본 발명에서 사용하기 위해 및 본원의 하나 이상의 청구범위에 포함될 가능성을 위해 참조로 본원에 포함된다.
표 3. Quad 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열
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표 4. 결합 모이어티, 도메인 및 펩티드의 아미노산 서열
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*는 도메인을 포함하는 제품을 나타낸다.
표 5. Quad 폴리펩티드의 아미노산 서열
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표 6. NHR2 TD의 DNA 및 아미노산 서열
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NHR2* TD 및 NHR2** TD는 N-말단 및/또는 C-말단에서 추가의 아미노산 잔기를 포함한다. NHR2***는 Pubmed(참조: UniProtKB - Q06455　(MTG8_HUMAN)에 따라 주석이 달린 NHR2 도메인의 아미노산 잔기만을 포함한다.
표 7. 인간 p53 TD 서열
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p53* TD는 p53 TD의 절두된 버전이다.
표 8: Quad 형식 A - AC 및 도 22 및 42에 요약된 바와 같은 단량체성 빌딩 블록의 설명
도식에서, 폴리펩티드 쇄의 구성요소는 제시된 바와 같이 각 쇄의 상부에서 하부까지 N-말단에서 C-말단으로이다.
본원에서 용어 "SAM", "자기-회합 다량체화 도메인" 및 "다량체화 도메인"은 상호교환가능하게 사용된다. SAM은 예를 들어 본원에서 TD라고 불릴 수 있다. TD는 본원에 개시된 바와 같이 사량체화 도메인, 예를 들어, p53, p63, p73 또는 NHR2 도메인 또는 이의 상동체 또는 오솔로그일 수 있다.
원자가는 TD를 SAM으로 사용하는 경우 사량체 형태에서 결합 부위 수를 나타낸다.
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표 9: Quad 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열
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표 10: 성숙 Quad 폴리펩티드의 아미노산 서열
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표 11: 항-TNFa 분자의 ED50
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표 12(a): 인간 IgG 이소형 및 서열의 힌지 영역 아미노산 서열
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표 12(b): 추가의 힌지 서열, 상부 및 코어 영역
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표 13: p53 사량체화 도메인(TD)을 함유하는 단백질의 UniProt 수탁 번호.
각 단백질에 대한 TD 도메인의 아미노산 서열 위치가 또한 표시된다(즉, 제1 entry의 경우, TD 서열은 수탁 번호 A0A024R4C3으로 UniProt에 개시된 단백질의 아미노산 잔기 345 내지 383(및 이를 포함)이다).
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표 14: Quad 68 및 69 서열
서열번호: 188 (Quad 68 뉴클레오티드 서열)
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서열번호: 189 (Quad 69 뉴클레오티드 서열)
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서열번호: 190 (Quad 68 아미노산 서열)
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서열번호: 191 (Quad 69 아미노산 서열)
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표 15: WEHI 세포에서 TNFα 매개된 세포독성을 중화하는 4가 및 8가 Quad(비-Ig 및 Ig-유사) 항-TNFα Quad의 EC 50 값을 요약한 표. 1가 대조군에 비해 상이한 Quad에 대한 효능의 배수 향상이 또한 제시되어 있다.
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표 16: WEHI 세포에서 TNFα 매개된 세포독성을 중화하는 비-Ig 12가 및 16가 항-TNFα Quad의 EC 50 값을 요약한 표. 1가 대조군에 비해 상이한 Quad에 대한 효능의 배수 향상이 또한 제시되어 있다.
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표 17 : Quad 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열
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표 18 : 성숙 Quad 폴리펩티드의 아미노산 서열
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표 19 . 본 발명의 다량체에 의해 결합될 수 있는 바이러스의 목록
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표 20 . 예를 들어, 숙주 세포 상에 부착 및/또는 이에 진입을 차단하기 위해 본 발명의 다랑체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 숙주 세포 또는 바이러스 표면 상의 예시적인 세포 표면 항원의 목록
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Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 atggagaccc tcttgggcct gcttatcctt tggctgcagc tgcaatgggt gagcagcaaa 60 caggaggtga cacagattcc tgcagctctg agtgtcccag aaggagaaaa cttggttctc 120 aactgcagtt tcactgatag cgctatttac aacctccagt ggtttaggca ggaccctggg 180 aaaggtctca catctctgtt gcttattaca ccttggcaga gagagcaaac aagtggaaga 240 cttaatgcct cgctggataa atcatcagga cgtagtactt tatacattgc agcttctcag 300 cctggtgact cagccaccta cctctgtgct gtgaggcccc tgcttgacgg aacatacata 360 cctacatttg gaagaggaac cagccttatt gttcatccgt atatccagaa ccctgaccct 420 gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 480 tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 540 actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 600 aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 660 ttccccagcc cagaaagttc cgccagcacc aagggcccct ctgtgttccc tctggcccct 720 tccagcaagt ccacctctgg cggaacagcc gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc 780 cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct ggcgctctga 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taacgtgaat 660 cataaaccca gtaacacaaa ggtagataag aaggttgaac ctaagtcctg cgataagaca 720 cataccgccc ctgaactgct gggcggacct tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag 780 gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac 840 gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 900 accaagccta gagaggaaca gtacaactcc acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg 960 ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg 1020 cctgccccca tcgaaaagac catctccaag gccaagggcc agccccggga accccaggtg 1080 tacacactgc cccctagcag ggacgagctg accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc 1140 gtgaaaggct tctacccctc cgatatcgcc gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag 1200 aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg gactccgacg gctcattctt cctgtacagc 1260 aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg 1320 cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ccctgagccc cggcaagaag 1380 aaaaagcccc tggacggcga gtacttcaca ctgcagatcc ggggcagaga acgcttcgag 1440 atgttcagag agctgaacga ggccctggaa ctgaaggatg cccaggccgg aaaagagccc 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cttccgtgtt cctgtttcct 840 ccaaagccta aggacaccct gatgatcagc agaacccctg aagtgacctg cgtggtggtg 900 gatgtgtccc acgaggatcc cgaagtgaag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 960 cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa cagtacaaca gcacctacag agtggtgtcc 1020 gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc 1080 aacaaggccc tgcctgctcc tatcgagaaa accatcagca aggccaaggg ccagcctagg 1140 gaaccccagg tttacacact gcctccaagc cgggaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1200 ctgacctgcc tcgtgaaggg cttctaccct tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat 1260 ggccagccag agaacaacta caagacaacc cctcctgtgc tggacagcga cggctcattc 1320 ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag tccagatggc agcagggcaa cgtgttctcc 1380 tgctctgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gagcctgtct 1440 cctggcaaaa agaaaaagcc cctggacggc gagtacttca cactgcaaat ccggggcaga 1500 gaacgcttcg agatgttcag agagctgaac gaggccctgg aactgaagga tgcccaggcc 1560 ggaaaagagc ccggc 1575 <210> 195 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 195 atgggttggt cttgtattat tcttttcctc gtcgcaaccg ctaccggggt ccattccgag 60 gtccaattgc ttgaatccgg aggaggtgaa gtgcaacccg gtgggtcact tcggctctcc 120 tgcgccgcga gtggcgggat tttcgctatt aaaccaattt cctggtatcg tcaagcacca 180 ggaaaacaac gagaatgggt gtcaactact acgtcttctg gggcaactaa ctatgcagaa 240 tcagtcaaag gacgctttac gattagtcga gataatgcga agaatactct ttatctccaa 300 atgtcatcac tcagggcaga agacactgct gtctattatt gtaatgtttt cgaatactgg 360 ggtcaaggaa ctttggtgac cgtaaagccc ggcggcagcg gcggtagtga agtccaactc 420 ctcgagtccg gaggaggtga agtgcaaccc ggtgggtcac ttcggctctc ctgcgccgcg 480 agtggcggga ttttcgctat taaaccaatt tcctggtatc gtcaagcacc aggaaaacaa 540 cgagaatggg tgtcaactac tacgtcttct ggggcaacta actatgcaga atcagtcaaa 600 ggacgcttta cgattagtcg agataatgcg aagaatactc tttatctcca aatgtcatca 660 ctcagggcag aagacactgc tgtctattat tgtaatgttt tcgaatactg gggtcaagga 720 actttggtga ccgtaaagcc cggtggtggt ggggacaaga cccacaccgc ccctgaactg 780 ctgggcggac cttccgtgtt cctgtttcct ccaaagccta aggacaccct gatgatcagc 840 agaacccctg aagtgacctg cgtggtggtg 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Gln Trp 275 280 285 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 290 295 300 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 305 310 315 320 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 325 330 335 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 340 345 350 Glu Cys <210> 222 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 222 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Lys Lys 435 440 445 Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg 450 455 460 Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala 465 470 475 480 Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly 485 <210> 223 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 223 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 224 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 224 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Lys 435 440 445 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 450 455 460 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 465 470 475 480 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly 485 <210> 225 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly 1 5 10 15 Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu 20 25 30 Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys 35 <210> 226 <211> 38 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 226 Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Lys Ile Arg Gly 1 5 10 15 Arg Lys Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu 20 25 30 Lys Asp Ala His Ala Thr 35 <210> 227 <211> 38 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 227 Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Lys Ile Arg Gly 1 5 10 15 Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu 20 25 30 Lys Asp Ala Arg Ala Ala 35 <210> 228 <211> 39 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 228 Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly 1 5 10 15 Arg Glu Arg Tyr Glu Met Phe Arg Asn Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu 20 25 30 Lys Asp Ala Gln Ser Gly Lys 35 <210> 229 <211> 39 <212> PRT <213> Felis catus <400> 229 Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly 1 5 10 15 Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu 20 25 30 Lys Asp Ala Gln Ser Gly Lys 35 <210> 230 <211> 39 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 230 Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly 1 5 10 15 Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu 20 25 30 Lys Asp Ala Gln Thr Gly Lys 35 <210> 231 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 231 His His His His His His 1 5 <210> 232 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 232 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 233 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 233 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His 1 5 10 <210> 234 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> Xaa = any amino acid <222> (15)..(16) <400> 234 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His Xaa Xaa 1 5 10 15 Ala Ala Ala

Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 폴리펩티드로서:
    (a) 항체 Fc 영역, 여기서 Fc 영역은 항체 CH2 및 항체 CH3을 포함함; 및
    (b) 자기-회합 다량체화 도메인(SAM);
    여기서 CH2는 항체 힌지 서열을 포함하고 코어 힌지 영역이 없는 것인, 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CH2가 다음이 없는 것인, 폴리펩티드:
    (i) 코어 힌지 CXXC 아미노산 서열, 여기서 X는 임의의 아미노산이거나 또는 여기서 각 아미노산 X는 P, R 및 S로부터 선택됨; 및/또는
    (ii) 상부 힌지 아미노산 서열.
  3. 제1항의 (i)에 있어서,
    (a) CXXC 서열이 서열번호: 180-182로부터 선택되거나; 또는
    (b) CH2가 서열번호: 183-187의 아미노산 서열이 없는 것인, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CH2가 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:
    (a) 아미노산 서열 APELLGGPSV(서열번호: 163), 또는 PAPELLGGPSV(서열번호: 164);
    (b) 아미노산 서열 APPVAGPSV(서열번호: 165), 또는 PAPPVAGPSV(서열번호: 166);
    (c) 아미노산 서열 APEFLGGPSV(서열번호: 175), 또는 PAPEFLGGPSV(서열번호: 176);
    (d) 아미노산 서열 EPKSCDKTHT[P]APELLGGPSV(서열번호: 167 또는 168), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
    (e) 아미노산 서열 ERKCCVE[P]APPVAGPSV(서열번호: 169 또는 170), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
    (f) 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT[P]APELLGGPSV(서열번호: 171 또는 172), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임;
    (g) 아미노산 서열 EPKSCDTPPP[P]APELLGGPSV(서열번호: 173 또는 174), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임; 또는
    (h) 아미노산 서열 ESKYGPP[P]APEFLGGPSV(서열번호: 177 또는 178), 여기서 괄호로 묶인 P는 임의적임.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3이 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:
    (a) 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인;
    (b) 인간 IgG2 CH2 및 CH3 도메인;
    (c) 인간 IgG3 CH2 및 CH3 도메인; 또는
    (d) 인간 IgG4 CH2 및 CH3 도메인.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) CH2 도메인이 인간 IgG1 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열이 서열번호: 180이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDKTHT(서열번호: 183)이 없거나;
    (b) CH2 도메인이 인간 IgG2 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열이 서열번호: 180이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ERKCCVE(서열번호: 184)가 없거나;
    (c) CH2 도메인이 인간 IgG3 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열이 서열번호: 181이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT(서열번호: 185) 또는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 EPKSCDTPPP(서열번호: 186)가 없거나; 또는
    (d) CH2 도메인이 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함하고 코어 힌지 영역 아미노산 서열이 서열번호: 182이며, 임의적으로 여기서 CH2는 상부 힌지 영역 아미노산 서열 ESKYGPP(서열번호: 187)가 없는 것인, 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) Fc 영역 및 SAM을 포함하며, Fc 영역이 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 힌지 서열, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하나 이상의 에피토프 결합 부위, 임의적으로 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 가변 도메인을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인, VH 및 VL로부터 선택되거나; 또는 상기 도메인이 scFv에 의해 포함되는(comprised by) 것인, 폴리펩티드.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:
    (a) 가변 도메인, SAM 및 Fc 영역;
    (b) Fc 영역, SAM 및 가변 도메인;
    (c) 가변 도메인, Fc 영역 및 SAM;
    (d) SAM, 가변 도메인 및 Fc 영역; 또는
    (e) SAM, Fc 영역 및 가변 도메인.
  11. 제8항, 제9항 또는 제10항에 있어서, SAM에 대한 제2 항체 가변 도메인 N-말단 또는 C-말단을 포함하며, 여기서 제2 가변 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 동일하거나 또는 상이한 것인, 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SAM이 자기-회합 사량체화 도메인(TD)이며; 임의적으로 여기서 TD는 p53, p63 또는 p73 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이거나; 또는 여기서 TD는 NHR2 TD 또는 이의 상동체 또는 오솔로그이거나; 또는 여기서 TD는 서열번호: 10 또는 126과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나:
    A. 제1 항체 단일 가변 도메인(dAb), 임의적 링커 및 상기 SAM;
    B. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 항체 단일 가변 도메인;
    C. 제1 scFv, 임의적 링커 및 상기 SAM;
    D. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제2 scFv;
    E. 제1 항체 단일 가변 도메인, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 scFv;
    F. 제1 scFv, 임의적 링커, 상기 SAM 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
    G. 제1 항체 가변 도메인, 임의적 제1 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 상기 SAM;
    H. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 항체 단일 가변 도메인;
    I. 상기 SAM, 임의적 링커 및 제1 scFv;
    J. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 불변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 가변 도메인; 또는
    K. 상기 SAM, 임의적 링커, 제1 항체 가변 도메인, 제2 임의적 링커 및 제1 항체 불변 도메인;
    또는
    (ii) 폴리펩티드가 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 다음을 포함하거나:
    A. dAb 및 SAM;
    B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb;
    C. 제1 scFv 및 SAM;
    D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
    E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
    F. 제1 dAb, Fc 영역 및 SAM;
    G. 제1 scFv, Fc 영역 및 SAM;
    H. VH, CH1, Fc 영역 및 SAM;
    I. VL, CL, Fc 영역 및 SAM;
    J. dAb; SAM 및 Fc 영역;
    K. scFv; SAM 및 Fc 영역;
    L. VH, CH1, SAM 및 Fc 영역;
    M. VL, CL, SAM 및 Fc 영역;
    N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
    O. VH, CH1 및 SAM;
    P. VL, CL 및 SAM;
    Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
    R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
    S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
    T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
    U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
    V. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제2 dAb;
    W. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv;
    X. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역 및 SAM;
    Y. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제3 dAb;
    Z. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv; 또는
    AA. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
    또는
    (iii) 폴리펩티드가 (C-말단에서 N-말단 방향으로) 다음을 포함하는 것인, 폴리펩티드:
    A. dAb 및 SAM;
    B. 제1 dAb, SAM 및 제2 dAb;
    C. 제1 scFv 및 SAM;
    D. 제1 scFv, SAM 및 제2 scFv;
    E. 제1 scFv, SAM 및 제1 dAb;
    F. 제1 dAb, Fc 영역 및 SAM;
    G. 제1 scFv, Fc 영역 및 SAM;
    H. VH, CH1, Fc 영역 및 SAM;
    I. VL, CL, Fc 영역 및 SAM;
    J. dAb; SAM 및 Fc 영역;
    K. scFv; SAM 및 Fc 영역;
    L. VH, CH1, SAM 및 Fc 영역;
    M. VL, CL, SAM 및 Fc 영역;
    N. 제1 dAb, 제2 dAb 및 SAM;
    O. VH, CH1 및 SAM;
    P. VL, CL 및 SAM;
    Q. VH, CH1, SAM 및 제1 dAb;
    R. VL, CL, SAM 및 제1 dAb;
    S. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제3 dAb;
    T. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM 및 제1 scFv;
    U. 제1 dAb, 제2 dAb, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb;
    V. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제2 dAb;
    W. 제1 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv;
    X. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역 및 SAM;
    Y. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제3 dAb;
    Z. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM 및 제1 scFv; 또는
    AA. 제1 dAb, 제2 dAb, Fc 영역, SAM, 제3 dAb 및 제4 dAb.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 다량체(임의적으로 사량체)로; 임의적으로 여기서 다량체는 의학적 용도를 위한 것인, 다량체.
  15. 복수의 항체 Fc 영역의 다량체로, 여기서 각 Fc는 각각의 폴리펩티드에 의해 포함되고 또 다른 Fc 영역과 쌍을 이루지 않으며; 임의적으로 여기서 다량체는 의학적 용도를 위한 것인, 다량체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 다량체를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로; 임의적으로 여기서 핵산은 진핵생물 세포 또는 벡터에 의해 포함되는 것인, 핵산.
  18. 항원의 다중 카피를 결합하는 방법으로, 상기 방법은 카피를 제14항 또는 제15항의 다량체 또는 제16항의 조성물과 조합하는 단계를 포함하며, 여기서 카피는 다량체의 폴리펩티드에 의해 결합되고, 임의적으로 상기 방법은 항원 카피에 결합된 다량체를 단리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  19. 인간 또는 동물 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 위험을 감소시키는 방법으로, 상기 방법은 제16항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물에 의해 포함된 다량체는 대상체에서 표적 항원에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 결합은 질환 또는 병태의 치료 또는 위험 감소를 매개하는 것인, 방법.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 복수의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 생성하는 방법으로, 여기서 SAM은 자기-회합 사량체화 도메인(TD)이며, 상기 방법은 제17항에 따른 진핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 폴리펩티드의 사량체의 세포로부터 발현 및 분비를 허용하는 단계, 및 임의적으로 사량체를 단리 또는 정제하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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