JP2022524303A - 多量体 - Google Patents

Abstract

【課題】エフェクタードメインの多量体は、医学的および非医学的用途における有用性を認識している。【解決手段】 本発明は、ポリペプチドの四量体、ならびに抗原結合部位（例えば、抗原もしくはｐＭＨＣに、またはその可変ドメインに特異的に結合する抗体またはＴＣＲ結合部位）などのエピトープもしくはエフェクタードメインの、またはインクレチン、インスリンもしくはホルモンペプチドなどのペプチドの四量体、八量体、十二量体および十六量体などの多量体に関する。【選択図】図３８Ｂ

Description

本発明は、ポリペプチドの四量体、ならびに抗原結合部位（例えば、抗原もしくはｐＭＨＣに、またはその可変ドメインに特異的に結合する抗体またはＴＣＲ結合部位）などのエピトープもしくはエフェクタードメインの、またはインクレチン、インスリンもしくはホルモンペプチドなどのペプチドの、四量体、八量体、十二量体および十六量体などの多量体に関する。

エフェクタードメインの多量体は、例えば、抗原結合のより高い結合活性（例えば、抗体またはＴＣＲ結合ドメインであるエフェクタードメインの場合）を提供するために、エフェクタードメインの活性および存在を組み合わせて増加させるための、あるいはインビボまたはインビトロでの二重特異性もしくは多重特異性の標的化または標的リガンドとの相互作用を提供するための、生物学的または結合活性を増強するための、医学的および非医学的用途における有用性を認識している。

タンパク質単量体の多量体への自己集合を引き起こす多量体化ドメインは、当技術分野において既知である。例としては、ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３などの転写因子に見られるドメインならびにＴＲＰカチオンチャネルなどのイオンチャネルに見られるドメインが挙げられる。転写因子ｐ５３は、Ｎ末端トランス活性化ドメイン、プロリンリッチドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、四量体化ドメイン、およびＣ末端調節領域などのさまざまな機能ドメインに分けることができる。ヒトｐ５３の四量体化ドメインは残基３２５から３５６まで伸びており、４ヘリックスバンドルフォールドを有している（Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）１９９５，２６７（５２０３）：１４９８－１５０２）。ＴＲＰＭ四量体化ドメインは、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバータンパク質１～８の短い逆方向コイルドコイル四量体化ドメインである。それは、広範なコアパッキングおよび鎖間極性相互作用によって一緒に保持されている（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，３８３（４）：８５４－８７０）。一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルは、多様な形態の感覚入力に応答する四量体カチオン選択性イオンチャネルの大きなファミリーを構成する。別の例は、カリウムチャネルＢＴＢドメインである。このドメインは、電位依存性カリウムチャネルタンパク質のＮ末端に見られ、αサブユニットの機能的四量体チャネルへの集合に関与する細胞質四量体化ドメイン（Ｔ１）を表す（Ｂｉｘｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９９，６（１）：３８－４３）。このドメインは、ＫＣＴＤ１（カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，２７（５）：２５７－２６５）のようなカリウムチャネルではないタンパク質にも見られる。

多量体抗体フラグメントは、ビオチン、ｄＨＬＸ、ＺＩＰおよびＢＡＤドメイン、ならびにｐ５３を含むさまざまな多量体化技術を使用して生成されている（Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｏｉｔｅｃｈ．，２００９：２６，３１４－３２１）。ビオチンは生産に効率的であり、ヒトに免疫反応を誘発する細菌タンパク質である。

ヒトｐ５３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４６３７（Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ））は、多くの腫瘍型で腫瘍抑制因子として機能し、生理学的状況および細胞型に応じて増殖停止またはアポトーシスを誘導する。これは、このプロセスに必要な遺伝子のセットを制御することによって細胞分裂を負に調節するように作用するトランス活性化因子として細胞周期調節に関与している。ヒトｐ５３は、さまざまな形質転換細胞において増加した量で見出されている。これは、がんの約６０％で頻繁に変異または不活化される。ヒトｐ５３欠損は、下部食道の通常の重層扁平上皮が化生円柱上皮に置き換わっている状態のバレット化生に見られる。この状態は、慢性胃食道逆流疾患の患者の約１０％で合併症として発症し、食道腺がんの発症の素因となる。

ｐ５３の９つのアイソフォームが自然に発生し、広範囲の正常組織で発現されるが、組織依存的な方法である。アイソフォーム２はほとんどの正常組織で発現されるが、脳、肺、前立腺、筋肉、胎児の脳、脊髄、および胎児の肝臓では検出されない。アイソフォーム３はほとんどの正常組織で発現されるが、肺、脾臓、精巣、胎児の脳、脊髄、および胎児の肝臓では検出されない。アイソフォーム７はほとんどの正常組織で発現されるが、前立腺、子宮、骨格筋、および乳房では検出されない。アイソフォーム８は、結腸、骨髄、精巣、胎児の脳、および腸でのみ検出される。アイソフォーム９はほとんどの正常組織で発現されるが、脳、心臓、肺、胎児の肝臓、唾液腺、乳房、または腸では検出されない。

本発明は、抗体Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、Ｆｃ領域が、抗体ＣＨ２および抗体ＣＨ３を含む、抗体Ｆｃ領域と、自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）とを含むポリペプチドを提供し、ＣＨ２は、抗体ヒンジ配列を含み、コアヒンジ領域を欠いている。有利なことに、Ｆｃは別のＦｃと直接対合せず、これは、ＳＡＭドメインを使用する多量体化によって多量体を生成するのに有用である。例えば、利益は、所望の多量体形成を支援すること、および／またはそのような多量体化によって形成される多量体純度を高めることであり得る。

本発明はまた、複数の抗体Ｆｃ領域の多量体であって、各Ｆｃが、それぞれのポリペプチドによって構成され、別のＦｃ領域と対合せず、任意に、多量体は医療用である、複数の抗体Ｆｃ領域の多量体を提供する。

本発明はまた下記を提供する：－
第１の構成では
エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメインまたはペプチド）の少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体であって、多量体が、一緒に会合された第１、第２、第３および第４の自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）によって多量体化され、各四量体化ドメインが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含むそれぞれの操作されたポリペプチドによって構成される、エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメインまたはペプチド）の少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体。

第２の構成では
ＴＣＲ結合部位、インスリンペプチド、インクレチンペプチドまたはペプチドホルモンの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体、あるいは複数の該四量体または八量体。
抗体結合部位または抗体可変ドメイン（例えば、単一の可変ドメイン）の単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体、あるいは複数の該四量体または八量体。
例では、四量体または八量体は、水溶液（例えば、水性真核細胞培養培地）に可溶性である。例では、四量体または八量体は、真核細胞中で発現可能である。例証を以下に提供する。

第３の構成では
下記の
（ａ）ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位であって、四量体または八量体が、水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）に可溶性である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位、
（ｂ）抗体単一可変ドメインであって、四量体または八量体が、水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）に可溶性である、抗体単一可変ドメイン、
（ｃ）ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位であって、四量体または八量体が、ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外で発現することができる、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位、あるいは
（ｄ）抗体可変ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）であって、四量体または八量体が、ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外で発現することができる、抗体可変ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）の、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体。

第４の構成では
本発明の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）の操作されたポリペプチドもしくは単量体。

第５の構成では
操作された（および任意に単離され）操作されたポリペプチド（Ｐ１）であって、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：－
（ａ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、Ｃ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、Ｃ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであり、Ｃ１がＣγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδであり、Ｃ１がＣδである、ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｂ）ＴＣＲ Ｖ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδである、ＴＣＲ Ｖ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｃ）抗体Ｖ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ１－抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｄ）抗体Ｖ１－－任意の抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－抗体Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ）－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ１－－任意の抗体ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）－抗体Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ）－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｅ）抗体Ｖ１－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ１－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｆ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、Ｃ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、Ｃ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであり、Ｃ１がＣγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδであり、Ｃ１がＣδである、ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－任意のリンカー－ＴＤ、を含む、操作された（および任意に単離され）操作されたポリペプチド（Ｐ１）。

第６の構成では
本発明の操作されたポリペプチドまたは単量体をコードする核酸であって、任意に、核酸が、ポリペプチドを発現するための発現ベクターによって構成される、本発明の操作されたポリペプチドまたは単量体をコードする核酸。

第７の構成では
細胞内で発現および／または分泌された多量体を産生するためのタンパク質多量体の製造方法における本発明の核酸またはベクターの使用であって、この方法が、核酸またはベクターを含む真核細胞から多量体を発現および／または分泌させることを含む、本発明の核酸またはベクターの使用。

第８の構成では、
（ａ）ＴＣＲ Ｖドメイン多量体であって、方法が、真核細胞で発現されるＴＣＲ Ｖ－ＴＤ（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤまたはＴＣＲ Ｖ－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、ＴＣＲ Ｖドメイン多量体、
（ａ）抗体Ｖドメイン多量体であって、方法が、真核細胞で発現される抗体Ｖ（例えば、単一可変ドメイン）－ＴＤ（例えば、Ｖ－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＶ－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、抗体Ｖドメイン多量体、
（ｃ）インクレチンペプチド（例えば、ＧＬＰ－１、ＧＩＰまたはインスリン）多量体であって、方法が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞で発現されるインクレチンペプチド－ＴＤ（例えば、インクレチンペプチド－ＮＨＲ２ ＴＤまたはインクレチンペプチド－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、インクレチンペプチド、または
（ｄ）ペプチドホルモン多量体であって、方法が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞で発現されるペプチドホルモン－ＴＤ（例えば、ペプチドホルモン－ＮＨＲ２ ＴＤまたはペプチドホルモン－ｐ５３ ＴＤ）融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、ペプチドホルモン多量体を産生する方法。

第９の構成では
核酸またはベクターを含む真核細胞においてグリコシル化多量体を産生するためのタンパク質多量体の製造方法における本発明の核酸またはベクターの使用。

第１０の構成では
ポリペプチドの単量体および／または二量体と対比してより高い収量の四量体を産生するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログ）の使用。

第１１の構成では
ポリペプチドの単量体および／または二量体と対比してより高い収量の四量体を産生するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における、操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、操作されたポリペプチドの使用。

第１２の構成では
単量体、二量体または三量体との混合物ではない複数の四量体を産生するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログ）の使用。

第１３の構成では
本発明の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体、八量体）、操作されたポリペプチドまたは単量体の細胞内および／または分泌発現のための核酸もしくはベクターを含む宿主真核細胞。

第１４の構成では
単量体、二量体または三量体との混合物ではない複数の四量体を産生するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における、操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、操作されたポリペプチドの使用。

第１５の構成では
ｐＭＨＣ複合体に結合することができる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体であって、下記の
（ｉ）（ＴＣＲ細胞外ドメインと、
（ｉｉ）免疫グロブリン定常ドメインと、
（ｉｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体。

第１６の構成では
多量体免疫グロブリンであって
（ｉ）免疫グロブリン可変ドメインと、
（ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多量体免疫グロブリン。

第１７の構成では
可溶性の多量体ポリペプチドを集合化させる方法であって、
（ａ）ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインに融合された、該多量体ポリペプチドの単量体を提供することと、
（ｂ）該単量体の複数のコピーを会合させ、それにより、多量体可溶性ポリペプチドを得ることと、を含む、方法。

第１８の構成では、
（ｉ）本発明のポリペプチドをコードする細胞株（例えば、真核生物の哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株）と、（ｉｉ）本発明の四量体と、を含む混合物。

第１９の構成では
タンパク質エフェクタードメイン（例えば、抗体可変ドメインまたは結合部位）の四量体の収量を向上させるための方法であって、この方法が、細胞株（例えば、哺乳動物細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＣｏｓ細胞株）からポリペプチドの四量体を発現させることであって、このポリペプチドが、本発明のポリペプチドであり、１つ以上のエフェクタードメインを含む、発現させることと、任意に、該発現された四量体を単離することと、を含む方法。

第２０の構成では
（Ｎ末端からＣ末端の方向に、またはＣ末端からＮ末端の方向に）
（ｉ）免疫グロブリンスーパーファミリードメインと、
（ｉｉ）任意のリンカーと、
（ｉｉｉ）自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）（任意に自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ））と、を含む、ポリペプチド。

本発明はまた、本発明の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）を含む薬学的組成物、化粧品、食品、飲料、洗浄製品、洗剤を提供する。

本明細書における多量体は、例えば、二量体、三量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体、または２０量体である。

実施例２２に示されるように、十二量体および十六量体の多量体は、驚くべきことに、増加する結合活性効果のために、抗原結合に対して非常に高い機能的親和性を示す。８～１２個の結合部位（表１５と１６を比較）または８～１６個の結合部位に向かうこれらの機能的親和性は、相加的以上のものであり、相乗効果の増加が、強化された結合活性の結果として見られる。したがって、一実施形態では、抗原に対して１２価である多量体（すなわち、本明細書に記載の十二量体）が好ましく、別の実施形態では、抗原に対して１６価である多量体（すなわち、本明細書に記載の十六量体）が好ましい。

ＮＨＲ２四量体化ドメインによって補助される、単量体およびホモ二量体を介した四価ヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質複合体の段階的自己集合を表す概略図である。 ＮＨＲ２四量体化ドメインおよび免疫グロブリンヒンジドメインによって補助される、単量体^２およびホモ二量体^２を介して八価ヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質複合体の段階的自己集合を示す概略図である。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの発現および集合に用いたα鎖およびβ鎖のドメイン配置の概略図である。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの発現および集合に用いたα鎖およびβ鎖のドメイン配置の概略図である。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質複合体のα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。代替ドメインのアミノ酸配列には下線が引かれている。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質複合体のα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。代替ドメインのアミノ酸配列には下線が引かれている。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合の発現および集合に用いたα鎖およびβ鎖のドメイン配置の概略図である。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合の発現および集合に用いたα鎖およびβ鎖のドメイン配置の概略図である。 ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合体のα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。代替ドメインのアミノ酸配列には下線が引かれている。 ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２融合タンパク質複合体のα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列である。代替ドメインのアミノ酸配列には下線が引かれている。 ＮＨＲ２四量体化ドメインによって補助される、単量体およびホモ二量体を介した四価単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）複合体の段階的自己集合を表す概略図である。 リンカーおよびＮＨＲ２ドメインを含む、四価のｄＡｂを集合させるためのドメイン配置の概略図である。 ＮＨＲ２四量体化ドメインによって補助される、単量体およびホモ二量体を介した四価Ｆａｂ複合体の段階的自己集合を表す概略図である。 重鎖におけるリンカードメインおよびＮＨＲ２ドメインと、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインと、を含む、四価のＦａｂを集合させるためのドメイン配置の概略図である。 ＮＨＲ２四量体化ドメインおよびＣＨ１ドメインに連結した抗体ヒンジ領域によって補助される、単量体およびホモ二量体を介した八価Ｆａｂ複合体の段階的自己集合を表す概略図である。 重鎖におけるヒンジ、リンカードメインおよびＮＨＲ２ドメインと、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインと、を含む、八価のＦａｂを集合させるためのドメイン配置の概略図である。 Ｑｕａｄ（四重変異体）１６およびＱｕａｄ１７の概略図である。 （Ａ）Ｑｕａｄ１６および（Ｂ）Ｑｕａｄ１７の単量体配列および構成を示している。 抗Ｉｇウエスタンブロットを使用した分泌タンパク質の分析を示し、（Ａ）ＳＤＳ変性条件下でのＰＡＧＥゲル－１６＝Ｑｕａｄ１６；１７＝Ｑｕａｄ１７；（Ｂ）ネイティブ（すなわち、非変性）条件下でのＰＡＧＥゲル－１６＝Ｑｕａｄ１６；１７＝Ｑｕａｄ１７である。 抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体でプローブした変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから調製したウエスタンブロットであり、（Ａ）Ｑｕａｄ３および４のタンパク質サンプルを全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１および２に装填した。Ｑｕａｄ３および４について予想されたＭｗは、それぞれ４６．１および４６．４ｋＤａである。（Ｂ）Ｑｕａｄ１２および１３からのタンパク質サンプルを全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１および２に装填した。Ｑｕａｄ１２および１３について予想されたＭｗは、それぞれ４７．８および４８．１ｋＤａである。 抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体でプローブした変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから調製したウエスタンブロットであり、（Ａ）Ｑｕａｄ３および４からのタンパク質サンプルを、細胞上清を濃縮することによって調製し、それぞれレーン１および２に装填した。Ｑｕａｄ３および４について予想されたＭｗは、それぞれ４６．１および４６．４ｋＤａである。（Ｂ）Ｑｕａｄ１２および１３からのタンパク質サンプルを、細胞上清を濃縮することによって調製し、それぞれレーン１および２に装填した。Ｑｕａｄ１２および１３について予想されたＭｗは、それぞれ４７．８および４８．１ｋＤａである。 抗ＨＩＳ ＨＲＰ検出抗体でプローブした変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから調製したウエスタンブロットであり、（Ａ）Ｑｕａｄ１４、１５、１８および１９からのタンパク質サンプルを全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１および４に装填した。Ｑｕａｄ１４、１５、１８および１９について予想されたＭｗは、それぞれ２２．０、２２．３、３７．４および３７．７ｋＤａである。（Ｂ）Ｑｕａｄ２３、２４、２６および２７からのタンパク質サンプルを全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１～４に装填した。Ｑｕａｄ２３、２４、２６および２７について予想されたＭｗは、それぞれ３２．１、３２．４、３３．７および３４．０ｋＤａである。（Ｃ）Ｑｕａｄ３４、および３８からのタンパク質サンプルを全細胞抽出物から調製しそれぞれレーン１～２に装填した。Ｑｕａｄ３４、および３８について予想されたＭｗは、それぞれ２５．５および２５．４ｋＤａである。（Ｄ）Ｑｕａｄ４０、４２、４４および４６からのタンパク質サンプルを全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１～４に装填した。Ｑｕａｄ４０、４２、４４および４６について予想されたＭｗは、それぞれ２５．４、３７．６、２５．５および３８．０ｋＤａである。レーンＵには、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞（陰性対照）から調製された濃縮血清が含まれ、Ｃは抗Ｈｉｓ ＨＲＰ検出抗体の陽性対照として使用されるＨｉｓタグ付きタンパク質である。血清抗Ｈｉｓバックグラウンドのバンドは黒い矢印で強調表示されており、これはすべてのブロットで一貫して検出され得る。 変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ａ）から調製し、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体でプローブしたウエスタンブロットである。Ｑｕａｄ１４および１５からのタンパク質サンプルを全細胞抽出物から調製し、それぞれレーン１および２に装填した。Ｑｕａｄ１４および１５について予想されたＭｗは、それぞれ２２．０および２２．３ｋＤａである。（Ｂ）未変性ＰＡＧＥゲルから調製し、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体でプローブしたウエスタンブロットである。レーン１および２には、全細胞抽出物から調製されたＱｕａｄ１４および１５のタンパク質サンプルが含まれている。 リーダーおよびタグ配列に融合したＱｕａｄポリペプチドである。リンカーが存在する場合、リンカーはＧ４Ｓ（１つのＧ４Ｓのみ）である。＊は、ＴＣＲα鎖とベータ鎖との間のＳ－Ｓ結合形成を可能にするシステイン残基が導入されたＴＣＲ定常ドメインを示す。ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用した。すべてのＣ領域は、ヒトである。ＴＣＲ Ｖドメインは、ＮＹ－ＥＳＯ－１に特異的である。ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質。 ＱｕａｄフォーマットＡ～ＡＣの多量体構造の略図である。四価Ｑｕａｄ分子が集合される説明および単量体ビルディングブロックを表８に示す。 培養上清から精製した単一特異性四価ｄＡｂ Ｑｕａｄ５７タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。Ｑｕａｄタンパク質は、矢印で示されているように、予想されたＭＷに従って移動し、目に見える不純物は伴わなかった。 培養上清から精製した二重特異性四価ｄＡｂ Ｑｕａｄ５４タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。（Ａ）Ｑｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに矢印で示されるように予想されたＭＷに従って移動し、（Ｂ）プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＴＮＦａタンパク質で連続希釈されたＱｕａｄ５４タンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ５４は、用量依存的にＴＮＦａタンパク質に結合する。 単一特異性四価ｓｃＦｖ ＱｕａｄのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。培養上清から精製され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析されたＱｕａｄ５１および６３タンパク質である。（Ａ）Ｑｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに矢印で示されるように、それらの予想されたＭＷに従って移動し、（Ｂ）プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＴＮＦａタンパク質で連続希釈されたＱｕａｄ５１および６３タンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ５１および６３はどちらも、用量依存的に同様の結合強度でＴＮＦａタンパク質に結合する。（Ｃ）Ｗ５１ＳｃＦｖ一価抗ＴＮＦａ対照タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。（Ｄ）Ｑｕａｄ５１、Ｈｕｍｉｒａ（Ｈｕｍ）およびＷ５１ＳｃＦｖの存在下でのＴＮＦａを介したカスパーゼ－３シグナル伝達のウエスタンブロット分析である。培養培地（ＣＭ）単独またはアクチノマイシンＤ（ＡＤ）を含む培養培地を、陰性対照として使用した。各ブロットに使用された検出抗体は、各ブロットの隣に示されている。抗チューブリンによって検出されたウエスタンブロットは、内部ローディングコントロールを表している。（Ｅ）培養上清から精製されたＱｕａｄ５３ Ｔｅｔタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。Ｑｕａｄタンパク質は、矢印で示されているように、予想されたＭＷに従って移動した。（Ｆ）．プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＣＤ２０タンパク質を含む連続希釈されたＱｕａｄ５３ Ｔｅｔタンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ５３ Ｔｅｔは、用量依存的にＣＤ２０タンパク質に結合する。 培養上清から精製した単一特異性八価ｓｃＦｖ Ｑｕａｄ５３タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。（Ａ）Ｑｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに矢印で示されるように予想されたＭＷに従って移動し、（Ｂ）プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＣＤ２０タンパク質で連続希釈されたＱｕａｄ５３ Ｏｃｔタンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ５３ Ｏｃｔは、用量依存的にＣＤ２０タンパク質に結合する。（Ｃ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析されたＱｕａｄ５３の一価、四価および八価バージョンである。（Ｄ）Ｑｕａｄ５３の一価、四価および八価バージョンの組換えＣＤ２０に対する結合強度を比較する直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ５３の原子価の増加に伴い、結合強度の増加が見られる。 培養上清から精製した二重特異性四価ＳＣｆＶ Ｑｕａｄ５５タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。（Ａ）Ｑｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに矢印で示されるように予想されたＭＷに従って移動し、（Ｂ）プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＴＮＦａタンパク質で連続希釈されたＱｕａｄ５５タンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ５５は、用量依存的にＴＮＦａタンパク質に結合する。 二重特異性四価ＱｕａｄのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。二重特異性ｓｃＦｖ×ｄＡｂ Ｑｕａｄ５６タンパク質を培養上清から精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析された。（Ａ）Ｑｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに矢印で示されるように予想されたＭＷに従って移動し、（Ｂ）プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＴＮＦａタンパク質で連続希釈されたＱｕａｄ５６タンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ５６は、用量依存的にＴＮＦａタンパク質に結合する。（Ｃ）組換えＣＤ２０への３つの異なる二重特異性四価Ｑｕａｄフォーマット（Ｑｕａｄ５４：ｄＡｂ×ｄＡｂ、Ｑｕａｄ５５：ｓｃＦｖ×ｓｃＦｖおよびＱｕａｄ５６：ＳｃＦｖ×ｄＡｂ）の結合強度を比較する直接結合ＥＬＩＳＡである。３つの二重特異性四価Ｑｕａｄフォーマットはすべて、同様の結合強度でかつ用量依存的にＣＤ２０に結合する。 培養上清から精製した単一特異性四価単量体Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄ６４バージョン１タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。「単量体Ｉｇ」は、Ｆｃを含む本発明のポリペプチドの多量体を指し、ここで、ＣＨ２は、ヒンジ配列を含むが、コアヒンジ領域を欠いており、これは有利に、Ｆｃ領域が一緒に多量体化するのを防ぎ、その結果、多量体化は、代わりに、多量体中のポリペプチドのＳＡＭ（例えば、ＴＤ）ドメインによってもたらされる。（Ａ）Ｑｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに矢印で示されるように予想されたＭＷに従って移動し、（Ｂ）プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＣＤ２０タンパク質で連続希釈されたＱｕａｄ６４タンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ６４は、用量依存的にＣＤ２０タンパク質に結合する。 培養上清から精製した単一特異性四価単量体Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄ６５バージョン２タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。（Ａ）Ｑｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに矢印で示されるように予想されたＭＷに従って移動し、（Ｂ）プレート上にコーティングされた固定濃度の組換えＣＤ２０タンパク質で連続希釈されたＱｕａｄ６５タンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡである。Ｑｕａｄ６５は、用量依存的にＣＤ２０タンパク質に結合する。 ：Ｑｕａｄ６８およびＱｕａｄ６９の略図である（Ａ＆Ｂ）。ＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢに対するｄＡｂの特異性は、矢印で示されている。（Ｃ＆Ｄ）培養上清から精製されたＱｕａｄ６８およびＱｕａｄ６９タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。Ｑｕａｄタンパク質は、矢印で示されているように、予想されたＭＷに従って移動し、目に見える不純物は伴わなかった。 異なる種からのｐ５３四量体化ドメイン（ＴＤ）のアラインメントである。ヒトＴＤからの配列変動は、太字で強調表示され、下線が引かれている。 四価および八価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄの分子（Ａ）および構造（Ｂ＆Ｃ）配置の略図である。精製されたＱｕａｄタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｄ）で分析した。四価および八価のＱｕａｄタンパク質は、目に見える不純物を伴わずに示されるように、予想される分子量に従って移動した。コアヒンジ領域はこれらのフォーマットでは削除されており、これは図に＊またはＣＨ２’として示されている。Ｑ９２鎖には、Ｃ末端に位置するＨｉｓタグが含まれているが、図には示されていない。 培養上清から精製した八価二重特異性抗ＰＤＬ１／４－１ＢＢ ｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ａ）および八価単一特異性抗ＰＤＬ１ ｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ｂ）タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。Ｑｕａｄタンパク質は、矢印で示されているように、予想された分子量に従って移動し、目に見える不純物は伴わなかった。 培養上清から精製したアベルマブＦａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ａ）およびＨｕｍｉｒａＦａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ｂ）タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。Ｑｕａｄタンパク質は、矢印で示されているように、予想された分子量に従って移動し、目に見える不純物は伴わなかった。Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）Ｆａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄは、ＳＥＣによってさらに分析されたところ、完全に集合した四量体タンパク質が、予想される分子量（３１５．８ｋＤａ）で単一のピークとして溶出し、二量体または単量体の形態は目に見えて検出されなかった。 アフリベルセプト単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ｑ９６）の構造配置の略図である。＊は、ヒンジ領域は、コアヒンジ領域を欠いていることを示す。Ｑ９６ Ｑｕａｄタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、予想される分子量での単一タンパク質バンドが見られた（Ｂ）。Ｑ９６のＶＥＧＦ－Ａへの結合プロファイルは、ＥＬＩＳＡにより分析されたところ、用量依存的な結合が見られた。 一価、四価および八価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄの分子配置の略図である（Ａ）。すべての構築物は、Ｃ末端に位置するＨｉｓタグを含有するが、図には示されていない。精製されたＱｕａｄタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、一価、四価および八価のバージョンについて予想された分子量で（それぞれレーン１～３）単一タンパク質バンドが見られた（Ｂ）。Ｑ９２およびＱ９２＋Ｑ９３（Ｄ）Ｑｕａｄタンパク質に加えてＱ８８一価、四価および八価のＱｕａｄタンパク質（Ｃ）を使用したＴＮＦα結合アッセイをＥＬＩＳＡにより実施し、用量依存的な結合を見ることができる。Ｑｕａｄタンパク質のそれぞれのＴＮＦα中和能力は、ＷＥＨＩ」細胞ベースのバイオアッセイ（それぞれＥおよびＦ）を使用して分析された。ＴＮＦα中和能力の増強は、抗ＴＮＦα ｄＡｂ結合ドメインの数が増えるにつれてＱｕａｄで見ることができる。 十二価および十六価抗ＴＮＦα ｄＡｂ多量体（代替的に多量体Ｑｕａｄとも呼ばれる）の分子（Ａ）および構造（Ｂ）配列の略図である。軽鎖定常領域はＣＬで表され、これは、カッパ定常領域またはラムダ定常領域のいずれかから構成される。Ｑ１４２構築物は、Ｃ末端に位置するＨｉｓタグを含有するが、図には示されていない。精製されたＱｕａｄタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃ）で分析した。ラムダ（レーン１）またはカッパ（レーン２）定常領域のいずれかを有する十二価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄは、予想される分子量に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上を移動した。ラムダ（レーン３）またはカッパ（レーン４）定常領域のいずれかを有する十六価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄも、予想される分子量に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上を移動した。ＷＥＨＩ細胞ベースのバイオアッセイを使用して分析した場合のカッパ（Ｄ）またはラムダ（Ｅ）軽鎖定常領域のいずれかを有する十二価および十六価抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄタンパク質のＴＮＦα中和効力である。抗ＴＮＦα ｄＡｂ結合ドメインの増加に伴う能力の増強が見られる。 十二価の三重特異性（Ａ）および十六価の四重特異性（Ｂ）多量体の概略構造図である。各フォーマットについて、単量体ビルディングブロックの概略構造も示されている。任意の柔軟なリンカーを含むこれらの分子内の領域は、矢印で示されている。ＣＬドメインは、カッパまたはラムダＣ領域のいずれかであり得る。十二価の三重特異性Ｑｕａｄは、１～３とラベル付けされた３つの異なるｄＡｂを含有し、これらは、３つの異なる細胞の３つの異なる抗原に結合するか、または同じ細胞の３つの抗原に結合するか、または同じ抗原の３つの異なるエピトープに結合することができる。このフォーマットは、４＋４＋４の三重特異性十二価のＱｕａｄを表す。十二価の三重特異性Ｑｕａｄは、１～４とラベル付けされた４つの異なるｄＡｂを含有し、これらは、４つの異なる細胞の４つの異なる抗原に結合するか、または同じ細胞の４つの抗原に結合するか、または同じ抗原の４つの異なるエピトープに結合することができる。このフォーマットは、４＋４＋４＋４の四重特異性十二価のＱｕａｄを表す。 四価の非Ｉｇ様Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤ Ｑｕａｄ（Ａ）の概略構造図である。単量体ビルディングブロックの概略構造も示されている。任意の柔軟なリンカーを含有するこの分子内の領域は矢印で示されている（例えば、各リンカーは（本明細書に記載の（Ｇ_４Ｓリンカーである）。＊は、コアヒンジ領域が存在しないことを示す（すなわち、下部ヒンジ配列が存在し、任意に上部ヒンジ配列も存在する）。精製されたＨｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、予想される分子量での単一タンパク質バンドが見られた（Ｂ）。Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤおよびＨｕｍｉｒａ Ｆａｂ一価対照タンパク質を使用したＴＮＦα結合アッセイをＥＬＩＳＡによって実施したところ、用量依存的な結合が見られした（Ｃ）。Ｑｕａｄタンパク質のそれぞれのＴＮＦα中和能力は、ＷＥＨＩ細胞ベースのバイオアッセイを使用して分析された（Ｄ）。ＴＮＦα中和能力の増強は、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ一価対照と比較してＨｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤで見ることができる。 八価Ｆａｂの非Ｉｇ様Ｑｕａｄ（Ａ）またはＩｇ様Ｑｕａｄ（Ｂ）の概略構造図である。各フォーマットについて、単量体ビルディングブロックの概略構造も示されている。任意の柔軟なリンカーを含有するこれらの分子内の領域は矢印で示されている（例えば、各リンカーは（本明細書に記載の（Ｇ_４Ｓリンカーである）。 図２２に概説されているフォーマットＡ－ＡＣの単量体ビルディングブロックの概略図である。

本明細書のすべてのポリペプチド概略図およびアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって書かれている。本明細書のすべてのヌクレオチド配列は、５’から３’に向かって書かれている。

本発明は、ポリペプチドの四量体、およびエピトープもしくはエフェクタードメイン（抗原結合部位（例えば、抗原もしくはｐＭＨＣに、またはその可変ドメインに特異的に結合する抗体もしくはＴＣＲ結合部位）など）の、またはインクレチン、インスリンもしくはホルモンペプチドなどのペプチドの四量体、八量体、十二量体および十六量体または２０量体（例えば、四量体および八量体）などの多量体に関する。実施形態では、本発明の多量体は、真核生物系において有用に産生可能であり、可溶性形態で真核細胞から分泌され得、これは、例えば、医薬品、診断薬、造影剤、洗剤などの産生の様々な産業用途に有用である。エフェクタードメインまたはペプチドの四量体または八量体などの高次多量体は、抗原またはｐＭＨＣ結合活性を増強するのに有用である。これは、有効な医薬品を製造するため、または四量体もしくは八量体などの多量体を含む診断試薬の感度を高めるために有用であり得る。追加のまたは代替の利点は、本発明の多量体が、例えば、対象の疾患もしくは状態を治療または予防するために、ヒトまたは動物の対象に投与される場合、インビボでの半減期が向上されることである。有用には、本発明はまた、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）多価結合タンパク質を提供することができる。特異性は、抗原またはｐＭＨＣ結合の特異性に関連し得る。結合ドメインまたはペプチドを含む単一の操作されたポリペプチドを使用することにより、本発明は、ある特定の実施例において、多価（例えば、二重特異性）タンパク質を高純度で産生するための手段を有用に提供する。単一種の操作されたポリペプチド単量体の使用は、２つ以上の異なるポリペプチド種が多重（例えば、二重）特異的または多価タンパク質を産生するために使用されるときに見られる混合生成物の問題を回避する。

本発明は、以下の項目、態様、パラグラフおよび概念を提供する（これらは「請求項」を表すことを意図するものではなく；請求項は、実施例および表の後に本開示の終わりに提示される）。本明細書のいずれかの項目は、本明細書のいずれかの態様または概念と組み合わせることができる。本明細書のいずれかの態様は、本明細書のいずれかの概念と組み合わせることができる。

態様：
１．エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメイン）またはペプチドの少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体であって、多量体が、一緒に会合された第１、第２、第３および第４の自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）によって多量体化され、各四量体化ドメインが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含むそれぞれの操作されたポリペプチドによって構成される、タンパク質多量体。

例では、各ＴＤは、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のいずれか１つのＴＤである。例では、各ＴＤは、ｐ５３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。例では、各ＴＤは、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。例では、各ＴＤは、ｐ６３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。例では、各ＴＤは、ｐ７３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである。例では、各ＴＤは、ＮＨＲ２ ＴＤではない。例では、各ＴＤは、ｐ５３ ＴＤではない。例では、各ＴＤは、ｐ６３ ＴＤではない。例では、各ＴＤは、ｐ７３ ＴＤではない。例では、各ＴＤは、ｐ５３、６３または７３ ＴＤではない。例では、各ＴＤは、ＮＨＲ２、ｐ５３、６３または７３ ＴＤではない。

「一緒に会合する」ことにより、態様１におけるＴＤは、操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４のコピーを多量体化して、多量体タンパク質、例えば、真核細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）で細胞内に発現され得る、および／または真核細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から細胞外に分泌され得る、および／または水性媒体（例えば、真核生物または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）培養培地）に可溶性である多量体を提供する。例は、ＮＨＲ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤおよびｐ７３ ＴＤ（例えば、ＮＨＲ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤおよびｐ７３ ＴＤ）またはそれらのオルソログもしくは相同体である。

例では、ＴＤは、ｐ５３ ＴＤ（またはその相同体もしくはオルソログ）ではなく、例えば、それは、ヒトｐ５３ ＴＤ（またはその相同体もしくはオルソログ）ではない。例では、ＴＤは、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログであるが、ｐ５３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログを除く。例では、ＴＤは、ヒトＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログであるが、ヒトｐ５３ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログを除く。例では、ＴＤは、ヒトＮＨＲ２である。例では、ＴＤのアミノ酸配列は、ヒトＮＨＲ２の配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である。例では、ドメインまたはペプチドは、ＮＨＲ２ ＴＤも含むポリペプチドによって自然に含まれるわけではない。

例では、ポリペプチドのドメインのすべてはヒトである。

操作されたポリペプチドは、該ＴＤのコピーに対する該ドメインまたはペプチドのＮ末端の１つまたは複数のコピーを含み得る。追加的または代替的に、操作されたポリペプチドは、該ＴＤのコピーに対する該ドメインまたはペプチドのＣ末端の１つまたは複数のコピーを含み得る。例では、操作されたポリペプチドは、第１の該ドメインまたはペプチドおよびＴＤを含み、第１のドメインまたはペプチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の、ＴＤからの連続するアミノ酸によって離間配置されており、第１のドメインまたはペプチドとＴＤとの間にそれ以上の該ドメインまたはペプチドは存在しない。

例では、多量体（例えば、該操作されたポリペプチドの四量体）は、該ドメインまたはペプチドの４個（ただし４個以下）のＴＤ（例えば、同一のＴＤ）および４、８、１２または１６個（ただし、それぞれ、該４、８、１２または１６個以下）のコピーを含む。例では、各ＴＤおよび各該ドメインまたはペプチドは、ヒトである。

例では、多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）は、操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４の同一のコピーを含み、ポリペプチドは、ＴＤおよび該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ（ただし、１つ以下）、２つ（ただし２つ以下）、またはそれ以上のコピーを含む。例えば、エピトープまたはエフェクタードメインの四量体は、ＴＤを含むポリペプチドの４つの同一のコピーを有し、各ポリペプチドは、１つのそのようなエピトープまたはエフェクタードメインを有する。例えば、エピトープまたはエフェクタードメインの八量体は、ＴＤを含むポリペプチドの４つの同一のコピーを有し、各ポリペプチドは、２つのそのようなエピトープまたはエフェクタードメインを有する。例えば、エピトープまたはエフェクタードメインの十二量体は、ＴＤを含むポリペプチドの４つの同一のコピーを有し、各ポリペプチドは、３つのそのようなエピトープまたはエフェクタードメインを有する。例えば、エピトープまたはエフェクタードメインの十六量体は、ＴＤを含むポリペプチドの４つの同一のコピーを有し、各ポリペプチドは、４つのそのようなエピトープまたはエフェクタードメインを有する。例えば、エピトープまたはエフェクタードメインの２０量体は、ＴＤを含むポリペプチドの４つの同一のコピーを有し、各ポリペプチドは、５つのそのようなエピトープまたはエフェクタードメインを有する。一般に、例えば、エピトープまたはエフェクタードメインのＸ量体は、ＴＤを含むポリペプチドの４つの同一のコピーを有し、各ポリペプチドは、Ｘ／４個のそのようなエピトープまたはエフェクタードメインを有し、ここでＸ＝４の任意の倍数、例えば、４、８、１２、１６、２０、２４、２８または３２である。

いくつかの実施形態では、本発明の多量体、例えば、四量体または八量体を形成するためにただ１つのタイプの操作されたポリペプチドを必要とすることによって、本発明は、純粋な（または高純度、すなわち＞９０、９５、９６、９７、９８または９９％純度）フォーマットを容易に単離され得るフォーマット、ならびにそのようなフォーマットを純粋な（または非常に純粋な）形態で生成するための方法を有利に提供する。純度は、本発明の多量体が任意の他の多量体またはポリペプチド単量体と組成物中に混合されていないこと、または本発明の多量体が、組成物中に＞９０、９５、９６、９７、９８または９９％を超える、操作されたポリペプチドを含む本発明の多量体および他の多量体ならびに／またはポリペプチド単量体を含む種を含むことによって示される。したがって、これらの実施形態における異なるタイプのポリペプチドの混合物は、回避または最小化される。したがって、これはまた、有利には、１つのみ（および１つ以下）のタイプの操作されたポリペプチドを含む複数の多量体（例えば、複数の四量体または八量体または十二量体または十六量体）を提供し、ここで、多量体は、抗原結合に対して単一特異性であり（しかしながら多価であり）、あるいは抗原結合に対して二重または多重特異性である。したがって、本発明は、複数の多量体（例えば、複数の四量体または八量体または十二量体または六量体）であって、各ポリペプチドが、抗原結合に対して少なくとも四価であり、（ｉ）二重特異性（すなわち、２つの異なる抗原に特異的に結合することができる）、または（ｉｉ）抗原結合に対して単一特異性かつ少なくとも四価である、多量体を提供する。本明細書において、抗原結合が言及される場合、これは、ドメインがＴＣＲ Ｖドメインである場合、代わりにｐＭＨＣ結合であり得る。有利には、複数のものは、純粋な形態である（すなわち、２つ以上のタイプのポリペプチド単量体を含む複数のタイプのポリペプチド単量体を含む多量体（例えば、四量体または八量体または十二量体または十六量体）と混合されていない）。例では、多量体は、少なくとも２つの異なるタイプの抗原結合部位を含む。例では、多量体は、二重特異性、三重特異性、または四特異性である。例では、多量体は、４、６、８、１０、または１２、好ましくは４または８の抗原結合部位またはｐＭＨＣ結合部位の原子価を有する。

例では、ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）は、クラスＩまたはクラスＩＩのｐＭＨＣである。

本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、例えば、ドメイン、抗体または結合部位に関して、ＳＰＲによって決定される１ｍＭ以下の結合親和性で特定の抗原（またはｐＭＨＣ）を認識するドメイン、抗体または結合部位を意味する。

標的結合能力、特異性および親和性（ＫＤ（Ｋｄとも呼ばれる）、Ｋ_オフおよび／またはＫ_オン）は、当技術分野における任意の日常的な方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、特定の結合部位／リガンド、受容体／リガンド、または抗体／抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図している。一実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、２５℃で実施される。別の実施形態では、ＳＰＲは、３７℃で実施される。一実施形態では、ＳＰＲは、約ｐＨ７などの生理学的ｐＨで、またはｐＨ７．６で（例えば、ｐＨ７．６の緩衝生理食塩水（ＨＢＳ－ＥＰとも称される）を使用）で実施される。一実施形態では、ＳＰＲは、生理学的塩レベル、例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌで実施される。一実施形態では、ＳＰＲは、０．０５堆積％以下の洗剤レベルで、例えば、０．０５％のＰ２０（ポリソルベート２０；例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０（商標））および３ｍＭのＥＤＴＡの存在下で実施される。一例では、ＳＰＲは、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％の洗剤（例えば、Ｐ２０）および３ｍＭのＥＤＴＡの緩衝液中で２５℃または３７℃で実施される。緩衝液は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有することができる。一例では、ＳＰＲは、ＨＢＳ－ＥＰにおいて２５℃または３７℃で実施される。ＨＢＳ－ＥＰは、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ（カリフォルニア、カタログ番号Ｈ８０２２）から入手可能である。例では、親和性（例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位の）は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）またはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））などの任意の標準ＳＰＲ装置を使用することにより、ＳＰＲを使用して決定される。バインディングデータは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（商標）分析ソフトウェアに固有のモデルを使用するなど、標準的な手法を使用して固有の１：１モデルに適合させることができる。

例では、本発明の多量体、四量体または八量体または十二量体または十六量体または２０量体は、単離された多量体、四量体または八量体または十二量体または十六量体または２０量体である。例では、本発明の多量体、四量体または八量体は、該操作されたポリペプチドのコピーからなる。任意に、本発明の多量体、四量体または八量体または十二量体または十六量体または２０量体は、操作されたポリペプチドのそれぞれ４または８または１２または１６または２０のコピーを含むが、ただし４または８または１２または１６または２０コピー以下を含む。

「操作された」とは、そのポリペプチドが天然に存在しないことを意味し、例えば、タンパク質ドメインまたはペプチドは、該ＴＤも含むポリペプチドによって天然に含まれない。

該各タンパク質ドメインまたはペプチドは、抗原またはペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）に特異的に結合するドメインなどの生物学的に活性なドメインまたはペプチド（例えば、ヒトまたは動物において生物学的に活性である）であり得るか、またはドメインが、抗原またはｐＭＨＣ結合部位によって構成される。あるいは、ドメインまたはペプチドは、炭水化物、グルコース、またはインクレチンもしくはインスリンペプチドなどの糖調節剤である。別の方法では、ドメインまたはペプチドは、酵素の阻害剤、またはヒトまたは動物における生物学的機能もしくは経路の阻害剤である。別の方法では、ドメインまたはペプチドは鉄調節剤である。したがって、例では、各タンパク質ドメインまたはペプチドは、抗原またはｐＭＨＣ結合ドメインまたはペプチド、ホルモン、炭水化物、グルコースまたは糖調節剤、鉄調節剤、および酵素阻害剤から選択される。
２．多量体が、該ドメインまたはペプチドの四量体、八量体、１２量体、１６量体または２０量体（例えば、四量体、八量体、１２量体または１６量体）である、先行する態様のいずれか１つに記載の多量体。
３．免疫グロブリンスーパーファミリー結合部位（抗体またはＴＣＲ結合部位、例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＴＣＲ）の四量体、八量体、１２量体、１６量体または２０量体（例えば、四量体、八量体、１２量体または１６量体）を含む、態様１または２のいずれか１つに記載の多量体。

免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、細胞の認識、結合、または接着プロセスに関与する細胞表面および可溶性タンパク質の大きなタンパク質スーパーファミリーである。分子は、免疫グロブリン（抗体としても知られている）との共有構造的特徴に基づいて、このスーパーファミリーのメンバーとして分類され、それらはすべて免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして知られるドメインを有している。ＩｇＳＦのメンバーとしては、細胞表面抗原受容体、免疫系の補助受容体および共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、特定のサイトカイン受容体、および細胞内筋タンパク質が挙げられる。それらは一般的に免疫系の役割に関連している。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ドメインは、Ｖα（例えば、Ｖβと対合している）、Ｖβ（例えば、Ｖαと対合している）、Ｖγ（例えば、Ｖδと対号している）またはＶδ（例えば、Ｖγと対合している）であり得る。
４．結合部位が、第２の可変ドメインと対合している第１の可変ドメインを含む、態様３に記載の多量体。

第１の例では、第１および第２の可変ドメインは、操作されたポリペプチドによって構成される。別の例では、第１のドメインは操作されたポリペプチドによって構成され、第２のドメインは、操作されたポリペプチドとは異なる（および任意にＴＤを含むか、またはＴＤを欠く）さらなるポリペプチドによって構成される。

別の方法では、ドメインは定常領域ドメインである。別の方法では、ドメインはＦｃＡｂである。別の方法では、ドメインは非Ｉｇ抗原結合部位であるか、または非Ｉｇ抗原結合部位、例えばアフィボディによって構成される。

抗原結合部位およびエフェクタードメイン
例では、この抗原結合部位もしくは各抗原結合部位（またはエフェクタードメイン）は、抗体可変ドメイン（例えば、ＶＬまたはＶＨ、抗体単一可変ドメイン（ドメイン抗体またはｄＡｂ）、ラクダＶＨＨ抗体単一可変ドメイン、サメ免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＮＡ Ｖ）、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）またはラクダ化ＶＨ単一可変ドメイン）；Ｔ細胞受容体結合ドメイン；免疫グロブリンスーパーファミリードメイン；アグナサン可変リンパ球受容体（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；２０１０ Ａｕｇ ｌ；１８５（３）：１３６７－７４；「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｊａｗｌｅｓｓ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ」；Ｈｅｒｒｉｎ ＢＲ ＆ Ｃｏｏｐｅｒ Ｍ Ｄ．）；フィブロネクチンドメイン（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））；ｓｃＦｖ；（ｓｃＦｖ）_２；ｓｃ－ダイアボディ；ｓｃＦａｂ；センチリンおよびＣＴＬＡ－４（Ｅｖｉｂｏｄｙ（商標））から選択されたスキャフォールドに由来する抗原結合部位；リポカリンドメイン；プロテインＡのＺドメインなどのプロテインＡ（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）またはＳｐＡ）；Ａドメイン（例えば：Ａｖｉｍｅｒ（商標）またはＭａｘｉｂｏｄｙ（商標）；熱ショックタンパク質（ＧｒｏＥＩおよびＧｒｏＥＳに由来するエピトープ結合ドメインなど）；トランスフェリンドメイン（例えば、トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（商標））；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（例えば、Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ（商標））：ヒトγ－クリスタリンまたはヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；サソリ毒素；およびヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメインからなる群から選択される。

抗原結合部位のさらなる供給源は、ＷＯ２００７／０２４７１５の４０ページの２３行目から４３ページの２３行目に開示されている抗体の可変ドメインおよびＶＨ／ＶＬ対である。この特定の開示は、本発明で使用するためのエピトープ結合部分および本明細書の特許請求の範囲に含まれる可能性のある部分に対して基礎を提供するために、本明細書に明示的に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。

「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分から独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般に、ドメインはタンパク質の個別の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質の残りの部分および／またはドメインの機能を失うことなく、他のタンパク質に追加、削除、または転送することができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、これには、完全抗体可変ドメインおよび修飾可変ドメイン、例えば、１つ以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列、または短縮された、またはＮ－もしくはＣ－末端伸長を含む抗体可変ドメインによって置き換えられているもの、ならびに少なくとも完全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントが挙げられる。

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「抗体単一可変ドメイン」という句は、異なるＶ領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の異なる可変領域または可変ドメインとのフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在することができ、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインが追加の可変ドメインとは独立して抗原に結合する場合）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書で使用される用語としての、抗原に結合することができる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであり得るが、齧歯動物（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示される）、コモリザメおよびラクダＶＨＨ免疫グロブリン単一可変ドメインなどの他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコなどの種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、軽鎖を自然に欠く重鎖抗体を産生する。そのようなＶＨＨドメインは、当技術分野において利用可能な標準的な技術に従ってヒト化することができ、そのようなドメインは、依然として、本発明による「ドメイン抗体」であると見なされる。本明細書で使用される場合、「ＶＨ」はラクダＶＨＨドメインを含む。ＮＡ Ｖは、コモリザメを含む軟骨魚類で同定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。これらのドメインは、新規抗原受容体可変領域（一般にＶ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと略される）としても知られている。さらなる詳細については、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，６５６－６６５（２００６）およびＵＳ２００５／００４３５１９Ａを参照されたい。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、Ｉｇフォールドのような可変ドメインを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように設計されたＣＴＬＡ－４分子は、Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓとしても知られている。さらなる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２），３１－４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド、脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる円錐構造の開放端部に多数のループを備えた堅いβシート二次構造を有する。アンチカリンのサイズは１６０～１８０個のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、ＵＳ７２５０２９７Ｂ１およびＵＳ２００７／０２２４６３３を参照されたい。アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのプロテインＡに由来するスキャフォールドであり、抗原に結合するように操作することができる。ドメインは、約５８個のアミノ酸の３ヘリックスバンドルで構成されている。ライブラリは、表面残基のランダム化によって生成されている。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７，４５５－４６２（２００４）およびＥＰ１６４１８１８Ａ１を参照されたい。Ａｖｉｍｅｒｓ（商標）は、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。約３５個のアミノ酸のネイティブドメインは、定義されたジスルフィド結合構造を採用している。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然変異のシャッフリングによって生成される。さらなる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２），１５５６－１５６１（２００５）およびＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６），９０９－９１７（Ｊｕｎｅ ２００７）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループにペプチド配列を挿入することにより、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例には、トランスボディが含まれる。詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ ２７４，２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ（商標））は、細胞骨格への内在性膜タンパク質の付着を仲介するタンパク質ファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのａ－ヘリックスとβ－ターンとからなる３３残基のモチーフである。それらは、最初のα－ヘリックスの残基と各リピートのβ－ターンをランダム化することにより、異なる標的抗原に結合するように設計することができる。それらの結合インターフェースは、モジュールの数を増やすことによって増やすことができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３（２００３），ＰＮＡＳ １００（４），１７００－１７０５（２００３）およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９，１０１５－１０２８ （２００７）ならびにＵＳ２００４／０１３２０２８Ａ１を参照されたい。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができるスキャフォールドである。Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標）は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５の繰り返し単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格で構成されている。βサンドイッチの一端にある３つのループを操作して、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるようにすることができる。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５－４４４（２００５）、ＵＳ２００８／０１３９７９１、ＷＯ２００５／０５６７６４およびＵＳ６８１８４１８Ｂ１を参照されたい。ペプチドアプタマーは、一定のスキャフォールドタンパク質、典型的には、活性部位で挿入された拘束された可変ペプチドループを含有するチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなる組み合わせの認識分子である。さらなる詳細についてはＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ，５ ７８３－７９７（２００５）を参照されたい。マイクロボディは、３～４個のシステインブリッジを含む２５～５０個のアミノ酸の長さの天然に存在するマイクロタンパク質に由来し、マイクロタンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩおよびコノトキシンおよびノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）などが挙げられる。マイクロプロテインは、マイクロプロテインの全体的な折り畳みに影響を与えることなく、最大２５個のアミノ酸を含むように設計できるループを有する。操作されたノッチンドメインの詳細については、ＷＯ２００８／０９８７９６を参照されたい。他のエピトープ結合部分およびドメインは、異なる標的抗原結合特性を操作するためのスキャフォールドとして使用されてきたタンパク質を含み、ヒトγ－クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ－６のＰＤＺ－ドメイン、サソリ毒素（チャリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）は、Ｃｈａｐｔｅｒ ７－Ｎｏｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｒｏｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２００７、Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌにより編集）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４－２７（２００６）で考察されている。

例では、抗原結合部位もしくは各抗原結合部位（またはエフェクタードメイン）は、非Ｉｇスキャフォールドを含み、例えば、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、自転車ペプチド、Ｃｙｓノット、ＤＡＲｐｉｎ、フィブロネクチンＩＩＩ型、Ｆｙｏｍｅｒｓ、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、ＯＢｏｄｉｅｓ、アプタマー、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、アルマジロリピートドメイン、ベータ－ヘパリン模倣体およびリポカリン（Ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ）からなる群から選択される。
５．各ポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの第１および第２のコピーを含み、ポリペプチドが（Ｎ末端からＣ末端に向かう方向）に（ｉ）該コピーの第１のもの－ＴＤ－該コピーの第２のもの、（ｉｉ）ＴＤ－と第１および第２のコピー、または（ｉｉｉ）該第１および第２のコピー－ＴＤを含む、態様１～４のいずれか１つに記載の多量体。
６．ＴＤがＮＨＲ２ ＴＤであり、ドメインまたはペプチドがＮＨＲ２ドメインまたはペプチドではないか、あるいはＴＤがｐ５３ ＴＤであり、ドメインまたはペプチドが、ｐ５３ドメインまたはペプチドではない、態様１～５のいずれか１つに記載の多量体。
７．操作されたポリペプチドが、第２のタイプのタンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、第２のタイプのタンパク質ドメインまたはペプチドが、第１のタンパク質ドメインまたはペプチドとは異なる、態様１～６のいずれか１つに記載の多量体。

例えば、ポリペプチドは、Ｎ末端方向に（ｉ）Ｐ１－ＴＤ－Ｐ２、または（ｉｉ）ＴＤ－Ｐ１－Ｐ２を含み、Ｐ１＝第１のタイプのドメインまたはペプチドのコピー（すなわち、態様１の多量体のドメインまたはペプチドのタイプ）であり、Ｐ２＝該第２のタイプのドメインまたはペプチドのコピーである。
８．ドメインが、免疫グロブリンスーパーファミリードメインである、態様１～７のいずれか１つに記載の多量体。
９．ドメインまたはペプチドが、抗体可変もしくは定常ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）、ＴＣＲ可変もしくは定常ドメイン、インクレチン、インスリンペプチド、またはホルモンペプチドである、態様１～８のいずれか１つに記載の多量体。
１０．多量体が、該操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４の同一のコピーを含み、ポリペプチドが、ＴＤおよび該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ（ただし、１つ以下）、２つ（ただし２つ以下）、またはそれ以上のコピーを含む、態様１～９のいずれか１つに記載の多量体。
１１．操作されたポリペプチドが、抗体またはＴＣＲ可変ドメイン（Ｖ１）およびＮＨＲ２ ＴＤを含む、態様１～１０のいずれか１つに記載の多量体。
１２．ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）Ｖ１－任意のリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ；（ｉｉ）Ｖ１－任意のリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ－任意のリンカー－Ｖ２、あるいは（ｉｉｉ）Ｖ１－任意のリンカーカー－Ｖ２－任意のリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤを含み、Ｖ１およびＶ２が、ＴＣＲ可変ドメインであり、同じであるか、または異なり、あるいはＶ１およびＶ２が、抗体可変ドメインであり、同じであるか、または異なる、態様１１に記載の多量体。
１３．Ｖ１およびＶ２が、抗体単一可変ドメインである、態様１２に記載の多量体。
１４．各操作されたポリペプチドが（Ｎ末端からＣ末端の方向に）Ｖ１－任意のリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤを含み、Ｖ１が、抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、各操作されたポリペプチドが、それぞれの第２の操作されたポリペプチドと対合しており、Ｖ２を含むポリペプチド、Ｖ２が、それぞれ、Ｖ１と対合して抗原またはｐＭＨＣ結合部位を形成する抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、任意に、一方のポリペプチドが、抗体Ｆｃを含むか、または抗体ＣＨ１を含み、他方のポリペプチドが、ＣＨ１と対合している抗体ＣＬを含む、態様１１に記載の多量体。
１５．ＴＤが、（ｉ）配列番号１０または１２６と同一であるか、またはそれと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１２０または１２３と同一または少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、態様１～１４のいずれか１つに記載の多量体。
１６．多量体が、ＲｅｏＰｒｏ（商標）、アブシキシマブ、リツキサン（商標）、リツキシマブ、ゼナパックス（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）、エファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）、トシリズマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、ラニビズマブ、Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａ（商標）、セルトリズマブ、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキヌマブ、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏｌｉａ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘ（商標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）、イプリズマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズムマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アド－トラスツズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）、Ｏｐｄｉｖｏ（商標）、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の四量体、八量体、１２量体、１６量体、または２０量体（例えば、四量体、八量体、１２量体または１６量体、もしくは四量体または八量体）を含む、態様１～１５のいずれか１つに記載の多量体。任意に、多量体のポリペプチドの結合部位は、抗体の結合部位のＶＨおよび抗体のＣＨ１（すなわち、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＨ１およびＳＡＭ）を含む。実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に、例えば、ＣＬが抗体のＣＬである、ＶＬ－ＣＬ）を含むさらなるポリペプチドと対合され得る。

例えば、操作されたポリペプチドの該タンパク質ドメインは、該群から選択される抗体の抗体結合部位のＶドメイン（ＶＨまたはＶＬ）であり、ここで、多量体は、操作されたポリペプチドのＶドメインと対合して、選択された抗体の抗原結合部位を形成するさらなるＶドメイン（それぞれ、ＶＬまたはＶＨ）を含む。したがって、有利には、本発明は、該選択された結合部位の四量体、八量体、１２量体、１６量体または２０量体（例えば、四量体、八量体、１２量体もしくは１６量体、または四量体もしくは八量体）を提供し、これらは、その同族抗原に結合するための、または多量体がインビボで同族抗原に結合するためにそれに投与されるヒトまたは動物における疾患または状態を治療もしくは予防するための改善された親和性、結合活性および／または有効性を有益に有し得る。

例えば、多量体、四量体、八量体、１２量体、１６量体または２０量体（例えば、四量体、八量体、１２量体もしくは１６量体、または四量体もしくは八量体）は、４つ（または上記のように該Ｘ／４）の抗体の抗原結合部位のコピーを含み、この抗体は、アダリムマブ、サリルマブ、デュピルマブ、ベバシズマブ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、セツキシマブ（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（商標））、トシリズマブ（例えば、ＡＣＴＥＭＲＡ（商標））またはトラスツズマブ（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））である。別の方法では、抗体は、抗ＣＤ３８抗体、抗ＴＮＦａ抗体、抗ＴＮＦＲ抗体、抗ＩＬ－４Ｒａ抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＩＬ－１抗体である。別の方法として、抗体は、ＷＯ２００７／０２４７１５の４０ページ、２３行目から４３ページ、２３行目に開示されている抗体から選択され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書の結合部位は、例えば、受容体（例えば、ＫＤＲまたはＦｌｔ）のリガンド（例えば、サイトカインまたは成長因子、例えば、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲ）結合部位であり得る。本明細書の結合部位は、例えば、Ｅｙｅｌｅａ（商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）またはＬｕｃｅｎｔｉｓ（商標）の結合部位であり得、例えば、ヒトまたは動物における眼または腫瘍学的な医学的使用のためである。リガンドまたは抗原がＶＥＧＦである場合、多量体、四量体または八量体は、がんまたは眼の状態（例えば、ウェット型もしくはドライ型のＡＭＤまたは糖尿病性網膜症）の治療もしくは予防のため、またはヒトもしくは動物の対象における血管新生の阻害剤としてあり得る。
１７．ＴＣＲ結合部位、インスリンペプチド、インクレチンペプチドまたはペプチドホルモンの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体、あるいは複数の該四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。

いくつかの重要なペプチドホルモンは、下垂体から分泌される。下垂体前葉は３つのホルモンを分泌し、乳腺に作用するプロラクチン、副腎皮質に作用してグルココルチコイドの分泌を調節する副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、骨、筋肉、肝臓に作用する成長ホルモンである。下垂体後葉は、バソプレッシン、およびオキシトシンとも呼ばれる抗利尿ホルモンを分泌する。しかしながら、ペプチドホルモンは、心臓（心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ））および膵臓（グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン）、胃腸管（コレシストキニン、ガストリン）、および脂肪組織（レプチン）を含む、さまざまな臓器や組織によって産生される。例では、本発明のペプチドホルモンは、プロラクチン、ＡＣＴＨ、成長ホルモン（ソマトトロピン）、バソプレッシン、オキシトシン、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリンおよびレプチン（例えば、ヒトプロラクチン、ＡＣＴＨ、成長ホルモン、バソプレッシン、オキシトシン、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリンおよびレプチン）から選択される。

例では、インクレチンは、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ、またはエキセンディン－４ペプチドである。

本発明は、実施形態では、以下の操作された多量体を提供する。
インクレチンの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
インスリンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１））ペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）ペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
エキセンディン（例えば、エキセンディン－４）ペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ペプチドホルモンの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
プロラクチンまたはプロラクチンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ＡＣＴＨまたはＡＣＴＨペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
成長ホルモンまたは成長ホルモンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体ペプチド。
バソプレッシンまたはバソプレッシンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
オキシトシンまたはオキシトシンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
グルカゴンまたはグルカゴンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
インスリンまたはインスリンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ソマトスタチンまたはソマトスタチンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
コレシストキニンまたはコレシストキニンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ガストリンまたはガストリンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
レプチンまたはレプチンペプチドの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
抗体結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）の単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ＴＣＲ結合部位（例えば、ｓｃＴＣＲ）の単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ＴＣＲ Ｖα／Ｖβ結合部位の単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ＴＣＲ Ｖγ／Ｖδ結合部位の単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
抗体の単一可変ドメイン結合部位の単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
ＦｃＡｂ結合部位の単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。

これらの四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体のいずれかの例では、ドメインまたはペプチドはヒトである。これらの四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体のいずれかの例では、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、ＮＨＲ２ ＴＤ（例えば、ヒトＮＨＲ２）を含む。これらの四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体のいずれかの例では、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、ｐ５３ ＴＤ（例えば、ヒトｐ５３ ＴＤ）を含む。これらの四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体のいずれかの例では、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、ｐ６３ ＴＤ（例えば、ヒトｐ６３ ＴＤ）を含む。これらの四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体のいずれかの例では、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、ｐ７３ ＴＤ（例えば、ヒトｐ７３ ＴＤ）を含む。これらの四量体、八量体、十二量体、六量体または２０量体のいずれかの例では、四量体、八量体、十二量体、六量体または２０量体は、ＴＤ（例えば、ヒトＮＨＲ２ ＴＤ）の四量体を含み、それにより、ドメインまたはペプチドが４つもしくは８つのドメインまたはペプチドの多量体を形成する。

例では、複数は純粋であり、例えば、多量体が２つ以上のタイプのポリペプチド単量体を含む、該結合部位またはペプチドの多量体との混合物ではない。
１８．多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、
（ａ）水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）に可溶であり、
（ｂ）真核細胞から分泌可能であり、および／または
（ｃ）真核細胞の発現産物である、態様１～１７のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。

例では、多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、ＨＥＫ２９３Ｔ（または他の真核生物、哺乳動物、ＣＨＯまたはＣｏｓ）細胞から安定した形で分泌可能であり、そのような細胞からの上清のサンプルを使用するＰＡＧＥゲル上で、ウエスタンブロットを使用して検出された該多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体に対して予想された分子量での単一のバンドによって示される通りである。
１９．下記の
（ａ）ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位であって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）に可溶性である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位、
（ｂ）抗体単一可変ドメインであって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、水溶液（例えば、水性真核細胞増殖培地または緩衝液）に可溶性である、抗体単一可変ドメイン、
（ｃ）ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位であって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外で発現することができる、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位、あるいは
（ｄ）抗体可変ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）であって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外で発現することができる、抗体可変ドメイン（例えば、抗体単一可変ドメイン）の、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）。

培地の例は、Ｌ－グルタミンを補充したＳＦＭＩＩ増殖培地（例えば、４ｍＭのＬ－グルタミンを補充した完全ＳＦＭＩＩ増殖培地）である。例では、培地は無血清ＨＥＫ２９３細胞培養培地である。例では、培地は無血清ＣＨＯ細胞培養培地である。

例えば、本明細書の細胞は、ヒト細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞など）である。
２０．多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、抗原またはｐＭＨＣ結合に対して二重特異性である、態様１～１９のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
２１．ドメインが同一である、態様１～２０のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
２２．多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、真核細胞のグリコシル化を含む、態様１～２１のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。

例えば、グリコシル化はＣＨＯ細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化は、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３ＴなどのＨＥＫ２９３）細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化はＣｏｓ細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化はＰｉｃｃｈｉａ細胞のグリコシル化である。例えば、グリコシル化はＳａｃｃｈａａｒｏｍｙｃｅｓ細胞のグリコシル化である。
２３．細胞がＨＥＫ２９３細胞である、態様２２に記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
２４．態様１～２３のいずれか１つに記載の複数の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体、または２０量体。
２５．態様１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と、を含む薬学的組成物。
２６．態様１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体を含む化粧品、食品、飲料、洗浄製品、洗剤。
２７．態様１～２６のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体の該操作された（および任意に単離された）ポリペプチドまたは単量体（任意に単離された）。

単量体は、本明細書に開示されるように操作されたポリペプチドであり、該タンパク質ドメインまたはペプチドを含み、さらにＴＤを含む。

任意に、操作されたポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）可変ドメイン（Ｖ１）－定常ドメイン（Ｃ）（例えば、ＣＨ１またはＦｃ）－任意のリンカー－ＴＤを含む。
２８．操作された（および任意に単離され）操作されたポリペプチド（Ｐ１）であって、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：－
（ａ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、Ｃ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、Ｃ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであり、Ｃ１がＣγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδであり、Ｃ１がＣδである、ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｂ）ＴＣＲ Ｖ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδである、ＴＣＲ Ｖ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｃ）抗体Ｖ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ１－抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｄ）抗体Ｖ１－任意の抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－抗体Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ）－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ１－任意の抗体Ｃ（例えば、ＣＨ、ＣＨ１（ＩｇＧ ＣＨ１など）またはＣＬ（ＣλまたはＣκなど））－抗体Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ）－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｅ）抗体Ｖ１－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ１－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｆ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、Ｃ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、Ｃ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであり、Ｃ１がＣγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδであり、Ｃ１がＣδである、ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－任意のリンカー－ＴＤ、を含む、操作された（および任意に単離され）操作されたポリペプチド（Ｐ１）。

（ａ）または（ｂ）において、例では、ＴＣＲ Ｖは、ｐＭＨＣに特異的に結合する一本鎖ＴＣＲ結合部位（ｓｃＴＣＲ）によって構成され、結合部位は、ＴＣＲ Ｖ－リンカー－ＴＣＲＶを含む。例では、操作されたポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）Ｖ１－リンカー－Ｖ－任意のＣ－任意のリンカー－ＴＤ、または（ｉｉ）Ｖａ－リンカー－Ｖ１－任意のＣ－任意のリンカー－ＴＤを含み、ここで、ＶａはＴＣＲ Ｖドメインであり、Ｃは抗体Ｃドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）またはＴＣＲ Ｃである。

好ましくは、抗体ＣはＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）である。

例では、多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、１５５ｋＤａ以下のサイズを有し、例えば、該タンパク質ドメインは、ラクダＣＤＲ３またはウシＣＤＲ３などの、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸のＣＤＲ３を含む抗体可変ドメインである。

例では、多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体、または２０量体は、ＴＣＲ結合部位および抗体結合部位を含む。例えば、各ポリペプチドは、ＴＣＲ Ｖ（例えば、ｐＭＨＣに特異的に結合するｓｃＴＣＲによって構成される）および抗体Ｖ（例えば、ｓｃＦｖによって構成されるか、または該第２のポリペプチドによって構成される第２のＶドメインと対合して、抗原に特異的に結合するＶ／Ｖ対合結合部位を形成する）を含む。例では、ｐＭＨＣはＲＡＳペプチドを含む。例では、抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、または本明細書に開示される任意の他の抗原からなる群から選択される。例えば、抗原はＰＤ－１であり、ｐＭＨＣはＲＡＳペプチドを含む。
２９．操作されたポリペプチドＰ１がさらなるポリペプチド（Ｐ２）と対合しており、Ｐ２が（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
（ｇ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）であって、Ｐ１が、態様２８の（ａ）に記載されているものであり、
（ｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶαであり、Ｃ２はＣαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶβであり、Ｃ２はＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｖ）に従っている場合、Ｖ２はＶγであり、Ｃ２はＣγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶδであり、Ｃ２はＣδである、ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）、
あるいは
（ｈ）ＴＣＲ Ｖ２－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）であって、Ｐ１が、態様２８に記載の（ｂ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｖ）に従っている場合、Ｖ２はＶγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶδである、ＴＣＲ Ｖ２－抗体ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）、
あるいは
（ｉ）抗体Ｖ２－ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）であって、Ｐ１が、態様２８に記載の（ｃ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＨであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ２－ＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）、
あるいは
（ｊ）抗体Ｖ２－任意のＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）であって、Ｐ１が、態様２８に記載の（ｄ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＨであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ２－任意のＣＬ（例えば、ＣλまたはＣκ）、
あるいは
（ｋ）抗体Ｖ２－ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）であって、Ｐ１が、態様２８に記載の（ｅ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＨであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＬ（例えば、ＶλまたはＶκ）である、抗体Ｖ２－ＣＨ１（例えば、ＩｇＧ ＣＨ１）、
あるいは
（ｌ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２であって、Ｐ１が、態様２８に記載の（ｆ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶαであり、Ｃ２はＣαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶβであり、Ｃ２はＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶγであり、Ｃ２はＣγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｖ）に従っている場合、Ｖ２はＶδであり、Ｃ２はＣδである、ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２を含む、態様２８に記載のポリペプチド。

任意に、Ｖ１およびＶ２は、抗原またはｐＭＨＣに特異的に結合することができる対合した可変ドメイン結合部位を形成する。例では、Ｖ１およびＶ２は、ＲｅｏＰｒｏ（商標）、アブシキシマブ、リツキサン（商標）、リツキシマブ、ゼナパックス（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）、エファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）、トシリズマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、ラニビズマブ、Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａ（商標）、セルトリズマブ、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキヌマブ、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏｌｉａ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘ（商標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）、イプリズマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズムマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アド－トラスツズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）、Ｏｐｄｉｖｏ（商標）、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の可変ドメインである。任意に、多量体のポリペプチドの結合部位は、抗体の結合部位のＶＨおよび抗体のＣＨ１（すなわち、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＨ１およびＳＡＭ）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に、例えば、ＣＬが抗体のＣＬである、ＶＬ－ＣＬ）を含むさらなるポリペプチドと対合され得る。

一実施形態では、抗体はアバスチンである。

一実施形態では、抗体はアクテムラである。

一実施形態では、抗体はエルビタックスである。

一実施形態では、抗体はルセンティスである。

一実施形態では、抗体はサリルマブである。

一実施形態では、抗体はデュピルマブである。

一実施形態では、抗体はアリロクマブである。

一実施形態では、抗体はボコシズマブである。

一実施形態では、抗体はエボロクマブである。

一実施形態では、抗体はペムブロリズマブである。

一実施形態では、抗体はニボルマブである。

一実施形態では、抗体はイピリムマブである。

一実施形態では、抗体はレミケードである。

一実施形態では、抗体はゴリムマブである。

一実施形態では、抗体はオファツムマブである。

一実施形態では、抗体はベンリスタである。

一実施形態では、抗体はカンパスである。

一実施形態では、抗体はリツキシマブである。

一実施形態では、抗体はハーセプチンである。

一実施形態では、抗体はデュルバルマブである。

一実施形態では、抗体はダラツムマブである。

例では、本明細書の任意の結合ドメイン（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖまたはＦａｂ）またはＶ１は、ＡＢＣＦ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、アグレカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＷＩ、ＡＩＧ１、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、ＡＩＹＩＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣ１、ＡＲ、ＡＺＧＰ１（ジンク－ａ－糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧ１、ＢＡＩ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）、ＢｌｙＳ、ＢＭＰｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲＩＡ、ＢＭＰＲＩＢ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧ１（プレクチン）、ＢＲＣＡ１、ＣＩ９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶ１、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬ１（１－３０９）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ－２）、ＳＬＣ、ｅｘｏｄｕｓ－２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２Ｉエオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－ｌａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－ｌｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－１ＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ－２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２ＩＷａｐｌ／Ｃｉｐｌ）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）、ＣＤＫＮＩＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐｌ６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲ１、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン－７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラステリン）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＮＲ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、ＣＲＰ、ＣＳＦｌ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢｌ（ｂ－カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｉ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯｌ）、ＣＸＣＬＩＯ（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１（ｌ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８ＩＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ ＩＳＴＲＬ３３ Ｉ Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬ１、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡＩ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、ＥＮ０１、ＥＮ０２、ＥＮ０３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）、ＦＵ１２５８４、ＦＵ２５５３０、ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン）、ＦＬＴｌ、ＦＯＳ、ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ－Ｉ）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６５Ｔ、ＧＡＴＡ３、ＧＤＦ５、ＧＦＩ１、ＧＧＴ１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＮＡＳ１、ＧＮＲＨｌ、ＧＰＲ２（ＣＣＲＩＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ））、ＧＳＴＰｌ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ４、ＥＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ヒスタミンならびにヒスタミン受容体、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸ１、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、１Ｄ２、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮガンマ、ＴＦＮＷ１、ＩＧＢＰ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ－１、ＩＬ１０、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ－１２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、１Ｌ１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、１Ｌ１４、１Ｌ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１６、１Ｌ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、１Ｌ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、１Ｌ１９、ＩＬＩＡ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２ ＩＬ１ＲＮ、１Ｌ２、１Ｌ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、１Ｌ２２、１Ｌ２２Ｒ、１Ｌ２２ＲＡ２、１Ｌ２３、１Ｌ２４、１Ｌ２５、１Ｌ２６、１Ｌ２７、１Ｌ２８Ａ、１Ｌ２８Ｂ、１Ｌ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、１Ｌ３、１Ｌ３０、ＩＬ３ＲＡ、１Ｌ４、ＩＬ４Ｒ、１Ｌ５、ＩＬ５ＲＡ、１Ｌ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、１Ｌ７、ＴＬ７Ｒ、１Ｌ８、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、１Ｌ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、１ＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩ１、ＫＤＲ、ＭＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣＢｏｘＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異型ＩＩケラチン）、ＬＡＭＡ５、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）、ＭＤＫ、ＭＩＢ１、ミドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＰ－２、ＭＫ１６７（Ｋｉ－６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン－ｉｆｉ）、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ－ｐ７５、ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ、ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢ１、ＮＲＯＢ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺ１、ＯＰＲＤ１、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴＩ、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣ１、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲ１、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（ｐ２ＩＲａｃ２）、ＲＡＲＢ、ＲＧＳ１、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）、ＲＯＢ０２、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロブリン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロブリン１）、ＳＣＹＥ１（血管内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＩＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＴ－ｉ）、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＨＢＧ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰｌ、ＳＰＲＲＩＢ（Ｓｐｒｉ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢｌ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰＩＯ、ＴＤＧＦ１、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン－１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ－ｉ）、Ｔ］ＭＰ３、組織因子、ＴＬＲＩＯ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＦ、ＴＮＦ－ａ（本明細書ではＴＮＦアルファまたはＴＮＦαとも呼ばれる）、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦＩＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（０Ｘ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－ｌＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼｌｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＬＡ－４、ＸＣＬ１
（リンフォテクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－ｌｂ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＹＹ１、およびＺＦＰＭ２からなる群から選択される抗原に特異的に結合することができる（それ自体、単一の可変ドメインの場合、またはＶ２と対合する場合）。

例えば、本発明の任意の構成において、多量体、八量体、十二量体、十六量体はまたは２０量体は、第１および第２のエピトープもしくは抗原に特異的に結合し（例えば、八量体、十二量体、十六量体または２０量体の場合）、任意に第１、第２および第３のエピトープもしくは抗原に特異的に結合し（例えば、十二量体、十六量体または２０量体の場合）、または任意に、第１、第２、第３、および第４のエピトープもしくは抗原に特異的に結合し（例えば、十六量体または２０量体の場合）、または、任意に第１、第２、第３、第４および第５のエピトープもしくは抗原に特異的に結合し（例えば、２０量体の場合）、エピトープもしくは抗原のそれぞれは、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３；ＣＤ１９およびＣＤ３；ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２；ＶＥＧＦおよびＥＧＦＲ；ＣＤ１３８およびＣＤ２０；ＣＤ１３８およびＣＤ４０；ＣＤ２０およびＣＤ３；ＣＤ３８およびＣＤ１３８；ＣＤ３８およびＣＤ２０；ＣＤ３８およびＣＤ４０；ＣＤ４０およびＣＤ２０；ＣＤ１９およびＣＤ２０；ＣＤ－８およびＩＬ－６；ＰＤＬ－１およびＣＴＬＡ－４；ＣＴＬＡ－４およびＢＴＮ０２；ＣＳＰＧｓおよびＲＧＭＡ；ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１および／または２ならびにＥｒｂ２Ｂ；ＩＬ－１２およびＩＬ－１８；ＩＬ－１２およびＴＷＥＡＫ；ＩＬ－１３およびＡＤＡＭ８；ＩＬ－１３およびＣＬ２５；ＩＬ－１３およびＩＬ－ｌベータ；ＩＬ－１３およびＩＬ－２５；ＩＬ－１３およびＩＬ－４；ＩＬ－１３およびＩＬ－５；ＩＬ－１３およびＩＬ－９；ＩＬ－１３およびＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１３およびＭＤＣ；ＩＬ－１３およびＭＩＦ；ＩＬ－１３およびＰＥＤ２；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３およびＴＡＲＣ；ＩＬ－１３およびＴＧＦ－ベータ；ＩＬ－１アルファおよびＩＬ－１ベータ；ＭＡＧおよびＲＧＭ Ａ；ＮｇＲおよびＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐおよびＲＧＭ Ａ；ＲＧＭ ＡおよびＲＧＭ Ｂ；Ｔｅ３８およびＴＮＦアルファ；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１２；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１２ｐ４０；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１３；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１５；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１７；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１８；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１ベータ；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２３；ＴＮＦアルファおよびＭＩＦ；ＴＮＦアルファおよびＰＥＧ２；ＴＮＦアルファおよびＰＧＥ４；ＴＮＦアルファおよびＶＥＧＦ；およびＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ；ＴＮＦアルファおよびＲＡＮＫリガンド；ＴＮＦアルファおよびＢｌｙｓ；ＴＮＦアルファおよびＧＰ１３０；ＴＮＦアルファおよびＣＤ－２２；およびＴＮＦアルファおよびＣＴＬＡ－４からなる群から選択される。

例えば、第１のエピトープもしくは抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、おとびＣＤ８９からなる群から選択され、第２のエピトープもしくは抗原は、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ－１Ｒ、Ｈｅｒ２、ｃ－Ｍｅｔ（別名ＨＧＦ）、ＨＥＲ３、ＣＥＡ、ＣＤ３３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ６６、ＣＤ３０、ＨＡＳ、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＡＮＧ２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３からなる群から選択される。

例では、本明細書の任意の結合ドメイン（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖまたはＦａｂ）またはＶ１は、ヒトＩＬ－１Ａ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＮ、ＩＬ－６、ＢＬｙｓ、ＡＰＲＩＬ、アクチビンＡ、ＴＮＦアルファ、ａ ＢＭＰ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢまたはＰＧＦからなる群から選択される抗原に特異的に結合することができ（それ自体、単一の可変ドメインの場合、またはＶ２と対合する場合）、任意に、多量体は、ＩＬ－２またはＩＬ２－ペプチドなどのサイトカインアミノ酸配列（例えば、ＴＤのＣ末端）を含み、多量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、ヒト対象のがんを治療または予防するためのものである。例では、該エフェクターまたはタンパク質ドメインは、そのような抗原に結合することができ、任意に、多量体は、ＩＬ－２またはＩＬ２－ペプチドなどのサイトカインアミノ酸配列（例えば、ＴＤのＣ末端）を含み、多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体は、ヒト対象のがんを治療または予防するためのものである。
３０．態様２８で定義されているＰ１の、または、態様２９で定義されているＰ２と対合したＰ１の多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体）、または、複数の該多量体であって、この多量体が、態様１～２４のいずれか１つに記載のものである、多量体。

好ましくは、多量体は、操作されたポリペプチドおよび／またはエフェクタードメインの四量体である。一例では、複数の四量体は、ポリペプチドの単量体、二量体、または三量体との混合物ではない。

一例では、多量体、例えば四量体は、２つの異なるｐＭＨＣに特異的に結合することができる。
３１．態様２７～２９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチドまたは単量体をコードする核酸であって、任意に、核酸が、ポリペプチドを発現するための発現ベクターによって構成される、核酸。

例では、核酸は、ポリペプチドまたは単量体の発現のためのプロモーターに任意に作動可能に接続されているか、またはプロモーターを含むＤＮＡである。別の例では、核酸はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
３２．態様１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体の操作されたポリペプチドもしくは単量体の細胞内発現および／または分泌発現のための、態様３１に記載の核酸またはベクターを含む真核宿主細胞。
３３．細胞内で発現および／または分泌された多量体を産生するためのタンパク質多量体の製造方法における態様３１に記載の核酸またはベクターの使用であって、この方法が、核酸またはベクターを含む真核細胞から多量体を発現および／または分泌させることを含む、核酸またはベクターの使用。
３４．核酸またはベクターを含む真核細胞においてグリコシル化多量体を産生するためのタンパク質多量体の製造方法における、態様３１に記載の核酸またはベクターの使用。

本発明の哺乳動物のグリコシル化は、哺乳動物、例えばヒトの疾患もしくは状態の治療または予防のために、本発明の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体を含むか、またはそれらからなる医薬品を製造するのに有用である。したがって、本発明は、そのような使用方法ならびにこの目的のための本発明の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体を提供する。同様に、本発明による哺乳動物である１つ以上の宿主細胞（またはその細胞株）における細胞内発現および／または分泌された発現は、そのような医薬品を製造するために有用である。特に有用なのは、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞における発現であり、これらは医薬品の製造に一般的に使用されている。

一実施形態では、本発明は、本発明の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体を含む洗剤またはパーソナルヘルスケア製品を含む。一実施形態では、本発明は、本発明の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体を含む食品または飲料を含む。

例では、本発明の多量体、単量体、二量体、三量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体、ポリペプチド、組成物、混合物、使用または方法は、工業用もしくは家庭用であるか、またはそのような使用のための方法で使用される。例えば、これは、農業、石油または石油産業、食品または飲料産業、衣料産業、包装産業、電子産業、コンピューター産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自動車産業、バイオテクノロジー産業、医療産業、ヘルスケア産業、歯科産業、エネルギー産業、消費財産業、製薬産業、鉱業、クリーニング産業、林業、漁業、レジャー産業、リサイクル産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプ製紙産業、繊維産業、衣類産業、皮革またはスエードまたは動物の皮産業、タバコ産業または鉄鋼産業向けであるか、またはそれらで使用されている。
３５．（ｉ）態様２７～２９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチドをコードする真核細胞株と、（ｉｉ）態様１～２４のいずれか１つで定義された多量体、単量体、二量体、三量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体と、を含む、混合物。
３６．細胞株が、細胞の分泌産物を含む培地中にあり、分泌産物が、該多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体を含む、態様３５に記載の混合物。
３７．医療用の、態様１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
３８．下記を産生する方法であって、
（ａ）ＴＣＲ Ｖドメイン多量体（ＴＣＲ Ｖドメイン多量体を産生する方法は、真核細胞で発現されるＴＣＲ Ｖ－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＴＣＲ Ｖ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、この方法は、任意に、複数の該多量体を単離することを含む）、
（ａ）抗体Ｖドメイン多量体（抗体Ｖドメイン多量体を産生する方法は、真核細胞で発現される抗体 Ｖ（例えば、単一可変ドメイン）－ＮＨＲ２－ＴＤまたはＶ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、この方法は、任意に、複数の該多量体を単離することを含む）、
（ｃ）インクレチンペプチド（例えば、ＧＬＰ－１、ＧＩＰまたはインスリン）多量体（インクレチンペプチド多量体を産生する方法は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞で発現されるインクレチンペプチド－ＮＨＲ２ ＴＤまたはインクレチンペプチド－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、この方法は、任意に、複数の該多量体を単離することを含む）、あるいは
（ａ）ペプチドホルモン多量体（ペプチドホルモン多量体を産生する方法は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞で発現されるペプチドホルモン－ＮＨＲ２ ＴＤまたはペプチドホルモン－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／または細胞内発現を含み、この方法は、任意に、複数の該多量体を単離することを含む）を、産生する方法。
３９．ポリペプチドの単量体および／または二量体と対比してより高い収量の四量体を産生するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログ）の使用を提供する。
４０．ポリペプチドの単量体および／または二量体と対比してより高い収量の四量体を産生するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における、操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、操作されたポリペプチドの使用を提供する。
４１．単量体、二量体または三量体との混合物ではない複数の四量体を産生するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログ）の使用。
４２．単量体、二量体または三量体との混合物ではない複数の四量体を産生するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における、操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ＮＨＲ２ ＴＤ、ｐ５３ ＴＤ、ｐ６３ ＴＤまたはｐ７３ ＴＤまたはホモログもしくはオルソログ）をさらに含む、操作されたポリペプチドの使用。
４３．四量体の収量が、単量体および／または二量体の収量の少なくとも１０、２０、３０、４０または５０倍である、態様３９～４２のいずれか１つに記載の使用。
４４．この方法で産生される四量体：産生される単量体および／または二量体の比が、少なくとも９０：１０（例えば、少なくとも９５：５または９８：２、または９９：１）である、態様３９～４３のいずれか１つに記載の使用。
４５．各単量体が、４０、３５、３０、２５または２０ｋＤａ以下のサイズを有する、態様３９～４４のいずれか１つに記載の使用。
４６．各四量体が２００、１６０、１５５または１５０ｋＤａ以下のサイズを有する、態様３９～４５のいずれか１つに記載の使用。
４７．方法が、真核細胞株から四量体を発現することを含む、態様３９～４６のいずれか１つに記載の使用。
４８．ｐＭＨＣ複合体に結合することができる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体であって、下記の
（ｉ）（ＴＣＲ細胞外ドメインと、
（ｉｉ）免疫グロブリン定常ドメインと、
（ｉｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体。
４９．多量体免疫グロブリンであって
（ｉ）免疫グロブリン可変ドメインと、
（ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多量体免疫グロブリン。
５０．可溶性の多量体ポリペプチドを集合化させる方法であって、
（ａ）ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインに融合された、該多量体ポリペプチドの単量体を提供することと、
（ｂ）該単量体の複数のコピーを会合させ、それにより、多量体可溶性ポリペプチドを得ることと、を含む、方法。

本発明は、
（ｉ）図１に示すような単量体、
（ｉｉ）図１に示すようなホモ二量体、
（ｉｉｉ）図１に示すようなホモ四量体、
（ｉｖ）図２に示すような単量体^２、
（ｖ）図２に示すようなホモ二量体^２、
（ｖｉ）図２に示すようなホモ四量体^２、
（ｖｉｉ）図１１ａに示すような単量体、
（ｖｉｉｉ）図１１ａに示すようなホモ二量体、
（ｉｘ）図１１ａに示すようなホモ四量体、
（ｘ）図１２ａに示すような単量体、
（ｘｉ）図１２ａに示すようなホモ二量体、
（ｘｉｉ）図１２ａに示すようなホモ四量体、
（ｘｉｉｉ）図１３ａに示すような単量体^２、
（ｘｉｖ）図１３ａに示すようなホモ二量体^２、
（ｘｖ）図１３ａに示すようなホモ四量体^２、または
（ｘｖｉ）（ｉ）～（ｘｖ）のいずれか１つを含む多量体タンパク質（例えば、Ｑｕａｄ３、４、１２、１３、１４、１５、１６および１７のいずれか１つ）または図２１に示す任意のタンパク質の多量体（リーダーまたはタグを除く）、
（ｘｖｉｉ）（ｘｖｉ）の複数の多量体、または
（ｘｖｉｉｉ）（ｉ）～（ｘｖｉｉ）のいずれか１つと、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と、含む薬学的組成物、をさらに提供する。

本発明はまた、
（ｉ）四価または八価の抗体Ｖ分子、
（ｉｉ）四価または八価の抗体Ｆａｂ分子、
（ｉｉｉ）四価または八価の抗体ｄＡｂ分子、
（ｉｖ）四価または八価の抗体ｓｃＦｖ分子、
（ｖ）四価または八価の抗体ＴＣＲ Ｖ分子、または
（ｖｉ）四価または八価の抗体ｓｃＦｖ分子、を提供し、
この分子は、
（ａ）水溶液（例えば、本明細書に開示される溶液または細胞培養培地）に可溶であり、および／または、
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内で発現および／または細胞外で発現することができる。

本発明は、そのＮ末端および／またはＣ末端で、ＮＨＲ２配列ではない、アミノ酸配列（例えば、ペプチド、タンパク質ドメインまたはタンパク質）に融合されたＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）のクレーム多量体（例えば、四量体）を提供する。例えば、配列は、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣαまたはＣβ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＦＮ）、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂまたはＦａｂ）および抗体ドメイン（例えば、ＶまたはＣドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＬ、Ｖκ、Ｖλ、ＣＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、ＣκまたはＣλドメイン）から選択される。任意に、多量体は、
ａ）水溶液（例えば、本明細書に開示される溶液または細胞培養培地）に可溶であり、および／または、
ｂ）ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内で発現および／または細胞外で発現することができる、分子である。

本発明は以下を提供する：－
（ｉ）細胞、例えば真核細胞、例えば哺乳動物、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞からのポリペプチドの多量体の可溶性発現のためのポリペプチドの製造のためのＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）の使用。
（ｉｉ）細胞、例えば真核細胞、例えば哺乳動物、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞中のポリペプチドの多量体の細胞内発現のためのポリペプチドの製造のためのＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）の使用。
（ｉｉｉ）細胞内発現産物を含む細胞であって、この産物が、Ｎ末端および／またはＣ末端で、ＮＨＲ２配列ではない、アミノ酸配列（例えば、ペプチド、タンパク質ドメインまたはタンパク質）に融合されたＮＨＲ２またはｐ５３（または本明細書に開示される別のＴＤ）を含むポリペプチドの多量体を含む、細胞。
（ｉｖ）宿主細胞から細胞内発現および／または可溶性発現される多量体の製造において、ペプチド、タンパク質ドメイン、ポリペプチドまたはタンパク質を四量体化するためのプロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）四量体化ドメインとしてのＮＨＲ２の使用。

任意に、アミノ酸は、ヒトペプチド、タンパク質ドメインまたはタンパク質、例えば、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣαまたはＣβ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２およびＩＦＮ）、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂまたはＦａｂ）、または抗体ドメイン（例えば、ＶまたはＣドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＬ、Ｖκ、Ｖλ、ＣＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、ＣκまたはＣλドメイン）のアミノ酸配列である。

任意に、このポリペプチドまたは各ポリペプチドは、Ｑｕａｄ１～４６からなる群から選択されるポリペプチド（すなわち、図２１に示されるが、リーダーまたはタグ配列を除くポリペプチド）を含む。任意に、本発明は、例えば、医学的または診断的使用のため、例えば、ヒトまたは動物（例えば、ヒト）の疾患もしくは状態を治療または予防するための、そのようなＱｕａｄ１～４６からなる群から選択されるポリペプチド（すなわち、そのようなポリペプチドの２、３、４、５、６、７または８コピー）の多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体、好ましくは、四量体または八量体）を提供する。

任意に、このポリペプチドまたは各ポリペプチドは、配列番号１３～５０からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド（任意のリーダーまたはタグ配列を除く）を含む。任意に、このポリペプチドまたは各ポリペプチドは、配列番号８３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（任意のリーダーまたはタグ配列を除く）を含む。任意に、本発明は、例えば、医学的または診断的使用のため、例えば、ヒトまたは動物（例えば、ヒト）の疾患もしくは状態を治療または予防するための、そのようなポリペプチドの多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体、好ましくは、四量体または八量体）を提供する。

例では、ＴＤは、配列番号１～９のいずれか１つによって構成されるＴＤである。例では、ＴＤは、配列番号１０または１２６を含むＴＤである。例では、ＴＤは、配列番号１２４または１２５によってコード化されている。例では、各ＴＤのアミノ酸配列は、配列番号１０または１２６であるか、または配列番号１０または１２６と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６ｍ、９７、９８または９９％同一である。

例では、ＴＤは、配列番号１２０または１２３を含むＴＤである。例では、ＴＤは、配列番号１１６または１１９によってコード化されている。例では、各ＴＤのアミノ酸配列は、配列番号１２０または１２３であるか、または配列番号１２０または１２３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６ｍ、９７、９８または９９％同一である。

任意に、操作されたポリペプチドまたは単量体によって構成されるドメインまたはペプチドは、配列番号５１～８２から選択されるアミノ酸を含む。

高純度四量体
本明細書に例示されるように、１つの構成における本発明は、四量体化ドメイン（ＴＤ）、例えば、ｐ５３四量体化ドメイン（ｐ５３ ＴＤ）が、二量体および単量体などの低次構造の産生よりもエフェクタードメインの四量体を優先的に産生するために使用され得るという驚くべき認識に基づく。これは、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＣｏｓ細胞株などの哺乳動物発現細胞株からの望ましい収量である、四量体の分泌に特に有用である。本発明はまた、サイズが２００、１６０、１５５または１５０ｋＤａ以下の四量体の産生に特に有用である。

したがって、本発明は以下の概念を提供する：－
概念
１．ポリペプチドの単量体および／または二量体と対比してより高い収量の四量体を産生するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における、四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ｐ５３ 四量体化ドメイン（ｐ５３ ＴＤ）もしくはＮＨＲ２ ＴＤ）またはそれらのホモログもしくはオルソログの使用。

単量体および二量体は、それぞれ、ＴＤ、ホモログまたはオルソログの１つまたは２つのコピーを含む。

例では、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、ヒトドメインである。

本明細書において、ＴＤは、ヒトＴＤまたはホモログであり、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に開示されるｐ５３ ＴＤ配列のいずれかから選択されるＴＤであり、例えば、ｐ５３ ＴＤは、表１３に開示されるＴＤである。例では、ホモログは、非ヒト動物種のｐ５３ＴＤ、例えば、マウス、ラット、ウマ、ネコまたはイヌのｐ５３ＴＤである。図３２を参照していただくと、これは、異なる種のｐ５３ ＴＤ間の高レベルの保存を示しており、ヒトｐ５３ ＴＤの代替としての非ヒトｐ５３ ＴＤの使用を支持している。例では、ホモログは、非ヒト哺乳動物種のｐ５３ＴＤである。例では、ホモログは、最大１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸変化を除いて、ヒトｐ５３ ＴＤと同一である。

例では、四量体の収量は単量体の収量よりも高く、例では、四量体の収量は二量体の収量よりも高く、例では、四量体の収量は三量体の収量よりも高く、例では、四量体の収量は、単量体および二量体の収量よりも高く、例では、四量体の収量は、単量体および三量体の収量よりも高く、例では、四量体の収量は、単量体、二量体、および三量体の収量よりも高い。

例えば、ＴＤは、ｐ５３アイソフォーム１のＴＤである。例では、ＴＤは、ヒトｐ５３（例えば、アイソフォーム１）の位置３２５～３５６（または３１９～３６０、または３２１～３５９）と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。任意に、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、配列番号１０、１２６、１１または１２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。例えば、配列は、該選択された配列と同一である。任意に、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、配列番号１２０、１２１、１２２または１２３と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。例えば、配列は、該選択された配列と同一である。
２．同一のＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログの第１、第２、第３および第４のコピーが使用される、概念１に記載の使用。
３．ＴＤが、ＮＨＲ２、ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３四量体化ドメインである、概念１～２のいずれか１つに記載の使用。
例えば、各ＴＤは、ｐ５３ ＴＤである。例では、ＴＤは、ｐ５３ ＴＤのオルソログまたはホモログ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤである。
４．四量体の収量が、単量体および／または二量体の収量の少なくとも１０倍である、概念１～３のいずれか１つに記載の使用。

任意に、収量は、単量体および／または二量体の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍の収量である。任意に、産生される四量体：単量体および／または二量体の比は、少なくとも９０：１０、例えば、少なくとも９５：５、または９６：４、または９７：３、または９８：２または９９：１である。任意に、四量体のみが産生される。

一実施形態では、各単量体、二量体または四量体によって構成される各ドメインは、ヒトドメインであり、任意に、単量体、二量体または四量体は、非ヒトアミノ酸配列またはリンカーを含まない。
５．本方法で産生される四量体：産生される単量体および／または二量体の比が、少なくとも９０：１０（すなわち、単量体の量の９倍、二量体の量の９倍、または単量体と二量体の組み合わせの量の９倍）である、概念１～４のいずれか１つに記載の使用。
６．収量または比が、四量体製造方法の産物のサンプルを得て、四量体、単量体および二量体を分解するためにサンプルに対してタンパク質分離技術を使用し、および四量体の量を単量体と二量体との量と比較することによって決定可能であるか、または決定される、概念４または５に記載の使用。

四量体、単量体、二量体および三量体の量は、例えば、本明細書に記載のゲル、例えば、未変性ゲル、すなわち、ＳＤＳの非存在下などの変性条件下ではないゲルのウエスタンブロット分析を使用して決定することができる。
７．収量または比が、
（ａ）四量体製造法の産物のサンプルを得ることと、
（ｂ）非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施して、サンプルを該四量体に対応するバンドおよび該単量体に対応するバンドおよび／または該二量体に対応するバンドに分解することと、
（ｃ）四量体バンドを単量体および／または二量体バンドと比較して、例えば、相対的なバンド強度および／またはバンドサイズを比較することによって、該終了または比を決定することと、によって決定可能であるか、または決定される、概念４または５に記載の使用。
８．収量または比が、
（ｄ）四量体製造法の産物のサンプルを得ること、
（ｅ）非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実行して、サンプルを該四量体に対応するバンドに分解させることであって、例えば、ゲルが非変性条件下（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の非存在下）である、非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実行して、サンプルを該四量体に対応するバンドに分解させること、
（ｆ）該単量体に対応するバンドがないこと、および／または該二量体に対応するバンドがないことを決定すること、によって決定可能であるか、または決定される、概念４または５に記載の使用。
９．
（ｇ）四量体製造法の産物の第２のサンプルを得ることと、
（ｈ）還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実行して、第２のサンプルを該単量体に対応するバンドおよび／または該二量体に対応するバンドに分解させることであって、例えば、ゲルが非変性条件下（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の非存在下）である、還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実行して、第２のサンプルを該単量体に対応するバンドおよび／または該二量体に対応するバンドに分解させることと、
（ｉ）工程（ｈ）によって生成されたゲルを、工程（ｂ）または（ｅ）のゲルと比較して、工程（ｂ）のゲルにおいて単量体および／または二量体バンドの位置を決定するか、または工程（ｅ）のゲルにおいてそのようなゲルがどこにあるか予想されるかを決定することと、を含む、概念７または８に記載の使用。
１０．各単量体が、４０ｋＤａ以下のサイズを有する、概念１～９のいずれか１つに記載の使用。

例えば、単量体は、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０ｋＤａ以下のサイズを有する。
１１．各単量体が、１５０ｋＤａ以下のサイズを有する、概念１～１０のいずれか１つに記載の使用。

例えば、単量体は、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０ｋＤａ以下のサイズを有する。
１２．方法が、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株から四量体を発現することを含む、概念１～１１のいずれか１つに記載の使用。

例えば、細胞株は、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株である。別の方法では、細胞株は、酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ、例えば、Ｐ ｐａｓｔｏｒｉｓ）または細菌細胞株である。
１３．方法が、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株から四量体を分泌することを含む、概念１～１２のいずれか１つに記載の使用。

したがって、有利な例では、四量体の使用は、哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株）または真核細胞株からの発現のためのものである。これは、本発明の産物、例えば四量体の大規模製造に有用である。

例えば、細胞株は、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株である。代替的に、細胞株は、酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ、例えば、Ｐ ｐａｓｔｏｒｉｓ）または細菌細胞株である。
１４．各ポリペプチドまたは単量体が、該ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、および１つ以上の抗体ドメイン、例えば、抗原結合部位を形成する１つ以上の抗体ドメインなどの１つ以上のタンパク質エフェクタードメインを含む、概念１～１３のいずれか１つに記載の使用。
１５．ポリペプチドが、
（ｉ）抗原に特異的に結合することができる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合することができるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位、のうちの１つ以上を含む、概念１４に記載の使用。
１６．各ポリペプチドまたは単量体が、該ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、ならびに１つ以上のインクレチン、インスリン、ＧＬＰ－１またはエキセンディン－４ドメインを含む、概念１～１５のいずれか１つに記載の使用。
１７．各ポリペプチドまたは単量体が、該ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、ならびに第１および第２の抗原結合部位を含む、概念１～１６のいずれか１つに記載の使用。
１８．各結合部位が、
（ｉ）抗原に特異的に結合することができる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合することができるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位、によって提供される、概念１７に記載の使用。
１９．各結合部位が、抗体単一可変ドメインによって提供される、概念１８に記載の使用。
２０．ＴＤ、ホモログまたはオルソログが、該さらなるドメインに直接融合される、概念１４～１８のいずれか１つに記載の使用。
２１．各単量体またはポリペプチドが、直接的に、またはペプチドリンカーを介して該さらなるドメインのＣ末端に融合されたＴＤ、ホモログまたはオルソログを含む、概念２０に記載の使用。
２２．ポリペプチドの四量体であって、各ポリペプチドが、
（ｉ）四量体化ドメイン（ＴＤ）（例えば、ｐ５３ ＴＤまたはＮＨＲ２ ＴＤ）またはそのホモログもしくはオルソログと、
（ｉｉ）１つ以上のタンパク質エフェクタードメインと、
（ｉｉｉ）任意に、（ｉ）を（ｉｉ）に連結するリンカー（例えば、（ｉｉ）のＣ末端を（ｉ）のＮ末端に連結する）と、を含み、
任意に、各四量体が、１５０または２００ｋＤａ以下のサイズを有する、四量体。

例えば、単量体は、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０ｋＤａ以下のサイズを有する。例では、任意の多量体、二量体、三量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体、または２０量体は、少なくとも６０または８０ｋＤａのサイズを有し、これは、例えば、多量体、二量体、三量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体、または２０量体で投与された（例えば、対象における疾患もしくは状態を治療または予防するために）ヒトまたは動物の対象における半減期を延ばすために有用であり得る。これらの範囲のサイズは、腎濾過サイズを超える場合がある。

別の方法では、本発明は、四量体の代わりに、単量体、二量体、八量体、十二量体、十六量体、または２０量体を提供する。
２３．各ポリペプチドが、
（ｉ）抗原に特異的に結合することができる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合することができるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位、のうちの１つ以上を含む、概念２２に記載の四量体。
２４．各ポリペプチドが、該ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、ならびに１つ以上のインクレチン、インスリン、ＧＬＰ－１またはエキセンディン－４ドメインを含む、概念２２または２３に記載の四量体。
２５．各ポリペプチドが、該ＴＤ、ホモログまたはオルソログ、ならびに第１および第２の抗原結合部位を含む、概念２２または２３に記載の四量体。
２６．各結合部位が、
（ｉ）抗原に特異的に結合することができる抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂまたはＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｙ（商標））、
（ｉｉ）抗原に結合できるｓｃＦｖまたはｐＭＨＣに結合できるｓｃＴＣＲ、
（ｉｉｉ）抗原に結合することができるＦａｂ、または
（ｉｖ）ＴＣＲ可変ドメインまたはｐＭＨＣ結合部位、によって提供される、概念２５に記載の四量体。
２７．各結合部位が、抗体単一可変ドメインによって提供される、概念２６に記載の四量体。
２８．ＴＤ、ホモログまたはオルソログが、該エフェクタードメインに直接融合される、概念２２～２７のいずれか１つに記載の四量体。
２９．各ポリペプチドが、直接的に、またはペプチドリンカーを介して該エフェクタードメインのＣ末端に融合されたＴＤ、ホモログまたはオルソログを含む、概念２２～２７のいずれか１つに記載の四量体。

実施形態では、各ポリペプチドは、２つのみの（すなわち、第１および第２のみの、しかしながら第３ではない）エフェクタードメイン、または２つのみのｄＡｂ、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、Ｆａｂまたは抗原結合部位を含む。
３０．概念２２～２９のいずれか１つに記載の四量体と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む薬学的組成物。

任意に、組成物は、無菌の医療用容器または器具、例えば、注射器、バイアル、吸入器、または注入器具によって構成される。
３１．概念２２～２９のいずれか１つに記載の四量体を含む化粧品、食品、飲料、洗浄用製品、洗剤。
３２．概念１～３１のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする細胞株（例えば、哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞株）と、概念１～３１のいずれか１つに定義された四量体と、を含む混合物。

任意に、混合物は滅菌容器によって構成される。
３３．細胞株が、細胞の分泌産物を含む培地中にあり、分泌産物が、該四量体を含む、概念３２に記載の混合物。
３４．分泌産物が、概念１～３１のいずれか１つで定義されるような単量体および／または二量体を含まない、概念３３に記載の混合物。
３５．分泌産物が、単量体および／または二量体の量の少なくとも１０倍の量の該四量体を含む、概念３３に記載の混合物。
３６．分泌産物が、少なくとも９０：１０の四量体：単量体および／または二量体の比で該四量体を含む、概念３３に記載の混合物。
３７．タンパク質エフェクタードメイン（例えば、抗体可変ドメインまたは結合部位）の四量体の収量を向上させるための方法であって、この方法が、細胞株（例えば、哺乳動物細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＣｏｓ細胞株）からポリペプチドの四量体を発現させることであって、このポリペプチドが、概念１～３６のいずれか１つで定義されるものであり、１つ以上のエフェクタードメインを含む、発現させることと、任意に、該発現された四量体を単離することと、を含む方法。

ホモログ、オルソログまたは同等物は、多量体化または四量体化機能を有する。

ホモログ：共通の祖先ＤＮＡまたはタンパク質配列からの子孫による第２の遺伝子、ヌクレオチドまたはタンパク質配列に関連する遺伝子、ヌクレオチドまたはタンパク質配列。ホモログという用語は、イベントによって分離された遺伝子間の関係、または遺伝子複製のイベントによって分離された遺伝子間の関係に適用され得る。

オルソログ：オルソログは、種分化によって共通の祖先の遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質の配列から進化した、異なる種の遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質の配列である。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。

例では、ＴＤ、オルソログまたはホモログは、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のいずれか１つのＴＤである。例では、オルソログまたはホモログは、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のいずれか１つのＴＤのオルソログまたはホモログである。一実施形態では、ｐ５３四量体化ドメイン（ｐ５３－ＴＤ）またはそのホモログもしくはオルソログの使用の代わりに、本明細書の本発明のすべての態様は、代わりに、表２に列挙されたタンパク質１～１１９のＴＤ、またはそのホモログもしくはオルソログのポリペプチド、単量体、二量体、三量体または四量体の使用または包含に関連するように読み取ることができる。ＴＤは、ＮＨＲ２（例えば、ヒトＮＨＲ２）ＴＤまたはそのオルソログもしくはホモログであり得る。ＴＤは、ｐ６３（例えば、ヒトｐ６３）ＴＤまたはそのオルソログもしくはホモログであり得る。ＴＤは、ｐ７３（例えば、ヒトｐ７３）ＴＤまたはそのオルソログもしくはホモログであり得る。これには、次のような１つ以上の利点がある：－
－哺乳動物または他の真核細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＣｏｓなどの本明細書に開示される哺乳動物細胞からの四量体の分泌、
－分泌された四量体の単量体に対比する収量の向上、
－分泌された四量体の二量体に対比する収量の向上、
－分泌された四量体の三量体に対比する収量の向上、
－分泌された四量体の組み合わされた単量体と二量体に対比する収量の向上、
－分泌された四量体の組み合わされた二量体と三量体に対比する収量の向上、
－抗原結合部位を含む四量体における抗原結合の親和性または結合活性の向上、
－向上された四量体の産生および／または発現であって、この四量体のサイズは、２００以下または１６０以下または１５０ｋＤａ以下である。
例では、各ポリペプチドまたは単量体は、ＲｅｏＰｒｏ（商標）、アブシキシマブ、リツキサン（商標）、リツキシマブ、ゼナパックス（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）、エファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）、トシリズマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、ラニビズマブ、Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａ（商標）、セルトリズマブ、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキヌマブ、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏｌｉａ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘ（商標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）、イプリズマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズムマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アド－トラスツズマブ、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体のＶＨ、ＶＬまたはＶＨ／ＶＬ結合部位を含む。別の方法では、（例えば、ヒトのがんを治療または予防するために）、各ポリペプチドまたは単量体は、イピリムマブ（またはＹＥＲＶＯＹ（商標））、トレメリムマブ、ニボルマブ（またはＯＰＤＩＶＯ（商標））、ペムブロリズマブ（またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標））、ピジリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体の１つ以上のＶＨ、ＶＬまたＶＨ／ＶＬ結合部位を含む。任意に、多量体のポリペプチドの結合部位は、抗体の結合部位のＶＨおよび抗体のＣＨ１（すなわち、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＨ１およびＳＡＭ）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に、例えば、ＣＬが抗体のＣＬである、ＶＬ－ＣＬ）を含むさらなるポリペプチドと対合され得る。

例では、四量体は、イピリムマブ（またはＹＥＲＶＯＹ（商標））、トレメリムマブ、ニボルマブ（またはＯＰＤＩＶＯ（商標））、ペムブロリズマブ（またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標））、ピジリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブからなる群から選択される第１の抗体の抗原結合部位の４つのコピーを含み、任意に、該群から選択される第２の抗体の抗原結合部位の４つのコピーを含み、第１および第２の抗体は、異なる。例えば、第１の抗体はイピリムマブ（またはＹＥＲＶＯＹ（商標））であり、任意に、第２の抗体はニボルマブ（またはＯＰＤＩＶＯ（商標））またはペムブロリズマブ（またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標））である。これは、ヒトのがんを治療または予防するのに有用である。

例では、四量体は、Ａｖａｓｔｉｎの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、Ｈｕｍｉｒａの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、Ｅｒｂｉｔｕｘの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）の抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、サリルマブの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、デュピルマブの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、アリロクマブまたはエボロクマブの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、Ｒｅｍｉｃａｄｅの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、Ｒｅｍｉｃａｄｅの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓの抗原結合部位の４つのコピーを含む。例では、四量体は、Ｅｙｌｅａ（商標）の抗原結合部位の４つのコピーを含む。そのような四量体は、がんを治療または予防するためにヒトに投与するのに有用である。そのような四量体は、眼の状態（例えば、結合部位がＡｖａｓｔｉｎ、ＬｕｃｅｎｔｉｓまたはＥｙｌｅａ部位である場合、例えば、ウェット型ＡＭＤまたは糖尿病性網膜症）を治療または予防するためにヒトに投与するのに有用である。そのような四量体は、血管新生を治療または予防するためにヒトに投与するのに有用である。

例では、四量体は、インスリンの４つのコピーを含む。例では、四量体は、ＧＬＰ－１の４つのコピーを含む。例では、四量体は、ＧＩＰの４つのコピーを含む。例では、四量体は、エキセンディン－４の４つのコピーを含む。例では、四量体は、インスリンの４つのコピーおよびＧＬＰ－１の４つのコピーを含む。例では、四量体は、インスリンの４つのコピーおよびＧＩＰの４つのコピーを含む。例では、四量体は、インスリンの４つのコピーおよびエキセンディン－４の４つのコピーを含む。例では、四量体は、ＧＬＰ－１の４つのコピーおよびエキセンディン－４の４つのコピーを含む。そのような四量体は、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）または肥満症を治療または予防するためにヒトに投与するのに有用である。

例示的な抗原
ポリペプチド、多量体は、１つ以上の抗原またはエピトープに結合することができ、または本明細書の各結合部位（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ結合部位）は、抗原またはエピトープに結合することができる。例では、本明細書の（または各）抗原は、以下のリストから選択される。例では、本明細書の（または各）エピトープは、以下のリストから選択される抗原のエピトープである。

アクチビンＩＩ型受容体、アクチビンＩＩＢ型受容体、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ１Ａ、ＡＤＡＭ１Ｂ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２４Ｐ、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ３Ａ、ＡＤＡＭ３Ｂ、ＡＤＡＭ５、ＡＤＡＭ６、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＫＴ、ＡＬＫ、アルファ－４インテグリン、アルファシヌクレイン、炭疽菌防御抗原、ＢＡＣＥ１、ＢＣＭＡ、ベータアミロイド、ＢＲＡＦ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１２６、ＣＤ１５１、ＣＤ１６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＤ２７、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＣＤ２７６、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３００Ａ、ＣＤ３００Ｃ、ＣＤ３００Ｅ、ＣＤ３００ＬＢ、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５９、ＣＤ６、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤＫ４／６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＧＲＰ受容体、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣ１Ｂ、ＣＬＥＣ４Ａ、ＣＬＥＣ５Ａ、ＣＬＥＣ７Ａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素、ｃＭＥＴ、補体Ｃ５因子、補体因子Ｄ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＤＡ、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＭＲ１、ＥＮＴＰＤ１、ＥｐＣＡＭ、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、ＦＡＰ、ＦＡＳ、ＦＣＡＲ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＥＲ２、ＴＦＲ２、４－１ＢＢ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＣＲＬ１、ＦＣＲＬ３、ＦＣＲＬ４、ＦＣＲＬ６、ＦＧＲＦ１／２／３、ＦＬＴ３、ＧＡＬ、ＧＥＭ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＧＰ ＩＩｂ ＩＩＩａ、ｇｐＮＭＢ、ＴＩＭ３、ＨＤＡＣ１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ３、ＨＦＥ、ＨＨＬＡ２、ヒストンＨ１モジュレータ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＭＧＢ１、ＨＭＭＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤＯ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ－１ ベータ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－２、ＩＬ－２２Ｒ、ＩＬ－２３、ＩＬ－２３ａ、ＩＬ－２４、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－３４、ＩＬ－８、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｄ、ＩＬ２２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ３６Ｇ、ＩＬ４、ＩＬ４ａ、ＩＬ５、ＩＬ６、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＨＢＢ、インターフェロンＩ型受容体、ＩＮＦ－ａ－２ａ／２ｂ、ＩＮＦ－ｂ－１ａ／１ｂ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＫＩＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＴ、ＫＬＲＣ１、ＫＬＲＣ２、ＫＬＲＦ１、ＫＬＲＧ１、ＫＬＲＫ１、ＫＲＡＳ、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＬＡＩＲ２、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＬＲＡ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＡ３、ＬＩＬＲＡ４、ＬＩＬＲＡ５、ＬＩＬＲＡ６、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＩＬＲＢ５、ＬＩＬＲＰ１、ＬＩＬＲＰ２、ＬＴＡ、ＬＴＢＲ、ＬＹ９、ＭａｄＣａｍ、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＲＣＯ、ＭＥＫ－１／２、ＭＩＡ３、ＭＩＣ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳ４Ａ２、ｍＴＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣＩＮ－１、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＮＧＦ、ＮＧＦＲ、ＮＴ５Ｅ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ｐ５３、ＰＡＲＰ、ＰＣＳＫ９、ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＣＤ６、ＰＤＧＦ受容体アルファ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩＬＲＡ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＮ６、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ３、ＲＡＮＫＬ、呼吸器合胞体ウイルスタンパク質、ＳＩＧＬＥＣ１０、ＳＩＧＬＥＣ１２、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＩＧＬＥＣ５、ＳＩＧＬＥＣ６、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＲＰＢ１、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＡＭＦ８、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＩＮＧ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＲＭ１、Ｔａｕ、ＴＤＰ４３、ＴｆＲ１、ＴＧＦ－ｂ、ＴＧＭ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ－４、ＴＬＲ０３、ＴＭＥＭ３０ａ、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、膜貫通型糖タンパク質ＮＭＢモジュレータ、ＴＲＥＭＬ１、ＴＲＥＭＬ２、ＴＳＬＰ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－２Ｒ、ＶＥＧＦ１、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＬ、ＶＥＧＦＲ、ウィルスエンベロープ糖タンパク質、ウイルスタンパク質ヘマグルチニン、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ４、ＶＳＴＭ１、ＶＴＣＮ１、およびＷＥＥ－１。例では、本明細書の抗原は、ＰＣＳＫ９、例えば、ヒトＰＣＳＫ９であり、任意に、多量体は抗ＰＣＳＫ９結合部位（例えば、ｄＡｂ）の４、８、１２または１６このコピーを有する。

例示的な抗原は、ヘビ毒の毒素などの毒素であり、例えば、本発明の多量体がヒトまたは動物の対象に投与され（全身またはＩＶ注射によるなど）、多量体によって構成される抗原結合部位が、対象の毒素に特異的に結合する。好ましくは、多量体の各結合部位またはドメインは、ｄＡｂ（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標））である。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｊｕｌ ２２；８（７）：ｅ６９４９５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９４９５；「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ α－ｃｏｂｒａｔｏｘｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｌａｍａ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＶＨＨｓ）ａｎｄ ａ ＶＨＨ－Ｆｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されているように、Ｃ３３単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されているように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ１５単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ７単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ１３単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ１９単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ３４単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ３１単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ２０単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ２単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ２９単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ４２単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。例えば、本発明の多量体の各ヘビ毒の毒素抗原結合部位は、Ｒｉｃｈａｒｄらの図４に開示されるようなＣ４３単一ドメインＶＨであり、そのアミノ酸は、該図４に開示されるように、結合部位またはドメインまたはｄＡｂまたはＮａｎｏｂｏｄｙまたはＶＨＨまたはＶＨとして本発明において可能な使用のために、本発明でその全体が本明細書に組み込まれている。ヘビ毒の毒素の例は、３ＦＴｘ、デンドロトキシン、またはＰＬＡ２毒素である。任意に、毒素は、例えば、コブラからのアルファ神経毒である。

毒素の別の例は、血中毒素であり、例えば、本発明の多量体がヒトまたは動物の対象に投与され（全身的にまたはＩＶ注射によるなど）、多量体によって構成される抗原結合部位が、対象の血液中の毒素に特異的に結合する。これらの例は、毒素を封鎖するため、または対象に対する毒素の毒作用を低減するため、または毒素の排泄または代謝を促進するために有用である。

例では、抗原はウイルス抗原であり、それぞれがキャプシドタンパク質または炭水化物（例えば、糖）である。例では、本発明の多量体は、ウイルスまたはウイルス抗原、例えば、ウイルスが多量体によって結合される表面抗原を含む、表１９から選択されるウイルスに結合するか、または、本発明の多量体は、例えば、表２０に開示される抗原から選択される細胞またはウイルス抗原に結合する。ウイルスへの結合は、例えば、ウイルスの宿主細胞への付着またはウイルスによる細胞の感染を減少もしくは阻害し得る。例えば、本発明は、ヒトまたは動物または植物の対象（例えば、ヒト対象）におけるウイルスまたは細胞感染を治療または予防する（例えば、リスクを低減する）方法を提供し、この方法は、本発明の多量体を対象に投与することを含み、ここでは多量体がウイルスの表面抗原に結合し、それによってウイルスが宿主細胞に付着するのを阻害し、ウイルスの夜宿主細胞の感染を阻害し、および／または対象においてウイルスを封鎖する（例えば、対象の体循環または組織からのクリアランスのために結合したウイルスをマークするため）。別の方法では、本発明は、ヒトまたは動物または植物の対象（例えば、ヒト対象）における細菌または古細菌の細胞感染を治療または予防する（例えば、リスクを低減する）方法を提供し、この方法は、本発明の多量体を対象に投与することを含み、ここでは多量体が細胞の表面抗原に結合し、それによって細胞による対象の感染を阻害し、および／または対象において細胞を封鎖する（例えば、対象の体循環または組織からのクリアランスのために結合した細胞をマークするため）。別の方法では、例えば、本発明は、ヒトまたは動物対象（例えば、ヒト対象）におけるがんを治療または予防する（例えば、リスクを低減する）方法を提供し、この方法は、本発明の多量体を対象に投与することを含み、多量体が腫瘍細胞の表面抗原に結合し、それによって対象の細胞を封鎖する（例えば、結合した細胞を全身循環または対象の組織からのクリアランスのためにマークするために）か、または免疫系または対象に施された別の療法（例えば、免疫チェックポイント療法またはＣＡＲ－Ｔ療法）による標的化のために細胞をマークする。

例では、抗原は、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ２、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＦ、ＴＧＦ－、ＴＮＦ－、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２およびＶＣＡＭ－１から選択される。これらの抗原のうちの１つ以上を標的化することは、対象の敗血症を治療または予防するのに有用であり得る。したがって、例では、本発明の多量体は、１つ以上の抗原結合部位（例えば、それぞれがｄＡｂによって提供される）を含み、多量体は、ヒトまたは動物対象における敗血症を治療または予防する方法で使用するためのものであり、多量体は、対象に投与される（例えば、全身的にまたは静脈内に）。任意に、多量体は、抗原結合に関して単一特異性、二重特異性、三重特異性、または四特異性である。例えば、多量体は、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１Ｒ２、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＦ、ＴＧＦ－、ＴＮＦ－、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２およびＶＣＡＭ－１から選択される抗原に対して、二重特異性、三重特異性または四重特異性である。そのような多量体および薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供される。ヒトまたは動物の対象における敗血症を治療または予防する方法も提供され、この方法は、例えば、多量体を、対象に、例えば全身的または静脈内に投与することを含む。

疾患および状態
本発明のポリペプチド単量体または多量体（例えば、二量体、三量体、四量体または八量体）は、対象の疾患または状態を治療または予防するために、ヒトまたは動物の対象に投与するための方法で使用することができる。

任意に、疾患または状態は下記から選択される。
（ａ）神経変性疾患または状態、
（ｂ）脳疾患または状態、
（ｃ）ＣＮＳ疾患または状態、
（ｄ）記憶喪失または障害、
（ｅ）心臓もしくは心血管疾患または状態、例えば、心臓発作、脳卒中、心房細動、
（ｆ）肝臓疾患または状態；
（ｇ）腎臓疾患または状態、例えば、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、
（ｈ）膵臓疾患または状態、
（ｉ）肺疾患または状態、例えば、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤ、
（ｊ）胃腸疾患または状態；
（ｋ）喉もしくは口腔の疾患または状態、
（ｌ）眼疾患または状態、
（ｍ）生殖器の疾患または状態、例えば、膣、陰唇、陰茎もしくは陰嚢の疾患または状態、
（ｎ）性感染症または状態、例えば、淋病、ＨＩＶ感染症、梅毒またはクラミジア感染症、
（ｏ）耳の疾患または状態、
（ｐ）皮膚の疾患または状態、
（ｑ）心臓疾患または状態、
（ｒ）鼻の疾患または状態、
（ｓ）血液学的疾患または状態、例えば貧血、例えば慢性疾患またはがんの貧血、
（ｔ）ウイルス感染、
（ｕ）病原性細菌感染、
（ｖ）がん、
（ｗ）自己免疫疾患または状態、例えば、ＳＬＥ、
（ｘ）炎症性疾患または状態、例えば、関節リウマチ、乾癬、湿疹、喘息、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病またはＩＢＤ、
（ｙ）自閉症、
（ｚ）ＡＤＨＤ、
（ａａ）双極性障害、
（ｂｂ）ＡＬＳ［筋萎縮性側索硬化症］、
（ｃｃ）変形性関節症、
（ｄｄ）先天性障害もしくは発達障害または状態、
（ｅｅ）流産、
（ｆｆ）血液凝固状態、
（ｇｇ）気管支炎、
（ｈｈ）ドライ型またはウェット型ＡＭＤ、
（ｉｉ）血管新生（例えば、腫瘍の、または眼の）、
（ｊｊ）感冒、
（ｋｋ）てんかん、
（ｌｌ）線維症、例えば、肝臓または肺線維症、
（ｍｍ）真菌性疾患または状態、例えば、鵞口瘡、
（ｎｎ）代謝性疾患または状態、例えば、肥満症、食欲不振、糖尿病、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病。
（ｏｏ）潰瘍、例えば、胃潰瘍または皮膚潰瘍、
（ｐｐ）乾燥肌、
（ｑｑ）シェーグレン症候群、
（ｒｒ）サイトカインストーム、
（ｓｓ）難聴、聴覚損失または聴覚障害、
（ｔｔ）低代謝または高代謝（すなわち、対象の体重、性別、年齢についての平均よりも遅いか、または速い）。
（ｕｕ）受胎障害、例えば、不妊症または低受精率、
（ｖｖ）黄疸、
（ｗｗ）皮膚の発疹、
（ｘｘ）川崎病、
（ｙｙ）ライム病、
（ｚｚ）アレルギー、例えば、木の実、花粉、チリダニ、ネコもしくはイヌの毛皮または皮屑アレルギー、
（ａａａ）マラリア、腸チフス、結核またはコレラ、
（ｂｂｂ）うつ病、
（ｃｃｃ）精神遅滞、
（ｄｄｄ）小頭症、
（ｅｅｅ）栄養失調、
（ｆｆｆ）結膜炎、
（ｇｇｇ）肺炎、
（ｈｈｈ）肺塞栓症、
（ｉｉｉ）肺高血圧症、
（ｊｊｊ）骨障害、
（ｋｋｋ）敗血症または敗血症性ショック、
（ｌｌｌ）副鼻腔炎、
（ｍｍｍ）ストレス（例えば、職業性ストレス）、
（ｎｎｎ）サラセミア、貧血、ヴォン・ヴィレブランド病、または血友病、
（ｏｏｏ）帯状疱疹または口唇ヘルペス、
（ｐｐｐ）月経、
（ｑｑｑ）精子数減少。

治療または予防するための神経変性もしくはＣＮＳ神経系の疾患または状態
例では、神経変性もしくはＣＮＳの疾患または状態は、アルツハイマー病、生殖精神病、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン症候群、ハンチントン舞踏病、マチャド・ジョセフ病、筋委縮性側策硬化症、糖尿病性ニューロパチー、およびクロイツフェルトクロイツフェルトヤコブ病からなる群から選択される。例えば、疾患はアルツハイマー病である。例えば、疾患はパーキンソン症候群である。

例では、本発明の方法が、ＣＮＳもしくは神経変性疾患または状態を治療するためにヒトまたは動物の対象に対して実施される場合、この方法は、対象のＴｒｅｇ細胞のダウンレギュレーションを引き起こし、それにより、全身性単球由来マクロファージおよび／またはＴｒｅｇ細胞の脈絡叢を横切って対象の脳に入る進入を促進し、これにより、疾患または状態（例えば、アルツハイマー病）が治療、予防されるか、またはその進行が低減される。一実施形態では、この方法は、対象のＣＮＳ系（例えば、脳および／またはＣＳＦ）においてＩＦＮ－ガンマの増加を引き起こす。例では、この方法は、神経線維を回復し、および／または神経線維損傷の進行を低減する。例では、この方法は、神経ミエリンを回復し、および／または神経ミエリン損傷の進行を低減する。例では、本発明の方法は、ＷＯ２０１５／１３６５４１に開示される疾患または状態を治療または予防し、および／またはこの方法は、ＷＯ２０１５／１３６５４１に開示される任意の方法とともに使用することができる（本文書の開示は、例えば、ＣＮＳならびに神経変性疾患および状態の治療および／または予防をもたらすために対象に施すことができるそのような方法、疾患、状態および潜在的な治療薬、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ３またはここに開示される他の抗体などの薬剤の開示を提供するために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

治療または予防のためのがん
治療され得るがんとしては、血管新生されていないか、または実質的に血管新生されていない腫瘍、ならびに血管新生された腫瘍が挙げられる。がんは、非固形腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫などの血液腫瘍）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明で治療されるがんの種類としては、がん腫、芽細胞腫、および肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに肉腫、がん腫、および黒色腫などの悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／がんおよび小児の腫瘍／がんも含まれる。

血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液学的（または血行性）がんの例としては、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病および骨髄芽球生、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤芽球性白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度）、多発性骨髄腫、ウォルデンストロームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病および骨髄異形成が挙げられる。

固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない異常な組織の塊である。固形腫瘍は良性または悪性の場合がある。さまざまな種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類（肉腫、がん腫、およびリンパ腫など）にちなんで命名されている。肉腫およびがん腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系悪性腫瘍肺がん、肺がん、結腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺ガン、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、髄質甲状腺がん、乳頭状甲状腺がん、褐色細胞腫脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、髄質がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、頸部がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱がん、メラノーマ、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽腫としても知られる）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、ジャーミノーマ、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移など）が挙げられる。

治療または予防のための自己免疫疾患
・急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）
・急性壊死性出血性白質脳炎
・アジソン病
・無ガンマグロブリン血症
・円形脱毛症
・アミロイドーシス
・強直性脊椎炎
・抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎
・抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）
・自己免疫性血管性浮腫
・自己免疫性再生不良性貧血
・自己免疫性自律神経失調症
・自己免疫性肝炎
・自己免疫性高脂血症
・自己免疫免疫不全
・自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）
・自己免疫性心筋炎
・自己免疫性卵巣炎
・自己免疫性膵炎
・自己免疫性網膜症
・自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）
・自己免疫性甲状腺疾患
・自己免疫性蕁麻疹
・軸索およびニューロンニューロパチー
・バロ病
・ベーチェット病
・水疱性類天疱瘡
・心筋症
・キャッスルマン病
・セリアック病
・シャーガス病
・慢性疲労症候群
・慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）
・慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）
・チャーグ－ストラウス症候群
・瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡
・クローン病
・コーガン症候群
・寒冷凝集素症
・先天性心ブロック
・コクサッキー心筋炎
・ＣＲＥＳＴ病
・本質的混合クリオグロブリン血症
・脱髄性ニューロパチー
・疱疹状皮膚炎
・皮膚筋炎
・デビック病（視神経脊髄炎）
・円板状エリテマトーデス
・ドレスラー症候群
・子宮内膜症
・好酸球性食道炎
・好酸球性筋膜炎
・結節性紅斑
・実験的アレルギー性脳脊髄炎
・エヴァンス症候群
・線維筋痛症
・線維化性肺胞炎
・巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）
・巨大細胞心筋炎
・糸球体腎炎
・グッドパスチャー症候群
・多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（旧ウェゲナー肉芽腫症）
・バセドウ病
・ギランバレー症候群
・橋本脳炎
・橋本甲状腺炎
・溶血性貧血
・ヘノッホシェーンライン紫斑病
・妊娠性疱疹
・低ガンマグロブリン血症
・特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
・ＩｇＡ腎症
・ＩｇＧ４関連硬化性疾患
・免疫調節性リポタンパク質
・封入体筋炎
・間質性膀胱炎
・若年性関節炎
・若年性糖尿病（１型糖尿病）
・若年性筋炎
・川崎症候群
・ランバート・イートン症候群
・白血球破砕性血管炎
・扁平苔癬
・硬化性苔癬
・木質結膜炎
・線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）
・ループス（ＳＬＥ）
・ライム病、慢性
・メニエール病
・顕微鏡的多発血管炎
・混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）
・モーレン潰瘍
・ムッカハーベルマン病
・多発性硬化症
・重症筋無力症
・筋炎
・ナルコレプシー
・視神経脊髄炎（デビック病）
・好中球減少症
・眼の瘢痕性類天疱瘡
・視神経炎
・回帰性リウマチ
・ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌感染関連性精神神経障害）
・腫瘍随伴性小脳変性症
・発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）
・パリーロンベルグ症候群
・神経痛性筋萎縮症
・扁平部炎（周辺部ブドウ膜炎）
・天疱瘡
・末梢性ニューロパチー
・静脈周囲脳炎
・悪性貧血
・ＰＯＥＭＳ症候群
・結節性多発性動脈炎
・多腺性自己免疫症候群Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型
・リウマチ性多発筋痛
・多発性筋炎
・心筋梗塞後症候群
・心膜切開後症候群
・プロゲステロン皮膚炎
・原発性胆汁性肝硬変
・原発性硬化性胆管炎
・乾癬
・乾癬性関節炎
・特発性肺線維症
・壊疽性膿皮症
・赤芽球癆
・レイノー現象
・反応性関節炎
・反射性交感神経性ジストロフィー
・ライター症候群
・再発性多発性軟骨炎
・むずむず脚症候群
・後腹膜線維症
・リウマチ熱
・関節リウマチ
・サルコイドーシス
・シュミット症候群
・強膜炎
・強皮症
・シェーグレン症候群
・精液精巣自己免疫
・スティッフパーソン症候群
・亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）
・スザック症候群
・交感性眼炎
・高安動脈炎
・側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎
・血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
・トロサ・ハント症候群
・横断性脊髄炎
・１型糖尿病
・潰瘍性大腸炎
・未分化型結合組織病（ＵＣＴＤ）
・ブドウ膜炎
・血管炎
・水疱性皮膚症
・白斑
・ウェゲナー肉芽腫症（現在、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれている。

治療または予防のための炎症性疾患
・アルツハイマー病
・強直性脊椎炎
・関節炎（変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎）
・喘息
・アテローム性動脈硬化症
・クローン病
・大腸炎
・皮膚炎
・憩室炎
・線維筋痛症
・肝炎
・過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
・全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
・腎炎
・パーキンソン病
・潰瘍性大腸炎。

多価可溶性ＴＣＲ
本構成は、多価可溶性ＴＣＲタンパク質に関する。一態様では、本発明は、四価および八価の可溶性ＴＣＲ類似体に関する。本発明のＴＣＲタンパク質は、単量体からの自己集合が可能であり、完全にヒト起源である。このタンパク質は、ＥＴＯ ＮＨＲ２多量体化ドメインを構成する多量体である。本発明はまた、多量体可溶性ＴＣＲを構築する方法、およびそのようなタンパク質を使用する方法に関する。

治療用分子が多数の抗体フォーマットと比較して大きく後れを取っているため、代替の可溶性ＴＣＲフォーマットを利用する試みを行う。これは、細胞外ＴＣＲα／β鎖が膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインから解離すると、溶解性の本質的な問題を抱えるヘテロ二量体膜貫通タンパク質であるＴＣＲに主に起因する。第２に、標的部位でのそれらの同族リガンドに対するこれらの分子の固有の低い親和性および結合活性が、治療用分子としてのそれらの開発を大幅に妨げてきた。

これらの欠点を克服するために、本発明の本構成は、多価かつ可溶性の両方であるＴＣＲタンパク質を提供する。多価性は同族のｐＭＨＣに対するＴＣＲの結合活性を高め、溶解性はＴＣＲを膜貫通環境の外で使用することを可能にする。したがって、第１の態様では、ｐＭＨＣ複合体に結合することができる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体であって、下記の
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインと、
（ｉｉ）（ｉｉ）免疫グロブリン定常ドメインと、
（ｉｉｉ）（ｉｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体が提供される。

Ｉｇ定常ドメインの使用は、ＴＣＲ細胞外ドメインに安定性および溶解性を提供し、ＮＨＲ２ドメインを介した多量体化は、多価性および結合活性の向上を提供する。有利なことに、ドメインのすべては、はヒト起源であるか、またはヒトタンパク質配列と一致する。

Ｉｇ定常ドメインを使用してＴＣＲを安定化し、可溶性にすることで、非天然のジスルフィド結合の使用を回避する。したがって、有利には、本発明のＴＣＲは、非天然のジスルフィド結合を含まない。

一実施形態では、該複合体は、重鎖および軽鎖を含み、各軽鎖は、ＴＣＲ Ｖαドメインと免疫グロブリンＣ_αドメインを含み、各重鎖は、ＴＣＲ Ｖβドメインおよび免疫グロブリンＣ_Ｈ１ドメインを含む。

一実施形態では、各軽鎖はさらにＴＣＲ Ｃαドメインを含み、各重鎖はさらにＴＣＲ Ｃβドメインを含む。

実施形態では、ＴＣＲおよび免疫グロブリンドメインは、柔軟なリンカーによって分離され得る。

ＮＨＲ２多量体化ドメインは、免疫グロブリンドメインのＣ末端に有利に取り付けらえている。したがって、重鎖および軽鎖の各二量体は、１つの多量体化ドメインに結合し、その結果、重鎖－軽鎖二量体は、多価オリゴマーに会合する。

実施形態では、多量体化ドメインおよび免疫グロブリンドメインは、柔軟なリンカーによって分離されている。ある特定の実施形態では、これは、多量体化ドメインが免疫グロブリンドメインからの妨害なしに多量体化することを可能にする。

実施形態では、ＴＣＲタンパク質は、免疫グロブリンヒンジドメインをさらに含み得る。ヒンジドメインは、重鎖－軽鎖二量体の二量体化を可能にし、これにより、ＴＣＲタンパク質のさらなる多量体化を可能にする。例えば、ポリペプチド四量体を形成する多量体化ドメインは、免疫グロブリンヒンジドメインを使用して、ポリペプチド八量体までの多量体を形成することができる。同様に、二量体化多量体化ドメインは、ヒンジドメインの存在下で四量体を形成することができる。

実施形態では、本発明のＴＣＲタンパク質は四価である。

実施形態では、本発明のＴＣＲタンパク質は八価である。

本発明は、ヒトのＥＴＯファミリータンパク質に見られる神経相同性領域２（ＮＨＲ２）ドメインを使用して、四価のヘテロ二量体フォーマットで安定して組み立てられる可溶性ＴＣＲを提供する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＮＨＲ２ドメインは、２つのＮＨＲ２ホモ二量体の対合から形成されるホモ四量体を形成することが自然に見出される。細胞外ＴＣＲαまたはＴＣＲβ鎖に作動可能に結合したＮＨＲ２は、単量体とそれに続くホモ二量体から順次自己集合した四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子を優先的に形成する（図１）。

八量体に集合するＴＣＲタンパク質は、免疫グロブリンヒンジドメインを使用することにより、ＮＨＲ２ドメインを使用して作り出すことができる。

さらなる態様において、本発明のＴＣＲタンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド／エフェクター分子に結合され得る。そのようなポリペプチドの例としては、サイトカインなどの免疫学的に活性な部分、抗体または標的化ポリペプチドなどの結合タンパク質などを挙げらることができる。

本発明はさらに、四価および八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを作製する方法、目的とする宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるタンパク質をコードするＤＮＡベクター、およびこれらの新規の高感度多価可溶性ＴＣＲタンパク質分子の使用に関する。使用するための用途には、治療、診断、および創薬が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる態様では、本発明は、非ヒト構築物成分を使用することなく、効率的な方法で多価免疫グロブリン分子を構築するための方法を提供する。

したがって、下記の、
（ｉ）免疫グロブリン可変ドメインと、
（ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多量体免疫グロブリンが提供される。

免疫グロブリン可変ドメインは、好ましくは抗体可変ドメインである。そのようなドメインは、ＥＴＯ ＮＨＲ２多量体化素ドメインに融合されており、これは免疫グロブリン可変ドメインの四量体を形成するための手段を提供する。

ＥＴＯ ＮＨＲ２ドメインは、免疫グロブリン多量体の産生において、ｐ５３および同様の多量体化ドメインよりも効率的であり、構築物に非ヒト成分を使用せずに多量体免疫グロブリン分子の産生を可能にする。

ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインと融合して免疫グロブリン可変ドメインを発現することと、可変ドメインが多量体に集合することを可能にすることと、を含む、多量体免疫グロブリンを産生するための方法も提供される。

好ましくは、免疫グロブリン可変ドメインは、１つ以上の免疫グロブリン定常ドメインに取り付いている。

有利には、免疫グロブリンドメインは抗体ドメインである。例えば、可変ドメインは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ抗体ドメインであり得る。例えば、定常ドメインは、抗体ＣＨ１ドメインである。

一実施形態では、本発明による多量体免疫グロブリン分子、ＴＣＲおよび非ＴＣＲ免疫グロブリンの両方が、ファージディスプレイまたは別のディスプレイ技術によるスクリーニングのために産生される。したがって、例えば、多価免疫グロブリンは、ファージコートタンパク質との融合物として産生される。コートタンパク質に融合して産生される各免疫グロブリンについて、他の免疫グロブリン分子はコートタンパク質なしで産生されるため、ＮＨＲ２多量体化の結果としてファージ表面に集合することができる。

上に詳述した本発明の構成は、新規の多価、例えば四価および八価の可溶性タンパク質を産生するための核酸配列および方法に関する。一態様では、特に可溶性タンパク質は、高い感度、親和性、および特異性で４つのｐＭＨＣに結合することができる四価のヘテロ二量体フォーマットに集合されたＴＣＲである。可溶性四価ヘテロ二量体ＴＣＲは、細胞外ＴＣＲα／β鎖の全体または一部のいずれかから構成される独特なタンパク質分子である。細胞外ＴＣＲα／β鎖は、免疫グロブリンＣ_Ｈ１およびＣ_Ｌ（ＣκまたはＣλのいずれか）ドメインに連結されている。この連結により、ヘテロ二量体ＴＣＲα／βの安定した形成が可能になる。可溶性四価ＴＣＲの文脈において、独特な特徴は、Ｃ_Ｈ１のＣ末端またはＣ_ＬのＣ末端に作動可能に連結されたタンパク質のＥＴＯファミリーのＮＨＲ２のホモ四量体ドメインである。このようにＮＨＲ２ドメインをヘテロ二量体α／βＴＣＲに結合させると、細胞内で自己集合して四価のフォーマットになり、その後、可溶性タンパク質として上清に分泌される。
ＴＣＲ細胞外ドメイン

ＴＣＲ細胞外ドメインは、可変領域と、定常領域とで構成されている。これらのドメインは、抗体および他の免疫グロブリンドメインに存在するのと同じ方法でＴ細胞受容体に存在する。ＴＣＲレパートリーは、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子で使用されているのと同じ遺伝子再配列メカニズムによって作成された広範な多様性を有している（Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｓ．（１９８８）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．８：３－２６）。多様性のほとんどは、α鎖とβ鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をコードする可変（Ｖ）領域と結合（Ｊ）（または多様性Ｄ）領域の接合部で生成される（Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３９５－４０２）。ＩＭＧＴ ＬＩＧＭデータベースなどのＴＣＲ遺伝子のデータベースが利用可能であり、ＴＣＲをクローニングする方法は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ａｎｄ Ｍａｒｉｕｚｚａ（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５６３－５９０；Ｍｏｙｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４ Ｍａｒ １５；３２６（２）：２８４－６；Ｗａｌｃｈｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（１１）：ｅ２７９３０を参照されたい。

免疫グロブリン可変ドメイン
抗体可変ドメインは当技術分野において既知であり、多種多様な供給源から入手可能である。ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔなどの抗体可変ドメインの配列のデータベースが存在し、可変ドメインは、天然配列のクローニングおよび発現、または確立された技術に従った人工核酸の合成によって産生することができる。

バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリおよびラムダファージ発現ライブラリの構築方法は、当該技術分野において周知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ；Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：８６７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８：１３１３、参照により本明細書に組み入れられる）。

特に有利なアプローチの１つは、ｓｃＦｖファージライブラリの使用であった（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９－５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６－１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ｓｕｐｒａ；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．，２２２：５８１；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．，２６７）。バクテリオファージコートタンパク質上に表示されるｓｃＦｖライブラリの様々な実施形態が記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗ０９６／０６２１３およびＷ０９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．）ならびにＷ０９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）に記載されているように、ファージディスプレイアプローチの改良も知られている。

このような技術は、ＮＨＲ２多量体化ドメインを抗体可変ドメインに融合させることにより、多量体免疫グロブリンの産生に適合させることができる。

免疫グロブリン定常ドメイン
本明細書で言及される免疫グロブリン定常ドメインは、好ましくは抗体定常ドメインである。定常ドメインは、抗体サブタイプ間で配列が異なり、好ましくは、定常ドメインは、ＩｇＧ定常ドメインである。好ましくは、定常ドメインは、ＣＨ１定常ドメインである。抗体定常ドメインは当該技術分野において周知であり、ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベースを含む多くの供給源およびデータベースから入手可能である。

免疫グロブリン可変ドメインへの抗体定常ドメインの融合はまた、当該技術分野において、例えば、操作されたＦａｂ抗体フラグメントの構築においても知られている。

リンカー
柔軟なリンカーを使用して、ＴＣＲ可変ドメイン（Ｉｇ定常ドメイン）を、ＮＨＲ２多量体化ドメインに接続することができる。これにより、ＴＣＲドメインおよび多量体化ドメインが、互いにまたは多量体複合体の他の分子からの立体障害なしに機能することを可能にする。適切なリンカーは、例えば、グリシンリピート、グリシン－アラニンリピート、Ｇｌｙ（４）Ｓｅｒリンカー、またはＲｅｄｄｙ Ｃｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２：１５３－１６７に記載されているような柔軟なポリペプチドリンカーを含む。

免疫グロブリンヒンジドメイン
Ｉｇヒンジドメイン、本明細書では好ましくは抗体ヒンジドメインは、天然抗体の抗体定常領域を連結するドメインである。したがって、このドメインは、抗体定常ドメインを含む分子の自然な二量体化を提供する。これは、例えば、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、ならびにＩｇＧなどの抗体全体に存在する。この領域は、２つのＣＨ１定常ドメインを接続する２つの天然の鎖間ジスルフィド結合を構成する。

一実施形態では、多量体化ドメインは、Ｉｇ定常ドメインまたはヒンジドメインに結合することができる。ヒンジドメインが存在する場合、多量体化ドメインは、ヒンジ領域で結合されたＴＣＲ可変Ｉｇ定常ドメインの４つの二量体を含むＴＲＣ八量体を形成する。ヒンジ領域がないと、多量体化ドメインは、四量体の形成につなる。好ましくは、多量体化ドメインは、定常ドメインまたはヒンジ領域のＣ末端に取り付けられている。

生物学的に活性な分子
１つ以上の生物学的に活性な分子またはエフェクター分子（ＥＭ）を、本発明の多量体、例えば、多量体ＴＣＲタンパク質に取り付けることができる。そのような分子は、例えば、抗体、特に、抗ＣＤ３抗体または抗体フラグメントなどの、ＴＣＲの免疫認識および機能を支援し得る抗体であり得る。

いくつかの態様では、生物学的に活性な分子は、以下により詳細に記載されるように、細胞毒性薬、毒素、またはサイトカインなどの生物学的に活性な分子であり得る。生物学的に活性な分子の例としては、ＭＩＰ－１ｂなどのケモカイン、ＩＬ－２などのサイトカイン、ＧＭ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦなどの成長因子、リシンなどの毒素、ドキソルビシンまたはタキサンなどの細胞傷害性剤、放射性および蛍光標識などが挙げられる。ＴＣＲに結合可能な生物学的に活性な分子の例については、ＵＳ２０１１／００７１９１９を参照されたい。

他の態様では、生物学的に活性な分子は、例えば、インビボでポリペプチドリガンドの半減期を延長する分子に結合することができるグループ、およびインビボでポリペプチドリガンドの半減期を延長する分子からなる群から選択される。そのような分子は、例えば、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質であり得、インビボでＴＣＲ分子の半減期を延長する分子に結合することができるグループは、ＨＳＡまたは細胞マトリックスに特異的な抗体または抗体フラグメントである。

一実施形態では、生物学的に活性な分子は、結合分子、例えば抗体フラグメントである。２、３、４、５またはそれ以上の抗体フラグメントは、適切なリンカーを使用して一緒に結合され得る。これらの抗体フラグメントのうちのいずれか２つ以上の特異性は同じであっても、または異なっていてもよく、それらが同じである場合、多価結合構造が形成され、これは、一価抗体フラグメントと比較して標的に対して増加した結合活性を有する。

さらに、生物学的に活性な分子は、エフェクターグループ、例えば抗体Ｆｃ領域であり得る。

ＮまたはＣ末端への取り付けは、ＴＣＲ分子または操作されたポリペプチドが多量体に集合する前に、またはその後に行うことができる。したがって、Ｉｇ定常ドメインとのＴＣＲ融合体は、ＮまたはＣ末端の生物学的に活性な分子がすでに定位置にある状態で（合成的に、または核酸の発現によって）生成することができる。しかしながら、ある特定の態様では、Ｎ末端またはＣ末端への付加は、ＴＣＲ融合体が生成された後に起こる。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリドを使用して、ＴＣＲ融合体のＮ末端にＦｍｏｃ保護基を導入することができる。ＦｍｏｃはＨＳＡを含む血清アルブミンに高い親和性で結合し、Ｆｍｏｃ－ＴｒｐまたはＦＭＯＣ－Ｌｙｓは高い親和性で結合する。ペプチドは、Ｆｍｏｃ保護基を残したまま合成し、システインを介してスキャフォールドと結合させることができる。別の方法は、ＨＳＡにも結合するパルミトイル部分であり、例えば、このＧＬＰ－１類似体の半減期を延長するためにリラグルチドで使用されている。

あるいは、ＴＣＲ融合体は、例えば、アミンおよびスルフヒドリル反応性リンカーＮ－ｅ－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）を用いて、Ｎ末端で修飾することができる。このリンカーを介して、ＴＣＲを他のポリペプチド、例えば抗体Ｆｃフラグメントに連結させることができる。

ＮＨＲ２ドメイン
ＡＭＬ１／ＥＴＯは、Ｍ２サブタイプの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に見られるｔ（８：２１）に起因する融合タンパク質である。ＡＭＬ１／ＥＴＯは、ＥＴＯのほとんど（５７５ａａ）とインフレームで融合したＲＵＮＸ１のＮ末端１７７アミノ酸を含有している。ＥＴＯの神経相同性ドメイン２は、オリゴマー化およびタンパク質間相互作用を含む、ＡＭＬ１／ＥＴＯに関連する多くの生物学的活性に関与している。このドメインは、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（２００６）で詳細に特徴付けられている。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿０２３２７２．２を参照されたい。

本発明の一態様では、可溶性多価フォーマットに集合したタンパク質は、ＴＣＲαおよびβ鎖の細胞外ドメインの一部またはすべてのいずれかから構成されるＴＣＲである。ＴＣＲのαおよびβ鎖は、免疫グロブリンＣ_Ｈ１およびＣ_Ｌドメインによって安定化され、次の構成で配置され得る。
１．Ｖα－Ｃ_ＬおよびＶβＣ_Ｈ１
２．Ｖα－Ｃ_Ｈ１およびＶβ－Ｃ_Ｌ
３．ＶαＣα－Ｃ_ＬおよびＶβＣβ－Ｃ_Ｈ１
４．ＶαＣαＣ_Ｈ１およびＶβＣβＣ_Ｌ

本発明の一態様では、細胞外ＴＣＲドメインは、任意のペプチドリンカー（Ｌ）を介して免疫グロブリンＣ_Ｈ１およびＣ_Ｌドメインに連結されて、タンパク質の柔軟性を促進し、最適なタンパク質フォールディングを促進する。
１．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１
２．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１およびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ
３．ＶαＣα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１
４．ＶαＣα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１およびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ

本発明の別の態様では、ＮＨＲ２ホモ四量体ドメインなどの四量体化ドメイン（ＴＤ）は、細胞外ＴＣＲαおよびβ鎖に連結されている、免疫グロブリンＣ_Ｈ１またはＣ_ＬドメインのいずれかのＣ末端に連結されている。ＮＨＲ２ドメインは、任意に、ペプチドリンカーを介してＣ_Ｈ１またはＣ_Ｌドメインに連結することができる。得られた四価ヘテロ二量体ＴＣＲタンパク質は、以下の構成で配置することができ、ここでは、（Ｌ）は、任意のペプチドリンカーである。
１．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ
２．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ
３．ＶαＣα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ
４．ＶαＣα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ
５．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１
６．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１およびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ
７．ＶαＣα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１
８．ＶαＣα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１およびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ

同族のｐＭＨＣに対する可溶性ＴＣＲの感度は、結合活性効果を高めることによって向上させることができる。これは、四量体化ドメインによって促進される、抗原結合部位の数を増やすことによって達成される。これは今度はまた、一価の可溶性ＴＣＲと比較してタンパク質分子の分子量を増加させ、したがって循環中の血清保持を延長する。血清半減期を長くなると、これらの分子が同族の標的抗原と相互作用する可能性も高まる。

四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、単一細胞で表示される１、２、３または４つのｐＭＨＣに同時に結合することができるか、同族のｐＭＨＣを表示する１、２、３、または４つの異なる細胞に同時に結合することができる。

本発明で使用されるＴＣＲαおよびβ鎖配列は、特定のｐＭＨＣに特異的な既知のＴＣＲに由来するか、またはファージディスプレイなどの当該技術分野において既知の技術を使用してスクリーニングすることによって新たに特定され得る。さらに、ＴＣＲ配列は、本発明においてαおよびβ鎖に限定されず、ヒトＴ細胞から直接クローン化されるか、または組換えＤＮＡ技術を使用する指向性進化によって特定される、ＴＣＲδおよびγまたはε鎖およびそれらの配列変動を組み込むこともできる。

本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、可溶性で、安定で、正しく折り畳まれたタンパク質分子の最適な産生のために、哺乳動物細胞において優先的に産生される。

本発明による多量体（例えば、四量体または八量体）、または多価ＴＣＲは、任意の好適ななベクターシステムを使用して、哺乳動物細胞などの細胞で発現され得る。ｐＴＴ５発現ベクターは、多価可溶性ＴＣＲを発現するために使用される発現システムの一例である。ｐＴＴ５発現システムは、懸濁液に適応したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞での組換えタンパク質の高レベルの一過性産生を可能にする（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９）。これは、ウイルスタンパク質エプスタイン／バール核抗原１（ＥＢＮＡ－１）によって認識される複製起点（ｏｒｉＰ）を含有しており、これは、宿主細胞複製因子とともにＤＮＡプラスミドのエピソーム複製を媒介し、組換えタンパク質の発現の増強を可能にする。当該技術分野において既知であり、市販されている哺乳動物細胞発現のための他の好適なベクターシステムを本発明で使用することができる。

四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体は、発現ベクターから遺伝子を一過性に発現させることによって産生することができる。

別の実施形態では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体は、操作された安定な細胞株から産生され得る。細胞株は、タンパク質分子をコードする遺伝子が単一コピーまたは複数コピーのいずれかとして宿主細胞のゲノムに組み込まれる、当該技術分野において既知のゲノム工学技術を使用してタンパク質分子を産生するように操作することができる。ＤＮＡ組み込みの部位は、宿主ゲノム内の定義された場所であるか、またはランダムに組み込まれて、所望のタンパク質分子の最大の発現をもたらすことができる。ゲノム工学技術には、相同組換え、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムなどのトランスポゾン媒介遺伝子導入、リコンビナーゼ媒介カセット交換を含む部位特異的リコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼ媒介遺伝子ターゲティング、およびレンチウイルスなどのウイルス媒介遺伝子導入を挙げることができるが、これらに限定されない。

また、本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体は、封入体としてのＥ．ｃｏｌｉの細胞質における過剰発現によって産生され、親和性クロマトグラフィーによる精製後にインビトロで再折り畳みされて、その同族のｐＭＨＣまたは抗原に正しく結合することが可能な機能性タンパク質分子を産生する。

本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子または他の多量体の発現は、哺乳動物または細菌細胞に限定されず、昆虫細胞、植物細胞、および酵母細胞などの下等真核細胞においても発現および産生され得る。

本発明の別の態様では、ヘテロ二量体可溶性ＴＣＲ分子または他の多量体は、例えば、その同族のｐＭＨＣに対して最大８つの結合部位を有する、八価のタンパク質複合体として産生される（図２）。複数の抗原結合部位が、この分子は１つの細胞に表示される最大８つのｐＭＨＣに結合するか、最大８つの異なる細胞に表示されるｐＭＨＣに結合することを可能にするため、高感度の可溶性ＴＣＲが作り出される。

分子のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲ部分は、ＴＣＲのαまたはβ鎖のいずれか自体を連結しているＣ_Ｈ１またはＣ_ＬドメインのいずれかのＣ末端に免疫グロブリンヒンジドメインを融合することによって二価の分子に作り変える。ヒンジドメインは、ＩｇＧと同様の構造を与える２本の重鎖の接続を可能にする。ヒンジドメインのＣ末端には、ＮＨＲ２などの四量体化ドメインが、任意のペプチドリンカーを介して連結されている。免疫グロブリンヒンジをＩｇＣＨ１またはＣＬドメインおよびＮＨＲ２ドメインのＣ末端およびＮ末端にそれぞれ結合することにより、単量体^２と呼ばれる２つのＮＨＲ２単量体の集合が可能になる。このコンフォメーションでは、ヒンジとＮＨＲ２ドメインとの間に長く柔軟なリンカーが提供されない限り、構造上の制約により、２つのＮＨＲ２ドメインが逆平行結合によってホモ二量体を形成しない可能性が高いと予測する。免疫グロブリンＣ_Ｈ１またはＣ_Ｌドメイン免疫グロブリンを介してヘテロ二量体可溶性ＴＣＲへの四量体化およびヒンジドメインの結合は、ＮＨＲ２のホモ四量体^２を通して形成された八価の可溶性ＴＣＲの段階的な自己集合を可能にする。八価の可溶性ＴＣＲの自己集合は、ＮＨＲ２単量体^２およびホモ二量体^２中間体タンパク質複合体を介している（図２）。得られた八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、その同族のｐＭＨＣに対して優れた感度を有し、したがって、自然に見られる親和性をはるかに超えて、そのｐＭＨＣリガンドに対してＴＣＲを親和性成熟させる必要なく未知の抗原またはｐＭＨＣを特定するという独特の利点を与える。特に、特徴付けされていない腫瘍特異的Ｔ細胞および自己免疫疾患などの他の疾患に関与するＴ細胞によって認識されるｐＭＨＣを特定するのに有用であろう。八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子の多くの異なる構成を生成することができる。いくつかの例を以下に示す。
１．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤ
２．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ
３．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤ
４．ＶαＣα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ
５．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジ
６．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ
７．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－Ｃβ（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジ
８．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－ヒンジおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ

本発明の別の態様では、自己集合化多価タンパク質、優先的には四価および八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲは、生物学的に活性な薬剤／エフェクター分子に融合または結合され、したがってこれらの分子ががん細胞などの所望の細胞集団に誘導され、それらの治療効果を特異的に発揮することを可能にする。細胞傷害性薬、細胞傷害性薬などのエフェクター分子、毒素またはサイトカインなどの生物学的に活性な分子を誘導するモノクローナル抗体の腫瘍標的化能力は十分に確立されている（Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）。同様の方法で、本発明で概説された多価可溶性ＴＣＲ分子はまた、エフェクタータンパク質およびポリペプチドと融合され得るか、または細胞傷害性剤に結合され得る。本発明で概説される多価タンパク質複合体との融合タンパク質としての使用に適したエフェクタータンパク質分子の例としては、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、顆粒球コロニー刺激因子［Ｇ－ＣＳＦ］、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［ＧＭ－ＣＳＦ］、および腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］α、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＲＡＩＬ、共刺激リガンドＢ７．１またはＢ７．２、ケモカインＤＣ－ＣＫ１、ＳＤＦ－１、フラクタルカイン、リホタクチン、ＩＰ－１０、Ｍｉｇ、ＭＣＡＦ、ＭｌＰ－１α、ＭＩＰ－１／３、ＩＬ－８、ＮＡＰ－２、ＰＦ－４、およびＲＡＮＴＥＳまたはそれらの活性フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に記載の融合タンパク質としての使用に適した、または多価タンパク質複合体に結合した毒性剤の例としては、ジフテリア毒素、リシン、シュードモナスエキソトキシンなどの毒素、オーリスタチン、メイタンシン、カリケアマイシン、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピンなどの細胞傷害性薬が挙げられるが、これらに限定されない。細胞傷害性薬は、プロテアーゼによって切断不可能もしくは切断可能のいずれかであるか、または酸に不安定である選択リンカーによってコンジュゲートすることができる。

不均一性を排除し、コンジュゲートの安定性を改善するために、細胞傷害性薬を部位特異的にコンジュゲートすることができる。特定のシステイン残基を操作するか、グリコトランスフェラーゼおよびトランスグルタミナーゼを介した酵素抱合を使用することにより、これを達成できる（Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。

本発明の別の態様では、多価タンパク質複合体は、蛍光剤、放射性剤、または電子移動剤などの検出を可能にする分子に共有結合している。

本発明の別の態様では、エフェクター分子（ＥＭ）は、任意のペプチドリンカーを介して、ＮＨＲ２などの四量体化ドメインのＣ末端を介して多価タンパク質複合体に融合される。ＮＨＲ２ドメインを介した融合は、多くの異なる構成で多価タンパク質複合体を生成するように配置され得る。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを使用して生成できるいくつかのタンパク質構成の例を以下に示す。
１．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
２．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ
３．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_ＬおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
４．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ
５．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１
６．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１およびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
７．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１
８．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１およびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ

本発明の別の態様では、エフェクター分子（ＥＭ）は、任意のペプチドリンカーを介して、免疫グロブリンＣＨ１またはＣＬ１ドメインのいずれかのＣ末端で、多価タンパク質複合体に融合される。免疫グロブリンドメインを介したＥＭの融合は、多くの異なる構成で多価タンパク質複合体を生成するように配置され得る。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを使用して生成できるいくつかのタンパク質構成の例を以下に示す。
９．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ
１０．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭ
１１．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶαβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ
１２．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭ
１３．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＥＭ
１４．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ
１５．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－－（Ｌ）－ＥＭ
１６．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ

本発明の別の態様では、エフェクター分子（ＥＭ）は、任意のペプチドリンカーを介して、免疫グロブリンＣＨ１またはＣＬ１ドメインのいずれかのＣ末端、また四量体化ドメイン（例えば、ＮＨＲ２）のＣ末端で、多価タンパク質複合体に融合される。このアプローチにより、２つのエフェクター分子の融合をＴＣＲヘテロ二量体複合体ごとに融合させることが可能となる。免疫グロブリンドメインおよび四量体化ドメインを介したＥＭの融合は、多くの異なる構成で多価タンパク質複合体を生成するように配置され得る。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲを使用して生成できるいくつかのタンパク質構成の例を以下に示す。
１７．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
１８．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭ
１９．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβＣβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
２０．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＥＭ
２１．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＥＭ
２２．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ－）ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ
２３．Ｖα－Ｃα－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＥＭ
２４．Ｖα－（Ｌ）－Ｃ_Ｈ１－（Ｌ）－ＥＭおよびＶβ－Ｃβ－（Ｌ）－Ｃ_Ｌ－（Ｌ）－ＴＤ－（Ｌ）－ＥＭ

本発明の別の態様では、多価タンパク質複合体は、精製を容易にするためにタンパク質タグに融合される。精製タグは当該技術分野において既知であり、以下のタグ：Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＴＥＶ、ＭＢＰ、Ｓｔｒｅｐ、ＦＬＡＧが挙げられるが、これらに限定されない。

非ＴＣＲ多量体
本発明は、複数の相互作用ドメインまたは抗原に結合する可能性のある可溶性多価フォーマットでタンパク質を組み立てるための独特の方法を提供する。タンパク質は、免疫系に直接的または間接的に優先的に関与する、または免疫応答を調節する可能性を有する単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体またはオリゴマーであり得る。例としては、ＴＣＲ、ペプチドＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ、それらの抗体または抗原結合部分、ならびに代替の非抗体タンパク質スキャフォールドを有する結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の別の態様では、相互作用ドメインまたは抗原は、任意の細胞表面発現または分泌タンパク質、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩに関連するペプチド、もしくはウイルスおよび細菌タンパク質を含む病原体に関連する任意のタンパク質であり得る。

非ＴＣＲ多量体は、抗体または抗体フラグメントの多量体、例えば、ＦａｂのｄＡｂであり得る。本発明によるｄＡｂおよびＦａｂの例には、以下が含まれる：

多価ｄＡｂの例
２５．ＶＨ－（Ｌ）－ＮＨＲ２
２６．ＶＬ（λまたはκ）－（Ｌ）－ＮＨＲ２
２７．ＶＨ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ
２８．ＶＬ（λまたはκ）－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ
２９．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２
３０．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２
３１．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ
３２．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭ

多価Ｆａｂの例
３３．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
３４．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１
３５．ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
３６．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１
３７．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
３８．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＨ－ＣＨ１
３９．ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ
４０．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２－（Ｌ）－ＥＭおよびＶＨ－ＣＨ１
４１．ＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
４２．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ
４３．ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－（Ｌ）－ＥＭ
４４．ＶＬ（λまたはκ）－ＣＬ－ヒンジ－（Ｌ）－ＮＨＲ２およびＶＨ－ＣＨ１－（Ｌ）－ＥＭ

上記の例では、（Ｌ）は任意のペプチドリンカーを示し、一方ＥＭは毒素、薬物、サイトカインなどの生物学的に活性な薬剤またはエフェクター分子を示し、抗体、ＦａｂおよびＳｃＦｖなどの結合分子が含まれる。

可変軽鎖は、ＶλまたはＶκのいずれかであり得る。

本発明の一態様では、一例で組み立てられた四量体化タンパク質分子は、動物の創薬プラットフォーム（例えば、ラット、ウサギ、ニワトリ）を使用する創薬に置ける用途のためのヒトｐＭＨＣであり得る。そのような状況において、四量体化ドメインは、それが意図される動物種に由来する遺伝子から優先的に発現および産生される。このような創薬用途の一例は、例えばラットにおける免疫化のための抗原としての四量体化ヒトｐＭＨＣの使用であろう。ラットがｐＭＨＣで免疫されると、免疫応答はヒトｐＭＨＣに特異的に向けられ、タンパク質複合体の四量体化ドメインには向けられない。

多価抗体は、例えば、ＮＨＲ２多量体化ドメインに融合された単一ドメイン抗体配列を使用して産生することができる。

本発明に関連する態様では、四価タンパク質は、腫瘍抗原の分子イメージングのためのプローブとして使用されるペプチドであり得る。そのようなプローブの多価結合は、インビボで親和性、結合活性および保持時間を増強し、これが次にインビボ腫瘍標的化を増強するので、一価分子プローブを超える独特の利点を有するであろう。

多量体化ドメインは、上記のＮＨＲ２ドメインである。好ましくは、ポリペプチドは、ポリペプチドに融合されたＩｇ定常ドメインの使用によって安定化および／または可溶性にされ、その結果、融合は、ポリペプチドの四量体を提供する。Ｉｇヒンジドメインを使用して、八量体を提供することができる。

多量体の使用
本発明による多量体ＴＣＲタンパク質は、可溶性ＴＣＲタンパク質が示される任意の用途において有用である。本発明のＴＣＲタンパク質の特定の利点には、選択された標的に対する結合活性の増加、および／または複数の標的に結合する能力が含まれる。

したがって、一態様では、本発明の多価ヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、免疫応答、例えば自己免疫応答の抑制を選択的に阻害するために使用することができる。これらの可溶性タンパク質分子の多価、例えば四価の性質は、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の抗原特異的相互作用と競合するための絶妙な感度および結合親和性を与える。この種の中和効果は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患、バセドウ病、血管炎、１型糖尿病などの自己免疫疾患に治療的に有益であり得る。

同様に、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子を使用して、特定の移植抗原および標的分子に結合する自己抗原のＴ細胞認識を選択的に抑制し、したがって細胞間相互作用を阻害することにより、組織移植拒絶を防ぐことができる。

本発明の別の態様では、四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、毒性、感染症研究、神経学的研究、行動および認知研究、生殖、遺伝学および異種移植研究などの臨床研究で使用することができる。

同族のｐＭＨＣに対する感度が向上した四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、ヒト患者から直接得られた生体サンプルを使用した診断の目的で使用することができる。四価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲの感度の向上により、ＭＨＣに表示される潜在的な疾患関連ペプチドの検出が可能になり、これらのペプチドは、低密度で発現することが自然に見られる。これらの分子は、関連する臨床試験に患者を登録するための患者の層別化にも使用することができる。

本発明の別の態様では、八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、様々な疾患の治療のための医薬製剤において使用され得る。

本発明に関連する別の態様では、八価のヘテロ二量体可溶性ＴＣＲタンパク質分子は、腫瘍分子イメージングのためのプローブとして使用され得るか、または治療用タンパク質として調製され得る。

任意に、ポリペプチド（第１のポリペプチド）は、表８に開示されるポリペプチドを含むか、またはそれからなる。例では、本発明は、そのようなポリペプチドの多量体（例えば、二量体、三量体または四量体、好ましくは四量体）を提供する。例では、表８において、多量体化ドメイン（ＳＡＭ）は、ｐ５３ドメイン（例えば、ヒトｐ５３ドメイン）である。例では、表８において、多量体化ドメイン（ＳＡＭ）は、ｐ５３ドメイン（例えば、ヒトｐ５３ドメイン）のオルソログまたはホモログである。

任意に、本発明は、ポリペプチド（例えば、該ポリペプチドまたは該第１のポリペプチド）を提供し、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に＊）、
Ａ．ｄＡｂおよび自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、または
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ。

＊別の方法では、成分はＣ末端からＮ末端の方向に書き込まれる。

一実施形態では、ポリペプチドＨ、Ｌ、ＯまたはＱは、第２のポリペプチドと関連しており、第２のポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）ＶＬおよびＣＬを含み、このＣＬは、第１のポリペプチドのＣＨ１と関連している。

一実施形態では、ポリペプチドＩ、Ｍ、ＰまたはＲは、第２のポリペプチドと関連しており、第２のポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）ＶＨおよびＣＨ１を含み、このＣＨ１は、第１のポリペプチドのＣＬと関連している。

例では、ポリペプチドは、表９に開示されるヌクレオチド配列によってコードされる。例では、ポリペプチドは、表１０に開示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

例では、（ｉ）ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよび自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、または
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂを含むか、
あるいは（ｉｉ）ポリペプチドは（Ｃ末端からＮ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよび自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、または
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂを含む。

任意に、ＳＡＭは四量体化ドメイン、例えば、ｐ５３ ＴＤである。

例では、第１、第２、第３（存在する場合）および第４（存在する場合）のｄＡｂは、同じ抗原結合特異性を有する。例では、第１、第２、第３（存在する場合）および第４（存在する場合）のｄＡｂは、同じ異なる抗原結合特異性を有する。

例では、第１および第２のｓｃＦｖは同じ抗原結合特異性を有する。例では、第１および第２のｓｃＦｖは、同じ種々の抗原結合特異性を有する。

例では、第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、および第１のｓｃＦｖは、同じ抗原結合特異性を有する。例では、第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、および第１のｓｃＦｖは、同じ種々の抗原結合特異性を有する。

本明細書において、ｄＡｂがポリペプチドに提供される場合、別の方法では、代わりに、ｓｃＦｖまたはＦａｂまたは非Ｉｇ結合ドメイン（例えば、アフィボディ、アビマーまたはフィブロネクチンドメイン）などの任意の異なるタイプの抗原結合ドメインが提供され得る。

本明細書において、ｓｃＦｖがポリペプチドに提供される場合、別の方法では、代わりに、ｄＡｂまたはＦａｂまたは非Ｉｇ結合ドメイン（例えば、アフィボディ、アビマーまたはフィブロネクチンドメイン）などの任意の異なるタイプの抗原結合ドメインが提供され得る。

本明細書において、Ｆａｂがポリペプチドに提供される場合、別の方法では、代わりに、ｓｃＦｖまたはｄＡｂまたは非Ｉｇ結合ドメイン（例えば、アフィボディ、アビマーまたはフィブロネクチンドメイン）などの任意の異なるタイプの抗原結合ドメインが提供され得る。

各抗原は、本明細書に開示される任意の抗原であり得る。

例では、ＣＨ１（存在する場合）、ＣＨ２およびＣＨ３は、ヒトＩｇ ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３である。例では、ＣＨ２はＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ３はＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２はヒンジアミノ酸配列を含む。この例では、ＣＨ２は（Ｎ末端からＣ末端方向に）、ヒンジアミノ酸配列およびＣＨ２ドメインを含む。例では、ヒンジアミノ酸配列は、（ｉ）完全なヒンジであり、（ｉｉ）ポリペプチドを別のそのようなポリペプチドと二量体化するために機能しないヒンジアミノ酸配列であり、（ｉｉｉ）アミノ酸モチーフＣＸＸＣを含むヒンジコアを欠く（および任意に、上部ヒンジアミノ酸配列も欠く）ヒンジアミノ酸配列であるか、または（ｉｖ）上部ヒンジが下部ヒンジに融合しているが、アミノ酸モチーフＣＸＸＣを含むコアヒンジを欠いているか、または（ｖ）下部ヒンジであるが、アミノ酸モチーフＣＸＸＣを含むヒンジコアを欠いている（および任意に、上部ヒンジアミノ酸配列も欠いている）。上部、コア、および下部ヒンジの配列の例は、表１２に開示されている。例では、ＣＨ２は、機能的ヒンジ領域を欠いており、すなわち、ヒンジ領域は、ポリペプチドを別のそのようなポリペプチドと二量体化するために非機能的である。例では、ＣＨ２はヒンジ領域を欠いている。例では、ＣＨ２は完全なヒンジ領域配列を欠いている。例では、ＣＨ２はコアヒンジ領域配列を欠いている。

例では、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）任意の上部ヒンジ領域、下部ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、ポリペプチドを別の該ポリペプチドと二量体化するために機能的であるコアヒンジ領域を欠いている。

例では、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）任意の上部ヒンジ領域、下部ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＸＸＣを欠いており、Ｘは、任意のアミノ酸である（任意に、各アミノ酸Ｘは、Ｐ、ＲおよびＳから選択される）。

例では、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）配列番号１６３～１７８から選択されるアミノ酸およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＸＸＣを欠いており、Ｘは、任意のアミノ酸である（任意に、各アミノ酸Ｘは、Ｐ、ＲおよびＳから選択される）。

一実施形態では、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０～１８２から選択される。実施形態では、ＣＨ２（ポリペプチド）は、配列番号１８３～１８７のアミノ酸配列を欠いている。

実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ１ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１８３）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。

実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ２ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号１８４）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。

実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８１である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ３ ＣＨ１およびＣＨ３である。場合により、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号１８５）およびコアヒンジ領域アミノ酸配列ＣＰＲＣ（配列番号１８１）を欠いている。任意に、代替的に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号１８６）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＲＣ（配列番号１８１）を欠いている。

実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８２である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ４ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１８７）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＳＣ（配列番号１８２）を欠いている。

例では、本明細書のポリペプチドのＣＨ２は、コアヒンジ（および任意に、また上部ヒンジ）のアミノ酸配列を欠いている。例では、本明細書のポリペプチドのＣＨ２は、コアヒンジのＣＸＸＣアミノ酸配列を欠いており、Ｘが任意のアミノ酸、好ましくはＰ、ＲまたはＳ、最も好ましくはＰである。例では、ＣＨ２は、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列またはＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列を含む。例では、ＣＨ２は、ＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列を含む。例では、ＣＨ２は、ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列を含む。

例では、本明細書のポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり、ＣＨ２は、コアヒンジ（および任意に、また上部ヒンジ）のアミノ酸配列を欠いており、例えば、ＣＨ２は、ＣＰＰＣ配列を欠いている。例では、ＣＨ２は、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列を含み、括弧で囲まれたＰは任意である。

例では、本明細書のポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３は、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり、ＣＨ２は、コアヒンジ（および任意に、また上部ヒンジ）のアミノ酸配列を欠いており、例えば、ＣＨ２は、ＣＰＰＣ配列を欠いている。例では、ＣＨ２は、ＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＥＲＫＣＣＶＥ［Ｐ］ＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列を含み、括弧で囲まれたＰは任意である。

例では、本明細書のポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３は、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり、ＣＨ２は、コアヒンジ（および任意に、また上部ヒンジ）のアミノ酸配列を欠いており、例えば、ＣＨ２は、ＣＰＲＣ配列を欠いている。例では、ＣＨ２は、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列を含み、括弧で囲まれたＰは任意である。例では、ＣＨ２は、ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列を含み、括弧で囲まれたＰは任意である。

例では、本明細書のポリペプチドのＣＨ２およびＣＨ３は、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり、ＣＨ２は、コアヒンジ（および任意に、また上部ヒンジ）のアミノ酸配列を欠いており、例えば、ＣＨ２は、ＣＰＳＣ配列を欠いている。例では、ＣＨ２は、ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＥＳＫＹＧＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列を含み、括弧で囲まれたＰは任意である。

ポリペプチドがＶ－ＣＨ１を含む場合、ＣＨ２も存在し得るが、この場合、任意に、コアヒンジ領域（または少なくとも本明細書に開示されるＣＸＸＣおよび配列番号１８０～１８２から選択される配列）を欠き、任意に、Ｆ（ａｂ’）２形成を防ぐために上部および／または下部ヒンジ領域を欠く。

態様：
例として、本発明は以下の態様を提供し、それらのいくつかは本明細書で例示されている。
１．（Ｎ末端からＣ末端の方向に、またはＣ末端からＮ末端の方向に）
（ａ）免疫グロブリンスーパーファミリードメインと、
（ｂ）任意のリンカーと、
（ｃ）自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）（任意に自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ））と、を含む、ポリペプチド。
例では、各リンカーは、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４個のアミノ酸を含む（または最大それを含むか、またはそれからなる）。
別の方法では、（ａ）のドメインは非Ｉｇドメインであるか、または非Ｉｇスキャフォールドを含む。

本明細書の別の方法では、ＴＤまたはＴＤのコピーを使用する代わりに、一実施形態では、任意の他の自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）を使用することができる。例では、ＳＡＭ（例えば、ＴＤ）は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、サル（例えば、カニクイザル）、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ、鳥（例えば、ニワトリ）または魚ＳＡＭ（例えば、またはＴＤ）である。

任意に、（ａ）のドメインは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＴＮＦアルファ、ＩＬ１７（例えば、ＩＬ１７Ａ）、ＣＤ３８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＥＧＦＲ、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－４Ｒ（例えば、ＩＬ－４Ｒａ）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＬＡＧ－３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＲＡＳ、ヘマグルチニン、トランスフェリン受容体１、アミロイドベータ、ＢＡＣＥ１、Ｔａｕ、ＴＤＰ４３、ＳＯＤ１、アルファシヌクレインおよびＣＤ３から選択される抗原に特異的に結合することができる。

例では、抗原はペプチド－ＭＨＣである。

いくつかの実施形態（例えば、以下の態様１６または以下の１７のいくつかの実施形態）では、ポリペプチドは、少なくとも２つの結合部分、例えば、２つのｄＡｂ、２つのｓｃＦｖ、またはｄＡｂおよびｓｃＦｖを含む。例では、これらの結合部分は、同じ抗原（例えば、本明細書または本明細書の直前のパラグラフに開示されている抗原）に結合する。例では、この部分は、異なる抗原（例えば、本明細書または本明細書の直前のパラグラフに開示されている抗原）に結合する。例えば、態様１６Ｂ、Ｄ、ＥまたはＦでは、可変ドメインまたはｓｃＦｖは、ＴＮＦアルファ、ＣＤ３８、ＩＬ１７ａ、ＣＤ２０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４および４－１ＢＢから選択される同じまたは異なる抗原に特異的に結合することができる。例えば、部分のうちの一方はＴＮＦアルファに結合し、他方はＩＬ１７ａに結合し、部分のうちの一方はＰＤ－１に結合し、他方は４－１ＢＢに結合し、または、部分のうちの一方はＰＤ－Ｌ１に結合し、他方は４－１ＢＢに結合し、部分のうちの一方はＰＤ－１に結合し、他方はＣＴＬＡ－４に結合し、または、部分のうちの一方はＰＤ－Ｌ１に結合し、他方はＣＴＬＡ－４に結合する。
２．（ａ）ドメインが、抗体可変ドメインである、態様１に記載のポリペプチド。

例えば、本明細書の可変ドメインは、ＶＨ（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂポリペプチド鎖によって構成される）である。別の例では、それはＶＨＨである（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂポリペプチド鎖によって構成される）。別の例では、それは、ヒト化ＶＨ、ヒト化ＶＨＨ、またはヒトＶＨ（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂポリペプチド鎖によって構成される）である。別の例では、それはＶＬである（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂポリペプチド鎖によって構成される）。別の例では、それはＶκである。別の例では、それはＶλである。

別の例では、（ａ）のドメインは、ＴＣＲ可変ドメイン（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδ）である。

例では、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、は抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）である。
３．（ａ）の可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬから選択されるか、または、ドメインが、ｓｃＦｖによって構成されている、態様１～２のいずれか１つに記載のポリペプチド。

例では、本明細書の単一の可変ドメインは、ヒトもしくはヒト化ｄＡｂまたはナノボディであり、またはラクダＶＨＨドメインである。

例では、（ａ）のドメインは単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）で構成されている。
４．（ａ）が（ｃ）に直接結合しているか、または、（ｂ）が（ａ）および（ｃ）に直接結合されている、態様１～３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
５．（Ｎ末端からＣ末端の方向に）ＳＡＭ、（ｄ）任意の第２のリンカー、および（ｅ）第２の免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む、態様１～４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
６．第２のドメインが、抗体単一可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬから選択されるか、または、ドメインが、ｓｃＦｖによって構成されている、態様５に記載のポリペプチド。

例では、単一の可変ドメインは、ヒトもしくはヒト化ｄＡｂまたはナノボディであり、またはラクダＶＨＨドメインである。
７．第２のドメインが、抗体単一可変ドメインまたは抗体定常ドメインである、態様５に記載のポリペプチド。
８．定常ドメインが、抗体Ｆｃ領域によって構成されている、態様７に記載のポリペプチド。
９．（ｃ）が（ｅ）に直接結合しているか、または、（ｄ）が（ｃ）および（ｅ）に直接結合されている、態様５～８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１０．ＴＤが、ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログであるか、または、ＴＤが、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである、態様１～９のいずれか１つに記載のポリペプチド。

任意に、本明細書のＴＤは、表２に開示されているタンパク質のＴＤである。
１１．ＴＤが、配列番号１０または１２６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１～１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１２．（ａ）と（ｃ）との間に（ｆ）抗体可変ドメイン、抗体定常領域、または抗体Ｆｃ領域を含む、態様１～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１３．（ｆ）が、（ｉ）抗体ＣＨ１定常ドメインを含むか、または（ｉｉ）抗体Ｆｃ領域（すなわち、ＣＨ２－ＣＨ３を含む）、態様１２に記載のポリペプチド。
１４．ポリペプチドが、第２のポリペプチドと会合しており、（ｉｉｉ）第２のポリペプチドが、（ｉ）のＣＨ１ドメインと対合している抗体ＣＬ定常ドメインを含むか、または（ｉｖ）第２のポリペプチドが、（ｉｉ）のＦｃ領域と対合している第２の抗体のＦｃ領域を含む、態様１３に記載のポリペプチド。
１５．（ｆ）の可変ドメインが、抗体単一可変ドメインである、態様１２に記載のポリペプチド。
１６．ポリペプチド（第１のポリペプチド）が、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
Ａ．第１の抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、任意のリンカー、および該ＳＡＭ、
Ｂ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第２の抗体単一可変ドメイン、
Ｃ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカーおよび該ＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｆ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
Ｇ．第１の抗体可変ドメイン、任意の第１のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカー、および該ＳＡＭ、
Ｈ．該ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
Ｉ．該ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｊ．該ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体可変ドメイン、または
Ｋ．該ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体可変ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体定常ドメイン、を含むか、またはこれらからなる、態様１～１５のいずれか１つに記載のポリペプチド。

任意に、各可変ドメインは、ＶＨまたはＶＬ（例えば、ＶκまたはＶλ）である。

任意に、本明細書のポリペプチドの各ドメインは、ヒトドメインである。任意に、本明細書のポリペプチドの各ドメインは、ヒトまたはヒト化ドメインである。
１７．
（ｉ）該ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよび自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、または
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂを含むか、
または
（ｉｉ）ポリペプチドが（Ｃ末端からＮ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよび自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭ、ＣＨ２およびＣＨ３、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、または
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂを含む、態様１～１５のいずれか１つに記載のポリペプチド。

したがって、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を含み、このＦｃは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
１８．単一可変ドメイン（ｄＡｂ）が、同一であるか、またはｓｃＦｖが同一である、態様１６Ｂ、１６Ｄ、（ｉ）１７Ｂ、（ｉ）１７Ｄ、（ｉ）１７Ｎ、（ｉ）１７Ｓ、（ｉ）１７Ｔ、（ｉ）１７Ｕ、（ｉ）１７Ｘ、（ｉ）１７Ｙ、（ｉ）１７Ｚ、（ｉ）１７ＡＡ、（ｉｉ）１７Ｂ、（ｉｉ）１７Ｄ、（ｉｉ）１７Ｎ、（ｉｉ）１７Ｓ、（ｉｉ）１７Ｔ、（ｉｉ）１７Ｕ、（ｉｉ）１７Ｘ、（ｉｉ）１７Ｙ、（ｉｉ）１７Ｚまたは（ｉｉ）１７ＡＡに記載のポリペプチド。
１９．単一可変ドメインが異なるか、またはｓｃＦｖが異なる、態様１６Ｂ、１６Ｄ、（ｉ）１７Ｂ、（ｉ）１７Ｄ、（ｉ）１７Ｎ、（ｉ）１７Ｓ、（ｉ）１７Ｔ、（ｉ）１７Ｕ、（ｉ）１７Ｘ、（ｉ）１７Ｙ、（ｉ）１７Ｚ、（ｉ）１７ＡＡ、（ｉｉ）１７Ｂ、（ｉｉ）１７Ｄ、（ｉｉ）１７Ｎ、（ｉｉ）１７Ｓ、（ｉｉ）１７Ｔ、（ｉｉ）１７Ｕ、（ｉｉ）１７Ｘ、（ｉｉ）１７Ｙ、（ｉｉ）１７Ｚまたは（ｉｉ）１７ＡＡに記載のポリペプチド。
２０．（ｉ）第１の可変ドメインがＶＨドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＨ１ドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインと対合している抗体ＣＬ定常ドメインを含み、（ｉｉ）第１の可変ドメインがＶＨドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＬドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＬドメインと対合している抗体ＣＨ１定常ドメインを含み、（ｉｉｉ）第１の可変ドメインがＶＬドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＨ１ドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインと対合している抗体ＣＬ定常ドメインを含み、または（ｉｖ）第１の可変ドメインがＶＬドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＬドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＬドメインと対合している抗体ＣＨ１定常ドメインを含む、態様１６Ｇ、１６Ｊ、１６Ｋ、（ｉ）１７Ｈ、（ｉ）１７Ｉ、（ｉ）１７Ｌ、（ｉ）１７Ｍ、（ｉ）１７Ｏ、（ｉ）１７Ｐ、（ｉ）１７Ｑ、（ｉ）１７Ｒ、（ｉｉ）１７Ｈ、（ｉｉ）１７Ｉ、（ｉｉ）１７Ｌ、（ｉｉ）１７Ｍ、（ｉｉ）１７Ｏ、（ｉｉ）１７Ｐ、（ｉｉ）１７Ｑまたは（ｉｉ）１７Ｒに記載のポリペプチド。
２１．（ｖ）第１の可変ドメインまたはｓｃＦｖと（ｖｉ）ＳＡＭとの間に抗体Ｆｃ領域またはさらなる抗体単一可変ドメインを含み、ＦｃがＣＨ２およびＣＨ３を含む、態様１６～２０のいずれか１つに記載のポリペプチド。

このさらなる可変ドメインは、第１の単一可変ドメインとは異なってもよく、または第１の単一可変ドメインまたはｓｃＦｖの標的結合特異性とは異なる標的結合特異性を有してもよい。
２２．（ｖｉｉ）ＳＡＭと（ｖｉｉｉ）最もＣ末端の可変ドメインとの間に抗体Ｆｃ領域または抗体単一可変ドメインを含み、ＦｃがＣＨ２およびＣＨ３を含む、態様１６～２１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２３．Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体Ｆｃ領域および最もＮ末端の可変ドメインまたはｓｃＦｖを含み、ＦｃがＣＨ２およびＣＨ３を含む、態様１６～２２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２４．Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＳＡＭおよび抗体Ｆｃ領域を含み、ＦｃがＣＨ２およびＣＨ３を含む、態様１６～２３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２５．ＣＨ２が、アミノ酸配列ＣＸＸＣまたは配列番号１８０～１８２から選択されるアミノ酸配列を欠いており、任意に、アミノ酸配列の配列番号１８３～１８７を欠いている、態様１７～２４のいずれか１つに記載のポリペプチド。

例では、ＣＨ２は、本明細書に開示されるＣＨ２’である。任意に、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）任意の上部ヒンジ領域、下部ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、ポリペプチドを別の該ポリペプチドと二量体化するために機能的であるコアヒンジ領域を欠いている。任意に、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）任意の上部ヒンジ領域、下部ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＸＸＣを欠いており、Ｘは、任意のアミノ酸である（任意に、各アミノ酸Ｘは、Ｐ、ＲおよびＳから選択される）。任意に、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）配列番号１６３～１７８から選択されるアミノ酸およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＸＸＣを欠いており、Ｘは、任意のアミノ酸である（任意に、各アミノ酸Ｘは、Ｐ、ＲおよびＳから選択される）。一実施形態では、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０～１８２から選択される。実施形態では、ＣＨ２（ポリペプチド）は、配列番号１８３～１８７のアミノ酸配列を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ１ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１８３）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ２ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号１８４）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８１である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ３ ＣＨ１およびＣＨ３である。場合により、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号１８５）およびコアヒンジ領域アミノ酸配列ＣＰＲＣ（配列番号１８１）を欠いている。任意に、代替的に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号１８６）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＲＣ（配列番号１８１）を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８２である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ４ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１８７）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＳＣ（配列番号１８２）を欠いている。
２６．第１または各リンカーが、（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーであり、ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である、態様１～２５のいずれか１つに記載のポリペプチド。

例では、ｎは３である。例では、ｎは４である。例では、ｎは５である。
２７．各ドメインおよびＳＡＭが、それぞれヒトドメインおよびＳＡＭである、態様１～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２８．各可変ドメインまたはｓｃＦｖが、抗原に結合することができる、態様１～２７のいずれか１つに記載のポリペプチド。

例では、結合は抗原に拮抗する。別の例では、結合は抗原に作動する。
２９．ポリペプチドが２つ以上の抗原、任意に、２、３または４つの異なる抗原に対する結合特異性を含む、態様１～２８のいずれか１つに記載のポリペプチド。

例えば、ポリペプチドは、少なくとも１つの抗ＣＴＬＡ－４結合ドメイン（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ）および少なくとも１つの抗４－１ＢＢ結合ドメインを含む。例えば、ポリペプチドは、少なくとも１つの抗ＣＴＬＡ－４結合ドメイン（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ）および少なくとも１つの抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメインを含む。例えば、ポリペプチドは、少なくとも１つの抗ＣＴＬＡ－４結合ドメイン（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ）および少なくとも１つの抗ＰＤ－１結合ドメインを含む。例えば、ポリペプチドは、少なくとも１つの抗ＴＮＦアルファ結合ドメイン（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ）および少なくとも１つの抗ＩＬ－１７Ａ結合ドメインを含む。

例えば、ポリペプチドは、ＳＡＭのＮ末端にある第１の抗原結合ドメイン（例えば、該ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ可変領域）およびＳＡＭのＣ末端にある第２の抗原結合ドメイン（例えば、該ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ可変領域）を含む。例では、ポリペプチドは、ＳＡＭのＮ末端にある（例えば、また第１のドメインのＮ末端、または第１のドメインとＳＡＭとの間）第３の抗原結合ドメイン（例えば、該ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ可変領域）を含み、任意に、ポリペプチドは、ＳＡＭのＣ末端にある（例えば、また第２のドメインのＣ末端、または第２のドメインとＳＡＭとの間）第４の抗原結合ドメイン（例えば、該ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはＦａｂ可変領域）を含む。

実施形態では、第１のドメインは、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができ、第２の結合部位は、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。例では、ドメインは同じ抗原結合特異性を有している。例では、ドメインは同じエピトープ結合特異性を有すしている。例では、ドメインは異なる抗原結合特異性を有している。例では、ドメインは、同じ抗原に対して異なるエピトープ結合特異性を有している。例では、ドメインはＴＮＦアルファに結合する。例では、ドメインはＣＤ２０に結合する。例では、ドメインはＰＤ－１に結合する。例では、ドメインはＰＤ－Ｌ１に結合する。例では、ドメインはＣＴＬＡ－４に結合する。

実施形態では、第１のドメインは、４－１ＢＢ、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、第２の結合部位は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができる。実施形態では、第２のドメインは、４－１ＢＢ、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、第１の結合部位は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができる。例では、第１のドメインは、４－１ＢＢに特異的に結合することができ、第２の結合部位は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができ、第３の結合部位は、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができ、第４の結合部位は、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。例では、第１のドメインは、ＰＤ－１に特異的に結合することができ、第２の結合部位は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができ、第３の結合部位は、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができ、第４の結合部位は、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。例では、第１のドメインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、第２の結合部位は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができ、第３の結合部位は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的に結合することができ、第４の結合部位は、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。

実施形態では、第１のドメインは、ＴＮＦアルファに特異的に結合することができ、第２の結合部位は、ＩＬ－１７（例えば、ＩＬ－１７Ａ）に特異的に結合することができる。実施形態では、第２のドメインは、ＴＮＦアルファに特異的に結合することができ、第１の結合部位は、ＩＬ－１７（例えば、ＩＬ－１７Ａ）に特異的に結合することができる。

例では、ポリペプチドは、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１を含む。例では、サイトカインは、短縮型サイトカイン、例えば、短縮型ＩＬ－２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１である。例では、サイトカインは、ＳＡＭのＣ末端（例えば、抗原結合ドメインの最もＣ末端のＣ末端）である。例では、サイトカインは、ＳＡＭのＮ末端（例えば、抗原結合ドメインの最もＮ末端のＮ末端）である。これらの例の一実施形態では、第１のドメインは、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。これらの例の実施形態では、第１のドメインは、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができる。これらの例の一実施形態では、第２のドメインは、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。これらの例の実施形態では、第２のドメインは、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができる。これらの例の一実施形態では、第３のドメインは、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。これらの例の実施形態では、第３のドメインは、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができる。これらの例の一実施形態では、第４のドメインは、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＬＡＧ３およびＴＩＭ－３から選択される）に特異的に結合することができる。これらの例の実施形態では、第４のドメインは、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に特異的に結合することができる。
３０．態様１～２９のいずれか１つに記載のポリペプチドの多量体（任意に四量体）。

例では、多量体はポリペプチド二量体である。

例では、多量体はポリペプチド三量体である。

例では、多量体はポリペプチド四量体である。
３１．真核細胞のグリコシル化を含む、態様１～３０のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは多量体。
３２．細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞である、態様３１に記載のポリペプチドまたは多量体。
３３．医療用の、態様１～３２のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは多量体。
３４．態様１～３３のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは多量体を含む薬学的組成物。
３５．態様１～２９および３１～３３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする核酸。
３６．態様３５の核酸を含む真核細胞またはベクター。
３７．抗原の複数のコピーを結合する方法であって、方法が、コピーを態様３０～３３のいずれか１つに記載の多量体と組み合わせることを含み、コピーが、多量体のポリペプチドによって結合されており、任意に、方法が、抗原コピーに結合した多量体を単離することを含む、方法。
３８．方法が、サンプル中の物質の存在を検出するための診断方法であり、物質が抗原を含み、方法がサンプル（例えば、体液、食品、食品成分、飲料、飲料成分、土壌または法医学サンプル）を提供することと、サンプルを態様３０～３３のいずれか１つに記載の多量体と混合することと、サンプル中の抗原への多量体の結合を検出することと、を含む、態様３７に記載の方法。

例では、体液は、血液、唾液、精液、または尿のサンプルである。

例では、この方法は、サンプルが以前に得られた対象における妊娠検査または疾患または状態を診断するためのものである。
３９．ヒトまたは動物の対象における疾患もしくは状態のリスクを治療または低減する方法であって、方法が、態様３４に記載の組成物を、対象に投与することを含み、組成物に含まれる多量体が、対象の標的抗原に特異的に結合し、該結合が、リスクの治療または低減を媒介する、方法。
４０．抗原が、免疫チェックポイントまたはＴ細胞共刺激抗原（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１もしくはＣＴＬＡ４）であるか、または抗原が、ＴＮＦアルファもしくはＩＬ－１７Ａである、態様３９に記載の方法。
４１．抗原が対象の疾患または状態を媒介し、任意に、結合が抗原に拮抗する、態様３９に記載の方法。

別の実施形態では、結合は抗原に作動する。
４２．態様１～２９および３１～３３のいずれか１つに記載の複数のポリペプチドを含む組成物であって、ポリペプチドの少なくとも９０％が、該ポリペプチドの四量体によって構成されている、組成物。

任意に、ポリペプチドの少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％は、該ポリペプチドの四量体によって構成されている。
４３．ポリペプチドの少なくとも９８％が、該ポリペプチドの四量体によって構成されている、態様４２に記載の組成物。
４４．残りの（すなわち、ポリペプチドの１００％に対する残部）ポリペプチドが、ポリペプチド単量体、二量体および三量体のうちの１つ以上から選択される、態様４２または４３に記載の組成物。
４５．態様１～２９および３１～３３のいずれか１つに記載の複数のポリペプチドを含む組成物（任意に、態様４２～４４のいずれか１つに記載の組成物）を産生する方法であって、方法が、態様３４に記載の真核宿主細胞を提供することと、宿主細胞を培養することと、ポリペプチドの四量体の細胞からの発現および分泌を可能にすることと、任意に、四量体を単離または精製することと、を含む、方法。
これらの態様のいずれかは、本明細書の他の開示、例えば、項目またはパラグラフのいずれかと組み合わせることができる。

ＦＣを含むポリペプチドおよび多量体
本発明はまた、抗体Ｆｃ領域を含むポリペプチドおよび多量体を提供する。これは、例えば、ヒトまたは動物などの対象に投与されたときに、ＦｃＲｎリサイクルを利用するのに有用であり、これは、インビボでの望ましい半減期に寄与し得る。Ｆｃ領域は、Ｆｃエフェクター機能を提供するのにも有用である。例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃは、多量体ががんを治療するために使用される場合、または例えばＡＤＣＣによって細胞殺傷が望まれる場合に有用であり得る。

この目的のために、本発明は以下を提供する：
抗体Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、Ｆｃ領域が、抗体ＣＨ２および抗体ＣＨ３を含む、抗体Ｆｃ領域と、自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）とを含むポリペプチドを提供し、ＣＨ２は、抗体ヒンジ配列を含み、コアヒンジ領域を欠いている。

一実施形態では、ポリペプチドは、エピトープ結合部位、例えば、エピトープに結合する抗体ＶＨ単一可変ドメインまたは抗体ＶＨ／ＶＬ対を含む。追加的または代替的に、ポリペプチドは、抗体と同族であるエピトープを含む。これは、例えば、ポリペプチドが抗体のコピーに結合する多量体を形成することができるので、例えば、多量体が抗体を含むサンプルと接触されるとき（例えば、本明細書に開示されるような医療用）に有用である。このようにして、例えば、多量体は、サンプル中の抗体の存在および／または量（または相対量）を決定するための診断または試験の方法で使用することができる。多量体はエピトープの複数のコピー（多量体に酔って構成される各ポリペプチドに少なくとも１つ）を提供するため、これは、サンプル中に比較的少量存在し得る抗体の多くのコピーに結合するのに有用であり、それによって、抗体の存在を示す陽性シグナルを検出（または増幅）の機会を向上させる効果を有する。したがって、アッセイの感度を高めて、サンプル中の比較的まれな抗体を検出できるようにすることができる。

任意に、ＣＨ２は、（ｉ）コアヒンジＣＸＸＣアミノ酸配列であって、式中、Ｘが、任意のアミノ酸であるか、もしくは各アミノ酸Ｘが、Ｐ、ＲおよびＳから選択される、コアヒンジＣＸＸＣアミノ酸配列を欠いており、ならびに／または（ｉｉ）上部ヒンジアミノ酸配列を欠いている。ＣＨ２では、（ｉ）コアヒンジＣＸＸＣアミノ酸配列であって、式中、Ｘが、任意のアミノ酸であるか、もしくは各アミノ酸Ｘが、Ｐ、ＲおよびＳから選択される、コアヒンジＣＸＸＣアミノ酸配列を欠いており、Ｆｃは、別のＦｃと直接対合しない。

任意に、ＣＸＸＣ配列は、配列番号１８０～１８２から選択されるか、または、ＣＨ２は、配列番号１８３～１８７のアミノ酸配列を欠いている。

任意に、ＣＨ２は、下記を
Ａ．アミノ酸配列ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１６３）、またはＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１６４）、
Ｂ．アミノ酸配列ＡＰＰＶＡＧＰＳＶ（配列番号：１６５）、またはＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶ（配列番号：１６６）、
Ｃ．アミノ酸配列ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７５）、またはＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７６）、
Ｄ．アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１６７、または１６８）（括弧で囲まれたＰは任意である）、
Ｅ．アミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥ［Ｐ］ＡＰＰＶＡＧＰＳＶ（配列番号：１６９、または１７０）（括弧で囲まれたＰは任意である）、
Ｆ．アミノ酸配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７１、または１７２）（括弧で囲まれたＰは任意である）、
Ｇ．アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７３、または１７４）（括弧で囲まれたＰは任意である）、あるいは
Ｈ．アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７７、または１７８）（括弧で囲まれたＰは任意である）を含む。

任意に、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）任意の上部ヒンジ領域、下部ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、ポリペプチドを別の該ポリペプチドと二量体化するために機能的であるコアヒンジ領域を欠いている。任意に、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）任意の上部ヒンジ領域、下部ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＸＸＣを欠いており、Ｘは、任意のアミノ酸である（任意に、各アミノ酸Ｘは、Ｐ、ＲおよびＳから選択される）。任意に、ＣＨ２は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）配列番号１６３～１７８から選択されるアミノ酸およびＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＸＸＣを欠いており、Ｘは、任意のアミノ酸である（任意に、各アミノ酸Ｘは、Ｐ、ＲおよびＳから選択される）。一実施形態では、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０～１８２から選択される。実施形態では、ＣＨ２（ポリペプチド）は、配列番号１８３～１８７のアミノ酸配列を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ１ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１８３）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８０である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ２ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号１８４）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１８０）を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８１である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ３ ＣＨ１およびＣＨ３である。場合により、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号１８５）およびコアヒンジ領域アミノ酸配列ＣＰＲＣ（配列番号１８１）を欠いている。任意に、代替的に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号１８６）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＲＣ（配列番号１８１）を欠いている。実施形態では、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであり、コアヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号１８２である。任意に、ポリペプチドに存在するいずれかのＣＨ１およびＣＨ３は、それぞれヒトＩｇＧ４ ＣＨ１およびＣＨ３である。任意に、ＣＨ２（およびポリペプチド）は、上部ヒンジ領域のアミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１８７）およびコアヒンジ領域のアミノ酸配列ＣＰＳＣ（配列番号１８２）を欠いている。

任意に、ポリペプチドは、コア領域－ＣＨ２－ＣＨ３を欠く抗体ＣＨ１－ヒンジ配列を含む。

任意に、ＣＨ２およびＣＨ３は、
Ａ．ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、
Ｂ．ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、
Ｃ．ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、または
Ｄ．ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、を含む。

任意に、ＣＨ２およびＣＨ３は、
（ａ）ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにヒトＩｇＧ１ヒンジ配列およびヒンジ領域であるヒンジ配列およびコアヒンジ領域、
（ｂ）ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにヒトＩｇＧ２ヒンジ配列およびヒンジ領域であるヒンジ配列およびコアヒンジ領域、
（ｃ）ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにヒトＩｇＧ３１ヒンジ配列およびヒンジ領域であるヒンジ配列およびコアヒンジ領域、または
（ｄ）ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにヒトＩｇＧ４ヒンジ配列およびヒンジ領域であるヒンジ配列およびコアヒンジ領域を含む。

任意に、
Ａ．ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含み、コアヒンジｉ領域アミノ酸配列が、配列番号１８０であり、任意に、ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１８３）を欠いているか、
Ｂ．ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインを含み、コアヒンジ領域アミノ酸配列が、配列番号１８０であり、任意に、ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号１８４）を欠いているか、
Ｃ．ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインを含み、コアヒンジ領域アミノ酸配列が、配列番号１８１であり、任意に、ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号：１８５）もしくは上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号：１８６）を欠いているか、または
Ｄ．ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであり、該コアヒンジ領域アミノ酸配列が、配列番号１８２であり、任意に、ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１８７）を欠いている。

任意に、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）該Ｆｃ領域および該ＳＡＭを含み、Ｆｃ領域は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）ヒンジ配列、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。

任意に、ポリペプチドは、１つ以上のエピトープ結合部位、例えば、第１のエピトープに特異的に結合することができる抗体可変ドメインを含む。任意に、第１のエピトープは、ＡＢＣＦ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、アグレカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＷＩ、ＡＩＧ１、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、ＡＩＹＩＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣ１、ＡＲ、ＡＺＧＰ１（ジンク－ａ－糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧ１、ＢＡＩ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）、ＢｌｙＳ、ＢＭＰｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲＩＡ、ＢＭＰＲＩＢ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧ１（プレクチン）、ＢＲＣＡ１、ＣＩ９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶ１、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬ１（１－３０９）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ－２）、ＳＬＣ、ｅｘｏｄｕｓ－２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２Ｉエオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－ｌａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－ｌｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－１ＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ－２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２ＩＷａｐｌ／Ｃｉｐｌ）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）、ＣＤＫＮＩＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐｌ６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲ１、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン－７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラステリン）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＮＲ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、ＣＲＰ、ＣＳＦｌ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢｌ（ｂ－カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｉ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯｌ）、ＣＸＣＬＩＯ（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１（ｌ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８ＩＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ ＩＳＴＲＬ３３ Ｉ Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬ１、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡＩ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、ＥＮ０１、ＥＮ０２、ＥＮ０３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）、ＦＵ１２５８４、ＦＵ２５５３０、ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン）、ＦＬＴｌ、ＦＯＳ、ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ－Ｉ）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６５Ｔ、ＧＡＴＡ３、ＧＤＦ５、ＧＦＩ１、ＧＧＴ１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＮＡＳ１、ＧＮＲＨｌ、ＧＰＲ２（ＣＣＲＩＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ））、ＧＳＴＰｌ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ４、ＥＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ヒスタミンならびにヒスタミン受容体、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸ１、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、１Ｄ２、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮガンマ、ＴＦＮＷ１、ＩＧＢＰ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ－１、ＩＬ１０、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ－１２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、１Ｌ１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、１Ｌ１４、１Ｌ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１６、１Ｌ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、１Ｌ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、１Ｌ１９、ＩＬＩＡ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２ ＩＬ１ＲＮ、１Ｌ２、１Ｌ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、１Ｌ２２、１Ｌ２２Ｒ、１Ｌ２２ＲＡ２、１Ｌ２３、１Ｌ２４、１Ｌ２５、１Ｌ２６、１Ｌ２７、１Ｌ２８Ａ、１Ｌ２８Ｂ、１Ｌ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、１Ｌ３、１Ｌ３０、ＩＬ３ＲＡ、１Ｌ４、ＩＬ４Ｒ、１Ｌ５、ＩＬ５ＲＡ、１Ｌ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、１Ｌ７、ＴＬ７Ｒ、１Ｌ８、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、１Ｌ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、１ＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩ１、ＫＤＲ、ＭＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣＢｏｘＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異型ＩＩケラチン）、ＬＡＭＡ５、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）、ＭＤＫ、ＭＩＢ１、ミドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＰ－２、ＭＫ１６７（Ｋｉ－６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン－ｉｆｉ）、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ－ｐ７５、ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ、ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢ１、ＮＲＯＢ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺ１、ＯＰＲＤ１、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴＩ、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣ１、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲ１、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（ｐ２ＩＲａｃ２）、ＲＡＲＢ、ＲＧＳ１、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）、ＲＯＢ０２、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロブリン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロブリン１）、ＳＣＹＥ１（血管内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＩＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＴ－ｉ）、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＨＢＧ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰｌ、ＳＰＲＲＩＢ（Ｓｐｒｉ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢｌ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰＩＯ、ＴＤＧＦ１、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン－１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ－ｉ）、Ｔ］ＭＰ３、組織因子、ＴＬＲＩＯ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＦ、ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦＩＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（０Ｘ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－ｌＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼｌｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＬＡ－４
、ＸＣＬ１（リンフォテクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－ｌｂ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＹＹ１、およびＺＦＰＭ２からなる群から選択される抗原（例えば、ヒト抗原）によって構成される。任意に、第２のエピトープ（以下で論じられるように）は、第１のエピトープと同じ抗原によって構成されている（例えば、同じ抗原分子によって構成されている）。別の例では、第２の抗原は、該グループによって構成される。例では、第１および第２のエピトープは、該グループ群から選択される異なる抗原によって構成されている。

例えば、ポリペプチドは、１、２、３、４または５個のエピトープ結合部位を有する（任意に、ポリペプチドが、異なるエピトープに結合する２つ以上の結合部位（例えば、単一の可変ドメイン）を含むか、またはポリペプチド結合部位が同一である）。一実施形態では、ＳＡＭはＴＤ（例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤ）であり、ポリペプチドは、３つの部位などの、または４つの部位などの、２、３または４つの結合部位を有する。好ましくは、ポリペプチドは３つの結合部位を有する。好ましくは、ポリペプチドは４つの結合部位を有する。例えば、結合部位はそれぞれＴＮＦアルファに結合する（例えば、結合部位が同一である、例えば、同一の抗体単一可変ドメインである）。

例では、多量体は、抗ＰＤ－Ｌ１結合部位（例えば、ｄＡｂ）の４つのコピーおよび抗４－１ＢＢ結合部位（例えば、ｄＡｂ）の４つのコピーを含む八価の二重特異性多量体である。

例では、多量体は、抗ＰＤ－Ｌ１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＰＤ－Ｌ１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＰＤ－Ｌ１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＰＤ－Ｌ１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。例では、抗ＰＤ－Ｌ１結合部位は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合するアベルマブまたはアテゾリズマブ結合部位を含む。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

例では、多量体は、抗ＰＤ－１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＰＤ－１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＰＤ－１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＰＤ－１結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。例では、抗ＰＤ－１結合部位は、ＰＤ－１に特異的に結合するニボルマブまたはペムブロリズマブ結合部位を含む。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

例では、多量体は、抗ＤＲ５（細胞死受容体５）結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＤＲ５結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＤＲ５結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＤＲ５結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

例では、多量体は、抗ＯＸ４０またはＯＸ４０Ｌ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＯＸ４０またはＯＸ４０Ｌ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＯＸ４０またはＯＸ４０Ｌ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＯＸ４０またはＯＸ４０Ｌ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

例では、多量体は、抗糖質コルチコイド誘発性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＧＩＴＲ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＧＩＴＲ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＧＩＴＲ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

例では、多量体は、抗抗体カッパ軽鎖（ＫＬＣ）結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＫＬＣ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＫＬＣ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＫＬＣ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

例では、多量体は、抗ＶＥＧＦ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＶＥＧＦ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＶＥＧＦ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＶＥＧＦ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。例では、抗ＶＥＧＦ結合部位は、ＶＥＧＦに特異的に結合するＶＥＧＦ受容体ドメイン（例えば、ヒトｆｌｔ（例えば、ｆｌｔ－１）またはＫＤＲのＶＥＧＦ結合部位、例えば、ＶＥＧＦＲ１からのＩｇドメイン２またはＶＥＧＦＲ２からのＩｇドメイン３））を含む。例では、抗ＶＥＧＦ結合部位は、ＶＥＧＦに特異的に結合するアフリベルセプト、ベバシズマブまたはラニビズマブ結合部位を含む。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

例では、多量体は、抗ＴＮＦα結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＴＮＦα結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む四価多量体である。例では、多量体は、抗ＴＮＦアルファ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む八価多量体である。例では、多量体は、抗ＴＮＦアルファ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１２価多量体である。例では、多量体は、抗ＴＮＦアルファ結合部位（例えば、ｄＡｂ）のコピーを含む１６価多量体である。好ましくは、これらの例では、ＳＡＭドメインは、ＴＤ、例えば、ヒトｐ５３ ＴＤなどのｐ５３ ＴＤである。四量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の１つのコピーを含む。八量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の２つのコピーを含む。１２量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の３つのコピーを含む。１６量体の場合、各ポリペプチドは結合部位の４つのコピーを含む。

任意に、可変ドメインは、抗体単一可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬから選択されるか、または、ドメインは、ｓｃＦｖによって構成されている。任意に、ドメインは、該第１のエピトープに結合する抗体ＶＨ／ＶＬ対により構成されている。例では、本明細書のエピトープ結合は、本明細書で定義されるような特異的結合である。

任意に、ポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端の方向に）
Ａ．可変ドメイン、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｂ．Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび可変ドメイン、
Ｃ．可変ドメイン、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｄ．ＳＡＭ、可変ドメインおよびＦｃ領域、または
Ｅ．ＳＡＭ、Ｆｃ領域および可変ドメインを含む。

任意に、ポリペプチドは、ＳＡＭのＮ末端またはＣ末端に第２の抗体可変ドメインを含み、第２の可変ドメインが、第２のエピトープに特異的に結合することができ、第１および第２のエピトープが、同一または異なる。

任意に、ＳＡＭは、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）であり、任意に、ＴＤが、ｐ５３、ｐ６３もしくはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログであるか、あるいは、該ＴＤが、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログであるか、あるいは、ＴＤが、配列番号１０または１２６と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

任意に、
（ｉ）ポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
Ａ．第１の抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、任意のリンカー、および該ＳＡＭ、
Ｂ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第２の抗体単一可変ドメイン、
Ｃ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカーおよび該ＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｆ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
Ｇ．第１の抗体可変ドメイン、任意の第１のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカー、および該ＳＡＭ、
Ｈ．該ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
Ｉ．該ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｊ．該ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体可変ドメイン、もしくは
Ｋ．該ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体可変ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体定常ドメイン、を含むか、
または
（ｉｉ）ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、．
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、もしくは
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、を含むか、
または
（ｉｉｉ）ポリペプチドは（Ｃ末端からＮ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域および該ＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、Ｆｃ領域および該ＳＡＭ、．
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、Ｆｃ領域、およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、もしくは
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、を含む。

任意に、本明細書の任意の単一の可変ドメインまたはｄＡｂは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）またはラクダＶＨＨ（例えば、ヒト化ラクダＶＨＨ）である。

一実施形態では、多量体の各ポリペプチドは、さらなるポリペプチドのコピーと対合しており、さらなるポリペプチドは、第１のポリペプチドのＦｃと対合する抗体軽鎖定常領域（例えば、ＣκまたはＣλ）を含む。例では、第１のポリペプチドは抗体ＶＨドメインを含み、さらなるポリペプチドは抗体ＶＬドメイン（例えば、ＶκまたはＶλ）を含み、ＶＨとＶＬとは、エピトープ結合部位を形成する。このように、多量体は、以下の実施例に例示されるように、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）またはアベルマブ（バベンシオ）結合部位の複数のコピーを含むような、Ｆａｂ様構造の多量体であり得る。そのような多量体中のすべての抗体ドメインは、例えば、ヒトで有ってもよく、任意に、ＳＡＭはヒトドメインである。ＳＡＭがＴＤ（例えば、ｐ５３ ＴＤ）である場合、多量体は、ＶＨ／ＶＬエピトープ結合部位の四量体を含む。第１のポリペプチドまたはさらなるポリペプチドは、例えば、多量体が八価である第２のエピトープ結合部位を含み得る。８つの結合部位が同じ抗原に結合する可能性がある場合、あるいは、４つのＶＨ／ＶＬ結合部位は第１の抗原に結合し、他の４つの結合部位は第２の抗原に結合し、ここで抗原は異なる。したがって、多量体は八価および二重特異性であり得る。第１のまたはさらなるポリペプチドがさらに別の抗原結合部位を含む場合、多量体は１２価であり得る（および、例えば、抗原結合について単一特異性、二重特異性または三重特異性である）。第１のまたはさらなるポリペプチドがさらに別の抗原結合部位を含む場合、多量体は１６価であり得る（および、例えば、抗原結合について単一特異性、二重特異性、三重特異性または四重特異性である）。

本発明はさらに以下を提供する：－
本発明によるのポリペプチドの多量体（任意に四量体）であって、任意に、多量体が、医療用である、多量体。例では、本明細書の医療用とは、がん、自己免疫疾患または状態、もしくは本明細書に開示される任意の他の疾患または状態の治療または予防である。
複数の抗体Ｆｃ領域の多量体であって、各Ｆｃが、それぞれのポリペプチドによって構成され、別のＦｃ領域と対合せず、任意に、多量体が医療用である、多量体。任意選択で、各ポリペプチドは、本明細書に開示されるようなエピトープ結合ドメインまたは部位を含む。
本発明のポリペプチドまたは多量体を含む薬学的組成物。
本発明のポリペプチドをコードする核酸であって、任意に、核酸が、真核細胞またはベクターによって構成される、核酸。
抗原の複数のコピーを結合する方法であって、方法が、コピーを本発明の組成物と組み合わせることを含み、コピーが、多量体のポリペプチドによって結合されており、任意に、方法が、抗原コピーに結合した多量体を単離することを含む、方法。例では、多量体は、抗原のコピーを含むサンプルと接触され、抗原のコピーは、多量体に結合することによってサンプル中に封鎖される。例えば、多量体は、ヒトまたは動物の患者に投与され（または環境が多量体に曝露される）、抗原コピーは、ヒト（例えば、該医療用に）、動物（例えば、該医療用に）または環境に封鎖される。例えば、環境は、例えば、抗原が環境汚染物質または汚染物によって構成される場合などの環境修復のために、土壌、水源、水路または工業用流体によって構成される。例では、この方法は、サンプルを精製するため、またはサンプルに含まれる抗原を単離するためのものである。
ヒトまたは動物の対象における疾患もしくは状態のリスクを治療または低減する方法であって、方法が、本発明の組成物を、対象に投与することを含み、組成物に含まれる多量体が、対象の標的抗原に特異的に結合し、結合が、疾患もしくは状態のリスクの治療または低減を媒介する、方法。
ＳＡＭが自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）である場合の、本発明の複数のポリペプチドを含む組成物を生成する方法であって、方法が、本発明による真核宿主細胞を提供することと、宿主細胞を培養することと、ポリペプチドの四量体の細胞からの発現および分泌を可能にすることと、任意に、四量体を単離または精製することと、を含む、方法。

パラグラフ：
本発明は、以下のパラグラフを提供する。
１．
（ａ）抗体Ｆｃ領域であって、Ｆｃ領域が、抗体ＣＨ２ドメインおよび抗体ＣＨ３ドメインを含む、抗体Ｆｃ領域と、
（ｂ）自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）と、を含む、ポリペプチド（任意に、本明細書の任意のポリペプチド）であって、
ＣＨ２が、コアヒンジＣＸＸＣアミノ酸配列を欠いており、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である、ポリペプチド。
２．各アミノ酸Ｘが、Ｐ、ＲおよびＳから選択される、パラグラフ１のポリペプチド。
３．ＣＨ２が、完全な上部ヒンジ配列を欠いている、パラグラフ１または２に記載のポリペプチド。
４．ＣＨ２が、
（ａ）ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、
（ｂ）ＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列、
（ｃ）ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、またはＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列を含む、パラグラフ１～３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
５．ＣＨ２およびＣＨ３が、
（ａ）ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、
（ｃ）ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、または
（ｄ）ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、パラグラフ１～４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
６．ＣＨ２がＣＰＰＣ配列を欠いている、パラグラフ５（ａ）または（ｂ）のポリペプチド、あるいはＣＨ２がＣＰＲＣ配列を欠いている、パラグラフ５（ｃ）のポリペプチド、あるいは、ＣＨ２がＣＰＳＣ配列を欠いている、パラグラフ５（ｄ）のポリペプチド。
７．ＣＨ２が、
（ａ）ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、
（ｂ）ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、括弧で囲まれたＰは任意であり、
（ｃ）ＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列、
（ｄ）ＥＲＫＣＣＶＥ［Ｐ］ＡＰＰＶＡＧＰＳＶアミノ酸配列を含み、括弧で囲まれたＰは任意であり、
（ｅ）ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、括弧で囲まれたＰは任意であり、
（ｆ）ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、括弧で囲まれたＰは任意であり、
（ｇ）ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、または
（ｈ）ＥＳＫＹＧＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶアミノ酸配列、括弧で囲まれたＰは任意である、を含む、パラグラフ１～４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
８．ＣＨ２が、本明細書に開示されるＣＸＸＣおよび配列番号１８０～１８２から選択される配列を欠いている、パラグラフ１～７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
９．ポリペプチドが、第１のエピトープに特異的に結合することができる抗体可変ドメインを含む、パラグラフ１～８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１０．可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬから選択されるか、または、ドメインが、ｓｃＦｖによって構成されている、パラグラフ９に記載のポリペプチド。
１１．Ｆｃ領域が、ＳＡＭの３’にある、パラグラフ１～１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１２．
（ａ）可変ドメインが、ＳＡＭの５’にあり、およびＦｃ領域が、ＳＡＭの３’にあり、
（ｂ）可変ドメインが、ＳＡＭの３’にあり、およびＦｃ領域が、ＳＡＭの５’にあり、
（ｃ）可変ドメインおよびＦｃ領域が、ＳＡＭの５’にあり、または
（ｄ）可変ドメインおよびＦｃ領域が、ＳＡＭの３’にある、パラグラフ９、１０または１１に記載のポリペプチド。
１３．ＳＡＭの５’または３’の第２の可変ドメインを含み、第２の可変ドメインが、第２のエピトープに特異的に結合することができ、第１および第２のエピトープが、同一または異なる、パラグラフ１２に記載のポリペプチド。
１４．エピトープが同じ抗原の異なるエピトープであるか、または異なる抗原のエピトープである、パラグラフ１３に記載のポリペプチド。
１５．第２の可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬから選択されるか、または、ドメインが、ｓｃＦｖによって構成されている、パラグラフ１３または１４に記載のポリペプチド。
１６．第２の可変ドメインが、抗体単一可変ドメインまたは抗体定常ドメインである、パラグラフ１５に記載のポリペプチド。
１７．ＳＡＭが、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）である、パラグラフ１～１６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１８．ＴＤが、ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログであるか、または、ＴＤが、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログである、パラグラフ１７に記載のポリペプチド。
１９．ＴＤが、配列番号１０または１２６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、パラグラフ１７または１８に記載のポリペプチド。
２０．抗体ＣＨ１定常ドメイン、任意にＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、ＣＨ２およびＣＨ３が、該Ｆｃ領域によって構成される、パラグラフ１～１９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２１．ポリペプチド（第１のポリペプチド）が、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
Ａ．第１の抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、任意のリンカー、および該ＳＡＭ、
Ｂ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第２の抗体単一可変ドメイン、
Ｃ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカーおよび該ＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｆ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、該ＳＡＭおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
Ｇ．第１の抗体可変ドメイン、任意の第１のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカー、および該ＳＡＭ、
Ｈ．該ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
Ｉ．該ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｊ．該ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体可変ドメイン、もしくは
Ｋ．該ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体可変ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体定常ドメイン、を含むか、またはこれらからなる、パラグラフ１～２０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２２．
（ｉ）ポリペプチドが（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよび自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）、
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、．
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、もしくは
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、を含むか、
または
（ｉｉ）ポリペプチドが（Ｃ末端からＮ末端の方向に）、
Ａ．ｄＡｂおよび自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）、
Ｂ．第１のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｃ．第１のｓｃＦｖおよびＳＡＭ、
Ｄ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
Ｅ．第１のｓｃＦｖ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｆ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｇ．第１のｓｃＦｖ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、．
Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、Ｆｃ領域、およびＳＡＭ、
Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｊ．ｄＡｂ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｋ．ｓｃＦｖ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよびＳＡＭ、
Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１およびＳＡＭ、
Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよびＳＡＭ、
Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
Ｖ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
Ｗ．第１のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域およびＳＡＭ、
Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、もしくは
ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、Ｆｃ領域、ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、を含む、パラグラフ１～２０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２３．単一可変ドメイン（ｄＡｂ）が、同一であるか、またはｓｃＦｖが同一である、パラグラフ２１Ｂ、２１Ｄ、（ｉ）２２Ｂ、（ｉ）２２Ｄ、（ｉ）２２Ｎ、（ｉ）２２Ｓ、（ｉ）２２Ｔ、（ｉ）２２Ｕ、（ｉ）２２Ｘ、（ｉ）２２Ｙ、（ｉ）２２Ｚ、（ｉ）２２ＡＡ、（ｉｉ）２２Ｂ、（ｉｉ）２２Ｄ、（ｉｉ）２２Ｎ、（ｉｉ）２２Ｓ、（ｉｉ）２２Ｔ、（ｉｉ）２２Ｕ、（ｉｉ）２２Ｘ、（ｉｉ）２２Ｙ、（ｉｉ）２２Ｚまたは（ｉｉ）２２ＡＡに記載のポリペプチド。
２４．単一可変ドメインが異なるか、またはｓｃＦｖが異なる、パラグラフ２１Ｂ、２１Ｄ、（ｉ）２２Ｂ、（ｉ）２２Ｄ、（ｉ）２２Ｎ、（ｉ）２２Ｓ、（ｉ）２２Ｔ、（ｉ）２２Ｕ、（ｉ）２２Ｘ、（ｉ）２２Ｙ、（ｉ）２２Ｚ、（ｉ）２２ＡＡ、（ｉｉ）２２Ｂ、（ｉｉ）２２Ｄ、（ｉｉ）２２Ｎ、（ｉｉ）２２Ｓ、（ｉｉ）２２Ｔ、（ｉｉ）２２Ｕ、（ｉｉ）２２Ｘ、（ｉｉ）２２Ｙ、（ｉｉ）２２Ｚまたは（ｉｉ）２２ＡＡに記載のポリペプチド。
２５．（ｉ）第１の可変ドメインがＶＨドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＨ１ドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインと対合している抗体ＣＬ定常ドメインを含み、（ｉｉ）第１の可変ドメインがＶＨドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＬドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＬドメインと対合している抗体ＣＨ１定常ドメインを含み、（ｉｉｉ）第１の可変ドメインがＶＬドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＨ１ドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインと対合している抗体ＣＬ定常ドメインを含み、または（ｉｖ）第１の可変ドメインがＶＬドメインであり、かつ第１の定常ドメインがＣＬドメインであり、任意に、ポリペプチドが第２のポリペプチドと会合しており、第２のポリペプチドが、ＣＬドメインと対合している抗体ＣＨ１定常ドメインを含む、パラグラフ２１Ｇ、２１Ｊ、２１Ｋ、（ｉ）２２Ｈ、（ｉ）２２Ｉ、（ｉ）２２Ｌ、（ｉ）２２Ｍ、（ｉ）２２Ｏ、（ｉ）２２Ｐ、（ｉ）２２Ｑ、（ｉ）２２Ｒ、（ｉｉ）２２Ｈ、（ｉｉ）２２Ｉ、（ｉｉ）２２Ｌ、（ｉｉ）２２Ｍ、（ｉｉ）２２Ｏ、（ｉｉ）２２Ｐ、（ｉｉ）２２Ｑまたは（ｉｉ）２２Ｒに記載のポリペプチド。
２６．（ｖ）第１の可変ドメインまたはｓｃＦｖと（ｖｉ）ＳＡＭとの間に抗体Ｆｃ領域または抗体単一可変ドメインを含み、ＦｃがＣＨ２およびＣＨ３を含む、パラグラフ２１～２５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２７．（ｉ）ＳＡＭと（ｉｉ）最もＣ末端の可変ドメインとの間にＦｃ領域または抗体単一可変ドメインを含むパラグラフ２１～２６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２８．Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体Ｆｃ領域および最もＮ末端の可変ドメインまたはｓｃＦｖを含む、パラグラフ２１～２７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
２９．ＳＡＭおよび抗体Ｆｃ領域をＮ末端からＣ末端の方向に含む、パラグラフ２１から２８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
３０．第１または各リンカーが、（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーであり、ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である、パラグラフ２１～２９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
３１．各ドメインおよびＳＡＭが、それぞれヒトドメインおよびＳＡＭである、パラグラフ１～３０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
３２．ポリペプチドが２つ以上の抗原、任意に、２、３または４つの異なる抗原に対する結合特異性を含む、パラグラフ１～３１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
３３．パラグラフ１～３２のいずれか１つに記載のポリペプチドの多量体（任意に四量体）。
３４．複数の抗体Ｆｃ領域の多量体であって、各Ｆｃが、それぞれのポリペプチドによって構成され、別のＦｃ領域と対合していない、多量体。
３５．多量体が、少なくとも４つのＦｃ領域を含むポリペプチド四量体である、パラグラフ３４に記載の多量体。
３６．各Ｆｃ領域が同一である、パラグラフ３４または３５に記載の多量体。
３７．各Ｆｃが、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、各ＣＨ２がパラグラフ１～３２のいずれか１つに記載されているようなＣＨ２である、パラグラフ１～３６のいずれか１つに記載の多量体。
３８．真核細胞のグリコシル化を含む、パラグラフ１～３７のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは多量体。
３９．細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣｏｓ細胞である、パラグラフ３８に記載のポリペプチドまたは多量体。
４０．医療用のためのパラグラフ１～３９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは多量体。
４１．パラグラフ１～４０のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは多量体を含む薬学的組成物。
４２．パラグラフ１～３２および３８～４０のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする核酸。
４３．パラグラフ４２に記載の核酸を含む真核細胞またはベクター。
４４．抗原の複数のコピーを結合する方法であって、方法が、コピーをパラグラフ３３～４０のいずれか１つに記載の多量体と組み合わせることを含み、コピーが、多量体のポリペプチドによって結合されており、任意に、方法が、抗原コピーに結合した多量体を単離することを含む、方法。
４５．方法が、サンプル中の物質の存在を検出するための診断方法であり、物質が抗原を含み、方法がサンプル（例えば、体液、食品、食品成分、飲料、飲料成分、土壌または法医学サンプル）を提供することと、サンプルをパラグラフ３３～４０のいずれか１つに記載の多量体と混合することと、サンプル中の抗原への多量体の結合を検出することと、を含む、パラグラフ３７に記載の方法。
４６．ヒトまたは動物の対象における疾患もしくは状態のリスクを治療または低減する方法であって、方法が、パラグラフ４１に記載の組成物を、対象に投与することを含み、組成物に含まれる多量体が、対象の標的抗原に特異的に結合し、該結合が、リスクの治療または低減を媒介する、方法。
４７．抗原が、免疫チェックポイント（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１もしくはＣＴＬＡ４）であるか、または抗原が、ＴＮＦアルファもしくはＩＬ－１７Ａである、パラグラフ４６に記載の方法。
４８．抗原が対象の疾患または状態を媒介し、任意に、結合が抗原に拮抗する、パラグラフ４６に記載の方法。
４９．パラグラフ１～３２および３８～４０のいずれか１つに記載の複数のポリペプチドを含む組成物であって、ポリペプチドの少なくとも９０％が、該ポリペプチドの四量体によって構成されている、組成物。
５０．ポリペプチドの少なくとも９８％が、該ポリペプチドの四量体によって構成されている、パラグラフ４９に記載の組成物。
５１．残りのポリペプチドが、ポリペプチド単量体、二量体および三量体のうちの１つ以上から選択される、パラグラフ４９または５０に記載の組成物。
５２．パラグラフ１～３２および３８～４０のいずれか１つに記載の複数のポリペプチドを含む組成物（任意に、パラグラフ４９～５１のいずれか１つに記載の組成物）を産生する方法であって、方法が、パラグラフ３４に記載の真核宿主細胞を提供することと、宿主細胞を培養することと、ポリペプチドの四量体の細胞からの発現および分泌を可能にすることと、任意に、四量体を単離または精製することと、を含む、方法。

概念：
ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物におけるがんを治療するための多量体を提供するために有用である。この点で、腫瘍関連抗原に結合することによって腫瘍を標的化するために、および／またはそれらの活性を調節するようにＴ細胞に結合するために、多量体を使用することが有用であり得る。例えば、多量体は、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）上の抗原に結合して、それらの活性をダウンレギュレートし得る。追加的または代替的に、多量体は、それらの活性をアップレギュレートするために、Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞に結合し得る。多量体のポリペプチドにおける抗体Ｆｃ領域の提供は、腫瘍細胞を殺傷するためのＦｃエフェクター機能および／または細胞傷害性を提供するために有利であり得る。１つの有利な構成では、本発明は、腫瘍細胞上の同じ抗原またはエピトープのいくつかのコピーに結合するために使用できる複数の同一の抗原またはエピトープ結合部位を提供する能力を利用し、それにより、多量体が任意の非標的細胞または正常細胞よりも優先的に腫瘍細胞結合する結合力効果を提供し、なぜなら、前者の表面は正常細胞よりも多くの抗原のコピーを発現するためである。一構成では、多量体が免疫チェックポイント調節剤の結合部位も含む場合である。一例では、調節因子は免疫チェックポイント阻害剤であり、結合部位は阻害剤に拮抗する。これは、例えば、阻害剤がＴｅｆｆ細胞によって発現される場合、多量体によって標的とされる腫瘍細胞の近くでＴｅｆｆ活性をアップレギュレートするために（例えば、腫瘍細胞にＴＡＡを結合させることによって）有用である。別の例では、調節因子は免疫チェックポイント刺激剤であり、結合部位は阻害剤に作動する。これは、例えば、阻害剤がＴｅｆｆ細胞によって発現される場合、多量体によって標的とされる腫瘍細胞の近くでＴｅｆｆ活性をアップレギュレートするために（例えば、腫瘍細胞にＴＡＡを結合させることによって）有用である。したがって、Ｔ細胞活性のアップレギュレーションは、非標的（例えば、正常または非がん性）細胞の近くではなく、腫瘍細胞の近くで刺激され得る。この目的のために、本発明は以下の概念を提供する。
１．自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）、第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位を含むポリペプチドであって、第１の部位が、第１の抗原もしくはエピトープに特異的に結合し、第２の結合部位が、第２の抗原もしくはエピトープに特異的に結合し、各抗原もしくはエピトープが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはエピトープ、または免疫チェックポイント調節因子（例えば、阻害剤）抗原もしくはエピトープである、ポリペプチド。
２．第１の抗原が、ＴＡＡであり、第２の抗原が、免疫チェックポイント調節因子（例えば、阻害剤）である、概念１に記載のポリペプチド。
３．第１の抗原が、ＴＡＡであり、第２の抗原が、ＴＡＡである、概念１に記載のポリペプチド。
４．第１の抗原が、免疫チェックポイント阻害剤であり、第２の抗原が、免疫チェックポイント調節因子（例えば、阻害剤）である、概念１に記載のポリペプチド。
５．結合部位が、同じ抗原の同じエピトープに特異的に結合することができる、概念３または４に記載のポリペプチド。
６．結合部位が、同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる、概念３または４に記載のポリペプチド。
７．第１の抗原が、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＡＧＥ Ａ３、ＧＤ２、ＣＥＡ、Ｍｅｌａｎ ａ／ＭＡＲＴ１、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、ＰＳＣＡ、ＰＡＸ５、ＬＣＫ、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＭＡＤ ＣＴ－２、ＰＤＧＦＲ－ベータ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＮＹ－ＢＲ－１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ－１、ＳＴｎ、ＰＡＰおよびＢＣＭＡから選択される、概念１～６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
８．第２の抗原が、ＰＤＬ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＲＰａ、ＣＤ４７、ＣＤ１６０、ＣＤ１５５、ＩＤＯ、ＣＥＡＣＡＭ１、２Ｂ４、ＣＤ４８およびＴＩＧＩＴから選択される、概念１～７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
９．ポリペプチドが、第３の抗原またはエピトープに特異的に結合することができる第３の抗原結合部位を含む、概念１～８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１０．第３の抗原が、ＴＡＡである、概念９に記載のポリペプチド。
１１．第３の抗原が、免疫チェックポイント調節因子（例えば、阻害剤）である、概念９に記載のポリペプチド。
１２．第３の抗原が、第１または第２の抗原と同じである、概念９～１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１３．第３の抗原が、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ｅ）またはＣＤ２８である、概念９～１２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１４．ポリペプチドが、第４の抗原もしくはエピトープに特異的に結合することができる第４の抗体結合部位を含む、概念９～１３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
１５．第４の抗原がＴＡＡである、概念１４に記載のポリペプチド。
１６．第４の抗原が、免疫チェックポイント調節因子（例えば、阻害剤）である、概念１４に記載のポリペプチド。
１７．ポリペプチドが、本明細書に開示されるいずれかのポリペプチドによるものである、概念１～１６のいずれか１つに記載のポリペプチド。

例では、本明細書におけるポリペプチドの該第１のｄＡｂまたは第１のｓｃＦｖは、これらの概念の第１の抗原結合部位であり、任意に、さらなるｄＡｂまたはｓｃＦｖ結合部位が存在するとき、これは概念の第２の抗原結合部位である。

例では、本明細書におけるポリペプチドの該第１のｄＡｂまたは第１のｓｃＦｖは、これらの概念の第２の抗原結合部位であり、任意に、さらなるｄＡｂまたはｓｃＦｖ結合部位が存在するとき、これは概念の第１の抗原結合部位である。
１８．概念１～１７のいずれか１つに記載のポリペプチドの多量体。
１９．がんの治療のための免疫チェックポイント阻害剤および免疫共刺激分子を標的化するためのヒトまたは動物対象への投与のための、概念１８に記載の多量体。
２０．ヒトまたは動物の対象におけるがんを治療する方法であって、請求項１８に記載の多量体を対象に投与することを含む、方法。

項目：
構成において、本発明は以下の項目を提供する。
１．エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメインまたはペプチド）の少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体であって、多量体が、一緒に会合された第１、第２、第３および第４の自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）によって多量体化され、各四量体化ドメインが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含むそれぞれの操作されたポリペプチドによって構成される、エフェクタードメイン（例えば、タンパク質ドメインまたはペプチド）の少なくとも第１、第２、第３および第４のコピーのタンパク質多量体。
２．多量体が、該ドメインまたはペプチドの四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体、八量体）である、項目１に記載の多量体。
３．免疫グロブリンスーパーファミリー結合部位の四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体、八量体）を含む、項目１または２に記載の多量体。
４．結合部位が、第２の可変ドメインと対合している第１の可変ドメインを含む、項目３に記載の多量体。
５．各ポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの第１および第２のコピーを含み、ポリペプチドが（Ｎ末端からＣ末端に向かう方向）に（ｉ）該コピーの第１のもの－ＴＤ－該コピーの第２のもの、（ｉｉ）ＴＤ－と第１および第２のコピー、または（ｉｉｉ）該第１および第２のコピー－ＴＤを含む、項目１～４のいずれか１つに記載の多量体。
６．ＴＤがＮＨＲ２ ＴＤであり、ドメインまたはペプチドがＮＨＲ２ドメインまたはペプチドではないか、あるいはＴＤがｐ５３ ＴＤであり、ドメインまたはペプチドが、ｐ５３ドメインまたはペプチドではない、項目１～５のいずれかに記載の多量体。
７．操作されたポリペプチドが、第２のタイプのタンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、第２のタイプのタンパク質ドメインまたはペプチドが、第１のタンパク質ドメインまたはペプチドとは異なる、項目１～６のいずれか１つに記載の多量体。
８．ドメインが、免疫グロブリンスーパーファミリードメインである、項目１～７のいずれか１つに記載の多量体。
９．ドメインまたはペプチドが、抗体可変もしくは定常ドメイン、ＴＣＲ可変もしくは定常ドメイン、インクレチン、インスリンペプチド、またはホルモンペプチドである、項目１～８のいずれか１つに記載の多量体。
１０．多量体が、該操作されたポリペプチドの第１、第２、第３および第４の同一のコピーを含み、ポリペプチドが、ＴＤおよび該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ（ただし、１つ以下）、２つ（ただし２つ以下）、またはそれ以上のコピーを含む、項目１～９のいずれか１つに記載の多量体。
１１．操作されたポリペプチドが、抗体またはＴＣＲ可変ドメイン（Ｖ１）およびＮＨＲ２ ＴＤを含む、項目１～１０のいずれか１つに記載の多量体。
１２．ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）（ｉ）Ｖ１－任意のリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ；（ｉｉ）Ｖ１－任意のリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤ－任意のリンカー－Ｖ２、あるいは（ｉｉｉ）Ｖ１－任意のリンカーカー－Ｖ２－任意のリンカー－ＮＨＲ２ ＴＤを含み、Ｖ１およびＶ２が、ＴＣＲ可変ドメインであり、同じであるか、または異なり、あるいはＶ１およびＶ２が、抗体可変ドメインであり、同じであるか、または異なる、項目１１に記載の多量体。
１３．Ｖ１およびＶ２が、抗体単一可変ドメインである項目１２に記載の多量体。
１４．各操作されたポリペプチドが（Ｎ末端からＣ末端の方向に）Ｖ１－任意のリンカー－ＴＤを含み、Ｖ１が、抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、各操作されたポリペプチドが、それぞれの第２の操作されたポリペプチドと対合しており、Ｖ２を含むポリペプチド、Ｖ２が、それぞれ、Ｖ１と対合して抗原またはｐＭＨＣ結合部位を形成する抗体またはＴＣＲ可変ドメインであり、任意に、一方のポリペプチドが、抗体Ｆｃを含むか、または抗体ＣＨ１を含み、他方のポリペプチドが、ＣＨ１と対合している抗体ＣＬを含む、項目１１に記載の多量体。
１５．ＴＤが、（ｉ）配列番号１０または１２６と同一であるか、またはそれと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、あるいは（ｉｉ）配列番号１２０または１２３と同一または少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１～１４のいずれか１つに記載の多量体。
１６．多量体が、ＲｅｏＰｒｏ（商標）、アブシキシマブ、リツキサン（商標）、リツキシマブ、ゼナパックス（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）、エファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）、トシリズマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、ラニビズマブ、Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａ（商標）、セルトリズマブ、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキヌマブ、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏｌｉａ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘ（商標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）、イプリズマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズムマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アド－トラスツズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）、Ｏｐｄｉｖｏ（商標）、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の四量体、八量体、十二量体、十六量体、または２０量体（例えば、四量体または八量体）を含む、項目１～１５のいずれか１つに記載の多量体。
１７．ＴＣＲ結合部位、インスリンペプチド、インクレチンペプチドまたはペプチドホルモンの単離された四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体、あるいは複数の該四量体または八量体。
１８．多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、
（ａ）水溶液に可溶生であり、
（ｂ）真核細胞から分泌可能であり、および／または
（ｃ）真核細胞の発現産物である、項目１～１７のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）。
１９．下記の
（ａ）ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位であって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、水溶液に可溶性である、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位、
（ｂ）抗体単一可変ドメインであって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が水溶液に可溶性である、抗体単一可変ドメイン、
（ｃ）ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位であって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外で発現することができる、ＴＣＲ ＶドメインまたはＴＣＲ結合部位、あるいは
（ｄ）抗体可変ドメインであって、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、ＨＥＫ２９３細胞によって細胞内および／または細胞外で発現することができる、抗体可変ドメインの、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）。
２０．多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、抗原またはｐＭＨＣ結合に対して二重特異性である、項目１～１９のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
２１．ドメインが同一である、項目１～２０のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
２２．多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体が、真核細胞のグリコシル化を含む、項目１～２１のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
２３．細胞がＨＥＫ２９３細胞である、項目２２に記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体。
２４．項目１～２３のいずれか１つに記載の複数の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）。
２５．項目１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と、を含む薬学的組成物。
２６．項目１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）を含む化粧品、食品、飲料、洗浄製品、洗剤。
２７．項目１～２６のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体の該操作された（および任意に単離された）ポリペプチドまたは単量体（任意に単離された）。
２８．操作された（および任意に単離された）ポリペプチド（Ｐ１）であって、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）：－
（ａ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体ＣＨ１－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、Ｃ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、Ｃ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであり、Ｃ１がＣγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδであり、Ｃ１がＣδである、ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－抗体ＣＨ１－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｂ）ＴＣＲ Ｖ１－抗体ＣＨ１－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδである、ＴＣＲ Ｖ１－抗体ＣＨ１－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｃ）抗体Ｖ１－抗体ＣＨ１－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬである、抗体Ｖ１－抗体ＣＨ１－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｄ）抗体Ｖ１－任意の抗体ＣＨ１－抗体Ｆｃ－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬである、抗体Ｖ１－任意の抗体ＣＨ１－抗体Ｆｃ－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（Ｅ）抗体Ｖ１－抗体ＣＬ－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、ＶＨであるか、または
（ｉｉ）Ｖ１が、ＶＬである、抗体Ｖ１－抗体ＣＬ－任意のリンカー－ＴＤ、
あるいは
（ｆ）ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－任意のリンカー－ＴＤであって、
（ｉ）Ｖ１が、Ｖαであり、Ｃ１がＣαであり、
（ｉｉ）Ｖ１が、Ｖβであり、Ｃ１がＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｖ１が、Ｖγであり、Ｃ１がＣγであるか、または
（ｉｖ）Ｖ１が、Ｖδであり、Ｃ１がＣδである、ＴＣＲ Ｖ１－ＴＣＲ Ｃ１－任意のリンカー－ＴＤ、を含む、操作された（および任意に単離され）操作されたポリペプチド（Ｐ１）。
２９．操作されたポリペプチドＰ１がさらなるポリペプチド（Ｐ２）と対合しており、Ｐ２が（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
（ｇ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２－抗体ＣＬであって、Ｐ１が、項目２８で記載の（ａ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶαであり、Ｃ２はＣαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶβであり、Ｃ２はＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ａ）（ｉｖ）に従っている場合、Ｖ２はＶγであり、Ｃ２はＣγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ａ）（ｉｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶδであり、Ｃ２はＣδである、ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２－抗体ＣＬ、
あるいは
（ｈ）ＴＣＲ Ｖ２－抗体ＣＬであって、Ｐ１が、項目２８で記載の（ｂ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｖ）に従っている場合、Ｖ２はＶγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ｂ）（ｉｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶδである、ＴＣＲ Ｖ２－抗体ＣＬ、
あるいは
（ｉ）抗体Ｖ２－ＣＬであって、Ｐ１が、項目２８に記載の（ｃ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＨであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｃ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＬである、抗体Ｖ２－ＣＬ、
あるいは
（ｊ）抗体Ｖ２－任意のＣＬであって、Ｐ１が、項目２８に記載の（ｄ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＨであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｄ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＬである、抗体Ｖ２－任意のＣＬ、
あるいは
（ｋ）抗体Ｖ２－ＣＨ１であって、Ｐ１が、項目２８に記載の（ｅ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＨであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｅ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶＬである、抗体Ｖ２－ＣＨ１、
あるいは
（ｌ）ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２であって、Ｐ１が、項目２８に記載の（ｆ）に従っており、
（ｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶαであり、Ｃ２はＣαであり、
（ｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶβであり、Ｃ２はＣβであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｖ）に従っている場合、Ｖ２はＶγであり、Ｃ２はＣγであり、または
（ｉｖ）Ｐ１が（ｆ）（ｉｉｉ）に従っている場合、Ｖ２はＶδであり、Ｃ２はＣδである、ＴＣＲ Ｖ２－ＴＣＲ Ｃ２、を含む、項目２８に記載のポリペプチド。
３０．項目２８で定義されているＰ１の、または、項目２９で定義されているＰ２と対合したＰ１の多量体、または、複数の該多量体であって、この多量体が、項目１～２４のいずれか１つに記載のものである、多量体。
３１．項目２７～２９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチドまたは単量体をコードする核酸であって、任意に、核酸が、ポリペプチドを発現するための発現ベクターによって構成される、核酸。
３２．項目１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体、八量体）の操作されたポリペプチドもしくは単量体の細胞内発現および／または分泌発現のための、項目３１に記載の核酸またはベクターを含む真核宿主細胞。
３３．細胞内で発現および／または分泌された多量体を産生するためのタンパク質多量体の製造方法における項目３１に記載の核酸またはベクターの使用であって、この方法が、核酸またはベクターを含む真核細胞から多量体を発現および／または分泌させることを含む、核酸またはベクターの使用。
３４．核酸またはベクターを含む真核細胞においてグリコシル化多量体を産生するためのタンパク質多量体の製造方法における、項目３１に記載の核酸またはベクターの使用。
３５．（ｉ）項目２７～２９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチドをコードする真核細胞株と、（ｉｉ）項目１～２４のいずれか１つで定義された多量体、単量体、二量体、三量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）と、を含む、混合物。
３６．細胞株が、細胞の分泌産物を含む培地中にあり、分泌産物が、該多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）を含む、項目３５に記載の混合物。
３７．医療用の、項目１～２４のいずれか１つに記載の多量体、四量体、八量体、十二量体、十六量体または２０量体（例えば、四量体または八量体）。
３８．
（ａ）ＴＣＲ Ｖドメイン多量体であって、方法が、真核細胞で発現されるＴＣＲ Ｖ－ＮＨＲ２ ＴＤまたはＴＣＲ Ｖ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、ＴＣＲ Ｖドメイン、
（ｂ）抗体Ｖドメイン多量体であって、方法が、真核細胞で発現される抗体 Ｖ－ＮＨＲ２－ＴＤまたはＶ－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、抗体Ｖドメイン多量体、
（ｃ）インクレチンペプチド多量体であって、方法が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞で発現されるインクレチンペプチド－ＮＨＲ２ ＴＤまたはインクレチンペプチド－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、インクレチンペプチド多量体、または
（ｄ）ペプチドホルモン多量体であって、方法が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞で発現されるペプチドホルモン－ＮＨＲ２ ＴＤまたはペプチドホルモン－ｐ５３ ＴＤ融合タンパク質の可溶性および／もしくは細胞内発現を含み、方法が、任意に、複数の該多量体を単離することを含む、ペプチドホルモン多量体を、産生する方法。
３９．ポリペプチドの単量体および／または二量体と対比してより高い収量の四量体を産生するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）の使用。
４０．ポリペプチドの単量体および／または二量体と対比してより高い収量の四量体を産生するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における、操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）をさらに含む、操作されたポリペプチドの使用。
４１．単量体、二量体または三量体との混合物ではない複数の四量体を産生するための、ポリペプチドの四量体の製造方法における自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）の使用。
４２．単量体、二量体または三量体との混合物ではない複数の四量体を産生するための、タンパク質ドメインまたはペプチドの複数のコピーを含むポリペプチドの四量体の製造方法における、操作されたポリペプチドの使用であって、操作されたポリペプチドが、該タンパク質ドメインまたはペプチドの１つ以上のコピーを含み、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）をさらに含む、操作されたポリペプチドの使用。
４３．四量体の収量が、単量体および／または二量体の収量の少なくとも１０倍である、項目３９～４２のいずれか１つに記載の使用。
４４．この方法で産生される四量体：産生される単量体および／または二量体の比が、少なくとも９０：１０である、項目３９～４３のいずれか１つに記載の使用。
４５．各単量体が、４０ｋＤａ以下のサイズを有する、項目３９～４４のいずれか１つに記載の使用。
４６．各四量体が１５０ｋＤａ以下のサイズを有する、項目３９～４５のいずれか１つに記載の使用。
４７．方法が、真核細胞株から四量体を発現することを含む、項目３９～４６のいずれか１つに記載の使用。
４８．ｐＭＨＣ複合体に結合することができる多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体であって、下記の
（ａ）ＴＣＲ細胞外ドメインと、
（ｂ）免疫グロブリン定常ドメインと、
（ｃ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多価ヘテロ二量体可溶性Ｔ細胞受容体。
４９．多量体免疫グロブリンであって
（ｉ）免疫グロブリン可変ドメインと、
（ｉｉ）ＥＴＯのＮＨＲ２多量体化ドメインと、を含む、多量体免疫グロブリン。
５０．可溶性の多量体ポリペプチドを集合化させる方法であって、
（ａ）ＥＴＯのＮＨＲ２ドメインに融合された、該多量体ポリペプチドの単量体を提供することと、
（ｂ）該単量体の複数のコピーを会合させ、それにより、多量体可溶性ポリペプチドを得ることと、を含む、方法。

本明細書の任意の開示において、本定常領域または各定常領域もしくはドメイン、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２およびＣＨ３またはＦｃは、それぞれ、ヒトの定常領域もしくはドメイン、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２およびＣＨ３またはＦｃである。例えば、定常領域は、グループＩＧＨＡ１＊０１、ＩＧＨＡ１＊０２、ＩＧＨＡ１＊０３、ＩＧＨＡ２＊０１、ＩＧＨＡ２＊０２、ＩＧＨＡ２＊０３、ＩＧＨＤ＊０１、ＩＧＨＤ＊０２、ＩＧＨＥ＊０１、ＩＧＨＥ＊０２、ＩＧＨＥ＊０３、ＩＧＨＥ＊０４、ＩＧＨＥＰ１＊０１、ＩＧＨＥＰ１＊０２、ＩＧＨＥＰ１＊０３、ＩＧＨＥＰ１＊０４、ＩＧＨＧ１＊０１、ＩＧＨＧ１＊０２、ＩＧＨＧ１＊０３、ＩＧＨＧ１＊０４、ＩＧＨＧ１＊０５、ＩＧＨＧ１＊０６、ＩＧＨＧ１＊０７、ＩＧＨＧ１＊０８、ＩＧＨＧ１＊０９、ＩＧＨＧ１＊１０、ＩＧＨＧ１＊１１、ＩＧＨＧ１＊１２、ＩＧＨＧ１＊１３、ＩＧＨＧ１＊１４、ＩＧＨＧ２＊０１、ＩＧＨＧ２＊０２、ＩＧＨＧ２＊０３、ＩＧＨＧ２＊０４、ＩＧＨＧ２＊０５、ＩＧＨＧ２＊０６、ＩＧＨＧ２＊０７、ＩＧＨＧ２＊０８、ＩＧＨＧ２＊０９、ＩＧＨＧ２＊１０、ＩＧＨＧ２＊１１、ＩＧＨＧ２＊１２、ＩＧＨＧ２＊１３、ＩＧＨＧ２＊１４、ＩＧＨＧ２＊１５、ＩＧＨＧ２＊１６、ＩＧＨＧ２＊１７、ＩＧＨＧ３＊０１、ＩＧＨＧ３＊０２、ＩＧＨＧ３＊０３、ＩＧＨＧ３＊０４、ＩＧＨＧ３＊０５、ＩＧＨＧ３＊０６、ＩＧＨＧ３＊０７、ＩＧＨＧ３＊０８、ＩＧＨＧ３＊０９、ＩＧＨＧ３＊１０、ＩＧＨＧ３＊１１、ＩＧＨＧ３＊１２、ＩＧＨＧ３＊１３、ＩＧＨＧ３＊１４、ＩＧＨＧ３＊１５、ＩＧＨＧ３＊１６、ＩＧＨＧ３＊１７、ＩＧＨＧ３＊１８、ＩＧＨＧ３＊１９、ＩＧＨＧ３＊２０、ＩＧＨＧ３＊２１、ＩＧＨＧ３＊２２、ＩＧＨＧ３＊２３、ＩＧＨＧ３＊２４、ＩＧＨＧ３＊２５、ＩＧＨＧ３＊２６、ＩＧＨＧ３＊２７、ＩＧＨＧ３＊２８、ＩＧＨＧ３＊２９、ＩＧＨＧ４＊０１、ＩＧＨＧ４＊０２、ＩＧＨＧ４＊０３、ＩＧＨＧ４＊０４、ＩＧＨＧ４＊０５、ＩＧＨＧ４＊０６、ＩＧＨＧ４＊０７、ＩＧＨＧ４＊０８、ＩＧＨＧＰ＊０１、ＩＧＨＧＰ＊０２、ＩＧＨＧＰ＊０３、ＩＧＨＭ＊０１、ＩＧＨＭ＊０２、ＩＧＨＭ＊０３、およびＩＧＨＭ＊０４から選択される（例えば、定常領域は、該グループに列挙された＊０１対立遺伝子であり、好ましくは、定常領域は、ヒトＩＧＨＧ１＊０１またはＩＧＨＭ＊０１定常領域である）。別の方法では、定常領域は、該グループに列挙されたヒト定常領域のホモログなどの非ヒト（例えば、哺乳動物、齧歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコまたはウマ）定常領域である。

ポリペプチドは、一実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）第１の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂ）、抗体ＣＨ１（例えば、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１）、下部ヒンジを含み、コアヒンジ領域を欠く（および、任意に、上部ヒンジ領域を欠く）ヒンジ配列、抗体Ｆｃ領域およびＳＡＭ（例えば、ｐ５３ ＴＤなどのＴＤ）を含む。例えば、コアヒンジ領域配列は、ＣＸＸＣアミノ酸配列である。ポリペプチドは、第１の結合部位とＣＨ１との間、ＦｃとＳＡＭの間、および／またはＳＡＭに対してＣ末端との間に別の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ）を含み得る。任意に、多量体は、そのようなポリペプチドの複数（例えば、４つのコピー）を含み、例えば、各ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）第２の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂ）、抗体ＣＬ（例えば、ヒトＣκ）、および、任意に、第３の抗原結合部位を含むさらなるポリペプチドと対合している。任意に、結合部位は同じ抗原特異性を有する（例えば、すべてがＴＮＦアルファに結合する）。別のオプションでは、第１および第２（および任意に、該別の結合部位）が異なる抗原に結合する。本結合部位または各結合部位は、本明細書に開示される任意の抗原に結合することができ、例えば、各結合部位は、ＴＮＦアルファ（実施例１７に示されるような）に結合する。別の例では、第１の抗原結合部位は、抗原に特異的に結合する所定の抗体の抗原結合部位のＶＨであり（および、ＣＨ１は、任意に、抗体のＣＨ１であり）、さらなるポリペプチドの第２の結合部位は、所定の抗体の抗原結合部位のＶＬであり（および、ＣＬは、任意に、抗体のＣＬであり）、ＶＨとＶＬとは対合して、抗原に対する結合特異性を有するＶＨ／ＶＬ結合部位を形成する。所定の抗体は、例えば、実施例１９に示されるように、市販の抗体であり得る。例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、例えば、所定の抗体がイピリムマブ（またはＹｅｒｖｏｙ（商標））である。例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位は、ＴＮＦアルファに特異的に結合し、例えば、所定の抗体が、アダリムマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ（またはＨｕｍｉｒａ（商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）もしくはＲｅｍｉｃａｄｅ（商標））である。例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、例えば、所定の抗体がアベルマブ（もしくはＢａｖｅｎｃｉｏ（商標））またはアテゾリズマブ（もしくはＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））である。例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位は、ＰＤ－１に特異的に結合し、例えば、所定の抗体がニボルマブ（もしくはＯｐｄｉｖｏ（商標））またはペムブロリズマブ（もしくはＫｅｙｔｒｕｄａ（商標））である。例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位は、ＶＥＧＦに特異的に結合し、例えば、所定の抗体がベバシズマブ（もしくはＡｖａｓｔｉｎ（商標））またはラニビズマブ（もしくはＬｕｃｅｎｔｉｓ（商標））である。別の例では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）第１のＶＥＧＦ結合部位、任意の第２のＶＥＧＦ結合部位、抗体ＣＨ１（例えば、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１）、下部ヒンジを含み、コアヒンジ領域を欠く（および、任意に、上部ヒンジ領域を欠く）ヒンジ配列、抗体Ｆｃ領域およびＳＡＭ（例えば、ｐ５３ ＴＤなどのＴＤ）を含む。例では、第１の結合部位は、ＶＥＧＦＲ１からのＩｇドメイン２であり、第２の結合部位は、ＶＥＧＦＲ２からのＩｇドメイン３である（実施例２０に示されるように）。別の例では、第１の結合部位は、ＶＥＧＦＲ２からのＩｇドメイン３であり、第２の結合部位は、ＶＥＧＦＲ２からのＩｇドメイン２である。例では、第１および第２の結合ドメインは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）アフリベルセプト（またはＥｙｌｅａ（商標））の第１および第２のＶＥＧＦ結合部位である。

好適な所定の抗体はＲｅｏＰｒｏ（商標）、アブシキシマブ、Ｒｉｔｕｘａｎｈ（商標）、リツキシマブ、Ｚｅｎａｐａｘｈ（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔｈ（商標）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅｈ（商標）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎｈ（商標）、トラスツズマブ、Ｍｙｌｏｔａｒｇｈ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎｈ（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａｈ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒｈ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａｈ（商標）、エファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘｈ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎｈ（商標）、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉｈ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａｈ（商標）、トシリズマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘｈ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓｈ（商標）、ラニビズマブ、Ｓｏｌｉｒｉｓｈ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａｈ（商標）、セルトリズマブ、Ｓｉｍｐｏｎｉｈ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキヌマブ、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａｈ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏｌｉｅ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘｈ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘｈ^（商標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａｈ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙｈ（商標）、イピリムマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓｈ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アド－トラスツズマブ、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブである。これらの一般的なバージョンおよび対応するＩＮＮ名も開示されており－これらのそれぞれは、本発明で使用するための抗原結合部位の供給源として使用するための適切な所定の抗体である。所定の抗体のＶＨおよびＶＬドメインの適切な配列を表４に開示する。したがって、例えば、本発明の多量体は、これらの抗体のいずれかのＶＨ／ＶＬ抗原結合部位の複数の（例えば、４、８、１２、１６または２０個の）コピーを含み、例えば、結合部位のＶＨは、ＳＡＭ（例えば、ＴＤ）を含む本発明のポリペプチドによって構成され、各ポリペプチドは、ＶＨと対合するＶＬを含むさらなるポリペプチドと対合しており、したがって、抗原結合部位を形成する。例では、ＳＡＭを含むポリペプチドは、さらなるポリペプチドのＣＬと対合するＣＨ１も含む。任意に、多量体のポリペプチドの結合部位は、抗体の結合部位のＶＨおよび抗体のＣＨ１（すなわち、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＨ１およびＳＡＭ）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に、例えば、ＣＬが抗体のＣＬである、ＶＬ－ＣＬ）を含むさらなるポリペプチドと対合され得る。

一実施形態では、所定の抗体はアバスチンである。

一実施形態では、所定の抗体はアクテムラである。

一実施形態では、所定の抗体はエルビタックスである。

一実施形態では、所定の抗体はルセンティスである。

一実施形態では、所定の抗体はサリルマブである。

一実施形態では、所定の抗体はデュピルマブである。

一実施形態では、所定の抗体はアリロクマブである。

一実施形態では、所定の抗体はエボロクマブである。

一実施形態では、所定の抗体はペムブロリズマブである。

一実施形態では、所定の抗体はニボルマブである。

一実施形態では、所定の抗体はイピリムマブである。

一実施形態では、所定の抗体はレミケードである。

一実施形態では、所定の抗体はゴリムマブである。

一実施形態では、所定の抗体はオファツムマブである。

一実施形態では、所定の抗体はベンリスタである。

一実施形態では、所定の抗体はキャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）である。

一実施形態では、所定の抗体はリツキシマブである。

一実施形態では、所定の抗体はハーセプチンである。

一実施形態では、所定の抗体はデュルバルマブである。

一実施形態では、所定の抗体はダラツムマブである。

別の実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）第１の抗原部位、任意のリンカー（例えば、Ｇ_４Ｓ_ｎ、ここでｎ＝１、２、３、４、５、６、７、または８であり、好ましくは３である）、第２の抗原結合部位、下部ヒンジを含み、コアヒンジ領域を欠く（および、任意に、上部ヒンジ領域を欠く）ヒンジ配列、抗体Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ）およびＳＡＭ（例えば、ｐ５３ ＴＤなどのＴＤ）を含む。例えば、コアヒンジ領域配列は、ＣＸＸＣアミノ酸配列である。ポリペプチドは、ＦｃとＳＡＭの間、および／またはＳＡＭに対してＣ末端との間に別の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ）を含み得る。任意に、多量体は、そのようなポリペプチドの複数個（例えば、４つのコピー）を含む。任意に、結合部位は同じ抗原特異性を有する（例えば、すべてがＴＮＦアルファに結合する）。別のオプションでは、第１および第２（および任意に、該別の結合部位）が異なる抗原に結合する。本結合部位または各結合部位は、本明細書に開示される任意の抗原に結合することができ、例えば、各結合部位はＰＤ－Ｌ１に結合するか、または第１の結合部位はＰＤ－Ｌ１に結合し、かつ第２の結合部位は４１－ＢＢに結合するか、または第１の結合部位は４－１ＢＢに結合し、かつ第２の結合部位は、ＰＤ－Ｌ１に結合する（実施例１８に示されるように）。

ポリペプチドは、一実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）第１の抗原部位（例えば、ｄＡｂ）、任意のリンカー（例えば、Ｇ_４Ｓ_ｎ、ここでｎ＝１、２、３、４、５、６、７、または８であり、好ましくは３である）、第２の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂ）、抗体ＣＨ１（例えば、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１）およびＳＡＭ（例えば、ｐ５３ ＴＤなどのＴＤ）を含む。ポリペプチドは、ＳＡＭに対してＣ末端の別の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂまたはｓｃＦｖ）を含み得る。任意に、多量体は、そのようなポリペプチドの複数個（例えば、４つのコピー）を含み、例えば、各ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）第３の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂ）、任意に第４の抗原結合部位（例えば、ｄＡｂ）、抗体ＣＬ（例えば、ヒトＣκまたはＣλ）、および、任意に、さらなる抗原結合部位を含むさらなるポリペプチドと対合している。例えば、第４およびさらなる結合部位は省略されている。別の例では、第３および第４の結合部位が存在するが、さらなる結合部位は存在しない。別の例では、第３およびさらなる（第４ではない）の結合部位が存在する。任意に、結合部位は同じ抗原特異性を有する（例えば、すべてがＴＮＦアルファに結合する）。別のオプションでは、第１および第２（および任意に、該別の該結合部位）が異なる抗原に結合する。本結合部位または各結合部位は、本明細書に開示される任意の抗原に結合することができ、例えば、各結合部位は、ＴＮＦアルファ（実施例２１および２２に示されるような）に結合する。例では、第１および第３、または第２および第３の結合部位が対合して、アダリムマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ（またはＨｕｍｉｒａ（商標）、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）もしくはＲｅｍｉｃａｄｅ（商標））などの抗ＴＮＦα抗体のＶＨ／ＶＬ結合部位と同一であるＶＨ／ＶＬ対を形成する。例では、第１および第３、または第２および第３の結合部位が対合して、アベルマブ（もしくはＢａｖｅｎｃｉｏ（商標））またはアテゾリズマブ（もしくはＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））などの抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＨ／ＶＬ結合部位と同一であるＶＨ／ＶＬ対を形成する。例では、第１および第３、または第２および第３の結合部位が対合して、ニボルマブ（もしくはＯｐｄｉｖｏ（商標））またはペムブロリズマブ（もしくはＫｅｙｔｒｕｄａ（商標））などの抗ＰＤ－１抗体のＶＨ／ＶＬ結合部位と同一であるＶＨ／ＶＬ対を形成する。例では、第１および第３、または第２および第３の結合部位が対合して、ベバシズマブ（もしくはＡｖａｓｔｉｎ（商標））またはラニビズマブ（もしくはＬｕｃｅｎｔｉｓ（商標））などの抗ＶＥＧＦ抗体のＶＨ／ＶＬ結合部位と同一であるＶＨ／ＶＬ対を形成する。上述のような所定の抗体は、ＶＨ／ＶＬ対の供給源として使用することができる。

例では、本発明のポリペプチドは、本明細書に開示される任意のＱｕａｄポリペプチドであり、例えば、本明細書の表のいずれかに示されるＱｕａｄアミノ酸（例えば、配列番号８１～１１５、１５１～１６２、１９０、１９１、２０９～２２４および１７９のいずれか１つ）を含むか、または本明細書の表のいずれか（例えば、表９、１４または１７）のＱｕａｄヌクレオチド配列によってコードされるか、または表８に示されるポリペプチドの構造を有する。ＳＡＭは、本明細書に開示される任意のＳＡＭ、例えば、本明細書の任意の表に開示される任意のｐ５３またはホモログＴＤ（例えば、表７に示されるか、または表１３のタンパク質により構成される）であり得る。

アミノ酸配列がそれらのＣ末端に複数のヒスチジンで示されている場合（例えば、「ＨＨＨＨＨＨ」の後に「．．ＡＡＡ」が任意に続く）、そのようなヒスチジンおよび任意の．．ＡＡＡは一実施形態では省略され、これをコードする対応するヌクレオチドはアミノ酸配列をコードする核酸から省略される。アミノ酸配列がＤＹＫＤＤＤＤＫモチーフ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫＨＨＨＨＨＨまたはＤＹＫＤＤＤＤＫＨＨＨＨＨＨ．．ＡＡＡ）で示される場合、そのようなモチーフは、一実施形態では省略され、これをコードする対応するヌクレオチドは、アミノ酸配列をコードする核酸から省略されている。

本明細書の任意の例、構成、態様、概念、項目またはパラグラフまたは開示は、本明細書の任意のさらなる例、構成、態様、概念、項目またはパラグラフまたは開示の任意の特徴と組み合わせることができる。

本明細書に記載の特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく、例示として示されていることが理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態で使用することができる。当業者は、本明細書に記載の特定の手順に相当する多くの同等物を認識し、または日常的な研究にすぎないことを使用して確認することができるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると見なされ、特許請求の範囲によってカバーされる。本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当業者の技能のレベルを示している。すべての刊行物および特許出願（言及されたすべての特許出願および特許の米国同等物を含む）は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と併せて使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味する場合があるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは複数」の意味とも一致する。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、または代替物が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物および「および／また」のみを指す定義を支援する。この出願全体を通して、「約」という用語は、値がデバイスの固有の誤差の変動、値を決定するために使用される方法、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などを含む任意の形式）、「有する」（および「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」や「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの任意の形式）または「含有（するｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する）ｃｏｎｔａｉｎ）」などの任意の形式）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の引用されていない要素または方法ステップを除外しない。

本明細書で使用される「またはそれらの組み合わせ」という用語は、その用語に先行するリストされた項目のすべての順列および組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことを意図しており、特定の文脈で順序が重要な場合は、またＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢである。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１つ以上の項目または用語の繰り返しを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から明らかでない限り、通常、任意の組み合わせの項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。

本開示の任意の部分は、文脈から別段明らかでない限り、開示の他の部分と組み合わせて読むことができる。

本明細書に開示および請求されるすべての組成物および／または方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作成および実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変更が本明細書に記載される組成物および／または方法ならびにステップまたは一連のステップに適用され得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのようなすべての同様の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。

実施例１：四価および八価の可溶性ヘテロ二量体ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ分子の生成
この実施例は、それぞれｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲと称される四価および八価の可溶性ヘテロ二量体ＴＣＲ分子を生成する方法を示している。これらのフォーマットは、標的部位での同族リガンドについての溶解性および結合活性に関連する問題を克服する。

ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを安定で可溶性の分子として例示するために、この実施例では、免疫グロブリン定常ドメインおよびＮＨＲ２四量体化ドメインと一緒になったＮＹ－ＥＳＯ－１に対して高い親和性を有するＴＣＲαβ可変配列が使用される。

この実施例で使用されるＳＬＬＭＷＩＴＱＣ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に特異的な高親和性ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲαβ鎖（それぞれ、ＴＣＲＶα－ＣαおよびＶβ－Ｃβから構成される）は、シグナルペプチド配列（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）を含めてＷＯ２００５／１１３５９５Ａ２で報告されているとおりである。タンパク質の精製を助けるために、ヒスチジンタグをＮＨＲ２ドメインのＣ末端に組み込んだ。

ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの構成要素をコードするＤＮＡ構築物は、哺乳動物細胞でのそれらの可溶性発現および機能的集合を可能にする２つのベクターシステムとして合成的に構築される。発現ベクターにクローニングするためにそのＤＮＡ配列が合成される２つの組み立てられたＴＣＲ鎖（αおよびβ鎖）の概略図を図３および４に示し、それらのアミノ酸配列を図５および６に示す。

ｐＴＴ５ベクターシステムは、懸濁液に適応したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞での組換えタンパク質の高レベルの一過性産生を可能にする（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９）。これは、ウイルスタンパク質エプスタイン／バール核抗原１（ＥＢＮＡ－１）によって認識される複製起点（ｏｒｉＰ）を含有しており、これは、宿主細胞複製因子とともにＤＮＡプラスミドのエピソーム複製を媒介し、組換えタンパク質の発現の増強を可能にする。したがって、ｐＴＴ５発現ベクターは、ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ分子の構成要素をクローニングするために選択される。

ＴＣＲαβ鎖を含有する合成されたＤＮＡフラグメントは、制限部位（ＲＳ）（ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ、Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）で制限酵素により消化され、ＤＮＡは１％アガロースゲルで分離される。正しいサイズのＤＮＡフラグメントを切り出し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用してＤＮＡを精製する。ｐＴＴ５ベクターもまた同じ制限酵素により消化され、線状化されたプラスミドＤＮＡは切除されたアガロースゲルから精製される。消化されたＴＣＲαβ鎖は消化されたｐＴＴ５ベクターにクローン化され、４つの発現ベクター（ｐＴＴ５－ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲα、ｐＴＴ５－ｔｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβ、ｐＴＴ５－ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲαおよびｐＴＴ５－ｏｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβ）を得る。

四価および八価の可溶性ＮＹ－ＥＳＯ－ＴＣＲの発現
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの機能的発現は、懸濁液に適応したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞で実行する。ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を、無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、２ｍＭのＬ－グルタミンを有する高グルコース（４．５Ｇ／Ｌ））中で、３７℃、５％ＣＯ_２および９５％の湿度で培養する。

トランスフェクションごとに、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞（３×１０^７細胞）を約６０％のコンフルエントな細胞から、２５０ｍＬの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に新たに播種する。トランスフェクションは、供給元のガイドラインに従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸカチオン性脂質ベース試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実行する。ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの発現について、３７．５μｇの全プラスミドＤＮＡ（ｐＴＴ５－ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲαおよびｐＴＴ５－ｔｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβベクターのそれぞれ１８．７５μｇのプラスミドＤＮＡが使用されるか、２つの発現プラスミドの量を変化させる）を、トランスフェクションごとに使用する。同様に、ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの発現について、ｐＴＴ５－ｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲαとｐＴＴ５－ｏｓ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲβのそれぞれ１８．７５μｇのプラスミドＤＮＡを、トランスフェクションごとに使用する。トランスフェクション後、細胞を新鮮な培地中に回収し、１１０ｒｐｍでオービタルシェーカーで、３７℃で５％ＣＯ_２にて４～８日間培養した。小規模なトランスフェクションは、６ウェルまたは２４ウェルプレートで同様に行われる。

発現された可溶性ｅＴＣＲ^２－ＢｉＴｅの分析
上清に分泌されたｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲタンパク質分子は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって直接的に分析されるか、タンパク質精製後に分析される。タンパク質サンプルと標準は、還元条件下と非還元条件下の両方で調製される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｅｔｒａ細胞電気泳動システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でのタンパク質電気泳動用のキャストミニゲルを使用して実施した。クマシーブルー色素を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでタンパク質を染色した。

ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質分子の精製
細胞上清からの可溶性ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲは、２段階で精製される。最初の工程では、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を、ニッケルを充填されたニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アガロース樹脂（ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡスーパーフローアガロース－Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）とともに使用する。結合および洗浄緩衝液は、低濃度のイミダゾール（１０～２５ｍＭ）を含有するｐＨ７．２のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）からなる。ＩＭＡＣカラムからのＨｉｓタグ付きｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲの溶出および回収は、高濃度のイミダゾール（＞２００ｍＭ）で洗浄することによって達成される。溶出したタンパク質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、目的のタンパク質を含む画分をプールする。プールされたタンパク質画分は、結合アッセイで直接使用されるか、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を伴う２番目の工程でさらに精製する。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００増加の事前充填カラム（Ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、単量体、オリゴマー、および標的タンパク質の凝集形態を分離するために使用される。

表面プラズモン共鳴
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのｐＭＨＣへの特異的結合および親和性分析は、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して実行される。簡単に説明すると、精製されたヒスチジンタグ付きｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲタンパク質は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）のＮｉ^２＋キレート化を介してセンサー表面に捕捉される。ＮＹ－ＥＳＯ ｐｅｐ_{（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）}－ＭＨＣ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を含有するさまざまな濃度の分析物を注入し、結合シグナルをモニターした。

実施例２：四価および八価の可溶性ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ－ＩＬ２融合分子の生成
ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２およびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２タンパク質複合体の発現に必要とされるドメインをコードするＤＮＡを合成し、上記のように発現ベクターｐＴＴ５にクローニングする。ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２およびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２のＴＣＲαβ鎖内のドメインの概略図を図７および８に示し、アミノ酸配列を図９および１０に示す。

ｔｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２およびｏｓ－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＩＬ２の発現、精製、および特性評価は、上記のように実行される。

実施例３：高収量の四量体分泌
簡単に説明すると、従来の遺伝子工学技術を使用して、Ｑｕａｄ１６（図１４および１５）をコードするＨＥＫ２９３－Ｔ細胞株を作製し、Ｑｕａｄ１７（図１４および１５）をコードする別のＨＥＫ２９３－Ｔ細胞株を作製した。

タンパク質の発現が起こり、タンパク質が細胞株から分泌された。細胞がインキュベートされた培地のサンプルを、変性条件下（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）または天然条件下（ＳＤＳなし）でＰＡＧＥに供した。前者はさらに還元条件下（メルカプトエタノールを使用）にあったが、後者は還元条件下にはなかった。

還元されたゲルは、予想される単量体サイズで明確なバンドを示した（図１６）。驚くべきことに、還元されていない天然のゲルは、単量体、二量体、または三量体のサイズで検出可能なバンディングを示さなかったが、代わりに、四量体のサイズで強度のバンディングが見られ、非常に高い収量の四量体が得られたことを示し、これはＳＥＣによって高純度であることが確認された。

Ｑｕａｄ１６については、ＳＥＣからの四量体ピークをＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で泳動させ、得られたバンドを質量分析用に切り出した。データはトリプシン消化物で得られ、ｐ５３はタンパク質の１００％で検出された。これは、分泌されたＱｕａｄ１６が多量体化されたという決定的な証拠であった。

実施例４：ＮＨＲ２ ＴＤに融合したＴＣＲの細胞外部分の細胞内タンパク質発現
発現ベクター
すべてのＤＮＡフラグメントは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって合成され、発現ベクターｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化された。合成されたＤＮＡフラグメントおよびＱｕａｄポリペプチドの概略図ならびに配列を図２１に示し、本明細書の配列表に示す。

ＤＮＡの調製
Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された凍結乾燥プラスミドＤＮＡを、ＭＱ水を用いて５０ｎｇ／μｌの濃度に再懸濁した。従来の熱ショック法を使用して、５０ｎｇのＤＮＡを５０μｌのコンピテントＤＨ５α細胞に形質転換した。細胞を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。個々のコロニーを選定し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。ＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従って使用して、細胞から精製した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのトランスフェクション
簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％のＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを添加した高グルコースＤＭＥＭで維持された。細胞を、２ｍｌ培地中、６ウェルプレートのウェル当たり６×１０^５細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩接着させた。７．５μｌのリポフェクタミン２０００を、１５０μｌのＯｐｔｉＭｅｍで希釈し、室温で５分間インキュベートした。プラスミドＤＮＡ（２．５μｇ）を１５０μｌのＯｐｔｉＭｅｍで希釈した。希釈したＤＮＡを希釈したリポフェクタミン２０００と組み合わせて、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。３００μｌの複合体を６ウェルプレートの１つのウェルに添加した。分析で培地に無血清が必要な場合、トランスフェクションの６時間後に培地を吸引し、ＣＤ２９３培地と交換した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした後、分析した。

したがって、ＴＣＲ連結ＮＨＲ２四量体化ドメイン（ＴＤ）構築物（Ｑｕａｄ）のさまざまなフォーマットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＴＣＲ四価フォーマットに似たＱｕａｄ３および４（図１および３に概略的に表された構造）およびＴＣＲ八価フォーマットに似たＱｕａｄ１２および１３（図２および４に概略的に表された構造）を、タンパク質発現分析のためにトランスフェクトした。細胞内で発現したタンパク質をチェックするために、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からタンパク質サンプルを以下のように調製した。簡単に説明すると、細胞を２ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、その後吸引した。１５０μｌのトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）を各ウェルに添加し、細胞を室温で約１分間インキュベートした。プレートを軽くたたいて、強く接着している細胞も持ち上げた。トリプシンを不活性化するために、８５０μｌの培地を各ウェルに添加した。細胞を１．５ｍｌエッペンドルフに移し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを氷上で保存した。細胞を、１／２００に希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する４００μｌの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、１％のＳＤＳ）に再懸濁した。サンプルを激しくボルテックスし、氷上で２０分間インキュベートした。Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞を超音波処理した。振幅を３０％に設定し、細胞を合計２４秒間超音波処理した（６秒オン、３秒オフ×４）。総タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（商標）を製造元の指示に従って使用して定量化した。１００μｇをＭＱ水で希釈して８０μｌの容量にした。次いで、２０μｌの５×ＳＤＳ装填緩衝液を添加し、１ｍｇ／ｍｌのサンプルを得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の前に、サンプルを９５℃で５分間インキュベートした。

タンパク質サンプルは、変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離された。典型的には、２５μｇの全細胞溶解物（２５μｌ）をウエスタンブロット分析のためにゲルに装填した。５μｌのＰａｇｅＲｕｌｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄの１０～１８０ｋＤａのＰｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒをタンパク質サンプルと一緒にゲルに装填した。ゲルは、０．１％ＳＤＳを含むトリス－グリシン緩衝液で泳動させた。１５０ボルトの定電圧を使用し、染料フロントが完全に移動するまでゲルを約７０分間泳動させた。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１５％Ｂｉｓ－トリス）ゲルは、以下の分離およびスタッキングゲルを使用して調製した。

分解ゲル：
・５ｍｌの３０％ビス－アクリルアミド
・２．６ｍｌの１．５Ｍトリス（ｐＨ８．８）
・５０μｌの２０％ＳＤＳ
・１００μｌの１０％ＡＰＳ
・１０μｌのＴＥＭＥＤ
・２．２ｍｌのＭＱ水

スタッキングジェル：
・０．７５ｍｌの３０％ビス－アクリルアミド
・１．２５ｍｌの１．５Ｍトリス（ｐＨ８．８）
・２５μｌの２０％ＳＤＳ
・５０μｌの１０％ＡＰＳ
・５μｌのＴＥＭＥＤ
・２．９ｍｌのＭＱ水

Ｑｕａｄ３、４、１２および１３からのＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質のタンパク質発現を特異的かつ高感度に検出するために、ウエスタンブロッティングを実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離したタンパク質を以下のようにＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ（商標）の０．４５μＭのＰＶＤＦ膜に転写した。簡単に説明すると、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄの０．４５μＭのＰＶＤＦ膜をＭｅＯＨで約１分間活性化し、使用前に転写緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９０ｍＭのグリシン、２０％のＭｅＯＨ）ですすいだ。スポンジ、濾紙、ゲル、膜、濾紙、スポンジスタックを用意し、カセットに入れて転写した。転写は、氷上で２８０ｍＡで７５分間実行した。膜をブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ、５％粉乳）で約２時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで簡単に洗浄した後、ＴＢＳＴ、１％の粉乳で１／２５００に希釈した抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、３１４１０）とともに４℃で一晩インキュベートした。Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロッティング基質を使用して現像する前に、膜を完全に洗浄した（ＴＢＳＴを３回洗浄、各１５分）

抗ヒトＩｇＧ検出抗体を使用してウエスタンブロットをプローブし、Ｑｕａｄ３（４６．１ｋＤａ）、４（４６．４ｋＤａ）、１２（４７．８ｋＤａ）、および１３（４８．１ｋＤａ）から調製したサンプルから、予想される分子量の特定のタンパク質バンドを検出できる（図１７Ａおよび１７Ｂ）。これらのデータにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質の細胞内タンパク質発現を確認する。

分析したすべてのＱｕａｄについて、ＮＨＲ２ ＴＤとのＴＲＶβ－ＴＲＣβ－ＩｇＧ１－ＣＨ１（＋／－ＩｇＧヒンジドメイン）融合が安定していることを示す明確な単一バンドを検出することができる。これらの発現データにより、この例で例示されているように、四価（Ｑｕａｄ３および４）および八価（Ｑｕａｄ１２および１３）分子を組み立てる可能性も確認する。

Ｑｕａｄ３とＱｕａｄ４の違いは、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインとＮＨＲ２ ＴＤとの間にある小さなペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）の存在である。これは、Ｑ１３がＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインとＮＨＲ２ ＴＤの間にペプチドリンカーを含有するＱｕａｄ１２および１３にも当てはまる。発現データから、ペプチドリンカーはタンパク質発現に影響を与えないことがわかる。しかしながら、これらのＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤフォーマットにおける抗原結合および／または多量体化複合体の安定化支援するためにペプチドリンカーを含むことが望ましい場合がある。

実施例５：ＮＨＲ２ ＴＤに融合したＴＣＲの細胞外部分の可溶性タンパク質発現
ＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質は、実施例４において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では細胞内で発現されることが示された。ここでも、Ｑｕａｄ３、４、１２、および１３が、これらの融合タンパク質の可溶性発現を実証するために使用された。上記のように、Ｑｕａｄ３、４、１２、および１３をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、細胞上清からの可溶性タンパク質を濃縮した。簡単に説明すると、トランスフェクションの４８時間後に培地を回収し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞または破片を全て除去した。典型的には、５００μｌの培地は、ＭＷＣＯが１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ０．５遠心ユニットを使用して１００μｌに濃縮された。２５μｌのｐ５×ＳＤＳローディング緩衝液をサンプルに添加し、ゲル／ウエスタンブロット分析の前に９５℃で５分間インキュベートした。濃縮したタンパク質サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄの０．４５μＭのＰＶＤＦ膜に転写した。ウエスタンブロッティングおよびタンパク質検出は、上記の方法を使用して抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰを使用して行われた。

細胞上清から濃縮され調製されたタンパク質サンプルは、Ｑｕａｄ３（４６．１ｋＤａ）、４（４６．４ｋＤａ）、１２（４７．８ｋＤａ）、および１３（４８．１ｋＤａ）に対応するウエスタンブロットで予想された分子量で特定のタンパク質バンド示す（図１８Ａおよび１８Ｂ）。ウエスタンブロット発現データは、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質の可溶性発現を明確に示している。これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞で発現するＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質の可溶性発現を実証する最初の報告である。

四量体（Ｑｕａｄ３および４）と八量体（Ｑｕａｄ１２および１３）ＴＣＲ－ＮＨＲ２ ＴＤフォーマットとの両方からの可溶性タンパク質発現は、幅広い設定でのＮＨＲ２ ＴＤの潜在的な適用性を強調している。ＮＨＲ２ ＴＤ融合分子の使用は、診断および撮像で使用するための治療用分子およびタンパク質分子の調製のために使用され得る。

実施例６：ＮＨＲ２ ＴＤに融合した抗体フラグメントの細胞内タンパク質発現
ＮＨＲ２ ＴＤの多様性をさらに例示するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での発現を試験するために、ＮＨＲ２ ＴＤに融合したいくつかの異なる抗体フラグメントフォーマットを構築した。

Ｑｕａｄ１４および１５は、図１１および２１に概略的に示されているように、ＶＨとＮＨＲ２ ＴＤとの間にペプチドリンカーを用いて、または用いずにＮＨＲ２ ＴＤに融合した抗体ＶＨドメインを含有するＱｕａｄ１４および１５のＶＨドメインは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）に特異的である。このフォーマットの他のいくつかのバージョンも構築され、治療上有用な薬物標的に特異的なＶＨでテストした。結合ドメインの配列は、表４に列挙されている。これらのいくつかには、Ｑｕａｄ３４（ＴＮＦαに特異的）、Ｑｕａｄ３８（ＶＥＧＦに特異的）、Ｑｕａｄ４０（ＥＧＦＲに特異的）、Ｑｕａｄ４４（ＣＤ３８に特異的）が含まれる。

Ｑｕａｄ３８および４４は、それぞれＥＧＦＲおよびＣＤ１３８に特異的な第２のＶＨドメインを含む追加の結合アームを含むようにさらに開発し、Ｑｕａｄ４２および４６を生成した。Ｑｕａｄ４２および４６は、ＮＨＲ２ ＴＤドメインを介して多量体化して二重特異性四量体を形成するための能力を有する二重特異性分子を表している。

別の例では、エフェクター分子（ヒトＩＬ２）がＱｕａｄ１４および１５のＣ末端に結合してＱｕａｄ１８および１９になり、ＶＨ－ＮＨＲ２－ＩＬ２分子は四価の二機能性になる。

別の例では、抗体Ｆａｂフラグメント（ＶＨ－ＣＨ１）はＮＨＲ２ ＴＤ（Ｑｕａｄ２３および２４）に連結され、図１２に概略的に示されている。Ｑｕａｄ２３および２４は、免疫グロブリン軽鎖を含有する第２の鎖（例えば、Ｑｕａｄ２５）とインビトロで共発現または混合され、組み立てられたときの四価のＦａｂ分子を表している。

さらに別の例では、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインがＱｕａｄ２３および２４に含まれ、これはＱｕａｄ２６および２７と称され、図１３に概略的に示されている。Ｑｕａｄ２６および２７は、免疫グロブリン軽鎖ドメインを含有する第２の鎖（例えば、Ｑｕａｄ２５）とインビトロで共発現または混合され、組み立てられたときの八価のＦａｂ分子を表している。

次のＱｕａｄベクター、Ｑｕａｄ１４、１５、１８、１９、２３、２４、２６、２７、３４、３８、４０、４２、４４、４６はＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。上記のように全細胞抽出物からタンパク質サンプルを調製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄの０．４５μＭのＰＶＤＦ膜に転写した。ＴＢＳＴ、１％の粉乳中で１／２５００に希釈された抗Ｈｉｓ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７０５８）を使用して、特定のタンパク質発現を調べた。

全細胞抽出物中の特異的タンパク質発現は、Ｑｕａｄ１４、１５、１８、１９、２３、２４、２６、２７、３４、３８、４０、４２、４４、および４６を使用してテストした全ての異なる抗体－ＮＨＲ２ ＴＤ融合タンパク質で検出することができた（図１９Ａ～Ｄ）。興味深いことに、ＮＨＲ２ ＴＤのＮ末端に融合したＶＨ結合ドメインに加えて、ＮＨＲ２ ＴＤドメインのＣ末端に融合したエフェクタードメイン（ＩＬ２）を含有するＱｕａｄ１８および１９は、良好なタンパク質発現を示した。

Ｑｕａｄ２３および２４ポリペプチドの発現は、パートナーの可溶性Ｑｕａｄ分子（例えば、Ｑｕａｄ２５）とインビトロで共発現または混合したときの、ＮＨＲ２ ＴＤを使用して四価の抗体Ｆａｂ分子を形成する可能性を強調している。同様に、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインを含む、Ｑｕａｄ２６および２７の発現は、パートナーの可溶性第２のパートナー鎖（例えば、Ｑｕａｄ２５）とインビトロで共発現または混合したときの、ＮＨＲ２ ＴＤを使用して八価の抗体Ｆａｂ分子を形成する可能性を強調している。

ＮＨＲ２ ＴＤドメインのＣ末端に融合した追加のＶＨドメインを含有するＱｕａｄ４２および４６の二重特異性分子もまた、良好なタンパク質発現を示した。これらのデータは、ＮＨＲ２ ＴＤドメインの多様性、ならびにさまざまなタンパク質フォーマットを開発するためのさまざまな結合およびエフェクター分子に融合する能力を強調している。データはまた、タンパク質分子をＮＨＲ２ ＴＤのＮ末端とＣ末端の両方に融合させることが可能であることを示唆しており、これにより二重特異性多価タンパク質分子の開発が可能になる。

実施例７：ＮＨＲ２ ＴＤに融合された抗体フラグメントの多価集合性
ＮＨＲ２ ＴＤは、ＥＴＯの四量体複合体へのオリゴマー化を担っている。ＮＨＲ２ ＴＤドメインを使用すると、実施例４～６に示すように、発現に影響を与えることなく、結合ドメインとエフェクター分子とを、Ｎ末端またはＣ末端、あるいはＮ末端とＣ末端の両方に融合させることができる。結合ドメインは、ＴＣＲ可変および定常ドメイン、抗体および抗体フラグメント、またはＩＬ２などのエフェクター分子であり得る。ＮＨＲ２ ＴＤは細胞内で発現するタンパク質の一部であり、本来は細胞内でのみ発現するにもかかわらず、ＮＨＲ２ ＴＤと融合すると可溶性フォーマットでタンパク質を発現することも可能である（図１８）。

ＮＨＲ２ ＴＤが結合ドメインに融合した後、オリゴマー化する可能性を保持するかどうかを示すために、Ｑｕａｄ１４および１５をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させ、タンパク質サンプルを上記のように全細胞抽出物から調製した。タンパク質サンプルは、変性および非変性（天然）条件下で、ＰＡＧＥゲル上で分離された。天然ゲルは、上記のプロトコルを使用して調製したが、ＳＤＳは使用しなかった。ＰＡＧＥゲルからのタンパク質をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄの０．４５μＭのＰＶＤＦ膜に転写した。特定のタンパク質発現は、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体を用いてプローブした。

変性条件下で予想されるように、Ｑｕａｄ１４および１５からのＶＨ－ＮＨＲ２ ＴＤの発現は、予想される分子量（２２および２２．３ｋＤａ）で特定のタンパク質バンドを検出できる単量体として見なすことができる（図２０Ａ）。非変性、したがって天然の条件下では、興味深いことに、Ｑｕａｄ１４および１５からのＶＨ－ＮＨＲ２ ＴＤの単量体または二量体は検出することができない（図２０Ｂ）。Ｑｕａｄ１４および１５からのＶＨ－ＮＨＲ２ ＴＤの四量体であると考えられる高分子量タンパク質バンドのみを検出することができる。四量体の集合は、タンパク質の強度と、Ｑｕａｄ１４および１５の検出可能な単量体および二量体が不在であることから判断すると、非常に効率的かつ純粋であるように見える。

実施例４～７のデータとともに、ＮＨＲ２ ＴＤは非常に用途が広く、さまざまなタンパク質結合ドメインとエフェクター分子との融合を可能にするという決定的な証拠がある。ＮＨＲ２ ＴＤは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの真核細胞からのタンパク質の可溶性発現を可能にし、それらは非常に安定しかつ純粋な四量体分子を形成する。

さらなる実施例
方法
発現ベクター
すべてのＤＮＡフラグメントは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって合成され、発現ベクターｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化された。合成されたＤＮＡフラグメントの概略図および配列を、それぞれ図２２および表８～１０に示す。

プラスミドＤＮＡの調製
Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された凍結乾燥プラスミドＤＮＡを、ＭＱ水を用いて５０ｎｇ／μｌの濃度に再懸濁した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５α細胞は、従来のヒートショック法を使用して５０ｎｇのＤＮＡで形質転換された。形質転換細胞を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。個々のコロニーを選定し、ＬＢブロス中で３７℃、２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎプラスミド抽出キット、を製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従って使用して、細胞から精製した。

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるＱｕａｄタンパク質の発現
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ^（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｅｘｐｉ２９３^（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、製造元の推奨に従って培養した。唯一の例外は、細胞が分裂し、非通気キャップを使用した場合、５％ＣＯ_２をフラスコに直接添加したことであった。

異なるトランスフェクション試薬を伴う２つの方法をタンパク質発現に利用した。３０ｍｌ培養の方法が以下に記載されており、プロトコルは実験要件に応じてスケールアップまたはスケールダウンするように適合された。

ＰＥＩトランスフェクションの場合、ＮＣ－３０００^（商標）（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）を使用してトランスフェクションの１日前に細胞を計数し、Ｅｘｐｉ２９３発現培地をチ擁して、１．５×１０^６細胞／ｍｌに希釈した。細胞を、５％ＣＯ_２中で、３７℃にて、１２５ｒｐｍで一晩培養した。翌日、細胞を計数し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、新鮮な培地３０ｍｌに２×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁した。３３ｕｇのプラスミドＤＮＡを９００ｕｌの培地に添加し、９０ｕｌのＰＥＩＭａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を９００ｕｌの培地に添加した。ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬のサンプルを混合し、室温で１５分間インキュベートした。ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合物を細胞に添加し、前と同じように培養し、さらに７２時間インキュベートした。

Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ^（商標）２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるトランスフェクションについては、トランスフェクションの１日前に、細胞をまた１．５×１０^６細胞／ｍｌに、Ｅｘｐｉ２９３^（商標）発現培地中で希釈した。トランスフェクション当日に、細胞を遠心分離し、新鮮な培地３０ｍｌに２．５×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁した。１．５ｍｌのＧｉｂｃｏ^（商標）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ^（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する２本のチューブを準備した。３０ｕｇのプラスミドＤＮＡを一方のチューブに添加し、８０ｕｌのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅをもう一方のチューブに添加した。溶液を混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡトランスフェクション試薬複合体を細胞に添加し、これを、５％ＣＯ_２中で３７℃にて１２５ｒｐｍで培養した。１６～１８時間のインキュベーション後、製造元のプロトコルに従って、トランスフェクションエンハンサー１および２を細胞に添加した。細胞をさらに９６時間インキュベートした。

Ｈｉｓタグ付きタンパク質の精製
４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により細胞を回収した。約３０ｍｌの上清を０．２２μｍのフィルタで濾過し、カラムへの結合を促進するためのＣｏｍｐｌｅｔｅ^（商標）ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する結合緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）で５０ｍｌに希釈した。１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ^（商標）ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＡＫＴＡ Ｓｔａｒｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続し、結合緩衝液で事前に平衡化した。タンパク質含有培地を、１ｍｌ／分の流速を使用してカラムに充填した。カラムを＞１０ＣＶの結合緩衝液で洗浄した後、１２ｍｌ超の２０～３００ｍＭのイミダゾールグラジエントを使用してタンパク質を溶出した。０．５ｍｌの画分を採集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。タンパク質含有画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ登録商標超遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。

親和性クロマトグラフィー後に、タンパク質を急速凍結し、－８０℃で保存し、さまざまなＱｕａｄフォーマットの分子量を評価するために濾過したゲルの特定の適用のために代替緩衝液中で透析した。後者の分析では、タンパク質サンプルを１．５～２ｍｌに濃縮し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭのＮａＣｌを使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １６／６００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲル濾過した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離することにより、精製されたタンパク質を分析した。典型的には、１レーンあたり１～２μｇの精製タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに装填した。ゲルは、０．１％ＳＤＳを含むトリス－グリシン緩衝液で泳動させた。１５０ボルトの定電圧を使用し、染料フロントが完全に移動するまでゲルを約７０分間泳動させた。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１５％Ｂｉｓ－トリス）ゲルは、以下の分離およびスタッキングゲルを使用して調製した。

分解ゲル：
・５ｍｌの３０％ビス－アクリルアミド
・２．６ｍｌの１．５Ｍトリス（ｐＨ８．８）
・５０μｌの２０％ＳＤＳ
・１００μｌの１０％ＡＰＳ
・１０μｌのＴＥＭＥＤ
・２．２ｍｌのＭＱ水

スタッキングジェル：
・０．７５ｍｌの３０％ビス－アクリルアミド
・１．２５ｍｌの１．５Ｍトリス（ｐＨ８．８）
・２５μｌの２０％ＳＤＳ
・５０μｌの１０％ＡＰＳ
・５μｌのＴＥＭＥＤ
・２．９ｍｌのＭＱ水

一般的な直接結合ＥＬＩＳＡアッセイ
精製されたＱｕａｄタンパク質がその標的タンパク質に結合する可能性を、結合ＥＬＩＳＡを方向付けることによって確認した。簡単に説明すれば、高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、組換え標的タンパク質をコーティングするために使用し（ＰＢＳ中で１～５ｕｇ／ｍｌに希釈するか、または指示されたように希釈）、これを、典型的には、４℃で一晩保存した。次いで、プレートを２００ｕｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ）で３回洗浄し、２００ｕｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ）を使用して室温で１時間遮蔽した。精製されたタンパク質サンプルは典型的には、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ）で連続希釈され、１００ｕｌ／ウェルで添加される。サンプルを室温で１時間インキュベートした後、２００ｕｌの洗浄緩衝液を使用してプレートを再度３回洗浄する。製造元の推奨に従って希釈した抗Ｈｉｓ ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートを最後に３×２００ｕｌの洗浄緩衝液を使用して洗浄し、ウェル当たり５０ｕｌの予熱した検出試薬（ＴＭＢ－Ｓｉｇｍａ）を添加し、プレートを暗所で１０～３０分間インキュベートする。２５ｕｌ／ウェルの１Ｍの硫酸を添加することにより反応を停止させる。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。

実施例８：単一特異性四価のｄＡｂ Ｑｕａｄの発現
この実施例では、ｐ５３四量体化ドメインに融合した抗体可変フラグメント（ｄＡｂ）（ＶＨまたはＶＬ、ＶκまたはＶλ）の単一ドメインが融合した多量体フォーマット（「Ｑｕａｄ」フォーマット）が例示されている。

抗ＩＬ１７ＡのｄＡｂ ＶＨ配列（ＷＯ２０１０／１４２５５１Ａ２から適合した配列）は、四価のｄＡｂ Ｑｕａｄフォーマット（Ｑｕａｄ５７）（配列番号１４６）に設計された。Ｑｕａｄ５７の発現ベクターは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成され、上記に記載されるようにＨＥＫ２９３細胞で発現された。分泌されたＱｕａｄ５７タンパク質を細胞上清から採集し、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを使用して精製した。Ｑｕａｄ５７の可溶性発現および純度を実証するために、精製タンパク質のごく一部（１．５ｕｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離した（図２３）。Ｑｕａｄ５７に対応する予想サイズ（１８ｋＤａ）で純粋なタンパク質を検出でき、四価のｄＡｂ Ｑｕａｄタンパク質の可溶性発現が確認された。四価の単一特異性ｄＡｂ Ｑｕａｄの概略図を図２２－Ａ（すなわち、図２２Ａの実施形態Ａ）に示す。

実施例９：二重特異性四価ｄＡｂ Ｑｕａｄの発現および結合分析
二重特異性四価ｄＡｂ Ｑｕａｄは、２つの異なるｄＡｂ結合ドメインがＮ末端およびＣ末端を介してｐ５３四量体化ドメインに連結され、図２２－Ｃ（すなわち、図２２Ａの実施形態Ｃ）に概略的に示されるように、この実施例で例示されている。

二重特異性四価ｄＡｂ Ｑｕａｄの特定の例では、オゾラリズマブ由来の抗ＴＮＦａ ｄＡｂ ＶＨ結合ドメインは、ｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に結合し、抗ＩＬ１７Ａ ｄＡｂ ＶＨ結合ドメイン（ＷＯ２０１０／１４２５５１Ａ２から適合された配列）は、ｐ５３四量体化ドメイン（Ｑｕａｄ５４）（配列番号１４３）のＣ末端に連結していた。この特定の例では、両方のｄＡｂ結合ドメインがＶＨであったが、ｄＡｂ結合ドメインはＶκまたはＶλ、あるいは異なるｄＡｂフォーマットの組み合わせである可能性がある。

そのような二重特異性四価ｄＡｂ Ｑｕａｄフォーマットを可溶性タンパク質として発現できるかどうかを実証するために、二重抗ＴＮＦａおよび抗ＩＬ１７Ａ ｄＡｂ結合ドメインを含む発現構築物をＱｕａｄフォーマットとして合成し、ＨＥＫ２９３細胞で発現させた。ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを使用して培養上清からタンパク質を精製した後、約１．５ｕｇの精製タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離した（図２４Ａ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから、予想されるサイズ（３０．７ｋＤａ）の純粋な生成物が見られ、可溶性の二重特異性四価ｄＡｂ Ｑｕａｄの発現が確認された。

そのような二重特異性四価抗ＴＮＦａ×抗ＩＬ１７Ａ ｄＡｂ Ｑｕａｄの機能をさらに例示するために、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。高タンパク質結合の９６個のウェルプレート（コーニング）を１ｕｇ／ｍｌ組換えヒトＴＮＦａタンパク質（Ａｂｃａｍ）でコーティングし、上記の方法を使用して連続希釈したＱｕａｄ５４タンパク質で直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。典型的なシグモイド用量反応曲線は、低ｐＭ範囲（約１０ｐＭ）で最大結合の半分を有する組換えヒトＴＮＦａタンパク質を用いたＱｕａｄ５４直接結合ＥＬＩＳＡから得られた（図２４Ｂ）。これは、二重特異性四価抗ＴＮＦａ×抗ＩＬ１７Ａ ｄＡｂ Ｑｕａｄが可溶性タンパク質として発現できるだけでなく、それらが高い結合強度で標的タンパク質に結合できるという点でも機能的であることを確認している。高い結合強度は、四価の結合によって得られる結合活性の増加の尺度である可能性が高く、これはＱｕａｄ多価分子の重要な特徴を強調する。

実施例１０：単一特異性四価ｓｃＦｖ Ｑｕａｄの発現、結合および機能分析
この実施例では、２つの異なる標的のｓｃＦｖ結合ドメインが選択され、ｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に個別に接続されて、図２２－Ｄ（すなわち、図２２Ｂの実施形態Ｄ）に概略的に示される単一特異性四価ｓｃＦｖ Ｑｕａｄが生成される。

一例では、ｓｃＦｖ結合ドメインは抗ＴＮＦａであり、ＶＨおよびＶκ配列がＨｕｍｉｒａからｓｃＦｖ Ｑｕａｄフォーマットに適合された。ペプチドリンカーの存在がＱｕａｄ分子の発現とその標的タンパク質への結合に影響を与えたかどうかを分析するために、この実施例では、抗ＴＮＦａ ｓｃＦｖ結合ドメインを（Ｇ４Ｓ）３ペプチドリンカー（Ｑｕａｄ６３）（配列番号１４７）を介して、またはペプチドリンカーなし（Ｑｕａｄ５１）（配列番号１３９）のいずれかでｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に連結された。

別の例では、ｓｃＦｖ結合ドメインは、Ｗｕら（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００１）から適合された抗ＣＤ２０であった。抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ結合ドメインは、ペプチドリンカー（Ｑｕａｄ５３ Ｔｅｔ）（配列番号１４１）なしで結合ドメインをｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に直接結合することにより、四価のＱｕａｄフォーマットに設計された。

すべての四価ｓｃＦｖ ＱｕａｄをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、培養上清からの可溶性タンパク質を、上記のようなＨｉｓＴｒａｐ^（商標）ＨＰカラムを使用して精製した。少量の精製タンパク質（約１．５ｕｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、発現および純度を確認した。

抗ＴＮＦａ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄ（Ｑｕａｄ５１および６３）は可溶性タンパク質と同様に発現することが分かり、ｓｃＦｖをｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に結合するペプチドリンカーの存在または非存在は、発現に影響を与えないようであった（図２５Ａ）。さらに、分泌された可溶性Ｑｕａｄタンパク質の純度は、非常に純粋であるように見える（＞９９％）。これらのＱｕａｄをさらに特徴付けるために、Ｑｕａｄ５１とＱｕａｄ６３の両方を、組換えヒトＴＮＦａ（Ａｂｃａｍ）を使用した直接結合ＥＬＩＳＡアッセイで分析した。高結合の９６個のウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を１ｕｇ／ｍｌのヒトＴＮＦａタンパク質でコーティングし、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを上記に記載されるように連続希釈したＱｕａｄ５１およびＱｕａｄ６３タンパク質を使用して実施した。Ｑｕａｄ５１とＱｕａｄ６３についての両方で用量依存的な結合の増加が観察され、これらの抗ＴＮＦａ ｓｃＦｖが正しく組み立てられ、ネイティブの結合機能がこのＱｕａｄフォーマットで保持されていることが確認した。さらに、Ｑｕａｄ５１とＱｕａｄ６３の結合プロファイルは、低ｐＭ範囲（約３０ｐＭ）で最大結合濃度の半分を有する両方のＱｕａｄがと非常に類似していることが分かった（図２５Ｂ）。総合すると、これらのデータは、ペプチドリンカーの有無がタンパク質発現またはそれらの標的タンパク質へのＱｕａｄ結合強度に影響を与えないことを確認する。

ＴＮＦａを中和する抗ＴＮＦａ Ｑｕａｄ５１分子の活性をさらに機能的に特徴付けるために、ＴＮＦａに非常に敏感なＷＥＨＩ－１３ＶＡＲ細胞（ＡＴＣＣ）を使用して細胞ベースのアッセイを実施した。ＷＥＨＩ細胞を使用したバイオアッセイを、以下に記載されるように設定した。一価の抗ＴＮＦａ（Ｗ５１ＳｃＦｖ）を対照（Ｓｅｑ ＩＤ：１５０）としてアッセイに含め、Ｈｕｍｉｒａを陽性対照として使用した。Ｗ５１ＳｃＦｖは、ｐ５３四量体化ドメインが除去されたＱｕａｄ５１を改変することによって生成された。Ｗ５１ＳｃＦｖの発現はＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図２５Ｃ）。

簡潔に説明すると、ＷＥＨＩ－１３ＶＡＲ細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＢＳ中、９６個のウェルプレートにウェル当たり１×１０^４細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。培地を細胞から吸引し、２ｕｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ、０．１ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦα（ａｂ９６４９、Ａｂｃａｍ）および０～２４００ｐＭのＱ５１、Ｑ３５、Ｗ５１ＳｃＦＶおよびヒョウミラを含有する培地と交換した。］サンプルは、ＴＮＦαおよび抗体対照なしで、４通りでセットアップされた。細胞を標準的な培養条件下でさらに２０～２２時間インキュベートした。

細胞生存率を評価するために、代謝的に活性な細胞によって生成されたＡＴＰを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元の指示に従って使用して定量化した。発光シグナルは、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。化合物で処理された細胞から得られた発光シグナルは、対照の培地に対して正規化された。ＷＥＨＩ細胞の５０％が生存率を保持する有効量（ＥＤ）を計算し、Ｑｕａｄ５１、Ｈｕｍｉｒａ、およびＷ５１ＳｃＦＶのＥＤ５０を表１１にまとめている。

予想通り、４つの抗ＴＮＦａ結合ドメインを有するＱｕａｄ５１は、ＴＮＦａに対して２つの結合ドメインを有するＨｕｍｉｒａと比較して、ＷＥＨＩ細胞に対する組換えヒトＴＮＦａタンパク質の細胞傷害性効果を中和するために最も効果的であることが分かった。ＴＮＦａの結合ドメインを１つのみ有するＷ５１ＳｃＦｖ対照は、最も高いＥＤ５０を有していた。ＴＮＦａに対する抗ＴＮＦａ分子の価数の増加は、ＥＤ５０値の減少と逆相関した。これらのデータは、原子価の増加に伴うＱｕａｄ分子の強化された機能的効力を強調しており、これは、多くの研究（Ａｌａｍ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｒｕｄｎｉｃｋ＆Ａｄａｍｓ ２００９；Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｂｒｕ ｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６）によって報告されるように、結合活性対効力の一般的な概念と一致している。さらに、Ｑｕａｄ分子の結合活性の増加を使用して、腫瘍細胞で高度に発現する腫瘍関連抗原を選択的に駆動し、これにより、Ｓｌａｇａらによって概説された例で報告されているように（Ｓｌａｇａ ｅｔ ａｌ．２０１８）、健康な細胞に対するｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｕｒ効果を制限することができる。

ＴＮＦａが誘導するカスパーゼ３の活性化を遮蔽する抗ＴＮＦａ Ｑｕａｄ５１の能力をさらに実証するために、対照としてＨｕｍｉｒａおよびＷ５１ＳｃＦｖと一緒にウエスタンブロット分析を実行した。簡潔に説明すると、ＷＥＨＩ－１３ＶＡＲ細胞を、培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＢＳ）中、６個のウェルプレートにウェル当たり２．５×１０^６細胞で播種し、一晩インキュベートした。培地を、２ｕｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ、１ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦα、および５００ｐＭのＱｕａｄ５１、Ｗ５１ＳｃＦＶ、およびＨｕｍｉｒａを含有する培地と交換した。培地のみおよび２ｕｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含有する培地を対照として含めた。細胞をＴＮＦαおよび＋／－抗ＴＮＦａ分子とともに１０時間インキュベートした。

細胞は、１ｍＭのＤＴＴおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ^（商標）ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）を使用して溶解させた。細胞溶解物は、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ登録商標Ｐｉｃｏ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用して超音波処理され、各サンプルのタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。１０ｕｇのタンパク質を１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで電気泳動し、バンドをその後Ａｍｅｒｓｈａｍ^（商標）Ｈｙｂｏｎｄ登録商標Ｐ ０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅに転写した。膜を１０％－ＢＳＡ－ＴＢＳＴまたは５％－ｍｉｌｋ－ＴＢＳＴで遮蔽した後、適切な抗体（抗カスパーゼ－３（１／１０００、ＣＳＴ、９６６５）および抗切断カスパーゼ－３（１／１００、ＣＳＴ、９６６４））とともに４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し、抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ結合（１／２５００、ＣＳＴ、７０７４Ｓ）二次抗体と、室温で２時間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、膜はＰｉｅｒｃｅ^（商標）ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣＬ－ＸＰｏｓｕｒｅ^（商標）フィルム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発色させた。

ウエスタンブロットから、Ｑｕａｄ５１は、Ｈｕｍｉｒａと同様に、検出可能な切断カスパーゼ－３なしで、ＴＮＦａを介したカスパーゼ－３の活性化を効果的に中和できることがわかる（図２５Ｄ）。高いＥＤ５０値を有する一価のＷ５１ＳｃＦｖ抗ＴＮＦａ制御分子は、ＴＮＦａを介したカスパーゼ－３の活性化を完全に中和することは不可能だが、これは、このサンプルに切断カスパーゼ－３が存在することによって示される。これらのデータは、Ｑｕａｄ５１の作用メカニズムがＨｕｍｉｒａ（商標）と同様のシグナル伝達機構を介していることを確認している。

２番目の例では、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄ（Ｑｕａｄ５３ Ｔｅｔ）をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、精製後、タンパク質発現分析とタンパク質結合アッセイを実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、Ｑｕａｄ５３ Ｔｅｔの可溶性発現が高純度タンパク質（＞９９％）であることを確認した（図２５Ｅ）。連続希釈したＱｕａｄ５３ Ｔｅｔタンパク質を使用した組換えヒトＣＤ２０タンパク質（Ａｂｃａｍ）を使用したＥＬＩＳＡ結合アッセイは、結合における用量依存的な増加を確認した。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ ＱｕａｄがＣＤ２０への結合を保持する能力は、このＱｕａｄフォーマットの機能分子への正しい集合を再び確認している（図２５Ｆ）。

実施例１１：単一特異性八価ｓｃＦｖ Ｑｕａｄの発現および結合分析
この実施例では、ｓｃＦｖ結合ドメインの原子価が４（四価）から８（八価）に増加した。これは、図２２－Ｅに概略的に示されているように、ｓｃＦｖをｐ５３四量体化ドメインのＮ末端とＣ末端の両方に連結することによって達成された。

実施例１０で説明したように、この実施例では、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ結合ドメインを使用して、単一特異性の八価抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄ（Ｑｕａｄ５３ Ｏｃｔ）（配列番号１４２）を構築した。この特定の例では、ｓｃＦｖはペプチドリンカー無しでｐ５３四量体化ドメインのＮ末端とＣ末端に接続されていたが、しかしながら、この形式の他の例では、結合ドメインの柔軟性を高めるために、ペプチドリンカーを一方または両方の端に導入することができた。

培養上清からのＱｕａｄ５３ Ｏｃｔタンパク質の発現および精製に続いて、タンパク質発現分析ならびにＥＬＩＳＡ結合アッセイを実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離されたタンパク質は、高純度（＞９９％）のＱｕａｄ５３ Ｏｃｔの可溶性発現を確認した（図２６Ａ）。ＥＬＩＳＡ結合アッセイはまた、組換えＣＤ２０および連続希釈したＱｕａｄ５３ Ｏｃｔタンパク質を使用して実施した（図２６Ｂ）。結合において用量依存的な増加が見られ、八価フォーマットでの抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖの正しい集合が確認された。

原子価の増加が標的タンパク質結合に及ぼす影響を分析するために、四量体化ドメインのないｓｃＦｖ抗ＣＤ２０を構築して、一価の対照（Ｑｕａｄ５３ Ｍｏｎ）（配列番号１４０）として機能させた。タンパク質の発現と精製に続いて、３つ全てのＱｕａｄ５３抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ分子（一価、四価、および八価）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で並べて分離し（図２６Ｃ）、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを実施した（図２６Ｄ）。３つの全てのＱｕａｄ５３分子で、結合の用量依存的な増加が見られ、結合強度の全体的な増加は、原子価の増加に反映されていた。八価の抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖバージョンは、全体的な結合強度が最も高く、次に四価バージョン、次に一価バージョンが続くことが分かった。注目すべきは、標的タンパク質が９６ウェルプレートに密にコーティングされてＣＤ２０へのＱｕａｄ５３結合飽和が急速に起こる直接結合ＥＬＩＳＡの性質により、この方法を使用して真の結合力（総結合強度）を正確に決定できないということである。直接結合ＥＬＩＳＡのこれらの制限にもかかわらず、図２６Ｄに見られるように、結合の代表的な増加は、原子価の増加とともになおも観察することができた。

実施例１２：二重特異性四価ｓｃＦｖ Ｑｕａｄの発現および結合分析
この実施例では、２つの異なる標的タンパク質に対して特異性を有する２つの異なるｓｃＦｖ結合ドメインが、Ｎ末端とＣ末端を介してｐ５３四量体化ドメインに接続され、図２２－Ｆに概略的に例示されているように二重特異性四価ｓｃＦｖ Ｑｕａｄが得られた。

この実施例で使用されている特定のｓｃＦｖ結合ドメインは、抗ＴＮＦａおよび抗ＩＬ１７Ａに対して特異性を有する。抗ＴＮＦａ ｓｃＦｖ配列はＨｕｍｉｒａから適合され、抗ＩＬ１７Ａ ｓｃＦｖ配列はイセキズマブ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）から二重特異性Ｑｕａｄフォーマット（Ｑｕａｄ５５）（配列番号１４４）に適合された。可溶性発現を確認するために、Ｑｕａｄ５５をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、分泌されたタンパク質を培養上清から精製した後、タンパク質を分析した。（図２７Ａ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したタンパク質は、この二重特異性ｓｃＦｖ Ｑｕａｄフォーマットの高純度（＞９９％）での可溶性発現を確認した。このフォーマットが機能するかどうかをさらに分析するために、抗ＴＮＦａ ｓｃＦｖアームに対してＥＬＩＳＡ結合アッセイを実施した（図６Ｂ）。Ｑｕａｄ５５の組換えヒトＴＮＦａへの結合の用量依存的な増加が見ることができ、Ｑｕａｄ５５が正しく集合したことを確認した。さらに、Ｑ５５は、実施例１０で詳述されたＱｕａｄ５１と同様の、低ｐＭ範囲で最大の半分の結合を有しているようである。

実施例１３：二重特異性四価ｓｃＦｖ×ｄＡｂ Ｑｕａｄの発現および結合分析
この実施例では、図２２－Ｇに概略的に例示されているように、２つの異なる標的タンパク質に対して特異性を有する２つの異なる結合ドメインフォーマットが、それぞれｐ５３四量体化ドメインのＮ末端およびＣ末端に連結された。

第１の結合ドメインは、実施例１２に詳述されるような、Ｎ末端を介してｐ５３四量体化ドメインに連結された抗ＴＮＦａ ｓｃＦｖであった。第２の結合ドメインは、配列決定された抗ＩＬ１７Ａ ｄＡｂであり、実施例９（Ｑｕａｄ５６）（配列番号１４５）に詳述されるように、Ｃ末端を介してｐ５３四量体化ドメインに連結された。

この二重特異性四価ｓｃＦｖ×ｄＡｂ Ｑｕａｄフォーマットの可溶性発現は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで精製タンパク質を分析することにより確認された（図２８Ａ）。追加のＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、抗ＴＮＦａ結合アーム（図２８Ｂ）に対して実行され、用量依存的な結合の増加が観察された。これにより、この二重特異性ｓｃＦｖ×ｄＡｂ Ｑｕａｄフォーマットの正しい発現および集合が確認された。

上記の実施例（実施例１０、１２、および１３）では、抗ＴＮＦａ×抗ＩＬ１７Ａに対して特異性を有する異なる二重特異性Ｑｕａｄフォーマット（Ｑｕａｄ５４～５６）を作成し、抗ＴＮＦａ結合アームについてのＥＬＩＳＡ結合アッセイによって発現および機能性を分析した。これまでに示されたデータから、ｐ５３四量体化ドメインは非常に用途が広く、Ｎ末端とＣ末端のいずれかまたは両方での異なる結合ドメインとの融合に適していることが明らかである。Ｑｕａｄ５４～５６の機能的結合強度を比較するために、異なる二重特異性Ｑｕａｄの抗ＴＮＦａ結合アームのＥＬＩＳＡ結合アッセイデータを並べてプロットした（図２８Ｃ）。３つの二重特異性Ｑｕａｄフォーマット全ての用量反応曲線は非常に類似しているようであり、結合ドメインフォーマット（ｓｃＦｖまたはｄＡｂ）が結合に影響を与えないことを示している。これは、高い結合強度を有する高純度の多価可溶性タンパク質を生成するためのｐ５３四量体化ドメインの多様性と有用性をさらに強調している。

実施例１４：四価の単一特異性Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄｖ１の発現および結合分析
この実施例では、ｓｃＦｖ結合ドメインがコアヒンジおよび上部ヒンジ領域なしでＩｇＧ１ Ｆｃの下部ヒンジ／ＣＨ２ドメインに連結され、ｓｃＦｖ単量体Ｉｇ Ｆｃ（ｓｃＦｖ－ｍＦｃ）が生成され、すなわち、ここで、ポリペプチド単量体を使用して多量体が形成されるとき、Ｆｃは別のＦｃと対合しない。典型的には、コアヒンジ領域に存在するシステイン残基を含むＣＸＸＣモチーフは、鎖間ジスルフィド結合の形成に関与する。したがって、コアヒンジ領域を除外することにより、Ｆｃ領域は、天然ＩｇＧ抗体に通常見られる密に詰まったホモ二量体構造を形成することが抑制される。エフェクター機能に必要なＦｃγ受容体との適切な相互作用を可能にするために、下部ヒンジ／ＣＨ２ドメインはそのままの状態保つ。

ｓｃＦｖ－ｍＦｃは、Ｎ末端を介してｐ５３四量体化ドメインに接続することによって、Ｑｕａｄ形式に設計され、図２２－Ｉ（すなわち、図２２Ｄに示される実施形態Ｉ）に概略的に示されるバージョン１と称される四価の単一特異性Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄを生成する。

この実施例では、上部ヒンジも除外されたが、他の実施例では、上部ヒンジ領域を任意に完全に保持するか、または部分的にそのまま保持して、単一特異性、二重特異性、三重特異性、または四重特異性を有する、ｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（図２２－Ｈ、Ｌ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＡＡ、ＡＢ、およびＡＣに概略的に例示される）、ｓｃＦｖ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（図２２－Ｉ、Ｍ、Ｘ、およびＡＡに概略的に例示される）ならびにＦａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（図２２－Ｊ、Ｋ、Ｎ、およびＯに概略的に例示される）を生成することができる。この特定の実施例では、ヒトＩｇＧ１が例として使用されたが、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ｇＧ４またはそれらの誘導体を含む他のＩｇＧアイソタイプのいずれかであり得る。ヒトＩｇＧヒンジ領域をコードするアミノ酸配列を表１２に示す。

この特定の例で使用されたｓｃＦｖ結合ドメインは、実施例１０で説明されている抗ＣＤ２０のドメインであった。抗ＣＤ２０ｓｃＦｖは、ペプチド（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介してＦｃの下部ヒンジ／ＣＨ２ドメインに連結された。ｐ５３四量体化ドメインは、いずれのペプチドリンカーなしでＣＨ３ドメインのＣ末端に直接接続されていた（Ｑｕａｄ６４）（配列番号１４８）。任意のリンカーは、ＣＨ３ドメインと多量体化ドメインとの間のこの接合部に含めて、柔軟性を提供することができる。

Ｑｕａｄ６４の発現および精製に続いて、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって定量および分析した（図２９Ａ）。Ｎａｎｏｓｐｅｃを使用したタンパク質の定量は、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム精製後、１３０ｍｇ／Ｌに相当するタンパク質収量で高いタンパク質収量を確認した。加えて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで見られる予想サイズ（５８．２ｋＤａ）の単一タンパク質バンドは、高純度（＞９９％）の四価単量体Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄタンパク質の発現を確認した。発現されたＩｇ Ｑｕａｄタンパク質が正しく集合されているかどうかを分析するために、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを実行した（図２９Ｂ）。Ｑｕａｄ６４は、組換えヒトＣＤ２０への結合を用量依存的に保持することが分かり、正しく集合され、機能的に活性であることを確認した。

実施例１５：四価の単一特異性Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄｖ２の発現および結合分析
この実施例では、実施例１４に記載される四価単量体Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄの異なるバージョンが構築され、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ結合ドメインは、ｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に直接連結された。下部ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有するｍＦｃは、ｐ５３四量体化ドメインのＣ末端に直接連結された。このバージョンの四価単量体Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄはバージョン２と称され、図２２－Ｍに概略的に表示されている（すなわち、図２２Ｆに示されている実施形態Ｍ）。

以下に説明される特定の実施例では、上部ヒンジは含まれていなかったが、他の実施例では、上部ヒンジ領域は、任意に、完全に保持するか、または部分的にのみそのままの状態でに保つことができる。

他の実施例では、バージョン２構成は、図１－Ｌ、Ｘ、Ｚ、およびＡＡに概略的に例示されるように、ｄＡｂ結合ドメインを含有し、それぞれ、単一特異性、二重特異性、または三重特異性のＱｕａｄ分子を生成する。別の例では、結合ドメインは、図２２－ＮおよびＯに概略的に例示されるＦａｂである可能性がある。さらに別の実施例では、バージョン２をｍＦｃなしで作製して、四価のＦａｂを単一特異性（図２２－ＱおよびＲに概略的に例示される）または二重特異性（図２２－Ｓに概略的に例示される）として与えることができる。

ＣＤ２０（Ｑｕａｄ６５）（配列番号１４９）に特異的な四価の単量体Ｉｇ ｓｃＦｖ Ｑｕａｄバージョン２の発現構築物をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、可溶性分泌タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。Ｎａｎｏｓｐｅｃを使用したタンパク質の定量は、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム精製後、１６０ｍｇ／Ｌに相当するタンパク質収量で高いタンパク質収量を確認した。加えて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで見られる予想サイズ（５７．２ｋＤａ）の単一タンパク質バンドは、高純度（＞９９％）の発現を確認した（図３０Ａ）。発現されたタンパク質の完全性は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって分析された。組換えヒトＣＤ２０タンパク質は、連続希釈されたＱｕａｄ６５タンパク質を使用した直接結合ＥＬＩＳＡで使用された。Ｑｕａｄ６５はＣＤ２０に用量依存的手順において結合することがわかり（図３０Ｂ）、正しく集合され、機能的に活性であることを確認した。

上記および実施例１４に概説されたデータは、四価の単量体Ｉｇ分子の可溶性および機能的発現の最初の例を表している。そのような多価単量体Ｆｃフォーマットは、Ｆｃを欠くスキャフォールドおよび抗体フラグメントベースの分子を超えるいくつかの利点を有する。第一に、単量体ＱｕａｄフォーマットのＦｃ領域の存在は、これらの分子のインビボでの延長された半減期を提供する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合を可能にすることである。第二に、Ｆｃ領域の存在は、複数のＦｃ受容体に結合して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を誘導するための能力を有することである（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２）。第三に、この実施例で概説されている概念実証データは、任意の所与のモノクローナルＩｇＧ抗体が、図２２－Ｊ、Ｋ、Ｎ、およびＯに概略的に示されるように、多価単量体Ｉｇ Ｑｕａｄフォーマットに迅速にフォーマットすることができることを示唆していることである。これらのフォーマットはＩｇＧ抗体の天然の結合ドメインアーキテクチャを保持しているため、多価単量体Ｉｇ Ｑｕａｄフォーマットでは、多価性によって得られる結合活性が増加するため、標的タンパク質の結合強度が大幅に増加する。このような単量体のＩｇ Ｑｕａｄフォーマットは、増強された標的タンパク質の中和能（Ｂｏｒｕａｈ ｅｔ ａｌ．２０１３； Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）、ならびに増強された細胞表面受容体を架橋してアポトーシスを媒介するための効率（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）を有する新規のクラスの治療用分子を提供し、アゴニストの可能性が強化された受容体スーパークラスタリングを介してシグナル伝達を誘導する（Ｍａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１８）。

実施例１６：八価の二重特異性Ｑｕａｄの発現
八価の二重特異性Ｑｕａｄの特定の実施例では、ＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢのｄＡｂ結合ドメインを、がん治療のための免疫チェックポイント阻害剤と免疫共刺激分子の二重標的化のために使用した。他の例では、ｄＡｂ結合ドメインは、二重チェックポイント阻害剤の二重特異性多量体（例えば、ＰＤ－Ｌ１×ＣＴＬＡ－４）または二重チェックポイント阻害剤と免疫共刺激二重特異性多量体（例えば、ＰＤ－Ｌ１×４－１ＢＢ）または二重免疫共刺激二重特異性多量体（例えば、４－１ＢＢ×ＯＸ４０）を提供するための、任意の免疫チェックポイント阻害剤および任意の共刺激分子またはそれらの混合物に特異性を有し得る。

八価二重特異性Ｑｕａｄを例示するために、２つの異なるバージョンを構築して、可溶性Ｑｕａｄタンパク質の発現を実証した。１つのフォーマットでは、ＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢ ｄＡｂ結合ドメインは、図３１－Ａに概略的に示されるように、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかでタンデムｄＡｂとしてｐ５３多量体化ドメインに連結された。

八価の二重特異性多量体の第２の例では、ＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢのｄＡｂ結合ドメインは、図３１－Ｂに概略的に示されるように、それぞれ反対の末端でｐ５３四量体化ドメインに連結された。

ＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢのｄＡｂ結合ドメイン配列は、ＷＯ２０１７／１２３６５０Ａ２から適合された。八価二重特異性Ｑｕａｄの第１のバージョンでは、Ｎ－Ｃ末端方向に抗ＰＤ－Ｌ１および抗４－１ＢＢを含むタンデムｄＡｂが、ペプチドリンカーなしでｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に連結された。このバージョンは、Ｑｕａｄ６８（配列番号１９０）と称される。しかしながら、他の例では、タンデムｄＡｂは、任意のペプチドリンカーを介して、そして表８－Ｐにさらに記載されるように、四量体化ドメインに連結することができる。

八価の二重特異性Ｑｕａｄ多量体の第２のバージョンでは、抗ＰＤ－Ｌ１ ｄＡｂがｐ５３四量体化ドメインのＮ末端に連結され、抗４－１ＢＢ ｄＡｂがＣ末端に連結された。このバージョンは、Ｑｕａｄ６９（配列番号１９１）と称される。この特定の例では、ｄＡｂはペプチドリンカーなしで四量体化ドメインに連結された。しかしながら、他の例では、ｄＡｂは、任意のリンカーを介して、そして表８－Ｃでさらに記載されるように、四量体化ドメインに連結することができる。

Ｑｕａｄ６８および６９の発現構築物を、ＨＥＫ２９３中で発現させて、分泌された可溶性タンパク質を培養上清から精製した。精製したＱｕａｄタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図３１－ＣおよびＤ）。Ｎａｎｏｓｐｅｃを使用したＱｕａｄ６８およびＱｕａｄ６９のタンパク質の定量は、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム精製後、それぞれ２９７ｍｇ／Ｌおよび３６０ｍｇ／Ｌに相当するタンパク質収量で高いタンパク質収量を確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで見られるように、予想されるサイズ（３２ｋＤａ）でＱｕａｄ６８とＱｕａｄ６９の両方についての単一のタンパク質バンドの存在により、高純度（＞９９％）を有する発現を確認した（図３１－ＣおよびＤ）。

タンデム（Ｑｕａｄ６８におけるように）または反対方向（Ｑｕａｄ６９におけるように）のｄＡｂの構成は、４－１ＢＢを発現するＴ細胞よりも高い効力で選択的にＰＤ－Ｌ１を介してがん細胞と会合することが予期される。したがって、がん細胞がＱｕａｄ分子と結合した場合にのみ、Ｔ細胞が優先的にがん細胞に動員され、改善された安全性プロファイルを有する選択的Ｔ細胞活性化が可能になる。

実施例１７：四価の単量体Ｉｇ ｄＡｂ Ｑｕａｄおよび八価のＦａｂ様ｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄの発現
実施例９に詳述されるようなＴＮＦαに対する特異性を有するｄＡｂ ＶＨもまた、この実施例において、単量体Ｉｇ ｄＡｂ Ｑｕａｄの２つの新しいバージョンを生成するために使用された。第１のバージョンでは、抗ＴＮＦα ｄＡｂ ＶＨがＩｇＧ ＣＨ１に直接連結された。ＣＨ１領域は、コアヒンジが除去されるようにヒンジ領域が改変されたＩｇＧ１ Ｆｃに連結された（配列番号１６８ヒンジ配列が使用された）。Ｆｃ領域はｐ５３ ＴＤドメインのＮ末端に連結しており、Ｑｕａｄ９２を生じた。Ｑ９２におけるＣＨ１領域の存在は、Ｑ９２がカッパ軽鎖定常ドメインに接続された抗ＴＮＦα ｄＡｂと共発現させたときに、図３３Ａに概略的に示されているような八価の抗ＴＮＦα Ｆａｂ様ｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ｑ９３）が生成する、単量体Ｉｇ Ｑｕａｄの第２バージョンの生成を可能にした。Ｑ９２およびＱ９３の分子設計は、図３３ＢおよびＣに概略的に示されている。

Ｑ９２のみ、またはＱ９２に加えてＱ９３を、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、Ｑｕａｄタンパク質を培養上清から直接精製した。精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、予想される分子量（Ｑ９２（四価）－５５ｋＤａおよびＱ９２＋Ｑ９３（八価）－７９ｋＤａ）の純粋な生成物が見られ、これらのＱｕａｄフォーマットの可溶性発現を確認した（図３３Ｄ）。この特定の例では、ｄＡｂの四価バージョンはＣＨ１領域を保持していたが、別の例では、ＣＨ１ドメインを削除して、図２２Ｆに概略的に示されている四価ｄＡｂ Ｑｕａｄのわずかに改変されたバージョンを生成できた（図にＬとして埋め込まれている）。

実施例１８：単一特異性および二重特異性八価タンデムｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄの発現
この実施例では、実施例１４で例示されたものと同様に、２つの異なるバージョンの単量体Ｉｇ Ｑｕａｄを生成した。しかしながら、結合ドメインとしてｓｃＦｖを使用する代わりに、この特定の実施例では、抗体の単一ドメイン（ＶＨ）が、ＰＤＬ１のみ、またはＰＤＬ１に加えて４－１ＢＢのいずれかに対する特異性でタンデムに連結された。これらの例の最初の例では、二重特異性八価抗ＰＤＬ１／４－１ＢＢ単量体Ｉｇ ｄＡｂ Ｑｕａｄ（Ｑ１１３）が、抗ＰＤＬ１ ｄＡｂと可撓性のリンカーによって分離された抗４－１ＢＢ ｄＡｂをタンデムに連結することによって生成された。このタンデム二重特異性結合モジュールは、コアヒンジ領域なしでＩｇＧ１ Ｆｃの下部ヒンジ／ＣＨ２領域に連結され、タンデムｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｆｃ（すなわち、（Ｎ末端～Ｃ末端方向に）抗ＰＤＬ１ ｄＡｂ、抗４－１ＢＢ ｄＡｂ、コアヒンジ領域およびＩｇＧ１ ＣＨ３なしのＩｇＧ１ Ｆｃの下部ヒンジ／ＣＨ２領域）を生成した。Ｆｃ領域はｐ５３－ＴＤドメインのＮ末端に連結され、図２２Ｏに概略的に示されるように、二重特異性タンデムｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｆｃ Ｑｕａｄを生成した。この例では、抗ＰＤＬ１ドメインと抗４－１ＢＢ ｄＡｂドメインの両方の結合価は、それらの標的タンパク質に対して四価であった。これは、Ｉｇ Ｆｃ領域を含有する多価４＋４（八価）二重特異性抗体の例である。２番目の例は、タンデムｄＡｂが八価の抗ＰＤＬ１単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ｑ１１４）を生成する抗ＰＤＬ１ ｄＡｂドメインのみで構成されていることを除いて、Ｑ１１３とまったく同じであった。

ＨＥＫ２９３細胞でのＱｕａｄ１１３およびＱ１１４の発現と培養上清からのタンパク質の精製に続いて、回収されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図３４ＡおよびＢ）。Ｑ１１３とＱ１１４の両方について、予想される分子量の単一の純粋なタンパク質バンドが観察され、これらの単量体Ｉｇ Ｑｕａｄの発現を、高純度（＞９９％）の可溶性Ｑｕａｄタンパク質として確認した。

実施例１９：Ｆａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄの発現
この特定の実施例では、単量体ＩｇＱｕａｄは、可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）の天然の対合がそのまま維持されているＩｇＧモノクローナル抗体から生成された。これは、ＩｇＧモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントを取得し、図２２Ｅ（図にＪとして埋め込まれている）に概略的に示されるように、単量体のＩｇ Ｑｕａｄに変換することによって達成された。このようなＱｕａｄフォーマットを例示するために、２つの臨床的に承認されたモノクローナル抗体（アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））およびアベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（商標）））からのＦａｂフラグメントを使用した。ＨｕｍｉｒａまたはＡｖｅｌｕｍａｂのいずれかのＶＨ－ＣＨ１ドメインは、コアヒンジ領域無しでＩｇＧ１ Ｆｃの下部ヒンジ／ＣＨ２領域に連結された。Ｆｃ領域はｐ５３－ＴＤドメインのＮ末端に連結され、単量体のＩｇ Ｑｕａｄ鎖を生成した。ＨｕｍｉｒａおよびアベルマブＦａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄを生成するために、ネイティブ軽鎖ＶＬ－ＣＬをＨＥＫ２９３細胞でそれぞれの単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ鎖と共発現させた。

Ｆａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄタンパク質を培養上清から精製し、最初にＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図３５ＡおよびＢ）。ＨｕｍｉｒａおよびアベルマブＦａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄのいずれかに対応する非還元変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで予想される分子量の単一タンパク質バンドを検出により、これらの単量体Ｉｇフォーマットの可溶性発現および高純度の両方を確認した。これらのＦａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄタンパク質調製物におけるいずれかの検出可能な遊離ＨＣまたは遊離ＬＣの非存在でも、これらのフォーマットの高い安定性をさらに確認した。これらのＦａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄタンパク質の本来の分子量とオリゴマー状態を確認するために、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した（図３５Ｃ）。Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルは、３１５．８ｋＤａの四量体分子量と一致する予想される体積で溶出される明確な主なピークを有した。これらのデータにより、これらのＱｕａｄタンパク質の高純度をさらに確認し、これらのタンパク質は安定しており、いかなる凝集体も存在せずに均一な四量体の形で存在する。Ｆａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄのさらなる例は、完全な（ｉｎｔａｃｔ）Ｆａｂが天然ＶＨとＶＬの対合、またはその天然抗原結合能を変更することなくＱｕａｄを生成するために使用される、任意の所与のモノクローナル抗体から生成することができた。

実施例２０：単量体Ｉｇ Ｑｕａｄ（Ｑ９６）としての細胞外タンパク質ドメインの発現
上記の実施例では、抗体フラグメントを使用してＱｕａｄを生成した。この特定の実施例では、ｐ５３ ＴＤドメインの多様性がさらに実証され、それにより、細胞表面受容体の細胞外ドメインが、その天然リガンドに結合するその能力に影響を与えることなく、Ｑｕａｄフォーマットに多量体化された。これを例示するために、ＶＥＧＦトラップアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（商標））で使用される可溶性細胞外ドメインを、例として使用した。ＶＥＧＦＲ１からのＩｇドメイン２およびＶＥＧＦＲ２からのＩｇドメイン３を、Ｅｙｌｅａと同様に、実施例１７～１９に例示されたものと同様に、図３６Ａ（Ｑ９６）に概略的に示されているように、単量体Ｉｇ Ｑｕａｄに連結した。

Ｑ９６はＨＥＫ２９３細胞で発現させ、可溶性タンパク質を、培養上清から直接精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、予想される分子量で単一のタンパク質バンドを持つ高純度のＱｕａｄとしてＱ９６の発現が確認された（図３６Ｂ）。Ｑ９６の完全性は、ＶＥＧＦ－Ａリガンドへの結合を確認するために、上記に記載されるＥＬＩＳＡ結合アッセイによってさらに分析された。ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦ－Ａで０．５ｕｇ／ｍｌにてコーティングし、連続希釈した（５ｎＭから開始して１～３倍に希釈）Ｑ９６タンパク質をコーティングしたＶＥＧＦ－Ａプレートに添加した。ＶＥＧＦ－Ａに結合するＱ９６の検出には、抗Ｈｉｓ ＨＲＰ検出抗体を使用した。Ｑ９６は用量依存的にＶＥＧＦ－Ａに結合し、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインを含有するこのフォーマットに正しく集合し、その天然リガンド結合能を保持していることを確認した（図３６Ｃ）。

実施例２１：非Ｉｇ四価および非Ｉｇ八価抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄの発現、結合および機能的効力
実施例８と同様に、抗体単一ドメインを使用して、ＩｇＧ Ｆｃを含まない単一特異性の四価および八価のＱｕａｄを生成した（本明細書では、略記により「非Ｉｇ」と称される）。抗ＴＮＦα ｄＡｂ ＶＨは、Ｎ末端でｐ５３ ＴＤに直接連結して四価のＱｕａｄ（Ｑ８８四価）を生成するか、またはＮ末端とＣ末端の両方で図２２Ａに例示的に示されるような八価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄ（Ｑ８８八価）を生成する（それぞれ、ＡおよびＢとして図に埋め込まれている）。ＴＤドメインを含まない元の抗ＴＮＦα ｄＡｂも、一価の対照（Ｑ８８一価）として使用するために製造した。分子設計を図３７Ａに模式的に示しし、これは、これらのＱｕａｄのモジュラー設計も強調している。

ＨＥＫ２９３細胞での発現と培養上清からの直接Ｑｕａｄタンパク質精製に続いて、元のタンパク質分析をＳＤＳ－ＰＡＧＥで実施した。予想される分子量に対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の単一バンドによって判断されるように、多価抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄは高純度タンパク質として発現した（図３７Ｂ）。これらの多価Ｑｕａｄおよび結合活性がＴＮＦα結合およびＴＮＦα中和に及ぼす影響をさらに分析するために、ＥＬＩＳＡ結合アッセイおよびＷＥＨＩ細胞ベースのバイオアッセイを、実施例９および１０に記載されるように実施した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいては、抗ＴＮＦα一価対照と比較して、四価および八価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄの両方でＴＮＦα結合強度の増加が見ることができる（図３７Ｃ）。驚くべきことに、八価バージョンと四価バージョンとの間のＴＮＦα結合能は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイでは解決できなかった。同様に、驚くべきことに、実施例１７に詳述された四価および八価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄバージョンについての結合強度は解決できず、ＥＬＩＳＡ結合アッセイではＴＮＦα結合強度のわずかな増加のみが観察された（図３７Ｄ）。これは、結合強度が大幅に強化され、テトラメチルベンジジンベースの比色シグナルがこれらの多価Ｑｕａｄによって急速に飽和されるため、このＥＬＩＳＡ結合アッセイの動的検出範囲は、特定のポイントを超えて強化された結合強度を区別するのに十分ではないためと考えられる。

ＴＮＦα結合ドメインの原子価の増加は、ＷＥＨＩ細胞のＴＮＦα媒介細胞傷害性を中和する抗ＴＮＦα Ｑｕａｄ分子の効力が比較されたＷＥＨＩバイオアッセイでさらに検討された。非ＩｇおよびＩｇ様抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄの両方を使用して、実施例１０に記載されているように、ＷＥＨＩバイオアッセイを実施した（図３７ＥおよびＦ）。ＥＬＩＳＡ結合アッセイとは異なり、この細胞ベースのバイオアッセイでは、驚くべきことに、四価バージョンと八価バージョンとの間の効力の大きな違いを含む抗ＴＮＦα結合ドメインの増加に伴い、効力の実質的な増加が見られる。ＥＣ_５０値と、これらの分子の効力の増強倍率を表１５にまとめている。

実施例２２：非Ｉｇ十二価および十六価抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄの発現および機能的効力
多価の概念をさらに四価および八価を超えて拡張するために、１２（別名ドデカ、１２価もしくは１２量体）または１６（本明細書ではヘキサデカ、１６価もしくは１６量体）抗ＴＮＦα ｄＡｂ結合ドメインのいずれかを有する、抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄの２つのさらなるフォーマットを、非Ｉｇフォーマットで生成した。これらのＱｕａｄのモジュラー設計および構造配置を、図３８ＡおよびＢに概略図に示す。

ドデカバージョンでは、第１の鎖は、ＩｇＧ ＣＨ１に連結されたタンデム抗ＴＮＦα ｄＡｂを含有しており、ＩｇＧ ＣＨ１は、次にはＴＤドメインに連結されている（Ｑ１４２）。第２のは、カッパ（Ｑ１３５）またはラムダ（Ｑ１３６）軽鎖定常領域のいずれかに連結した単一の抗ＴＮＦα ｄＡｂを含有していた。十二価のＱｕａｄは、ＨＥＫ２９３細胞で２つの鎖を共発現させることにより生成され、ＣＨ１とＣ－カッパまたはＣ－ラムダ定常領域との相互作用を通して２つの鎖のヘテロ二量体化が生じた。ＴＤドメインは、これら２つの集合した鎖の四量体への四量体化を可能にした。

十六価の抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄの場合、第１の鎖は十二価のフォーマットとまったく同じであったが、第２の鎖は、カッパ（Ｑ１４５）またはラムダ（Ｑ１４４）軽鎖定常領域のいずれかに連結したタンデム抗ＴＮＦα ｄＡｂを含有していた。これらの２つの鎖の共発現により、十六価の抗ＴＮＦα Ｑｕａｄの生成が可能になった。

ドデカおよびヘキサデカ抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄを、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、Ｑｕａｄタンパク質を、培養上清から直接精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図３８Ｃ）。予想される分子量で優勢なタンパク質バンドが存在することにより、これらの多価抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄは高純度の可溶性Ｑｕａｄタンパク質として発現できることが確認された。さらに、これらの多価Ｑｕａｄは、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域のいずれかを使用して生成できることを確認した。

ＷＥＨＩバイオアッセイを、精製されたドデカおよびヘキサデカ抗ＴＮＦα ｄＡｂ Ｑｕａｄを使用して実行し、ＴＮＦα中和効力を、一価抗ＴＮＦα ｄＡｂ対照と比較した（図３８ＤおよびＥ）。十二価および十六価のＱｕａｄフォーマットにおける抗ＴＮＦα ｄＡｂ結合ドメインの価数の増加は、ＴＮＦα中和効力を実質的に増加させた。これらのＱｕａｄのＥＣ_５０は、表１６にまとめている。

したがって、本発明の構築物は、驚くべきことに、抗原結合効力における非常に有意な増加（例えば、表１６の７６２倍）を達成することができ、有利には、これは、異なるタイプの結合部位（例えば、ｄＡｂまたはＦａｂ様）を使用して、抗体Ｆｃの存在の有無にかかわらず、臨床的に承認された抗体を転用して、テストされた結合部位を非常に高い純度レベル（ほぼ１００％の純度）で保持する可能性を有して、達成できることが実証された。

実施例２３：非Ｉｇ四価Ｆａｂ Ｑｕａｄの発現
実施例１９では、四価のＨｕｍｉｒａ Ｆａｂ単量体Ｉｇ Ｑｕａｄの生成が例示された。この特定の実施例では、完全な軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）を含むが、Ｆｃ領域を含まない（非Ｉｇバージョン）、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂを生成した。ｐ５３ ＴＤドメインは、ヒンジ領域がコアヒンジを欠くように改変されたＨｕｍｉｒａ ＨＣ ＣＨ１ドメインのＣ末端で連結された（すなわち、コアのない上部ヒンジ配列または下部ヒンジ配列；配列番号１８３が使用された）。この改変ＨＣと天然Ｈｕｍｉｒａ ＬＣとの共発現により、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ単量体Ｉｇ－ＴＤバージョンと比較して分子サイズが大幅に縮小された四価のＨｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤの生成が可能になった。Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤの概略構造図を図４０Ａに示す。「非Ｉｇ」多量体は、開始単量体ビルディングブロックがＦｃを含有する「Ｉｇ様」多量体で想定されたように、開始単量体ブルディングブロックがＦｃを含有しないＱｕａｄ多量体を指す。

Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤ Ｑｕａｄを、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、Ｑｕａｄタンパク質を、培養上清から直接精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した（図４０Ｂ）。予想された分子量で単一のタンパク質バンドが存在することにより、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤが高純度（＞９９％純度）を有する可溶性タンパク質として発現できることを確認した。

このＱｕａｄタンパク質をさらに特徴付けるために、ＥＬＩＳＡを使用したＴＮＦα結合アッセイおよびＷＥＨＩバイオアッセイを使用したＴＮＦα中和能を実施した。対照としては、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂを一価対照として使用した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイから、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤがＨｕｍｉｒａ Ｆａｂ 一価対照よりも高い結合強度でＴＮＦａに結合できたことが分かる（図４０Ｃ）。ＴＮＦα中和バイオアッセイでは同様に、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ－ＴＤは、Ｈｕｍｉｒａ Ｆａｂ一価対照よりも高い効力でＴＮＦα媒介の毒性を中和することが可能であった（図４０Ｄ）。これらのデータにより、原子価を増加させることにより、機能的親和性が増加し、より強い結合をもたらし、これはまた、一価対照と比較してＱｕａｄの機能的効力を増強することを確認される。

実施例２４：非ＩｇおよびＩｇ様Ｑｕａｄとしての八価Ｆａｂ
上記の実施例では、抗体からのＦａｂは、Ｉｇ様（実施例１９）または非Ｉｇ様（実施例２３）のいずれかとして四価のＱｕａｄを生成するために使用された。Ｆａｂ Ｑｕａｄをさらに繰り返して、Ｉｇ様または非Ｉｇ様のいずれかの八価の原子価を有するＦａｂを生成することができる。

八価の非Ｉｇ様Ｆａｂ Ｑｕａｄを生成するために、完全なヒンジ領域を有するＦａｂが使用され、ここでは、ｐ５３ ＴＤドメインが、任意に柔軟なペプチドリンカーを介してヒンジ領域に直接連結されている。完全なコアヒンジ領域は、その天然のＬＣと共発現する場合、Ｆａｂ－ＴＤのホモ二量体化を可能にし、Ｆ（ａｂ’）_２を生成し、そのため、単量体ビルディングブロックは二価になる。次に、ＴＤドメインは、Ｆ（ａｂ’）_２の四量体化を可能にし、図４１Ａに概略的に示すように、八価のＦａｂ Ｑｕａｄを生成する。

同様に、八価のＩｇ様Ｆａｂ Ｑｕａｄを生成するために、ＴＤ、例えば、ｐ５３ ＴＤドメインは、任意のペプチドリンカーを介して、所定の抗体の未改変ＨＣのＣＨ３ドメインのＣ末端に直接連結される。これが抗体からの天然ＬＣと共発現する場合、単量体の構成要素は、組み立てられた抗体のＨＣのＣ末端にｐ５３ ＴＤドメインが連結した完全に集合されたＩｇ抗体に実際上に似ている。次に、ＴＤドメインにより、単量体ビルディングブロックの四量体化が可能になり、図４１Ｂに概略的に示すように、八価のＦａｂ Ｉｇ様Ｑｕａｄの生成が可能となる。この実施形態は、本明細書に開示される任意の所定の抗体などの任意の所定の抗体を四量体化するのに有用である。したがって、例えば、臨床的に承認された抗体は、ＳＡＭ（例えば、ＴＤ）多量体化を使用して本発明に従ってフォーマットされ、同族抗原に対して２つを超える多くの結合部位を有する多量体を生成することができる。例えば、抗体は、ボコシズマブ、アリロクマブ、またはエボロクマブであり得る。別の方法では、ＳＡＭ（例えば、ＴＤ）を有する抗体を使用する代わりに、１つ以上の抗原結合部位およびＦｃを含む抗原結合トラップを使用することができる。例えば、単量体またはアフリベルセプト－ＴＤ（本明細書に開示されるようなｐ５３またはホモログＴＤなど）としてアフリベルセプト－ＳＡＭを使用することができる。したがって、アフリベルセプトの四量体は、ＴＤの多量体化によって形成される。

したがって、一実施形態は、重鎖を含む抗体を提供し、ここで、重鎖は、ＳＡＭ、例えば、ＴＤ（本明細書に開示されるようなｐ５３またはホモログＴＤなど）を含む。ＴＤは重鎖のＣ末端にあってもよい。例えば、重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）ＶＨ、抗体ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＳＡＭ（例えば、ＴＤ）を含む。例では、重鎖は軽鎖と対合しており（例えば、軽鎖は（Ｎ末端からＣ末端の方向に）ＶＬおよび抗体ＣＬを含み）、ここで、ＶＨおよびＶＬは、重鎖および軽鎖の対によって構成され、抗原結合部位を形成する。例では、抗体は、重鎖および軽鎖対の第１および第２のコピーを含むような、４本鎖抗体である（すなわち、第１の重鎖が第１の軽鎖と対合し、かつ第２の重鎖が第２の軽鎖と対合しており、各対がＶＨ／ＶＬ抗原結合部位を含み、重鎖が互いに対合している（定常領域でのジスルフィド結合を介するなど））。例では、そのような抗体の四量体が提供され、各抗体の重鎖はそのＣ末端にＴＤを含み、抗体の４つのコピーがＴＤによって四量体化される。例えば、図４１Ｂを参照されたい。

例では、Ｎ末端からＣ末端の方向に）抗体Ｖドメイン（例えば、ＶκもしくはＶλなどのＶＬ、またはＶＨ）、抗体ＣＬおよびＳＡＭ、例えば、ＴＤ（本明細書に開示されるようなｐ５３またはホモログＴＤなど）を含む抗体軽鎖が提供される。例えば、そのような軽鎖の多量体（例えば、四量体）が提供され、任意に、軽鎖（または多量体の各軽鎖）は、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）別のＶドメインとＣＨ１とを含む第２の抗体鎖と対合しており、軽鎖のＶドメインおよびＣＬと、それぞれ、他のＶドメインおよびＣＨ１と対合している。

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・Ａｌａｍ， Ｋ．ｅｔ ａｌ．， ２０１８．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ （ ｔｒｉ－ｓｃＦｖ ） ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＳｐｙＴａｇ ／ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ．， ｐｐ．１－８．
・Ｂｏｒｕａｈ， Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， ２０１３．Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ Ｃｏｎｆｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｂｉｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ８（８）．
・Ｂｒｕ ｎｋｅｒ， Ｐ．ｅｔ ａｌ．， ２０１６．ＲＧ７３８６， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ＦＡＰ－ＤＲ５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｔｒｉｇｇｅｒｓ ＦＡＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ， Ａｖｉｄｉｔｙ－Ｄｒｉｖｅｎ ＤＲ５ Ｈｙｐｅｒｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １５（５）， ｐｐ．９４６－９５７．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ｈｔｔｐ：／／ｍｃｔ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１１５８／１５３５－７１６３．ＭＣＴ－１５－０６４７．
・Ｌｉ， Ｌ．ｅｔ ａｌ．， ２０１８．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２０ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ ｉｎ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂ－Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｒｕｇ－Ｆｒｅｅ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ， １２（４）， ｐｐ．３６５８－３６７０．
・Ｍａｙｅｓ， Ｐ．Ａ．， Ｈａｎｃｅ， Ｋ．Ｗ．＆ Ｈｏｏｓ， Ａ．， ２０１８．Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， １７（７）， ｐｐ．５０９－５２７．
・Ｒｕｄｎｉｃｋ， Ｓ．Ｉ．＆ Ａｄａｍｓ， Ｇ．Ｐ．， ２００９．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ Ａｖｉｄｉｔｙ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｂａｓｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， ２４（２）， ｐｐ．１５５－１６１．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｅｂｅｒｔｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１０８９／ｃｂｒ．２００９．０６２７．
・Ｓｈｅｎ， Ｃ．ｅｔ ａｌ．， ２０１９．Ａｎ ＩｇＭ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ｂｌｏｃｋｓ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｂｒｅａｄｔｈ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ， ９（１）， ｐｐ．２１０－２３１．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｎｏ．ｏｒｇ／ｖ０９ｐ０２１０．ｈｔｍ．
・Ｓｌａｇａ， Ｄ．ｅｔ ａｌ．， ２０１８．Ａｖｉｄｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＥＲ２ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ＨＥＲ２－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２／ＣＤ３．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １０（４６３）．
・Ｗｕ， Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， ２００１．Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １４（１２）， ｐｐ．１０２５－１０３３．
・Ｙｉｎｇ， Ｔ．ｅｔ ａｌ．， ２０１７．Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ａｒｔｉｃｌｅ， ８（Ｊａｎｕａｒｙ）， ｐ．１．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ｗｗｗ．ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ．ｏｒｇ．
・Ｙｉｎｇ， Ｔ．ｅｔ ａｌ．， ２０１２．Ｓｏｌｕｂｌｅ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＩｇＧ１ Ｆｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８７（２３）， ｐｐ．１９３９９－１９４０８．

これらのタンパク質のそれぞれのアミノ酸およびヌクレオチド配列ならびにそのＴＤは、本発明で使用するため、および本明細書の１つ以上の特許請求の範囲に含まれる可能性があるために、参照により本明細書に組み込まれる。

表１２（ｂ）：さらなるヒンジ配列、上部およびコア領域
配列番号１６３：ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１６４：ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１６５：ＡＰＰＶＡＧＰＳＶ
配列番号１６６：ＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶ
配列番号１６７：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１６８：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１６９：ＥＲＫＣＣＶＥＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶ
配列番号１７０：ＥＲＫＣＣＶＥＡＰＰＶＡＧＰＳＶ
配列番号１７１：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７２：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７３：ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７４：ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７５：ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７６：ＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７７：ＥＳＫＹＧＰＰＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７８：ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
配列番号１７９：Ｈｕｍｉｒａ軽鎖（表１８を参照）
配列番号１８０：ＣＰＰＣ
配列番号１８１：ＣＰＲＣ
配列番号１８２：ＣＰＳＣ
配列番号１８３：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ
配列番号１８４：ＥＲＫＣＣＶＥ
配列番号１８５：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ
配列番号１８６：ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ
配列番号１８７：ＥＳＫＹＧＰＰ

表１４：Ｑｕａｄ６８および６９の配列
配列番号１８８（Ｑｕａｄ６８ヌクレオチド配列）
ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＴＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＡＣＴＣＣＧＧＴＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＡＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴＴＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＡＡＣＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＧＣＧＡＣＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＡＴＣＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＴＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＴＴＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＣＧＧＧＴＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＡＧＴＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣＧＧＴＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＧＴＣＧＣＧＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＴＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＧＧＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＡＧＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴ
配列番号１８９（Ｑｕａｄ６９ヌクレオチド配列）
ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＣＴＧＴＡＴＴＡＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＴＡＧＴＧＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＣＧＧＡＡＴＴＴＴＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＡＡＣＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＧＡＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＣＧＣＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＣＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＴＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＡＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＣＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＧＡＴＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＧＴＣＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＧＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＧＣＴＣＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴ
ＳＥＱ配列番号１９０（アミノ酸配列アミノＱｕａｄ６８）
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＥＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＧＩＦＡＩＫＰＩＳＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＷＶＳＴＴＴＳＳＧＡＴＮＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＦＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰＧＧＳＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＥＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＲＲＥＦＶＡＡＩＥＳＧＲＮＴＶＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＧＬＬＫＧＮＲＶＶＳＰＳＶＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰＫＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲＧＲＥＲＦＥＭＦＲＥＬＮＥＡＬＥＬＫＤＡＱＡＧＫＥＰＧ
配列番号１９１（Ｑｕａｄ６９アミノ酸配列）
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＥＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＧＩＦＡＩＫＰＩＳＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＷＶＳＴＴＴＳＳＧＡＴＮＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＦＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰＫＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲＧＲＥＲＦＥＭＦＲＥＬＮＥＡＬＥＬＫＤＡＱＡＧＫＥＰＧＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＥＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＩＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＲＲＥＦＶＡＡＩＥＳＧＲＮＴＶＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＧＬＬＫＧＮＲＶＶＳＰＳＶＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰ

Claims (20)

1. （ａ）抗体Ｆｃ領域であって、前記Ｆｃ領域が、抗体ＣＨ２および抗体ＣＨ３を含む、抗体Ｆｃ領域と、
   （ｂ）自己会合性多量体化ドメイン（ＳＡＭ）と、を含み、
   前記ＣＨ２が、抗体ヒンジ配列を含み、コアヒンジ領域を欠いている、ポリペプチド。
2. 前記ＣＨ２が、
   （ｉ）コアヒンジＣＸＸＣアミノ酸配列であって、式中、Ｘが、任意のアミノ酸であるか、もしくは各アミノ酸Ｘが、Ｐ、ＲおよびＳから選択される、コアヒンジＣＸＸＣアミノ酸配列、ならびに／または
   （ｉｉ）上部ヒンジアミノ酸配列を欠いている、請求項１に記載のポリペプチド。
3. （ａ）前記ＣＸＸＣ配列が、配列番号１８０～１８２から選択されるか、または
   （ｂ）前記ＣＨ２が、配列番号１８３～１８７のアミノ酸配列を欠いている、請求項１（ｉ）に記載のポリペプチド。
4. 前記ＣＨ２が、
   （ａ）アミノ酸配列ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１６３）、またはＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１６４）、
   （ｂ）アミノ酸配列ＡＰＰＶＡＧＰＳＶ（配列番号：１６５）、またはＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶ（配列番号：１６６）、
   （ｃ）アミノ酸配列ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７５）、またはＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７６）、
   （ｄ）アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１６７、または１６８）（括弧で囲まれたＰは任意である）、
   （ｅ）アミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥ［Ｐ］ＡＰＰＶＡＧＰＳＶ（配列番号：１６９、または１７０）（括弧で囲まれたＰは任意である）、
   （ｆ）アミノ酸配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７１、または１７２）（括弧で囲まれたＰは任意である）、
   （ｇ）アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７３、または１７４）（括弧で囲まれたＰは任意である）、あるいは
   （ｈ）アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰ［Ｐ］ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ（配列番号：１７７、または１７８）（括弧で囲まれたＰは任意である）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 前記ＣＨ２およびＣＨ３が、
   （ａ）ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、
   （ｂ）ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、
   （ｃ）ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、または
   （ｄ）ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
6. （ａ）前記ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含み、前記コアヒンジ領域アミノ酸配列が、配列番号１８０であり、任意に、前記ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１８３）を欠いているか、
   （ｂ）前記ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインを含み、前記コアヒンジ領域アミノ酸配列が、配列番号１８０であり、任意に、前記ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号１８４）を欠いているか、
   （ｃ）前記ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインを含み、前記コアヒンジ領域アミノ酸配列が、配列番号１８１であり、任意に、前記ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号：１８５）もしくは上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号：１８６）を欠いているか、または
   （ｄ）前記ＣＨ２ドメインが、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであり、前記コアヒンジ領域アミノ酸配列が、配列番号１８２であり、任意に、前記ＣＨ２が、上部ヒンジ領域アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１８７）を欠いている、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 前記ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭを含み、前記Ｆｃ領域が、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）前記ヒンジ配列、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. 前記ポリペプチドが、１つ以上のエピトープ結合部位を含み、任意に、第１のエピトープに特異的に結合することができる抗体可変ドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
9. 前記可変ドメインが、抗体単一可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬから選択されるか、または、前記ドメインが、ｓｃＦｖによって構成されている、請求項８に記載のポリペプチド。
10. 前記ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）
    （ａ）前記可変ドメイン、前記ＳＡＭおよび前記Ｆｃ領域、
    （ｂ）前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび前記可変ドメイン、
    （ｃ）前記可変ドメイン、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    （ｄ）前記ＳＡＭ、前記可変ドメインおよび前記Ｆｃ領域、または
    （ｅ）前記ＳＡＭ、前記Ｆｃ領域および前記可変ドメインを含む、請求項８または９に記載のポリペプチド。
11. 前記ＳＡＭのＮ末端またはＣ末端に第２の抗体可変ドメインを含み、前記第２の可変ドメインが、第２のエピトープに特異的に結合することができ、前記第１および第２のエピトープが、同一または異なる、請求項８、９または１０に記載のポリペプチド。
12. 前記ＳＡＭが、自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）であり、任意に、前記ＴＤが、ｐ５３、ｐ６３もしくはｐ７３ ＴＤまたはそれらのホモログもしくはオルソログであるか、あるいは、前記ＴＤが、ＮＨＲ２ ＴＤまたはそのホモログもしくはオルソログであるか、あるいは、前記ＴＤが、配列番号１０または１２６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. （ｉ）前記ポリペプチドが（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
    Ａ．第１の抗体単一可変ドメイン（ｄＡｂ）、任意のリンカー、および前記ＳＡＭ、
    Ｂ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、前記ＳＡＭおよび第２の抗体単一可変ドメイン、
    Ｃ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカーおよび前記ＳＡＭ、
    Ｄ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、前記ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
    Ｅ．第１の抗体単一可変ドメイン、任意のリンカー、前記ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
    Ｆ．第１のｓｃＦｖ、任意のリンカー、前記ＳＡＭおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
    Ｇ．第１の抗体可変ドメイン、任意の第１のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカー、および前記ＳＡＭ、
    Ｈ．前記ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１の抗体単一可変ドメイン、
    Ｉ．前記ＳＡＭ、任意のリンカーおよび第１のｓｃＦｖ、
    Ｊ．前記ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体定常ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体可変ドメイン、もしくは
    Ｋ．前記ＳＡＭ、任意のリンカー、第１の抗体可変ドメイン、第２の任意のリンカーおよび第１の抗体定常ドメイン、を含むか、
    または
    （ｉｉ）前記ポリペプチドが、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、
    Ａ．ｄＡｂおよび前記ＳＡＭ、
    Ｂ．第１のｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
    Ｃ．第１のｓｃＦｖおよび前記ＳＡＭ、
    Ｄ．第１のｓｃＦｖ、前記ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
    Ｅ．第１のｓｃＦｖ、前記ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
    Ｆ．第１のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｇ．第１のｓｃＦｖ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｊ．ｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび前記Ｆｃ領域、
    Ｋ．ｓｃＦｖ、前記ＳＡＭおよび前記Ｆｃ領域、
    Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、ＳＡＭおよびＦｃ領域、
    Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、前記ＳＡＭおよび前記Ｆｃ領域、
    Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよび前記ＳＡＭ、
    Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１および前記ＳＡＭ、
    Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよび前記ＳＡＭ、
    Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、前記ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
    Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、前記ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
    Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
    Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
    Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
    Ｖ．第１のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
    Ｗ．第１のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
    Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
    Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、もしくは
    ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、を含むか、
    または
    （ｉｉｉ）前記ポリペプチドが、（Ｃ末端からＮ末端の方向に）、
    Ａ．ｄＡｂおよび前記ＳＡＭ、
    Ｂ．第１のｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
    Ｃ．第１のｓｃＦｖおよび前記ＳＡＭ、
    Ｄ．第１のｓｃＦｖ、前記ＳＡＭおよび第２のｓｃＦｖ、
    Ｅ．第１のｓｃＦｖ、前記ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
    Ｆ．第１のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｇ．第１のｓｃＦｖ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｈ．ＶＨ、ＣＨ１、前記Ｆｃ領域、および前記ＳＡＭ、
    Ｉ．ＶＬ、ＣＬ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｊ．ｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび前記Ｆｃ領域、
    Ｋ．ｓｃＦｖ、前記ＳＡＭおよび前記Ｆｃ領域、
    Ｌ．ＶＨ、ＣＨ１、前記ＳＡＭおよびＦｃ領域、
    Ｍ．ＶＬ、ＣＬ、前記ＳＡＭおよび前記Ｆｃ領域、
    Ｎ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂおよび前記ＳＡＭ、
    Ｏ．ＶＨ、ＣＨ１および前記ＳＡＭ、
    Ｐ．ＶＬ、ＣＬおよび前記ＳＡＭ、
    Ｑ．ＶＨ、ＣＨ１、前記ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
    Ｒ．ＶＬ、ＣＬ、前記ＳＡＭおよび第１のｄＡｂ、
    Ｓ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
    Ｔ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
    Ｕ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、
    Ｖ．第１のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第２のｄＡｂ、
    Ｗ．第１のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、
    Ｘ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域および前記ＳＡＭ、
    Ｙ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第３のｄＡｂ、
    Ｚ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭおよび第１のｓｃＦｖ、もしくは
    ＡＡ．第１のｄＡｂ、第２のｄＡｂ、前記Ｆｃ領域、前記ＳＡＭ、第３のｄＡｂおよび第４のｄＡｂ、を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチドの多量体（任意に四量体）であって、任意に、前記多量体が、医療用である、多量体。
15. 複数の抗体Ｆｃ領域の多量体であって、各Ｆｃが、それぞれのポリペプチドによって構成され、別のＦｃ領域と対合せず、任意に、前記多量体が医療用である、多量体。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは多量体を含む薬学的組成物。
17. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸であって、任意に、前記核酸が、真核細胞またはベクターによって構成される、核酸。
18. 抗原の複数のコピーを結合する方法であって、前記方法が、前記コピーを請求項１４もしくは１５に記載の多量体または請求項１６に記載の組成物と組み合わせることを含み、前記コピーが、前記多量体のポリペプチドによって結合されており、任意に、前記方法が、前記抗原コピーに結合した前記多量体を単離することを含む、方法。
19. ヒトまたは動物の対象における疾患もしくは状態のリスクを治療または低減する方法であって、前記方法が、請求項１６に記載の組成物を、前記対象に投与することを含み、前記組成物に含まれる多量体が、前記対象の標的抗原に特異的に結合し、前記結合が、疾患もしくは状態のリスクの治療または低減を媒介する、方法。
20. 前記ＳＡＭが自己会合性四量体化ドメイン（ＴＤ）である場合の、請求項１～１４のいずれか一項に記載の複数のポリペプチドを含む組成物を生成する方法であって、前記方法が、請求項１７に記載の真核宿主細胞を提供することと、前記宿主細胞を培養することと、前記ポリペプチドの四量体の前記細胞からの発現および分泌を可能にすることと、任意に、前記四量体を単離または精製することと、を含む、方法。
    

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