KR20210149071A - 세포외 소포(ev)의 혈관생성 가능성을 예측하기 위한 방법 - Google Patents

세포외 소포(ev)의 혈관생성 가능성을 예측하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포외 소포(EV), 바람직하게는 혈액-유래 EV 제제의 혈관생성 활성을 예측하기 위한 생체외 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 및 마이크로RNA-130a의 함량의 조합된 결정에 기반한다. 또한, 강력한 혈관생성을 가질 것으로 예측되는 세포외 소포(EV)의 제제를 제조하는 방법 및 허혈성 질환, 허혈성 부상 및 심혈관 질환의 위험에 연관된 병리학적 병태의 치료적 치료에 효과적이거나, 상처 치유에 사용하기 위한 EV 제제가 개시된다.

Description

세포외 소포(EV)의 혈관생성 가능성을 예측하기 위한 방법
세포외 소포(EV)의 혈관생성 가능성을 예측하기 위한 방법
본 발명은 세포외 소포(EV) 제제의 혈관생성 활성을 예측하는 방법, EV 제제 및 이의 치료적 용도에 관한 것이다.
세포외 소포(EV)는 정상 및 병리학적 병태 모두에서 거의 모든 세포 종류로부터 나오는 작은 소포이다. 이들은 주로 세포 원형질막의 출아(budding)에 의해 생성되는 미세소포 및 세포외배출(exocytosis)에 의해 엔도솜 막 구획으로부터 유래되는 엑소좀을 포함한다. 최근 증거는 EV가 다양한 병태생리학적 과정의 매개체로 작용할 수 있음을 시사한다. 증가된 순환 EV 수준은, 특히 당뇨병 및 급성 관상동맥 증후군을 가진 환자에서 혈관 손상 및 과응고성(hypercoagulability)과 연관되어, 심혈관 질환을 유발하는 역할을 시사한다. 더욱이, 주로 혈소판과 내피 세포로부터 기원하는 순환 EV의 증가된 수준이 세포 기능장애의 특징으로 제안되었다. EV는 생물학적 활성 벡터로 작용하고 순환 세포와 내피 세포를 포함한 많은 세포 종류 사이에서 정보 교환에 참여하는 것으로 광범위하게 보고되었다. 실제로, 혈소판으로부터 유래된 EV가 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 발병기전에 일조하는 것도 제안되었다.
EV는 통상적으로 EV 카고(EV cargo)로 지칭되는 단백질, 활성 지질 및 세포외 RNA를 주로 전달함으로써 생물학적 매개체로 작용한다(Pathan M., et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. (2019) Nucleic Acids Res. 47: D516-D519). 그러나, 가장 많이 연구된 EV-매개 생물학적 과정은 miR 전달에 의존하였다. miR은 전사-후 유전자 발현을 조절하는 작은 비코딩(noncoding) RNA의 유형이다. miRs는 혈청/혈장에서 안정적으로 발현되고 이들의 독특한 발현 패턴은 많은 임상 환경에서 질환 핑거프린트(fingerprint)로 작용하도록 제안되었다. 더욱이, 활성화된 혈소판은 EV를 사용하여 기능적 miR을 혈관 세포로 전달할 수 있는 것으로 나타났다. 이는, ICAM-1 발현과 혈관 염증 반응을 차례로 조절한다. 실제로, 순환 EV 카고의 변화는 당뇨병에서 내피 및 평활근(smooth muscle) 세포 기능장애와 관련이 있는 것으로 나타났다.
증가하는 일련의 증거는 EV가 잠재적인 치료, 진단 및 예후적 도구로서 작용할 수 있음을 시사한다.
심혈관 사례의 위험 증가는 당뇨병 및 비만을 겪는 환자의 공통된 특징이다. 손상된 혈관 형성은 이러한 임상 환경에서 비정상적인 혈관 리모델링을 설명하는 관련 메커니즘으로 여전히 여겨진다. 따라서, 손상된 조직의 신혈관형성(neovascularization)을 촉진하는 것은 환자의 결과를 개선하기 위해 필수적으로 남아있다. 심혈관 위험 인자를 가진 환자에서 혈관 리모델링을 개선하기 위해 상이한 치료적 접근법이 제안되었다. 그러나, 이들은 실제 혜택을 제공하지 못하였으며, 이는 신규한 치료 선택사항이 여전히 필요하다는 것을 나타낸다.
WO2018069408은 강력한 혈관생성 활성을 특징으로 하는 혈액-유래 EV의 조성물을 개시한다. 더욱이, WO2018069408은 EV의 혈관생성 가능성을 측정할 수 있는 테스트를 교시하며, 이는 생체외 세포 증식 및/또는 관-유사 구조 형성을 유도하는 능력에 대해 EV를 검정하는 것을 포함한다.
본 발명은, 이러한 소포가 혈관생성 활성을 나타내는지 여부에 대해 EV 카고의 조성물이 신뢰할 수 있는 예측 지표를 나타낸다는 발견에 기반한다. 놀랍게도, 하기 실험 섹션에서 상세하게 설명되는 본 발명자에 의해 수행된 실험 연구에 따르면, 혈관생성 활성을 갖는 EV가, miR-130a의 측정과 조합하여 사용되는 전환 성장 인자 베타(TGFβ)의 함량에 기반하여 비활성 소포로부터 구별될 수 있음이 드러났다. 실제로, ROC 분석으로부터 추론되는 바와 같이, 상기 측정의 조합에 기반한 테스트는 민감도 및 특이성 모두의 측면에서 EV 혈관생성 활성에 대한 식별의 강한 예측력을 나타내고, 이에 따라 혈관생성 요법에 의해 긍정적인 영향을 받는 질환 또는 부상의 치료적 치료에 효과적인 EV의 정확한 선택을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 세포외 소포(EV)의 조성물이 혈관생성 활성을 갖는지의 여부를 예측하는 방법이고, 상기 방법은,
(a) EV 조성물에서 miR-130a 마이크로RNA 함량을 정량화하는 단계;
(b) EV 조성물에서 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 함량을 정량화하는 단계; 및
(c) miR-130a 함량이 제1 선결 값 초과이고, TGFβ 함량이 제2 선결 값 초과인지 여부를 결정하는 단계
를 포함하고, 여기서,
miR-130a 함량이 상기 제1 선결 값 초과이고 TGFβ 함량이 상기 제2 선결 값 초과일 때, EV의 조성물이 혈관생성 활성을 가질 것으로 예측된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관생성 활성"은 혈관신생(angiogenesis) 및/또는 내피 세포 증식의 자극 또는 증대를 지칭한다.
이하에서 보다 상세하게 설명하는 바와 같이, 본 발명자는 건강한 기증자 및 심혈관 위험 인자를 가진 환자의 혈액으로부터 단리된, 혈관생성 효과적 및 비효과적 EV에 대해 마이크로RNA(miRNA)의 마이크로어레이-기반 발현 프로파일링을 수행하였으며, 놀랍게도 이러한 소포의 혈관생성 활성 및 miR-130a의 함량 간에 유의미한 상관관계를 발견하였다. 추가적인 연구에 따르면 혈관생성 활성을 갖는 EV는 비-활성 EV에 비해, 더 높은 양의 TGFβ 단백질을 함유함이 드러났다.
임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 혈관형성 과정(angiogenic process)을 촉진함에 있어서 miR-130a의 역할이 본 발명자에 의해 수행된 IPA 인저뉴이티 생물정보학 분석(Ingenuity bioinformatic analysis)에 의해 밝혀진 대로 KDR, HOXA5, ROCK1 및 EPHB6와 같이, 혈관형성 과정에 관여된 여러 유전자와 이러한 분자의 상호작용으로 설명될 수 있다고 믿고 있다. 더욱이, 이러한 분석 결과, miR-130a의 제어 하에 있는 유전자 중에서 TGFβ 및 TGFBR1도 발견되어, 생물학적 활성 EV의 혈관생성 활성을 유도하는 miR-130a 및 TGFβ 간의 공조를 추가로 확인하였다.
본 발명에 따르면, miR-130a 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 5' -CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU-3'(서열 식별 번호. 1)을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명에 따른 방법에서, EV 조성물 중 miR-130a의 정량화는 바람직하게는 핵산-기반 증폭 기술, 보다 바람직하게는 실시간 PCR에 의해 수행된다.
바람직한 실시양태에서, 실시간 PCR에 의해 EV 조성물에서 평가된 miR-130 함량은 역치 사이클(threshold cycle)(Ct) 값으로 측정된다.
통상적으로, 실시간 PCR에 의한 핵산 정량화는 로그자(logarithmic scale)의 사이클 수에 대해, 증폭 신호, 예를 들어 형광을 플롯팅하는 것에 의존한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Ct 값"은 핵산 증폭 반응의 지수기(exponential phase) 동안 증폭 신호가 백그라운드 수준을 초과하는 강도에 도달하는 데 요구되는 PCR 사이클의 수를 지칭한다. 결과적으로, Ct 값은 샘플에 초기에 존재하는 표적 핵산의 양과 반비례 관계에 있고, 즉, 표적 핵산이 풍부할수록, Ct 값이 작아진다. 실시간 PCR 반응에서 백그라운드 수준을 결정하는 방법은 잘 확립되어 있으며 당업자에게 알려져 있다.
보다 특히, 본 발명자는 건강한 대상체 및 환자 모두로부터의 혈청 EV(sEV) 중 Ct > 30의 Ct 값으로 측정된 miR130a 함량이 혈관생성 비효과적 소포(생체외 역가 테스트에서 측정 시 < 50%)의 예측임을 관찰하였다.
따라서, 본 발명의 방법에서 EV 조성물은 선결 값 초과의 miR130a 함량을 갖는 것으로 결정된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 EV 조성물은 35 이하의 Ct, 보다 바람직하게는 33 이하의 Ct, 보다 더 바람직하게는 30 이하의 Ct, 한층 더 바람직하게는, 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29와 같이, 10 내지 29의 범위 내에 포함되는 Ct의 Ct 값으로 측정된 바와 같은 miR130a 함량을 갖는 것으로 결정된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 EV 조성물은 30 미만의 Ct의 Ct 값으로 측정된 바와 같은 miR130a 함량을 갖는 것으로 결정된다.
바람직한 실시양태에서, EV의 miR-130a 함량의 양은 2-(ΔCt) 방법을 적용하여 Ct 값으로 결정되며, 이는 문헌 [Livak KJ and Schmittgen TD, "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method" (2001) Methods 25: 402-408]에 기재된 바와 같이 샘플의 상대적 배수 유전자 발현을 계산할 수 있게 하는 공식을 기반으로 한다. 하기 실시예에서 상세하게 설명될 바와 같이, 델타-델타 Ct 방법을 사용하기 위해, 본 발명자는 조사된 모든 유전자 및 세포유지 유전자(housekeeping gene)에 대해 측정된 Ct 값을 고려하였다. 전체 분석이 상이한 세포유지 유전자를 기반으로 하였기 때문에, 이전에는 모든 세포유지 유전자 Ct 값(Human U& snRNA, RNU43 snoRNA, Hm/Ms/RT U1 snRNA)의 평균을 내었다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, EV에서 miR-130a 함량의 정량화는 알려진 양의 miR-130a의 표준 곡선을 사용하고 미확인 샘플에서 실시간 PCR에 의해 결정된 Ct 값을 표준 곡선과 보간(interpolating)함으로써 달성된다.
실시간 PCR에 대한 참조가 이루어지지만, 당업계에 알려진 바와 같이, 핵산 증폭의 다른 방법이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있음이 이해된다. 이러한 방법은, 비제한적으로, 핵산 서열-기반 증폭(NASBA) 및 디지털 PCR을 포함한다.
이들의 연구와 함께, 본 발명자는 선결 값 미만, 바람직하게는 23 pg/1010 EV 미만의 TGFβ 함량을 갖는 건강한 대상체 및 환자 둘 모두로부터의 sEV가 혈관생성 불활성일 것으로 예측됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 방법에서 EV 조성물은 선결 값 초과, 바람직하게는 20 pg/1010 EV 내지 50 pg/1010 EV의 범위 내에 포함되는 값 초과, 보다 바람직하게는 23 pg/1010 EV 내지 40 pg/1010 EV의 범위 내의 값 초과, 보다 더 바람직하게는 예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 pg/1010 EV와 같이, 25 pg/1010 EV 내지 35 pg/1010 EV의 범위 내의 값 초과의 TGFβ의 함량을 갖는 것으로 결정된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 EV 조성물은 적어도 23 pg/1010 EV의 TGFβ 함량을 갖는 것으로 결정된다.
본 발명의 방법에 따르면, EV에서 TGFβ 단백질의 정량화는 단백질 분야에 알려진 것들과 같은 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다.
바람직하게는, EV의 TGFβ 함량은 면역검정에 의해 측정된다. 임의의 적합한 면역검정, 예를 들어 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 화학발광 면역검정(CLIA), 형광 면역검정(FIA), 방사선면역검정(RIA), 침전 면역검정, 입자 면역검정, 경쟁 결합 검정 등이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 면역검정은 ELISA 검정이다. 자명하게도, 당업자의 기술 내에 속하는 선택으로서, 임의 종류의 면역검정 형식의 사용은 본 발명의 범위 내에 있다.
또한, 상기 모든 실시양태에서, EV는 인간 세포로부터 유래되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법의 하나의 실시양태에 따르면, EV의 조성물의 혈관생성 활성은 BrdU 세포 증식 검정 또는 관 형성 생체외 검정, 또는 BrdU 세포 증식 검정 및 관 형성 생체외 검정 둘 모두에 의하여 EV를 테스트하는 것을 포함하는, 생체외 역가 테스트로 정량화된다.
바람직한 실시양태에서, 역가 테스트는 다음 단계를 포함한다:
- BrdU 세포 증식 검정에 의해 EV 조성물의 활성을 측정하는 단계;
- BrdU 세포 증식 검정에 의해 음성 대조군의 활성을 측정하는 단계;
- BrdU 세포 증식 검정에 의해 양성 대조군의 활성을 측정하는 단계;
- 하기 식을 적용하여 BrdU 세포 증식 검정에서 조성물의 % 활성을 계산하는 단계:
Figure pct00001
.
본 실시양태에 따르면, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는 역가 테스트에 의하여 EV 조성물의 혈관생성 활성을 정량화하는 단계 (d)를 추가로 포함한다:
- BrdU 세포 증식 검정에 의해 EV 조성물을 테스트하여 조성물 값을 얻는 단계;
- BrdU 세포 증식 검정에 의해 음성 대조군을 테스트하여 음성 대조군 값을 얻는 단계;
- BrdU 세포 증식 검정에 의해 양성 대조군을 테스트하여 양성 대조군 값을 얻는 단계;
- 하기 식을 적용하여 BrdU 세포 증식 검정에서 EV 조성물의 % 혈관생성 활성을 계산하는 단계:
Figure pct00002
.
BrdU 검정은 바람직하게는 매트리겔(matrigel)에 시딩된 HMEC 세포를 사용한다. BrdU 세포 증식 검정에서, 혈청(바람직하게는 10% 혈청)이 양성 대조군에 첨가된다. 음성 대조군은 양성 대조군과 동일한 배지이지만 혈청 첨가가 없다. BrdU 검정은 바람직하게는 표적 세포당 10000 EV의 농도를 기반으로 한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 역가 테스트는 다음 단계를 포함한다:
- 관 형성 검정에 의해 EV 조성물의 활성을 측정하는 단계;
- 관 형성 검정에 의해 음성 대조군의 활성을 측정하는 단계;
- 관 형성 검정에 의해 양성 대조군의 활성을 측정하는 단계;
- 하기 식을 적용하여 관 형성 검정에서 조성물의 % 활성을 계산하는 단계:
Figure pct00003
.
본 실시양태에 따르면, 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함하는 역가 테스트에 의하여 EV 조성물의 혈관생성 활성을 정량화하는 단계 (d)를 추가로 포함한다:
- 관 형성 검정에 의해 EV 조성물을 테스트하여 조성물 값을 얻는 단계;
- 관 형성 검정에 의해 음성 대조군을 테스트하여 음성 대조군 값을 얻는 단계;
- 관 형성 검정에 의해 양성 대조군을 테스트하여 양성 대조군 값을 얻는 단계;
- 하기 식을 적용하여 관 형성 검정에서 EV 조성물의 % 혈관생성 활성을 계산하는 단계:
Figure pct00004
.
관 형성 생체외 검정은 바람직하게는 HUVEC 세포를 사용한다. 관 형성 생체외 검정에서, VEGF, 바람직하게는 10 ng/ml의 VEGF가 양성 대조군에 첨가된다. 음성 대조군은 양성 대조군과 동일한 배지이지만 VEGF 첨가가 없다. 관 형성 생체외 검정은 바람직하게는 표적 세포당 50000 EV의 농도를 기반으로 한다.
보다 바람직한 실시양태에서, BrdU 세포 증식 검정 및 관 형성 생체외 검정 모두는 양성 대조군의 활성에 대해 주어진 EV 조성물의 활성을 테스트하는 데 사용되며, 이 경우 BrdU 세포 증식 검정 분석 및 관 형성 검정으로부터의 평균 % 활성 값들이 비교된다.
본 실시양태에 따르면, 본 발명의 방법은 상기와 같은 BrdU 세포 증식 검정 및 관 형성 생체외 검정 모두를 포함하는 역가 테스트에 의하여 EV 조성물의 혈관생성 활성을 정량하는 단계 (d)를 추가로 포함한다.
EV 측정 활성이, 양성 대조군 측정 활성의 선결된 백분율을 초과하는 경우, 예를 들어, 양성 대조군 측정 활성의 >50%의 경우, 테스트된 EV 제제는 활성으로 간주된다.
따라서, 본 발명의 방법에서 EV 조성물은, 바람직하게는, 적어도 50%의 혈관생성 활성을 갖는 것으로 결정된다.
더욱이, 상기 예측 테스트는 체액의 복수의 제제 또는 세포 배양의 조정 배지로부터 단리된 EV를 스크리닝하고 추가 처리를 위한 혈관생성 활성 제제를 식별하는 데 적합하다.
따라서, 본 발명의 제2 양태는 혈관생성 세포외 소포(EV)의 제제를 제조하는 방법이고, 상기 방법은,
- 체액의 복수의 제제 또는 세포 배양의 조정 배지로부터 EV를 단리하는 단계;
- 선결된 EV의 농도로 단리된 EV로부터 하나 이상의 샘플을 제조하는 단계;
- 상기와 같은 방법으로 각각의 EV 샘플의 혈관생성 활성을 예측하는 단계;
- miR-130a 함량이 상기 제1 선결 값 초과이고, TGFβ가 상기 제2 선결 값 초과인 샘플을 선택하는 단계; 및 선택적으로,
- 둘 이상의 활성 EV 샘플을 합하는 단계
를 포함하여, 이에 따라 혈관생성 EV의 제제를 수득한다.
건강한 기증자 또는 심혈관 위험 인자를 가진 환자의 혈청 또는 다른 혈액 성분으로부터 유래된 EV는 생체외 및 생체내 혈관생성 신호를 유도할 수 있으며, 이러한 효과는 sEV를 합하더라도 손실되지 않는다.
상기와 같이, 본 발명자는 연구를 이용해, miR-130a 및 TGFβ의 함량이 각각 제1 선결 값 및 제2 선결 값을 초과하는 것으로 결정된 EV 조성물이, 강력한 혈관생성 특성을 가질 것으로 예측된다는 것을 확인하였다. 이러한 특징은 허혈성 질환, 허혈성 부상 및 심혈관 질환의 위험과 관련된 병리학적 병태의 치료 또는 상처 치유에 사용하기에 특히 적합하게 한다.
따라서, 본 발명의 제3 양태는 혈관생성 요법에 긍정적인 영향을 받는 질환 또는 부상의 치료적 치료 또는 상처 치유에 사용하기 위한 혈관생성 세포외 소포(EV)의 제제이고, 여기서, 실시간 PCR에 의해 Ct 값으로 측정된 제제 중 miR-130a 함량이 35 이하의 Ct이고, TGFβ 함량이 20 pg/1010 EV 내지 50 pg/1010 EV의 범위 내에 포함되는 값을 초과한다.
바람직하게는, 본 발명의 혈관생성 EV의 제제에서 TGFβ 함량은 23 pg/1010 EV 내지 40 pg/1010 EV의 범위 내, 보다 바람직하게는 예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 pg/1010 EV와 같이, 25 pg/1010 EV 내지 35 pg/1010 EV의 범위 내에 포함되는 값을 초과한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 혈관생성 EV의 제제에서 TGFβ 함량은 > 23 pg/1010 EV이다.
바람직하게는, 실시간 PCR에 의해 Ct 값으로 측정되는 본 발명의 혈관생성 EV의 제제에서 miR-130a 함량은 33 이하의 Ct, 보다 바람직하게는 30 이하의 Ct, 보다 더 바람직하게는, 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29와 같이 10 내지 29의 범위 내에 포함되는 Ct이다.
바람직한 실시양태에서, 실시간 PCR에 의해 Ct 값으로 측정되는 본 발명의 혈관생성 EV의 제제에서 miR-130a 함량은 30 미만의 Ct이다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 혈관생성 EV의 제제에서, 실시간 PCR에 의해 Ct 값으로 측정되는 miR-130a 함량은 30 미만의 Ct이고 TGFβ 함량은 23 pg/1010 EV이다.
본 발명의 제4 양태는 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 용도를 위한 혈관생성 세포외 소포(EV)의 제제이며, 이는 상기 제조 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 EV 제제로 치료되는 심혈관 질환의 위험과 관련된 병태는 바람직하게는 손상된 혈관 리모델링을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 비만, 당뇨병, 이상지질혈증 또는 고혈압이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 EV 제제는 급성 심근 경색, 급성 뇌혈관병, 급성 및 만성 말초 혈액 질환, 급성 신장 허혈, 비만 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료에 사용하기에 적합하다.
세포외 소포는 많은 다른 세포 종류 - 소위 기증자 세포에 의해 제조되며, 생물학적 유체, 세포 또는 조직 배양물에 보편적으로 존재한다. 따라서, 본 발명에 따르면, EV 조성물은 임의의 적합한 세포 종류, 바람직하게는 유핵 포유류 세포, 보다 바람직하게는 줄기 세포, 보다 더 바람직하게는 성체 줄기 세포로부터 수득될 수 있다.
본원의 맥락 내에서 표현 "성체 줄기 세포"는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 단리된 "배아 줄기 세포"와 대조적으로, 성체 조직으로부터 단리된 줄기 세포를 의미하도록 의도된다. 성체 줄기 세포는 "신체 줄기 세포(somatic stem cell)"로도 알려져 있다.
대안적인 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 용도를 위한 EV 제제는 생물학적 유체 또는 조정 세포 또는 조직 배양 배지로부터 단리된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 용도를 위한 EV 제제는 혈액 성분, 보다 바람직하게는 전혈, 혈장 또는 혈청(sEV)으로부터 단리된다.
하나의 실시양태에서, 혈관생성 EV는 건강한 기증자의 헌혈로부터 제조된다.
또 다른 실시양태에서, 혈관생성 EV는 환자의 헌혈, 보다 바람직하게는 심혈관 위험 인자를 갖는 환자로부터 제조된다.
보다 바람직한 실시양태에서, 심혈관 위험 인자를 갖는 환자의 혈액으로부터 제조된 혈관생성 EV는 동일한 환자의 치료를 위한 의약품으로 사용하기에 적합하다.
또한, 상기 모든 실시양태에서, 본 발명의 제제는 약학 제제일 수 있으며, 이는 상기 정의된 바와 같은 혈관생성 EV뿐만 아니라 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체 및/또는 희석제를 포함한다. 담체, 비히클 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 부형제의 선택은, 특히 선택된 약학적 투약 형태, 투여 경로 및 투여 요법뿐만 아니라 환자의 특성 및 치료될 질환을 고려하여 당업자의 기술 내에 속한다.
본 발명은 단지 예시로서 제공되고 첨부된 도면을 참조하는 하기 실시예로부터 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 나노사이트(Nanosight)에 의한 sEV 특성화 결과를 도시한다. (A) 환자의 개별 그룹에 대해 나타낸 NTA 분석의 대표적인 이미지. (B) 각 개별 대상체(건강한 기증자, 비만, 당뇨병, 당뇨병/비만 및 허혈상 환자)에 대한 평균 크기 값과 함께, NTA 크기 분포를 나타내는 도트 플롯 그래프(Dot plot graph). (C) 개별 환자 그룹의 혈청으로부터 회수된 EV의 수를 보고하는 히스토그램. D= 당뇨병; O= 비만; OD= 비만/당뇨병; IC= 허혈성 환자. *p < 0.05 비만 및 허혈성 환자 대 건강한 대상체; (일-방향 아노바(ANOVA)에 이은 다중 비교 테스트)(n= 9명의 환자/그룹).
도 2는 건강한 기증자와 환자로부터 혈청 EV의 생체외 및 생체내 혈관생성 활성을 도시한다. (A) 효과적 및 비효과적 sEV에 반응하여 혈관 형성을 보여주는 대표적인 현미경 사진. 각 숫자는 개별 대상체로부터 제조된 sEV를 지칭한다(상단 패널 = 비효과적 sEV; 하단 패널 = 효과적 sEV)(n=3 각 그룹, OD를 제외하고 동일한 샘플이 3개의 독립적인 실험에서 사용됨). (B) 혈관 형성의 생체내 정량 분석의 결과. 각 실험 조건의 경우, 매트리겔의 10개 섹션에서 혈관이 카운팅되었다. 데이터는 비치료된 마우스(C)(n= 3) 또는 다음과 같은 EV 제제로 치료된 마우스에서 카운팅된 평균 혈관 수를 보여준다: 건강한 기증자(i-sEV)로부터의 혈관생성 비효과적 sEV; 건강한 기증자(e-sEV)로부터의 혈관생성 효과적 sEV; 당뇨병 환자(D i-sEV)로부터의 혈관생성 비효과적 sEV; 당뇨병 환자(D e-sEV)로부터의 혈관생성 효과적 sEV; 비만 환자(O i-sEV)로부터의 혈관생성 비효과적 sEV; 비만 환자 (O e-sEV)로부터의 혈관생성 효과적 sEV; 당뇨병/비만 환자(OD i-sEV)로부터의 혈관생성 비효과적 sEV; 당뇨병/비만 환자(OD e-sEV)로부터의 혈관생성 효과적 sEV; 허혈성 환자(IC i-sEV)로부터의 혈관생성 비효과적 sEV; 허혈성 환자(IC e-sEV)로부터의 혈관생성 효과적 sEV. *p < 0.05 건강한 e-sEV 대 건강한 i-sEV; §p < 0.05 당뇨병 e-sEV 대 당뇨병 i-sEV; #p < 0.05 비만 e-sEV 대 비만 i-sEV; ˚p < 0.05 당뇨병/비만 e-sEV 대 당뇨병/비만 i-sEV; +p < 0.05 허혈성 e-sEV 대 허혈성 i-sEV 허혈성; (일-방향 아노바에 이은 다중 비교 테스트)(n=3 각 그룹, OD를 제외하고 동일한 샘플이 3개의 독립적인 실험에서 사용됨)(원래 배율: x200, 눈금 막대: 12 μm).
도 3은 sEV의 혈관생성 활성이 TGFβ 함량과 상관관계가 있음을 도시한다. 그래프는 각각의 그룹(건강한 기증자, 당뇨병, 비만 및 허혈성 환자)의 개별 대상체로부터 제조된 혈청 EV 샘플에 대해 얻은 데이터를 보고한다. 각 환자 그룹의 경우, 상부 곡선은 pg/1010 EV로 sEV에서 측정된 TGFβ 함량을 나타내는 반면, 하부 곡선은 생체외 역가 테스트에서 측정된 바와 같은 혈관생성 활성의 %를 나타낸다. 점선은 혈관생성 효과적 및 비효과적 sEV에 대한 TGFβ > 23 pg/1010 EV의 컷-오프를 나타낸다. 각 숫자는 개별 환자에 해당한다(n=3 각 그룹).
도 4는 sEV에서 miRNA 발현 프로파일링의 결과를 도시한다. (A) 개별 환자 및 건강한 대상체로부터의 혈관생성 효과적(어두운 원) 및 비효과적(백색 원) sEV에서 miR-130a에 대해 측정된 Ct 값의 분포. 결과는 40-Ct로 보고된다. (B) miR-130a와 양의 상관관계가 있는 경로의 네트워크 분석. 데이터는 다이아나 miRpath 분석에 의해 얻어졌다. 적어도 15개의 유전자를 포함하는 경로만이 선택되었다.
도 5 (A) miR-130a와 mRNA 표적 간의 네트워크 분석. 선은 IPA 소프트웨어에 의해 예측된 유전자와 miR-130a 간의 상호작용을 나타낸다: 간접 상호작용(점선), 직접 상호작용(연속선). 정사각형은 TGFβ 및 TGFBR을 포함한다. 원은 혈관생성에 관여된 유전자(KDR, EPHB6, ROCK1, HOXA5)를 포함한다. (B) 수신자 조작 특성(Receiving Operating Characteristic, ROC) 곡선 및 해당하는 곡선하면적(area under the curve, AUC)은 miR-130a 및 TGFβ가 비효과적인 소포로부터 혈관생성 효과적 sEV를 구별하는 예측 능력을 갖는다는 것을 보여준다. ROC 분석의 경우, 모든 환자와 건강한 대상체로부터의 sEV에 대해 얻어진 결과가 고려되었다. AUC 값뿐만 아니라 표준 오차, p-값 및 임계값은 ROC 곡선 아래의 표에 보고된다.
실시예
1. 방법
1.1 환자
본 발명자가 수행한 연구에는, 36명의 심혈관 위험 인자를 가진 환자 및 9명의 성별이 일치하는 건강한 지원자가 포함되었다. 특히, 당뇨병 환자 9명(D: n=9), 비만 환자 9명(O: n=9), 당뇨병 및 비만 환자 9명(OD: n=9) 및 허혈성 환자 9명(뒤쪽 하지 허혈에 대해 외과적 치료를 받은 환자)(IC: n=9)을 시험하였다. 모든 당뇨병 환자를 인슐린으로 치료하지 않았다. 모든 인체 실험을 유럽 지침 및 정책에 따라 수행하였고, 이탈리아 토리노 대학교의 윤리 위원회의 승인을 받았다. 모든 환자의 혈청을 클리닉(D, O, OD)에 입원한 후에 얻었고, 허혈성 환자(IC)의 경우 수술 전에 얻었다. 모든 환자로부터 사전 동의를 얻었다. 혈액 은행의 내부 검토 위원회(internal Review Board of the Blood Bank)의 사전 동의와 승인 후, "시타 델라 살루테 에 델라 사이네자 디 토리노(Citta della Salute e della Scienza di Torino)" 혈액 은행에서 건강한 기증자(n=9)의 인간 혈청을 제공하였다.
1.2. 연구 승인
실험 동물의 관리 및 이용에 대한 이탈리아 국립 보건원 지침(Italian National Institute of Health Guide)(프로토콜 번호: 490/2105-PR)에 따라 동물 연구를 수행하였다. 유럽 실험 동물 과학 협회 가이드라인(European Laboratory Animal Science Association Guideline) 연맹 및 토리노 대학교의 윤리 위원회에 따라 마우스를 수용시켰다. 모든 실험을 관련 지침 및 규정에 따라 수행하였다.
1.3. 혈청 EV 단리
정맥천자에 의해 건강한 기증자와 환자 기증자로부터 인간 혈액을 얻었다. 총 9 ml의 혈청을 각 기증자로부터 회수하고, -80℃로 보관하였다. 해동 후, 전체 EV를 단리하고 2시간 동안 100,000 x g으로 초원심분리한 후, 3000 g의 원심분리로 정제하여 조직파편을 제거하였다. 펠렛을 PBS로 1회 세척하고 100,000 x g, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다. 샘플을 -80˚로 보관한 후 신선한 상태로 사용하거나 해동하였다.
1.4 나노입자 추적 분석
sEV를 405 nm 레이저와 NTA 2.3 분석 소프트웨어가 장착된 나노사이트 LM10 시스템(영국 에임즈베리, 나노사이트 엘티디)을 사용하여, 나노입자 추적 분석(NTA)에 의해 분석하여, 치수와 프로파일을 규정하였다. 14의 카메라 레벨 설정으로 모든 획득을 완료하고, 각 샘플에 대해 30초 동안 3개의 비디오를 녹화하였다. sEV를 1 ml의 소포 미포함 생리학적 용액(영국 렁컨, 프레제니우스 카비(Fresenius Kabi))에서 희석(1:1000)하였다. NTA 획득-후 설정을 샘플에 걸쳐 최적화하고 일정하게 유지한 후, 각 비디오를 분석하여 EV 크기, 분포 및 농도를 측정하였다.
1.5 sEVs 혈관신생 분석
1차 대혈관 내피 세포(EC) 및 미세혈관 내피 세포(HMEC)를 론자(Lonza)(스위스, 바젤(Basel))로부터 구입하고 제조업체의 설명서에 기재된 바와 같이 배양하였다. 생체외 혈관신생 역가 테스트 및 생체내 혈관신생 테스트를 이전에 설명한 바와 같이 수행하였다(Cavallari C. et al, "Serum-derived extracellular vesicles (EVs) impact on vascular remodeling and prevent muscle damage in acute hind limb ischemia" (2017) Sci Rep. 7(1):8180). 간략하게는, 5x104 sEV/표적 세포를 생체외 연구 전반에 걸쳐 투여하였다. 단일 샘플로부터의 sEV를 BrdU 및 생체외 관 형성 검정을 사용하여, 이들의 혈관생성-후 활성에 대해 평가하였다. 분석한 모든 그룹의 EV를 50%의 % 컷-오프 값에 따라 혈관생성 활성 또는 비활성 EV로 분류하였다.
생체내 혈관신생을 이전에 설명한 바와 같이 혈관의 성장을 측정하여 평가하였다(Lopatina T. et al, "Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential" (2014) Cell Commun Signal. 12:26). 간략하게는, EC(1x106 세포/주사)를 sEV(EC의 1x106당 5x1010 EV)와 함께 밤새 항온처리하였다. 그 후, 수컷 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스(6주령)에 피하로 주사하였다. 동일한 수의 비-자극 EC를 음성 대조군으로 사용하였다. 매트리겔 플러그를 7일째에 회수하고, 고정하고, 삼색 염색법을 사용하여 염색하였다. 혈관 내강 면적을 이전에 설명된 바와 같이 결정하였다(Lopatina T. et al, "Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential" (2014) Cell Commun Signal. 12:26).
1.6 TGFβ ELISA 검정
건강한 대상체와 환자의 혈청 샘플에서 단리된 EV의 TGFβ 함량을 제조업체의 설명서에 따라 고체상 샌드위치 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA, 독일, 인비트로겐 멀티스페시스(Invitrogen Multispecies) TGF-β1 키트)를 사용하여 측정하였다. 실험을 1x1011 EV를 함유하는 샘플에서 3중 수행하였다. 검정에서 수득된 유색 생성물의 강도를 450 nm에서 흡광도를 갖는 ELISA 아이마크티엠(iMarkTM) 마이크로플레이트 흡광도 판독기(스위스, 바이오 라드(Bio Rad))로 결정하였다. EV 제제에 존재하는 TGFβ의 농도를 pg/1010 EV로 표현하였다.
1.7 miRNA 발현 프로파일링
sEV(소위 miRNome)에 함유된 miRNA의 발현 프로파일을 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라, miRNome 마이크로RNA 프로파일러 퀀티미르(Profilers QuantiMir)(SBI, 시스템 바이오사이언스(System Biosciences))를 사용하여 1140 마이크로RNA에 대한 실시간 PCR에 의해 평가하였다. 키트는 각 플레이트에 정규화 신호로 3개의 내인성 참조 RNA(인간 U6 snRNA, 작은 핵소체 RNA RNU43 및 Hm/Ms/Rt U1 snRNA)와 함께 인간 마이크로RNA용 사전-형식화된 플레이트 검정을 포함한다.
간략하게는, 100 ng의 RNA를 고-용량 cDNA 역전사 키트(미국 캘리포니아 포스터 시티, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 레트로번역(retrotranscribe)하였다. 모든 qRT-PCR 반응을 다음 조건 하에서 스텝원플러스(StepOnePlus)TM 실시간 PCR 시스템에서 수행하였다: 95℃로 15'(PCR 초기 활성화 단계) 후, 40 사이클 동안 3-단계 사이클링(94℃로 15'', 55℃로 30'', 70℃로 30''). 스크리닝에서, miRNome을 상기 역가 테스트를 이용해 혈관생성 활성(n=3) 및 혈관생생 비활성(n=3)으로 평가한 건강한 대상체의 혈청으로부터 수집한 sEV에 대해 프로파일링하였다. miRNA에 대한 Ct 값을 분석된 각 sEV 샘플에 대해 외삽하였다. 효과적 및 비효과적 sEV 집단 둘 모두의 상이한 샘플(n=3)의 Ct 평균을 나타내는 Ct를 내인성 참조 RNA에 대해 정규화하고, 2-(ΔCt) 값으로 변환하였다(Livak KJ and Schmittgen TD, "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method" (2001) Methods 25: 402-408).
miScript SYBR 그린 PCR 키트(미국 캘리포니아 발렌시아, 퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 건강한 기증자와 환자의 sEV에서 miRNA 검증을 수행하였다. 간략하게는, sEV 샘플로부터 단리된 100 ng의 입력 RNA를 miScript 역전사 키트를 사용하여 역 번역하고, 이렇게 얻은 cDNA를 사용하여 관심 miRNA를 검출하고 정량화하였다. 제조업체의 프로토콜(퀴아젠)에 기재된 바와 같이 각 반응에 3 ng의 cDNA를 사용하여 실험을 3중으로 실행하였다. 다음의 miRNA를 모든 환자-유래 sEV에 대해 스크리닝하였다: miR-126(서열 식별 번호. 2), miR-21(서열 식별 번호. 3), miR-296-3p(서열 식별 번호. 4), miR-210(서열 식별 번호. 5), miR-130a(서열 식별 번호. 1), miR-27a(서열 식별 번호. 6), miR-29a(서열 식별 번호. 7), miR-191(서열 식별 번호. 8). qRT-PCR로 얻은 증폭 데이터를 내부 대조군으로 RNU6B 및 RNU43 참조 유전자를 사용하여 정규화하였다. 표적 서열과 내인성 대조군의 증폭 효율은 거의 동일한 것으로 나타났다.
1.8 miRNA EV 함량의 경로 및 표적 예측 분석
EV miRNA 표적 예측 및 생물학적 경로 농축 분석을 수행하기 위해, 웹-기반 프로그램 다이아나 mirpath를 사용하였다(Collino F. et al, "Exosome and Microvesicle-Enriched Fractions Isolated from Mesenchymal Stem Cells by Gradient Separation Showed Different Molecular Signatures and Functions on Renal Tubular Epithelial Cells"(2017) Stem Cell Rev.(2):226-43). 알고리즘 마이크로T-CDS를 선택하여 기본 임계값(마이크로T = 0.8)을 사용하여 EV-유래 miRNA 표적을 예측하였다. 알려진 모든 유전자 및 게놈 교토 백과사전(KEGG) 경로에 대해 P 값 < 0.01을 나타내는 생물학적 경로만을 유의미하게 풍부한 것으로 간주하였다. 인저뉴이티 IPA 경로 분석을 이용하여 miR-130a에 대한 표적 유전자를 예측하였다. 본 발명자는 IPA(퀴아젠: http://www.qiagen-bioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/)에서 miRNA 표적 필터 도구를 설정하여, miR-130a를 예측된 mRNA 표적과 연관시켰다.
1.9 ROC 분석
주요 데이터는 참조 표준(RS)으로 간주되는, "실제(True) 혈관생성 활성 sEVs"/"실제 혈관생성 비활성 sEVs" 두 조사 그룹에 대한 평균, 표준 편차(SD), 중간값 및 95% 신뢰 구간으로 표시된다. miR-130a 및 TGFβ에 대한 예측가능성을 평가하기 위해, ROC 곡선을 사용하여 RS의 달성을 평가하였다(Grund B and Sabin C. "Analysis of biomarker data: logs, odds ratios, and receiver operating characteristic curves" (2010) Curr Opin HIV AIDS 5(6):473-9). sEV 조성물을 Ct 값으로 측정된 miR-130a의 함량 및 pg/1010 EV로 측정된 TGFβ의 함량에 기반하여 다음 범주로 분류하였다:
1. miR-130a Ct 값 ≥ 30을 나타내는 sEV는 혈관생성 비효과적 sEV로 간주됨;
2. TGFβ 함량 < 23 pg/1010 EV를 나타내는 sEV는 혈관생성 비효과적 sEV로 간주됨.
상기 척도에 대한 ROC 곡선 분석을 기반으로 하는 컷-오프 스코어의 '양호도'를 평가하여, RS에 정의된 "실제 혈관생성 비효과적 sEV"를 예측하기 위해, 두 개의 척도 각각을 개별적으로 평가하는 것 및 '일련의' 접근법에 의해 두 측정을 합하여 평가하는 것, 둘 모두로 예측 능력을 평가하였다(두 측정 모두에 대해 혈관생성 비효과적 sEV를 "혈관생성 비효과적 sEV"로 간주하고, 두 척도 중 적어도 하나에 대해 "비(NON) 혈관생성 비효과적 sEV "인 소포를 "비 혈관생성 비효과적 sEV"로 간주).
분석을 민감도(Se), 특이성(Sp) 및 양성 우도비(LH+) ["실제 혈관생성 효과적 sEV"와 비교하여, "실제 혈관생성 비효과적 sEV"를 "혈관생성 비효과적 sEV"로 식별할 확률] 및 상대 95% 신뢰 구간 값을 기반으로 평가하였다.
1.10 통계 분석
데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6.0 데모 프로그램을 사용하여 분석하였다. 결과는, 달리 보고하지 않는 한, 평균 ± SD 또는 ± SEM으로 표시된다. 1-방향 아노바 후, 투키(Tukey)의 사후 또는 다중 비교, 2-그룹 비교를 위한 스튜던트 t(Student t) 테스트 및 적절한 경우 뉴맨-큘즈(Newman-Keuls) 다중 비교 테스트를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성에 대한 컷-오프를 p<0.05(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)로 설정하였다.
2. 결과
2.1 혈청 EV의 특성화
본 발명자가 수행한 연구에서, 건강한 개체로부터 유래된 sEV의 9개 샘플 및 환자 코호트로부터 유래된 sEV의 36개 샘플의 개수 및 크기를 조사하였다. sEV 크기의 분포는 건강한 개체 및 환자 중에 어떠한 유의미한 차이도 보이지 않았다(도 1a 및 b). 관찰된 평균 입자 크기는 약 138 nm였다. 환자의 sEV 수는 건강한 대상체보다 높았다(도 1c). 비만 및 허혈성 환자에서 유의미하게 더 높은 수준의 sEV가 검출되었다(도 1c).
2.2 환자로부터 유래된 혈청 EV의 혈관생성 촉진 활성
상이한 환자 그룹으로부터 유래된 sEV의 생체외 혈관신생 활성을 평가하기 위해, 상기 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 역가 테스트를 수행하였다. 50%를 초과하는 평균 값을 나타낸 sEV의 조성물을 혈관생성 활성으로 간주하였다.
혈관신생 역가 테스트의 결과는 상이한 환자 그룹의 혈관생성 효과적 및 비효과적 sEV를 사용하여 생체내에서 검증되었다(도 2a-b).
2.3 sEV의 TGFβ 함량과 혈관신생 가능성
sEV의 TGFβ 함량이 이들의 혈관신생 가능성을 설명할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자는 건강한 대상체 및 환자(당뇨병, 비만, 당뇨병/비만 및 허혈성 환자)의 혈청 샘플로부터 단리된 EV에 대해 ELISA 분석을 수행하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, sEV 조성물에서 측정된 TGFβ의 함량은 환자 코호트뿐만 아니라 건강한 기증자에서 이들 소포의 혈관생성 가능성과 유의미하게 상관관계가 있다. 23 pg/1010 EV 미만의 TGFβ 함량을 갖는 EV가 혈관생성 비활성일 가능성이 더 높다는 관찰에 기반하여, 23 pg/1010 EV의 TGFβ 농도에 해당하는 컷-오프 값을 비효과적 소포로부터 혈관생성 효과적 EV를 구별하는 것으로 결정하였다.
2.4 sEV의 miRNome 프로파일
건강한 기증자로부터의 혈관생성 효과적 및 비효과적 sEV(3개 샘플/각각)에 대해 본 발명자에 의해 수행된 miRNome 분석은, 가장 차별적으로 발현되는, miR-126, miR-21, miR-296-3p, miR-210, miR-130a, miR-27a, miR-29a, miR-191, 8개의 혈관(angio)-miRNA의 식별로 이어졌다. 특히, miR-126, miR-130a, miR-27a 및 296-3p는 상향 조절된 반면, miR-21, miR-29a, miR-191 및 miR-210은 혈관생성 능력을 가진 sEV에서 하향 조절되었다.
EV에서 관찰된 miRNA 발현 수준의 차이가 이들의 기능적 활성과 관련이 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자는 개별 건강한 기증자 및 환자로부터 유래된 sEV에서 선택된 miRNA의 발현을 생체외 역가 테스트로 측정된 바와 같은 이러한 소포의 혈관생성 활성 수준과 비교함으로써 연구를 수행하였다. 발현 분석을 실시간 PCR(컷-오프 Ct 값 30)로 수행하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 개별 대상체(건강한 기증자 및 환자)의 EV에서 miR-130a에 대해 측정된 Ct 값의 분포는 이러한 EV 샘플에서 수행된 혈관신생 역가 테스트의 결과와 유의미하게 상관관계가 있다. 특히, Ct > 30의 Ct 값으로 측정된 miR130a의 함량을 갖는 EV는 혈관생성 비효과적일 가능성이 더 높은 것으로 관찰되었다.
흥미롭게도, 문헌 [Shalaby SM. et al, "Serum miRNA-499 and miRNA-210: A potential role in early diagnosis of acute coronary syndrome" IUBMB Life. 2016;68(8):673-82]에서 이전에 기재된 바와 같이, 본 발명자는 또한 환자로부터 유래된 sEV에서 miR-210의 농축을 발견하였다. 그러나, sEV에서 miR-210 함량과 이러한 소포의 혈관생성 활성 사이에 유의미한 상관관계가 검출되지 않았다.
다이아나 mirpath 분석을 적어도 15개의 유전자를 수반한 경로를 선택함으로써, miR-130a를 사용하여 조사하였다. 다시 말하면, 특히 TGFβ 경로에 관여하는 유전자의 상당한 농축을 검출하였다(도 4b).
miR-130a 표적 유전자에 대해 IPA에 의해 예측된 네트워크는 KDR, HOXA5, ROCK1, EPHB6과 같은 여러 유전자를 식별했으며, 이는 혈관형성 과정과 강력하게 관련된다(도 5a). 더욱이, miR-130a 상호작용자(interactor) 중에서 TGFβ 및 TGFBR1 유전자가 발견되었다. 전반적으로, 상기 결과는 sEV-매개 작용 메커니즘에서 TGFβ 신호전달 경로의 기여를 추가로 뒷받침한다.
2.5 sEV에서 miR-130a 및 TGFβ의 함량은 "실제 혈관생성 비효과적" sEV를 식별하는 가치있는 예측 마커를 나타낸다.
본 발명자는 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행하여, sEV에서 miR-130a 및 TGFβ의 함량이 혈관생성 능력을 나타내는 sEV와 비효과적 소포를 구별하는 예측 능력을 갖는지 여부를 평가하였다. 도 5b에 도시된 ROC 곡선으로부터 추론되는 바와 같이, miR-130a와 TGFβ 모두 RS에 의해 식별된 "실제 혈관생성 비효과적 sEV"의 양호한 예측 척도이고, 통계적으로 유의미한 AUC 값을 보여준다.
두 척도 모두 RS에 의해 식별된 "실제 혈관생성 비효과적 sEV"를 "혈관생성 비효과적"으로 식별하는 데 양호한 민감도를 나타내었다. 이것은 특히 자명하였고, miR-130a(0.73 내지 0.99에서 Se = 0.94 IC95%) 및 TGFβ(0.66 내지 0.97에서 Se = 0.88 IC95%)에 대해 1.49 내지 2.27에서 LH + = 1.88 IC 95%로 추가로 밑줄 처리하였다. 그러나, 두 측정 모두에서 낮은 특이성 값이 검출되었다(miR-130a: Sp = 0.50; TGFβ Sp = 0.64).
두 척도를 '연속적으로' 합하여, 즉, 두 척도 모두에서 "혈관생성 비효과적"으로 정의된 이러한 sEV를 "혈관생성 비효과적"으로 간주함으로써, 양호한 수준의 민감도와 증가된 특이성 값을 검출하였다(Sp= 0.75; Se= 0.82). 하기 표 1에 보고된 LH + 값은 이러한 결과를 추가로 뒷받침한다.
표 1
miR-130a 및 TGFβ1을 '연속하여' 합하는 테스트. '연속하여' 두 척도를 합하여 얻은 값 목록(miR-130a 및 TGFβ1 척도 모두에서 "혈관생성 비효과적"으로 정의된 sEV를 "혈관생성 비효과적"으로 간주).
Figure pct00005
SEQUENCE LISTING <110> Unicyte EV AG <120> Method for predicting proangiogenic potential of extracellular vesicles (EVs) <130> PC1746RRI <160> 8 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> hsa-miR-130a <400> 1 cagugcaaug uuaaaagggc au 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> hsa-miR-126 <400> 2 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> hsa-miR-21 <400> 3 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> hsa-miR-296-3p <400> 4 gaggguuggg uggaggcucu cc 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> hsa-miR-210 <400> 5 cugugcgugu gacagcggcu ga 22 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> miR-27a <400> 6 uucacagugg cuaaguuccg c 21 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> miR-29a <400> 7 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> miR-191 <400> 8 caacggaauc ccaaaagcag cug 23

Claims (23)

  1. (a) 세포외 소포(EV) 조성물에서 miR-130a 마이크로RNA 함량을 정량화하는 단계;
    (b) EV 조성물에서 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 함량을 정량화하는 단계; 및
    (c) miR-130a 함량이 제1 선결 값(predetermined value) 초과이고, TGFβ 함량이 제2 선결 값 초과인지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하고,
    miR-130a 함량이 상기 제1 선결 값 초과이고, TGFβ 함량이 상기 제2 선결 값 초과일 때, EV 조성물이 혈관생성(proangiogenic) 활성을 가질 것으로 예측되는 것인,
    세포외 소포(EV) 조성물이 혈관생성 활성을 갖는지의 여부를 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    miR-130a 함량이 실시간 중합효소 연쇄 반응(실시간 PCR)에 의해 Ct 값으로 정량화되고, miR-130a 함량 및 Ct 값 간에 역상관(inverse correlation)이 있는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 선결 값이 30 미만의 Ct 값인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    TGFβ 함량이 면역검정, 바람직하게는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 측정되는 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 선결 값이 23 pg/1010 EV의 TGFβ의 양인 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    - BrdU 세포 증식 검정에 의해 EV 조성물을 테스트하여 조성물 값을 얻는 단계;
    - BrdU 세포 증식 검정에 의해 음성 대조군을 테스트하여 음성 대조군 값을 얻는 단계;
    - BrdU 세포 증식 검정에 의해 양성 대조군을 테스트하여 양성 대조군 값을 얻는 단계; 및
    - 하기 식을 적용하여 BrdU 세포 증식 검정에서 EV 조성물의 혈관생성 활성 %를 계산하는 단계
    를 포함하는, 역가 테스트(potency test)에 의하여 EV 조성물의 혈관생성 활성을 정량화하는 단계 (d)
    를 추가로 포함하는 방법:
    Figure pct00006
    .
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 관 형성(tubulogenesis) 검정에 의해 EV 조성물을 테스트하여 조성물 값을 얻는 단계;
    - 관 형성 검정에 의해 음성 대조군을 테스트하여 음성 대조군 값을 얻는 단계;
    - 관 형성 검정에 의해 양성 대조군을 테스트하여 양성 대조군 값을 얻는 단계; 및
    - 하기 식을 적용하여 관 형성 검정에서 EV 조성물의 혈관생성 활성 %를 계산하는 단계
    를 포함하는, 역가 테스트에 의하여 EV 조성물의 혈관생성 활성을 정량화하는 단계 (d)
    를 추가로 포함하는 방법:
    Figure pct00007
    .
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제6항에 따른 BrdU 세포 증식 검정 및 제7항에 따른 관 형성 생체외 검정 둘 모두를 포함하는 역가 테스트에 의하여 EV 조성물의 혈관생성 활성을 정량화하는 단계 (d)를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    EV 조성물이 적어도 50%의 혈관생성 활성을 갖는 것으로 결정되는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    EV가 인간 세포 유래의 것인, 방법.
  11. - 체액의 복수의 제제 또는 세포 배양의 조정 배지(conditioned medium)로부터 세포외 소포(EV)를 단리하는 단계;
    - 선결된 EV 농도로 단리된 EV로부터 하나 이상의 샘플을 제조하는 단계;
    - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 각각의 EV 샘플의 혈관생성 활성을 예측하는 단계;
    - miR-130a 함량이 제1 선결 값 초과이고, TGFβ가 제2 선결 값 초과인 샘플을 선택하는 단계; 및 선택적으로,
    - 둘 이상의 활성 EV 샘플을 합하는(pooling) 단계
    를 포함하여, 이에 따라 혈관생성 EV의 제제를 수득하는, 혈관생성 세포외 소포(EV) 제제를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    miR-130a 함량이 실시간 PCR에 의해 Ct 값으로 정량화되고, 상기 제1 선결 값이 30 미만의 Ct 값인, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 제2 선결 값이 23 pg/1010 EV의 TGFβ 양인 것인, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    EV 제제가 적어도 50%의 혈관생성 활성을 갖는 것으로 결정되는 것인, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    EV가 인간 세포 유래의 것인, 방법.
  16. 실시간 PCR에 의해 Ct 값으로 측정되는 제제 중 miR-130a 함량이 30 미만의 Ct이고, 제제 중 TGFβ 함량이 23 pg/1010 EV 초과이며, 혈관생성 요법으로 긍정적인 영향을 받는 질환 또는 부상의 치료적 치료에 사용하거나 상처 치유에 사용하기 위한, 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 혈관생성 세포외 소포(EV) 제제.
  17. 실시간 PCR에 의해 30 미만의 Ct의 Ct 값으로 측정되는 miR-130a 함량 및/또는 23 pg/1010 EV 초과의 TGFβ 함량을 갖는, 혈관생성 요법으로 긍정적인 영향을 받는 질환 또는 부상의 치료적 치료에 사용하거나 상처 치유에 사용하기 위한 혈관생성 세포외 소포(EV) 제제.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    EV 제제가 적어도 50%의 혈관생성 활성을 갖는, 제제.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    EV가 생물학적 유체, 또는 조정 세포(conditioned cell) 또는 조직 배양 배지로부터 유래되는, 제제.
  20. 제19항에 있어서,
    생물학적 유체가 전혈, 혈장 또는 혈청인, 제제.
  21. 제20항에 있어서,
    EV가 건강한 기증자의 혈청 또는 심혈관 위험 인자를 가진 환자의 혈청으로부터 제조되는, 제제.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 부상이 혈관 질환 또는 부상, 또는 심혈관 질환의 위험과 관련된 병태인, 제제.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환 또는 부상이 급성 심근 경색, 급성 뇌혈관병, 급성 및 만성 말초 혈액 질환, 급성 신장 허혈, 비만 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제제.
KR1020217033241A 2019-03-15 2020-03-13 세포외 소포(ev)의 혈관생성 가능성을 예측하기 위한 방법 KR20210149071A (ko)

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