KR20210142668A - 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱 또는 분석하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱 또는 분석하기 위한 방법 및 시스템 Download PDF

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KR20210142668A
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리차드 에드워드 왓츠
디브야 카니차르
패트릭 제임스 맥케나니
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해이스택 사이언시스 코포레이션
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Abstract

본 개시내용은 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 표적-활성을 결정하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 것인 단계; 및 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 상이한 표적-활성에 기반한 전기영동에 의해 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 분리하는 다양한 방법을 포함한다. 본원에 개시된 방법의 이점은 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 표적-활성에 대한 정성적 및 정량적 데이터를 수집하고 계산하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

Description

올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱 또는 분석하기 위한 방법 및 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 62/818,645를 우선권 주장하며, 이 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
올리고뉴클레오티드 코딩된 라이브러리는 상이한 특성과 반응성을 갖는 수많은 상이한 분자의 조합 합성 및 식별을 지시하는 유용한 방법을 제공할 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 코딩된 부분에 테더링된 코딩 부분, 예컨대 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 코딩 부분은 코딩된 부분의 조합 합성을 기록하거나 지시하는 역할을 하고, 합성 후에는 코딩된 부분의 구조를 식별하는 역할을 한다. 비유하자면, 코딩 부분은 프린터에 무엇을 생산할지 알려주고 인쇄 후 제품을 식별하기 위해 부착된 상태로 유지되는 3-D 프린터에 대한 분자 바코드와 같을 것이다.
그러나, 일단 수백만 개 내지 수조 개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리가 합성되면, 이러한 코딩된 부분이 가질 수 있는 유용한 특성을 결정하는 것이 과제이다. 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 합성과 차세대 시퀀싱은 강력한 학술 및 산업 연구의 주제였으며, 그 결과 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 합성하고, 코딩된 부분을 신속하게 식별하고, 유용한 특성을 결정하는 보다 더 효율적인 방법이 개발되었다. 이러한 발전에도 불구하고, 이들 분자의 코딩된 부분을 분리, 측정 및/또는 그의 유용성을 결정하는 방법은 보조를 맞추는데 실패하였다.
표적 분자에 대한 결합 표적-활성에 기반하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 효율적으로 분리할 필요가 있다. 위양성 및 위음성 결과를 제거하거나 줄일 필요가 있다. 표적 분자에 대한 개별 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 표적-활성에 관한 정성적 및/또는 정량적 데이터를 제공할 필요가 있다.
본 개시내용은 전기영동 및 올리고뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 결정된 바와 같이, 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 차등 표적-활성에 적어도 부분적으로 기반하여 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 또한 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 상이한 표적-활성에 적어도 부분적으로 기반한 전기영동에 의해 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 분리하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본원에 개시된 방법의 이점은, 예를 들어, 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 표적-활성에 대한 정성적 및 정량적 데이터를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 표적-활성을 결정하는 방법은 분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 것인 단계; 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 함유하는 샘플을 분리 매질에 도입하며, 여기서 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 적어도 하나의 코딩된 부분에 작동적으로 연결된 코딩 부분을 포함하는 것인 단계; 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형성하는 단계; 분리 매질로부터 적어도 2개의 별도의 위치 중 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자로부터 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계; 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행할 수 있도록 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱하는 단계; 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 대해 PCR을 수행함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분을 증폭시키는 단계; 및 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 정체 및 적어도 하나의 위치를 프로세싱함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 표적-활성을 결정하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 것인 단계; 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 함유하는 샘플을 분리 매질에 도입하며, 여기서 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 적어도 하나의 코딩된 부분에 작동적으로 연결된 코딩 부분을 포함하는 것인 단계; 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형성하는 단계; 분리 매질로부터 적어도 2개의 별도의 위치 중 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자로부터 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계; PCR을 수행할 수 있도록 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱하는 단계; 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 대해 PCR을 수행함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분을 증폭시키는 단계; 및 적어도 하나의 위치를 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 정체와 상호연관시킴으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 분자는 세포, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 효소, 리보솜, 및 나노디스크 중 적어도 하나를 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 분리 매질은 입자, 중합체, 및 분리 표면 중 적어도 하나를 함유하고, 적어도 하나의 표적 분자는 분리 매질, 입자, 중합체, 및 분리 표면 중 적어도 하나에 연결된다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 입자는 중합체 입자 또는 금속 콜로이드를 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 중합체는 적어도 하나의 표적 분자의 가장 낮은 중량 표적 분자의 10% 이상의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 표적 분자와 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분 사이의 적어도 하나의 표적-활성에 기반하여 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 표적-활성은 적어도 하나의 표적 분자에 의한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 화학적 변형을 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하고, 적어도 하나의 코딩된 부분은 적어도 2개의 위치적 빌딩 블록을 함유하고, 적어도 하나의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록은 올리고뉴클레오티드의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 분리 매질은 다공성 겔 및 버퍼 시스템을 함유한다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 화학식 (I)에 따른 구조를 갖는다:
(I) G-L-B
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B는 적어도 2개의 위치적 빌딩 블록을 함유하는 코딩된 부분이고;
L은 G를 B에 작동적으로 연결하는 링커이고;
여기서 B에서의 각각의 위치적 빌딩 블록은 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 위치에 따라 별도로 식별된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는다:
(II) [(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 또는 1이고;
P는 0 또는 1이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 화학식 (III)에 따른 구조를 갖는다:
(III) [(B1)M-L1]O-G'-[(L2-(B2)K]P
여기서
G'는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, G'는 적어도 2개의 코딩 영역 및 적어도 하나의 헤어핀을 포함하는 것을 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 내지 5의 정수이고;
P는 0 내지 5의 정수이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1 내지 5의 정수이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G'의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 방향으로 분리 매질을 가로질러 제1 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제1 분리 처리는 제1 전압 프로토콜 및 제1 지속기간을 포함하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 방향에 실질적으로 수직인 제1 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제2 방향으로 분리 매질을 가로질러 제2 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제2 방향은 제1 방향에 실질적으로 수직이고, 여기서 제2 분리 처리는 제2 전압 프로토콜 및 제2 지속기간을 포함하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 세그먼트화 방향에 실질적으로 수직인 제2 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태에 대한 하기 상세한 설명뿐만 아니라 전술한 요약은 첨부된 도면과 연계해서 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 예시의 목적으로, 도면에 일부 실시양태가 도시되어 있는데, 이는 바람직할 수 있다. 도시된 실시양태는 도시된 정확한 세부사항으로 제한되지는 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 본원에 개시된 방법의 한 실시양태를 도시하는 플로우 차트이다.
도 2는 본원에 개시된 방법의 한 실시양태를 예시한 것이다.
도 3은 표적-활성 분리를 위한 전기영동 채널을 성형하기 위한 방법의 한 실시양태를 예시한 것이다.
도 4는 2개의 상이한 분리 매질을 사용하여 2차원 전기영동을 수행하는 방법의 한 실시양태를 예시한 것이다.
도 5는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형광 표지하기 위한 합성 계획의 화학적 표현이다.
도 6a는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6b는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6c는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6d는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6e는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6f는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6g는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6h는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6i는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6j는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6k는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6l은 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6m은 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6n은 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6o는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 6p는 양성 대조군 화합물의 화학 구조를 나타낸다.
도 7a는 농도에 기반한 화합물의 편광 형광 그래프를 함유하며, 여기서 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732는 도 6a, 6b, 6c, 6d, 6e, 6f, 6g, 6h, 6i, 6j, 6k, 6l, 6m, 6n, 6o, 6p 각각의 양성 대조군 화합물에 상응한다.
도 7b는 농도에 기반한 화합물의 편광 형광 그래프를 함유한다.
도 8a는 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 크로마토그램이다.
도 8b는 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 크로마토그램이다.
도 8c는 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 크로마토그램이다.
도 8d는 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 크로마토그램이다.
도 9는 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 혼합물의 크로마토그램이다.
도 10은 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 혼합물의 크로마토그램이다.
도 11a는 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 혼합물의 크로마토그램이다.
도 11b는 표적 활성 분리 프로토콜에 의해 분리된 바와 같은 대조군 화합물의 혼합물의 크로마토그램이다.
도 12는 본원에 개시된 시스템 및 방법의 실시양태를 구현하기 위한 컴퓨터 시스템의 예시이다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 측정은 표준 미터법 단위이다.
달리 명시되지 않는 한, 단위 측정으로서 직접 사용될 때 접두사 "u"는 "마이크로"를 의미하고 전형적으로 "μ"로 축약된다. 예를 들어, "uL"은 "마이크로리터" 또는 "μL"을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 단수 형태는 모든 경우에, 하나 또는 하나 초과를 나타낼 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 어구 "적어도 하나"는 객체의 하나 또는 하나 초과 또는 하나 초과의 임의의 조합을 의미한다. 예를 들어, "H1, H2, 및 H3 중 적어도 하나"는 H1, H2, 또는 H3, 또는 그의 임의의 조합을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 가장 가까운 정수로 반올림된, 기재된 백분율이 아닌 숫자의 ±10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 100 mm는 90 내지 110 mm를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 백분율 숫자의 ±5%를 지칭한다. 예를 들어, 약 20%는 15 내지 25%를 포함할 수 있다. 용어 "약"이 범위의 관점에서 논의될 때, 그 용어는 하한보다 작고 상한보다 많은 적절한 양을 지칭한다. 예를 들어, 약 100 내지 약 200 mm는 90 내지 220 mm를 포함할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "혼성화하다", "혼성화하는 것", "혼성화된" 및 "혼성화"는 DNA의 경우 구아닌-시토신 및 아데닌-티민 (G-C 및 A-T) 쌍형성을 포함하고 RNA의 경우 구아닌-시토신 및 아데닌-우라실 (G-C 및 A-U) 쌍형성을 포함하는, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성을 포함한다. 전형적으로, 이러한 용어는 안티코돈 또는 안티코딩 영역이라고 하는 뉴클레오티드의 상보적 가닥에 대한 뉴클레오티드 가닥의 선택적 인식의 맥락에서 사용된다.
어구 "선택적으로 혼성화하는 것", "선택적 혼성화", "선택적으로 분류하는 것" 및 "선택적 인식"은 비-상보적 올리고뉴클레오티드 가닥에 비해 상보적 올리고뉴클레오티드 가닥의 5:1 내지 100:1 이상의 선택성을 지칭한다.
용어 "올리고뉴클레오티드 코딩된 분자"는 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 코딩된 부분을 함유하는 본 개시내용의 분자를 지칭한다.
용어 "코딩 부분"은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 부분을 지칭하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분을 코딩하고 식별할 수 있다.
용어 "코딩된 부분"은 빌딩 블록, 예컨대 위치적 빌딩 블록 B1 및 B2의 구조를 함유하는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 하나 이상의 부분을 지칭하며, 이는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 의해 코딩되고 식별될 수 있다. 예를 들어, 용어 "코딩된 부분"은, 예를 들어, 이들 구조가 코딩된 부분을 합성하는 프로세스의 일부로서 부가될 수 있을지라도 링커를 포함하지 않는데, 이는 링커가 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 의해 코딩되지 않았기 때문이다. 제2 예로서, 용어 "코딩 부분" 및 "코딩된 부분"은 코딩 프로세스 후에 도입된 분자 구조, 예컨대 형광 측쇄를 포함하지 않을 것이다.
어구 "위치적 빌딩 블록의 총 수"는 코딩된 부분에서 빌딩 블록의 집계 수를 지칭한다. 용어 "빌딩 블록"의 의미는 상황에 따라 달라질 수 있다. 용어 "빌딩 블록"은 일반적으로, 코딩 부분에서 코딩되고 코딩된 부분으로 만들어지는 화학적 변화를 지칭한다. 빌딩 블록의 제1 예는 코딩된 부분의 일부를 형성하기 위해 링커 또는 또 다른 빌딩 블록과 반응하고 이와 결합할 수 있는 화학적 서브유닛이다. 제2 예로서, 빌딩 블록은 화학적 모이어티의 제거를 포함하는 화학적 변화일 수 있다. 이것의 구체적인 예는 에스테르의 가수분해, 또는 아민 또는 알데히드 또는 알콜의 탈보호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제3 예는 링커 또는 빌딩 블록의 반응성을 변화시키는 링커 또는 또 다른 빌딩 블록에 대해 만들어진 화학적 변화를 나타내는 빌딩 블록을 포함한다. 구체적 예는 알콜의 알데히드 또는 케톤으로의 산화, 알데히드 또는 케톤의 알콜로의 환원, 니트로 기의 아민으로의 환원, 아지드의 아민으로의 환원, 또는 아민의 니트로 기 또는 아지드로의 산화를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "식별된", "식별하다" 및 "식별한다"는 코딩 부분의 코딩 영역 또는 코딩 영역의 조합과 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 빌딩 블록의 구조 및/또는 서열 사이에 존재하는 상관관계를 지칭한다. 일반적으로, 코딩 영역의 서열의 이러한 상관관계는, 상기 서열이 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분의 PCR 생성된 카피로부터 간접적으로 수득된 경우 및 그러한 경우일지라도, 코딩된 부분의 서열, 구조 및/또는 예측된 구조의 추론 또는 식별을 허용하도록 코딩된 부분을 구축하는데 사용되는 합성 단계의 지식과 조합될 수 있다.
용어 "제1", "제2" 등은 단순히 어떤 대상이 참조되고 있는지를 지정하거나 구별하는 용어로 이해되며, 가장 먼저 발생하는 항목의 순서를 기반으로 하는 경우가 많다. 예를 들어, "제1" 어레이는 첫 번째로 사용되는 어레이이고 제1 코딩 영역은 제1 어레이 상에 고정화될 수 있는 제1 코딩 영역이다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "제1", "제2" 등은 분자 내의 위치를 지칭하지 않는다. 예를 들어, 제1 코딩 영역 및 제2 코딩 영역은 순차적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있으며, 코딩 부분 내에서 서로 가까울 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 것으로 이해된다.
본 개시내용에서, 분자 화학식에서 하이픈 또는 대시는 그러한 화학식의 일부가 공유 결합 또는 혼성화를 통해 서로 직접 연결되어 있음을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 뉴클레오티드, 정수 값 및 백분율의 모든 범위는 모든 중간 정수뿐만 아니라 종말점을 포함한다. 예를 들어, 5 내지 10개 뉴클레오티드의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 코딩 부분으로서 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 부분, 및 적어도 하나의 코딩된 부분을 함유하는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 (OEM)에 관한 것이며, 여기서 올리고뉴클레오티드 부분은 조합 화학을 사용하여 적어도 하나의 코딩된 부분의 합성을 지시하거나 코딩한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 올리고뉴클레오티드 부분은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 추론을 식별하거나 촉진시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 부분을 함유하며, 여기서 적어도 2개의 코딩 영역의 조합은 코딩된 부분 내의 빌딩 블록의 순서 또는 코딩된 부분의 구조에 상응하고 이를 식별하거나 추론하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 부분은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되어 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 부분의 카피를 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 원래의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 부분 또는 그의 카피는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 2개의 코딩 영역의 조합의 정체를 결정하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 코딩 영역의 조합의 정체는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분을 합성하는데 사용되는 일련의 조합 화학 단계와 상호연관될 수 있다. 특정 실시양태에서, 코딩된 부분을 합성하는데 사용되는 일련의 조합 화학 단계는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분을 식별할 수 있거나 그의 추론을 허용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리를 합성하는 방법은 표적 분자에 대한 수백만 개 내지 수십억 개 분자의 분자간 특성, 예컨대 표적-활성을 체계적으로 평가할 수 있는 능력으로 인해 집중적인 학술 및 산업 연구의 초점이었으며, 계속해서 초점이 되고 있다. 예를 들어, 표적 분자가 암 경로에 있어서 핵심 효소인 경우, 연구자는 수백만 개 내지 수십억 개의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 중 하나 이상의 코딩된 부분이, 촉매 반응의 속도를 증가시키거나 감소시키는 방식으로 그러한 효소와 결합할 수 있는지를 결정할 수 있다. 비유하자면, 이것은 올바른 조합을 찾을 때까지 짧은 시간 내에 수백만 개의 조합을 전자적으로 시도할 수 있는 장치를 사용하여 디지털 잠금 장치에 대한 조합을 결정하는 것과 같다. 그러나, 디지털 잠금 장치는 올바른 숫자 순서로 잠금을 해제하도록 설계된 반면, 생물학적 표적은 구조의 올바른 조합이 없을 수 있지만, 효과적인 치료법으로서 상업화하기에 충분히 잘 작동하는 하나 이상의 분자를 찾을 수 있기를 바란다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리는 일종의 유도 진화를 사용하여 원하는 결합 친화도를 가질 수 있는 분자에 점점 더 가까워질 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 표적 분자와 약하게 반응하는 경우, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 그 다음 라이브러리를 합성하여 가장 유망한 후보의 코딩된 부분의 구조적 변이를 조사할 수 있으며, 보다 더 나은 결합 특성을 갖는 코딩된 부분을 찾기를 바란다. 이러한 유도 진화 및 평가는 효과적인 해결책이 발견되거나, 또는 막다른 골목에 도달할 때까지 진행되어, 그 다음 분자가 유도 진화 연구의 출발점으로서 선택되도록 할 수 있다.
그러나, 유용한 특성을 가진 분자를 발견하기 위한 이러한 연구 분야의 약속에도 불구하고, 대다수의 연구는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리를 합성하는 효과적인 방법을 개발하는데 있었다. 또한 코딩 부분 또는 그의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 카피로부터 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분을 시퀀싱하고 식별하는 차세대 방법의 상당한 발전이 있었다. 또한 시퀀싱 데이터로부터 더 큰 차원을 추출하기 위해 통계 기술을 적용하려는 상당한 노력이 있어 왔다. 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 바람직한 특성에 관하여 표적 분자에 대해 어떻게 시험하는지의 문제에 대해서는 진전이 덜 이루어졌다.
올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리가 표적 분자와 반응하는지 시험하는 전통적인 방법 중 하나는 "대량 노출" 방법이며, 이는 특정 경우에 "패닝"으로서 지칭된다. 대량 노출 방법은 단순히 표적 분자를 용매 또는 매질에서 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리 또는 그의 일부분에 노출시킨다. 전형적으로, 표적 분자는 고정화되고, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 표적 분자와 결합한다. 노출 기간 후, 용매 또는 매질이 제거되어, 표적 분자에 부착되거나 이와 연합된 강력한 결합성 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 남게 된다. 이들 강력한 결합성 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 코딩 부분의 카피를 만들기 위해 PCR을 사용하고, 이어서 강력한 결합성 코딩된 부분의 구조를 디코딩하고 식별하기 위해 카피 또는 원본을 시퀀싱함으로써 식별될 수 있다. 이러한 방법은 어떤 구성원 또는 특정한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 표적 분자와 강하게 결합하거나 또는 그와 연합하는지를 발견할 수 있다. 그러나, 이러한 대량 노출 방법은 신뢰할 수 없으며, 반복 실험에서 식별된 결합제 제품군은 매우 다양할 수 있다. 전형적으로, 단지 중간 정도의 결합제 또는 약한 결합제이지만 그의 구조가 화학 구조를 생물학적 활동과 상호연관시키는데 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 많은 분자가 있을지라도, 가장 강력한 결합제만이 매번 재현가능하게 포착된다. 추가로, 이러한 방법은 위양성을 제공할 수 있으며, 여기서는 시험 챔버에 고정화된 상태로 남아 있는 구성원이 시험 환경의 일부, 예컨대 챔버 자체, 또는 테더링 매질, 또는 또 다른 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자와 결합한다. 대량 노출 방법은 또한 위음성을 제공하는데, 이는 표적 분자와 약하게, 중간 정도로 또는 심지어 강하게 결합하는 분자가 결합하고, 결합을 해제한 다음, 용매가 제거될 때 세척 제거될 수 있기 때문이다. 결합, 결합 해제 및 세척 제거되는 분자는 시퀀싱 데이터에서 절대 복구하거나 식별할 수 없으므로, 검정 소모로 인한 이러한 종류의 위음성은 실제 결합제를 비-결합제와 구별할 수 없게 만든다. 위음성의 두 번째 원인은 많은 위양성이 존재한다는 것이다. 종종, 위양성은 실제 결합제보다 더 강력한 시퀀싱 데이터 신호를 제공한다. 이러한 경우, 실제 결합제와 위양성을 구분할 수 없으며, 실제 결합제는 노이즈에서 손실된다. 사실, 이러한 대량 노출 방법은 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 표적 친화도를 측정하기 위한 데이터를 제공하지 않는다. 이러한 표준 방법에 의해 생성된 데이터는 이원성이다: PCR 및 시퀀싱 동안 존재한다는 것을 결합된 것을 의미하고; PCR 동안 존재하지 않는다는 것은 결합되지 않았다는 것을 의미한다. 대량 노출 방법은 프로세싱 관점에서는 효율적일 수 있지만, 데이터 수집 관점에서는 비효율적이고 제한적이다. 데이터 수집이 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리의 고처리량 스크리닝의 주요 목표이기 때문에, 대량 노출 방법은 신약 개발 과정에서 병목 현상이 되고 있다.
올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리가 표적 분자와 결합하는지를 시험하는 또 다른 전통적인 방법은 "대량 노출 후 전기영동" 방법이며, 이는 일부 경우에는 "겔 이동 검정"으로서 지칭된다. 이러한 방법에서, 대량 노출 후 전기영동 방법은 표적 분자가 결합되지 않은 것을 제외하고, 이전에 논의된 "대량 노출" 방법과 유사한 방식으로 용매 또는 매질에서 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리에 표적 분자를 단순히 노출시킨다. 대신, 표적 분자와 결합된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자, 결합되지 않은 표적 분자, 및 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리의 혼합물은 이러한 혼합물을 전통적인 전기영동에 적용함으로써 정제된다. 전통적인 전기영동은 분자의 크기와 전하 사이의 차이를 기반으로 표적 분자와 결합된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하며, 이는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자와 결합된 표적 분자를 결합되지 않은 표적 분자 및 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자로부터 분리할 수 있다. 이러한 대량 노출 후 전기영동 방법은 표적 분자와 결합된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 결합되지 않은 채로 남아 있는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 및 표적 분자로부터 분리하는 이점을 가질 수 있다. 그러나, 이러한 기존의 기술은 동일한 위음성을 겪게 되고, 결합되거나 결합되지 않는 동일한 이원 데이터를 제공한다.
본 개시내용은 일종의 "표적-활성 전기영동"을 적용함으로써 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법의 일반적인 개요로서, 도 1 및 도 2를 참조하여, 상기 방법은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 분리 매질을 제공하는 단계 (102, 202); 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 함유하는 샘플을 분리 매질에 도입하며, 여기서 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 적어도 하나의 코딩된 부분 ("별 모양")에 작동적으로 연결된 (예를 들어, "L") 코딩 부분 (예를 들어, "CBA")을 포함하는 것인 단계 (104, 204); 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형성하는 단계 (번개 부호의 크기로서 도시된 상대적 표적 활성) (106, 206); 분리 매질로부터 적어도 2개의 별도의 위치 중 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성하고 이동 거리를 측정함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자로부터 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계 (108, 208) (D1 또는 D2로서 표시됨); PCR을 허용하도록 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱하는 단계 (110, 210); 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 대해 PCR을 수행함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분을 증폭시키는 단계 (112, 212); 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 또는 그의 PCR 카피의 코딩 부분을 시퀀싱하고, 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분을 식별하는 단계 (114, 214); 적어도 하나의 위치를 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 정체와 상호연관시킴으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하는 단계 (116, 216)를 포함한다.
일반적으로, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 표적 분자를 함유하는 분리 매질에 도입하고, 전기영동을 사용하여 표적 분자를 함유하는 분리 매질을 통해 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 이동시켜, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 적어도 부분적으로, 표적 분자와 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분 사이의 활성을 기반으로 하여 분리되도록 하는 것을 포함한다. 그 다음, 한 실시양태에서, 상기 방법은 분리되거나 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 함유하는 분리 매질을 세그먼트화하고 출발점 또는 샘플 웰로부터 상이한 세그먼트의 이동 거리를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 그 다음, 한 실시양태에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분의 PCR 증폭을 허용하도록 분리 매질을 프로세싱함으로써 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분의 PCR 증폭을 수행하고 시퀀싱한 다음, 서열 데이터를 상호연관시켜 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분을 식별하고, 코딩 부분을 시퀀싱하며, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 구조를 식별 또는 추론하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 코딩된 부분의 정체를 분리 매질에서의 그의 이동 거리 또는 위치와 상호연관시킴으로써 표적-활성 데이터를 수집하는 것을 포함할 수 있다.
더 자세하게, 한 실시양태에서, 상기 방법은 매질에서의 표적 분자의 이동성을 고정화시키거나 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리는 샘플 웰에서 분리 매질에 도입될 수 있다. 이어서 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리를 전기영동하여, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리가 매질를 통해 이동하여 고정화된 표적 분자와 접촉하도록 할 수 있다. 추가로, 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 라이브러리는 부분적으로, 표적 분자와의 활성에 기반하여 분리되거나 분해될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자와의 높은 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 분리 매질을 통한 그의 이동이 느려지는 반면, 표적 분자와의 낮은 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 그의 이동이 덜 느려질 것이다. 한 실시양태에서, 일단 충분한 분리가 달성되면, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 함유하는 샘플 혼합물의 부분은 매질을 여러 부분으로 세그먼트화함으로써 회수될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 부분은 용매에 용해시키거나 용매에 침지시켜 그 부분에서의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 용매 내로 통과하도록 함으로써 단리될 수 있다. 한 실시양태에서, 일단 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 일부분이 회수되면, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분은 PCR을 수행하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 카피를 형성함으로써 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 카피가 시퀀싱될 수 있고, 서열 데이터를 사용하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 식별하고 분리 매질에서의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 이동 거리를 측정할 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 방법의 한 가지 이점은 위음성이 회피되거나 감소될 수 있다는 것인데, 이는 강력한 결합성 또는 반응성 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자도 더 강한 전압을 인가함으로써 복구될 수 있으므로, 검출에서 분자의 소멸을 기반으로 추론할 필요가 없기 때문이다. 한 실시양태에서, 이러한 방법의 이점은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 이동 거리의 측정이 표적 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 친화도에 대한 정성적 및/또는 정량적 데이터를 제공할 수 있다는 것이다. 대조적으로, 기존 방법은 각각의 분자에 대한 이원 데이터 (결합 또는 비결합)만을 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 의해 개시된 방법의 이점은 상이한 유형의 상호작용을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기존의 방법은 프로브-표적 친화도만 측정할 수 있다. 대조적으로, 본원에 개시된 방법은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 화학적 반응성에 관한 데이터를 제공할 수 있는데, 이는 코딩된 부분과 반응하는 표적 분자의 화학적 반응성, 예를 들어, 반응을 촉매하는 것은 분리 매질을 통한 이동 속도를 늦추는 경향이 있기 때문이다.
한 실시양태에서, 본원에 의해 개시된 방법은 포착되고 식별되는 실제 결합제의 수를 엄청나게 증가시킬 수 있다. 첫째, 실제 결합제는 '세척' 단계가 없기 때문에 검정 소모로 인해 손실될 가능성이 훨씬 적다. 대량 노출/패닝 방법에서의 세척 단계는 액체의 흐름을 사용하며 표적과 결합할 수 없는 분자를 표적으로부터 멀리 이동시키기 위한 것이다. 그러나, 실제 효과는 결합되지 않은 분자를 이동시키는 것이며, 즉 세척은 (a) 결합할 수 없는 분자와 (b) 일시적으로만 결합되지 않은 분자를 둘 다 똑같이 이동시킬 것이다. 대조적으로, 본원에 개시된 방법은 표적과 결합되지 않은 분자를 이동시키기 위해 전기영동을 사용하지만, 표적이 있는 한 장소에서 표적이 있는 또 다른 장소로 분자를 이동시키며; 이것은 일시적으로만 결합되지 않은 분자가 다시 결합할 수 있는 더 큰 기회를 제공한다. 이러한 프로세스는 이동 경로를 따라 여러 번 반복되기 때문에, 검정 소모에 대한 위음성으로서 손실되는 화합물이 훨씬 적다. 둘째, 시스템 내의 전압은 일시적이고 비특이적인 방식으로 결합하는 분자에 대해 매우 강력하고 지속적인 힘을 가하기 때문에, 이러한 분자는 세척 프로세스에 의해서보다 더 철저하게 제거된다. 더 완전히 제거되기 때문에, 이들 화합물은 시퀀싱 데이터에서 더 작은 신호를 생성하므로 실제 결합제의 신호를 무시할 가능성이 적다. 순 효과는 신호 대 잡음비의 매우 큰 증가와 실제 결합제로서 식별되는 화합물의 수에 있어서의 매우 큰 증가이다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 것인 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 분리 매질은 이러한 매질이 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 전기영동을 허용하는 한 일반적으로 제한되지는 않는다. 적합한 분리 매질은 다공성 겔 및 전기영동에 적합한 버퍼 시스템을 포함한다. 적합한 다공성 겔은 아가로스, 폴리아크릴아미드, 다양한 히드로겔 및 전분을 포함할 수 있다. 적합한 버퍼 시스템은 트리스/아세테이트/EDTA (TAE), 트리스/보레이트/EDTA (TBE), 트리스/보레이트 (TB) 및 리튬/보레이트 (LB)를 포함할 수 있으며, 여기서 EDTA는 에틸렌디아민테트라아세트산을 나타내고 트리스는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 나타낸다. 겔의 다공성은 선택된 버퍼 시스템에서 다양한 농도의 겔화 물질을 활용하여 제어할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 분리 매질을 제공하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 고정화될 수 있거나, 또는 표적 분자의 이동성은 표적 분자를 분리 매질, 입자, 중합체 및 분리 표면 중 적어도 하나와 결합하거나 또는 이에 테더링함으로써 감소될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 표적을 분리 매질과 접촉시키기 전, 접촉하는 동안 또는 접촉한 후에 입자, 중합체, 및 분리 표면 중 적어도 하나와 결합되거나 이에 테더링될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 분리 매질, 예컨대 아가로스 겔에 부가되기 전에 입자와 결합되거나 이에 테더링된다. 일반적으로, 전기영동 동안 결합이 안정하기만 하면 한 분자를 표면 또는 다른 분자와 결합시키는 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 분자, 예컨대 단백질 또는 단백질 복합체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 결합 방법을 사용하여 분리 매질, 입자, 중합체 및 분리 표면을 포함한 앵커와 결합될 수 있다. 적합한 결합 방법은 아미드 결합 가교, 술파미드 또는 술폰 형성, 약하게 반응성인 친전자성 상호작용, 중합 반응, 디술피드 형성, 에스테르 형성, 클릭 반응 (예컨대 구리와의 아지드 알킨 반응), 딜스-알더(Diels-Alder) 고리 부가 및 교차 복분해, 매트릭스 트래핑을 통한 칼슘 알지네이트 고정화 등을 포함한다.
분자, 예컨대 표적 분자를 고체 표면 상에 고정화시키는 것은 분자를 변형시키거나 또는 적어도 변형시킬 위험을 초래하여 천연 분자의 활성을 숨길 수 있는 것으로 공지되어 있다. 표적 분자의 변형을 피하거나 감소시키는 방법은 표적 분자의 천연 활성을 측정할 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 중합체 또는 올리고머 (분리 매질의 중합체 및/또는 올리고머 제외)에 부착되거나, 이와 결합하거나, 이와 강하게 연합 또는 테더링되며, 여기서 중합체 또는 올리고머는 표적 분자의 가장 낮은 분자량의 20% 내지 5000%를 포함한 10% 이상의 분자량을 갖는다. 한 실시양태에서, 표적 분자를 중합체 또는 올리고머에 테더링하는 것의 이점은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자, 표적 분자, 및 중합체 또는 올리고머의 조합이 표적 분자를 변형시킬 위험을 제거하거나 감소시키면서, 분리 매질을 통해 상이한 속도로 이동하여 다른 분자로부터 추가로 분리할 수 있다는 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자를 중합체 또는 올리고머에 테더링하는 것의 이점은 코딩된 부분을 식별하기 위해 코딩 부분을 PCR 및 시퀀싱하기 전에, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자, 표적 분자, 및 중합체 또는 올리고머가 분리 매질로부터, 예를 들어 용매 또는 버퍼 내로 제거될 수 있다는 점일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 분리 매질을 포함하며, 여기서 분리 매질은 입자와 결합되거나 이에 테더링된 표적 분자를 함유한다. 한 실시양태에서, 입자는 적절한 항-표적 태그로 표지된 조성물일 수 있다. 한 실시양태에서, 입자는 고체 입자, 무정형 입자, 다공성 입자, 중합체성 입자, 금속 콜로이드, 재료의 혼합물, 또는 단량체성 전기영동 매질일 수 있다. 적합한 입자는 이온 교환 수지, 실리카 입자, 폴리스티렌, 아가로스 비드, 비오틴-표지된 아가로스, 세파로스(SEPHAROSE)® 비드, 텐타겔(TENTAGEL)® 수지 비드, 덴드리머성 중합체 (폴리에틸렌 글리콜, 폴리스티렌 등), 디나비즈(DYNABEADS)® (자성 입자); 및 매트릭스 트래핑을 통한 칼슘 알지네이트 고정화를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자를 입자와 결합시키거나 또는 이에 테더링하는 것의 한 가지 이점은 표적 분자가 고정화되거나 또는 전기영동 동안의 그의 이동이 결합되지 않은 표적 분자에 비해 느려진다는 것일 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 분자를 입자에 부착 또는 테더링하는 것의 이점은 입자가 분리 매질에 고정화된다는 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 겔 전기영동 플레이트의 표면에 부착되거나 고정화되고, 여기서 겔 전기영동 플레이트는 겔이 형성되는 표면이다. 한 실시양태에서, 표적 분자를 입자 또는 표면에 부착 또는 테더링하는 것의 이점은 표적 분자의 이동이 제한되거나 방지되어, 표적 분자의 이동 속도가 분리를 위한 기반으로서 제거되도록 하는 것일 수 있다.
표적 분자가 분리 매질, 입자, 중합체 또는 분리 표면과 선택적으로 결합할 수 있는 방법이 유리할 수 있으며, 이는 상이한 결합 메커니즘을 사용할 수 있어 여러 실험에 대한 고려로부터 결합 메커니즘의 선택을 제거할 수 있기 때문이다. 한 실시양태에서, 접합체 쌍 반응은 태그부착된 표적 분자를 분리 매질, 입자, 중합체, 또는 분리 표면과 선택적으로 결합시킨다. 적합한 접합체 쌍 반응은 His 태그 (여기서 His는 6 내지 10의 정수의 히스티딘임)를 니켈 NTA 또는 항-His 항체를 함유하거나 또는 그의 표면 상에 디스플레이하는 입자와 결합시키는 반응; 비오틴 태그를 스트렙타비딘, 아비딘 또는 항-비오틴 항체를 함유하는 입자와 결합시키는 반응; 스트렙타비딘 결합 펩티드를 스트렙타비딘 또는 아비딘을 함유하는 입자와 결합시키는 반응; 할로-태그를 할로-태그 단백질을 디스플레이하는 입자와 결합시키는 반응; FLAG 태그를 항-FLAG 항체를 함유하거나 또는 그를 디스플레이하는 입자와 결합시키는 반응; 칼모듈린 결합 단백질을 칼모듈린을 함유하거나 또는 그를 디스플레이하는 입자와 결합시키는 반응; 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 글루타티온을 함유하는 입자와 결합시키는 반응; 셀룰로스 결합 도메인 (CBP)을 셀룰로스 입자 또는 분리 매질과 결합시키는 반응; 천연 단백질을 항-단백질 항체를 함유하거나 또는 그를 디스플레이하는 입자와 결합시키거나, 또는 통상의 부착 화학 (예를 들어, N-히드록시 숙시디미드 또는 카르보디이미드 화학)에 의해 입자 표면 상의 카르복실 기와 반응하는 표면 리신 모이어티에 의해 입자에 공유적으로 테더링되는 반응; 스트렙타비딘 단백질을 비오틴 또는 항-스트렙타비딘 항체를 함유하거나 또는 그를 디스플레이하는 입자와 결합시키는 반응; 및 올리고뉴클레오티드 표지된 단백질을 상보적 올리고뉴클레오티드를 함유하거나 또는 그를 디스플레이하는 입자와 결합시키는 반응을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 분리 매질에서의 표적 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 샘플 또는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물이 분리 매질에 도입되기 전에 표적 분자를 분리 매질에 부가하거나 혼합하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 표적 분자를 분리 매질에 또는 분리 매질과 접촉하거나 분리 매질에 의해 함유된 표면에 고정화시키거나 또는 이와 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 줄기 세포 또는 암 세포를 포함한 세포; DNA (데옥시리보핵산) 및 RNA (리보핵산)를 포함한 올리고뉴클레오티드; 천연 세포 용해물, 표적 과다발현 세포 용해물; 천연 단백질, 돌연변이체 단백질, 펩티드; 시토크롬, 키나제, 글루타미나제, 포스포릴라제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소; 리보솜, 리포솜, 합성 분자 및 나노디스크, 및 그 안에 각각, 일부, 또는 모두의 혼합물을 포함한 것일 수 있다. 적합한 합성 분자는 약물 및 오염 물질을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 나노디스크는 2개의 양친매성 단백질에 의해 스크리닝된 소수성 에지를 갖는 인지질의 지질 이중층을 포함할 수 있다. 이러한 나노 디스크는 종종 막 단백질을 연구하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 나노튜브, 중합체, 나노입자 또는 콜로이드를 포함한 입자에 부착된다.
한 실시양태에서, 표적 분자는 이동 축을 따라 분리 매질에 균질하게 또는 실질적으로 균질하게 분포될 수 있으며, 여기서 이동 축은 분리 매질 전체에 걸친 전압 방향일 수 있다. 한 실시양태에서, 표적은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 분리를 증가 또는 감소시키기 위해 이동 방향에 대해 증가하거나 감소하는 농도 구배로 분포될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 분자는 입자 또는 중합체에 테더링될 수 있고, 이어서 이와 같이 테더링된 표적은 매질이 경화되거나 겔화되기 전에 분리 매질에 혼합될 수 있고, 혼합물은 분리 매질 내의 테더링된 표적의 농도 구배를 제공하기 위해 원심분리될 수 있다. 표적을 중합체 또는 입자에 테더링하는 것의 한 가지 이점은 설계된 프로파일에 따라 분리 매질에 표적을 분포시키는 중합체 및 입자를 선택할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 균질한 표적 분자의 그룹은 2개의 상이한 크기의 입자 중 하나에 테더링되어, 분리 매질이 경화되거나 겔화될 때 표적 분자의 2개 그룹 또는 밴드가 형성되도록 할 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 분자는 분리 매질이 경화되거나 겔화되기 전에 이러한 매질에 혼합될 수 있고, 혼합물은 분리 매질 내의 표적의 농도 구배를 제공하기 위해 원심분리될 수 있다. 적합한 원심분리 방법은 차등 원심분리, 속도 구역 원심분리 및 등밀도 원심분리를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 분리 매질에서의 표적 물질의 농도 구배는 크기 배제 분별, 물질의 전기영동, 자기 표적의 자기 분리, 다른 크로마토그래피 분리 기술로부터의 분리에 기반한 시한 체류, 또는 액체 매질 내의 표적을 조작하는 임의의 적합한 방법에 의해 제공될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 일정량의 표적 분자를 일정량의 액체 분리 매질과 혼합하여 분리 매질 중의 표적 분자 농도를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 분리 매질 중의 표적 분자의 농도는 약 500 μg/mL 내지 약 5 mg/mL의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 표적 분자를 입자, 중합체 또는 올리고머와 접촉, 혼합 또는 결합한 다음, 표적 분자와 입자, 중합체 또는 올리고머의 혼합물을 분리 매질에 부가하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 표적 분자와 입자, 중합체 또는 올리고머를 동시에 또는 임의의 순서로 분리 매질에 부가하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자 및 적어도 하나의 샘플 영역 또는 샘플 웰을 함유하는 것인 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 일반적으로 평평한 연속 분리 매질를 제공하기 위해 전기영동 플레이트의 평면 표면 상에 분리 매질을 부가, 주입 및/또는 성형하는 것을 포함한다. 이러한 평평한 연속 분리 매질이 도 4에 예시되어 있다 (402). 도 3을 참조하면, 분리 매질은 도 3에 예시된 바와 같이 분리 매질의 레인으로 성형되거나 만들어질 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상부 표면 상에 레인 리지를 지지하는 캐스트를 제공하는 단계 (302); 적합한 중합체, 예컨대 폴리디메틸실록산 (PDMS)을 레인 리지를 지지하는 캐스트의 상부 표면 상에 주입하고 가교 또는 겔화될 수 있도록 하는 단계 (304); 레인 채널이 위쪽을 향하도록 성형된 중합체를 배향시키는 단계 (306); 임의로, 몰드 오프의 섹션을 차단하는 단계 (308, 310); 및 레인 채널을 분리 매질로 충전하여 분리 레인으로 만들어진 분리 매질을 형성하는 단계 (312)를 포함한다. 한 실시양태에서, 몰드 오프의 섹션을 차단하는 물질은 샘플 웰을 형성하기 위해 제거될 수 있다 (312). 한 실시양태에서, 샘플 웰은 분리 매질이 경화되거나 겔화된 후에 분리물로 커팅될 수 있다. 표적과 상이한 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 더 큰 분해능은 연속 분리 매질 또는 모세관 전기영동을 사용한 분리에 의해서보다 표적-활성 전기영동에 의해 달성될 수 있다는 것이 발견되었다. 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 모세관 전기영동을 사용한 분리는 표적에 태그가 부착되지 않는다는 이점이 있는 것으로 생각되지만, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 표적과 결합될 때, 자유로와서 상이하게 이동하는 분자보다 더 큰 유효 분자량을 획득하는 경우에 분리가 달성된다. 그러나, 달성가능한 분리의 정도는 이동성의 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자와 이동성의 결합된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 차등 이동성으로 제한된다. 표적-활성 전기영동은 고정화된 표적과 결합하는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 결합된 동안 전혀 움직일 수 없는 한 효과적으로 무한한 분자량을 획득하는 반면, 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 여전히 시스템의 최대 속도로 자유롭게 이동할 수 있기 때문에 더 큰 분해능을 달성할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형성하며, 여기서 분리 매질은 분리 레인으로 성형되거나 만들어지며, 여기서 분리 레인은 폭의 반경과 깊이의 반경을 갖고, 폭 R1의 반경과 깊이 R2의 반경은 동일하거나 상이할 수 있고, 이동 방향으로 분리 레인의 길이를 따라 증가하거나, 감소하거나, 또는 일관성을 유지할 수 있는 것인 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 방향으로 분리 매질을 가로질러 제1 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제1 분리 처리는 제1 전압 프로토콜 및 제1 지속기간을 포함하는 것인 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 방향에 실질적으로 수직인 제1 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계를 포함할 수 있다. 방향 또는 축과 관련하여, 용어 "실질적으로"는 30도 이내를 의미한다. 언급된 방향과 더 잘 정렬될수록 더 좋은 결과를 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 제1 분리 처리가 충분하면 추가 정제 또는 분리 방법이 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 제1 분리 처리가 원하는 해상도를 제공하지 않는 경우에는, 후속 제2 또는 순차적 처리를 적용할 수 있다. 예를 들어, 제1 처리가 한 방향으로 적용된 후, 전기영동 조건을 제2 방향으로 적용함으로써 제2 처리가 적용될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 제2 방향으로 분리 매질을 가로질러 제2 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제2 방향은 제1 방향에 실질적으로 수직이고, 제2 분리 처리는 제2 전압 프로토콜 및 제2 지속기간을 포함하는 것인 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 세그먼트화 방향에 실질적으로 수직인 제2 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 동일한 분리 매질에서 유지되는 동안 제1 및 제2 분리 처리가 적용된다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물에 2차원 전기영동을 적용하는 것의 이점은 인가된 제1 전압 파라미터에 비해 상이한 전압, 상이한 비율의 변화 또는 램핑 전압, 또는 펄싱 전압을 포함한, 상이한 제2 전압 파라미터의 적용에 기반하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물의 개선된 분리일 수 있다. 이러한 실시양태는 관련 기술분야에 공지된 2차원 전기영동과 일치한다.
도 4를 참조하면, 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 분리 매질을 제공하며, 여기서 제1 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 것인 단계 (402); 및 제1 방향으로 분리 매질을 가로질러 제1 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제1 분리 처리는 제1 전압 프로토콜 및 제1 지속기간을 포함하는 것인 단계 (404); 제1 분리 매질로부터, 분리의 라인, 레인, 또는 축을 따르는 것을 포함하여, 제1 분리 매질의 일부분 또는 플러그를 세그먼트화하는 단계 (406); 제1 분리 매질로부터의 플러그를 제2 분리 매질의 샘플 웰에 삽입하거나 플러깅하는 단계 (408, 410); 및 제2 방향으로 분리 매질을 가로질러 제2 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 제2 분리 매질의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제2 방향은 제1 방향에 실질적으로 수직이고, 여기서 제2 분리 처리는 제2 전압 프로토콜 및 제2 지속기간을 포함하는 것인 단계 (412)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 세그먼트화 방향에 실질적으로 수직인 제2 세그먼트화 방향으로 제2 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 분리 매질은 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 분리 매질은 제1 표적 분자를 함유할 수 있고 제2 분리 매질은 제2 표적 분자를 함유할 수 있으며, 여기서 제1 표적 분자는 제2 표적 분자와 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자의 농도는 동일하거나 상이할 수 있다.
한 실시양태에서, 분리 매질은 적어도 하나의 샘플 영역 또는 샘플 웰을 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 샘플 영역은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 영역으로부터 분리되며, 여기서 분리 범위는 1 mm 내지 10 cm이다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 샘플 영역은 분리 매질로 커팅된 하나 이상의 구멍 또는 웰을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플 영역의 이점은 전기영동 또는 전기영동 분리 전에 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 함유하는 샘플을 도입하기 위한 장소를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 샘플 영역의 에지로부터 분해된 세그먼트의 에지까지의 이동 거리를 측정하며, 여기서 샘플 영역의 에지는 이동 방향의 에지인 단계를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물 또는 그의 일부분은 샘플을 전기영동시켜 표적 분자에 접촉시켜, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 샘플 영역으로부터 이동하여 적어도 하나의 표적 분자와 접촉하게 할 수 있다. 전기영동 방법은 혼합물의 적어도 일부분을 표적 분자에 접촉시키고/거나 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 분리 매질을 통해 이동하게 할 수 있는 한 일반적으로 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 전기영동을 적용하는 방법은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자, 표적 분자, 또는 존재하는 경우 표적 분자에 테더링된 입자 또는 중합체의 분해를 일으키지 않을 것이다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 방향으로 분리 매질을 가로질러 제1 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제1 분리 처리는 제1 전압 프로토콜 및 제1 지속기간을 포함하는 것인 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제2 방향으로 분리 매질을 가로질러 제2 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제2 방향은 제1 방향에 실질적으로 수직이고, 여기서 제2 분리 처리는 제2 전압 프로토콜 및 제2 지속기간을 포함하는 것인 단계를 포함한다. 부가의 지속기간 동안, 및 임의로 부가의 방향으로 부가의 전압 프로토콜에 대한 부가의 분리 처리를 적용함으로써 분리 단계를 원하는 만큼 자주 반복할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 제1 분리 처리는 약 2 내지 약 40시간 포함, 약 3 내지 약 30시간 포함, 약 1 내지 50시간의 제1 지속기간 동안, 약 30 V 내지 약 140 V 포함, 약 50 V 내지 약 120 V 포함, 약 5 V 내지 약 150 V를 인가하는 제1 전압 프로토콜을 포함할 수 있다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 제2 분리 처리는 약 2 내지 약 40시간 포함, 약 3 내지 약 30시간 포함, 약 1 내지 50시간의 제2 지속기간 동안, 약 30 V 내지 약 140 V 포함, 약 50 V 내지 약 120 V 포함, 약 5 V 내지 약 150 V를 인가하는 제2 전압 프로토콜을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 처리 프로토콜 및 제2 처리 프로토콜은 각각 독립적으로 약 1 V/hr 내지 약 5 V/hr의 속도로 인가된 전압을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 처리 프로토콜 및 제2 처리 프로토콜은 각각 독립적으로 약 1 V/hr 내지 약 5 V/hr의 속도로 인가된 전압을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 상이한 전압 프로토콜이 상이한 길이의 분리 매질에 유용할 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 더 긴 길이는 더 짧은 분리 시간을 제공하기 위해 더 높은 전압을 필요로 한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 애노드와 캐소드 사이에 분리 매질을 배치하는 단계 및 분리 매질 또는 겔을 가로질러 약 1 V/cm 내지 약 35 V/cm 범위의 전압을 인가하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 분리 매질은 약 3 cm 내지 약 75 cm의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 처리 프로토콜 및 제2 처리 프로토콜은 펄스 전류를 인가하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 전압 프로토콜은 분리 매질을 3℃ 내지 약 10℃ 포함, 10℃ 내지 약 30℃ 포함, 30℃ 내지 약 40℃ 포함, 약 2℃ 내지 약 60℃의 온도로 가열, 냉각 또는 유지하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 방향에 실질적으로 수직인 제1 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 세그먼트화 방향에 실질적으로 수직인 제2 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 세그먼트화에 적용되는 "실질적으로 수직인 방향"이라는 어구는 분리 매질을 통한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 이동 방향으로부터 약 70° 내지 약 120°로 측정된 각도로 절단 또는 커팅하는 것을 의미한다. 용어 "세그먼트화"는 분리 매질이 여러 부분으로 나눠지는 한 일반적으로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 분리 매질이 겔인 경우, 세그먼트화는 겔을 세그먼트로 커팅하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 분리 매질이 겔인 경우, 상기 방법은 겔을 동결하는 단계 및 동결된 겔을 스칼펠, 면도칼 또는 레이저로 커팅함으로써 동결된 겔을 세그먼트화하는 단계를 포함할 수 있다. 부가적으로, 분리 매질이 액체인 경우, 세그먼트화는 분해된 액체 세그먼트를 형성하기 위해 피펫팅함으로써 분취액을 회수하는 것을 포함할 수 있다. 도 2를 참조하면, 상기 방법의 한 실시양태에서, 분리 매질의 하나 이상의 세그먼트 또는 분해된 세그먼트에 대한 이동 거리 (예를 들어, D1, D2)는 분리 매질의 하나 이상의 세그먼트가 분리 매질로부터 절단되거나 커팅되기 전, 동안 또는 후에 측정된다.
한 실시양태에서, 분리 매질을 세그먼트화하기 전, 동안 또는 후에, 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 PCR을 허용하도록 프로세싱될 수 있다. 이러한 단계는 PCR을 허용하도록 분리 매질을 변경하는 한 일반적으로 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 분리 매질이 액체인 경우, 이러한 단계는 상기 방법으로부터 생략될 수 있다. 한 실시양태에서, 분리 세그먼트로부터 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 분획을 제거하는 것은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 일부분이 세그먼트로부터 용매로 확산될 때까지 분리 매질의 단리된 세그먼트를 용매에 침지시키거나 습윤시키는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 OEM이 분리 매질 밖으로 통과할 수 있도록 하기 위해 세그먼트 또는 분해된 세그먼트를 물 또는 용매에 침지시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은, 분리 매질이 약 20℃ 내지 약 100℃의 융점을 갖는 경우에, 약 20℃ 내지 약 100℃의 버퍼 용액에서 세그먼트 또는 분해된 세그먼트를 가열하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 세그먼트 또는 분해된 세그먼트를 약 20℃ 내지 약 100℃로 가열하고, 겔을 용해시킬 수 있는 효소를 부가하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 분리 매질이 아가로스인 경우, 상기 방법은 β-아가라제 I (NEB; 미국 매사추세츠주 입스위치)를 포함한, 알파 및/또는 베타 아가라제를 포함한 아가라제 효소를 부가함으로써 PCR을 허용하도록 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱하는 단계를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 대해 PCR을 수행하여 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분의 카피를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 증폭시키기 위해 PCR을 사용하는 것의 이점은 관심 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 신호 대 잡음비를 개선하는 것을 포함할 수 있다. 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 증폭시키기 위해 PCR을 사용하는 것의 이점은 표적 분자와 비가역적으로 결합되었거나 또는 예상치 못한 반응으로 인해 분리 매질로부터 제거하기 어려운 코딩된 부분의 정체를 학습하는 것을 포함할 수 있다. PCR을 위한 절차는 관련 기술분야에 공지된 변형에 의해 필요에 따라 조정될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분을 시퀀싱하고/거나 더 가능성이 있는 경우 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분의 PCR 카피의 코딩 부분을 시퀀싱함으로써 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 서열, 구조 또는 예상 구조를 식별하거나 추론하는 단계를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 및 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 PCR 카피를 시퀀싱하는 절차는 현재 연구 개발 중인 차세대 DNA 시퀀싱, 대규모 병렬 또는 심층 시퀀싱을 적용하는 것을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 변형에 의해 필요에 따라 조정할 수 있는데, 이는 이들 방법을 사용하여 시간과 비용을 절약할 수 있기 때문이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 카피 서열의 특정 분획의 서열을 식별하여, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 분획의 각각의 코딩 영역 또는 코딩 영역의 조합을 식별하거나 또는 상호연관시켜 적어도 하나의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록을 식별하거나 또는 상호연관시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분 또는 그의 카피 서열을 시퀀싱함으로써 식별, 결정 또는 추론되며, 이는 코딩 부분 내의 올리고뉴클레오티드 서열을 코딩된 부분을 합성하는데 사용된 합성 단계의 서열과 상호연관시키는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 위치를 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 정체와 상호연관시킴으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 또는 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 정체는 측정된 이동 거리와 상호연관되거나, 매칭되거나, 또는 연관될 수 있다. 표적 분자에 대해 낮은 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 표적 분자에 대해 더 높은 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 비해 분리 매질을 통해 빠르게 이동할 것으로 생각되는데, 이는 더 높은 활성을 갖는 것이 반응 동안 진행이 느려지거나 방해를 받기 때문일 것이다. 추가로, 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 표적 분자와 상호작용하는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 kon 및 koff를 가질 것으로 생각되며, 여기서 kon은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 표적 분자와 반응하거나, 상호작용하거나 또는 회합하는 속도이고, koff는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 표적 분자로부터 해리 또는 분리되는 속도이다. 일반적으로, 친화도가 더 높은 OEM은 더 느리게 이동하고, 친화도가 더 느슨한 OEM은 더 빠르게 이동하는 것으로 관찰된다. 그러나, 표적 활성이 반드시 전기영동 이동에 영향을 미치는 요인은 아닐 것으로 이해된다. 예를 들어, 전기영동 속도는 분자 크기가 더 작고 순 음전하가 더 높은 분자를 기반으로 증가할 수 있다. 이러한 요인은 적절한 제어 분자를 도입함으로써 무효화할 수 있다. 다른 전기영동 인자로부터 표적 활성을 단리하는 또 다른 방법은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자당 2개 이상의 코딩된 부분을 도입하는 것일 수 있다. 예를 들어, 하나의 코딩된 부분을 갖는 OEM은 그의 이동이 하나의 체류 시간만큼 느려질 것으로 예상된다. 그러면 2 또는 3개의 코딩된 부분을 갖는 OEM이 하나의 코딩된 부분을 갖는 OEM보다 2배 또는 3배 더 큰 활동을 가지므로, 2 내지 3개의 코딩된 부분을 갖는 OEM의 이동이, 1.5 내지 3배만의 체류 시간을 갖는 OEM에 비해 느려질 것이다. 본원에 개시된 방법의 이점은 다중 코딩된 부분을 갖는 OEM의 사용이 표적 활성 데이터를 계산하기 위한 목적으로 다른 요인과 비교되는 요인으로서 표적 활동을 단리할 수 있다는 점이다. 이러한 방법의 이점은 신호 대 잡음비를 증강시키기 위해 다중 코딩된 부분을 갖는 OEM의 사용을 포함할 수 있어, 약간만 상이한 표적 활성을 가진 OEM이, OEM 당 다중 코딩된 부분을 도입하여 그의 체류 시간에 있어서의 차이를 확대하고 이에 따라 계산된 표적 반응성에서의 차이를 확대함으로써 그 표적 활성을 기준으로 하여 단리되거나 또는 분해될 수 있도록 하는 것이다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 샘플 영역으로부터 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 제1 이동 거리를 측정하는 단계, 및 이동된 거리를 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 식별과 상호연관시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 샘플 영역으로부터 제2 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 제2 이동 거리를 측정하는 단계, 및 이동된 제2 거리를 제2 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 식별과 상호연관시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 거리를 제2 거리로 나눔으로써 제2 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자와 비교하여 표적 분자에 대한 제1 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 상대적 또는 정성적 결합 친화도를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 화학식 (I)에 따른 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 하나 이상을 포함할 수 있다:
(I) G-L-B
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B는 적어도 2개의 빌딩 블록을 함유하는 코딩된 부분이고;
L은 G를 B에 작동적으로 연결하는 링커이고;
여기서 B에서의 각각의 빌딩 블록 또는 위치적 빌딩 블록은 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 위치에 따라 별도로 식별된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 하나 이상을 포함할 수 있다:
(II) [(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 또는 1이고;
P는 0 또는 1이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다. 한 실시양태에서, 화학식 II의 분자를 사용하는 방법의 이점은 2개의 코딩된 부분인 (B1)M 및 (B2)K를 디스플레이하는 OEM의 도입을 포함할 수 있으며, 이는 상기 논의된 바와 같이, 단일 코딩된 부분을 디스플레이하는 OEM에 비해 신호 대 잡음비를 증가시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 화학식 (III)에 따른 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자 하나 이상을 포함할 수 있다:
(III) [(B1)M-L1]O-G'-[(L2-(B2)K]P
여기서
G'는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, G'는 적어도 2개의 코딩 영역 및 적어도 하나의 헤어핀을 포함하는 것을 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 내지 5의 정수이고;
P는 0 내지 5의 정수이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1 내지 5의 정수이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G'의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다. 한 실시양태에서, 화학식 II의 분자를 사용하는 방법의 이점은 2 내지 10개의 코딩된 부분: (B1)M 및 (B2)K를 디스플레이하는 OEM의 도입을 포함할 수 있으며, 이는 상기 논의된 바와 같이, 단일 코딩된 부분을 디스플레이하는 OEM에 비해 신호 대 잡음비를 엄청나게 증가시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형성하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 분자에 대한 코딩된 부분의 친화도를 결정하기 위해 본원에 개시된 친화성 전기영동을 사용함으로써 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 친화성 전기영동은 표적 분자와 결합할 수 있는 능력, 표적 분자의 특정한 영역과 결합할 수 있는 능력, 공지된 화합물에 대한 경쟁적 또는 비-경쟁적 결합 능력, 다른 항-표적 분자와 결합하지 않는 능력, 표적 분자의 다른 밀접하게 관련된 클래스 또는 패밀리와 결합하지 않는 능력, 효소에 의한 화학적 변화에 대해 저항성이 되는 능력, 효소 패밀리에 의한 화학적 변화에 대해 저항성이 되는 능력, 효소 또는 효소 패밀리에 의해 쉽게 화학적으로 변화되는 능력, 수 용해도를 갖는 능력, 조직 투과성이 되는 능력, 및 세포 투과성이 되는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는 원하는 특성에 기반하여 분자를 분리할 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 (I)의 분자는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자이다. 한 실시양태에서, 화학식 (II) 및 (III)의 분자는 화학식 (I)의 분자의 아종이다. 한 실시양태에서, 화학식 (III)의 분자는 화학식 (II)의 분자의 아종이다. 화학식 (I)의 분자의 특정 실시양태에서, G는 코딩된 부분의 합성을 위해 지시되거나 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 화학식 (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, (B1)M 및 (B2)K는 각각 코딩된 부분을 나타낸다. 화학식 (I)의 분자의 특정 실시양태에서, 분자는 올리고뉴클레오티드 부분 및 적어도 하나의 코딩된 부분을 함유한다. G에서의 올리고뉴클레오티드의 많은 구조적 특징은 화학식 (I)의 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 합성을 지시하거나 코딩하는 관점뿐만 아니라 이러한 합성 프로세스가 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 구조에 부과하는 분자 구조적 관계 또는 상관관계의 관점에서 본원에 논의되는 것으로 이해된다. 화학식 (I) 또는 화학식 (II) 및/또는 (III) 각각의 분자의 G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드의 많은 구조적 특징은 화학식 (I)의 분자를 제조하는데 사용되는 합성 단계의 추론을 식별하거나, 상호연관시키거나 또는 용이하게 할 수 있는, G 또는 G', 또는 그의 PCR 카피에서의 올리고뉴클레오티드의 능력의 관점에서 논의되는 것으로 이해된다. 따라서, 코딩된 부분의 빌딩 블록의 서열 및/또는 구조와 올리고뉴클레오티드 부분의 코딩 영역의 서열 또는 서열 조합 사이에는 상관관계가 있는 것으로 이해된다. 화학식 (I) 및/또는 (II)에 대한 분자의 한 실시양태에서, G는 적어도 하나의 헤어핀을 포함하고, G'로서 표시될 수 있다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 또는 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하고, 여기서 코딩 영역의 약 50% 내지 100% 포함, 약 90% 내지 100% 포함, 1% 내지 100%가 단일 가닥이다. 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 코딩 영역을 함유하고, 여기서 말단 코딩 영역 중 1 또는 2개는 단일 가닥이다. 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 코딩 영역을 함유하고, 여기서 말단 코딩 영역 중 1 또는 2개는 이중 가닥이다.
본 개시내용에 사용된 바와 같은 용어 "헤어핀 구조"는 60% 내지 100%의 뉴클레오티드를 질량 퍼센트로서 함유하고, 올리고뉴클레오티드 G의 말단 코딩 영역과 혼성화하여 G'를 형성할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 헤어핀 구조의 특정 실시양태에서, 헤어핀 구조는 단일의 연속 중합체 쇄를 형성하고, 적어도 하나의 중첩 부분 (통상 "스템"으로 지칭됨)을 함유하며, 여기서 중첩 부분은 동일한 헤어핀 구조의 상보적 서열과 혼성화되는 뉴클레오티드의 서열을 함유한다. 헤어핀 구조의 특정 실시양태에서, 브릿지 구조는 2개의 별도의 올리고뉴클레오티드 가닥을 연결하고; 상기 브릿지 구조는 6 내지 12개의 PEG 유닛을 포함한 3 내지 15개의 PEG 유닛을 포함한 2 내지 20개의 PEG 유닛의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체로 구성될 수 있다. 헤어핀 구조의 특정 실시양태에서, 브릿지 구조는 30개 이하의 탄소의 알칸 쇄, 또는 20개 이하 유닛의 폴리글리신 쇄로 구성될 수 있거나, 또는 반응성 작용기를 보유하는 일부 다른 쇄로 구성될 수 있다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드는 3 내지 5개의 코딩 영역 포함, 3 내지 10개의 코딩 영역 포함, 2 내지 약 21개의 코딩 영역 포함, 적어도 2개의 코딩 영역을 함유한다. 특정 실시양태에서, 코딩 영역의 수가 2 미만이면, 코딩 영역의 조합이 불가능할 것이다. 특정 실시양태에서, 코딩 영역의 수가 20을 초과하면, 합성 비효율이 정확한 합성을 방해할 수 있다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 코딩 영역의 약 50% 내지 100%는 약 8 내지 약 30개의 뉴클레오티드 포함, 약 12 내지 약 40개의 뉴클레오티드 포함, 약 6 내지 약 50개의 뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 코딩 영역이 약 6개 미만의 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 코딩 영역은 코딩된 부분의 합성을 정확하게 지시할 수 없다. 특정 실시양태에서, 코딩 영역이 약 50개 초과의 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 코딩 영역은 교차 반응성이 될 수 있다. 이러한 교차 반응성은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 코딩된 부분을 합성하는데 사용되는 합성 단계를 정확하게 지시하고 식별할 수 있는 코딩 영역의 능력을 방해할 것이다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드의 목적은 상보적 안티-코딩 가닥과 선택적으로 혼성화함으로써 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 합성을 지시하는 것이다. 특정 실시양태에서, 코딩 영역은 상보적 가닥과의 혼성화를 촉진하기 위해 단일 가닥이다. 특정 실시양태에서, 코딩 영역의 80% 내지 95% 포함, 80% 내지 99% 포함, 70% 내지 100%는 단일 가닥이다. 코딩 영역에 대한 상보적 가닥이 존재한다면, 이는 합성 동안 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 코딩된 부분을 코딩하는 단계 후에 부가될 수 있는 것으로 이해된다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 자연 및 비자연 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 적합한 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T)을 포함한, DNA (데옥시리보핵산)의 자연 뉴클레오티드, 및 아데닌 (A), 우라실 (U), 구아닌 (G) 및 시토신 (C)을 포함한, RNA (리보핵산)의 자연 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 적합한 염기는 자연 염기, 예컨대 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 데옥시시티딘, 이노신, 디아미노 퓨린; 염기 유사체, 예컨대 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, C5-프로피닐시티딘, C5-프로피닐우리딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 4-((3-(2-(2-(3-아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프로필)아미노)피리미딘-2(1H)-온, 4-아미노-5-(헵타-1,5-디인-1-일)피리미딘-2(1H)-온, 6-메틸-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온, 3H-벤조[b]피리미도[4,5-e][1,4]옥사진-2(10H)-온, 및 2-티오시티딘; 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 2'-O-메틸화된 염기 및 2'-플루오로 염기를 포함한 2'-치환된 뉴클레오티드; 및 변형된 당, 예컨대 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스; 및/또는 변형된 포스페이트 기, 예컨대 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 중합체인 것으로 이해된다. 용어 "중합체" 및 "올리고머"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인접 염기를 함유할 필요가 없다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 링커 모이어티 또는 비-뉴클레오티드 분자와 산재될 수 있다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G에서의 올리고뉴클레오티드는 약 80% 내지 95% 포함, 약 80% 내지 99% 포함, 약 60% 내지 100%의 DNA 뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 80% 내지 95% 포함, 약 80% 내지 99% 포함, 약 60% 내지 100% RNA 뉴클레오티드를 함유한다.
화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하며, 여기서 코딩 영역 중 적어도 2개는 공존하도록 중첩되고, 단 중첩되는 코딩 영역은 약 10% 내지 2% 포함, 약 20% 내지 1% 포함, 약 30% 내지 1%의 동일한 뉴클레오티드만을 공유한다. 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드는 약 80% 내지 100% 포함, 약 60% 내지 100% 포함, 약 40% 내지 100% 단일 가닥이다. 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하며, 여기서 코딩 영역 중 적어도 2개는 인접한다. 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하며, 여기서 적어도 2개의 코딩 영역은 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 분자의 코딩된 부분의 합성을 지시 또는 기록하지 않는 뉴클레오티드 영역에 의해 분리된다.
존재하는 경우, 용어 "비-코딩 영역"은 화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자의 코딩된 부분의 합성을 지시하기 위해 뉴클레오티드의 상보적 가닥과 혼성화할 수 없거나, 또는 합성 동안 화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자를 분류하는데 사용되는 임의의 안티-코딩 올리고뉴클레오티드에 상응하지 않는 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역은 임의적이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2 내지 약 4개의 비-코딩 영역 포함, 2 내지 약 9개의 비-코딩 영역 포함, 1 내지 약 20개의 비-코딩 영역을 함유한다. 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역은 약 8 내지 약 30개의 뉴클레오티드 포함, 약 12 내지 약 40개의 뉴클레오티드 포함, 약 4 내지 약 50개의 뉴클레오티드를 함유한다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역의 한 가지 목적은 코딩 영역을 분리하여 교차-혼성화를 피하거나 감소시키는 것인데, 이는 교차-혼성화가 화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자의 코딩된 부분의 정확한 코딩을 방해할 것이기 때문이다. 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역의 한 가지 목적은 화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자에 단지 혼성화 또는 코딩 이외의 기능성을 부가하는 것이다. 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역 중 하나 이상은 표지, 예컨대 형광 표지 또는 방사성 표지로 변형되는 올리고뉴클레오티드의 영역일 수 있다. 이러한 표지는 화학식 (I), (II), 및 (III)에 대한 분자의 시각화 또는 정량화를 용이하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역 중 하나 이상은 프로세싱을 용이하게 하는 작용기 또는 테더로 변형된다. 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역 중 하나 이상은 이중 가닥이며, 이는 교차-혼성화를 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 비-코딩 영역은 임의적인 것으로 이해된다. 특정 실시양태에서, 적합한 비-코딩 영역은 올리고뉴클레오티드의 PCR 증폭을 방해하지 않는다.
특정 실시양태에서, 코딩 영역 중 하나 이상은 표지, 예컨대 형광 표지 또는 방사성 표지로 변형되는 G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드의 영역일 수 있다. 이러한 표지는 화학식 (I), (II) 및 (III)에 대한 분자의 시각화 또는 정량화를 용이하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 코딩 영역 중 하나 이상은 프로세싱을 용이하게 하는 작용기 또는 테더로 변형된다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G 또는 G'는 화학식 (CN-(ZN-CN+1)A) 또는 (ZN-(CN-ZN+1)A)으로서 나타낸 서열을 포함하며, 여기서 C는 코딩 영역이고, Z는 비-코딩 영역이고, N은 1 내지 20의 정수이고, A는 1 내지 20의 정수이고; 여기서 각각의 비-코딩 영역은 0 내지 50개의 뉴클레오티드를 함유하고 임의로 이중 가닥이다. 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 코딩 영역의 각각 또는 대부분은 6 내지 50개의 뉴클레오티드를 함유한다. 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 코딩 영역의 각각 또는 대부분은 8 내지 30개의 뉴클레오티드를 함유한다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 위치 M에서의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2의 약 20% 내지 100% 포함, 약 30% 내지 100% 포함, 약 50% 내지 100% 포함, 약 70% 내지 100% 포함, 약 90% 내지 100% 포함, 약 10% 내지 100%는 2, 3, 4, 또는 5개의 코딩 영역의 조합과 상관이 있다. 역으로, 화학식 (I), (II) 및 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 위치 M에서의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2의 0 내지 약 10% 포함, 0 내지 약 20% 포함, 0 내지 약 30% 포함, 0 내지 약 50% 포함, 0 내지 약 70% 포함, 0 내지 약 90%는 단일 코딩 영역과 상관이 있거나 또는 그 영역에 의해 식별된다.
화학식 (I), (II) 및 (III)에 대한 분자의 특정 실시양태에서, B는 위치적 빌딩 블록을 나타낸다. 본 개시내용에서 사용된 바와 같은 어구 "빌딩 블록" 또는 "위치적 빌딩 블록"은 더 큰 분자의 분자 구조를 형성하는 서브유닛으로서 함께 결합된 일련의 개별 빌딩 블록 유닛 중 하나의 유닛을 의미한다. 특정 실시양태에서, (B1)M 및 (B2)K는 각각 독립적으로, 함께 결합되어 각각 M 및 K개의 유닛을 갖는 중합체 쇄를 형성하는 일련의 개별 빌딩 블록 유닛을 나타낸다. 예를 들어, M이 10인 경우, (B)10은 빌딩 블록 유닛의 쇄를 나타낸다: B10-B9-B8-B7-B6-B5-B4-B3-B2-B1. 예를 들어, M이 3이고 K가 2인 경우, 화학식 (I)은 하기 화학식으로서 정확하게 나타낼 수 있다:
[((B1)3-(B1)2-(B1)1-L1]O-G-[(L2-(B2)1-(B2)2]P.
M 및 K는 각각 독립적으로, B의 각각의 개별 유닛에 대한 위치적 식별자 역할을 하고, B1 또는 B2의 "1" 또는 "2"는 단지 어떤 쇄가 참조되고 있는지 구별하는 역할을 하는 것으로 이해된다.
본 개시내용에서 용어 "빌딩 블록"의 정확한 정의는 그의 문맥에 의존한다. "빌딩 블록"은 다른 화학 구조 유닛에 화학적으로 연결될 수 있는 화학 구조 유닛이다. 특정 실시양태에서, 빌딩 블록은 빌딩 블록을 다른 화학 구조 유닛에 연결하는 화학 반응을 겪도록 하는 1, 2개 또는 그 초과의 반응성 화학적 기를 갖는다. 빌딩 블록이 화학적 연결을 형성하는 반응을 겪을 때 빌딩 블록의 반응성 화학적 기의 일부 또는 전부가 손실될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 용액 중의 빌딩 블록은 2개의 반응성 화학적 기를 가질 수 있다. 이러한 예에서, 용액 중의 빌딩 블록은 빌딩 블록의 쇄의 일부인 빌딩 블록의 반응성 화학적 기와 반응하여 쇄의 길이를 증가시키거나 또는 쇄로부터 분지를 연장시킬 수 있다. 빌딩 블록이 용액의 맥락에서 또는 반응물로서 언급될 때, 빌딩 블록은 적어도 하나의 반응성 화학적 기를 함유하는 것으로 이해되지만 2개 이상의 반응성 화학적 기를 함유할 수 있다. 빌딩 블록이 빌딩 블록 자체보다 더 큰 중합체, 올리고머 또는 분자의 맥락에서 언급될 때, 하나 이상의 화학적 반응성 기가 반응했을지라도, 빌딩 블록은 빌딩 블록의 구조를 더 큰 분자의 (단량체성) 유닛으로서 갖는 것으로 이해될 것이다.
하나의 빌딩 블록이 또 다른 빌딩 블록과 함께 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 한, 빌딩 블록으로서 사용될 수 있는 분자 또는 화합물의 유형은 일반적으로 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 빌딩 블록은 말단 유닛으로서 작용하는 하나의 화학 반응성 기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 빌딩 블록은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 적합한 반응성 화학적 기를 갖는다. 특정 실시양태에서, B의 위치적 빌딩 블록은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 적합한 반응성 화학적 기를 갖는다. 빌딩 블록에 적합한 반응성 화학적 기는 1급 아민, 2급 아민, 카르복실산, 티오산, 1급 알콜, 2급 알콜, 에스테르, 티올, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 클로로포르메이트, 술포닐 클로라이드, 술포닐 플루오라이드, 티오노카르보네이트, 헤테로아릴 할라이드, 알데히드, 케톤, 할로아세테이트, 아릴 할라이드, 아지드, 할라이드, 트리플레이트, 디엔, 친디엔체, 보론산, 보론산 에스테르, 알파-베타 불포화 케톤, 시아노-아크릴아미드, 말레이미드, 알킨 및 알켄을 포함한다.
임의의 커플링 화학을 사용하여 빌딩 블록을 연결할 수 있으며, 단 커플링 화학은 올리고뉴클레오티드의 존재와 양립할 수 있어야 한다. 예시적인 커플링 화학은 아민, 예컨대 DNA-연결된 아민과 Fmoc-보호된 아미노산 또는 다른 다양하게 치환된 카르복실산의 반응에 의해 아미드를 형성하는 것; DNA-연결된 아민을 포함함 아민과 이소시아네이트 및 또 다른 아민의 반응에 의해 우레아를 형성하는 것 (우레아화); DNA-연결된 아민을 포함한 아민과 클로로포르메이트 및 알콜의 반응에 의해 카르바메이트를 형성하는 것 (카르바모일화); DNA-연결된 아민을 포함한 아민과 술포닐 클로라이드의 반응에 의해 술폰아미드를 형성하는 것; DNA-연결된 아민을 포함한 아민과 티오노카르보네이트 및 또 다른 아민의 반응에 의해 티오우레아를 형성하는 것 (티오우레아화); DNA-연결된 아민을 포함한 아민과 헤테로아릴 할라이드의 반응에 의해 아닐린을 형성하는 것 (SNAr); DNA-연결된 아민을 포함한 아민과 알데히드을 반응시킨 후 환원에 의해 2급 아민을 형성하는 것 (환원성 아민화); DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 클로로아세테이트로로 아실화시킨 후 클로라이드를 또 다른 아민으로 변위시켜 펩토이드를 형성하는 것 (SN2 반응); DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 아릴 할라이드로 치환된 카르복실산으로 아실화시킨 후, 할라이드를 치환된 알킨에 의해 변위시킴으로써 알킨 함유 화합물을 형성하는 것 [소노가시라 반응]; DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 아릴 할라이드로 치환된 카르복실산으로 아실화한 후, 치환된 보론산에 의해 할라이드를 변위시켜 비아릴 화합물을 형성하는 것 (스즈키 반응); DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 염화시아누르와 반응시킨 후 또 다른 아민, 페놀 또는 티올과 반응시켜 치환된 트리아진을 형성하는 것 (시아누릴화, 방향족 치환); DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 할라이드 또는 트리플레이트와 같은 적합한 이탈기로 치환된 카르복실산으로 아실화한 후 이탈기를 또 다른 아민으로 변위시켜 2급 아민을 형성하는 것 (SN2/SN1 반응); 및 아민을 알켄 또는 알킨을 보유하는 화합물로 치환하는 것 및 그 산물을 아지드 또는 알켄과 반응시켜 시클릭 화합물을 형성하는 것 [딜스-알더 및 휘스겐 반응]을 포함한다. 상기 반응의 특정 실시양태에서, 1급 아민, 2급 아민을 포함한 아민 기, 카르복실산, 1급 알콜, 에스테르, 티올, 이소시아네이트, 클로로포르메이트, 술포닐 클로라이드, 티오노카르보네이트, 헤테로아릴 할라이드, 알데히드, 클로로아세테이트, 아릴 할라이드, 알켄, 할라이드, 보론산, 알킨 및 알켄과 반응하는 분자는 약 30 내지 약 500 달톤의 분자량을 갖는다.
커플링 반응의 특정 실시양태에서, 제1 빌딩 블록은 아민, 티올, 할라이드, 보론산, 알킨 또는 알켄과 같은 2급 반응성 기를 보유하는 분자를 사용한 상기 화학 중 임의의 것을 사용하여, DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 치환함으로써 부가될 수 있다. 그런 다음 2급 반응성 기는 적절한 반응성 기를 보유하는 빌딩 블록과 반응될 수 있다. 예시적인 2급 반응성 기 커플링 화학은 DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 Fmoc-아미노산으로 아실화한 후, 보호기를 제거하고 알데히드 및 수소화붕소로 새롭게 탈보호된 아민을 환원성 아민화시키는 것; DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 알데히드 또는 케톤 및 수소화붕소로 환원성 아민화시킨 후 현재 치환된 아민을 염화시아누르와 반응시킨 후 트리아진으로부터의 또 다른 클로라이드를 티올, 페놀, 또는 또 다른 아민으로 변위시키는 것; DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 헤테로아릴 할라이드에 의해 치환된 카르복실산으로 아실화한 후 또 다른 아민 또는 티올과 SNAr 반응시켜 할라이드를 변위시키고 아닐린 또는 티오에테르를 형성하는 것; 및 DNA-연결된 아민을 포함한 아민을 할로방향족 기에 의해 치환된 카르복실산으로 아실화한 후 소노가시라 반응에서 할라이드를 알킨에 의해 치환하는 것; 또는 보론산 에스테르-매개된 스즈키 반응에서 아릴기에 의해 할라이드를 치환하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 커플링 화학은 관련 기술분야에 공지된 적합한 결합 형성 반응을 기반으로 한다. 예를 들어, 문헌 [March, Advanced Organic Chemistry, fourth edition, New York: John Wiley and Sons (1992), Chapters 10 to 16; Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, Part B, Plenum (1990), Chapters 1-11; 및 Coltman et al., Principles and Applications of Organotransition Metal Chemistry, University Science Books, Mill Valley, Calif. (1987), Chapters 13 to 20] (이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 빌딩 블록은 빌딩 블록을 부착하기 위해 이용되는 반응성 기 또는 기들에 더하여 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 이들 부가의 작용기 중 하나 이상은 이들 작용기의 바람직하지 않은 반응을 방지하기 위해 보호될 수 있다. 적합한 보호기는 다양한 작용기에 대해 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, second edition, New York: John Wiley and Sons (1991); 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨). 특히 유용한 보호기는 t-부틸 에스테르 및 에테르, 아세탈, 트리틸 에테르 및 아민, 아세틸 에스테르, 트리메틸실릴 에테르, 트리클로로에틸 에테르 및 에스테르 및 카르바메이트를 포함한다.
빌딩 블록의 유형은 빌딩 블록이 다른 빌딩 블록과 공유 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 반응성 기와 상용성인 한, 일반적으로 제한되지는 않는다. 적합한 빌딩 블록은 펩티드, 사카라이드, 당지질, 지질, 프로테오글리칸, 당펩티드, 술폰아미드, 핵단백질, 우레아, 카르바메이트, 비닐계 폴리펩티드, 아미드, 비닐계 술폰아미드 펩티드, 에스테르, 사카라이드, 카르보네이트, 펩티딜포스포네이트, 아자티드, 펩토이드 (올리고 N-치환된 글리신), 에테르, 에톡시포름아세탈 올리고머, 티오에테르, 에틸렌, 에틸렌 글리콜, 디술피드, 아릴렌 술피드, 뉴클레오티드, 모르폴리노, 이민, 피롤리논, 에틸렌이민, 아세테이트, 스티렌, 아세틸렌, 비닐, 인지질, 실록산, 이소시아니드, 이소시아네이트 및 메타크릴레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 화학식 (I)의 (B1)M 또는 (B2)K는 각각 독립적으로 M 또는 K 유닛을 갖는 이들 빌딩 블록의 중합체를 나타내며, 이는 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 폴리당지질, 폴리지질, 폴리프로테오글리칸, 폴리글리코펩티드, 폴리술폰아미드, 폴리핵단백질, 폴리우레아, 폴리카르바메이트, 폴리비닐계 폴리펩티드, 폴리아미드, 폴리비닐계 술폰아미드 펩티드, 폴리에스테르, 폴리사카라이드, 폴리카르보네이트, 폴리펩티딜포스포네이트, 폴리아자티드, 폴리펩토이드 (올리고 N-치환된 글리신), 폴리에테르, 폴리톡시포름아세탈 올리고머, 폴리티오에테르, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리디술피드, 폴리아릴렌 술피드, 폴리뉴클레오티드, 폴리모르폴리노, 폴리이민, 폴리피롤리논, 폴리에틸렌이민, 폴리아세테이트, 폴리스티렌, 폴리아세틸렌, 폴리비닐, 폴리인지질, 폴리실록산, 폴리이소시아니드, 폴리이소시아네이트 및 폴리메타크릴레이트를 포함한다. 화학식 (I)에 대한 분자의 특정 실시양태에서, 약 60% 내지 약 95% 포함, 및 약 70% 내지 약 90% 포함, 약 50% 내지 약 100%의 빌딩 블록은 약 50 내지 약 200 달톤 포함, 약 40 내지 약 350 달톤 포함, 약 30 내지 약 500 달톤의 분자량을 갖는다.
2개의 반응성 기를 갖는 빌딩 블록은 각각의 빌딩 블록을 유닛으로서 함유하는, 선형 올리고머성 또는 중합체성 구조, 또는 선형 비-중합체성 분자를 형성하는 것으로 이해된다. 3개 이상의 반응성 기를 갖는 빌딩 블록은 3개 이상의 반응성 기를 갖는 각각의 빌딩 블록에서 분지를 갖는 분자를 형성할 수 있는 것으로 또한 이해된다.
화학식 (I), (II) 또는 (III)에 대한 분자의 특정 실시양태에서, L, L1, 및 L2는 각각 독립적으로 링커를 나타낸다. 용어 "링커 분자"는 반응하여 링커를 형성할 수 있는 2개 이상의 반응성 기를 갖는 분자를 지칭한다. 용어 "링커"는 G 또는 G'의 헤어핀 구조를 빌딩 블록에 작동적으로 연결하거나 이와 공유적으로 결합하는 분자의 일부분을 지칭한다. 용어 "작동적으로 연결된"은 PCR 증폭을 포함하여, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 겪을 것으로 예상되는 다양한 조작 전반에 걸쳐 부착된 상태를 유지하는 방식으로 2개 이상의 화학 구조가 함께 부착되거나 공유 결합되는 것을 의미한다.
화학식 (II) 또는 (III)에 대한 분자의 특정 실시양태에서, L1은 B1을 G 또는 G'에 각각 작동적으로 연결하는 링커이다. 화학식 (II) 또는 (III)에 대한 분자의 특정 실시양태에서, L2는 B2를 G 또는 G'에 각각 작동적으로 연결하는 링커이다. 특정 실시양태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로, 특별한 순서 없이, L1의 반응성 작용기 중 하나를 B1의 반응성 기에 반응시키고 L1의 다른 반응성 작용기를 G의 반응성 작용기 또는 G'의 헤어핀에 반응시키거나, 또는 특별한 순서 없이, L2의 반응성 작용기 중 하나를 B2의 반응성 기에 반응시키고 L2의 다른 반응성 작용기를 G의 반응성 작용기 또는 G'의 헤어핀에 반응시킴으로써 B1을 G 또는 G'에 연결하는 이작용성 분자이다. G'의 헤어핀에 대한 분자의 특정 실시양태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로, B1 및 G 또는 B2 및 G의 화학 반응성 기를 PEG (예를 들어, 아지도-PEG-NHS, 또는 아지도-PEG-아민, 또는 디-아지도-PEG), 또는 알칸 산 쇄 모이어티 (예를 들어, 5-아지도펜탄산, (S)-2-(아지도메틸)-1-Boc-피롤리딘, 4-아지도아닐린, 또는 4-아지도-부탄-1-오산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 포함한 상업적으로 입수가능한 링커; 티올 반응성 링커, 예컨대 PEG인 것 (예를 들어, SM(PEG)n NHS-PEG-말레이미드), 알칸 쇄인 것 (예를 들어, 3-(피리딘-2-일디술파닐)-프로피온산-Osu 또는 술포숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트)); 및 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 아미다이트, 예컨대 아미노 변형제 (예를 들어, 6-(트리플루오로아세틸아미노)-헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미다이트), 티올 변형제 (예를 들어, 5-트리틸-6-메르캅토헥실)-1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미디트, 또는 화학적으로 공반응성인 쌍 변형제 (예를 들어, 6-헥신-1-일-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미다이트, 3-디메톡시트리틸옥시-2-(3-(3-프로파르길옥시프로판아미도)프로판아미도)프로필-1-O-숙시노일, 장쇄 알킬아미노 CPG, 또는 4-아지도-부탄-1-오산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)); 및 그의 상용성 조합과 반응시킴으로써 형성된 링커이다.
화학식 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, G'의 헤어핀은 H1 또는 H2로서 표시될 수 있으며, 여기서 각각의 헤어핀은 독립적으로 약 45 내지 약 80개의 뉴클레오티드 포함, 약 32 내지 약 80개의 뉴클레오티드 포함, 약 20 내지 약 90개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, H1 및 H2는 각각 독립적으로, 링커 분자와의 반응을 촉진시키거나, 또는 임의로 예컨대 5'-디메톡시트리틸-5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (5-에티닐-dU-CE 포스포르아미다이트로 지칭되기도 함; 글렌 리서치 (Glen Research; 미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨)이지만, 이에 제한되지는 않는 염기를 사용하여 H1 및 H2가 각각 독립적으로 합성된 경우를 포함한 빌딩 블록과의 반응을 촉진시키기 위한 적합한 작용기로 변형된, 2 내지 3개 포함, 2 내지 4개 포함, 1 내지 5개 포함, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드를 함유한다. 특정 실시양태에서, H1 및 H2는 각각 독립적으로, 링커 분자와의 반응을 촉진시키거나, 또는 임의로 3-디메톡시트리틸옥시-2-(3-(5-헥신아미도)프로판아미도)프로필-1-O-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (알킨-변형제 세리놀 포스포르아미다이트로 지칭되기도 함; 글렌 리서치 (미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨), 및 무염기성-알킨 CEP (IBA GmbH (독일 궤팅겐)으로부터 구입됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 빌딩 블록과의 반응을 촉진시키기 위한 적합한 작용기를 갖는 비-뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, H1 및 H2는 각각 독립적으로, 이미 링커를 보유하는 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하며, 예를 들어 H1 및 H2는 각각 독립적으로, 하기와 같지만 그에 제한되지는 않는 염기를 사용하여 합성될 수 있다: 5'-디메톡시트리틸-N6-벤조일-N8-[6-(트리플루오로아세틸아미노)-헥스-1-일]-8-아미노-2'-데옥시아데노신-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (아미노-변형제 C6 dA로서 지칭되기도 함, 글렌 리서치 (미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨), 5'-디메톡시트리틸-N2-[6-(트리플루오로아세틸아미노)-헥스-1-일]-2'-데옥시구아노신-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (아미노-변형제 C6 dG로서 지칭되기도 함, 글렌 리서치 (미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨), 5'-디메톡시트리틸-5-[3-메틸-아크릴레이트]-2'-데옥시우리딘, 3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (카르복시 dT로서 지칭되기도 함, 글렌 리서치 (미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨), 5'-디메톡시트리틸-5-[N-((9-플루오레닐메톡시카르보닐)-아미노헥실)-3-아크릴이미도]-2'-데옥시우리딘, 3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (Fmoc-아미노 변형제 C6 dT로서 지칭되기도 함, 글렌 리서치 (미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨), 5'-디메톡시트리틸-5-(옥타-1,7-디이닐)-2'-데옥시우리딘, 3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (C8 알킨 dT로서 지칭되기도 함, 글렌 리서치 (미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨), 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-5-[N-(6-(3-벤조일티오프로파노일)-아미노헥실)-3-아크릴아미도]-2'데옥시우리딘, 3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (S-Bz-티올-변형제 C6-dT로서 지칭되기도 함, 글렌 리서치 (미국 버지니아주 스털링)로부터 구입됨), 및 5-카르복시 dC CEP (IBA GmbH (독일 궤팅겐)으로부터 구입됨), N4-트리G1-아미노 2'데옥시시티딘 (IBA GmbH (독일 궤팅겐)으로부터 구입됨). H1 및 H2에서 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드에 적합한 작용기는 1급 아민, 2급 아민, 카르복실산, 1급 알콜, 에스테르, 티올, 이소시아네이트, 클로로포르메이트, 술포닐 클로라이드, 티오노카르보네이트, 헤테로아릴 할라이드, 알데히드, 클로로아세테이트, 아릴 할라이드, 할라이드, 보론산, 알킨, 아지드 및 알켄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 헤어핀 구조 H1 및 H2 중 하나 이상은 표지, 예컨대 형광 표지 또는 방사성 표지로 변형될 수 있다. 이러한 표지는 화학식 (III)에 대한 분자의 시각화 또는 정량화를 용이하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 헤어핀 구조 H1 및 H2 중 하나 이상은 프로세싱을 용이하게 하는 작용기 또는 테더로 변형된다.
화학식 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, H1 및 H2의 헤어핀 구조의 이점은 하나 또는 둘 다가 화학식 (III)의 분자의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 다중 코딩된 부분의 폴리디스플레이를 허용할 수 있다는 것이다. 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 한쪽 또는 양쪽 말단에서의 다중 코딩된 부분의 폴리디스플레이는 특정 조건 하에 개선된 선택 특징을 제공하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 코딩된 화합물의 다가 디스플레이는 결합력 효과를 통해 겉보기 친화도를 증가시킬 수 있다.
화학식 (II) 또는 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 위치 M에서의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2의 약 20% 내지 100% 포함, 약 30% 내지 100% 포함, 약 50% 내지 100% 포함, 약 70% 내지 100% 포함, 약 90% 내지 100% 포함, 약 10% 내지 100%는 2, 3, 4, 또는 5개의 코딩 영역의 조합과 상관이 있다. 역으로, 화학식 (II) 또는 (III)의 분자의 특정 실시양태에서, 위치 M에서의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2의 0 내지 약 10% 포함, 0 내지 약 20% 포함, 0 내지 약 30% 포함, 0 내지 약 50% 포함, 0 내지 약 70% 포함, 0 내지 약 90%는 단일 코딩 영역과 상관이 있거나 또는 이 영역에 의해 식별된다.
본 개시내용은 화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자를 포함한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 합성하는 방법에 관한 것이다. 화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자를 합성하는 방법의 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 일련의 "분류 및 반응" 단계를 사용하며, 여기서 코딩 영역의 상이한 조합을 함유하는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 하나 이상의 코딩 영역과 혼성화 어레이 상에 고정화된 안티-코딩 올리고머와의 선택적 혼성화에 의해 서브-풀로 분류된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 서브-풀로 분류하는 것의 이점은 이러한 분리가, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 서브-풀이 추가의 화학 프로세싱을 위해 조합되거나 혼합되기 전에 별도의 반응 조건 하에 각각의 서브-풀이 B1 및/또는 B2를 포함한 위치적 빌딩 블록 B와 반응하도록 허용한다는 것이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 분류 및 반응 프로세스는 일련의 위치적 빌딩 블록을 부가하기 위해 반복될 수 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 분류 및 반응 방법을 사용하여 빌딩 블록을 부가하는 것의 이점은 분자의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록의 정체가, 빌딩 블록을 부가하기 전에 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 선택적으로 분리하거나 분류하는데 사용된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 코딩 영역(들)과 상관이 있을 수 있다는 것이다.
특정 실시양태에서, 단일 분류 단계를 사용하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 서브-풀로 분리하고, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 빌딩 블록과 반응시킨 다음, 재혼합함으로써 하나 이상의 빌딩 블록을 부가할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 합성 동안 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분류하는데 사용되는 하나의 코딩 영역은 그의 위치에 따라 빌딩 블록을 고유하게 식별하거나 이와 상호연관될 것인데, 이는 사용된 코딩 영역의 정체가 부가된 위치적 빌딩 블록의 정체를 포함할 것인, 빌딩 블록을 부가하는데 사용되는 반응의 정체와 상호연관될 수 있기 때문이다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 빌딩 블록은 2, 3, 4, 또는 5개의 분류 단계, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 빌딩 블록과 반응시킨 다음, 재혼합함으로써 부가될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 합성 동안 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분류하는데 사용되는 코딩 영역의 조합 또는 시리즈는 그의 위치에 따라 빌딩 블록을 고유하게 식별하거나 이와 상호연관될 것인데, 이는 사용된 코딩 영역의 조합 또는 시리즈가 부가된 위치적 빌딩 블록의 정체 또는 구조를 포함할 것인, 빌딩 블록을 부가하는데 사용된 반응의 정체와 상호연관될 수 있기 때문이다.
특정 실시양태에서, 합성 방법은 원하는 대로 단일 분류 단계 (단항식 표현) 또는 일련의 분류 단계 (다항식 표현)로부터 독립적으로 전환될 수 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 위치 M에서의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2의 약 20% 내지 100% 포함, 약 30% 내지 100% 포함, 약 50% 내지 100% 포함, 약 70% 내지 100% 포함, 약 90% 내지 100% 포함, 약 10% 내지 100%는 일련의 2, 3, 4, 또는 5개의 분류 단계에 의해 부가된다. 부가된 위치적 빌딩 블록의 양이 일련의 분류 단계를 사용하여 10% 미만인 경우에는, 비용 절감 및 보다 효율적인 합성의 이점을 인식할 수 없을 것이다.
화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자는 풀 내의 분자 사이에 또는 분자 중에 동일한 하나 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있는 것으로 이해되지만, 풀 내의 분자의 전부는 아닐지라도 대다수는 코딩 영역의 다른 조합을 가질 것이라는 것도 이해된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 코딩 영역의 상이한 조합을 갖는 분자 풀의 이점은, 이러한 상이한 조합이 다수의 상이한 코딩된 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 코딩할 수 있다는 것이다.
특정 실시양태에서, 합성 방법은 적어도 하나의 혼성화 어레이를 제공하는 것을 포함한다. 혼성화 어레이를 제공하는 단계는 일반적으로 제한되지는 않으며, 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 혼성화 어레이를 제조하거나 또는 혼성화 어레이를 상업적으로 구매하는 것을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 혼성화 어레이는 표면 상에 고정화된 안티-코돈 올리고머를 갖는 적어도 2개의 별도의 영역의 기질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 혼성화 어레이의 각각의 영역은 상이한 고정화된 안티-코돈 올리고머를 함유하며, 여기서 안티-코돈 올리고머는 화학식 (II) 및 (III)을 포함하여, 화학식 (I)의 분자의 하나 이상의 코딩 영역과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 혼성화 어레이는 2개 이상의 챔버를 사용한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 혼성화 어레이의 챔버는 입자의 표면 상에 고정화된 안티-코돈 올리고머를 갖는 입자, 예컨대 비드를 함유한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 어레이 상에 화학식 (II) 및 (III)를 포함하여, 화학식 (I)의 분자를 고정화하는 것의 이점은 이러한 단계가 상기 분자를 하나 이상의 코딩 영역의 특정한 올리고뉴클레오티드 서열에 기반하여 분자의 서브-풀로 분류하거나 또는 선택적으로 분리할 수 있게 한다는 것이다. 특정 실시양태에서, 분자의 분리된 서브-풀은 이후에 추가 혼성화 단계 또는 화학 반응 프로세싱을 위해 어레이로부터 반응 챔버 내로 별도로 방출되거나 제거될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방출 단계는 임의적이고 일반적으로 제한되지는 않으며, 가열에 의해 분자를 탈혼성화하거나, 변성제를 사용하거나, 또는 분자를 pH ≥ 12의 버퍼에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상이한 고정화된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 어레이의 챔버 또는 영역은 각각의 챔버 또는 영역의 내용물이 추가 화학적 프로세싱을 위해 웰의 어레이로 흐르도록 위치될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 B1 및/또는 B2를 포함한 적어도 하나의 빌딩 블록 B를 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자와 반응시켜 화학식 (II) 및 (III)의 분자의 서브-풀을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 B1 및/또는 B2는 화학식 (II) 및 (III)에 대해 상기 정의된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 빌딩 블록 B1 및/또는 B2는 화학식 (II) 및 (III)의 분자 이전, 도중 또는 이후에 용기에 부가될 수 있다. 빌딩 블록 B1 및/또는 B2를 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자와 반응 및 공유 부착하여 화학식 (II) 및 (III)의 분자를 형성하기 위해 사용되는 화학에 따라, 용기는 산성, 염기성 또는 중성 조건에서 용매 및 공반응물을 함유할 수 있는 것으로 이해된다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 증폭 단계는 각각 화학식 (I), (II) 및 (III)의 G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드의 카피 서열을 생성하기 위해 관련 기술분야에 공지된 PCR 기술을 사용하는 것을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 카피 서열은 화학식 (I), (II), 및 (III)의 적어도 2개의 코딩 영역의 카피를 함유한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 프로브 분자로부터 G 또는 G'에서의 올리고뉴클레오티드를 증폭시키는 것의 한 가지 이점은 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 표적 분자로부터 쉽게 제거될 수 없더라도, 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 어느 코딩된 부분이 표적 분자와 결합할 수 있는지를 검출할 수 있는 능력을 포함한다. 특정 실시양태에서, 증폭의 이점은 광범위한 다양성을 갖는 분자 라이브러리를 생성할 수 있다는 것이다. 이러한 광범위한 다양성은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 임의의 주어진 분자의 적은 수의 비용으로 발생한다. PCR에 의한 증폭은 쉽게 검출할 수 있는 수에 도달할 때까지 그 수를 증가시킴으로써 매우 적은 수로 존재하는 올리고뉴클레오티드 서열의 식별을 허용한다. 그 다음, 카피 서열의 DNA 시퀀싱 및 분석은 표적과 결합할 수 있는 화학식 (I), (II), 및 (III)의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분을 식별할 수 있거나 이와 상호연관시킬 수 있다.
화학식 (I), (II), 및 (III)의 분자의 라이브러리의 합성 및 분석, 또는 그의 인식가능한 변형이 WO 2017/218293, WO 2018/204420, 및 PCT/US2018/052494 (출원 당시 공개되지 않음)에 개시되어 있으며, 이들은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 실시양태
실시양태 1. 하기 단계를 포함하는, 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하는 방법:
분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 것인 단계;
적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 함유하는 샘플을 분리 매질에 도입하며, 여기서 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 적어도 하나의 코딩된 부분에 작동적으로 연결된 코딩 부분을 포함하는 것인 단계;
적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형성하는 단계;
분리 매질로부터 적어도 2개의 별도의 위치 중 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자로부터 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계;
PCR을 허용하도록 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱하는 단계;
적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 대해 PCR을 수행함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분을 증폭시키는 단계; 및
적어도 하나의 위치를 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 정체와 상호연관시킴으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하는 단계.
실시양태 2. 실시양태 1 또는 3 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자가 세포, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 효소, 리보솜, 및 나노디스크 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1 내지 2 또는 4 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 분리 매질이 입자, 중합체, 및 분리 표면 중 적어도 하나를 함유하고, 적어도 하나의 표적 분자가 분리 매질, 입자, 중합체, 및 분리 표면 중 적어도 하나에 연결되는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 또는 5 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 입자가 중합체 입자 또는 금속 콜로이드를 포함하는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 또는 6 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 중합체가 적어도 하나의 표적 분자의 가장 낮은 중량 표적 분자의 10% 이상의 분자량을 갖는 것인 방법.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 또는 7 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자와 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분 사이의 적어도 하나의 표적-활성에 기반하여 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 또는 8 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 표적-활성이 적어도 하나의 표적 분자에 의한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 화학적 변형을 포함하는 것인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 또는 9 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서,
올리고뉴클레오티드가 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하고,
적어도 하나의 코딩된 부분이 적어도 2개의 위치적 빌딩 블록을 함유하고,
적어도 하나의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록이 올리고뉴클레오티드의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별되고;
분리 매질이 다공성 겔 및 버퍼 시스템을 함유하는 것인
방법.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 또는 10 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (I)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
(I) G-L-B
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B는 적어도 2개의 빌딩 블록을 함유하는 코딩된 부분이고;
L은 G를 B에 작동적으로 연결하는 링커이고;
여기서 B에서의 각각의 위치적 빌딩 블록은 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 위치에 따라 별도로 식별된다.
실시양태 10. 실시양태 1 내지 9 또는 11 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
(II) [(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 또는 1이고;
P는 0 또는 1이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
실시양태 11. 실시양태 1 내지 10 또는 12 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (III)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
(III) [(B1)M-L1]O-G'-[(L2-(B2)K]P
여기서
G'는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, G'는 적어도 2개의 코딩 영역 및 적어도 하나의 헤어핀을 포함하는 것을 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 내지 5의 정수이고;
P는 0 내지 5의 정수이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1 내지 5의 정수이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G'의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
실시양태 12. 실시양태 1 내지 11 또는 13 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하며:
제1 방향으로 분리 매질을 가로질러 제1 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하는 단계,
여기서 제1 분리 처리는 제1 전압 프로토콜 및 제1 지속기간을 포함하는 것인
방법.
실시양태 13. 실시양태 1 내지 12 또는 14 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
제1 방향에 실질적으로 수직인 제1 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계.
실시양태 14. 실시양태 1 내지 13 또는 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하며:
제2 방향으로 분리 매질을 가로질러 제2 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제2 방향은 제1 방향에 실질적으로 수직인 단계,
여기서 제2 분리 처리는 제2 전압 프로토콜 및 제2 지속기간을 포함하는 것인
방법.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
제1 세그먼트화 방향에 실질적으로 수직인 제2 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계.
보다 더 예시적인 실시양태
실시양태 1A. 하기 단계를 포함하는 방법:
분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자 및 적어도 하나의 샘플 영역을 포함하는 것인 단계;
적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 함유하는 샘플을 분리 매질의 샘플 영역에 도입하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 코딩된 부분에 작동적으로 연결된 코딩 부분을 포함하는 것인 단계; 및
샘플을 전기영동시킴으로써 상기 혼합물의 적어도 일부분을 분리 매질 내의 표적에 접촉시키는 단계.
실시양태 2A. 실시양태 1A에 있어서, 코딩 부분이 적어도 하나의 코딩된 부분에 연결된 올리고뉴클레오티드를 함유하고,
올리고뉴클레오티드가 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하고,
적어도 하나의 코딩된 부분이 적어도 2개의 위치적 빌딩 블록을 함유하고,
적어도 하나의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록이 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별되고;
분리 매질이 다공성 겔 및 버퍼 시스템을 함유하는 것인
방법.
실시양태 3A. 실시양태 1A에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자가 세포, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 효소, 리보솜, 및 나노디스크 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
실시양태 4A. 실시양태 1A에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (I)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
(I) G-L-B
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B는 적어도 2개의 빌딩 블록을 함유하는 코딩된 부분이고;
L은 G를 B에 작동적으로 연결하는 링커이고;
여기서 B에서의 각각의 위치적 빌딩 블록은 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 위치에 따라 별도로 식별된다.
실시양태 5A. 실시양태 1A에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
(II) [(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
여기서
G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 또는 1이고;
P는 0 또는 1이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
실시양태 6A. 실시양태 1A에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (III)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
(III) [(B1)M-L1]O-G'-[(L2-(B2)K]P
여기서
G'는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, G'는 적어도 2개의 코딩 영역 및 적어도 하나의 헤어핀을 포함하는 것을 포함하고;
B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
L1은 B1을 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
L2는 B2를 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
O는 0 내지 5의 정수이고;
P는 0 내지 5의 정수이며;
단, O 및 P 중 적어도 하나는 1 내지 5의 정수이고;
여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G'의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
실시양태 7A. 실시양태 1A에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
제1 방향으로 분리 매질을 가로질러 전압을 인가함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하는 단계.
실시양태 8A. 실시양태 1A에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
제1 방향에 실질적으로 수직인 제1 절단 방향으로 분리 매질을 절단하여 분리 세그먼트를 형성함으로써 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 분획을 단리하는 단계.
실시양태 9A. 실시양태 8A에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
분리 세그먼트로부터 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 분획을 제거하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 복구된 분획을 형성하는 단계;
올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 복구된 분획으로부터 올리고뉴클레오티드를 증폭시켜 카피 서열의 분획을 형성하는 단계,
카피 서열의 분획을 시퀀싱하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 복구된 분획의 각각의 코딩 영역 또는 코딩 영역의 조합을 식별하여 적어도 하나의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록을 식별하는 단계.
실시양태 10A. 실시양태 7A에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
제2 방향으로 분리 매질을 가로질러 전압을 인가함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하며, 여기서 제2 방향은 제1 방향에 실질적으로 수직인 것인 단계.
실시양태 11A. 실시양태 10A에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
분리 매질을 2개의 방향으로 절단함으로써 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 분획을 단리하며, 여기서 2개의 방향이 각각 독립적으로, 제1 및 제2 방향에 대해 실질적으로 수직하여 직사각형 분리 세그먼트를 형성하는 것인 단계.
실시양태 12A. 실시양태 11A에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
직사각형 분리 세그먼트로부터 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 분획을 제거하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 복구된 분획을 형성하는 단계;
올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 복구된 분획으로부터 올리고뉴클레오티드를 증폭시켜 카피 서열의 분획을 형성하는 단계,
카피 서열의 분획을 시퀀싱하여 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 복구된 분획의 각각의 코딩 영역 또는 코딩 영역의 조합을 식별하여 적어도 하나의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록을 식별하는 단계.
실시양태 13A. 실시양태 1A에 있어서, 분리 매질이 입자 및 중합체 중 적어도 하나를 함유하고, 적어도 하나의 표적 분자가 입자 및 중합체 중 적어도 하나에 연결되는 것인 방법.
실시양태 14A. 분리 매질을 포함하는 전기영동 시스템으로서,
분리 매질은 하기를 포함하며:
다공성 겔;
다공성 겔 내의 적어도 하나의 표적 분자; 및
다공성 겔 내의 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자,
여기서 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 적어도 하나의 코딩된 부분에 연결된 올리고뉴클레오티드를 함유하고,
여기서 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하고,
여기서 적어도 하나의 코딩된 부분은 적어도 2개의 위치적 빌딩 블록을 함유하고,
여기서 각각의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록이 2 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별되는 것인
전기영동 시스템.
실시양태 15A. 실시양태 14A에 있어서, 다공성 겔이 입자 및 중합체 중 적어도 하나를 추가로 포함하고, 적어도 하나의 표적 분자가 입자 및 중합체 중 적어도 하나에 연결되는 것인 전기영동 시스템.
컴퓨터 시스템
본 개시내용은 예를 들어, 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하는 것과 같은, 본 개시내용의 방법을 구현하도록 프로그래밍된 컴퓨터 시스템을 제공한다. 도 12는 단일 코어 또는 다중 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위한 복수 개의 프로세서일 수 있는 중앙 처리 장치 (CPU, 본원에서 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서"라고도 함) (1205)를 포함하는 컴퓨터 시스템 (1201)을 도시한다. 컴퓨터 시스템 (1201)은 또한 메모리 또는 메모리 위치 (1210) (예를 들어, 랜덤 액세스 메모리, 읽기 전용 메모리, 플래시 메모리), 전자 저장 유닛 (1215) (예를 들어, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과의 통신을 위한 통신 인터페이스 (1220) (예를 들어, 네트워크 어댑터), 및 주변 장치 (1225), 예컨대 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함한다. 메모리 (1210), 저장 유닛 (1215), 인터페이스 (1220) 및 주변 장치 (1225)는 통신 버스 (실선), 예컨대 마더보드를 통해 CPU (1205)와 통신한다. 저장 유닛 (1215)은 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 유닛 (또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템 (1201)은 통신 인터페이스 (1220)의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크") (1230)에 작동적으로 커플링될 수 있다. 네트워크 (1230)는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크 (1230)는 일부 경우에 전기통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크 (1230)는 분산 컴퓨팅, 예컨대 클라우드 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다. 네트워크 (1230)는 일부 경우에 컴퓨터 시스템 (1201)의 도움으로 피어-투-피어 네트워크를 구현할 수 있으며, 이는 컴퓨터 시스템 (1201)에 커플링된 장치가 클라이언트 또는 서버로서 동작하도록 할 수 있다.
CPU (1205)는 프로그램 또는 소프트웨어로 구현될 수 있는 일련의 기계 판독가능 명령어를 실행할 수 있다. 명령어는 메모리 (1210)와 같은 메모리 위치에 저장될 수 있다. 명령어는 CPU (1205)로 향할 수 있으며, 이는 본 개시내용의 방법을 구현하도록 CPU (1205)를 후속적으로 프로그래밍하거나 달리 구성할 수 있다. CPU (1205)에 의해 수행되는 동작의 예는 페치, 디코딩, 실행 및 라이트백을 포함할 수 있다.
CPU (1205)는 회로, 예컨대 집적 회로의 일부일 수 있다. 시스템 (1201)의 하나 이상의 다른 구성요소가 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우에는, 회로가 애플리케이션 특이적 집적 회로 (ASIC)이다.
저장 유닛 (1215)는 파일, 예컨대 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램을 저장할 수 있다. 저장 유닛 (1215)은 사용자 데이터, 예를 들어, 사용자 선호도 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템 (1201)은 일부 경우에 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템 (1201)과 통신하는 원격 서버에 위치하는 것과 같이 컴퓨터 시스템 (1201) 외부에 있는 하나 이상의 부가의 데이터 저장 유닛을 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템 (1201)은 네트워크 (1230)를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템 (1201)은 사용자의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 예는 개인용 컴퓨터 (예를 들어, 휴대용 PC), 슬레이트 또는 태블릿 PC (예를 들어, 애플(APPLE)® iPad, 삼성(SAMSUNG)® Galaxy Tab), 전화기, 스마트폰 (예를 들어, 애플® iPhone, 안드로이드-지원 장치, 블랙베리(BLACKBERRY)®), 또는 개인 디지털 비서를 포함한다. 사용자는 네트워크 (1230)를 통해 컴퓨터 시스템 (1201)에 액세스할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 방법은 컴퓨터 시스템 (1201)의 전자 저장 위치, 예컨대 예를 들어 메모리 (1210) 또는 전자 저장 유닛 (1215)에 저장된 기계 (예를 들어, 컴퓨터 프로세서) 실행가능 코드를 통해 구현될 수 있다. 기계 실행가능 또는 기계 판독가능 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용 중에 코드는 프로세서 (1205)에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 저장 유닛 (1215)으로부터 검색될 수 있고 프로세서 (1205)에 의한 준비된 액세스를 위해 메모리 (1210)에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 저장 유닛 (1215)은 배제될 수 있고, 기계 실행가능한 명령어는 메모리 (1210)에 저장된다.
코드는 미리 컴파일되고 코드를 실행하도록 구성된 프로세서가 있는 기계와 함께 사용하도록 구성되거나, 또는 런타임 중에 컴파일될 수 있다. 코드는 미리 컴파일되거나 컴파일된 대로 실행할 수 있도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 제공될 수 있다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 측면, 예컨대 컴퓨터 시스템 (1201)은 프로그래밍으로 구현될 수 있다. 이러한 기술의 다양한 측면은 전형적으로 일종의 기계 판독가능 매체에 수반되거나 구현되는 기계 (또는 프로세서) 실행가능 코드 및/또는 관련 데이터 형태의 "제품" 또는 "제조품"으로서 간주될 수 있다. 기계 실행가능 코드는 전자 저장 유닛, 예컨대 메모리 (예를 들어, 읽기 전용 메모리, 랜덤 액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크에 저장할 수 있다. "저장" 유형의 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리 또는 그의 관련 모듈의 유형 메모리, 예컨대 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있으며, 이는 소프트웨어 프로그래밍을 위해 언제든지 비-일시적 저장을 제공할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부분은 때때로 인터넷 또는 다른 다양한 전기통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 예를 들어, 그러한 통신은 한 컴퓨터 또는 프로세서에서 또 다른 컴퓨터 또는 프로세서로, 예를 들어 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터에서 애플리케이션 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어를 로딩하는 것을 가능하게 할 수 있다. 따라서 소프트웨어 요소를 보유할 수 있는 또 다른 유형의 매체는 유선 및 광학 유선 네트워크 및 다양한 공중 링크를 통해 로컬 장치 사이의 물리적 인터페이스 전반에 걸쳐 사용되는 것과 같은 광학, 전기 및 전자기파를 포함한다. 이러한 전파를 전달하는 물리적 요소, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등이 또한 소프트웨어를 보유하는 매체로서 간주될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비-일시적 유형의 "저장" 매체로 제한되지는 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독가능 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
따라서, 기계 판독가능 매체, 예컨대 컴퓨터 실행가능 코드는 유형의 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 형태를 취할 수 있다. 비-휘발성 저장 매체는, 예를 들어, 광학 또는 자기 디스크, 예컨대 본 도면에 도시된 데이터베이스 등을 구현하는데 사용될 수 있는 것과 같이, 임의의 컴퓨터(들) 내의 저장 장치 중 임의의 것을 포함한다. 휘발성 저장 매체는 동적 메모리, 예컨대 이러한 컴퓨터 플랫폼의 메인 메모리를 포함한다. 유형의 전송 매체는 동축 케이블; 컴퓨터 시스템 내에서 버스를 구성하는 전선을 포함한 구리선 및 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 무선 주파수 (RF) 및 적외선 (IR) 데이터 통신 중에 생성되는 것과 같은 음향 또는 광파의 형태를 취할 수 있다. 따라서 통상적인 형태의 컴퓨터 판독가능 매체는 예를 들어 하기를 포함한다: 플로피 디스크, 플렉서블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 종이 테이프, 구멍 패턴이 있는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령을 전송하는 반송파, 그러한 반송파를 전송하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 읽을 수 있는 임의의 다른 매체. 이러한 형태의 컴퓨터 판독가능 매체 중 다수는 실행을 위해 프로세서에 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 전달하는데 관여할 수 있다.
컴퓨터 시스템 (1201)은, 예를 들어, 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 제공하기 위한 사용자 인터페이스 (UI) (1240)를 포함하는 전자 디스플레이 (1235)를 포함하거나 이와 통신할 수 있다. UI의 예는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 및 웹 기반 사용자 인터페이스를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 방법 및 시스템은 하나 이상의 알고리즘에 의해 구현될 수 있다. 알고리즘은 중앙 처리 유닛 (1205)에 의한 실행 시 소프트웨어를 통해 구현될 수 있다. 알고리즘은 예를 들어, 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자에 대한 표적-활성 데이터를 수집하기 위한 방법을 구현할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 실시양태는 하기 실시예에 의해 예시되지만 이에 의해 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 열거된 단계 또는 단계의 일부를 수행하기 위한 많은 동등한 기술을 인식할 것이다.
실시예
실시예 1. DNA 올리고뉴클레오티드에 연결된 합성 화합물의 제조.
활성화된 산을 반응성 유리 아민에 커플링하는 반응으로 인해 다수의 화합물 또는 개별 화합물이 신속하고 효율적으로 생성될 수 있다는 것은 DNA 변형 분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 것이다.
실시예 1A. 세파로스® 수지 상에서의 DNA의 고정화
반응성 아민 핸들에 연결된 DNA 올리고에 대한 화학적 변형을 수행하기 위해서는, 먼저 DNA를 세파로스® 수지 상에 고정화시킨다. 384 웰 필터 플레이트 [E&K 사이언티픽(Scientific), EK-2288] 내의 각각의 웰에 40 uL의 1:1 DEAE 세파로스®:저장 용액을 부가하였다. 웰을 플레이트 진공 매니폴드에서 70 uL의 물로 2회 세척한 다음, 70 uL의 결합 버퍼 (증류수 중 10 mM AcOH)로 2회 세척하였다. 플레이트를 2000 rpm에서 1분 동안 원심분리기에서 회전시켜 웰로부터 모든 액체를 건조시켰다. 각각의 웰에 40 uL의 결합 버퍼 및 10 uL의 100 ng/uL의 적절한 아민 연결된 DNA 올리고를 부가하고, 웰을 와이드 보어 팁 (Rainin)을 사용하여 분쇄하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하도록 하였다. 플레이트를 1분 동안 2000 RPM에서 리시버 플레이트 [그라이너 바이오-원(greiner bio-one) REF 781201]로 회전시켰다. 수집 플레이트 내의 용리액을 수지의 상부에 부가하고, 웰을 분쇄하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하도록 하였다. 플레이트를 리시버 플레이트로 다시 회전시키고 (2000 RPM 1분) 각각의 용리액 웰을 DNA 농도에 대해 나노드롭으로 분석하여 포획 효율을 평가하였다. 측정된 DNA 농도가 1 ng/uL 초과인 경우에는, 용리액을 수지에 세 번째로 부가하고 추가로 5분 동안 인큐베이션하고 스핀아웃 및 측정을 반복하였다. 측정된 DNA 농도가 1 ng/uL 미만인 경우에는, 웰을 진공 매니폴드 (결합 버퍼 3x 70 uL, 물 3x 70 uL, 메탄올 3x 70 uL)에서 세척하였다.
실시예 1B. 활성화된 산의 생성 일반 절차 및 반응성 아민에 연결된 DNA 올리고에 대한 커플링.
산 모이어티를 함유하는 화합물을 DNA 올리고머의 유리 아민에 커플링시키 위해, 산은 하기 방식으로 활성화된다. 각각의 산에 대해 80:20 DMF:MeOH 및 400 mM 농도의 용액을 산의 분자량에 의해 계산된 바와 같이 제조하였다. 40 mM HoAT (5.5 mg)의 1 mL 용액을 80:20 DMF:MeOH에서 제조하였다. 사용 직전에 100 mM EDC*HCl 7.7 mg의 스톡 용액을 400 uL의 MeOH에 용해시켰다. 활성화된 산을 생성하기 위해 15 uL의 원하는 산 (400 mM)을 15 uL의 HoAT (40 mM)에 부가한 다음 30 uL의 DMF:MeOH 80:20 및 마지막으로 60 uL의 EDC*HCl 용액 (100 mM)에 부가하였고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
실시예 1C. 활성화된 산에 의한 DNA의 아실화 일반 절차
활성화된 산 용액을 반응성 아민 핸들에 연결된 DNA 올리고에 커플링하기 위해, 필터 플레이트에서 실시예 1A로부터의 고정화된 DNA를 DMF:MeOH 80:20 중 70 uL의 400 mM DIPEA로 진공 매니폴드에서 3회 세척한 다음, 70 uL의 MeOH로 3회 세척하였다. 그런 다음 필터 플레이트를 고무 마개 위에 놓아 두어 웰이 배수되는 것을 방지하였다. 각각의 웰에 실시예 1B에서 제조된 원하는 활성화된 산 용액 70 uL를 부가하고 웰을 분쇄하였다. 웰을 금속 테이프 밀봉 [코닝(Corning), Cat. # 6569]으로 밀봉하고 인큐베이션하도록 하였다 (실온, 1시간). 그런 다음 플레이트를 개봉하고 진공 매니폴드를 통해 용액을 제거하였다. 플레이트 바닥을 고무 마개로 밀봉하고 활성화된 산의 새로운 분취액 (70 uL)을 적절한 웰에 부가하고, 분쇄하고, 금속 테이프 밀봉으로 플레이트 상단을 밀봉하고 인큐베이션하도록 하였다 (실온, 1시간). 인큐베이션 후 플레이트 밀봉을 제거하고, 용액을 진공 매니폴드에 의해 제거하고 웰을 세척하였다 (3x, 70 uL, 80:20 DMF:MeOH).
실시예 1D. 아민 보호기 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)의 제거
활성화된 산과 커플링되고 반응된 DNA-연결된 반응성 아민의 경우 (실시예 1C), Fmoc 보호된 산이 아실화된 웰에 대해서는 60 uL의 4-메틸 피페리딘 (20% v/v, DMF)을 부가하고 10분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 진공 매니폴드에 의해 제거하고 웰을 세척하였다 (3x 70 uL DMF, 3x 70 uL MeOH, 3x 70 uL 탈이온수). 플레이트를 회전시켜 액체의 어떠한 흔적도 제거하였다 (1분, 2000 RPM). 이러한 새로이 변형된 DNA 올리고는 용리될 수 있거나 (실시예 1E) 또는 부가 커플링을 수행하여 (실시예 1C-1D에 따라) 화합물을 연장시킬 수 있다.
실시예 1E. 세파로스®로부터 합성적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 용출, 회수 및 정제
세파로스® 수지 상에 고정화되어 있는 동안 DNA 연결된 반응성 아민을 변형시키는 반응 후, DNA 화합물 구축물은 분석 및 정제를 위해 웰로부터 수집 플레이트로 용출될 수 있다. 웰에 33 uL의 용리 버퍼 (1.5 M NaCl, 증류수 중 50 mM NaOH)를 부가하고, 분쇄하고, 5분 동안 인큐베이션하도록 하였다. 필터 플레이트를 리시버 플레이트 위에 놓아 두고 원심분리 (1분, 2000 RPM)에 의해 용액을 수집하였다. 이러한 단계를 추가로 2회 반복하여 99 uL의 용리 버퍼에서 용리된 DNA를 생성하였다. 수집된 용리액에 2.5 uL의 1 M 아세트산 (최종 농도 25 mM)을 부가하여, 용리액이 산성화되는 것을 방지하면서 50%의 NaOH를 중화시켰다. 샘플은 관심 특정한 화합물-DNA 구축물에 최적화된 HPLC 방법을 사용하여 페노메넥스 선명도 2.6 um 올리고-XT 100 A 컬럼 (50 x 2.1 mm)에서 애질런트(Agilent) 1200 HPLC에 의해 정제되었다.
실시예 1F. DNA에 첨부된 완전한 길이의 코딩된 양성 대조군 분자의 합성 및 생성.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 실시예 1A-1E로부터 합성된 분자로 변형된 DNA 올리고뉴클레오티드와 같은 변형된 프라이머를 활용하여 더 긴 DNA 구축물을 생성할 수 있음을 인지할 것이다. BCA 양성 대조군은 기재된 바와 같이 선택된 DNA 올리고뉴클레오티드 상에서 합성되었다. 정제된 화합물-DNA 하이브리드를 화합물의 정체에 특이적인 완전한 길이의 가닥 주형을 사용하는 표준 PCR에서 프라이머로서 사용하였다. 간단히 언급하면, Za'-A(097-107)-Zbi-Bi-Zbf-Bf-Zci-Ci-Zcf-Cf-Zd-D001-Zf로 이루어진 주형 가닥에 1 uL의 10 uM 화합물-Za-DNA 하이브리드를 부가하여 25 uL Q5 PCR 반응물이 되도록 하였고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 최적화된 PCR 프로그램을 실행하여 "완전한 길이의" 234 올리고뉴클레오티드 코드를 생성하고, DNA 코딩된 라이브러리 코딩 부분의 길이 및 조성을 모방함을 인지할 것이다. 그 산물은 써모사이언티픽 진제트(GeneJet) PCR 정제 키트에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 정제되었다.
실시예 2. 직교 반응 조건을 통한 DNA 올리고뉴클레오티드 상의 형광 표지 화합물
DNA에 연결된 공지된 결합 친화도의 화합물을 생산 및 정제하기 위해, 변형된 뉴클레오티드를 활용하여 DNA를 시각화하기 위해 형광 화합물을 부착한다. 형광단 (본 실시예에서는 플루오레세인)의 부착은 결합 친화도의 결정을 가능하게 할 수 있고 또한 표면, 겔 또는 샘플 상의 화합물 위치를 시각화하는데 활용될 수 있다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
2A. 상업적으로 이용가능한 알킨 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 변형된 DNA 코드의 활용.
당해 분야의 경험이 있는 자에게 친숙한 바와 같이, 직교 반응성 핸들, 이 경우 알킨의 활용은 관심 화합물로부터 원위 부위에 대한 합성 변형을 허용한다. 형광 화합물을 생성하기 위해, 반응성 아민 연결된 말단 (5AmMC6)을 보유하는 알킨 변형된 DNA 뉴클레오티드 (i5OctdU) 올리고뉴클레오티드를 원하는 화합물의 합성에 사용하였고 (도 6에 도시됨), 실시예 1B-1E에서와 같이 정제하였다. 정제 후 샘플을 스피드-백(speed-vac)을 통해 건조시키고 20 uL의 탈이온수에 용해시켰다. 이러한 용액에 10 uL의 7.3 mM 5-FAM 아지드 [루미프로브(Lumiprobe), Cat.#C4130]를 부가한 다음 80 uL의 새로이 제조된 클릭 반응 버퍼 (120 mM 포스페이트, 1.2 mM 아미노 구아니딘, 3 mM 트리스(벤질트리아졸릴메틸)아민, 6 mM 황산구리, 수중 12 mM 아스코르브산나트륨)를 부가하고, 인큐베이션하도록 허용하였다 (30분, 실온). 인큐베이션 후 80 uL의 클릭 켄치 버퍼 (100 mM 트리스, 10 mM EDTA, 0.005% 트윈, 탈이온수 중 0.002% SDS)에 이어 500 uL의 결합 버퍼를 부가한다. 에펜도르프 튜브 용액에 40 uL의 DEAE 수지를 부가하고 부드럽게 진탕시키면서 인큐베이션하도록 허용하였다 (20분 실온). 튜브를 벤치탑 원심분리기에서 1분 동안 회전시키고 상청액을 피펫팅을 통해 제거하였다. 수지를 50 uL의 물에 재현탁시키고 384웰 필터 플레이트로 옮겼다. 웰을 진공 매니폴드 상에서 세척하였다 (3x 70 uL 탈이온수, 3x 70 uL MeOH, 1x 70 uL DMSO, 3x 70 uL 메탄올, 3x 70 uL 물). 상기 기재된 절차를 사용하여 DNA를 용출하였다 (수집 플레이트 내로의 3x 33 uL 용리 버퍼). 용리액은 10 uL의 100 mM AcOH 사용하여 중화시켰다. 표준 방법을 사용한 HPLC를 사용하여 샘플을 정제하였다.
실시예 3. 형광 편광을 이용한 용액 내 표적과의 DNA 상의 형광 화합물의 결합 친화도 측정.
1. 가용성 단백질을 이용한 양성 대조군 형광 편광 일반 절차
도 6은 사용된 양성 대조군 화합물을 도시한다.
DNA에 공유적으로 테더링된 화합물은 비-변형된 천연 화합물과의 비교 시 더 높거나 더 낮게 변형되거나, 또는 변하지 않은 친화도 프로파일을 보유할 수 있다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 통상의 결합 검정인 형광 편광의 사용을 활용하여, 직교 화학을 활용하여 형광 표지될 수 있는 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 테더링된 모이어티로서 합성된 선택된 양성 대조군 분자를 평가하였다. DNA 상의 양성 대조군 화합물 (도 6에 제시된 바와 같음)을 1x 트리스보레이트 버퍼 (45 mM, pH 8.19)에서 개별적으로 희석하여 1 mL의 버퍼에서 20 nM의 최종 농도가 되도록 하였다. 이러한 20 nM 스톡 용액을 1:1로 희석하여 10 nM 스톡 용액을 생성하였다. BCA-II의 100 uM 스톡 용액을 1x 트리스보레이트 버퍼로 만들었다. 384 웰 폴리스티렌 F-바닥 작은 용적 하이베이스 비-결합 블랙 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat.# 784900)에 컬럼 1에 있는 적절한 화합물의 20 nM 스톡 용액 10 uL를 부가하였다. 컬럼 2-20에는 적절한 화합물 10 nM 스톡 용액 10 uL를 부가하였다. 컬럼 1에 100 uM 스톡 BCA-II 단백질 용액 10 uL를 부가하고, 웰을 분쇄하고, 웰 10 uL를 웰 컬럼 2로 옮기고, 피펫팅하여 혼합하는 프로세스를 웰 20까지 반복하였다. 이러한 절차는 각각의 후속 웰에서 스톡 단백질 농도의 1:1 희석을 생성함으로써, 50 uM 내지 95 pM의 범위를 제공하는 반면, 형광 표지된 DNA-화합물의 농도는 10 nM으로 일정하게 유지된다. 플레이트는 485/530의 여기/방출 및 사전 프로그래밍된 형광 편광 방법을 사용하여 스펙트라맥스(Spectramax) M5 플레이트 판독기에 의해 판독되었다. 수득된 값을 그래프화하고 결과를 힐 방정식에 맞춰 나노몰 값으로 기록된 바와 같은 결합 친화도 (Kd)를 산출하였다.
실시예 4. 형질 양성 대 형질 음성 분자의 선택을 위한 친화도 전기영동 체류 레인의 생성.
실시예 4A: 고정화를 위한 포획 모이어티가 있는 표적 단백질의 표지화를 효율적으로 생성하기 위함
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 단백질의 변형은 널리 사용되고 아주 흔하며, 본 실시예에서는 소 적혈구로부터의 탄산 탈수효소 동종효소 II를 스트렙타비딘 코팅된 입자에 대한 표적의 포획을 허용하도록 비오틴으로 변형시켰다. 이를 달성하기 위해, 소 적혈구 [시그마(sigma) C2552-25MG]로부터의 탄산 탈수효소 동종효소 II 25 mg (0.833 umole)을 PBS (pH 7.8) 450 uL에 부가하였다. 이러한 용액에, PBS (pH 7.8) 550 uL에 용해된 NHS-dPeg4-비오틴 (시그마 QBD10200) 1.5 mg (2.5 umoles, 3 당량)을 부가하였다. 이러한 혼합물 (단백질의 최종 농도 800 uM)을 4℃에서 밤새 놓아 두었다. 이러한 비오티닐화된 단백질은 진행 단계에서 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 4B: 스트렙타비딘 표지된 아가로스 수지 상에 고정화된 표적의 생성
비오닐화된 표적 단백질 (소 탄산 탈수효소 동종효소 II)을 관심 수지 상에 고정화시켰다. 이를 달성하기 위해, 50 mL 팔콘 튜브에 고 용량 스트렙타비딘 아가로스 수지 [써모(Thermo) #20361]의 50% 슬러리 10.6 mL를 부가하였다. 하기 절차에 따라 수지를 트리스-보레이트 버퍼 (pH 8.19)로 2회 세척하였다: 슬러리를 1000 RPM에서 1분 동안 원심분리하고 상청액을 피펫으로 제거하고, 이에 5 mL의 트리스-보레이트 버퍼를 부가하고 그 절차를 반복하였다. 제2 세척액을 제거한 후, 상기와 같이 제조된 800 uM 비오티닐화된 소 탄산 탈수효소 1 mL를 부가하였다. 이러한 슬러리를 부드럽게 교반하여 혼합하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하도록 하였다. 인큐베이션 후 샘플을 원심분리하고 (1000 RPM, 1분), 수지가 "습윤" 상태를 유지하도록 주의하면서 상청액을 조심스럽게 제거하였다.
실시예 4C: 대안적인 스트렙타비딘 표지된 수지 입자 상에 고정화된 표적의 생성.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 실시예 4B에 기재된 고정화 기술은 대안적인 수지 유형을 수용하도록 쉽게 변형될 수 있다. 본 실시예에서는, 스트렙타비딘 코팅된 실리카 입자 (Sphero SVSIP-05-5 0.4-0.6 um), 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 입자 (Sphero SVP-05-10 0.4-0.69 um) 및 스트렙타비딘 코팅된 아가로스 입자 [더 낮은 로딩 용량 써모피셔(Thermofisher) 20347]가, 표적 단백질로 코팅된 입자를 산출하기 위해 상기와 동일한 과정을 거쳤다.
실시예 4D 저 용융 아가로스 및 표적 표지된 입자를 활용한 친화성 전기영동 체류 아가로스 혼합물의 생성.
표적 코팅된 입자를 전기영동에 적합한 다공성 매질에 고정화시키기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 샘플 제조의 온도가 표적의 언폴딩을 방지하도록 제어될 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 제어를 달성하고 분리 매질에서 고정화된 표적 입자를 생성하기 위해, 저 용융 아가로스를 사용하였다. 4 그램의 울트라퓨어(UltraPure) 저 융점 아가로스 [인비트로젠(Invitrogen) 16520]를 함유하는 비커에, 100 mL의 0.5 X 트리스-보레이트 버퍼 (pH 8.19)를 부가하여 4% 아가로스 용액을 생성하였다. 모든 아가로스가 용해되고 최소한의 기포가 관찰될 때까지 비커를 1분 간격으로 높은 온도에서 전자레인지로 돌렸으며, 그 사이에 짧은 교반을 수행하였다. 용해된 겔을 50 mL 팔콘 튜브 2개에 옮겨 냉각시킨 다음, 가열 블록 내에서 42℃로 유지하였다. 별도로 2% 저 용융 아가로스 용액을 2 그램의 저 용융 아가로스 및 100 mL의 0.5 x 트리스-보레이트 버퍼 (pH 8.19)를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 표적 단백질이 로딩된 5.3 mL의 정착된 고 용량 스트렙타비딘 수지의 샘플을 가열 블록에서 42℃로 가온하였다. 가온된 표적 미립자에 42℃에서 4% 저 용융 아가로스 8 mL를 부가하였다. 슬러리는 기포를 피하도록 주의하면서 피펫 팁에 의해 철저히 혼합된다. 이러한 혼합물은 맞춤형 전기영동 몰드 (하프 실린더 4 mm 높이 8 mm 단면)를 사용하여 9 cm 친화성 전기영동 체류 레인의 4개 레인을 생성할 수 있다. 인식되는 바와 같이, 이러한 제제의 규모는 표적의 가용성, 입자의 가용성 또는 원하는 레인 수 및 길이에 따라 더 낮거나 높은 양으로 조정할 수 있다. 제조된 2% 아가로스 용액을 활용하여 아가로스 체류 레인 내에서 샘플의 로딩 지점을 생성하였다. 간단히 언급하면, 로딩 콤브 (하기 기재된 치수)를 겔 몰드의 상단으로부터 1cm 떨어진 장소에 놓아 두고 2% 아가로스를 부가하여 하프-실린더 로드 지점을 둘러싸도록 한다. 2% 아가로스를 실온에서 설정하고 로드 콥브를 겔로부터 조심스럽게 제거하면, 라이브러리 또는 원하는 샘플을 함유하는 15 uL의 로딩 용액을 그 사이에 보유할 수 있는 각각의 레인에 함몰부가 생성된다.
몰드는 무료 온라인 소프트웨어 팅커캐드(TINKERCAD)®로 설계되었다. 설계 사양은 하기와 같다: 베이스 LxWxD 19x9x1깊이 베이스는 2면 (19x0.5x0.8 cm)에 벽으로 브래킷되었다. 베이스 위에 19x0.8x0.4 cm의 치수를 갖는 6개의 균일한 간격 (0.5 cm 이격)의 하프 실린더 (도 3, (302) 참조)를 인쇄하였다. 이미지에 표시된 대로 "로딩 콤브"는 8.8x1x0.4 cm의 LxWxD 치수로 베이스에 인쇄되었다. "로딩 콤브 베이스" 상에는 0.3 cm 높이 및 0.6 cm 폭, 하프 실린더 사이의 간격이 0.6 cm인 6개의 하프 실린더가 인쇄되어 있고, 하프 실린더를 브래킷으로 묶은 두 개의 정사각형 (0.3x0.3x0.3x cm)이, 콤브가 제조된 몰드 내의 중앙에 놓이고 하프 실린더가 하프 파이프 내의 중심에 놓이도록 하는 주입된 몰드의 가장자리 전체에 맞추도록 하였다. 인쇄는 통상적으로 활용되는 ABS (아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌) 인쇄 재료와 함께 스트라타시스(STRATASYS)® 유프린트(UPRINT)® SE 플러스 3D 프린터를 사용하여 UPS 스토어에 의해 수행되었다.
레인 제조 및 이미징을 위한 분해 선택 몰드를 생성하기 위해, 상기 기재된 3d 인쇄된 몰드에 먼저, 에어로졸 스무스-온(SMOOTH-ON)® 유니버설 몰드 릴리스(Universal Mold Release)를 가볍게 분무하여 3d 인쇄된 몰드 상에 균일한 빛 코팅을 생성시킨다. 몰드의 개방된 말단부를 마스킹 테이프로 밀봉하고, SMOOTH-ON® 클리어플렉스(CLEARFLEX)® 50 (철저하게 혼합된 1:2 A:B의 중량비에 대한 제조업체의 지침에 따라 제조되고 2분 동안 초음파 처리하여 거품을 제거함)은 거품을 피하기 위해 조심스럽게 주입하고 밤새 경화시켜 두었다. 경화시킨 후 클리어-플렉스50 몰드를 조심스럽게 제거하여, 아가로스 겔을 채울 수 있는 하프 실린더 레인을 생성하였다. 몰드를 물과 70% 에탄올로 철저히 세척하고 추가 변형 없이 활용하였다.
분해 선택 겔 레인
실시예 4E. 로딩 지점이 있는 완전한 친화성 전기영동 체류 레인의 생성.
완전한 친화성 전기영동 체류 레인 구축물을 생성하기 위해, 샘플 로딩 지점을 생성하여 표적이 로딩된 체류 입자를 함유하는 다공성 아가로스에 샘플을 도입할 수 있다. 맞춤 인쇄된 로드 지점 콤브를 사용하여 이전에 제조된 2% 저 용융 아가로스를 필터 플러그로 막힌 몰드에 주입한다. 겔을 실온으로 냉각시켜, 아가로스가 경화될 수 있게 하고 콤브를 조심스럽게 제거한다. 로드 웰에 임의의 불일치 또는 구멍이 있는지를 검사한다. 콤브를 로딩 웰 영역으로 부드럽게 교체하고 초과 겔을 커팅 제거한다. 또 다른 신선한 필터 플러그는 로드 영역의 가장자리로부터 적절한 거리 (약 1-9 cm 또는 임의의 사용자 정의 거리)에 배치되고 표적 로딩된 입자 / 저 용융 아가로스 혼합물을 레인으로 피펫팅하고 실온으로 냉각되도록 하며, 겔의 "캡처 영역"을 생성하도록 설정한다. 필터 플러그를 커팅 제거하고 "캡처 영역"의 끝에 2% LMP 아가로스를 부가하여 레인을 끝까지 채우고 샘플 분자가 체류 "캡처 영역"에 직면한 후 이동할 수 있는 부가의 거리를 제공한다.
실시예 5. 전기영동 동안 친화도에 기반한 DNA에 부착된 공지된 결합 분자의 분별 및 분리:
실시예 5A. 표적 활성 전기영동 체류 레인을 통한 형광 양성 대조군 전기영동
a. 도 7a, 도 7b 및 도 8a-d
친화성 크로마토그래피 분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 생성된 친화성 전기영동 체류 레인은 전기영동 동안 겔을 통한 그의 운동을 지연시키기 위해 표적과 상호작용하는 분자의 공명 시간에 의존하는 분별로서 기능할 것이다. 높은 로딩 스트렙타비딘 아가로스 및 고정화된 표적으로 구성된 표적 소 탄산 탈수효소 II 캡처 영역을 갖는 겔 레인은 상기 기재된 바와 같이 생성되었다. 이들 레인에 단일 양성 대조군 화합물 (도 6) 또는 형광 표지된 양성 대조군 (도 6)과 200 ng의 각각의 화합물 및 2 uL의 겔 로딩 버퍼의 혼합물 (도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d, 도 9 및 도 10) 12 uL를 로딩하였다. 겔을 40 V에서 18시간 동안 실행하고 청색 플레이트를 사용하여 바이오-래드(Bio-Rad) 겔 독 EZ 이미저 상에서의 분리 진행을 추적하기 위해 일정한 간격으로 영상화하였다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 개별 화합물 실험은 합성적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 친화도에 상응하는 체류 인자 (Rf)를 산출하였다. 이러한 제어 분자의 혼합물은 동일한 방식으로 부가 및 분리될 수 있었다 (도 8a-d, 9 및 10).
실시예 5B. 상이한 입자 유형 및 로딩 밀도의 친화성 전기영동 체류 레인을 통한 형광 양성 대조군 전기영동.
a. 도 10
밀도와 입자 유형이 다양한 분리 매질을 사용하면, 형질이 향상될 수 있는 대안적 체류 능력이 제공된다. 이를 평가하기 위해, 3 cm에서 캡처된 표적이 있는 하기 체류 영역을 함유하는 레인이 생성되었다. 1. 포획된 표적이 있는 스트렙타비딘 표지된 폴리스티렌, 2. 포획된 표적이 있는 스트렙타비딘 표지된 실리카, 3. 고 로딩 스트렙타비딘 아가로스, 4. 저 로딩 스트렙타비딘 아가로스 (여기서 입자 밀도는 3과 동일함), 5. 레인 3에 대한 1/4 밀도에서 고 로딩 스트렙타비딘 아가로스 (여기서 총 표적 양은 4와 동일함). 이것은 입자 유형, 표면 디스플레이 표적 밀도 및 표적 입자 밀도를 탐색한다. 본 실험은 362 nM (화합물 10) 및 7160 nM (화합물 5)의 친화도를 갖는 화합물과 추적자로서의 플루오레세인을 사용하여 수행되었다. 전기영동은 90 V에서 3시간 동안 수행되었다.
실시예 5C. 완전한 길이의 코딩 올리고뉴클레오티드 및 코딩된 분자 분리
본 방법의 유용성은 형질 양성 화합물을 형질 음성 화합물로부터 분리하고, 표적에 대한 친화도에 의해 형질 양성 화합물을 분별하는 방식으로 그렇게 할 수 있는 능력 및 코딩 영역 및 그에 의해 코딩된 화합물을 식별하기 위해 시퀀싱될 수 있 능력에 있다. 전기영동 전에 겔 장치를 탈이온수로 세척한다. 장치에 0.5x TB 버퍼 2 L를 채우고 수조 (겔 장치의 라인 아래) 내의 델리 냉장고에 놓아두고 4℃로 냉각시킨다. 레인이 있는 겔 몰드를 장치에 로딩하고 30분 동안 냉각되도록 하였다. 제조된 분해 선택 겔 (표적 단백질이 로딩된 고 로딩 스트렙타비딘 아가로스를 사용한 3 cm의 캡처 영역)에, 보라색 겔 로딩 버퍼 (NEB #B7024S) 2 uL, 더미 라이브러리 100 ng (합성적으로 변형된 화합물을 제외한 1,600만 개의 고유 라이브러리 코드로 이루어짐) 및 소 탄산 탈수효소 II에 대한 각각의 양성 대조군의 50,000개 카피 (표 XA)를 함유하는 12 uL의 샘플을 부가하였으며, 이는 실시예 1F에서 생성되었고, 더미 라이브러리 샘플로부터 독립적으로 고유하게 코딩되었다. 샘플을 90 V에서 5시간 동안 전기영동하였다.
실시예 5D. 체류 매질의 물리적 분할
관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 수 있는 바와 같이, 클린룸 기술의 필요성은 샘플의 교차 오염을 방지하는데 가장 중요하다. 이를 달성하기 위해 겔을 실행한 후 층류 후드로 옮긴다. 친화성 선택 겔을 1 mm의 44개 슬라이스로 분할하고 멸균 PCR 플레이트로 옮긴다. 슬라이스는 비-유지성의 12개 면도날 스택을 사용하여 집게 손가락 사이에 잡고 겔 슬라이스 위에 눌려 생성된다. PCR 웰 위치는 겔 슬라이스의 위치에 직접 상응한다.
실시예 5E. 친화성 전기영동 체류 아가로스 겔 레인으로부터 DNA 올리고뉴클레오티드의 회수
분할된 각각의 슬라이스로부터 코딩 DNA의 PCR 카피를 생성하기 위해, DNA는 PCR 증폭에 적합한 형태로 회수될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 상기 생성된 개별 겔 슬라이스를 함유하는 PCR 플레이트를 열순환기에서 5분 동안 95℃로 가열한다. 플레이트를 침강시키고 (2000 RPM, 1분) 각각의 웰에 10x B-아가라제 I 버퍼 3 uL 및 양성 대조군 DNA 서열의 50,000개 분자를 함유하는 물 5 uL를 부가하여 총 용적이 30 uL가 되도록 한다. 플레이트를 다시 95℃로 10분 동안 가열하고 42℃의 가열 블록에 놓아 둔다. 샘플을 42℃ 가열 블록에서 10분 동안 유지한 다음 각각의 웰에 2 uL의 B-아가라제 효소 [뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) Cat# M0392L]를 부가한다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이션할 수 있다 (1시간, 42℃). 인큐베이션 후 플레이트를 침강시킨다 (2000 RPM, 1분). 필요한 경우, 플레이트를 밀봉하여 -20℃에서 저장할 수 있다. 이러한 절차는 더 이상 겔화할 수 없고 PCR에 의해 진행 단계에서 증폭될 수 있는 샘플을 생성한다.
실시예 5F. 특이적 인덱싱 올리고뉴클레오티드 프라이머의 PCR 설치를 통한 개별 겔 슬라이스의 인덱싱
친화성 선택 겔과 관련하여 회수된 DNA의 위치를 식별하기 위해, 인덱싱 올리고뉴클레오티드가 DNA 가닥을 코딩하는 모체의 모든 증폭된 PCR 카피에 설치된다. 이를 달성하기 위해, 상기 생성된 용해된 겔 샘플로부터 웰을 분쇄하고 15 uL를 신선한 96 웰 플레이트로 옮긴다. 각각의 겔 슬라이스는 zd'-D002' 인덱스 내지 D096'-Zf 인덱스로 개별적으로 인덱싱된다. Q5 고 충실도 2x 마스터 믹스 (NEB M0492L)를 사용하여 총 5 mL의 마스터 믹스가 제조된다. 각각의 웰에 1.25 uL의 D-인덱싱 프라이머 (10 uM) 및 1.25 uL의 일루미나-Za 프라이머 (10 uM)를 부가하고 프로토콜 Illum_Za_T73으로 12주기 동안 실행한다.
실시예 5G. 시퀀싱을 위한 일루미나 Za 및 일루미나 Zf 프라이머 세트의 인덱스 설치를 사용한 사후 증폭
코딩된 화합물 구조를 적절하게 할당하기 위해 코딩 및 인덱싱된 영역을 시퀀싱하기 위해, 시퀀싱 프라이머 세트가 설치될 수 있다. 일루미나 프라이머 세트는 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 설치된다. 간단히 언급하면, 각각의 인덱싱된 겔 슬라이스 웰로부터 2 uL를 제거하고, 이를 새로운 96 웰 PCR 플레이트로 옮긴다. 이들 웰에 일루미나 프라이머 세트를 함유하는 Q5 마스터 믹스 23 uL를 부가한다. 샘플은 프로토콜 Illum_Za-T73을 사용하여 10주기 동안 실행된다. 증폭 후 각각의 웰로부터의 2 uL 분취액을 풀링하고 풀링된 PCR 반응물 10 uL 당 1 uL의 엑소-I (NEB M0293-L)를 부가한다. 조합된 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 80℃에서 15분 동안 열 불활성화시킨다. 조합된 엑소뉴클레아제 샘플은 진제트 PCR 클린업 키트 (써모 Cat. #K0701)를 사용하여 정제된다. 샘플의 순도는 2% 아가로스 겔 및 농도계를 사용하여 평가하여 DNA의 양을 정량화한다. 정제된 DNA는 NGS 시퀀싱을 위해 제출된다.
실시예 5H. 시퀀싱을 위한 일루미나 Za 및 일루미나 Zf 프라이머 세트의 인덱스 설치를 사용한 사후 증폭
a. 도 11a
실시예 5F에서 제조된 DNA 샘플은 DNA 시퀀싱을 위해 제출된다. 사후 프로세싱 방법은 A097-A107 코딩 영역을 단리하고 식별하며, 이는 샘플 중의 양성 대조군 분자를 코딩하고 위치 인덱스를 사용하여 코드가 유래된 슬라이스를 결정한다. 시퀀싱 카운트는 겔 슬라이스에 의해 플로팅되며 (도 11a), 여기서 친화도가 가장 좋은 화합물은 친화도가 더 낮은 화합물과 비교 시 높게 유지되며, 단리, 시퀀싱 및 식별될 수 있다.

Claims (15)

  1. 하기 단계를 포함하는, 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 표적-활성을 결정하는 방법:
    분리 매질을 제공하며, 여기서 분리 매질은 적어도 하나의 표적 분자를 함유하는 것인 단계;
    적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 혼합물을 함유하는 샘플을 분리 매질에 도입하며, 여기서 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자는 적어도 하나의 코딩된 부분에 작동적으로 연결된 코딩 부분을 포함하는 것인 단계;
    적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 형성하는 단계;
    분리 매질로부터 적어도 2개의 별도의 위치 중 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 2개의 상이한 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자로부터 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계;
    폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행할 수 있도록 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 프로세싱하는 단계;
    적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩 부분에 대해 PCR을 수행함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분을 증폭시키는 단계; 및
    적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 적어도 하나의 코딩된 부분의 정체 및 적어도 하나의 위치를 프로세싱함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 표적-활성을 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자가 세포, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 효소, 리보솜, 및 나노디스크로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 구성원을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 분리 매질이 입자, 중합체, 및 분리 표면으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 구성원을 함유하고, 적어도 하나의 표적 분자가 분리 매질, 입자, 중합체, 및 분리 표면 중 적어도 하나에 연결되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 입자가 중합체 입자 또는 금속 콜로이드를 포함하는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 중합체가 적어도 하나의 표적 분자의 가장 낮은 중량 표적 분자의 10% 이상의 분자량을 갖는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자와 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분 사이의 적어도 하나의 표적-활성에 기반하여 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 하나의 표적-활성이 적어도 하나의 표적 분자에 의한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자의 코딩된 부분의 화학적 변형을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 적어도 2개의 코딩 영역을 함유하고,
    적어도 하나의 코딩된 부분이 적어도 2개의 위치적 빌딩 블록을 함유하고,
    적어도 하나의 코딩된 부분의 각각의 위치적 빌딩 블록이 올리고뉴클레오티드의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별되고;
    분리 매질이 다공성 겔 및 버퍼 시스템을 함유하는 것인
    방법.
  9. 제1항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (I)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
    (I) G-L-B
    여기서
    G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
    B는 적어도 2개의 빌딩 블록을 함유하는 코딩된 부분이고;
    L은 G를 B에 작동적으로 연결하는 링커이고;
    여기서 B에서의 각각의 위치적 빌딩 블록은 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 위치에 따라 별도로 식별된다.
  10. 제1항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
    (II) [(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
    여기서
    G는 적어도 2개의 코딩 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
    B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
    B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
    L1은 B1을 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
    L2는 B2를 G에 작동적으로 연결하는 링커이고;
    O는 0 또는 1이고;
    P는 0 또는 1이며;
    단, O 및 P 중 적어도 하나는 1이고;
    여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
  11. 제1항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자가 화학식 (III)에 따른 구조를 갖는 것인 방법:
    (III) [(B1)M-L1]O-G'-[(L2-(B2)K]P
    여기서
    G'는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, G'는 적어도 2개의 코딩 영역 및 적어도 하나의 헤어핀을 포함하는 것을 포함하고;
    B1은 위치적 빌딩 블록이고 M은 1 내지 20의 정수를 나타내고;
    B2는 위치적 빌딩 블록이고 K는 1 내지 20의 정수를 나타내고, 여기서 B1 및 B2는 동일하거나 상이하고, 여기서 M 및 K는 동일하거나 상이하고;
    L1은 B1을 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
    L2는 B2를 G'에 작동적으로 연결하는 링커이고;
    O는 0 내지 5의 정수이고;
    P는 0 내지 5의 정수이며;
    단, O 및 P 중 적어도 하나는 1 내지 5의 정수이고;
    여기서 위치 M에서의 각각의 위치적 빌딩 블록 B1 및/또는 위치 K에서의 B2는 G'의 1 내지 5개의 코딩 영역에 의해 식별된다.
  12. 제1항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하며:
    제1 방향으로 분리 매질을 가로질러 제1 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질 내의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하는 단계,
    여기서 제1 분리 처리는 제1 전압 프로토콜 및 제1 지속기간을 포함하는 것인
    방법.
  13. 제12항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    제1 방향에 실질적으로 수직인 제1 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하며:
    제2 방향으로 분리 매질을 가로질러 제2 분리 처리를 적용함으로써 적어도 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 분리 매질의 적어도 2개의 별도의 위치로 분리하며, 여기서 제2 방향은 제1 방향에 실질적으로 수직인 단계,
    여기서 제2 분리 처리는 제2 전압 프로토콜 및 제2 지속기간을 포함하는 것인
    방법.
  15. 제14항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    제1 세그먼트화 방향에 실질적으로 수직인 제2 세그먼트화 방향으로 분리 매질로부터 적어도 하나의 위치를 세그먼트화하여 적어도 하나의 분해된 세그먼트를 형성함으로써 적어도 하나의 분해된 올리고뉴클레오티드 코딩된 분자를 수거하는 단계.
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