CN116802265A - 选择性酶促胶凝 - Google Patents

选择性酶促胶凝 Download PDF

Info

Publication number
CN116802265A
CN116802265A CN202180074478.7A CN202180074478A CN116802265A CN 116802265 A CN116802265 A CN 116802265A CN 202180074478 A CN202180074478 A CN 202180074478A CN 116802265 A CN116802265 A CN 116802265A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
moiety
nucleic acid
beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180074478.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·戈希尔
J·德莱尼
Y·罗
A·罗威
J·C·贝尔
M·J·T·斯图宾顿
W·J·麦克唐奈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
10X Genomics Inc
Original Assignee
10X Genomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 10X Genomics Inc filed Critical 10X Genomics Inc
Priority claimed from PCT/US2021/051542 external-priority patent/WO2022066760A1/en
Publication of CN116802265A publication Critical patent/CN116802265A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开提供了用于包含在分区中的细胞例如免疫细胞的选择性酶促胶凝的方法、组合物和系统。

Description

选择性酶促胶凝
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年9月23日提交的美国临时专利申请号63/082,325和2021年5月26日提交的美国临时专利申请号63/193,571的优先权，这些申请的公开内容(包括任何附图)全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于生物颗粒的选择性酶促胶凝的组合物、系统和方法，所述生物颗粒诸如为分区中包含的细胞(例如，免疫细胞)或细胞核。
背景技术
微观生物样品(诸如单独细胞)可以在单独分区(诸如液滴)中分离和隔离，这允许单独样品经受多种过程。例如，包含单细胞的液滴可以与包含不同类型的细胞的其他液滴流体地隔离，从而实现液滴中的相应环境的准确控制。可以培养分区中的单细胞，使其经受化学或生物化学刺激或物理过程(诸如加热、冷却)或化学反应。可以使用诸如PCR和/或测序的过程定性或定量地处理细胞中的变化和/或分区中产生的物类。从对单独细胞进行此类过程中获得的信息可以允许疾病状态诸如癌症的早期检测。
WO2019/071039公开了用于通过以下方式制备包含细胞、细胞核或源自细胞或细胞核的一种或多种组分的水凝胶的系统和方法：生成包含细胞和具有交联前体的多种聚合物的分区，所述交联前体通过点击化学进行交联反应以在包含细胞的分区中形成水凝胶。
使用HRP催化的酚类聚合物的交联生成水凝胶已经用于多种药物递送和组织工程应用中。参见例如S.Sakai,Y.Liu,M.Sengoku,M.Taya.“Cell-selective encapsulationin hydrogel sheaths via biospecific identification and biochemical cross-linking.”Biomaterials 53(2015)494-501；S.V.Gohil,S.B.Brittain,H.Kan,H.Drissi,D.W.Rowe,L.S.Nair.“Evaluation of enzymatically crosslinked injectable glycolchitosan hydrogel.”J.Mater.Chem.B 3(2015)5511-5522。
仍然需要提供包含细胞的分区的选择性胶凝的组合物和方法，以提供被水凝胶包封的特定细胞。本公开满足了这些和其他需求。
发明内容
本公开总体上尤其涉及可用于制备带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的方法，以及在该方法中使用的和/或由该方法产生的组合物。
在至少一个实施方案中，本公开提供了一种方法，该方法包括：
(a)生成分区，该分区包含：(i)包含多个交联催化部分的细胞，该多个交联催化部分通过含膜锚部分的接头连接至其膜；和(ii)包含交联前体部分的线型聚合物；
(b)使该分区与交联形成引发剂接触；由此形成所述细胞的水凝胶涂层；以及
(c)裂解该接头；由此释放所述交联催化部分，使得所述细胞的水凝胶涂层程度增加。
如本文所述的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个特征。在本公开的方法的至少一个实施方案中，细胞的水凝胶涂层程度增加的特征在于涂层的厚度增加。
在该方法的至少一个实施方案中，水凝胶涂层的厚度为至少5μm、至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少120μm、至少150μm、至少200μm或更多；任选地，其中水凝胶涂层的平均厚度为约5μm至约200μm、约25μm至约175μm、约30μm至约150μm或约50μm至约150μm。在至少一个实施方案中，该分区是离散液滴。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，膜锚部分选自细胞膜的生物相容性锚定物(Biocompatible Anchor for cell Membrane，BAM)部分；针对细胞膜蛋白的抗体；胆固醇-寡核苷酸部分；3’-胆固醇-TEG部分；胆固醇装饰的聚合物；靶抗原。在至少一个实施方案中，膜锚部分是包含油烯基部分的BAM部分；任选地，其中BAM部分包含油烯基-O-(CH2CH2O)n-CO-CH2CH2-COO部分，其中聚乙二醇基团的数量n为这样的数量，使得该部分具有至少2000、至少4000或至少8000的分子量。在至少一个实施方案中，膜锚部分是针对细胞表面蛋白的抗体；任选地，其中所述细胞表面蛋白是分化簇(“CD”)蛋白。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，交联催化部分是选自以下的酶：过氧化物酶(例如，HRP)；转谷氨酰胺酶；酪氨酸酶；和漆酶。在至少一个实施方案中，交联催化部分是选自血色素和伞形酮的非酶化合物。在至少一个实施方案中，交联形成引发剂包含酶共底物，诸如含过氧化物部分的化合物；任选地，其中共底物是H2O2。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，交联催化部分是过氧化物酶(例如，HRP)，交联前体部分是酚基，并且交联形成引发剂是酶共底物，诸如过氧化物化合物(例如，H2O2)。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，交联形成引发剂包含在胶束中。在至少一个实施方案中，使该分区与交联形成引发剂接触包括胶束介导的共底物向该分区中的转运。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，该接头包含可裂解部分；任选地，其中可裂解部分选自二硫化物间隔序列部分；氨基甲酸酯间隔序列部分；可光解的间隔序列；和UDG可裂解的间隔序列。在至少一个实施方案中，裂解该接头包括使该分区与选自DTT和DETA的试剂接触。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，线型聚合物选自烯烃共聚物、聚烯烃、丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(噁唑啉)、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。在至少一个实施方案中，线型聚合物还包含可修饰侧链；任选地，其中所述可修饰侧链包含胺部分。在至少一个实施方案中，该方法还包括在合适的反应条件下使带水凝胶涂层的细胞与可检测标签部分接触，该可检测标签部分包含能够与水凝胶的可修饰侧链形成共价键的基团。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，该方法还包括在合适的反应条件下使带水凝胶涂层的细胞与固相基底的表面接触，其中该表面包含能够在该反应条件下与水凝胶的可修饰侧链形成共价键的基团，由此带水凝胶涂层的细胞共价连接至固相基底。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，该细胞是免疫细胞。在至少一个实施方案中，免疫细胞表达抗原结合分子(ABM)或其抗原结合片段。在至少一个实施方案中，ABM选自由抗体或其功能片段、免疫受体和免疫球蛋白组成的组。在至少一个实施方案中，ABM是免疫球蛋白(Ig)。在至少一个实施方案中，Ig选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM组成的组。在至少一个实施方案中，Ig是IgG。
在至少一个实施方案中，膜锚部分是靶抗原。
在至少一个实施方案中，该方法还包括在(a)生成该分区之前，使免疫细胞与靶抗原接触(多个交联催化部分通过含膜锚部分的接头连接至其膜)，其中该接触提供结合于靶抗原(连接至交联催化部分)的免疫细胞。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，免疫细胞是B细胞。在至少一个实施方案中，靶抗原选自由可溶性蛋白、短多肽、病毒样颗粒和膜结合蛋白组成的组。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在至少一个实施方案中，靶抗原选自由pMHC单体和多聚体组成的组。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，该方法还包括在(b)分隔之后，隔离和/或富集结合于靶抗原的免疫细胞。
在本公开的至少一个实施方案中，靶抗原偶联至第一报告寡核苷酸。
在本公开的至少一个实施方案中，ABM或其抗原结合片段偶联至第二报告寡核苷酸。在至少一个实施方案中，第一报告核苷酸和/或第二报告核苷酸缀合至标记剂。在至少一个实施方案中，标记剂是磁性的或有荧光的。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，该分区还包含具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。在至少一个实施方案中，该方法还包括在该分区中生成条形码化核酸分子，其中条形码化核酸分子包含：(i)第一条形码化核酸分子，该第一条形码化核酸分子包含第一报告寡核苷酸或第二报告寡核苷酸的序列或其反向互补序列以及分区特异性条形码序列或其反向互补序列。在附加实施方案中，条形码化核酸分子还包含：(ii)第二条形码化核酸分子，该第二条形码化核酸分子包含编码由免疫细胞表达的ABM或其抗原结合片段的至少一部分的核酸序列或其反向互补序列以及分区特异性条形码序列或其反向互补序列。在至少一个实施方案中，第一条形码化核酸分子和/或第二条形码化核酸分子还包含UMI序列。
在本公开的方法的至少一个实施方案中，该方法还包括确定第一条形码化核酸分子和第二条形码化核酸分子的序列。在至少一个实施方案中，该方法还包括基于第二条形码化核酸分子的确定的序列来鉴定和/或表征ABM或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，基于第二条形码化核酸分子的确定的序列来鉴定ABM或抗原结合片段。在一些实施方案中，确定的序列包含核苷酸序列。在一些实施方案中，确定的序列包含氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括基于生成的第一条形码化核酸分子来评估ABM或其抗原结合片段的亲和力。在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括使所述免疫细胞与以下物质接触：(i)对所述免疫细胞有很少或没有结合亲和力或者疑似有很少或没有结合亲和力的阴性对照抗原；和/或(ii)对所述免疫细胞有或疑似有结合亲和力的阳性对照剂。
在另一方面，本公开还提供了包含使用本文所公开的方法制备的带水凝胶涂层的细胞的组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了包含带水凝胶涂层的细胞的组合物，其中水凝胶涂层的厚度为至少5μm、至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少120μm、至少150μm、至少200μm或更多；任选地，其中水凝胶涂层的平均厚度为约5μm至约200μm、约25μm至约175μm、约30μm至约150μm或约50μm至约150μm。
如本文所述的组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个特征。在至少一个实施方案中，该细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。
在本公开的组合物的至少一个实施方案中，带水凝胶涂层的细胞进一步包含在分区中；任选地，其中该分区是离散液滴。
在本公开的组合物的至少一个实施方案中，该细胞包含通过膜锚部分连接至其膜的多个接头。在至少一个实施方案中，多个接头以至少约500个分子/μm2、至少约1000个分子/μm2、至少约1500个分子/μm2、至少约2000个分子/μm2、至少约5000个分子/μm2或至少约10,000个分子/μm2的平均表面浓度；任选地，约500个分子/μm2至约15,000个分子/μm2、约1000个分子/μm2至约10,000个分子/μm2、约1500个分子/μm2至约7500个分子/μm2或约2000个分子/μm2至约5000个分子/μm2的浓度连接至该细胞。
在至少一个实施方案中，膜锚部分选自：细胞膜的生物相容性锚定物(BAM)部分；针对细胞表面蛋白的抗体；油烯基-PEG部分；胆固醇-寡核苷酸部分；3’-胆固醇-TEG部分；胆固醇装饰的聚合物；和靶抗原。
在本公开的组合物的至少一个实施方案中，水凝胶包含交联的线型聚合物，其中交联包含酚部分。在至少一个实施方案中，该组合物还包含分布于整个水凝胶中的交联催化酶，其中该酶不连接至该细胞或线型聚合物；任选地，其中交联催化酶选自辣根过氧化物酶(HRP)；转谷氨酰胺酶；酪氨酸酶；和漆酶。
在本公开的组合物的至少一个实施方案中，交联的线型聚合物选自烯烃共聚物、聚烯烃、丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(噁唑啉)、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯或它们的组合。在至少一个实施方案中，交联的线型聚合物还包含可修饰侧链。在至少一个实施方案中，所述可修饰侧链包含胺部分；任选地，其中所述胺部分是氨基烷基部分；任选地，其中所述氨基烷基部分是氨基丙基基团。
在本公开的组合物的至少一个实施方案中，该组合物还包含通过其5’端或3’端连接至水凝胶的可修饰侧链的寡核苷酸。
在本公开的组合物的至少一个实施方案中，该组合物还包含连接至水凝胶的可修饰侧链的可检测标签部分。
在至少一个实施方案中，本公开还提供了一种细胞选择方法，该方法包括：(a)用包含催化部分的标记剂标记多个细胞，从而提供多个标记的细胞中的标记的细胞，其中所述标记的细胞包含所述催化部分；(b)分隔所述多个细胞以提供多个分区，其中所述多个分区包括(i)包含所述标记的细胞和多种线型聚合物的第一分区以及(ii)包含未标记的细胞的第二分区；(c)使所述第一分区经受一定条件以允许在所述标记的细胞上形成聚合物涂层，其中所述形成由所述催化部分使用所述多种线型聚合物在所述分区中催化；(d)从所述多个分区中取出所述多个细胞以提供包含来自所述第一分区的所述带聚合物涂层的标记的细胞和来自所述第二分区的所述未标记的细胞的细胞混合物；以及(e)将所述带聚合物涂层的标记的细胞从所述未标记的细胞分离以允许所述带聚合物涂层的标记的细胞的进一步处理。
在用于细胞选择的方法的至少一个实施方案中，所述分区还包含催化剂以促进带聚合物涂层的标记的细胞的形成。
在用于细胞选择的方法的至少一个实施方案中，所述催化部分共价连接至所述标记剂；任选地，其中所述催化部分经由可裂解接头共价连接至所述标记剂。
在用于细胞选择的方法的至少一个实施方案中，所述分区还包含裂解剂；任选地，其中步骤(c)的所述条件允许通过裂解剂来裂解可裂解接头。在至少一个实施方案中，所述裂解从标记剂释放催化部分。在至少一个实施方案中，释放的催化部分使得标记的细胞的聚合物涂层程度增加。
在用于细胞选择的方法的至少一个实施方案中，所述标记剂还包含报告寡核苷酸。
在用于细胞选择的方法的至少一个实施方案中，该方法还包括在(b)分隔之后，隔离和/或富集多个标记的细胞。
在用于细胞选择的方法的一个实施方案中，该方法还包括一种或多种参考抗原。在至少一个实施方案中，一种或多种参考抗原包含(i)对所述免疫细胞有很少或没有结合亲和力或者疑似有很少或没有结合亲和力的阴性对照抗原；和/或(ii)对所述免疫细胞有或疑似有结合亲和力的阳性对照剂。
附图说明
图1描绘了用于制备通过可裂解接头连接至辣根过氧化物酶(“HRP”)酶部分的BAM部分的示例性方案。
图2描绘了使用如图1中所描绘的那样制备的BAM-接头-酶部分来制备用酶部分修饰(或“装饰”)的细胞的示例性步骤
图3描绘了具有3’-胆固醇细胞锚部分的5’-生物素修饰的寡核苷酸用于装饰细胞的示例性用途。
图4描绘了用于进一步用HRP-链霉亲和素部分修饰先前用5’-生物素-寡核苷酸装饰的细胞的示例性方案。
图5描绘了用于经由抗体结合于细胞表面蛋白或抗原来生成酶装饰的细胞的示例性过程。
图6描绘了用链霉亲和素-酶缀合物对生物素-抗体装饰的细胞进行的示例性处理，从而得到酶装饰的细胞。
图7描绘了用于在存在共底物H2O2的情况下过氧化物酶催化的酚修饰的线型聚合物的交联以形成水凝胶基质的示例性方案。
图8描绘了用于制备能够进行酶催化的交联以形成水凝胶基质的酚修饰的线型聚合物的示例性3步方案。
图9描绘了用于使用通过包含可裂解二硫化物部分的接头连接的酚基来修饰聚丙烯酰胺的示例性反应方案。
图10描绘了示例性离散液滴分区，该离散液滴分区包含通过具有可裂解二硫化物部分的接头来装饰上HRP酶部分的细胞以及用酚基修饰的线型聚合物。
图11描绘了在存在共底物H2O2(未示出)的情况下HRP装饰的细胞周围酚交联的水凝胶基质的初始形成。
图12描绘了在二硫化物接头裂解(这允许HRP部分扩散到线型聚合物溶液的先前未交联的部分中)之后酚交联的水凝胶基质在该细胞周围延伸到更大厚度。
图13示出了用于生成包含单独生物颗粒诸如酶装饰的细胞和线型聚合物的分区的微流体通道结构的实例。
图14示出了用于将珠粒上的条形码递送到分区中的微流体通道结构的实例。
图15示出了用于共同分隔酶装饰的细胞、线型聚合物、条形码和其他试剂的微流体通道结构的实例。
图16示出了用于受控分隔成离散液滴的微流体通道结构的实例。
图17示出了用于实现增加的离散液滴生成通量的微流体通道结构的实例。
图18示出了用于实现增加的离散液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。
图19描绘了BAM接头的结构以及用于如实施例1中所述的那样制备用于装饰细胞的BAM-HRP部分的反应方案。
图20描绘了用于使用细胞特异性HRP装饰和胶凝来选择细胞的示例性工作流程。
图21描绘了根据本公开的一些非限制性实施方案的示例性工作流程，该工作流程可以用于通过抗原结合细胞的选择性胶凝来鉴定和/或表征新型抗原结合分子(例如，BCR、TCR及其片段)。
图22示意性地示出了示例微孔阵列。
图23示出了示例性携带条形码的珠粒
图24示出了携带条形码的珠粒的另一个实例
图25示意性地示出了用于处理核酸分子的示例工作流程。
图26示意性地示出了标记剂的实例。
图27描绘了携带条形码的珠粒的实例。
图28A、图28B和图28C示意性地描绘了用于处理核酸分子的示例工作流程。
图29描绘了示出根据一些示例实施方案的计算系统的实例的框图。
具体实施方式
本公开总体上尤其涉及带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)组合物及其制备方法。在一个实施方案中，水凝胶涂覆通过两步酶催化胶凝过程进行。所公开的方法适用于用水凝胶以一定厚度选择性地涂覆生物颗粒，诸如细胞，例如免疫细胞或细胞核，该厚度基本上比由已知方法产生的细胞的水凝胶鞘更厚(例如，至少约5μm至约200μm)。本公开的带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)在一系列单细胞、单细胞珠粒或单细胞核测定法中基本上更稳固、更有用。简而言之，本公开的方法涉及(a)生成分区，该分区包含：(i)包含多个交联催化部分的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)，该多个交联催化部分通过含膜锚部分的接头连接至其膜；和(ii)包含交联前体部分的线型聚合物；(b)使包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的分区与交联形成引发剂接触，由此膜系留酶部分催化线型聚合物交联以在生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)周围形成初始水凝胶涂层；以及(c)裂解将酶部分系留至生物颗粒(例如，细胞膜或核膜)的接头，从而允许酶部分远离生物颗粒(例如，细胞或细胞核)扩散并且催化生物颗粒(例如，细胞或细胞核)周围的水凝胶涂层的厚度的增长。因此所述方法可以提供带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)组合物，其中水凝胶涂层的平均厚度为约5μm至约200μm。如本文其他地方所述，对所述方法和组合物的进一步修改允许由生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)群体制备水凝胶选择性地涂覆的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)，然后可以进一步在各种基于分区的测定法中操纵和使用这些生物颗粒。
虽然本文描述了本公开的各种实施方案，但是本领域技术人员将认识到，这些实施方案仅作为示例来提供。在不脱离本公开的一般概念的情况下，本领域技术人员可以想到所公开的实施方案的许多变型、变化和替代。应当理解，可以采用本文所述的实施方案的各种替代形式。
定义
对于本文的描述和所附权利要求书，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个”和“一种”包括多个指代物。例如，术语“细胞”包括一个或多个细胞，包括其混合物。“A和/或B”在本文中用于包括所有以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”和“A和B”。因此，例如，对“蛋白质”的引用包括超过一种蛋白质，并且对“化合物”的引用是指超过一种化合物。“包含”、“含有”、“具有”和“包括”的使用可互换并且不旨在是限制性的。还应当理解，在各种实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些具体情况下，可以另选地使用“基本上由...组成”或“由...组成”的语言来描述实施方案。
如本文所用，术语“生物颗粒”一般是指来源于生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是大分子。生物颗粒可以是小分子。生物颗粒可以是病毒，例如噬菌体。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是细胞器。来自细胞的细胞器的实例包括但不限于细胞核、内质网、核糖体、高尔基氏体、内质网、叶绿体、胞吞囊泡、胞吐囊泡、液泡和溶酶体。生物颗粒可以是来自细胞群的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或无论从单细胞生物体还是多细胞生物体衍生的任何其他细胞类型。生物颗粒可以是细胞的成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以是或可以包括基质(例如，凝胶或聚合物基质)，该基质包含细胞或来自细胞的一种或多种成分(例如，细胞珠粒)，诸如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以获自受试者的组织。生物颗粒可以是硬化的细胞。此类硬化的细胞可以包括或可以不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或多种成分，但是可以不包括细胞的其他成分。此类成分的实例是细胞核或细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以是能够被培养的，例如，当被封闭在凝胶或聚合物基质中时被培养，或者当包含凝胶或聚合物基质时被培养。
如本文所用，术语“样品”一般是指受试者的生物样品。样品可以是组织样品，诸如活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是流体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。
在提供值范围的情况下，除非上下文另有明确规定，否则应当理解，在该范围的上限和下限之间的值的每个中间整数和值的每个中间整数的每十分之一(除非上下文另有明确规定)以及在该陈述范围中的任何其他陈述或居间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本发明内，但受制于陈述的范围中的任何具体排除的极限。在陈述的范围包括这些极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的(i)任一个或(ii)两个极限的范围也包括在本发明中。例如，“1至50”包括“2至25”、“5至20”、“25至50”、“1至10”等。
本公开中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献都据此全文以引用的方式并入以用于所有目的，达到与单独地指示每个单独出版物、专利、专利申请或其他文献以引用的方式并入本文以用于所有目的的相同程度。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案，而不旨在是限制性的。出于解释本公开的目的，以下对术语的描述将适用，并且在适当的情况下，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
本公开总体上尤其涉及可用于制备带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)组合物的方法，所述生物颗粒组合物可用于一系列基于分区的单细胞、单细胞珠粒或单细胞核方法和测定法。具体地讲，本公开的一些实施方案涉及一种制备带水凝胶涂层的细胞(或细胞珠粒或细胞核)组合物的方法，该方法包括：
(a)生成分区，该分区包含：(i)包含多个交联催化部分的细胞，该多个交联催化部分通过含膜锚部分的接头连接至其膜；和(ii)包含交联前体部分的线型聚合物；
(b)使该分区与交联形成引发剂接触；由此形成所述细胞的水凝胶涂层；以及
(c)裂解该接头；由此释放交联催化部分并且该细胞的水凝胶涂层的厚度增加。
生物颗粒
本文所公开的方法和组合物中的生物颗粒包括但不限于细胞、细胞珠粒或细胞核。细胞、细胞珠粒或细胞核可以获自或来源于组织样品、受试者或细胞系。可以用例如载体构建体对细胞进行基因工程改造(例如，转导或转化或转染)，该载体构建体可以是例如病毒载体或包含与宿主细胞的基因组的一部分同源的核酸序列的同源重组载体，或可以是用于表达感兴趣的多肽的表达载体。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。
在一些实施方案中，重组细胞或工程化细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，该细胞是离体的。在一些实施方案中，该细胞是体内的。在一些实施方案中，工程化细胞是真核细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是动物细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是人类细胞。在一些实施方案中，该细胞是非人灵长类细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞、或干细胞。在一些实施方案中，该细胞是干细胞。在一些实施方案中，该细胞是造血干细胞。
在一些实施方案中，重组细胞或工程化细胞是免疫细胞，例如淋巴细胞(例如，T细胞或NK细胞)或树突细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助T细胞(TH)、细胞毒性T细胞(TCTL)或其他T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，该细胞是前体T细胞或T调节(Treg)细胞。在一些实施方案中，该细胞是CD34+、CD8+或CD4+细胞。在一些实施方案中，该细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其选自由初始CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和批量CD8+T细胞组成的组。在该细胞的一些实施方案中，该细胞是CD4+T辅助淋巴细胞，其选自由初始CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和批量CD4+T细胞组成的组。在一些实施方案中，该细胞可以通过对获自个体的样品执行白细胞单采术来获得。在一些实施方案中，受试者是人类患者。
生物颗粒的标记
本公开提供了用于作为本文所述生物颗粒选择工作流程的一部分的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的标记的方法和系统。例如，单一或集成过程工作流程可以允许生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的细胞分析物的标记以达到鉴定、富集或选择此类标记的生物颗粒的目的。标记剂通常将能够或配置为与细胞膜或核膜或者细胞膜或核膜处的特征(例如，表面蛋白)相互作用或偶联并且将包含允许下游生物颗粒(例如，细胞或细胞核)选择的交联催化部分(例如，交联催化酶，诸如HRP，如本文其他地方所述)。如本文所用，术语“标记剂”通常是指能够与生物颗粒(诸如细胞或细胞核)的某部分相互作用的试剂，该部分包括但不限于细胞膜或核膜、细胞膜或核膜之上和/或之内的分子、细胞的细胞内分子等。该试剂与细胞、细胞珠粒或细胞核的某部分之间的相互作用可以是共价相互作用或非共价相互作用、可逆相互作用或不可逆相互作用。该试剂可以对细胞、细胞珠粒或细胞核的某部分具有特异性，该部分包括但不限于细胞、细胞珠粒或细胞核的生物分子(例如，多肽、核酸、脂质等)。在一些实施方案中，标记剂可以对生物靶标诸如抗体或抗体片段具有特异性。
在本文所述的方法和系统中，能够结合于或以其他方式偶联至一个或多个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)特征的一种或多种标记剂可以用于标记此类特征。在一些情况下，生物颗粒特征包括细胞表面特征和细胞核特征。细胞表面特征可以包括但不限于受体、抗原、细胞表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用、蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接或它们的任何组合。细胞核特征可以包括但不限于核膜或核膜蛋白或任何其他核蛋白。
在至少一个实施方案中，细胞特征是细胞表面蛋白，诸如分化簇(CD)蛋白。多种多样的CD蛋白及其同源抗体是本领域中已知的。CD细胞表面蛋白及其抗CD抗体通常用于例如使用流式细胞术鉴定、标记、分选和选择特定细胞类型。设想了本领域中已知的任何CD细胞表面蛋白及其相关联的抗CD抗体可以用于根据本公开的方法和组合物利用交联催化部分进行细胞标记或装饰。例如，下表1中所示的特定细胞类型的任何下述CD细胞表面蛋白标记物可以用于根据本公开的方法来标记细胞。
表1
在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、抗原、抗原片段、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、Darpin、蛋白质支架和靶抗原或它们的任何组合。
在一些实施方案中，标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞表面特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴定标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；以及美国专利公开20190367969。
如上所讨论，在特定实例中，可以提供潜在细胞特征标记剂的文库，其中相应细胞特征标记剂与核酸报告分子相关联，使得不同报告寡核苷酸序列与能够结合于特异性细胞特征的每种标记剂相关联。在一些实施方案中，细胞特征标记剂包含如本文所公开的靶抗原和靶抗原的片段。在一些实施方案中，细胞特征标记剂包含靶抗原的多个不重叠的片段。在其他方面，该文库的不同成员的特征可在于不同寡核苷酸序列标签的存在。例如，能够结合于靶蛋白的抗体可以具有与之相关联的第一报告寡核苷酸序列，而能够结合于靶抗原的一个或多个片段的抗体(其可以是相同抗体)可以具有与之相关联的不同(或附加(如果是相同抗体的话))报告寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列的存在可以指示特定抗体或者可由特定抗体识别或结合的细胞特征的存在。
能够结合于或以其他方式偶联至一个或多个细胞的标记剂可以用于将细胞表征为属于特定细胞组。例如，标记剂可以用于标记细胞的样品，例如以提供样品索引。又例如，标记剂可以用于标记属于特定实验条件的一组细胞。这样，一组细胞可以被标记为不同于另一组细胞。在一个实例中，第一组细胞可以源自第一样品，并且第二组细胞可以源自第二样品。标记剂可以允许第一组和第二组具有不同标记剂(或与标记剂相关联的报告寡核苷酸)。这可以例如促进多重分析，其中第一组的细胞和第二组的细胞可以被单独地标记，然后合并在一起以进行下游分析。标签的下游检测可以将分析物指示为属于特定细胞组。
例如，报告寡核苷酸可以连接至抗体或其表位结合片段，并且标记细胞可以包括使抗体连接的条形码分子或表位结合片段连接的条形码分子经受适用于将抗体结合于细胞表面上存在的分子的条件。抗体或其表位结合片段与表面上存在的分子之间的结合亲和力可以在所需范围内，以确保抗体或其表位结合片段保持与分子结合。例如，结合亲和力可以在所需范围内，以确保抗体或其表位结合片段在各种样品处理步骤(例如分隔和/或核酸扩增或延伸)期间保持与分子结合。抗体或其表位结合片段和它与之结合的分子之间的解离常数(Kd)可以小于约100μM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM或1pM。例如，解离常数可以小于约10μM。在一些实施方案中，抗体或其表位结合片段具有所需的解离速率(koff)，使得抗体或其抗原结合片段在各种样品处理步骤期间保持与靶抗原或抗原片段结合。
在另一个实例中，报告寡核苷酸可以偶联至细胞穿透肽(CPP)，并且标记细胞可以包括将CPP偶联的报告寡核苷酸递送到生物颗粒中。标记生物颗粒可以包括由细胞穿透肽将CPP缀合的寡核苷酸递送到细胞和/或细胞珠粒中。可以用于本文所提供的方法中的CPP可以包括至少一个无功能半胱氨酸残基，其可以是游离的或被衍生化以与已针对此类连接进行修饰的寡核苷酸形成二硫键。可以用于本文实施方案中的CPP的非限制性实例包括渗透素、转运素、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。可用于本文提供的方法中的细胞穿透肽可以具有诱导细胞群体的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％细胞的细胞穿透的能力。CPP可以是富含精氨酸的肽转运载体。CPP可以是渗透素或Tat肽。在另一个实例中，报告寡核苷酸可以偶联至荧光团或染料，并且标记细胞可以包括使荧光团连接的条形码分子经受适用于将荧光团结合于细胞表面的条件。在一些情况下，荧光团可以与脂质双层强烈地相互作用，并且标记细胞可以包括使荧光团连接的条形码分子经受一定条件，使得荧光团结合于细胞膜或插入细胞膜中。在一些情况下，荧光团是水溶性的有机荧光团。在一些情况下，荧光团是Alexa 532马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR马来酰亚胺)、BODIPY-TMR马来酰亚胺、Sulfo-Cy3马来酰亚胺、Alexa 546羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 550马来酰亚胺、Cy3羧酸/琥珀酰亚胺酯、Cy3B羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 565生物素、磺酰罗丹明B、Alexa 594马来酰亚胺、Texas Red马来酰亚胺、Alexa 633马来酰亚胺、Abberior STAR 635P叠氮化物、Atto 647N马来酰亚胺、Atto647SE或Sulfo-Cy5马来酰亚胺。参见例如Hughes L D等人,PLoS One.2014年2月4日；9(2):e87649，了解有机荧光团的描述。
报告寡核苷酸可以偶联至亲脂分子，并且标记细胞可以包括由亲脂分子将核酸条形码分子递送到细胞膜或核膜。亲脂分子可以与脂质膜(诸如细胞膜和核膜)缔合和/或插入这些脂质膜中。在一些情况下，插入可以是可逆的。在一些情况下，亲脂分子与细胞膜或核膜之间的结合可以是这样的，使得膜在后续处理(例如，分隔、细胞渗透化、扩增、合并等)期间保留亲脂分子(例如，以及其缔合的组分，例如核酸条形码分子)。报告核苷酸可以进入细胞内间隙和/或细胞核。在一些实施方案中，偶联至亲脂分子的报告寡核苷酸将经由亲脂分子保持与脂质膜(如本文所述)缔合和/或插入脂质膜中，直到例如在分区内发生细胞裂解。PCT/US2018/064600中描述了偶联至报告寡核苷酸的亲脂分子的示例性实施方案。
报告寡核苷酸可以是核酸分子的一部分(包括如本文其他地方所述的任何数量的功能序列，诸如靶标捕获序列、随机引物序列等)，并且偶联至作为分析物或衍生自分析物的另一核酸分子。
在分隔之前，可以将细胞与标记剂的文库一起温育，这些标记剂可以是对一组广泛的不同细胞特征(例如，受体、蛋白质等)的标记剂，并且包括其相关联的报告寡核苷酸。可以将未结合的标记剂从细胞洗去，然后可以将细胞与分区特异性条形码寡核苷酸(例如，连接至支持物，诸如珠粒或凝胶珠粒)一起共同分隔(例如，共同分隔到液滴或孔中)，如本文其他地方所述。因此，分区可以包括一个或多个细胞以及结合的标记剂及其已知的相关联的报告寡核苷酸。
在其他情况下，例如为了促进样品多重分析，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。例如，第一多种标记剂和第二多种标记剂可以与不同细胞、细胞群或样品相互作用，从而允许特定报告寡核苷酸指示特定细胞群(或细胞或样品)和细胞特征。这样，可以对不同样品或群组进行独立处理并且随后组合在一起以进行合并分析(例如，如本文其他地方所述的基于分区的条形码化)。参见例如美国专利公开20190323088。
在一些实施方案中，为了促进样品多重分析，可以使用脂质标签诸如胆固醇修饰的寡核苷酸(CMO，参见例如图7)、抗钙通道抗体或抗ACTB抗体对单独样品进行染色。抗钙通道抗体的非限制性实例包括抗KCNN4抗体、抗BK通道β3抗体、抗a1B钙通道抗体和抗CACNA1A抗体。适用于本公开的方法的抗ACTB抗体的实例包括但不限于mAbGEa、ACTN05、AC-15、15G5A11/E2、BA3R和HHF35。
如本文其他地方所述，标记剂的文库可以与特定细胞特征相关联以及用于将分析物鉴定为源自特定细胞群或样品。可以将细胞群与多个文库一起温育，使得一个或多个细胞包含多种标记剂。例如，细胞可以包括与之偶联的亲脂标记剂和抗体。亲脂标记剂可以指示细胞是特定细胞样品的成员，而抗体可以指示细胞包含特定分析物。这样，报告寡核苷酸和标记剂可以允许执行多分析物多重分析。
在一些情况下，这些报告寡核苷酸可以包括核酸条形码序列，其允许鉴定报告寡核苷酸与之偶联的标记试剂。使用寡核苷酸作为报告分子可以提供以下优点：能够在序列方面生成显著多样性，同时也易于连接至大多数生物分子例如抗体等，以及例如使用测序或阵列技术易于检测。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，报告寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从Innova Biosciences获得的抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗原或抗原片段、抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体(或生物素酰化抗原或生物素酰化抗原片段)和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling and AffinityPurification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552。此外，点击反应化学诸如甲基四嗪-PEG5-NHS酯反应、TCO-PEG4-NHS酯反应等可以用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。可商购获得的试剂盒，例如来自Thunderlink和Abcam的试剂盒，以及本领域常用的技术，可以用于在适当时将报告寡核苷酸偶联至标记试剂。在另一个实例中，标记试剂间接(例如，经由杂交)偶联至包括鉴定标记试剂的条形码序列的报告寡核苷酸。例如，标记试剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，其包括与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记试剂与报告寡核苷酸偶联。在一些实施方案中，例如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记试剂中释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定的、光不稳定的、热不稳定的等)连接至标记试剂，如本文其他地方对于从支持物中释放分子一般描述的。在一些情况下，本文所述的报告寡核苷酸可以包括可用于后续处理的一个或多个功能序列，诸如衔接子序列、独特分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流通池连接序列(诸如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(诸如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(例如，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合至与报告寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸，并且可以允许该寡核苷酸与报告寡核苷酸杂交。
图20描绘了用于通过胶凝进行细胞选择的细胞标记工作流程的实例。使用缀合至催化部分的标记剂(缀合至交联催化部分辣根过氧化物酶(HRP)的抗体)标记(或“装饰”)混合细胞群。抗体结合于表达感兴趣的第一细胞特征(例如，第一细胞表面蛋白)的那些细胞以提供标记的细胞和未标记的细胞的混合物。细胞混合物与用于选择性胶凝的其他试剂(诸如包含交联前体部分的线型聚合物)一起分隔。也可以在分区中提供用于选择性胶凝的催化剂或共底物。此外，在交联催化部分经由可裂解接头偶联至抗体的情况下，可以将裂解剂引入分区中以裂解交联催化部分(参见图12)。如图20中所描绘，表达第一细胞特征的细胞将在分区内经历选择性胶凝，因为辣根过氧化物酶(HRP)催化在线型聚合物之间形成交联(参见图11)。如图20中进一步描绘，从分区中取出选择性胶凝的细胞和非胶凝的细胞并且分离胶凝的细胞以用于进一步的下游处理。将胶凝的细胞从非胶凝的细胞分离的方法包括基于梯度的方法(例如，Percoll梯度)、离心以及使用可以掺入凝胶基质中的磁性纳米颗粒(参见例如Patrick,Soft Matter,2013年4月9日,第13期,第3439-3682页，该文献全文以引用方式并入本文)。在一个实施方案中，磁性纳米颗粒掺入例如通过涉及如本文所述的包含交联前体部分的线型聚合物和催化剂或共底物的反应来形成于细胞上的凝胶层中。在另一个实施方案中，磁性纳米颗粒在分区(例如，液滴或孔)中掺入凝胶层中。有关用于细胞的胶凝或包封和此类细胞的后续处理的方法、组合物和系统的描述，参见例如美国专利10,428,326以及美国专利公开20190100632，这些专利均全文以引用方式并入。
图21描绘了根据本公开的一些非限制性实施方案的另一个示例性工作流程，该工作流程可以用于通过抗原结合细胞的选择性胶凝来鉴定和/或表征新型抗原结合分子(例如，BCR、TCR及其片段)。使用缀合至催化部分的标记剂(缀合至交联催化部分辣根过氧化物酶(HRP)的靶抗原)标记(或“装饰”)混合免疫细胞群。靶抗原结合于表达感兴趣的第一细胞特征(例如，抗体)的那些细胞以提供标记的免疫细胞和未标记的免疫细胞的混合物。免疫细胞混合物与用于选择性胶凝的其他试剂(诸如包含交联前体部分的线型聚合物)一起分隔。也可以在分区中提供用于选择性胶凝的催化剂或共底物。此外，在交联催化部分经由可裂解接头偶联至抗原的情况下，可以将裂解剂引入分区中以裂解交联催化部分(参见图12)。如图21中所描绘，表达第一细胞特征的细胞将在分区内经历选择性胶凝，因为辣根过氧化物酶(HRP)催化在线型聚合物之间形成交联(参见图11)。如图21中进一步描绘，从分区中取出选择性胶凝的细胞和非胶凝的细胞并且分离胶凝的细胞以用于进一步的下游处理。将胶凝的细胞从非胶凝的细胞分离的方法包括基于梯度的方法(例如，Percoll梯度)、离心以及使用磁性纳米颗粒。有关用于细胞的胶凝或包封和此类细胞的后续处理的方法、组合物和系统的描述，参见例如美国专利10,428,326以及美国专利公开20190100632，这些专利均全文以引用方式并入。
在一个方面，本公开提供了通过感兴趣的细胞的选择性胶凝来进行细胞选择的方法。在一个实施方案中，该方法包括提供多个细胞，该多个细胞包含标记的细胞(或多个标记的细胞)和未标记的细胞(或多个未标记的细胞)。标记的细胞包含细胞标记剂，该细胞标记剂包含催化部分。未标记的细胞不包含或不含细胞标记剂。在另一个实施方案中，标记的细胞可以包含能够偶联至第一细胞表面蛋白(包括第一细胞表面受体)的第一细胞标记剂，例如第一试剂，诸如第一抗体或抗原，以及能够偶联至第二细胞表面蛋白(包括第二细胞表面受体)的第二细胞标记剂，例如第二试剂，诸如第二抗体或抗原。
在其他实施方案中，该方法包括分隔包含标记的细胞和未标记的细胞的多个细胞以提供多个分区，其中所述多个分区包括包含所述标记的细胞和多种线型聚合物的第一分区。多个分区还包括包含未标记的细胞和多种线型聚合物的第二分区。此外，多个分区可以包括附加分区，这些附加分区包括包含附加标记的细胞和多种线型聚合物和/或附加未标记的细胞和多种线型聚合物的附加分区。
在另外的实施方案中，该方法还包括使分区(例如，第一分区、第二分区、附加分区等)经受一定条件以允许在分区内的标记的细胞上形成聚合物涂层。该形成可以由催化部分使用多种线型聚合物在该分区中催化。在另一个实施方案中，该方法还包括从所述多个分区中取出所述多个细胞以提供包含来自所述第一分区的所述带聚合物涂层的标记的细胞和来自所述第二分区的所述未标记的细胞的细胞混合物。在一个实施方案中，取出步骤包括合并来自这些分区的细胞。就乳液形式的液滴而言，取出步骤包括破坏液滴并且合并内容物。就孔或孔阵列而言，取出步骤包括从每个孔中提取细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括将所述带聚合物涂层的标记的细胞从所述未标记的细胞分离以允许所述带聚合物涂层的标记的细胞的进一步处理。图20至图21中进一步描绘了细胞标记方法。
用交联催化部分装饰的细胞的生成
本公开的一般方法的步骤(a)使用已通过将许多交联催化部分连接至细胞膜来修饰(或“装饰”)的细胞。对膜的连接是通过“膜锚部分”进行的，该膜锚部分是指能够与细胞膜发生特异性强力结合相互作用的化学部分或生物化学部分。可以用于本公开的方法和组合物中的一系列膜锚部分是本领域中已知的。可用于本公开的组合物和方法中的已知膜锚部分有：“细胞膜的生物相容性锚定物”(或“BAM”)部分；针对细胞膜蛋白的抗体；胆固醇-寡核苷酸部分；3’-胆固醇-TEG部分；和胆固醇装饰的聚合物。本文描述了也称为细胞标记剂的其他膜锚部分。
在至少一个示例性实施方案中，用于本公开的组合物和方法中的膜锚部分是具有“油烯基-PEG-X”结构的化合物，其也称为“细胞膜的生物相容性锚定物”的“BAM”部分。以下方案1中示出了通用BAM结构。
方案1
BAM化合物的油烯基部分能够进入细胞的质膜，并形成将化合物锚定至细胞的强疏水相互作用。BAM化合物的PEG部分的数量(n)可以变化，从而根据需要改变细胞膜和锚定的生物分子之间的距离。“X”部分是可以与生物分子(诸如酶)形成连接的反应基团，诸如N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)。
在至少一个实施方案中，包含油烯基部分的BAM部分是油烯基-O-(CH2CH2O)n-CO-CH2CH2-COO部分，其中聚乙二醇(PEG)基团的数量n为这样的数量，使得该部分具有至少2000、至少4000或至少8000的分子量。在至少一个实施方案中，PEG部分的数量n为40并且反应基团为NHS，如以下方案2中所示。
方案2
图1描绘了用于制备通过可裂解接头连接至辣根过氧化物酶(“HRP”)酶部分的BAM部分的示例性方案。在第一步骤中，使先前已在可用胺侧链处用N-羟基-琥珀酰亚胺基团(NHS)修饰的HRP酶与胱胺二盐酸盐反应以提供用可裂解二硫化物接头修饰的酶。在第二步骤中，使与HRP酶部分连接的该可裂解二硫化物接头的游离胺与BAM化合物反应以产生通过可裂解接头连接至HRP酶部分的BAM部分。图2描绘了使用如图1中所描绘的那样制备的BAM-接头-酶部分来制备用酶部分修饰(或装饰)的细胞的示例性第三步骤。
一般来讲，可用于本公开的方法和组合物中的可裂解接头部分可以包含任何不稳定键，其可以被引入接头中并选择性地裂解化学或物理刺激。可以用作可裂解接头部分的不稳定键的非限制性实例包括二硫键(例如，可用还原剂裂解的)、酯键(例如，可用酸、碱或羟胺裂解的)、氨基甲酸酯键(例如，可用二亚乙基三胺“DETA”裂解的)、邻二醇键(例如，可经由高碘酸钠裂解的)、狄尔斯–阿尔德(Diels-Alder)键(例如，可经由热裂解的)、砜键(例如，可经由碱裂解的)、甲硅烷基醚键(例如，可经由酸裂解的)、糖苷键(例如，可经由淀粉酶裂解的)、肽键(例如，可经由蛋白酶裂解的)或磷酸二酯键(例如，可经由核酸酶裂解的)。可以用于本公开的方法和组合物中的包含可裂解部分的一系列接头是已知的。参见例如美国专利公开号2019/0100632A1和2019/0233878A1，这些美国专利公开中的每一篇据此以引用方式并入本文。在至少一个实施方案中，将膜锚部分连接至交联催化部分的可裂解接头选自二硫化物间隔序列部分；氨基甲酸酯间隔序列部分；可光解的间隔序列；和UDG可裂解的间隔序列。
普通技术人员将认识到，图1和图2的步骤可以被改变并且仍提供相同的最终膜修饰细胞。例如，BAM部分可以用于装饰细胞，然后可以使具有可裂解接头的酶部分与已经连接至细胞膜的BAM部分的游离反应基团反应。还设想了可以首先将可裂解接头连接至BAM部分，接着将其用于装饰细胞，之后才与酶的游离胺反应以提供装饰的细胞。
在至少一个示例性实施方案中，用于本公开的组合物和方法中的膜锚部分可以是缀合至亲脂部分的寡核苷酸，例如胆固醇-寡核苷酸部分。例如，可以使用标准的自动化寡核苷酸合成和可商购获得的亚磷酰胺试剂(例如，可从美国Integrated DNA Technologies获得)，用3’-胆固醇-TEG部分修饰寡核苷酸。与BAM的油烯基部分一样，3’-胆固醇部分能够进入细胞的质膜并形成将寡核苷酸锚定至细胞表面的强疏水相互作用。也可以使用可商购获得的5’-生物素亚磷酰胺试剂(例如，可从美国Integrated DNA Technologies获得)和标准的自动化寡核苷酸合成，制备具有5’-生物素部分的寡核苷酸。图3描绘了用5’-生物素部分和3’-胆固醇部分修饰的寡核苷酸用于装饰细胞的示意图。所得的细胞具有其表面上可用的生物素部分以由链霉亲和素连接的部分(诸如链霉亲和素修饰的酶)进行进一步修饰。图4提供了进一步用HRP-链霉亲和素部分修饰先前用5’-生物素-寡核苷酸修饰的细胞的示意性描绘。链霉亲和素与蛋白质(诸如HRP)的缀合是本领域中熟知的。链霉亲和素修饰的HRP与经由寡核苷酸连接至细胞表面的生物素部分形成极强非共价结合相互作用，得到HRP装饰的细胞。此外，可以用包含尿嘧啶(U)碱基的序列制备寡核苷酸，从而允许尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)对寡核苷酸的轻松酶促裂解。另选地，在掺入时允许轻松酶促裂解的其他寡核苷酸序列是已知的。
在至少一个实施方案中，设想了可以使用酶经由酶-抗体缀合物与细胞表面抗原的特异性结合来修饰细胞。图5和图6示意性地描绘了用于经由抗体结合于细胞表面抗原来生成酶装饰的细胞的示例性过程。如图5所示，将所需抗体的生物素缀合物在允许特异性结合于抗体所靶向的细胞表面抗原的条件下与细胞一起温育。如图6所示，随后用链霉亲和素-酶缀合物处理生物素-抗体装饰的细胞，该链霉亲和素-酶缀合物强力结合于细胞表面上的生物素部分，从而产生酶装饰的细胞。
使用酶-抗体缀合物装饰细胞的一个优点是其允许基于细胞表面蛋白抗原表达来对细胞类型进行选择性靶向。在至少一个实施方案中，使用结合于仅在特定细胞类型的表面上表达(或过表达)的细胞表面蛋白(诸如分化簇(CD)蛋白)的抗体。如本文其他地方所述，结合于特定细胞表面蛋白或抗原的多种多样的抗体(例如，抗CD抗体)是本领域中已知的。此类抗体可商购获得或可以使用常规抗体制备方法来生成。通过使用靶向细胞类型特异性表面受体的抗体，只有靶向的细胞类型才被装饰上生物素-抗体缀合物，然后被装饰上交联催化部分，诸如HRP酶。因此，使用本文所述的胶凝方法，可以选择性地仅修饰细胞池中的单一细胞类型，然后选择性地在该细胞类型周围形成水凝胶涂层。图20中描绘了用于选择性地使特定细胞类型胶凝的示例性工作流程，如本文其他地方所述。
可以用于本公开的方法和组合物中的一系列交联催化部分是本领域中已知的。可用于所述组合物和方法中的已知交联催化部分有多种酶，包括但不限于过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶或“HRP”)、漆酶、酪氨酸酶或转谷氨酰胺酶。过氧化物酶(诸如HRP)和E.C.1.11.1.7类的相关酶使用共底物过氧化氢(H2O2)催化多种多样的有机底物的氧化。在存在H2O2和具有酚部分的底物的情况下的HRP反应可以使得形成具有使相邻酚部分交联的C-C键的酚-聚合物基质。图7描绘了在存在HRP和共底物的情况下，用酚基修饰的线型聚合物(例如，聚丙烯酰胺)之间发生的示例性酚交联反应。
与HRP类似，漆酶(E.C.1.10.3.2)催化酚底物的氧化，在酚修饰的聚合物之间形成交联，产生聚合物基质。参见例如Jus等人,“Enzymatic cross-linking of gelatin withlaccase and tyrosinase,”Biocatalysis and Biotransformation,第30卷,2012,第86-95页。酪氨酸酶(E.C.1.14.18.1)催化在酚装饰的和胺装饰的聚合物之间形成交联，从而产生聚合物基质。参见例如Kim等人,“Tissue adhesive,rapid forming,and sprayable ECMhydrogel via recombinant tyrosinase crosslinking,”Biomaterials,2018年5月2日,178:401-412。转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)催化在谷氨酰胺装饰的聚合物之间形成交联，从而产生聚合物基质。
因此，在本公开的方法和组合物的至少一个实施方案中，交联催化部分包含选自以下的酶：过氧化物酶(E.C.1.11.1.7)、转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)、酪氨酸酶(E.C.1.14.18.1)和漆酶(E.C.1.10.3.2)。如上所述，每种酶用来形成交联的特定底物和共底物是本领域中已知的。
就过氧化物酶而言，酚底物的交联需要添加包含过氧化物部分的化合物，诸如H2O2，其充当引发交联形成催化的共底物。因此，在本公开的方法和组合物的至少一个实施方案中，交联催化部分是过氧化物酶(例如，HRP)，交联前体部分是酚基，并且交联形成引发剂是H2O2。水溶液中的共底物H2O2的存在连同过氧化物酶和酚修饰的线型聚合物一起引发酶催化的交联反应，由此形成水凝胶。
设想了H2O2通常将与底物和酶同时被递送到分区，或者在已形成含有过氧化物酶和酚底物的混合物的分区之后被递送到该分区。如本领域已知的和本文其他地方所描述的，可以使用微流体系统来控制在分区形成期间递送细胞和试剂的时机。在本公开的方法的至少一个实施方案中，形成交联的过氧化物共底物可以在其形成后被递送到水性分区，例如通过从分区外部的不混溶相扩散到分区中。在一个实施方案中设想了过氧化物共底物(例如，H2O2)可以包含在胶束中，并且可以经由胶束介导的向分区中的转运来递送到水性分区(参见例如WO20/167862)。
氧化还原酶(诸如漆酶和酪氨酸酶)也可以在本公开的组合物和方法中用作交联催化部分。然而，这些氧化还原酶不需要过氧化物诸如H2O2作为共底物，而是利用分子氧(O2)作为共底物来驱动使酚部分交联的催化反应。漆酶与O2相互作用，以形成能够催化双酚交联形成的结合过氧化物复合物。氧化还原酶酪氨酸酶利用两步催化过程，该过程使用O2将酚转化为儿茶酚，然后进一步将儿茶酚氧化为反应性醌部分，该反应性醌部分容易形成共价交联。
还设想了交联催化部分为非酶的化合物。例如，血色素是一种已知的非酶血红素化合物，其能够催化含酚聚合物交联形成水凝胶。参见例如Sakai等人,“Hematin is anAlternative Catalyst to Horseradish Peroxidase for In Situ Hydrogelation ofPolymers with Phenolic Hydroxyl Groups In Vivo,”Biomacromolecules 11(8):2179-83(2010年8月)。与HRP酶一样，血色素需要过氧化物共试剂(诸如H2O2)的存在，以引发和保持交联催化反应。伞形酮是另一种能够引发交联反应以形成水凝胶的非酶香豆素类化合物。参见例如Hickey等人,“Cross-Coupling of Amide and Amide Derivatives toUmbelliferone Nonaflates:Synthesis of Coumarin Derivatives and FluorescentMaterials,”J.Org.Chem.2020,85,12,7986–7999。因此，在至少一个实施方案中，交联催化部分是任选地选自血色素和伞形酮的非酶部分。
水凝胶基质形成
一般来讲，本公开的方法和组合物涉及在包含于分区中的细胞周围形成水凝胶涂层。通过在细胞周围的溶液中提供一种或多种线型聚合物来形成水凝胶涂层，其中线型聚合物用能够与混合物中的另一种线型聚合物发生形成共价交联的反应的化学部分(即，交联前体部分)进行修饰，例如如图7所示。在含有细胞的分区溶液中，线型聚合物之间的这些交联的形成导致水凝胶的形成，其中细胞包埋或截留在基质中。可用于本公开的方法和组合物中的线型聚合物包括烯烃共聚物、聚烯烃、丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(噁唑啉)、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。用于在分区中通过使线型聚合物交联来形成水凝胶基质的材料和方法是本领域中已知的。参见例如美国专利公开号2019/0100632A1和2019/0233878A1，这些美国专利公开中的每一篇据此以引用方式并入本文。
图8描绘了用于制备能够进行酶催化的交联以形成水凝胶基质的酚修饰的线型聚合物的示例性方案。在第一步骤中，由能够形成具有可修饰侧链的线型聚合物的单体制备单体水溶液。在至少一个实施方案中，这些单体是丙烯酰胺和3-氨基丙基甲基-丙烯酰胺。氨基丙基基团提供了可以被修饰以连接其他基团的侧链。还包括甲酸钠作为链转移剂，以促进线型聚合物的形成。在至少一个实施方案中，还包括5’-acrydite寡核苷酸，以提供用寡核苷酸修饰的线型聚合物。
可以通过一系列聚合方法在溶液中生成线型聚合物。例如，聚合可以由引发剂或自由基发生化合物(诸如例如过氧化苯甲酰、2,2-偶氮-异丁腈(AIBN)和过氧二硫酸铵)引发，或者通过使用紫外辐射、γ辐射或电子束辐射引发。在图8的步骤2所示的至少一个实施方案中，使用VA-044热引发聚合方法由丙烯酰胺单体生成线型聚合物。
如图8的步骤3所示，在至少一个实施方案中，线型聚合物一旦形成，就用交联前体部分修饰(或功能化)，所述交联前体部分能够充当交联催化部分的底物。在图8的示例性实施方案中，与线型聚合物偶联的交联前体部分是酚基。用交联前体部分(诸如酚基)对线型聚合物的修饰可以使用用于将生物分子(诸如酶或抗体)连接至其他生物分子、聚合物和/或固相支持物的一系列已知生物缀合化学中的任一者进行。通常，缀合不是直接到线型聚合物侧链，而是包括酶和胺基之间的接头部分。一系列接头(也称为间隔序列)(包括包含可裂解接头部分的接头)是生物缀合领域中已知的，并且可以用于本公开的方法和组合物中。可用于本公开的组合物和方法中的已知接头有：不可裂解的烷基接头、5'-巯基修饰剂C6S-S接头、可光解的间隔序列、UDG可裂解的间隔序列和寡核苷酸。
在本公开的方法和组合物的至少一个实施方案中，使用经由可裂解接头连接的交联前体部分(例如，酚基)修饰线型聚合物(例如，聚丙烯酰胺)。图9中示出了用于使用通过包含可裂解二硫化物部分的接头连接的酚基来修饰聚丙烯酰胺的示例性反应方案。二硫键允许接头在暴露于刺激诸如还原剂(例如，DTT)时裂解，从而允许水凝胶基质选择性降解或溶解。选择性降解截留细胞的水凝胶涂层的能力可以在多种选择性细胞培养、细胞储存和/或细胞测定的方法中提供带水凝胶涂层的细胞。用于在分区中制备和使用可降解水凝胶的技术和方法是本领域中已知的。参见例如美国专利公开号2019/0100632A1和2019/0233878A1，这些美国专利公开中的每一篇据此以引用方式并入本文。
两步胶凝过程
如本文其他地方所述，本公开的方法包括以下步骤：裂解将交联催化部分连接至生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的可裂解接头，由此释放交联催化部分并且生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的水凝胶涂层的厚度增加。裂解接头并释放交联催化酶部分的该步骤允许在生物颗粒(例如细胞、细胞珠粒或细胞核)周围形成水凝胶涂层的第二阶段。图10至图12中示意性地描绘了该过程的两个阶段。在图10中，在已用酚基修饰的线型聚合物的水溶液的分区中描绘了使用通过具有可裂解二硫化物部分的接头连接至膜的HRP酶部分来装饰的细胞。在图11中，HRP共底物H2O2(未示出)的存在引起附近线型聚合物上的酚部分之间的交联的催化形成。线型聚合物之间的交联使得在细胞周围形成初始水凝胶层。然而，该初始水凝胶层的该厚度是有限的，因为HRP交联催化部分能够与该初始层之外的分区的溶液中剩余的酚底物相互作用。在图12中，二硫化物裂解剂(例如，DTT)或刺激(例如，热)的存在使得接头裂解，从而允许HRP部分穿过初始水凝胶层的孔扩散到线型聚合物溶液的未交联的部分中。交联催化酶的该第二阶段活性使水凝胶涂层的形成进一步延伸到细胞周围，使得细胞被截留在基本上更厚的水凝胶涂层中。
细胞周围的这种水凝胶涂层提供了更稳固的细胞样品，其可以更容易地在应用和测定法中操纵和使用，这些应用和测定法包括选择性细胞培养、选择性细胞储存和选择性细胞测定。在本公开的至少一个实施方案中，由本公开的两阶段过程提供的水凝胶涂层的厚度为至少约5μm、至少约10μm、至少约20μm、至少约30μm、至少约40μm、至少约50μm、至少约75μm、至少约100μm、至少约120μm、至少约150μm、至少约200μm或甚至更大的厚度。因此，通常，水凝胶涂层的平均厚度为约5μm至约200μm、约25μm至约175μm、约30μm至约150μm或约50μm至约150μm。
在至少一个实施方案中，在两阶段过程中形成的水凝胶涂层的厚度可以通过包含细胞的水性分区的体积来控制。分区是适于包含一种或多种物类或进行一种或多种反应的空间或体积，并且可以是物理隔室，诸如液滴。分区能够将其空间或体积与另一个分区的空间或体积隔离。在一些实施方案中，分区可以是与第一相不混溶的第二相(例如，油相)中的第一相(例如，水相)的离散液滴。在至少一个实施方案中，本发明的组合物和方法中使用的分区是不混溶相中的离散液滴。如本文其他地方所述，用于生成包含生物颗粒的水性分区(例如，不混溶溶液中的离散液滴)的方法、试剂和微流体系统是众所周知的，并且可以用于控制包含细胞的分区的体积。
生成包含生物颗粒的分区
本领域中描述了可用于生成包含在分区(诸如离散液滴)中的细胞的方法、技术和方案。所生成的离散液滴分区充当纳升规模的容器，其可以保持液滴内容物与不混溶乳液中的其他液滴的内容物分开。
在一个方面，本文所述的系统和方法提供了将一个或多个颗粒(例如，生物颗粒(诸如细胞、细胞珠粒或细胞核)、生物颗粒的大分子成分、珠粒、试剂等)隔室化、沉积或分隔到离散的隔室或分区(本文可互换地称为分区)中，其中每个分区保持其自身内容物与其他分区的内容物分开。
在本文所公开的一些实施方案中，被分隔的生物颗粒是B细胞谱系的标记细胞，例如记忆B细胞，其在其表面上表达抗原结合分子(例如，免疫受体、抗体或其功能片段)。在其他实例中，被分隔的生物颗粒可以是被工程化以表达抗原结合分子(例如，免疫受体、抗体或其功能片段)的标记细胞。
如本文所用，术语“分区”一般是指可以适于包含一个或多个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)、一种或多种特征或化合物物类或进行一种或多种反应的空间或体积。分区可以是物理容器、隔室或器皿，诸如液滴、流通池、反应室、反应隔室、管、孔或微孔。在一些实施方案中，隔室或分区包括可在流体流内流动的分区。这些分区可以包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊，或者在一些情况下，分区可以包括能够在其基质内夹带和/或保留材料的多孔基质。在一些方面，分区包括在非水性连续相(例如，油相)内的水性流体的液滴。多种不同的容器在例如美国专利申请公开号2014/0155295中进行了描述。用于形成在非水性或油乳液中包封细胞或其他生物样品的稳定离散液滴的材料、方法和系统在例如美国专利公开号2010/0105112A1和2019/0100632A1中进行了描述。
在一些实施方案中，本文的分区包括可以适于包含一种或多种物类或进行一种或多种反应的空间或体积。分区可以是物理隔室，诸如液滴或孔。分区可以是与另一个空间或体积隔离的空间或体积。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如水相中的胶囊或脂质体。分区可以包括一个或多个其他(内部)分区。在一些情况下，分区可以是虚拟隔室，其可以由跨越多个和/或远程物理隔室的索引(例如，索引文库)定义且鉴定。例如，物理隔室可以包括多个虚拟隔室。
在一些实施方案中，本文所述的方法提供了将来自包含细胞的样品材料的单独生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)隔室化、沉积或分隔到离散分区中，其中每个分区保持其自身内容物与其他分区的内容物分开。包括独特标识符(例如，UMI)和共同或通用标签(例如，条形码)的标识符可以被预先、随后或同时递送到容纳被隔室化或被分隔的生物颗粒(例如细胞、细胞珠粒或细胞核)的分区，以便允许随后将单独生物颗粒的特性归属于一个或多个特定隔室。此外，包括独特标识符和共同或通用标签(例如，条形码)的标识符可以偶联至标记剂，并且被预先、随后或同时递送到容纳被隔室化或被分隔的细胞的分区，以便允许随后将单独生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的特性归属于一个或多个特定隔室。包括独特标识符和共同或通用标签(例如，条形码)的标识符可以例如在寡核苷酸上经由任何合适的机制(例如通过将条形码化寡核苷酸偶联至珠粒)递送到分区。在一些实施方案中，条形码化寡核苷酸可逆地(例如，可释放地)偶联至珠粒。适用于本公开的组合物和方法的珠粒可以具有不同的表面化学性质和/或物理体积。在一些实施方案中，珠粒包括聚合物凝胶。在一些实施方案中，聚合物凝胶是聚丙烯酰胺。合适珠粒的附加非限制性实例包括微粒、纳米颗粒、珠粒和微珠。分区可以是乳液中的液滴。用于形成稳定离散分区的材料、方法和系统可以包括一个或多个颗粒。分区可以包括一种或多种类型的颗粒。例如，本公开的分区可以包括一个或多个生物颗粒，例如标记的工程化细胞、B细胞或记忆B细胞、细胞器(例如，细胞核)和/或其大分子成分。分区可以包括一个或多个凝胶珠粒。分区可以包括一个或多个细胞珠粒。分区可以包括单个凝胶珠粒、单个细胞珠粒或单个细胞珠粒和单个凝胶珠粒两者。分区可以包括一种或多种试剂。另选地，分区可以是未被占据的。例如，分区可以不包括珠粒。可以在液滴生成之前、之后或同时，将诸如条形码之类的独特标识符诸如经由珠粒注入液滴中，如本文其他地方所述。微流体通道网络(例如，在芯片上)可以用于生成分区，如本文所述。在单独生物颗粒的分隔中还可以采用替代机制，包括多孔膜，细胞的水性混合物通过所述多孔膜被挤出成非水性流体。
分区在流体流中可以是可流动的。分区可以包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊。在一些情况下，分区可以包括多孔基质，该多孔基质能够(例如经由配置为与基质和表达的抗体或其抗原结合片段偶联的捕获剂)在其基质内夹带和/或保留材料(例如，表达的抗体或其抗原结合片段)。分区可以是第二相内的第一相的液滴，其中第一相和第二相是不混溶的。例如，分区可以是非水性连续相(例如，油相)内的水性流体的液滴。在另一个实例中，分区可以是水相内的非水性流体的液滴。在一些实例中，分区可以以油包水乳液或水包油乳液的形式提供。多种不同的容器在例如美国专利申请公开号2014/0155295中进行了描述。用于在非水性或油连续相中形成稳定液滴的乳液体系在例如美国专利申请公开号2010/0105112中进行了描述。
简而言之，生成包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的离散液滴是通过将包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的水性流体的流动流引入与其不混溶的非水性流体的流动流中使得在两个流的交汇处生成液滴来实现的(参见例如图13至图15)。可以调节流体特性(例如，流体流速、流体粘度等)、颗粒特性(例如，体积分数、粒度、颗粒浓度等)、微流体体系结构(例如，通道几何形状等)以及其他参数以控制所得分区的占据率(例如，每个分区的生物颗粒的数量、每个分区的珠粒的数量等)。通过以细胞的一定浓度和/或流速提供水流，可以控制所得液滴的占据率。例如，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，每个离散液滴包含少于一个生物颗粒，例如细胞、细胞珠粒或细胞核(或生物样品的其他颗粒)。这样的流速确保被占据的液滴主要被单个生物颗粒(诸如细胞、细胞珠粒或细胞核)占据。使用包括具有与储库相连的通道连接部的通道段的微流体结构也实现了包封生物颗粒(例如细胞、细胞珠粒或细胞核)的乳液中的离散液滴(参见图16至图18)。在一些情况下，以这种方式形成的多个离散液滴中的液滴包含至多一个颗粒(例如，珠粒、DNA、细胞，诸如标记的工程化细胞、B细胞或记忆B细胞、细胞珠粒、细胞核或细胞材料)。在一些实施方案中，可以选择或调节各种参数(例如，流体特性、颗粒特性、微流体体系结构等)，使得占据大部分区，例如仅允许小百分比的未被占据的分区。还可以控制流动和微流体通道体系结构，以确保被单占据的液滴具有给定的数量，未被占据的液滴小于一定水平，并且/或者被多重占据的液滴小于一定水平。
在一些实施方案中，该方法还包括在第二多个分区中的分区中从多个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)中单独地分隔一个或多个单生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)。
在一些实施方案中，第一多个分区和第二多个分区中的至少一者包括微孔、流通池、反应室、反应隔室或液滴。在一些实施方案中，第一多个分区和第二多个分区中的至少一者包括乳液中的单独液滴。在一些实施方案中，第一多个分区和/或第二多个分区中的分区具有相同的反应体积。
就乳液中的液滴而言，将单独生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)分配到离散分区通常可以通过将水性流体中的生物颗粒(诸如细胞、细胞珠粒或细胞核)的流动流引入非水性流体的流动流中使得在两个流的交汇处生成液滴来实现。通过以一定浓度的生物颗粒提供包含生物颗粒(例如，包含细胞、细胞珠粒或细胞核)的水性流，可以控制所得分区的占据率(例如，每个分区的生物颗粒(诸如细胞、细胞珠粒或细胞核)的数量)。例如，在需要单细胞分区的情况下，可以选择流体的相对流速，使得这些分区在每个分区中平均包含少于一个细胞，以确保被占据的那些分区主要是单占据的。在一些实施方案中，可以选择流体的相对流速，使得大多数分区被占据，例如，仅允许小百分比的分区未被占据。在一些实施方案中，控制流动和通道体系结构，以确保被单独占据的分区具有期望的数量，未被占据的分区小于一定水平，并且被多重占据的分区小于一定水平。
在一些实施方案中，可以执行本文所述的方法，使得大多数被占据的分区在每个被占据的分区中包括不超过一个细胞。在一些实施方案中，执行分隔过程，使得少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于2％或少于1％的被占据的分区包含超过一个细胞。在一些实施方案中，少于20％的被占据的分区包含超过一个细胞。在一些实施方案中，少于10％的被占据的分区在每个分区中包含超过一个细胞。在一些实施方案中，少于5％的被占据的分区在每个分区中包含超过一个细胞。在一些实施方案中，期望避免形成过多数量的空分区。例如，从成本角度和/或效率角度来看，可能期望使空分区的数量最小化。虽然这可以通过向分隔区中提供足够数量的细胞来实现，但是泊松分布可以任选地用于增加包括多个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的分区的数量。因此，在本文所述的一些实施方案中，执行一个或多个所述生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)或被引导到分隔区中的其他流体的流动，使得不超过50％的所生成的分区、不超过25％的所生成的分区或不超过10％的所生成的分区未被占据。此外，在一些方面，控制这些流动，以便呈现单占据分区的非泊松分布，同时提供较低水平的未被占据的分区。再次重申，在一些方面，可以实现未被占据的分区的上述范围，同时仍然提供上述任何一个单占据率。例如，在一些实施方案中，本文所述的系统和方法的使用形成了具有小于25％、小于20％、小于15％、小于10％并且在一些实施方案中小于5％的多重占据率的所得分区，同时具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％并且在一些实施方案中小于5％的未被占据的分区。
尽管上文在提供基本上被单占据的分区方面进行了描述，但是在一些实施方案中，如本文所述的方法包括提供被多重占据的分区，例如，在单个分区内包含具有核酸条形码分子的两个、三个、四个或更多个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)和/或珠粒。
在一些实施方案中，包含在多个分区中的一个分区内的报告寡核苷酸可与包含在其他分区内的报告寡核苷酸区分开。
在一些实施方案中，可能期望将多个不同的条形码序列掺入到给定分区中，这些条形码序列连接至分区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，混合但已知的条形码序列组可以在后续处理中提供更大的鉴定保证，例如，通过提供条形码至给定分区的更强地址或归属，作为给定分区的输出的重复确认或独立确认。
微流体通道结构
微流体通道网络(例如，在芯片上)可以用于生成分区，如本文所述。在单独生物颗粒的分隔中还可以采用替代机制，包括多孔膜，生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的水性混合物通过所述多孔膜被挤出成非水性流体。
图13示出了可用于生成分区(例如，离散液滴)的示例性微流体通道结构100，所述分区包封酶装饰的细胞和用本公开的交联前体部分修饰的线型聚合物。通道结构100可以包括在通道连接部110处连通的通道段102、104、106和108。在操作中，可以将包括悬浮的生物颗粒诸如细胞、细胞珠粒、细胞核或者生物样品的颗粒(例如，标记的工程化细胞、B细胞或记忆B细胞)114的第一水性流体112沿着通道段102运输到连接部110中，而将与水性流体112不混溶的第二流体116(或“分隔流体”)从通道段104和106中的每个通道段递送至连接部110以形成第一水性流体112的离散液滴118、120，所述离散液滴流入通道段108，并远离连接部110流动。通道段108可以流体联接至出口储库，在该出口储库中可以储存和/或收获离散液滴。所生成的离散液滴可以包含单独酶装饰的细胞114(诸如液滴118)，或可以生成包含超过一个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)114的离散液滴(未在图13中示出)。离散液滴可以不含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)114(诸如液滴120)。每个分区能够保持其自身内容物(例如，单独酶装饰的细胞114)与其他液滴的内容物分开。通常，第二流体116包含油，诸如氟化油，其包括有助于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴118、120的后续聚结)的氟表面活性剂。有用的分隔流体和氟表面活性剂的实例在例如美国专利公开号2010/0105112A1中进行了描述。
图13中举例说明的用于生成分区的微流体通道可以联接至多种不同流体源或接收部件中的任何一者，包括储库、管道、歧管或其他系统的流体部件。此外，微流体通道结构100可以具有其他几何形状，包括具有超过一个通道连接部的几何形状。例如，微流体通道结构可以具有各自携带酶装饰的细胞、线型聚合物和任选其他测定试剂和/或珠粒的2、3、4或5个通道段，这些通道段在通道连接部处相遇。一般来讲，用于生成离散液滴的流体经由一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。也可以或另行经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
所生成的液滴可以包括液滴的两个子组：(1)包含一个或多个生物颗粒114(例如，标记的工程化细胞、B细胞、记忆B细胞、细胞珠粒或细胞核)的被占据的液滴118，以及(2)不包含任何生物颗粒114的未被占据的液滴120。被占据的液滴118可以包括被单占据的液滴(具有一个生物颗粒，诸如一个B细胞或记忆B细胞、细胞珠粒或细胞核)和被多重占据的液滴(具有超过一个生物颗粒，诸如多个B细胞或记忆B细胞、细胞珠粒或细胞核)。如本文其他地方所述，在一些情况下，大多数被占据的分区在每个被占据的分区中可以包括不超过一个生物颗粒(例如，标记的工程化细胞、B细胞、记忆B细胞、细胞珠粒或细胞核)并且一些所生成的分区可以未被(任何生物颗粒或标记的工程化细胞、B细胞、记忆B细胞、细胞珠粒或细胞核)占据。然而，在一些情况下，一些被占据的分区可以包括超过一个生物颗粒，例如标记的工程化细胞、B细胞、记忆B细胞、细胞珠粒或细胞核。在一些情况下，可以控制分隔过程，使得少于约25％的被占据的分区包含超过一个生物颗粒，并且在许多情况下，少于约20％的被占据的分区具有超过一个生物颗粒，而在一些情况下，少于约10％或甚至少于约5％的被占据的分区在每个分区中包括超过一个生物颗粒。
在一些情况下，可能期望使过多数量的空分区的生成最小化，以便降低成本和/或提高效率。虽然可以通过在分隔连接部110处提供足够数量的生物颗粒(例如，诸如标记的工程化细胞、B细胞、记忆B细胞、细胞珠粒或细胞核的生物颗粒114)来实现这种最小化，以便确保至少一个生物颗粒被包封在分区中，但泊松分布可能预期会增加包括多个生物颗粒的分区的数量。因此，在将要获得单占据分区的情况下，最多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的所生成的分区可以是未被占据的。
在一些情况下，可以控制诸如B细胞或记忆B细胞的一个或多个生物颗粒(例如，在通道段102中)或被引导到分隔连接部中的其他流体(例如，在通道段104、106中)的流动，使得在许多情况下，不超过约50％的所生成的分区、不超过约25％的所生成的分区或不超过约10％的所生成的分区未被占据。可以控制这些流动，以便呈现单占据分区的非泊松分布，同时提供较低水平的未被占据的分区。可以实现未被占据的分区的上述范围，同时仍然提供上述任何一个单占据率。例如，在许多情况下，本文所述的系统和方法的使用可以生成具有小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％并且在许多情况下小于约5％的多重占据率的所得分区，同时具有小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或更少的未被占据的分区。
应当理解，上述占据率也适用于包括生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)和附加试剂两者的分区，所述附加试剂包括但不限于携带核酸条形码分子(例如，条形码化寡核苷酸)的珠粒(例如，凝胶珠粒)(相对于图13和图16描述)。被占据的分区(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的被占据的分区)可以包括包含核酸条形码分子的珠粒和生物颗粒(例如，细胞或细胞核)两者。
在另一方面，作为基于液滴的分隔的补充或替代，标记的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)可以被包封在微粒材料内以形成“细胞珠粒”。
细胞珠粒可以包括其他试剂。生物颗粒(例如，标记的生物颗粒，诸如工程化细胞或细胞核)的包封可以通过多种过程进行。此类过程可以将含有标记的生物颗粒的水性流体与聚合物前体材料组合，在向聚合物前体施加特定的刺激时该聚合物前体材料可能能够形成为凝胶或其他固体或半固体基质。此类刺激可以包括例如热刺激(例如，加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过交联、前体的聚合引发(例如，通过添加的引发剂))、机械刺激或它们的组合。
生物颗粒(例如，标记的细胞，包括工程化细胞、B细胞、记忆B细胞或细胞核)的包封可以通过多种方法进行。例如，气刀液滴或气溶胶发生器可以用于将前体流体的液滴分配到胶凝溶液中，以形成包括单独生物颗粒或小群生物颗粒的细胞珠粒。同样，基于膜的包封系统可以用于生成包含如本文所述的包封的生物颗粒的细胞珠粒。诸如图13所示的本公开的微流体系统可以容易地用于包封如本文所述的生物颗粒(例如，细胞或细胞核，包括标记的细胞或细胞核)。用于包封生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的示例性方法也在美国专利申请公开号US 2015/0376609和PCT/US2018/016019中进一步描述。具体地讲，并且参考图13，包含(i)生物颗粒114和(ii)聚合物前体材料(未示出)的水性流体112流入通道连接部110，其在该通道连接部通过非水性流体116的流动而被分隔到液滴118、120中。在包封方法的情况下，非水性流体116还可以包括引发剂(未示出)，以引起聚合物前体的聚合和/或交联，从而形成包括所夹带的生物颗粒的珠粒。聚合物前体/引发剂对的实例包括在美国专利申请公开号2014/0378345中描述的那些。
例如，在聚合物前体材料包括线型聚合物材料诸如线性聚丙烯酰胺、PEG或其他线型聚合物材料的情况下，活化剂可以包括交联剂，或活化所形成的液滴内的交联剂的化学品。同样，对于包括可聚合单体的聚合物前体，活化剂可以包括聚合引发剂。例如，在某些情况下，当聚合物前体包括丙烯酰胺单体与N,N’-双-(丙烯酰)胱胺(BAC)共聚单体的混合物时，可以在通道段1204和1206中的第二流体流1216内提供试剂诸如四乙基甲二胺(TEMED)，该试剂可以引发丙烯酰胺和BAC共聚成交联的聚合物网络或水凝胶。
在液滴形成期间第二流体流116与第一流体流112在连接部110处接触时，TEMED可以从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的水性流体112中，这将激活液滴118、120内的聚丙烯酰胺的交联，导致形成夹带生物颗粒(包括标记的生物颗粒(例如，诸如B细胞的细胞或细胞核)114)的固体或半固体珠粒或颗粒形式的凝胶(例如，水凝胶)细胞珠粒。尽管就聚丙烯酰胺包封进行了描述，但是在本文所述的方法和组合物的上下文中也可以采用其他“可激活的”包封组合物。例如，藻酸盐液滴形成及随后暴露于二价金属离子(例如，Ca2+离子)可以用作使用所述过程进行的包封过程。同样，还可以通过基于温度的胶凝(例如，在冷却后等)，将琼脂糖液滴转化成胶囊。
在一些情况下，包封的生物颗粒(例如，标记的细胞或细胞核)可以选择性地从细胞珠粒中释放出来，诸如通过时间的流逝或在施加特定刺激时，这使包封材料充分地降解以允许生物颗粒(例如，标记的细胞，包括B细胞或细胞核)或它的其他内容物从包封材料中释放出来，诸如释放到分区(例如，液滴)中。例如，在上述聚丙烯酰胺聚合物的情况下，聚合物的降解可以通过引入合适的还原剂诸如DTT等来实现，以裂解使聚合物基质交联的二硫键。参见例如美国专利申请公开号2014/0378345。
在至少一个实施方案中，包含酶装饰的细胞和线型聚合物以及其他试剂的分区也可以包括条形码。将条形码与细胞一起包含在一个分区中提供了独特标识符，该独特标识符允许从该分区中所得的带水凝胶涂层的细胞获得的数据与从其他分区获得的数据区分开，并被单独分析。如本文所用，术语“条形码”通常是指标识符，其传达或能够传达关于分区中与条形码相关联的细胞、生物颗粒或其他分析物的信息。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可以是连接至分析物(例如，核酸分子)的标签或该标签加上分析物的内在特性(例如，分析物或末端序列的大小)的组合。条形码可以是独特的。条形码可以具有各种不同的形式。例如，条形码可包括多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码可以可逆或不可逆方式连接至分析物。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后加入例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量单独测序读段。在一些实施方案中，条形码可以配置为用作荧光条形码。例如，在一些实施方案中，条形码可以配置用于与荧光标记的寡核苷酸探针杂交。条形码可以配置为例如以单细胞分辨率在空间上解析存在于生物样品中的分子组分(例如，条形码可以是或可以包括“空间条形码”)。在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包括两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。在一些实施方案中，两个或更多个子条形码被一个或多个非条形码序列分开。在一些实施方案中，两个或更多个子条形码未被非条形码序列分开。
在一些实施方案中，条形码可以包括一个或多个独特分子标识符(UMI)。一般来讲，独特分子标识符是连续核酸片段或者两个或更多个非连续核酸片段，其充当特定分析物的或经由捕获序列结合特定分析物(例如，mRNA)的核酸条形码分子的标签或标识符。UMI可以包括一个或多个特异性多核苷酸序列、一个或多个随机核酸和/或氨基酸序列和/或一个或多个合成核酸和/或氨基酸序列。在一些实施方案中，UMI是基本上不与生物样品中的分析物核酸分子杂交的核酸序列。在一些实施方案中，UMI与生物样品中核酸分子的实质部分(例如，80％或更高)中的核酸序列具有小于80％的序列同一性(例如，小于70％、60％、50％或小于40％的序列同一性)。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以被分成两个或更多个被1个或更多个核苷酸分开的单独子序列。
“条形码化核酸分子”是指例如用核酸序列(例如，与核酸条形码分子所涵盖的核酸引物序列互补的核酸序列)处理条形码分子而得到的核酸分子。核酸序列可以是靶向序列(例如，由引物序列靶向)或非靶向序列。例如，在本文所述的方法、组合物、试剂盒和系统中，包含在分区中的细胞的核酸分子(例如，mRNA分子)与核酸条形码分子(例如，包含条形码序列和与mRNA分子的核酸序列互补的核酸引物序列的核酸条形码分子)的杂交和逆转录产生具有与mRNA的核酸序列和条形码序列(或其反向互补序列)相对应的序列的条形码化核酸分子。条形码化核酸分子可以用作模板，例如模板多核苷酸，其可被进一步处理(例如，扩增)和测序以获得靶核酸序列。例如，在本文所述的方法和系统中，可以进一步对条形码化核酸分子进行处理(例如，扩增)和测序以获得mRNA的核酸序列。
设想了在本公开的方法中，可以在酶装饰的细胞、线型聚合物、共底物和/或其他测定试剂之前、之后或同时将条形码递送到分区中。例如，在不混溶油相中形成液滴之前，可以将条形码注入到用于形成离散液滴的水性混合物中。
可用于本公开的方法和组合物中的条形码通常包含核酸分子(例如，寡核苷酸)。通常经由与条形码分子连接的固相或半固相(诸如珠粒)将核酸分子递送到分区。在一些情况下，条形码核酸分子最初在生成分区时与珠粒缔合，然后在对液滴施加刺激时从珠粒中释放出来。可用于本公开的方法和组合物中的包含条形码的珠粒在本文其他地方有更详细的描述。珠粒通常是颗粒，并且可以包括固体或半固体颗粒，诸如凝胶珠粒。在一些实施方案中，凝胶珠粒可以包括通过线型聚合物的聚合或交联而形成的聚合物基质。聚合物基质可以由一种或多种不同的聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)组成，并且基质中的聚合物可以随机排列，诸如呈无规共聚物，和/或具有有序结构，诸如呈嵌段共聚物。聚合物基质中的聚合物之间的交联可以经由共价、离子或诱导相互作用或者物理缠结。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以经由分子(例如，大分子)诸如单体或聚合物(其可以是天然的或合成的)的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是或包括核酸分子(例如，DNA或RNA)。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。珠粒可以是覆盖有包含一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，基于金属的颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的、可降解的或可溶解的。可与组合物和方法一起使用的珠粒可以是多孔、无孔、固体、半固体、半流体、流体和/或其组合的材料。在一些实施方案中，珠粒是包含水凝胶基质的凝胶珠粒。此类凝胶珠粒可以由聚合或单体前体分子形成，这些分子发生交联反应而形成水凝胶基质。可用于本公开中的另一种半固体珠粒是脂质体珠粒。在一些实施方案中，所使用的珠粒可以是包含金属的固体珠粒，所述金属包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在其他情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。一般来讲，珠粒可以具有任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形的、圆形、圆柱形以及它们的变型。
生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)可以经受足以使前体聚合或胶凝的其他条件。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括足以使前体聚合或胶凝的任何条件。在聚合或胶凝之后，可以在生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)周围形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶对于化学试剂或生化试剂而言可以是扩散渗透性的。聚合物或凝胶对于生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)的大分子成分(例如，分泌的抗体或其抗原结合片段)而言可以是扩散不可渗透性的。这样，聚合物或凝胶可以起到让生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)经受化学或生化操作的作用，同时将大分子成分在空间上限制于由聚合物或凝胶限定的液滴的区域。聚合物或凝胶可以包括二硫化物交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-巯基、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可以包括任何其他聚合物或凝胶。
聚合物或凝胶可以被功能化(例如，偶联至捕获剂)以结合于靶向分析物(例如，分泌的抗体或其抗原结合片段)，诸如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其他分析物。聚合物或凝胶可以经由被动机理聚合或胶凝。聚合物或凝胶在碱性条件或升高的温度下可以是稳定的。聚合物或凝胶可以具有与珠粒的机械特性类似的机械特性。例如，聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的尺寸。聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的机械强度(例如，拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可以低于油。聚合物或凝胶的密度可以大致类似于缓冲液的密度。聚合物或凝胶可以具有可调的孔径。可以选择孔径以例如保留变性的核酸。可以选择孔径以维持对外源化学品(诸如氢氧化钠(NaOH))和/或内源化学品(诸如抑制剂)的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以维持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生物化学相容的。聚合物或凝胶可以通过热、化学、酶和/或光学方式聚合和/或解聚。
聚合物可以包括通过二硫键交联的聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)。聚合物的制备可以包括两步反应。在第一活化步骤中，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于酰化剂以将羧酸转化成酯。例如，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)。可以将聚丙烯酰胺-共-丙烯酸暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的其他盐。在第二交联步骤中，可以将在第一步骤中形成的酯暴露于二硫化物交联剂。例如，可以将该酯暴露于胱胺(2,2'-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后，生物颗粒(例如，标记的生物颗粒，包括标记的细胞或细胞核)可以被通过二硫桥连接在一起的聚丙烯酰胺链包围。这样，生物颗粒可以被包封在凝胶或基质(例如，聚合物基质)内部或包含该凝胶或基质以形成“细胞珠粒”。细胞珠粒可以包含生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)或生物颗粒的大分子成分(例如，RNA、DNA、蛋白质、分泌的抗体或其抗原结合片段等)。细胞珠粒可以包括单个细胞/细胞核或多个细胞/细胞核，或单个细胞/细胞核或多个细胞/细胞核的衍生物。例如，在裂解和洗涤细胞之后，可以将细胞或细胞核裂解物中的抑制组分洗掉，并且大分子成分可以结合为细胞珠粒。本文所公开的系统和方法可以适用于(i)包含生物颗粒的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)和(ii)包含生物颗粒的大分子成分的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)两者。
包封的生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)可以提供比基于液滴的分隔生物颗粒更易于存储和更便携的某些潜在的优势。此外，在一些情况下，可能期望在分析之前将生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)温育一段选定的时间，诸如以便在存在或不存在不同刺激(例如，细胞因子、抗原等)的情况下表征此类生物颗粒随时间的变化。在此类情况下，包封可以允许比在乳液液滴中的分隔有更长的温育时间，但在一些情况下，也可以将液滴分隔的生物颗粒温育不同的时间段，例如至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长时间。生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)的包封可以构成其他试剂被共同分隔到其中的生物颗粒的分隔。另选地或此外，包封的生物颗粒可以容易地沉积到如上所述的其他分区(例如，液滴)中。
微孔
如本文所述，可以在可为孔的分区中执行一个或多个过程。孔可以是基底的多个孔中的孔，例如微孔阵列或板的微孔，或者孔可以是包含基底的装置(例如，微流体装置)的微孔或微腔室。孔可以是孔阵列或板的孔，或者孔可以是装置(例如，流体装置)的孔或腔室。相应地，孔或微孔可以采取“开放”配置，其中孔或微孔暴露于环境(例如，含有开放表面)，并且在基底的一个平面表面上是可接近的，或者孔或微孔可以采取“关闭”或“密封”配置，其中微孔在基底的平面表面上是不可接近的。在一些情况下，孔或微孔可以配置为在“开放”和“关闭”配置之间切换。例如，一个“开放”微孔或一组微孔可以使用膜(例如，半透膜)、油(例如，覆盖水溶液的氟化油)或盖子进行“关闭”或“密封”，如本文其他地方所述。孔或微孔最初可以以“关闭”或“密封”配置提供，其中如果没有外力，它们在基底的平面表面上是不可接近的。例如，“关闭”或“密封”配置可以包括基底例如密封膜或箔，其可通过移液管吸头刺穿或穿透。用于基底的合适材料包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚乙烯、乙烯基和铝箔。
在一些实施方案中，孔可以具有小于1毫升(mL)的体积。例如，孔可以配置为容纳最多1000微升(μL)、最多100μL、最多10μL、最多1μL、最多100纳升(nL)、最多10nL、最多1nL、最多100皮升(pL)、最多10(pL)或更少的体积。孔可以配置为容纳约1000μL、约100μL、约10μL、约1μL、约100nL、约10nL、约1nL、约100pL、约10pL等的体积。孔可以配置为容纳至少10pL、至少100pL、至少1nL、至少10nL、至少100nL、至少1μL、至少10μL、至少100μL、至少1000μL或更多的体积。孔可以配置为容纳在本文中列出的体积范围内的体积，例如，约5nL至约20nL、约1nL至约100nL、约500pL至约100μL等。孔可以是具有不同体积的多个孔，并且可以配置为容纳适合容纳本文所述的任何隔室体积的体积。
在一些情况下，微孔阵列或板包括单一种类的微孔。在一些情况下，微孔阵列或板包括各种各样的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括在单个微孔阵列或板内的一种或多种类型的微孔。微孔的类型可以具有不同的尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形等)、长宽比或其他物理特性。微孔阵列或板可以包括任何数量的不同类型的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000种或更多种不同类型的微孔。孔可以具有任何尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积、体积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形、其他多边形等)、长宽比或本文关于任何孔描述的其他物理特性。
在某些情况下，微孔阵列或板包括在阵列或板内彼此相邻定位的不同类型的微孔。例如，具有一组尺寸的微孔可以与具有一组不同尺寸的另一个微孔相邻并接触定位。类似地，不同几何形状的微孔可以彼此相邻或接触放置。相邻的微孔可以配置为容纳不同的制品；例如，一个微孔可以用于容纳生物颗粒(例如，细胞、细胞核、细胞珠粒)或其他样品(例如，细胞组分、核酸分子等)，而相邻的微孔可以用于容纳液滴、珠粒或其他试剂。在一些情况下，相邻的微孔可以配置为例如在施加刺激时或在接触每个微孔中的制品时自发地合并其中容纳的内容物。
如本文中别处所述，在本文描述的系统、组合物和方法中可使用多个隔室。例如，可以生成或以其他方式提供任何合适数目的分区(例如，孔或液滴)。例如，在使用孔时的情况下，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个孔、至少约5,000个孔、至少约10,000个孔、至少约50,000个孔、至少约100,000个孔、至少约500,000个孔、至少约1,000,000个孔、至少约5,000,000个孔至少约10,000,000个孔、至少约50,000,000个孔、至少约100,000,000个孔、至少约500,000,000个孔、至少约1,000,000,000个孔或更多个孔。此外，多个孔可以包括未被占据的孔(例如，空孔)和占据的孔两者。
孔可以包括本文所述的任何试剂或其组合。这些试剂可以包括例如条形码分子、酶、衔接子以及它们的组合。试剂可以与置于孔中的样品(例如，细胞、细胞核、细胞珠粒或细胞组分例如蛋白质、核酸分子等)物理分离。这种物理分离可以通过将试剂包含在置于孔中的珠粒内或与珠粒偶联来实现。该物理分离也可以通过在孔中分配试剂并在将多核苷酸样品引入孔中之前用例如可溶解、可熔化或可渗透的层覆盖试剂来实现。该层可以是例如油、蜡、膜(例如，半透膜)等。可以在任何点(例如，在添加珠粒之后，在添加试剂之后，或者在添加这些组分中的任何一种之后)密封该孔。孔的密封可用于多种目的，包括防止珠粒或负载的试剂从孔中逸出，允许某些试剂的选择性递送(例如，经由使用半透膜)以便在进一步处理之前或之后储存孔等。
孔可以包括游离试剂和/或包封在珠粒或液滴中的试剂，或者以其他方式与珠粒或液滴偶联或缔合的试剂。在一些实施方案中，可以使用适用于涉及生物分子(诸如但不限于核酸分子和蛋白质)的样品处理反应的任何化学物质、颗粒和元素将本公开中所描述的任何试剂包封在液滴或珠粒中，或者以其他方式偶联至液滴或珠粒。例如，在用于DNA测序的样品制备反应中使用的珠粒或液滴可以包括一种或多种下列试剂：酶、限制性酶(例如、多剪切酶)、连接酶、聚合酶、荧光团、寡核苷酸条形码、衔接子、缓冲液、核苷酸(例如，dNTP、ddNTP)等。
试剂的附加实例包括但不限于：缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、温度敏感酶、pH敏感酶、光敏酶、金属、金属离子、氯化镁、氯化钠、锰、水性缓冲液、温和缓冲液、离子缓冲液、抑制剂、酶、蛋白质、多核苷酸、抗体、糖类、脂质、油、盐、离子、去垢剂、离子去垢剂、非离子去垢剂、寡核苷酸、核苷酸、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)、DNA、RNA、肽多核苷酸、互补DNA(cDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微小RNA、dsRNA、核酶、核糖开关和病毒RNA、聚合酶、连接酶、限制性酶、蛋白酶、核酸酶、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、螯合剂、还原剂、氧化剂、荧光团、探针、发色团、染料、有机物、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、聚合物、水、小分子、药物、放射性分子、防腐剂、抗生素、适体和药物化合物。如本文所述，孔中的一种或多种试剂可以用于进行一种或多种反应，包括但不限于：细胞裂解、细胞固定、透化、核酸反应例如核酸延伸反应、扩增、逆转录、转座酶反应(例如，标签化)等。
本文所公开的孔可以作为试剂盒的一部分提供。例如，试剂盒可以包括使用说明、微孔阵列或装置以及试剂(例如，珠粒)。该试剂盒可以包括用于进行本文所述过程的任何可用的试剂，所述过程例如为核酸反应、核酸分子的条形码化、样品处理(例如，用于细胞裂解、固定和/或透化)。
在一些情况下，孔包括珠粒或液滴，该珠粒或液滴包括具有相似属性的一组试剂，例如一组酶、一组矿物质、一组寡核苷酸、不同条形码分子的混合物、相同条形码分子的混合物。在其他情况下，珠粒或液滴包括试剂的异质混合物。在一些情况下，试剂的异质混合物可以包括进行反应所需的所有组分。在一些情况下，这种混合物可以包括进行反应所需的所有组分，但进行反应所需的1、2、3、4、5种或更多种组分除外。在一些情况下，此类附加组分包含在不同的液滴或珠粒中或以其他方式偶联至不同的液滴或珠粒，或者包含在系统的分区(例如，微孔)内的溶液中。
图22中示意性地呈现了根据本公开的一些实施方案的微孔阵列的非限制性实例。在该实例中，阵列可以包含在基底1700内。基底1700包括多个孔1702。孔1702可以具有任何尺寸或形状，并且孔之间的间距、每个基底的孔的数量以及基底1700上的孔的密度可以根据特定的应用进行修改。在一个这样的示例应用中，样品分子1706(其可以包括生物颗粒，包括细胞/细胞核或细胞/细胞核组分(例如，核酸分子))与珠粒1704共同分隔，该珠粒可以包括与其偶联的核酸条形码分子。可以使用重力或其他装载技术(例如，离心、液体处理器、声学装载、光电等)装载孔1702。在一些情况下，至少一个孔1702包含单个样品分子1706(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)和单个珠粒1704。
可以将试剂顺序或同时装载到孔中。在某些情况下，在特定操作之前或之后将试剂引入到装置中。在一些情况下，将试剂(其在某些情况下可以以液滴或珠粒的形式提供)顺序引入，使得在不同的步骤发生不同的反应或操作。也可以在穿插有反应或操作步骤的操作中装载试剂(或液滴或珠粒)。例如，可以将包括用于使多核苷酸片段化的试剂(例如，限制性酶)和/或其他酶(例如，转座酶、连接酶、聚合酶等)的液滴或珠粒装载到该孔或多个孔中，随后装载包括用于将核酸条形码分子连接至样品核酸分子的试剂的液滴或珠粒。可以将试剂与样品例如细胞/细胞核或细胞/细胞核组分(例如，细胞器、蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质等)同时或顺序提供。因此，在进行多步操作或反应时，使用孔可能是有用的。
如本文其他地方所述，核酸条形码分子和其他试剂可以包含在珠粒或液滴内。可以在装载生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)之前、之后或同时将这些珠粒或液滴装载到分区(例如，微孔)中，使得每个生物颗粒与不同的珠粒或液滴接触。可以使用该技术将独特核酸条形码分子连接至从每个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)获得的核酸分子。另选地或此外，可以将样品核酸分子连接至支持物。例如，分区(例如微孔)可以包括珠粒，其具有与之偶联的多个核酸条形码分子。样品核酸分子或其衍生物可以偶联或连接至在支持物上连接的核酸条形码分子。然后，所得到的条形码化核酸分子可以从分区中取出，并且在一些情况下，合并且测序。在此类情况下，核酸条形码序列可以用于追踪样品核酸分子的来源。例如，具有相同条形码的多核苷酸可以被确定为来源于相同的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)或分区，而具有不同条形码的多核苷酸可以被确定为来源于不同的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)或分区。
可以使用多种方法将样品或试剂装载到孔或微孔中。例如，可以使用外力(例如，重力、电力、磁力)或使用将样品或试剂驱动到孔中的机制(例如，经由压力驱动流、离心、光电、声学装载、电动泵送、真空、毛细管流等)将样品(例如，细胞、细胞核、细胞珠粒或细胞/细胞核组分)或试剂(如本文所述)装载到孔或微孔中。在某些情况下，可以使用流体处理系统将样品或试剂装载到孔中。样品或试剂的装载可以遵循泊松分布或非泊松分布，例如超泊松或亚泊松。可以修改微孔的几何形状、孔之间的间距、密度和尺寸，以适应可用的样品或试剂分布；例如，可以调节微孔的尺寸和间距，使得样品或试剂可以以超泊松方式分布。
在一个非限制性实例中，微孔阵列或板包括多对微孔，其中每对微孔配置为容纳液滴(例如，包括单个生物颗粒，诸如细胞、细胞珠粒或细胞核)和单个珠粒(诸如本文所述的那些，其在一些情况下也可以被包封在液滴中)。可以同时或顺序装载液滴和珠粒(或包含珠粒的液滴)，并且可以例如在液滴和珠粒接触时或者在施加刺激(例如，外力、搅拌、热、光、磁力或电力等)时合并液滴和珠粒。在一些情况下，液滴和珠的装载是超泊松的。在微孔对的其他实例中，孔配置为容纳包括不同试剂和/或样品的两个液滴，其在接触时或在施加刺激时合并。在此类情况下，该对中的一个微孔的液滴可以包括可以与该对中的另一个微孔的液滴中的试剂反应的试剂。例如，一个液滴可以包括被配置为释放定位于相邻微孔中的另一个液滴中包含的珠的核酸条形码分子的试剂。在液滴合并时，核酸条形码分子可以从珠粒释放到分区(例如，微孔或接触的微孔对)中，并且可以进行进一步的处理(例如，条形码化、核酸反应等)。在完整或活细胞被装载在微孔中的情况下，一个液滴可以包括用于在液滴合并时裂解细胞的裂解试剂。
在一些实施方案中，可以将液滴或珠粒分隔到孔中。在装载到孔中之前，可以选择液滴或对液滴进行预处理。例如，液滴可以包括生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)，并且只有某些液滴诸如包含单个生物颗粒(或至少一个生物颗粒)的液滴，才可以被选择用于孔的装载。这种预选过程可用于单个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的有效装载，诸如以获得非泊松分布，或在孔中进一步分隔之前预过滤具有选定特性的细胞。此外，该技术可用于在装载微孔之前或期间获得或防止生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的二重态或多重态形成。
在一些实施方案中，孔可以包括连接至其上的核酸条形码分子。核酸条形码分子可以连接至孔的表面(例如，孔的壁)。一个孔的核酸条形码分子(例如，分区条形码序列)可以不同于另一个孔的核酸条形码分子，其可以允许鉴定单个分区或孔内包含的内容物。在一些实施方案中，核酸条形码分子可以包括空间条形码序列，其可以鉴定孔例如在孔阵列或孔板内的空间坐标。在一些实施方案中，核酸条形码分子可以包括用于单独分子鉴定的独特分子标识符。在一些情况下，核酸条形码分子可以配置为连接至或捕获分布在孔中的样品或生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)内的核酸分子。例如，核酸条形码分子可以包括捕获序列，该捕获序列可以用于捕获或杂交于样品中的核酸分子(例如，RNA、DNA)。在一些实施方案中，核酸条形码分子可以从微孔中释放出来。例如，核酸条形码分子可以包括化学交联剂，其可以在施加刺激(例如，光刺激、磁刺激、化学刺激、生物刺激)时发生裂解。可以收集和合并释放的核酸条形码分子(其可以与样品核酸分子杂交或配置为与样品核酸分子杂交)以进行进一步处理，该进一步处理可以包括核酸处理(例如，扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如，测序)。在此类情况下，独特分区条形码序列可以用于鉴定核酸分子来源的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)或分区。
可以对孔内的样品进行表征。在非限制性实例中，这种表征可以包括样品(例如，细胞、细胞核、细胞珠粒或细胞/细胞核组分)或其衍生物的成像。诸如显微术或成像之类的表征技术可用于测量固定空间位置中的样品轮廓。例如，当生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)被分隔(任选地与珠粒一起分隔)时，每个微孔和其中包含的内容物的成像可以提供关于生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)二重态形成(例如，频率、空间位置等)、细胞-珠粒对效率、细胞活力、细胞大小、细胞形态、生物标记物(例如，表面标记物、其中的荧光标记分子等)的表达水平、细胞或珠粒装载速率、细胞-珠粒对的数量等的有用信息。在一些情况下，成像可以用于表征孔中的活细胞，包括但不限于：动态活细胞追踪、细胞-细胞相互作用(当两个或更多个细胞被共同分隔时)、细胞增殖等。可替代地或另外，成像可以用于表征孔中的大量扩增产物。
在操作中，可以同时或顺序向孔中装载样品和试剂。当装载生物颗粒(例如，细胞、细胞核或细胞珠粒)时，可以对孔进行洗涤，例如以从孔、微孔阵列或板中去除过量的细胞。类似地，可以进行洗涤以从孔、微孔阵列或板中去除过量的珠粒或其他试剂。在使用活细胞的情况下，可以在单独分区中裂解细胞以释放细胞内组分或细胞分析物。另选地，可以在单独的分区中固定或透化细胞或细胞核。细胞内组分或细胞分析物可以偶联至例如微孔表面上、固相支持物(例如，珠粒)上的支持物，或者可以收集细胞内组分或细胞分析物以进行进一步的下游处理。例如，在细胞或细胞核裂解后，可以将细胞内组分或细胞分析物转移到单独液滴或其他分区中以进行条形码化。另选地或此外，细胞内组分或细胞分析物(例如，核酸分子)可以偶联至包括核酸条形码分子的珠粒；随后，可以收集并进一步处理珠粒，例如对珠粒进行核酸反应，诸如逆转录、扩增或延伸，并且可以例如经由测序进一步表征其上的核酸分子。另选地或此外，可以在孔中对细胞内组分或细胞分析物进行条形码化(例如，使用包括可释放的核酸条形码分子的珠粒或在包括核酸条形码分子的微孔表面上的珠粒)。可以在孔中进一步处理条形码化核酸分子或分析物，或者可以从单独分区收集条形码化核酸分子或分析物并在分区外对其进行进一步处理。进一步处理可以包括核酸处理(例如，执行扩增、延伸)或表征(例如，扩增分子的荧光监测、测序)。在任何合适或可用的步骤中，可以(例如，使用油、膜、蜡等)将孔(或微孔阵列或板)密封，这使得能够储存测定试剂或选择性地引入附加试剂。
一旦被密封，孔就可以经受一定条件以进一步处理孔中的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)。例如，孔中的试剂可以允许生物颗粒的进一步处理，例如细胞或细胞核的裂解，如本文进一步描述的。另选地，包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的孔(或诸如孔基阵列的那些孔之类的孔)可以经受冻融循环以处理生物颗粒，例如细胞或细胞核的裂解。包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的孔可以经受冷冻温度(例如，0℃、低于0℃、-5℃C、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、
-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-80℃或-85℃)。冷冻可以以合适的方式进行，例如零下冰箱或干冰/乙醇浴。在初始冷冻后，包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒、细胞核或多个细胞核)的孔(或多个孔)可以经受冻融循环以裂解生物颗粒。在一个实施方案中，将最初冷冻的孔(或多个孔)解冻至高于冰点的温度(例如，室温或25℃)。在另一个实施方案中，进行少于10分钟(例如，5分钟或7分钟)的冷冻，然后在室温下解冻少于10分钟(例如，5分钟或7分钟)。可以重复该冻融循环多次，例如2、3或4次，以获得孔(或多个孔)中生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒、细胞核或多个细胞核)的裂解。在一个实施方案中，在不存在裂解缓冲液的情况下进行冷冻、解冻和/或冻融循环。
珠粒
在本公开的一些实施方案中，分区可以包括一个或多个独特标识符，诸如条形码(例如，多个核酸条形码分子，其可以是例如多个分区条形码序列)。条形码可以被预先、随后或同时递送到容纳隔室化的或分隔的生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞或细胞核)的分区中。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入到液滴中。在一些实施方案中，条形码到特定分区的递送允许稍后将单独生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞、细胞核或细胞珠粒)的特性归属于特定分区。条形码可以经由任何合适的机制例如在核酸分子(例如，条形码化寡核苷酸)上递送至分区。在一些实施方案中，核酸条形码分子可以经由珠粒递送至分区。下文进一步详细描述珠粒。
在一些实施方案中，核酸条形码分子可以首先与珠粒缔合，然后从珠粒中释放出来。在一些实施方案中，核酸条形码分子的释放可以是被动的(例如，通过扩散出珠粒)。此外或另选地，从珠粒的释放可以是在施加刺激后进行的，该刺激允许条形码化核酸分子解离或从珠粒释放。这种刺激可以破坏珠粒，即，将核酸条形码分子偶联至珠粒或偶联在珠粒内或两者兼有的相互作用。这种刺激可以包括例如热刺激、光刺激、化学刺激(例如，pH变化或使用还原剂)、机械刺激、辐射刺激；生物刺激(例如，酶)或它们的任何组合。在美国专利公开号2019/0367997和2019/0064173以及国际申请号PCT/US20/17785和PCT/US20/020486中提供了用于将携带条形码的珠粒分隔到液滴中的方法和系统。
有利的是，分隔生物颗粒和携带条形码的珠粒的离散液滴可以有效地允许条形码归属于分区内的生物颗粒的大分子成分。分区的内容物可以与其他分区的内容物保持离散。
在操作中，条形码化寡核苷酸可以被释放(例如，在分区中)，如本文其他地方所述。另选地，结合于珠粒(例如，凝胶珠粒)的核酸分子可以用于杂交和捕获珠粒固相上的分析物(例如，一种或多种类型的分析物)。
在一些实例中，珠粒、生物颗粒(例如，标记的细胞诸如B细胞、细胞珠粒或细胞核)和液滴可以沿着通道(例如，微流体装置的通道)流动，在一些情况下以基本上规则的流型(例如，以规则的流速)流动。此类规则流型可以允许液滴包括单个珠粒和单个生物颗粒。此类规则流型可以允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的占据率(例如，具有珠粒和生物颗粒的液滴)。在例如美国专利公开号2015/0292988中提供了此类规则流型和可以用于提供此类规则流型的装置。
珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或它们的任何组合。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的、可破坏的或可降解的。在一些情况下，珠粒可以不是可降解的。在一些情况下，珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由分子前体(诸如聚合物或单体物类)形成。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可以包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在其他情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。
珠粒可以具有任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形的、圆形、圆柱形以及它们的变型。
珠粒可以具有一致的尺寸或非均一的尺寸。在一些情况下，珠粒的直径可以为至少约10纳米(nm)、100nm、500nm、1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠粒可以具有小于约10nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小的直径。在一些情况下，珠粒可以具有约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在某些方面，珠粒可以以具有相对单分散的尺寸分布的珠粒群体或多个珠粒的形式提供。在可能期望在分区内提供相对一致的量的试剂的情况下，维持相对一致的珠粒特性(诸如尺寸)可以有助于总体的一致性。在一些实施方案中，本文所述的珠粒可以具有这样的尺寸分布，所述尺寸分布具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小的珠粒横截面尺寸的变异系数。
可用于本公开的方法和组合物中的珠粒可以包含一系列天然和/或合成的聚合材料。例如，珠粒可以包含天然聚合物、合成聚合物或天然聚合物和合成聚合物两者。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，诸如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、蚕丝、聚羟基链烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯树胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐胶、琼脂糖、藻酸、藻酸盐或它们的天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶(spandex)、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)和/或它们的组合(例如，共聚物)。珠粒也可以由除聚合物之外的材料形成，所述材料包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些实施方案中，珠粒可以含有分子前体(例如，单体或聚合物)，所述分子前体可以经由分子前体的聚合来形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是能够经历进一步聚合(例如，经由化学交联键)的已经聚合的物类。在一些实施方案中，前体可以包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、寡聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠粒可以包含预聚物，所述预聚物是能够进一步聚合的寡聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠粒。在一些实施方案中，珠粒可以包含可以进一步聚合在一起的单独聚合物。在一些情况下，可以经由不同前体的聚合来生成珠粒，使得它们包含混合的聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些实施方案中，珠粒可以在聚合物前体(例如，单体、寡聚物、线型聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间包含共价键或离子键。在一些实施方案中，共价键可以是碳-碳键、硫醚键或碳-杂原子键。
交联可以是永久的或可逆的，这取决于所使用的特定交联剂。可逆交联可以允许聚合物在适当的条件下线性化或解离。在一些实施方案中，可逆交联也可以允许结合于珠粒表面的材料的可逆连接。在一些实施方案中，交联剂可以形成二硫键。在一些实施方案中，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或经修饰的胱胺。
在一些实施方案中，二硫键可以在掺入到珠粒中的分子前体单元(例如，单体、寡聚物或线型聚合物)或前体与核酸分子(例如，寡核苷酸)之间形成。胱胺(包括经修饰的胱胺)例如是包含二硫键的有机剂，其可以用作珠粒的单独单体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可以在存在胱胺或包含胱胺的物类(例如，经修饰的胱胺)的情况下聚合，以生成包含二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如，包含可化学还原的交联剂的可化学降解的珠粒)。二硫键可以在珠粒暴露于还原剂时允许珠粒被降解(或溶解)。
在一些实施方案中，壳聚糖(一种线性多糖聚合物)可以经由亲水链与戊二醛交联以形成珠粒。壳聚糖聚合物的交联可以通过由热、压力、pH变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些实施方案中，珠粒可以包含acrydite部分，其在某些方面可以用于将一个或多个核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)连接至珠粒。在一些情况下，acrydite部分可以指由acrydite与一种或多种物类反应(诸如，在聚合反应期间acrydite与其他单体和交联剂的反应)生成的acrydite类似物。可以修饰acrydite部分以与待连接的物类诸如核酸分子(例如，条形码序列、条形码化核酸分子、条形码化寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)形成化学键。Acrydite部分可以用能够形成二硫键的巯基基团修饰，或者可以用已经包含二硫键的基团修饰。巯基或二硫键(通过二硫键交换)可以用作待连接的物类的锚定点，或者acrydite部分的另一部分可以用于连接。在一些情况下，连接可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在存在还原剂的情况下)，连接的物类从珠粒释放。在其他情况下，acrydite部分可以包含可以用于连接的反应性羟基基团。
为连接核酸分子(例如，寡核苷酸)而对珠粒的功能化可以通过多种不同的方法来实现，包括聚合物内化学基团的活化、聚合物结构中活性或可激活的官能团的掺入，或者在珠粒产生的预聚物或单体阶段的连接。
例如，聚合以形成珠粒的前体(例如，单体、交联剂)可以包含acrydite部分，使得当生成珠粒时，该珠粒还包含acrydite部分。可以将acrydite部分连接至核酸分子(例如，寡核苷酸)，该核酸分子可以包括引物序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、信使RNA的引物序列)和/或一个或多个条形码序列。一个或多个条形码序列可以包括对于偶联至给定珠粒的所有核酸分子而言相同的序列和/或在偶联至给定珠粒的所有核酸分子中不同的序列。可以将核酸分子掺入到珠粒中。
在一些实施方案中，核酸分子可以包含功能序列(例如用于连接至测序流通池)，例如用于测序的P5序列。在一些情况下，核酸分子或其衍生物(例如，从核酸分子生成的寡核苷酸或多核苷酸)可以包含另一功能序列，例如用于连接至测序流通池以进行Illumina测序的P7序列。在一些情况下，核酸分子可以包含条形码序列。在一些情况下，引物还可以包含独特分子标识符(UMI)。在一些情况下，引物可以包含用于Illumina测序的R1引物序列。在一些情况下，引物可以包含用于Illumina测序的R2引物序列。可以与本公开的组合物、装置、方法和系统一起使用的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)及其用途的实例提供于美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中。
图23示出了携带条形码的珠粒的实例。核酸分子1502(诸如寡核苷酸)可以通过可释放的键1506(例如二硫化物接头)偶联至珠粒1504。相同的珠粒1504可以(例如，经由可释放的键)偶联至一个或多个其他核酸分子1518、1520。核酸分子1502可以是或包含条形码。如本文其他地方所述，条形码的结构可以包含多个序列元件。核酸分子1502可以包含可以在后续处理中使用的功能序列1508。例如，功能序列1508可以包括测序仪特异性流通池连接序列(例如，用于测序系统的P5序列)和测序引物序列(例如，用于/>测序系统的R1引物)中的一者或多者。核酸分子1502可以包含用于使样品(例如，DNA、RNA、蛋白质等)条形码化的条形码序列1510。在一些情况下，条形码序列1510可以是珠粒特异性的，使得条形码序列1510对于偶联至相同珠粒1504的所有核酸分子(例如，包括核酸分子1502)是共有的。另选地或此外，条形码序列1510可以是分区特异性的，使得条形码序列1510对于与一个或多个被分隔到相同分区中的珠粒偶联的所有核酸分子是共有的。核酸分子1502可以包含特异性引物序列1512，诸如mRNA特异性引物序列(例如，多聚T序列)、靶向引物序列和/或随机引物序列。核酸分子1502可以包含锚定序列1514，以确保特异性引物序列1512在(例如，mRNA的)序列末端杂交。例如，锚定序列1514可以包括核苷酸的随机短序列，诸如1-mer、2-mer、3-mer或更长的序列，其可以确保多聚T片段更可能在mRNA的多聚A尾的序列末端杂交。
核酸分子1502可以包含独特分子鉴定序列1516(例如，独特分子标识符(UMI))。在一些情况下，独特分子鉴定序列1516可以包含约5至约8个核苷酸。另选地，独特分子鉴定序列1516可以压缩少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子鉴定序列1516可以是在偶联至单个珠粒(例如，珠粒1504)的单独核酸分子(例如，1502、1518、1520等)之间变化的独特序列。在一些情况下，独特分子鉴定序列1516可以是随机序列(例如，诸如随机N-mer序列)。例如，UMI可以提供被捕获的起始mRNA分子的独特标识符，以便允许定量初始表达的RNA的数量。应当理解，尽管图23示出了偶联至珠粒1504的表面的三个核酸分子1502、1518、1520，但是单独珠粒可以偶联至任何数量的单独核酸分子，例如，从一个到数十个到数十万个或甚至数百万个单独核酸分子。单独核酸分子的相应条形码可以包含在偶联至相同珠粒的不同单独核酸分子之间的共同序列片段或相对共同的序列片段(例如1508、1510、1512等)和可变或独特的序列片段(例如1516)。
在操作中，可以将生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒、细胞核、DNA、RNA等)连同带有条形码的珠粒1504一起共同分隔。可以从分区中的珠粒1504释放核酸条形码分子1502、1518、1520。举例来说，在分析样品RNA的上下文中，释放的核酸分子之一(例如，1502)的多聚T片段(例如，1512)可以与mRNA分子的多聚A尾杂交。逆转录可以产生mRNA的cDNA转录物，但是该转录物包括核酸分子1502的每个序列片段1508、1510、1516。由于核酸分子1502包含锚定序列1514，因此其更可能与mRNA的多聚A尾的序列末端杂交并引发逆转录。在任何给定的分区内，单独mRNA分子的所有cDNA转录物都可以包含一个共同的条形码序列片段1510。然而，由给定分区内的不同mRNA分子制备的转录物可能会在独特分子鉴定序列1512片段(例如，UMI片段)处发生变化。有利的是，即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后，不同UMI的数量也可以指示源自给定分区的mRNA的量，并因此指示源自生物颗粒(例如，细胞、细胞核或细胞珠粒)的mRNA的量。如上所述，可以对转录物进行扩增、净化和测序以鉴定mRNA的cDNA转录物的序列，以及对条形码片段和UMI片段进行测序。虽然描述了多聚T引物序列，但其他靶靶向或随机引物序列也可以用于引发逆转录反应。同样，尽管描述为将条形码化寡核苷酸释放到分区中，但是在一些情况下，结合于珠粒(例如，凝胶珠粒)的核酸分子可以用于杂交和捕获珠粒固相上的mRNA，例如，以促进RNA与其他细胞或细胞核内容物的分离。在此类情况下，可以在分区中或分区外(例如，批量)执行进一步的处理。例如，可以对珠粒上的RNA分子进行逆转录或其他核酸处理，可以将附加衔接子序列添加到条形码化核酸分子，或者可以进行其他核酸反应(例如，扩增、核酸延伸)。珠粒或其产物(例如，条形码化核酸分子)可以从分区收集和/或合并在一起，随后进行净化和进一步表征(例如，测序)。
本文所述的操作可以在任何可用或合适的步骤中执行。例如，可以在将样品引入分区(例如，孔或液滴)中之前、期间或之后将包括核酸条形码分子的珠粒引入分区中。可以对样品的核酸分子进行条形码化，这可以发生在珠粒上(在核酸分子保持偶联至珠粒的情况下)或者在核酸条形码分子释放到分区中之后。在来自样品的核酸分子保持连接至珠粒的情况下，可以收集、合并来自各种分区的珠粒，并对其进行进一步处理(例如，逆转录、衔接子连接、扩增、净化和/或测序)。在其他情况下，处理可以发生在分区中。例如，可以在分区中提供足以进行条形码化、衔接子连接、逆转录或其他核酸处理操作的条件，并且这在净化和测序之前进行。
在一些情况下，珠粒可以包括捕获序列或结合序列，其配置为结合于对应捕获序列或结合序列。在一些情况下，珠粒可以包括多个不同的捕获序列或结合序列，其配置为结合于不同的相应对应捕获序列或结合序列。例如，珠粒可以包括各自配置为结合于第一对应捕获序列的第一子组一个或多个捕获序列、各自配置为结合于第二对应捕获序列的第二子组一个或多个捕获序列、各自配置为结合于第三对应捕获序列的第三子组一个或多个捕获序列等。珠粒可以包括任何数量的不同捕获序列。在一些情况下，珠粒可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的捕获序列或结合序列，其配置为分别结合于不同的相应捕获序列或结合序列。另选地或此外，珠粒可以包括至多约10、9、8、7、6、5、4、3或2个不同的捕获序列或结合序列，其配置为结合于不同的相应捕获序列或结合序列。在一些情况下，不同的捕获序列或结合序列可以配置为促进相同类型的分析物的分析。在一些情况下，不同的捕获序列或结合序列可以配置为促进不同类型的分析物(具有相同珠粒)的分析。捕获序列可以被设计为连接至对应捕获序列。有利地，这种对应捕获序列可以被引入或以其他方式被诱导到生物颗粒(例如，细胞、细胞核、细胞珠粒等)中以便以各种格式(例如，包括对应捕获序列的条形码化抗体、包括对应捕获序列的条形码化MHC dextramer、包括对应捕获序列的条形码化指导RNA分子等)进行不同的测定法，使得对应捕获序列可以在稍后与和珠粒缔合的捕获序列相互作用。在一些情况下，偶联至珠粒(或其他支持物)的捕获序列可以配置为连接至接头分子，诸如夹板(splint)分子，其中接头分子配置为通过接头分子将珠粒(或其他支持物)偶联至其他分子，诸如偶联至一种或多种分析物或一种或多种其他接头分子。
图24示出了根据本公开的一些实施方案的携带条形码的珠粒的非限制性实例。核酸分子1605(诸如寡核苷酸)可以通过可释放的键1606(例如二硫化物接头)偶联至珠粒1604。核酸分子1605可以包含第一捕获序列1660。相同的珠粒1604可以例如经由可释放的键偶联至包括其他捕获序列的一个或多个其他核酸分子1603、1607。核酸分子1605可以是或包含条形码。如本文其他地方所述，条形码的结构可以包含许多序列元件，诸如功能序列1608(例如，流通池连接序列、测序引物序列等)、条形码序列1610(例如，珠粒共有的珠粒特异性序列、分区共有的分区特异性序列等)和独特分子标识符1612(例如，与珠粒相连的不同分子内的独特序列)，或其部分序列。捕获序列1660可以配置为连接至对应捕获序列1665(例如，捕获柄)。在一些情况下，对应捕获序列1665可以偶联至另一种分子，该分子可以是分析物或中间载体。例如，如图24所示，对应捕获序列1665偶联至包括靶序列1664的指导RNA分子1662，其中靶序列1664配置为连接至分析物。连接至珠粒1604的另一个寡核苷酸分子1607包括第二捕获序列1680，其配置为连接至第二对应捕获序列(例如，捕获柄)1685。如图24所示，第二对应捕获序列1685偶联至抗体1682。在一些情况下，抗体1682可以具有对分析物(例如，表面蛋白)的结合特异性。另选地，抗体1682可以不具有结合特异性。连接至珠粒1604的另一个寡核苷酸分子1603包括第三捕获序列470，其配置为连接至第二对应捕获序列1675。如图24所示，第三对应捕获序列(例如，捕获柄)1675偶联至分子1672。分子1672可以配置为或可以不配置为靶向分析物。其他寡核苷酸分子1603、1607可以包括相对于寡核苷酸分子1605描述的其他序列(例如，功能序列、条形码序列、UMI等)。虽然在图24中示出了包括每个捕获序列的单个寡核苷酸分子，但是应当理解，对于每个捕获序列，珠粒可以包括一组一个或多个寡核苷酸分子，每个寡核苷酸分子包括捕获序列。例如，珠粒可以包括任何数量的组的一个或多个不同的捕获序列。另选地或此外，珠粒1604可以包括其他捕获序列。另选地或此外，珠粒1604可以包括更少类型的捕获序列(例如，两个捕获序列)。另选地或此外，珠粒1604可以包括寡核苷酸分子，该寡核苷酸分子包括引物序列，诸如特异性引物序列，如mRNA特异性引物序列(例如，多聚T序列)、靶向引物序列和/或随机引物序列，例如以促进基因表达的测定。
本文描述了条形码化序列的生成，参见例如图23。
在一些实施方案中，可以将包含反应性的或能够被活化以使其变为反应性的官能团的前体与其他前体聚合，以生成包含活化或可活化的官能团的凝胶珠粒。然后，该官能团可以用于将附加物类(例如，二硫化物接头、引物、其他寡核苷酸等)连接至凝胶珠粒。例如，一些包含羧酸(COOH)基团的前体可以与其他前体共聚，以形成还包含COOH官能团的凝胶珠粒。在一些情况下，丙烯酸(包含游离COOH基团的物类)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可以共聚在一起以生成包含游离COOH基团的凝胶珠粒。可以活化凝胶珠粒的COOH基团(例如，经由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM))，使得其是反应性的(例如，在EDC/NHS或DMTMM用于激活的情况下，对胺官能团是反应性的)。然后，活化的COOH基团可以与包含将要连接至珠粒的部分的适当物类(例如，在羧酸基团被活化而对胺官能团具有反应性的情况下，包含胺官能团的物类)反应。
可以通过使一些二硫键还原为游离巯基，将在其聚合物网络中包含二硫键的珠粒用附加物类功能化。可以通过例如还原剂(例如，DTT、TCEP等)的作用使二硫键还原以生成游离的巯基基团，而不溶解珠粒。然后，珠粒的游离巯基可以与物类的游离巯基或者与包含另一个二硫键的物类反应(例如，通过巯基-二硫键交换)，使得该物类可以连接至珠粒(例如，通过生成的二硫键)。在一些情况下，珠粒的游离巯基可以与任何其他合适的基团反应。例如，珠粒的游离巯基可以与包含acrydite部分的物类反应。珠粒的游离巯基基团可以通过迈克尔加成化学来与acrydite反应，使得包含acrydite的物类连接至珠粒。在一些情况下，可以通过加入巯基封端剂诸如N-乙基马来酰亚胺或碘乙酸盐来防止不受控制的反应。
可以控制珠粒内的二硫键的活化，使得只有少量的二硫键被活化。可以例如通过控制用于生成游离巯基基团的还原剂的浓度和/或控制用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加控制。在一些情况下，低浓度(例如，还原剂:凝胶珠粒的分子比率小于或等于约1:100,000,000,000、小于或等于约1:10,000,000,000、小于或等于约1:1,000,000,000、小于或等于约1:100,000,000、小于或等于约1:10,000,000、小于或等于约1:1,000,000、小于或等于约1:100,000、小于或等于约1:10,000)的还原剂可以用于还原。控制被还原成游离巯基的二硫键的数量对于确保在功能化期间珠粒结构完整性可能是有用的。在一些情况下，光活性剂诸如荧光染料可以经由珠粒的游离巯基偶联至珠粒，并且用于定量珠粒中存在的游离巯基的数量和/或跟踪珠粒。
在一些实施方案中，在凝胶珠粒形成之后向凝胶珠粒添加部分可能是有利的。例如，在凝胶珠粒形成后添加寡核苷酸(例如，条形码化寡核苷酸，诸如条形码化核酸分子)可以避免在聚合期间可能发生的链转移终止过程中的物类损失。此外，较小的前体(例如，不包含侧链基团和连接的部分的单体或交联剂)可以用于聚合，并且可以最低限度地因粘滞效应而被阻碍生长链末端。在一些情况下，在凝胶珠粒合成之后的功能化可以使待负载的物类(例如，寡核苷酸)在潜在的损伤剂(例如，自由基)和/或化学环境中的暴露最小化。在一些情况下，所生成的凝胶可以具有上临界溶解温度(UCST)，该温度可以允许珠粒的温度驱动溶胀和塌缩。这种功能性可以在随后用寡核苷酸对珠粒的功能化期间帮助寡核苷酸(例如，引物)渗透到珠粒中。产生后的功能化还可以用于控制珠粒中物类的负载比，使得例如负载比的变异性最小化。物类负载还可以在分批过程中进行，使得多个珠粒可以在单批中用该物类功能化。
注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以包含可释放地、可裂解地或可逆地连接的条形码(例如，分区条形码序列)。注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以包含可活化的条形码。注入或以其他方式引入到分区中的珠粒可以是可降解的、可破坏的或可溶解的珠粒。
条形码可以是可释放地、可裂解地或可逆地连接至珠粒，使得条形码可以通过条形码分子和珠粒之间的键的裂解而被释放或可释放，或通过基础珠粒自身的降解而被释放，从而允许条形码被其他试剂接近或可接近，或两者。在非限制性实例中，可以通过还原二硫键，使用限制性酶、光活化的裂解或经由其他类型的刺激(例如，化学、热、pH、酶促等)裂解和/或反应来实现裂解，如本文其他地方所述。可释放的条形码有时可以称为可活化的，因为其一旦被释放即可用于反应。因此，例如，可以通过将条形码从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)释放来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中也设想了其他可活化的构型。
作为珠粒和缔合的分子诸如含有条形码的核酸分子(例如，条形码化寡核苷酸)之间的可裂解的键的补充或替代，珠粒可以是自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物类或化学相、暴露于光、还原剂等)时可降解的、可破坏的或可溶解的。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的，使得当暴露于特定化学物类或环境变化(诸如温度变化或pH变化)时，珠粒的材料组分溶解。在一些情况下，凝胶珠粒可以在升高的温度和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠粒可以是可热降解的，使得当珠粒暴露于适当的温度变化(例如，热)时，珠粒降解。与物类(例如，核酸分子，例如条形码化寡核苷酸)结合的珠粒的降解或溶解可以导致该物类从珠粒释放。
从上述公开内容将会理解，珠粒的降解可以指结合的(例如，配置为与分泌的抗体或其抗原结合片段偶联的捕获剂)或夹带的物类(例如，标记的B细胞或记忆B细胞或分泌的抗体或其抗原结合片段)从珠粒上的离解，伴随和不伴随物理珠粒自身的结构降解。例如，珠粒的降解可以涉及经由本文其他地方描述的一种或多种物类和/或方法使可裂解的键的裂解。在另一个实例中，夹带的物类可以通过例如由于化学环境改变导致的渗透压差而从珠粒释放。举例来说，通常可能在珠粒自身没有结构降解的情况下发生因渗透压差引起的珠粒孔径的改变。在一些情况下，因珠粒的渗透性溶胀引起的孔径的增加可以允许珠粒内夹带的物类释放。在其他情况下，由于孔径缩小，珠粒的渗透性收缩可以使珠粒更好地保持夹带的物类。
可以将可降解的珠粒引入到分区(诸如乳液的液滴或孔)中，使得当施加适当的刺激时，珠粒在分区内降解并且任何缔合的物类(例如，寡核苷酸)均被释放到液滴内。游离物类(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其他试剂相互作用。例如，可以将包含胱胺且经由二硫键连接至条形码序列的聚丙烯酰胺珠粒与还原剂在油包水乳液的液滴内组合。在液滴内，该还原剂可以破坏各个二硫键，导致珠粒降解和条形码序列释放到液滴的水性内环境中。在另一个实例中，将包含珠粒结合的条形码序列的液滴在碱性溶液中加热也可以导致珠粒降解和所连接的条形码序列释放到液滴的水性内环境中。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)都可以与珠粒缔合，使得从珠粒释放后，分子标签分子(例如，引物，例如条形码化寡核苷酸)以预定义的浓度存在于分区中。可以选择这种预定义的浓度以促进用于在分区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义的浓度可以通过产生带有核酸分子(例如，寡核苷酸)的珠粒的过程来限制。
在一些情况下，珠粒可以非共价地负载有一种或多种试剂。可以通过例如以下方式非共价地负载珠粒：使珠粒经受足以溶胀珠粒的条件，使试剂有足够的时间扩散到珠粒内部中，以及使珠粒经受足以去溶胀珠粒的条件。珠粒的溶胀可以例如通过以下方式完成：将珠粒置于热力学上有利的溶剂中，使珠粒经受较高或较低的温度，使珠粒经受较高或较低的离子浓度，和/或使珠粒经受电场。珠粒的溶胀可以通过各种溶胀方法完成。珠粒的去溶胀可以例如通过以下方式完成：将珠粒转移到热力学上不利的溶剂中，使珠粒经受较低或较高的温度，使珠粒经受较低或较高的离子浓度，和/或去除电场。珠粒的去溶胀可以通过各种去溶胀方法完成。转移珠粒可能会导致珠粒中的孔收缩。然后，收缩可能会阻碍珠粒内的试剂扩散出珠粒的内部。该阻碍可能是由于试剂与珠粒内部之间的空间相互作用。转移可以通过微流体完成。例如，转移可以通过将珠粒从一种协流溶剂流移动至不同协流溶剂流来实现。珠粒的可溶胀性和/或孔径可以通过改变珠粒的聚合物组成来调节。
在一些情况下，连接至前体的acrydite部分、连接至前体的另一物类或前体自身可以包含不稳定键，诸如化学、热或光敏感的键，例如二硫键、UV敏感的键等。一旦acrydite部分或包含不稳定键的其他部分被掺入到珠粒中，该珠粒也可以包含该不稳定键。不稳定键可以例如用于将物类(例如，条形码、引物等)可逆地连接(例如，共价连接)至珠粒。在一些情况下，热不稳定的键可以包括基于核酸杂交的连接(例如，在寡核苷酸与连接至珠粒的互补序列杂交的情况下)，使得杂交体的热解链从珠粒释放寡核苷酸，例如，含有条形码的序列。
向凝胶珠粒添加多种类型的不稳定键可以使得生成能够响应于不同刺激的珠粒。每种类型的不稳定键可能对相关的刺激(例如，化学刺激、光、温度、酶促等)敏感，使得可以通过施加适当的刺激来控制经由每种不稳定键连接至珠粒的物类的释放。这种功能性可能对物类从凝胶珠粒上的受控释放是有用的。在一些情况下，可以在凝胶珠粒形成后经由例如如上文所述的凝胶珠粒的活化官能团将包含不稳定键的另一物类连接至凝胶珠粒。应当理解，可释放地、可裂解地或可逆地连接至本文所述的珠粒的条形码包括通过条形码分子与珠粒之间的键的裂解而被释放或可释放的条形码，或通过基础珠粒自身的降解而被释放的条形码，从而允许条形码被其他试剂接近或可接近，或两者。
如本文所述的可释放的条形码有时可以称为可活化的，因为其一旦被释放即可用于反应。因此，例如，可以通过将条形码从珠粒(或本文所述的其他合适类型的分区)释放来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的上下文中也设想了其他可活化的构型。
除了热可裂解的键、二硫键和UV敏感的键之外，可以偶联至前体或珠粒的不稳定键的其他非限制性实例还包括酯键(例如，可用酸、碱或羟胺裂解的)、邻二醇键(例如，可经由高碘酸钠裂解的)、狄尔斯–阿尔德(Diels-Alder)键(例如，可经由热裂解的)、砜键(例如，可经由碱裂解的)、甲硅烷基醚键(例如，可经由酸裂解的)、糖苷键(例如，可经由淀粉酶裂解的)、肽键(例如，可经由蛋白酶裂解的)或磷酸二酯键(例如，可经由核酸酶(例如，DNA酶)裂解的)。可以经由其他核酸分子靶向酶诸如限制性酶(例如，限制性核酸内切酶)来裂解键，如下文进一步描述。
可以在珠粒生成期间(例如，在前体聚合期间)将物类包封在珠粒(例如，捕获剂)中。此类物类可以参与或可以不参与聚合。此类物类可以进入聚合反应混合物中，使得在珠粒形成时所生成的珠粒包含该物类。在一些情况下，此类物类可以在凝胶珠粒形成后添加至凝胶珠粒。此类物类可以包括例如核酸分子(例如，寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTP、包括本文所述的那些的辅因子(例如，离子辅因子、缓冲液)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物、缓冲液)、用于核酸修饰反应(诸如聚合、连接或消化)的试剂、和/或用于一个或多个测序平台(例如，的/>)的模板制备(例如，标签化)的试剂。此类物类可以包括本文所述的一种或多种酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性酶(例如，核酸内切酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。此类物类可以包括本文其他地方所述的一种或多种试剂(例如，裂解剂、抑制剂、失活剂、螯合剂、刺激)。可以通过前体聚合期间生成的聚合物网络密度、凝胶珠粒内离子电荷的控制(例如，经由连接至聚合物类的离子物类)或者通过其他物类的释放来控制此类物类的捕获。在珠粒降解时和/或通过施加能够从珠粒中释放物类的刺激，可以从珠粒中释放包封的物类。另选地或此外，可以在分区形成期间或之后在分区(例如，液滴)中分隔物类。此类物类可以包括但不限于也可以包封在珠粒中的上述物类。
可降解的珠粒可以包含一种或多种具有不稳定键的物类，使得当珠粒/物类暴露于适当的刺激时，该键被破坏并且珠粒降解。该不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)，或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于生成珠粒的交联剂可以包含不稳定键。在暴露于适当的条件时，不稳定键可以被破坏并且珠粒降解。例如，在包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠粒暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可以被破坏并且珠粒降解。
当向珠粒施加适当的刺激时，与不降解的珠粒相比，可降解的珠粒可以用于更快地从珠粒释放连接的物类(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合于多孔珠粒内表面的物类或在包封的物类的情况下，在珠粒降解时，该物类可以具有更高的迁移性和对溶液中其他物类的易接近性。在一些情况下，还可以通过可降解的接头(例如，二硫化物接头)将物类连接至可降解的珠粒。可降解的接头可以与可降解的珠粒响应于相同的刺激，或者这两种可降解的物类可以响应于不同的刺激。例如，可以经由二硫键将条形码序列连接至包含胱胺的聚丙烯酰胺珠粒。在条形码化珠粒暴露于还原剂时，珠粒降解，并且在条形码序列与珠粒之间的二硫键以及珠粒中的胱胺的二硫键断裂时条形码序列得到释放。
从上述公开内容将会理解，虽然称为珠粒的降解，但在许多上文提到的情况下，该降解可以指结合的或夹带的物类从珠粒上的离解，伴随和不伴随物理珠粒自身的结构降解。例如，夹带的物类可以通过例如由于化学环境改变导致的渗透压差而从珠粒释放。举例来说，通常可能在珠粒自身没有结构降解的情况下发生因渗透压差引起的珠粒孔径的改变。在一些情况下，因珠粒的渗透性溶胀引起的孔径的增加可以允许珠粒内夹带的物类释放。在其他情况下，由于孔径缩小，珠粒的渗透性收缩可以使珠粒更好地保持夹带的物类。
在提供可降解的珠粒的情况下，可能有利的是避免在给定时间之前将此类珠粒暴露于导致这种降解的一种或多种刺激，以便例如避免珠粒过早降解以及由这种降解所引发的问题，包括例如流动特性差和聚集。举例来说，在珠粒包含可还原的交联基团诸如二硫化物基团的情况下，将期望避免使此类珠粒与还原剂(例如，DTT或其他二硫键裂解试剂)接触。在此类情况下，对本文所述珠粒的处理在一些情况下将在无还原剂(诸如DTT)时提供。由于还原剂通常在商业酶制剂中提供，因此可能期望在处理本文所述的珠粒时提供无还原剂(或无DDT)的酶制剂。此类酶的实例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及许多其他可以用于处理本文所述的珠粒的酶制剂。术语“无还原剂的”或“无DTT的”制剂可以指具有在降解珠粒中使用的此类材料的下限范围的小于约1/10、小于约1/50或甚至小于约1/100的制剂。例如，对于DTT，无还原剂的制剂可以具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM DTT、0.0005mM DTT或甚至小于约0.0001mM DTT。在许多情况下，DTT的量可能是检测不到的。
许多化学触发物可以用于触发珠粒的降解。这些化学变化的实例可以包括但不限于pH介导的珠粒内组分完整性变化、经由交联键的裂解发生的珠粒组分的降解以及珠粒组分的解聚。
在一些实施方案中，珠粒可以由包含可降解化学交联剂(诸如BAC或胱胺)的材料形成。此类可降解交联剂的降解可以通过多种机制实现。在一些实例中，可以使珠粒与可诱导氧化、还原或其他化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的附加实例可以包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或它们的组合。还原剂可以降解在形成珠粒的凝胶前体之间形成的二硫键，因此降解珠粒。在其他情况下，溶液pH的变化(诸如pH增加)可以触发珠粒的降解。在其他情况下，暴露于水溶液(诸如水)可以触发水解降解，因此降解珠粒。在一些情况下，刺激的任何组合都可以触发珠粒的降解。例如，pH的改变可以使化学剂(例如，DTT)能够成为有效的还原剂。
当施加热刺激时，也可以诱导珠粒释放其内容物。温度的变化可以引起珠粒的多种变化。例如，热可以引起固体珠粒液化。热的变化可以引起珠粒的熔化，使得珠粒的一部分降解。在其他情况下，热可以增加珠粒组分的内部压力，使得珠粒破裂或爆炸。热还可以作用于用作构建珠粒的材料的热敏性聚合物。
任何合适的试剂都可以降解珠粒。在一些实施方案中，温度或pH的变化可以用于降解珠粒内的热敏的或pH敏感的键。在一些实施方案中，化学降解剂可以用于通过氧化、还原或其他化学变化来降解珠粒内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，诸如DTT，其中DTT可以降解在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠粒。在一些实施方案中，可以添加还原剂以降解珠粒，这可以引起或可以不引起珠粒释放其内容物。还原剂的实例可以包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或它们的组合。还原剂可以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM或10mM的浓度存在。还原剂可以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更低的浓度存在。
任何合适数量的分子标签分子(例如，引物、条形码化寡核苷酸)都可以与珠粒缔合，使得从珠粒释放后，分子标签分子(例如，引物，例如条形码化寡核苷酸)以预定义的浓度存在于分区中。可以选择这种预定义的浓度以促进用于在分区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义的浓度可以通过产生带有寡核苷酸的珠粒的过程来限制。
尽管上文已经在提供基本上单占据的分区方面描述了图13和图16，但是在某些情况下，可能期望提供多重占据的分区，例如在单个分区内包含两个、三个、四个或更多个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)和/或包括核酸条形码分子(例如，寡核苷酸)的珠粒(例如，如本文其他地方所述的多组学方法)。因此，如上所述，可以控制含有生物颗粒和/或珠粒的流体和分隔流体的流动特性，以提供此类多重占据的分区。具体地讲，可以控制流动参数，以提供大于约50％、大于约75％并在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的分区的给定占据率。
在一些情况下，可以使用附加珠粒将附加试剂递送到分区。在此类情况下，可能有利的是通过进入共同通道或液滴生成连接部(例如，连接部1210)的不同通道入口，从不同的珠粒来源(例如，含有不同相关试剂)向此类共同通道或液滴生成连接部中引入不同的珠粒。在此类情况下，可以控制不同珠粒进入该通道或连接部中的流动和频率，以提供特定比率的来自每个来源的珠粒，同时确保此类珠粒的给定配对和组合与给定数量的生物颗粒一起进入分区(例如，每个分区有一个生物颗粒和一个珠粒)。
本文所述的分区可以包括小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小。
例如，在基于液滴的分区的情况下，液滴的总体积可以小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更少。在与珠粒共同分隔的情况下，应当理解，分区内的样品流体体积(例如，包括共同分隔的生物颗粒和/或珠粒)可以为上述体积的小于约90％、上述体积的小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
如本文其他地方所描述的，分隔的物类可以生成群体或多个分区。在此类情况下，可以生成或以其他方式提供任何合适数量的分区。例如，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区、至少约1,000,000,000个分区或更多个分区。此外，所述多个分区可以包括未被占据的分区(例如，空的分区)和被占据的分区。
试剂
根据某些方面，可以将生物颗粒连同裂解试剂一起分隔，以释放该分区内的生物颗粒的内容物。参见例如美国专利公开2018/0216162(现为美国专利10,428,326)、美国专利公开2019/0100632(现为美国专利10,590,244)以及美国专利公开2019/0233878。可以将生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒、细胞核、细胞器等)连同核酸条形码分子一起分隔，并且可以如本文其他地方所述的那样使生物颗粒(例如，mRNA、cDNA、gDNA等)的核酸分子或来源于生物颗粒的核酸分子条形码化。在一些实施方案中，将生物颗粒与携带条形码的珠粒(例如，凝胶珠粒)共同分隔，并且如本文其他地方所述的那样使生物颗粒的核酸分子或来源于生物颗粒的核酸分子条形码化。在此类情况下，裂解剂可以在诸如通过通道连接部上游的一个或多个附加通道将生物颗粒引入到分隔连接部/液滴生成区(例如，连接部1210)中的同时或紧接在其之前与生物颗粒悬浮液接触。根据其他方面，附加地或另选地，生物颗粒可以连同其他试剂一起分隔，如将在下文进一步描述。
有利的是，当裂解试剂和生物颗粒被共同分隔时，裂解试剂可以促进在分区内释放生物颗粒的内容物。.分区中释放的内容物可以与其他分区的内容物保持离散。
应当理解，本文所述的通道段可以联接至多种不同流体源或接收部件中的任何一者，包括储库、管道、歧管或其他系统的流体部件。可以理解，微流体通道结构可以具有其他几何形状和/或配置。例如，微流体通道结构可以具有超过两个通道连接部。
例如，微流体通道结构可以具有各自携带相同或不同类型的珠粒、试剂和/或生物颗粒的2、3、4、5个或更多个通道段，这些通道段在通道连接部处相遇。可以控制每个通道段中的流体流动，以控制将不同元素分隔到液滴中。流体可以经由一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。也可以或另行经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和可从例如Sigma-Aldrich,Inc.(StLouis,MO)获得的多种其他裂解酶，以及其他可商购获得的裂解酶。其他裂解剂可以附加地或另选地与生物颗粒共同分隔，以引起生物颗粒的内容物释放到分区中。例如，在一些情况下，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液裂解细胞(例如，标记的工程化细胞)，但是对于其中表面活性剂可能干扰稳定乳液的基于乳液的体系而言，这些溶液可能不太理想。在某些情况下，裂解溶液可以包含非离子表面活性剂，诸如Triton X-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。电穿孔、热、声或机械细胞破坏也可以用于某些情况，例如基于非乳液的分隔，诸如生物颗粒的包封，其可以作为液滴分隔的补充或替代，其中在细胞破坏后包封物的任何孔径足够小到保留给定大小的核酸片段。
作为与上述生物颗粒(例如，标记的工程化细胞)共同分隔的裂解剂的替代或补充，其他试剂也可以与生物颗粒共同分隔，包括例如DNA酶和RNA酶失活剂或抑制剂，例如蛋白酶K、螯合剂诸如EDTA，以及用于去除或以其他方式减少不同细胞裂解物组分对后续核酸处理的负活性或影响的其他试剂。另外，就包封的生物颗粒(例如，包含标记的工程化细胞的细胞珠粒)而言，可以将生物颗粒暴露于适当的刺激以从共同分隔的细胞珠粒释放生物颗粒或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可以与包封的生物颗粒一起被共同分隔以允许包封材料降解以及细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下，该刺激可以与本文其他地方所述的用于从其相应珠粒释放核酸分子(例如，寡核苷酸)的刺激相同。在另选方面，这可以是不同且不重叠的刺激，以便允许包封的生物颗粒在与将核酸分子释放到相同分区中的不同时间释放到分区中。
附加试剂也可以与生物颗粒(例如，标记的工程化细胞)共同分隔，诸如使生物颗粒的DNA片段化的核酸内切酶、用于扩增生物颗粒的核酸片段并将条形码分子标签连接至扩增的片段的DNA聚合酶和dNTP。可以共同分隔其他酶，包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶K、DNA酶等。附加试剂还可以包括逆转录酶(包括具有末端转移酶活性的酶)、引物和寡核苷酸以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(本文也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板转换可以用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板转换可以用于将预定义的核酸序列补加至cDNA。在模板转换的实例中，cDNA可以由模板(例如细胞mRNA)的逆转录生成，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以以不依赖模板的方式向cDNA添加附加核苷酸，例如多聚C。转换寡核苷酸可以包括与附加核苷酸互补的序列，例如多聚G。cDNA上的附加核苷酸(例如，多聚C)可以与转换寡核苷酸上的附加核苷酸(例如，多聚G)杂交，由此逆转录酶可以将转换寡核苷酸用作模板以进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可以包含杂交区和模板区。杂交区可以包含能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况下，如先前所述，杂交区包含一系列G碱基，以与cDNA分子的3’末端的悬垂C碱基互补。该系列G碱基可以包括1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或超过5个G碱基。模板序列可以包含要掺入到cDNA中的任何序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可以包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；经修饰的核酸，包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、倒位dT、5-甲基dC、2’-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔-2’-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA，例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2’氟代碱基(例如，氟代C、氟代U、氟代A和氟代G)或任何组合。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。
一旦生物颗粒(例如，细胞诸如B细胞、细胞珠粒或细胞核)的内容物被释放到它们的相应分区中，其中包含的大分子成分(例如，生物颗粒的大分子成分，诸如RNA、DNA、蛋白质或分泌的抗体或其抗原结合片段)就可以在分区内被进一步处理。根据本文所述的方法和系统，可以为单独生物颗粒(例如，细胞诸如B细胞、细胞珠粒或细胞核)的大分子组分内容物提供独特标识符，使得在表征那些大分子组分时，它们可以被归属于来源于相同的一个或多个生物颗粒。将特性归属于单独生物颗粒或生物颗粒组的能力是通过将独特标识符特异性地分配给单独生物颗粒或生物颗粒组来提供的。可以将例如核酸条形码形式的独特标识符分配给单独生物颗粒或生物颗粒群体或与之相关联，以便用独特标识符标记或标示生物颗粒的大分子组分(以及因此其特性)。然后，这些独特标识符可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒群。
在一些方面，这是通过将单独生物颗粒(例如，细胞诸如B细胞、细胞珠粒或细胞核)或生物颗粒组(例如，细胞诸如B细胞、细胞珠粒或细胞核)与诸如上文所述(参考图12和图13)的独特标识符共同分隔来进行的。在一些方面，以核酸分子(例如，寡核苷酸)的形式提供独特标识符，所述核酸分子包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可以与单独生物颗粒的核酸内容物连接或以其他方式相关联，或与生物颗粒的其他组分连接，特别是与这些核酸的片段连接。核酸分子被分隔，使得在给定分区中的核酸分子之间时，包含在其中的核酸条形码序列是相同的，但是在不同分区之间时，核酸分子可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表在给定分析中所有分区中的大量不同的条形码序列。在一些方面，仅一个核酸条形码序列可以与给定分区相关联，但在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可以在核酸分子(例如，寡核苷酸)的序列内包含约6至约20个或更多个核苷酸。核酸条形码序列可以包含约6至约20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以为约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以被分成两个或更多个被1个或更多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
共同分隔的核酸分子还可以包含可用于处理来自共同分隔的生物颗粒(例如，标记的B细胞)的核酸的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，以用于扩增来自分区内单独生物颗粒的基因组DNA，同时连接相关联的条形码序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列，例如用于鉴定这些序列的存在或用于下拉条形码化核酸或许多其他潜在功能序列中的任何一个。也可以采用共同分隔寡核苷酸的其他机制，包括例如使两个或更多个液滴(其中一个液滴包含寡核苷酸)聚结，或将寡核苷酸微分散到分区(例如微流体系统内的液滴)中。
在一个实例中，提供了珠粒，其各自包括大量可释放地连接至珠粒的上述核酸条形码分子(例如，条形码化寡核苷酸)，其中连接至特定珠粒的所有核酸分子将包括相同的核酸条形码序列，但是在所使用的珠粒群体中代表了大量不同的条形码序列。在一些实施方案中，例如包含聚丙烯酰胺聚合物基质的水凝胶珠粒用作核酸分子进入分区的固相支持物和递送媒介，因为它们能够携带大量核酸分子，并且可以被构造为在暴露于特定刺激时释放那些核酸分子，如本文其他地方所述。在一些情况下，珠粒群体提供了多样的条形码序列文库，该文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列或更多。此外，可以为每个珠粒提供连接的大量核酸(例如，寡核苷酸)分子。特别地，单独的珠上包含条形码序列的核酸分子的分子数量可为至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸分子、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子并且在一些情况下至少约10亿个核酸分子或更多。给定珠的核酸分子可包括相同(或共有)条形码序列、不同条形码序列或两者的组合。给定珠粒的核酸分子可以包括多组核酸分子。给定组的核酸分子可以包括相同的条形码序列。相同的条形码序列可以不同于另一组核酸分子的条形码序列。
此外，当对珠粒群体进行分隔时，所得的分区群体也可以包括多样的条形码文库，该文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列。此外，该群体的每个分区可以包括至少约1,000个核酸分子、至少约5,000个核酸分子、至少约10,000个核酸分子、至少约50,000个核酸分子、至少约100,000个核酸分子、至少约500,000个核酸、至少约1,000,000个核酸分子、至少约5,000,000个核酸分子、至少约10,000,000个核酸分子、至少约50,000,000个核酸分子、至少约100,000,000个核酸分子、至少约250,000,000个核酸分子，并且在一些情况下，至少约10亿个核酸分子。
在一些情况下，可能期望将多个不同的条形码掺入到给定分区中，这些条形码连接至分区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，混合但已知的条形码序列组可以在后续处理中提供更大的鉴定保证，例如，通过提供条形码至给定分区的更强地址或归属，作为给定分区的输出的重复确认或独立确认。
在向珠粒施加特定刺激时，核酸分子(例如，寡核苷酸)可从珠粒释放。在一些情况下，该刺激可以是光刺激，例如通过光不稳定键的裂解，由此释放核酸分子。在其他情况下，可以使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高将使得核酸分子从珠粒发生键的裂解或其他释放。在其他情况下，可以使用化学刺激，该化学刺激裂解核酸分子与珠粒的键，或以其他方式使得核酸分子从珠粒释放。在一种情况下，此类组合物包括上述用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂(诸如DTT)而降解以释放连接的核酸分子。
用于受控分隔的系统和方法
在一些方面，提供了用于受控分隔的系统和方法。可以通过调节通道体系结构(例如，微流体通道体系结构)中的某些几何特征来控制液滴尺寸。例如，可以调节通道的扩展角、宽度和/或长度来控制液滴尺寸。
图14示出了用于生成离散液滴的示例性微流体通道结构200，所述离散液滴包含携带条形码的珠粒214以及酶装饰的细胞216。通道结构200包括在通道连接部210处流体连通的通道段201、202、204、206和208。在操作中，通道段201将可以包含多个珠粒214(例如，携带条形码寡核苷酸的凝胶珠粒)的水性流体212沿着通道段201运输到连接部210中。所述多个珠粒214可以源自珠粒的悬浮液。例如，通道段201可以连接至包含珠粒214的水性悬浮液的储库。通道段202将包括多个酶装饰的细胞216的水性流体212沿着通道段202运输到连接部210中。多个细胞216可可以源自悬浮液。例如，通道段202可以连接至包含生物样品的水性悬浮液的储库，该生物样品包含多个细胞216。在一些情况下，在第一通道段201或第二通道段202中或在两个段中的水性流体212可以包含一种或多种试剂，如本文其他地方进一步所述。例如，在本公开的一些实施方案中，第一通道段和/或第二通道段中递送酶装饰的细胞的水性流体可以包含用交联前体部分修饰的线型聚合物和/或共底物。将与水性流体212(例如，油)不混溶的第二流体218从通道段204和206中的每个通道段递送至连接部210。在来自通道段201和202中的每个通道段的水性流体212以及来自通道段204和206中的每个通道段的第二流体218(例如，氟化油)在通道连接部210处相遇时，水性流体212可以在第二流体218中分隔为离散液滴220，并且沿着通道段208远离连接部210流动。然后，通道段208可以将包封酶装饰的细胞和条形码珠粒的离散液滴递送至与通道段208流体联接的出口储库，在出口储库中可以收集离散液滴。
作为替代，通道段201和202可以在连接部210上游的另一个连接部处相遇。在这种连接部处，珠粒和酶装饰的细胞可以形成混合物，该混合物沿着另一个通道被引导至连接部210以产生液滴220。混合物可以以交替的方式提供珠粒和酶装饰的细胞，使得例如液滴包含单个珠粒和单个细胞。
使用如图14中举例说明的这种通道系统，可以生成分区220，其包封单独酶装饰的细胞、线型聚合物和一个珠粒，其中珠粒可以携带条形码，和/或珠粒可以携带其他试剂。还设想了在一些情况下可以使用图14的通道系统生成分区，其中该分区包含超过一个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)或不包含生物颗粒。类似地，在一些实施方案中，该分区可以包含超过一个珠粒或不包含珠粒。离散液滴也可以是完全未被占据的(例如，没有珠粒或细胞或细胞核或细胞珠粒)。
在一些实施方案中，期望酶装饰的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)、线型聚合物和珠粒、所生成的离散液滴以基本上规则的流速沿着通道流动，从而生成包含单个珠粒和单个生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的离散液滴。规则流速和可用于提供这种规则流速的装置是本领域中已知的，并在例如美国专利公开号2015/0292988A1中进行了描述。在一些实施方案中，流速被设定为以大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的产率提供包含单个珠粒和单个酶装饰的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的离散液滴。
普通技术人员将认识到，本文所述的用于生成包含酶装饰的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)、线型聚合物、共底物和其他交联试剂的离散液滴的许多不同微流体通道设计和方法也可以与本公开的方法和组合物一起使用，以生成进一步包含条形码和/或测定试剂的离散液滴。
尽管已经在提供主要单占据的分区(诸如离散液滴)方面描述了图13和图14的示例性实施方案，但是在某些实施方案中也设想了期望提供多重占据的离散液滴，例如，包含两个、三个、四个或更多个酶装饰的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的单个液滴。因此，如本文其他地方所述，可以控制生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的流动特性，以提供此类多重占据的分区。具体地讲，可以控制通道结构中使用的液体的流动参数以提供大于约50％、大于约75％并在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的给定液滴占据率。
在一些实施方案中，可以将多种不同的试剂和/或珠粒从不同的来源引入不同的入口中，这些入口通向共同的液滴生成连接部(例如，连接部210)。在此类情况下，可以控制不同试剂和/或珠粒进入通道或连接部的流动和频率，以提供来自每个来源的特定比率，同时确保在具有给定数量的生物颗粒(诸如细胞、细胞珠粒或细胞核)的分区中的给定比率(例如，每个分区有一个生物颗粒(诸如细胞、细胞珠粒或细胞核)和一个珠粒)。
本文所述的离散液滴通常具有小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小。在一些实施方案中，所生成的包封生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的离散液滴的总体积小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更小。应当理解，液滴内的样品流体体积(例如，包括共同分隔的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)、线型聚合物和/或珠粒)可以为上述体积的小于约90％、上述体积的小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
可与本公开的组合物和方法一起使用的生成离散液滴的方法使得生成包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)、线型聚合物、其他试剂和/或条形码珠粒的离散液滴群体或多个离散液滴。一般来讲，这些方法易于控制以提供任何合适数量的液滴。例如，可生成或以其他方式提供至少约1,000个离散液滴、至少约5,000个离散液滴、至少约10,000个离散液滴、至少约50,000个离散液滴、至少约100,000个离散液滴、至少约500,000个离散液滴、至少约1,000,000个离散液滴、至少约5,000,000个离散液滴、至少约10,000,000个离散液滴或更多个离散液滴。此外，多个离散液滴可以包括未被占据的液滴和已被占据的液滴两者。
如本文其他地方所述，在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，所生成的包含生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)、线型聚合物和任选的一个或多个不同珠粒的离散液滴还包含其他试剂。在一些实施方案中，液滴中包封或包含的其他试剂包括液滴内的共底物和/或接头裂解试剂。在一些实施方案中，在引入微流体系统的液滴生成连接部(例如，连接部210)中的同时或紧接在前，可以使共底物和/或接头裂解试剂与生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)的悬浮液接触。在一些实施方案中，通过通道连接部上游的一个或多个附加通道引入试剂。
图15示出了用于共同分隔酶装饰的细胞和其他试剂(诸如线型聚合物、共底物和/或接头裂解剂)的微流体通道结构300的实例。通道结构300可以包括通道段301、302、304、306和308。通道段301和302在第一通道连接部309处连通。通道段302、304、306和308在第二通道连接部310处连通。在示例性共同分隔操作中，通道段301可以将包含多个酶装饰的细胞314的水性流体312沿着通道段301运输到第二连接部310中。中。作为替代或补充，通道段301可以运输携带用交联前体部分修饰的线型聚合物的流体。例如，通道段301可以连接至包含酶装饰的细胞314的水性悬浮液的储库。在第二连接部310的上游且紧接在到达该第二连接部之前，通道段301可以在第一连接部309处与通道段302相遇。通道段302可以将水性流体312中的多种试剂315(例如，线型聚合物)沿着通道段302运输到第一连接部309中。例如，通道段302可以连接至包含其他试剂315的储库。在第一连接部309之后，通道段301中的水性流体312可以将酶装饰的细胞314和其他试剂315两者带向第二连接部310。在一些情况下，通道段301中的水性流体312可以包括一种或多种试剂，其可以是与试剂315相同或不同的试剂。可以将与水性流体312不混溶的第二流体316(例如，氟化油)从通道段304和306中的每个通道段递送至第二连接部310。在来自通道段301的水性流体312以及来自通道段304和306中的每个通道段的第二流体316在第二通道连接部310处相遇时，水性流体312在第二流体316中分隔为离散液滴318，并且沿着通道段308远离第二连接部310流动。通道段308可以将离散液滴318递送至与通道段308流体联接的出口储库，在出口储库中可以收集离散液滴以进行进一步分析。
所生成的离散液滴可以包含单独酶装饰的细胞314和/或一种或多种试剂315，这取决于通道段302中包含什么试剂。所生成的离散液滴还可以包含条形码化珠粒(未示出)，诸如可以经由本文其他地方所述的其他通道结构添加的条形码化珠粒。
一般来讲，本文所述的通道段可以联接至多种不同流体源或接收部件中的任何一者，包括储库、管道、歧管或其他系统的流体部件。应当理解，微流体通道结构300可以具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可以具有超过两个通道连接部。例如，微流体通道结构可以具有各自携带相同或不同类型的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)、线型聚合物、试剂和/或珠粒的2、3、4、5个或更多个通道段，这些通道段在通道连接部处相遇。可以控制每个通道段中的流体流动，以控制将不同元素分隔到液滴中。流体可以经由一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。也可以或另行经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制流体。
图16示出了用于将酶装饰的细胞和/或修饰的线型聚合物受控分隔到离散液滴中的微流体通道结构的实例。通道结构400可以包括通道段402，该通道段在通道连接部406(或相交处)处与储库404连通。储库404可以是室。如本文所用，对“储库”的任何引用也可以指“室”。在操作中，包含悬浮珠粒412的水性流体408可以沿着通道段402运输到连接部406中，以遇到与储库404中的水性流体408不混溶的第二流体410，从而产生流入储库404中的水性流体408的液滴416、418。在水性流体408和第二流体410相遇的连接部406，可以基于诸如在连接部406的流体动力、两种流体408、410的流速、流体特性和通道结构400的某些几何参数(例如，w、h0、α等)来形成液滴。通过从通道段402经连接部406连续地注入水性流体408，可以在储库404中收集多个液滴。
所生成的离散液滴可以包括珠粒(例如，如在被占据的液滴416中一样)。另选地，所生成的离散液滴可以包括超过一个珠粒。另选地，所生成的离散液滴可以不包括任何珠粒(例如，如在未被占据的液滴418中一样)。在一些情况下，所生成的离散液滴可以含有一个或多个生物颗粒，如本文其他地方所述。在一些情况下，所生成的离散液滴可以包含一种或多种试剂，如本文其他地方所述。
在一些情况下，水性流体408可以具有基本上一致的浓度或频率的珠粒412。珠粒412可以从单独的通道(图16中未示出)引入到通道段402中。可以通过控制将珠粒412引入到通道段402中的频率和/或通道段402和单独的通道中的流体的相对流速来控制通道段402中的珠粒412的频率。在一些情况下，可以将珠粒从多个不同的通道引入到通道段402中，并且相应地控制频率。
在一些情况下，通道段402中的水性流体408可以包含生物颗粒(例如，参考图16描述的)。在一些情况下，水性流体408可以具有基本上一致的浓度或频率的生物颗粒。与珠粒一样，可以将生物颗粒(例如，标记的工程化细胞、细胞珠粒或细胞核)从单独的通道引入到通道段402中。可以通过控制将生物颗粒引入到通道段402中的频率和/或通道段402和单独的通道中的流体的相对流速来控制通道段402中的水性流体408中的生物颗粒的频率或浓度。在一些情况下，可以将生物颗粒从多个不同的通道引入到通道段402中，并且相应地控制频率。在一些情况下，第一单独通道可以将珠粒引入到通道段402中，并且第二单独通道可以将生物颗粒引入到该通道段中。引入珠粒的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。
第二流体410可以包含油，诸如氟化油，其包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴的后续聚结)的氟表面活性剂。
在一些情况下，第二流体410可以不经受和/或不被引导至流入或流出储库404的任何流动。例如，第二流体410可以在储库404中基本上静止。在一些情况下，第二流体410可以诸如通过向储库404施加压力和/或受连接部406处的水性流体1308的来流影响而经受在储库404内流动，但不流入或流出储库404。另选地，第二流体410可以经受和/或被引导至流入或流出储库404。例如，储库404可以是将第二流体410从上游引导到下游的通道，从而运输所生成的液滴。
在连接部406处或附近的通道结构400可以具有某些几何特征，其至少部分地确定由通道结构400形成的液滴的尺寸。通道段402可以在连接部406处或附近具有高度h0和宽度w。举例来说，通道段402可以具有矩形横截面，该矩形横截面通向具有较宽横截面(诸如在宽度或直径上)的储库404。另选地，通道段402的横截面可以是其他形状，例如圆形形状、梯形形状、多边形形状或任何其他形状。在连接部406处或附近的储库404的顶壁和底壁可以以扩展角α倾斜。扩展角α允许舌状物(在连接部406处离开通道段402并在液滴形成之前进入储库404的水性流体408的部分)增加深度并且促进减小中间形成的液滴的曲率。液滴尺寸可能会随着扩展角的增加而减小。可以通过上述h0、w和α几何参数的以下方程预测最终的液滴半径Rd：
举例来说，对于w＝21μm、h＝21μm和α＝3°的通道结构，预测的液滴尺寸为121μm。在另一个实例中，对于w＝25μm、h＝25μm和α＝5°的通道结构，预测的液滴尺寸为123μm。在另一个实例中，对于w＝28μm、h＝28μm和α＝7°的通道结构，预测的液滴尺寸为124μm。
在一些情况下，扩展角α可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°或约0°至约90°的范围内。例如，扩展角可以为至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，扩展角可以为至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。在一些情况下，宽度w可以在约100微米(μm)至约500μm的范围内。在一些情况下，宽度w可以在约10μm至约200μm的范围内。另选地，宽度可以小于约10μm。另选地，宽度可以大于约500μm。在一些情况下，进入连接部1306的水性流体1308的流速可以介于约0.04微升(μL)/分钟(min)与约40μL/min之间。在一些情况下，进入连接部1306的水性流体1308的流速可以介于约0.01微升(μL)/分钟(min)与约100μL/min之间。另选地，进入连接部1306的水性流体1308的流速可以小于约0.01μL/min。另选地，进入连接部1306的水性流体1308的流速可以大于约40μL/min，诸如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速(诸如约小于或等于10微升/分钟的流速)下，液滴半径可能不取决于进入连接部1306的水性流体1308的流速。
在一些情况下，所生成的至少约50％的液滴可以具有一致的尺寸。在一些情况下，所生成的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的液滴可以具有一致的尺寸。另选地，所生成的小于约50％的液滴可以具有一致的尺寸。
液滴生成的通量可以通过增加生成点来增加，例如增加水性流体408的通道段(例如，通道段402)和储库404之间的连接部(例如，连接部406)的数量。另选地或此外，液滴生成的通量可以通过增加通道段402中中的水性流体408的流速来增加。本文所述的方法和系统可以用于极大地提高单细胞(或单个细胞珠粒或单个细胞核)应用和/或接收基于液滴的输入的其他应用的效率。
还可以通过使用本领域已知的其他合适的液滴生成方法诸如压电液滴发生器、分配器或致动器(参见例如PCT/US2020/062195，其全文以引用方式并入本文)来增加液滴生成的通量。
可以进行的后续操作可以包括生成扩增产物、纯化(例如，经由固相可逆固定(SPRI))、进一步处理(例如，剪切、连接功能序列和后续扩增(例如，经由PCR))。这些操作可以在本体中(例如，在分区外部)发生。在分区是乳液中的液滴的情况下，乳液可以被破坏并且液滴的内容物被合并以用于附加操作。可以与带有条形码的珠粒一起共同分隔的附加试剂可以包括用于封闭核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和用于消化细胞中的基因组DNA的核酸酶。另选地，可以在附加处理操作期间应用rRNA去除剂。通过这种方法生成的构建体的构型可以帮助在测序期间最小化(或避免)多聚T序列的测序和/或对多核苷酸序列的5’端进行测序。可以对扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序以进行序列分析。在一些情况下，可以使用部分发夹式测序扩增(PHASE)方法进行扩增。
多种应用需要评估生物颗粒群内不同生物颗粒或生物体类型的存在和定量，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全性测试、例如在污染物溯源中的流行病学分析等。
如美国专利公开号2018/0216162中所述，包含与条形码分子缔合的条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)和包封细胞成分诸如细胞核酸的珠粒(例如，细胞珠粒)的分区可用于成分分析。
图17示出了用于实现增加的液滴生成通量的微流体通道结构的实例。微流体通道结构500可以包括多个通道段502和储库504。所述多个通道段502中的每个通道段可以与储库504流体连通。通道结构500可以在所述多个通道段502与储库504之间包括多个通道连接部506。每个通道连接部可以是液滴生成的点。来自图6中的通道结构400的通道段402及对其部件的任何描述可以对应于通道结构500中的所述多个通道段502中的给定通道段及对其对应部件的任何描述。来自通道结构400的储库404及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构500的储库504及对其对应部件的任何描述。
图18示出了用于实现增加的液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。微流体通道结构600可以包括围绕储库604的周边大体上圆形地布置的多个通道段602。所述多个通道段602中的每个通道段可以与储库604流体连通。通道结构600可以在所述多个通道段602与储库604之间包括多个通道连接部606。每个通道连接部可以是液滴生成的点。来自图6中的通道结构400的通道段402及对其部件的任何描述可以对应于通道结构600中的所述多个通道段602中的给定通道段及对其对应部件的任何描述。来自通道结构400的储库404及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构600的储库604及对其对应部件的任何描述。图16至图18中描绘的微流体结构的附加方面(包括实现其的系统和方法)提供于美国专利公开号2019/0323088A1中。
可以进行的后续操作可以包括生成扩增产物、纯化(例如，经由固相可逆固定(SPRI))、进一步处理(例如，剪切、连接功能序列和后续扩增(例如，经由PCR))。这些操作可以在本体中(例如，在分区外部)发生。在分区是乳液中的液滴的情况下，乳液可以被破坏并且液滴的内容物被合并以用于附加操作。可以与带有条形码的珠粒一起共同分隔的附加试剂可以包括用于封闭核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和用于消化细胞中的基因组DNA的核酸酶。另选地，可以在附加处理操作期间应用rRNA去除剂。通过这种方法生成的构建体的构型可以帮助在测序期间最小化(或避免)多聚T序列的测序和/或对多核苷酸序列的5’端进行测序。可以对扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序以进行序列分析。在一些情况下，可以使用部分发夹式测序扩增(PHASE)方法进行扩增。
多种应用需要评估生物颗粒群内不同生物颗粒或生物体类型的存在和定量，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全性测试、例如在污染物溯源中的流行病学分析等。
如美国专利公开号2018/0216162中所述，包含与条形码分子缔合的条形码珠粒(例如，凝胶珠粒)和包封细胞成分诸如细胞核酸的珠粒(例如，细胞珠粒)的分区可用于成分分析。
样品和生物颗粒处理
样品可以来源于任何可用的来源，包括任何受试者，诸如人类受试者。样品可以包含来自一个或多个不同来源的材料(例如，一个或多个细胞或细胞核)，诸如一个或多个不同受试者。可以获得多个样品，诸如来自单一受试者的多个样品(例如，以相同或不同方式从相同或不同身体部位获得的多个样品，和/或在相同或不同时间(例如，秒、分钟、小时、天、周、月或年)获得的多个样品)或者来自不同受试者的多个样品以用于如本文所述的分析。例如，可以在第一时间从受试者获得第一样品，并且可以在晚于第一时间的第二时间从受试者获得第二样品。第一时间可以是在受试者经历治疗方案或程序(例如，以治疗疾病或病症)之前，并且第二时间可以是在受试者经历治疗方案或程序期间或之后。在另一个实例中，可以从受试者的第一身体部位或系统获得第一样品(例如，使用第一收集技术)，并且可以从受试者的第二身体部位或系统获得第二样品(例如，使用第二收集技术)，该第二身体部位或系统可以不同于第一身体部位或系统。在另一个实例中，可以同时从受试者的相同或不同身体部位获得多个样品。不同样品，诸如从相同受试者的不同身体部位、在不同时间、从多个不同受试者和/或使用不同收集技术收集的不同样品，可以经历相同或不同的处理(例如，如本文所述)。例如，第一样品可以经历第一处理方案，并且第二样品可以经历第二处理方案。
样品可以是生物样品，诸如细胞样品(例如，如本文所述)。样品可以包含一个或多个生物颗粒，诸如一个或多个细胞和/或细胞成分如一个或多个细胞核。例如，样品可以包含多个细胞和/或细胞成分。样品的组分(例如，细胞或细胞成分如细胞核)可以是单一类型或多种不同类型。例如，样品的细胞可以包括一种或多种不同类型的血细胞。
生物样品可以包含具有不同尺寸和特征的多个细胞。在一些情况下，生物样品的处理，诸如细胞分离和分选(例如，如本文所述)，可以通过耗尽具有某些特征和尺寸的细胞和/或分离具有某些特征和尺寸的细胞来影响样品中包含的尺寸和细胞特征的分布。
样品在准备分析时可以经历一个或多个过程(例如，如本文所述)，包括但不限于过滤、选择性沉淀、纯化、离心、透化、分离、搅拌、加热和/或其他过程。例如，可以过滤样品以去除污染物或其他材料。在一个实例中，过滤过程可以包括使用微流体(例如，以分离不同尺寸、类型、电荷或其他特征的生物颗粒)。
在一个实例中，可以处理包含一个或多个细胞的样品，以将一个或多个细胞与样品中的其他材料分离(例如，使用离心和/或另一个过程)。在一些情况下，可以处理样品的细胞和/或细胞成分以分离和/或分选细胞和/或细胞成分组，诸如分离和/或分选不同类型的细胞和/或细胞成分。细胞分离的实例包括但不限于从其他血细胞和组分中分离白细胞或免疫细胞，从血液中分离循环肿瘤细胞，以及从身体细胞和/或环境材料中分离细菌。分离过程可以包括阳性选择过程(例如，靶向感兴趣的细胞类型以保留用于后续下游分析，诸如通过使用靶向感兴趣的细胞类型的表面标记物的单克隆抗体)、阴性选择过程(例如，去除一种或多种细胞类型并保留一种或多种其他感兴趣的细胞类型)和/或耗尽过程(例如，从样品中去除单一细胞类型，诸如从外周血单核细胞中去除红细胞)。
一种或多种不同类型的细胞的分离可以包括例如离心、过滤、基于微流体的分选、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)、浮力激活细胞分选(BACS)或任何其他可用的方法。例如，流式细胞术方法可以用于基于诸如尺寸、形态或蛋白质表达的参数来检测细胞和/或细胞成分。基于流式细胞术的细胞分选可以包括将样品注入鞘流体中，该鞘流体将样品的细胞和/或细胞成分一次一个地输送到测量区域中。在测量区域中，诸如激光的光源可以询问细胞和/或细胞成分，并且散射光和/或荧光可以被检测并转换成数字信号。喷嘴系统(例如，振动喷嘴系统)可以用于生成包含单独细胞和/或细胞成分的液滴(例如，水性液滴)。包含感兴趣的细胞和/或细胞成分(例如，如经由光学检测确定的)的液滴可以用电荷(例如，使用充电环)标记，该电荷可以用于将此类液滴与包含其他细胞和/或细胞成分的液滴分离。例如，FACS可以包括用荧光标记物(例如，使用内部生物标记物和/或外部生物标记物)标记细胞和/或细胞成分。然后，可以对细胞和/或细胞成分逐一进行测量和鉴定，并且基于标记物发出的荧光或其缺失来对细胞和/或细胞成分进行分选。MACS可以使用微米级或纳米级的磁性颗粒来结合于细胞和/或细胞成分(例如，经由抗体与细胞表面标记物的相互作用)，以促进感兴趣的细胞和/或细胞成分与样品的其他组分的磁性分离(例如，使用基于柱的分析)。BACS可以使用用抗体标记的微泡(例如，玻璃微泡)来靶向感兴趣的细胞。与微泡偶联的细胞和/或细胞组分可以漂浮到溶液的表面，从而将靶细胞和/或细胞组分与样品的其他组分分离。细胞分离技术可以用于富集感兴趣的细胞群(例如，如本文所述，在分隔之前)。例如，可以对包含多个细胞(包括给定类型的多个细胞)的样品进行阳性分离过程。可以用荧光标记物(例如，基于表达的细胞表面标记物或另一种标记物)标记给定类型的多个细胞，并对其进行FACS过程以将这些细胞与多个细胞中的其他细胞分离。然后，可以对所选细胞进行后续的基于分区的分析(例如，如本文所述)或其他下游分析。可以在这种分析之前去除荧光标记物或者可以保留荧光标记物。荧光标记物可以包括鉴定特征，诸如核酸条形码序列和/或独特分子标识符。
在另一个实例中，可以对包含第一多个细胞的第一样品和包含第二多个细胞的第二样品进行阳性分离过程，该第一多个细胞包括给定类型的第一多个细胞(例如，表达特定标记物或标记物组合的免疫细胞)，并且该第二多个细胞包括给定类型的第二多个细胞。可以使用相同或不同的收集技术从相同或不同的受试者、按相同或不同的类型、从相同或不同的身体部位或系统收集第一样品和第二样品。例如，第一样品可以来自第一受试者，并且第二样品可以来自不同于第一受试者的第二受试者。可以向第一样品的第一多个细胞提供第一多个荧光标记物，其配置为标记给定类型的第一多个细胞。可以向第二样品的第二多个细胞提供第二多个荧光标记物，其配置为标记给定类型的第二多个细胞。第一多个荧光标记物可以包括第一鉴定特征，诸如第一条形码，而第二多个荧光标记物可以包括不同于第一鉴定特征的第二鉴定特征，诸如第二条形码。当用相同的激发源(例如，光源，诸如激光)激发时，第一多个荧光标记物和第二多个荧光标记物可以以相同的强度在相同的波长范围内发荧光。然后可以将第一样品和第二样品组合并进行FACS过程，以基于标记给定类型的第一多个细胞的第一多个荧光标记物和标记给定类型的第二多个细胞的第二多个荧光标记物，将给定类型的细胞与其他细胞分离。另选地，第一样品和第二样品可以经历单独的FACS过程，然后可以将从第一样品中阳性选择的给定类型的细胞和从第二样品中阳性选择的给定类型的细胞组合以用于后续分析。不同荧光标记物的编码鉴定特征可以用于鉴定源自第一样品的细胞和源自第二样品的细胞。例如，第一鉴定特征和第二鉴定特征可以配置为与核酸条形码分子(例如，如本文所述)相互作用(例如，在分区中，如本文所述)，以生成可使用例如核酸测序检测的条形码化核酸产物。
图25示意性地示出了用于处理样品内的核酸分子的示例工作流程。可以提供包括多个微孔1802的基底1800。可以将可以包含细胞、细胞珠粒、细胞组分或分析物(例如，蛋白质和/或核酸分子)的样品1806在多个微孔1802中与包含核酸条形码分子的多个珠粒1804一起共同分隔。在分隔过程期间，可以在分区内处理样品1806。例如，就活细胞而言，细胞可以经受足以裂解细胞并释放其中包含的分析物的条件。在过程1820中，可以进一步处理珠粒1804。举例来说，过程1820a和1820b示意性地示出了不同的工作流程，这取决于珠粒1804的特性。
在1820a中，珠粒包含连接于其上的核酸条形码分子，并且样品核酸分子(例如，RNA、DNA)可以例如经由杂交或连接反应而连接至核酸条形码分子。这种连接可以发生在珠粒上。在过程1830中，可以收集和合并来自多个孔1802的珠粒1804。可以在过程1840中进行进一步处理。例如，可以进行一种或多种核酸反应，诸如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，衔接子序列连接至核酸分子或其衍生物，如本文其他地方所述。例如，可以将测序引物序列补加至核酸分子的每个末端。在过程1850中，可以进行进一步的表征，诸如测序，以生成测序读段。测序读段可以产生关于单独细胞或细胞群的信息，这些信息可以在视觉上或以图形形式表示，例如在图表中表示。
在1820b中，珠粒包含可释放地连接于其上的核酸条形码分子，如下所述。珠粒可以降解核酸条形码分子或以其他方式将核酸条形码分子释放到孔1802中；然后可以使用核酸条形码分子使孔1802内的核酸分子条形码化。可以在分区内部或分区外部进行进一步处理。例如，可以进行一种或多种核酸反应，诸如逆转录、核酸延伸、扩增、连接、转座等。在一些情况下，衔接子序列连接至核酸分子或其衍生物，如本文其他地方所述。例如，可以将测序引物序列补加至核酸分子的每个末端。在过程1850中，可以进行进一步的表征，诸如测序，以生成测序读段。测序读段可以产生关于单独细胞或细胞群的信息，这些信息可以在视觉上或以图形形式表示，例如在图表中表示。
多重分析方法
在本公开的一些实施方案中，本文所述方法的步骤(a)和(b)以多重格式进行。例如，在一些实施方案中，本文所公开的方法的步骤(a)可以包括在多个分区的附加分区中单独地分隔多个生物颗粒(例如，细胞核、细胞珠粒或细胞)的附加单个生物颗粒，诸如细胞核、细胞珠粒或细胞(例如，B细胞)，并且步骤(b)可以进一步包括确定编码由附加生物颗粒诸如细胞(例如，B细胞)、细胞珠粒或细胞核产生的抗体或其抗原结合片段的全部或部分核酸序列。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了用于多重分析以及以其他方式增加用于分析的样品的通量的方法和系统。例如，单一或集成过程工作流程可以允许处理、鉴定和/或分析更多或多种分析物、更多或多种类型的分析物和/或更多或多种类型的分析物表征。
例如，在本文所述的方法和系统中，能够结合或以其他方式偶联至一个或多个生物颗粒(例如，细胞或细胞核)或生物颗粒特征(例如，细胞或细胞核)的一种或多种标记剂可以用于表征生物颗粒(例如，细胞/细胞核和/或细胞/细胞核特征)。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。细胞表面特征可以包括但不限于受体、抗原或抗原片段(例如，结合于位于细胞表面上的抗原结合分子的抗原或抗原片段)、表面蛋白、跨膜蛋白、分化簇蛋白、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘附连接或它们的任何组合。
在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以单体形式呈现。在一些情况下，标记剂以多聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以二聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以三聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以四聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以五聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以六聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以七聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以八聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以九聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以十聚体形式呈现。在一些情况下，标记剂(例如，抗原、抗原片段、抗体、抗体片段)以10+聚体形式呈现。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(例如，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合至与报告寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸，并且可以允许该寡核苷酸与报告寡核苷酸杂交。
图26描述了包含与之连接的报告寡核苷酸(1940)的示例性标记剂(1910、1920、1930)。标记剂1910(例如，本文所述的任何标记剂)连接(要么直接连接(例如，共价连接)，要么间接连接)至报告寡核苷酸1940。报告寡核苷酸1940可以包含鉴定标记剂1910的条形码序列1942。报告寡核苷酸1940还可以包含可用于后续处理的一个或多个功能序列1943，诸如衔接子序列、独特分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流通池连接序列(诸如P5、P7或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、或者测序引物或引物结合序列(诸如R1、R2或者部分R1或R2序列)。
参见图26，在一些情况下，缀合至标记剂(例如，1910、1920、1930)的报告寡核苷酸1940包含功能序列1941、鉴定标记剂(例如，1910、1920、1930)的报告条形码序列1942和报告捕获柄1943。报告捕获柄序列1943可以配置为杂交于互补序列，诸如存在于核酸条形码分子1990上的互补序列(未示出)，诸如本文其他地方所述的那些。在一些情况下，核酸条形码分子1990连接至支持物(例如，珠粒，诸如凝胶珠粒)，诸如本文其他地方所述的那些。例如，核酸条形码分子1990可以经由可释放键(例如，包括不稳定键)(诸如本文其他地方所述的那些)连接至支持物。在一些情况下，报告寡核苷酸1940包含一个或多个附加功能序列，诸如上文所述的那些。
在一些情况下，标记剂1910是包含报告寡核苷酸1940的蛋白质或多肽(例如，抗原或预期抗原，或者抗原或预期抗原的片段)。报告寡核苷酸1940包含报告条形码序列1942，该报告条形码序列鉴定多肽1910并且可以用于推断分析物例如多肽1910的结合伴侣(即，多肽1910可以结合的分子或化合物)的存在。在一些情况下，标记剂1910是包含报告寡核苷酸1940的亲脂部分(例如，胆固醇)，其中选择该亲脂部分，使得标记剂710整合到细胞膜或细胞核中。报告寡核苷酸740包含鉴定亲脂部分1910的报告条形码序列742，该亲脂部分在一些情况下用于标记生物颗粒，诸如细胞或细胞核(例如，细胞或细胞核的组、细胞样品等)并且可以用于多重分析，如本文其他地方所述。在一些情况下，标记剂是包含报告寡核苷酸1940的抗体1920(或其表位结合片段)。报告寡核苷酸1940包含报告条形码序列1942，该报告条形码序列鉴定抗体1920并且可以用于推断例如抗体1920的靶标(即，抗体1920结合的分子或化合物)的存在。在其他实施方案中，标记剂1930包含具有肽1932的MHC分子1931和鉴定肽1932的报告寡核苷酸1940。在一些情况下，MHC分子偶联至支持物1933。在一些情况下，支持物1933可以是多肽诸如链霉亲和素，或多糖诸如葡聚糖。在一些情况下，报告寡核苷酸1940可以以任何合适的方式直接或间接偶联至MHC标记剂1930。例如，报告寡核苷酸1940可以以偶联至MHC分子1931、支持物1933或肽1932。在一些实施方案中，标记剂1930包含多个MHC分子(例如是可以偶联至支持物(例如，1933)的MHC多聚体)。可以与本文所公开的组合物、方法和系统一起使用的I类和/或II类MHC多聚体有许多可能构型，例如MHC四聚体、MHC五聚体(经由卷曲螺旋结构域组装的MHC，例如MHC I类五聚体(ProImmune,Ltd.))、MHC八聚体、MHC十二聚体、MHC装饰的葡聚糖分子(例如，MHC />(Immudex))等。关于示例性标记剂(包括基于抗体和MHC的标记剂)、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429以及美国专利公开20190367969。
图27中示出了连接至支持物(例如，珠粒)的示例性条形码分子。在一些实施方案中，多种分析物(例如，使用本文所述标记剂的RNA和一种或多种分析物)的分析可以包括核酸条形码分子，如图27中一般性地描绘的。在一些实施方案中，核酸条形码分子2010和2020经由如本文其他地方所述的可释放键2040(例如，包括不稳定键)连接至支持物2030。核酸条形码分子2010可以包含功能序列2011、条形码序列2012和捕获序列2013。核酸条形码分子2020可以包含衔接子序列2021、条形码序列2012和捕获序列2023，其中捕获序列2023包含与捕获序列2013不同的序列。在一些情况下，衔接子2011和衔接子2021包含相同序列。在一些情况下，衔接子2011和衔接子2021包含不同序列。尽管支持物2030被示出为包含核酸条形码分子2010和2020，但是本文设想了包含共同条形码序列2012的任何合适数量的条形码分子。例如，在一些实施方案中，支持物2030还包含核酸条形码分子2050。核酸条形码分子2050可以包含衔接子序列2051、条形码序列2012和捕获序列2053，其中捕获序列2053包含与捕获序列2013和2023不同的序列。在一些情况下，核酸条形码分子(例如，2010、2020、2050)包含一个或多个附加功能序列，诸如本文所述的UMI或其他序列。核酸条形码分子2010、2020或2050可以与如本文其他地方所述的分析物相互作用，例如如图28A至图28C中所描绘。
参见图28A，在生物颗粒(例如，细胞或细胞核)用标记剂标记的情况下，捕获序列2123可以与报告寡核苷酸的衔接子序列互补。可以使生物颗粒(例如，细胞或细胞核)与一种或多种报告寡核苷酸2120缀合的标记剂2110(例如，多肽，诸如抗原或抗原片段、抗体或本文其他地方描述的其他物质)接触。在一些情况下，可以在条形码化之前进一步处理生物颗粒(例如，细胞或细胞核)。例如，此类处理步骤可以包括一个或多个洗涤和/或细胞分选步骤。在一些情况下，将与缀合至寡核苷酸2120的标记剂2110结合的细胞和包含核酸条形码分子2190的支持物2130(例如，珠粒，诸如凝胶珠粒)分隔到多个分区之中的分区(例如，液滴乳液的液滴或微孔阵列的孔)中。在一些情况下，该分区至多包含结合于标记剂2110的单细胞。在一些情况下，缀合至标记剂2110(例如，多肽诸如抗原或抗原片段、抗体、pMHC分子诸如MHC多聚体等)的报告寡核苷酸2120包含第一功能序列2111(例如，引物序列)、鉴定标记剂2110(例如，多肽诸如抗原或抗原片段、抗体或者pMHC分子或复合物的肽)的条形码序列2112和捕获柄序列2113。捕获柄序列2113可以配置为杂交于互补序列，诸如存在于核酸条形码分子2190(例如，分区特异性条形码分子)上的捕获序列2123在一些情况下，寡核苷酸2110包含一个或多个附加功能序列，诸如本文其他地方所述的那些。
条形码化核酸分子可以由图28A至图28C中描述的构建体生成(例如，经由核酸反应，诸如核酸延伸、逆转录或连接)。例如，然后可以使捕获柄序列2113与互补捕获序列2123杂交以生成(例如，经由核酸反应，诸如核酸延伸或连接)包含细胞条形码(例如，共同条形码或分区特异性条形码)序列2122(或其反向互补序列)和报告条形码序列2112(或其反向互补序列)的条形码化核酸分子。在一些实施方案中，核酸条形码分子2190(例如，分区特异性条形码分子)还包含UMI。然后可以任选地如本文其他地方所述的那样处理条形码化核酸分子，例如以扩增所述分子和/或将测序平台特异性序列补加至所述片段。参见例如美国专利公开2018/0105808。然后可以在合适的测序平台上对条形码化核酸分子或由其生成的衍生物进行测序。
在一些情况下，可以进行多种分析物(例如，使用本文所述标记剂的核酸和一种或多种分析物)的分析。例如，工作流程可以包括如在图28A至图28C中的任何一者中一般性地描绘的工作流程，或者如在本文其他地方所述的用于单独分析物的工作流程的组合。例如，通过使用如在图28A至图28C中一般性地描绘的工作流程的组合，可以分析多种分析物。
在一些情况下，分析物(例如，核酸、多肽、碳水化合物、脂质等)的分析包括如在图28A中一般性地描绘的工作流程。可以将核酸条形码分子2190与一种或多种分析物共同分隔。在一些情况下，核酸条形码分子2190连接至支持物2130(例如，珠粒，诸如凝胶珠粒)，诸如本文其他地方所述的那些。例如，核酸条形码分子2190可以经由可释放键2140(例如，包括不稳定键)(诸如本文其他地方所述的那些)连接至支持物2130。核酸条形码分子2190可以包含功能序列2121并且任选地包含其他附加序列，例如条形码序列2122(例如，共同条形码、分区特异性条形码或本文其他地方所述的其他功能序列)和/或UMI序列2125。核酸条形码分子2190可以包含捕获序列2123，该捕获序列可以与另一个核酸序列互补，使得其可以与特定序列杂交。
例如，捕获序列2123可以包含多聚T序列，并可用于与mRNA杂交。参见图28C，在一些实施方案中，核酸条形码分子2190包含与来自细胞的RNA分子2160的序列互补的捕获序列2123。在一些情况下，捕获序列2123包含对RNA分子具有特异性的序列。捕获序列2123可以包含已知知或靶向的序列或随机序列。在一些情况下，可以进行核酸延伸反应，从而生成条形码化核酸产物，包括捕获序列2123、功能序列2121、UMI序列2125、任何其他功能序列和对应于RNA分子2160的序列。
在另一个实例中，捕获序列2123可以与已经补加至分析物的悬垂序列或衔接子序列互补。例如，参见图28B，在一些实施方案中，引物2150包含与来自生物颗粒的核酸分子2160(诸如编码BCR序列的RNA)的序列互补的序列。在一些情况下，引物2150包含不与RNA分子2160互补的一个或多个序列2151。序列2151可以是如本文其他地方所述的功能序列，例如，衔接子序列、测序引物序列或便于与测序仪的流通池偶联的序列。在一些情况下，引物2150包含多聚T序列。在一些情况下，引物2150包含与RNA分子中的靶序列互补的序列。在一些情况下，引物2150包含与免疫分子的区域(诸如BCR序列的恒定区)互补的序列。引物2150与核酸分子2160杂交，并且生成互补分子2170。例如，互补分子2170可以是在逆转录反应中生成的cDNA。在一些情况下，可以将附加序列补加至互补分子2170。例如，可以选择逆转录酶，使得若干非模板碱基2180(例如，多聚C序列)补加至cDNA。在另一个实例中，末端转移酶也可以用于补加附加序列。核酸条形码分子2190包含与非模板碱基互补的序列2124，并且逆转录酶对核酸条形码分子2190执行模板转换反应以生成包含细胞(例如，分区特异性)条形码序列2122(或其反向互补序列)和互补分子序列2170(或其一部分)的条形码化核酸分子。在一些情况下，捕获序列2123包含与免疫分子的区域(诸如BCR序列的恒定区)互补的序列。捕获序列2123与核酸分子2160杂交，并且生成互补分子2170。例如，可以在逆转录反应中生成互补分子2170，该逆转录反应生成包含细胞条形码(例如，共同条形码或分区特异性条形码)序列2122(或其反向互补序列)和互补分子序列2170(或其一部分)的条形码化核酸分子。国际专利申请WO2018/075693、美国专利公开号2018/0105808、2015年6月26日提交的美国专利公开号2015/0376609和美国专利公开号2019/0367969中描述了适用于对从mRNA转录物(包括编码免疫细胞受体的V(D)J区的那些)生成的cDNA进行条形码化的附加方法和组合物，以及/或者包括模板转换寡核苷酸的条形码化方法和组合物。
在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括在分区中生成条形码化核酸分子。在一些实施方案中，条形码化核酸分子包含：(i)第一条形码化核酸分子，该第一条形码化核酸分子包含第一报告寡核苷酸或第二报告寡核苷酸的序列或其反向互补序列和分区特异性条形码序列或其反向互补序列。
在一些实施方案中，条形码化核酸分子还包含：(ii)第二条形码化核酸分子，该第二条形码化核酸分子包含编码由免疫细胞表达的ABM或其抗原结合片段的至少一部分的核酸序列或其反向互补序列以及分区特异性条形码序列或其反向互补序列。
在一些实施方案中，第一条形码化核酸分子和/或第二条形码化核酸分子包含UMI序列。在一些实施方案中，本文所公开的方法还确定第一条形码化核酸分子和第二条形码化核酸分子的序列。在一些实施方案中，确定的序列包含核苷酸序列。在一些实施方案中，确定的序列包含氨基酸序列。测序可以通过多种方法、系统或技术中的任何一种来进行，包括下一代测序(NGS)方法。可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR和液滴数字PCR(ddPCR)、定量PCR、实时PCR、多重PCR、基于PCR的单重方法、乳液PCR)和/或等温扩增来进行测序。核酸测序方法的非限制性实例包括Maxam-Gilbert测序和链终止法；从头测序方法，包括鸟枪测序和搭桥PCR；下一代方法，包括Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiDTM测序、Ion Torrent半导体测序、HeliScope单分子测序、纳米孔测序(参见例如Oxford Nanopore Technologies)和测序。
此外，核酸分子的序列分析可以是直接的或间接的。因此，可以对条形码化核酸分子进行序列分析，或者该核酸分子可以是由此衍生的分子(例如，其互补序列)。
测序方法的其他实例包括但不限于DNA杂交方法、限制性酶消化方法、Sanger测序方法、连接方法和微阵列方法。可以使用的测序方法的附加实例包括靶向测序、单分子实时测序、外显子测序、基于电子显微术的测序、组合测序、晶体管介导的测序、直接测序、随机鸟枪测序、Sanger双脱氧终止测序、全基因组测序、边杂交边测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双链测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行签名测序、低变性温度共扩增-PCR(COLD-PCR)、可逆染料终止物测序、配对末端测序、近期测序(near-term sequencing)、核酸外切酶测序、边连接边测序、短读段测序、单分子测序、边合成边测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、Solexa基因组分析仪测序、MS-PET测序、全转录组测序以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，该方法还包括基于第二条形码化核酸分子的确定的序列来鉴定和/或表征ABM或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，基于第二条形码化核酸分子的确定的序列来鉴定ABM或抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括基于生成的第一条形码化核酸分子来评估ABM或其抗原结合片段的亲和力。在一些实施方案中，本文所公开的方法还包括使所述免疫细胞与以下物质接触：(i)对所述免疫细胞有很少或没有结合亲和力或者疑似有很少或没有结合亲和力的阴性对照抗原；和/或(ii)对所述免疫细胞有或疑似有结合亲和力的阳性对照剂。
在基于分区的测定法中使用带水凝胶涂层的生物颗粒
如本文其他地方所公开，本公开的组合物和方法允许单独生物颗粒(例如，细胞或细胞核)被选择性地包埋或截留在水凝胶基质中。生物颗粒(例如，细胞或细胞核)包含在水凝胶基质中使得包埋的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的使用、储存、生长和测定更加容易。如本文其他地方所述，水凝胶基质可以用可裂解的交联制备，该可裂解的交联允许基质经由刺激降解，从而允许所含的生物颗粒或其内容物(例如，细胞/细胞核或细胞/细胞核的内容物)在选定的时间点在溶液中释放和测定。
包埋或截留在水凝胶涂层中的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)可以提供比仅分隔在液滴中的生物颗粒更易于存储和更便携的某些潜在的优势。水凝胶基质的多孔性质可以保留生物颗粒或其大分子内容物，同时允许试剂和代谢物扩散进出。因此，在分析之前，本公开的带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)组合物可以与试剂一起温育一段选定的时间，诸如以便在存在或不存在不同刺激的情况下表征生物颗粒随时间的变化。包含生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的水凝胶涂层允许与试剂进行更长时间的温育，这可以通过将细胞分隔在乳液液滴中来实现。还可以将带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)从一个分区中释放、收集，然后与选择的试剂和/或其他生物分子共同分隔到另一个分区中。
在至少一个实施方案中，可以将本公开的带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)组合物与条形码和测定试剂一起分隔到离散液滴中。就可降解的水凝胶基质而言，可以对分区施加刺激以释放生物颗粒(例如，细胞或细胞核)并允许进一步测定不含水凝胶基质的生物颗粒。通常，然后将用裂解试剂处理分区中的游离生物颗粒(例如，细胞或细胞核)以释放其细胞内容物。另选地，可以用裂解试剂处理分区中的带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)，该裂解试剂能够扩散通过水凝胶基质并裂解生物颗粒(例如，细胞或细胞核)以释放其细胞内容物(或“细胞分析物”)而不降解水凝胶基质。在一个实施方案中，最初使用本文所述的基于膜锚部分的选择性方法，用水凝胶层涂覆生物颗粒(例如，细胞或细胞核)，然后接着对生物颗粒进行本文所述的基于细胞珠粒的方法，其中具有初始水凝胶层的生物颗粒作为细胞珠粒的一部分提供。因此，可以使用本公开的带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)组合物和方法测定的细胞分析物的范围包括但不限于细胞内和部分细胞内分析物，包括蛋白质、代谢物、代谢副产物、抗体或抗体片段、酶、抗原、碳水化合物、脂质、大分子或它们的组合(例如，蛋白聚糖)或其他生物分子。细胞分析物可以是核酸分子，诸如脱氧核糖核酸(DNA)分子(例如，基因组DNA)或核糖核酸(RNA)分子(例如，信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA))。
在本公开的至少一个实施方案中，从带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)检测到的细胞分析物可以是RNA转录物，诸如在基因表达谱测定法中。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转运RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、与Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和rDNA衍生的小RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。
在至少一个实施方案中，检测到的细胞分析物与中间实体缔合，其中分析中间实体以提供关于细胞分析物和/或中间实体自身的信息。例如，中间实体(例如，抗体)可以结合于部分细胞内分析物(例如，细胞表面受体)，其中处理中间实体以提供关于中间实体、部分细胞内分析物或两者的信息。在至少一个实施方案中，中间实体包含生物样品的标识符，诸如条形码寡核苷酸，如本文进一步所述。
适用于本公开的实施方案的多种多样基于分区的材料、方法、测定法和系统是本领域中已知的，并在美国专利号9,694,361、10,357,771、10,273,541和10,011,872以及美国专利公开号2018/0105808A1、2019/0367982A1和2019/0338353A1中进行了描述。设想了可以使用包含在分区中的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)诸如与携带条形码的珠粒一起包封在液滴中的单个生物颗粒(例如，细胞或细胞核)进行的任何测定法，也可以使用包含带水凝胶涂层的细胞组合物的分区和本公开的方法进行。示例性测定法包括单细胞转录谱分析、单细胞序列分析、单独T和B细胞的免疫谱分析、单细胞染色质可及性分析(例如，ATAC序列分析)。这些示例性测定法可以使用可商购获得的用于将生物样品、凝胶珠粒、条形码和/或其他化合物/材料包封在液滴中的系统来进行，例如Chromium系统(10x Genomics,Pleasanton,CA,USA)。
在测定方法的一些实施方案中，离散液滴还包含一个或多个珠粒。在一些实施方案中，珠粒可以包含测定试剂和/或解固定剂(un-fixing agent)。在一些实施方案中，条形码由珠粒携带或包含在珠粒中。用于来自与条形码一起包封在液滴中的单细胞的生物分子的样品制备、扩增和测序的组合物、方法和系统提供于例如美国专利公开号2018/0216162A1中。
测定试剂可以包括用于对包封在液滴中的生物样品进行一种或多种附加化学或生物化学操作的试剂。因此，可用于测定方法的测定试剂包括可用于进行反应的任何试剂，该反应诸如为核酸修饰(例如，连接、消化、甲基化、随机诱变、亚硫酸氢盐转化、尿嘧啶水解、核酸修复、加帽或去帽)、核酸扩增(例如，等温扩增或PCR)、核酸插入或裂解(例如，经由CRISPR/Cas9介导或转座子介导的插入或裂解)和/或逆转录。此外，可用的测定试剂可以包括那些允许以比非靶序列特异性读段更高的速率制备对感兴趣的大分子成分具有特异性的靶序列或测序读段的试剂。
如本文其他地方所述，设想了带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)可以在分区中形成或者与用于进行生物颗粒(例如，细胞核、细胞和/或其细胞内容物)的测定法的试剂一起分隔。包含如本文所述的带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的分区还可以包含以下的一种或多种：逆转录酶(RT)、珠粒和用于核酸延伸反应的试剂。在附加实施方案中，本发明的组合物具有或提供于不同于环境温度的温度或非环境温度。在一个实施方案中，温度低于环境温度或高于环境温度。如本文其他地方所述，分隔方法可以生成分区群体或多个分区。在此类情况下，可以生成或以其他方式提供任何合适数量的分区。例如，可以生成或以其他方式提供至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区、至少约1,000,000,000个分区或更多个分区。此外，多个分区可以包括未被占据的分区(例如，空分区)和被占据的分区两者。例如，根据本发明的被占据的分区包含带水凝胶涂层的细胞。
在另一方面，本发明涉及用于将多个带水凝胶涂层的生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)分隔到单独分区中的方法和组合物。在一些情况下，可以将约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10,000、约15,000、约20,000、约25,000、约30,000、约35,000、约40,000、约50,000、约60,000、约70,000、约80,000、约90,000或约100,000个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)分隔到单独分区中。在一些情况下，该方法还包括将约50至约20,000个生物颗粒(例如，细胞、细胞珠粒或细胞核)与多个支持物中的每个支持物一起分隔，该多个支持物包含具有条形码序列的衔接子，其中条形码序列在该多个支持物中的每个支持物中是独特的。
该分区可以经受足以使前体聚合或胶凝的其他条件。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光。足以使前体聚合或胶凝的条件可以包括足以使前体聚合或胶凝的任何条件。在聚合或胶凝之后，可以在生物颗粒周围形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶对于化学试剂或生化试剂而言可以是扩散渗透性的。聚合物或凝胶对于生物颗粒的大分子成分而言可以是扩散不可渗透性的。这样，聚合物或凝胶可以起到让生物颗粒经受化学或生化操作的作用，同时将大分子成分在空间上限制于由聚合物或凝胶限定的液滴的区域。聚合物或凝胶可以包括二硫化物交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-巯基、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可以包括任何其他聚合物或凝胶。
聚合物或凝胶可以被功能化(例如，偶联至捕获剂)以结合于靶向分析物(例如，抗体或其抗原结合片段)，诸如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质或其他分析物。聚合物或凝胶可以经由被动机理聚合或胶凝。聚合物或凝胶在碱性条件或升高的温度下可以是稳定的。聚合物或凝胶可以具有与珠粒的机械特性类似的机械特性。例如，聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的尺寸。聚合物或凝胶可以具有与珠粒类似的机械强度(例如，拉伸强度)。聚合物或凝胶的密度可以低于油。聚合物或凝胶的密度可以大致类似于缓冲液的密度。聚合物或凝胶可以具有可调的孔径。可以选择孔径以例如保留变性的核酸。可以选择孔径以维持对外源化学品(诸如氢氧化钠(NaOH))和/或内源化学品(诸如抑制剂)的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以维持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生物化学相容的。聚合物或凝胶可以通过热、化学、酶和/或光学方式聚合和/或解聚。
该聚合物可以包括通过二硫键交联的聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)。聚合物的制备可以包括两步反应。在第一活化步骤中，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于酰化剂以将羧酸转化成酯。例如，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)。可以将聚丙烯酰胺-共-丙烯酸暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的其他盐。在第二交联步骤中，可以将在第一步骤中形成的酯暴露于二硫化物交联剂。例如，可以将该酯暴露于胱胺(2,2'-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后，生物颗粒(例如，细胞或细胞核)可以被通过二硫桥连接在一起的聚丙烯酰胺链围绕。这样，生物颗粒(例如，细胞或细胞核)可以被包封在凝胶或基质(例如，聚合物基质)内部或包含该凝胶或基质以形成带涂层的生物颗粒(例如，带涂层的细胞或细胞核)或“细胞珠粒”。带涂层的细胞或细胞珠粒可以包含生物颗粒(例如，细胞或细胞核)或生物颗粒的大分子成分(例如，RNA、DNA、蛋白质等)。细胞珠粒可以包含单个生物颗粒(例如，细胞或细胞核)或多个生物颗粒(例如，细胞或细胞核)或者单个生物颗粒(例如，细胞/细胞核或多个细胞/细胞核)的衍生物。例如，在裂解和洗涤细胞之后，可以将细胞裂解物中的抑制组分洗掉，并且大分子成分可以结合为细胞珠粒。本文所公开的系统和方法可以适用于包含生物颗粒的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)和包含生物颗粒的大分子成分的细胞珠粒(和/或液滴或其他分区)。
包封的生物颗粒(例如，标记的B细胞、细胞珠粒或细胞核)可以提供比基于液滴的分隔生物颗粒更易于存储和更便携的某些潜在的优势。此外，在一些情况下，可能期望在分析之前将生物颗粒(例如，标记的B细胞、细胞珠粒或细胞核)温育一段选定的时间，诸如以便在存在或不存在不同刺激(例如，细胞因子、抗原等)的情况下表征此类生物颗粒随时间的变化。在此类情况下，包封可以允许比在乳液液滴中的分隔有更长的温育时间，但在一些情况下，也可以将液滴分隔的生物颗粒温育不同的时间段，例如至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长时间。生物颗粒(例如，标记的B细胞、细胞珠粒或细胞核)的包封可以构成其他试剂被共同分隔到其中的生物颗粒的分隔。另选地或此外，包封的生物颗粒可以容易地沉积到如上所述的其他分区(例如，液滴)中。
实施例
本公开的各种特征和实施方案在以下代表性实施例中示出，这些实施例旨在是说明性的而非限制性的。本领域技术人员将容易理解，具体的实施例仅仅是对本发明的说明，如在随后的权利要求中更全面描述的。本申请中描述的每个实施方案和特征应该被理解为与其中包含的每个实施方案可互换且可组合。
实施例1：带水凝胶涂层的细胞的酶介导制备
该实施例示出了使用BAM-HRP细胞装饰和酚修饰的DTT可降解聚丙烯酰胺水凝胶制备带水凝胶涂层的细胞。
材料和方法
A.BAM-HRP的制备
如图19中的一般反应方案所示的那样用BAM接头修饰辣根过氧化物酶(HRP)(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)。
所使用的BAM接头是购自NOF EUROPE GmbH(Frankfurt,Germany)的OE-080CS。该BAM接头包含通过8000MW PEG聚合物连接至N-羟基-琥珀酰亚胺部分的BAM部分。偶联HRP和BAM接头的反应如下进行：将HRP在PBS中的溶液，pH 7.4(3μL，75μM)添加到BAM接头在PBS中的溶液(1000μL，2.27μM)中。将所得混合物在室温下振荡30分钟，然后用20kD截留分子量(MWCO)Amicon超离心过滤器(EMD Millipore,Billerica,MA,USA)纯化，并通过相同的过滤器在PBS中浓缩至0.1mL。
B.Jurkats细胞制备
先前已通过以下方式固定Jurkats细胞：在4℃下在4％PFA中重悬过夜，第二天用10％FBS淬灭固定，并在300g下离心5分钟。也可以根据以下细胞装饰和胶凝方案使用新鲜细胞。用PBS+2％ FBS洗涤细胞两次。然后用PE-cy7 CD45(2μL/200μL)在冰上避光染色细胞30分钟。用PBS+10％FBS淬灭染色，并以300g离心细胞5分钟。将细胞用1X PBS洗涤，以300g离心5分钟，并重悬于10mL PBS中。计数得出总共有28M个细胞，并将这些细胞按每管1百万个细胞分装到试管中。
C.用BAM-HRP进行细胞装饰
将如上所述制备的1百万个Jurkats细胞的等分试样在4℃下以450rpm离心5分钟。去除上清液，然后将细胞与如上所述制备的100μL BAM-HRP溶液(1μM，在PBS中)一起温育10分钟。用含0.04％BSA的PBS将溶液体积定容至2mL。将溶液以450rpm离心5分钟，去除上清液。这种BSA洗涤重复3次。
D.酚修饰的DTT可降解聚丙烯酸线型聚合物的制备
1.酚修饰的DTT可降解接头的合成
方案3
根据方案3(上文)按如下方式制备单Boc保护的胱胺中间体：在0℃下搅拌10g胱胺在150mL MeOH中的溶液。将1.1当量Boc2O滴加到溶液中，随后搅拌过夜。真空去除溶剂并且将粗油溶解于1M NaHPO3中。用3x50mL Et2O洗涤水性混合物，用2M NaOH中和所得水性混合物，并用3x50mL二氯甲烷(DCM)萃取。用MgSO4干燥合并的有机相，然后在去除溶剂之前过滤。通过9个烷基Boc质子与胱胺多重态的1H NMR积分来证实单Boc-胱胺产物。
方案4
根据方案4(上文)按如下方式制备单Boc-胱胺中间体的酚修饰：将单Boc-胱胺溶解于100mL MeOH中，并在室温下搅拌。先向该溶液中添加1.5当量的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，然后滴加20mL MeOH中的酚。将溶液搅拌16小时，然后去除溶剂，并将粗产物溶解于100mL DCM中。用3x50mL H2O、2M HCl和2M NaOH洗涤有机相，然后用MgSO4干燥并蒸发至干。通过Boc峰与芳基4H的1H NMR积分来证实产物和纯度。
方案5
按如下方式进行脱保护以提供方案5(上文)的化合物：将方案4的Boc保护的酚修饰的化合物溶解于含10％TFA的DCM中，并搅拌16小时。在真空下去除溶剂，最终的TFA盐无需进一步纯化即可使用。通过δ＝0.9–1.1ppm处酚峰的存在和烷基Boc峰的完全消失来证实方案3的目标Boc去保护化合物。
2.聚丙烯酰胺10％共-丙烯酸的合成
方案6
按如下方式根据方案6制备聚丙烯酰胺10％共-丙烯酸的线型聚合物：将49mL的40％丙烯酰胺水溶液与milliQ水中的2.17mL丙烯酸和10.8g甲甲酸钠一起搅拌。将溶液用Ar脱气数分钟，并加热至30℃。在单独的容器中称取200mg热引发剂VA-044，然后将其溶解于1.96mL脱气的H2O中。通过注射器将1mL引发剂溶液添加到搅拌中的单体溶液中，并使反应在Ar下进行16小时。使用3.5K MWCO小柱透析最终的聚合物溶液，将所得溶液冻干以回收目标聚丙烯酸。通过GPC分析聚合物以确定聚合物Mn和多分散性。
3.将酚修饰的DTT可降解接头偶联至聚丙烯酸
称取2g聚丙烯酸(如上制备)到100mL圆底烧瓶中，并将其溶解于30mL milliQ H2O中。将酚修饰的接头的TFA盐(如上所述制备)溶解于10mL milliQ水中，并添加到聚合物溶液中，然后在添加DMTMM(相对于酸的1当量)之前以300rpm搅拌聚合物溶液。一旦溶液变得均匀，就用pH试纸测试pH，并用2M NaOH调节pH至7。一旦中和，就将溶液避光并在室温下搅拌16小时。使用3.5K MWCO蛇皮透析管透析粗聚合物并且对其进行0.2μm过滤，之后冻干，得到目标酚修饰的聚丙烯酰胺线型聚合物。通过与δ＝1.1–2.5ppm处的烷基聚合物主链相比酚峰δ＝7.1–7.5ppm的积分来确定线型聚合物的酚负载量。
D.装饰的细胞的胶凝
将BAM-HRP装饰的Jurkats细胞(如上所述制备)重悬于含有0.05％至0.5％酚修饰的可降解聚丙烯酰胺线型聚合物和FITC白蛋白的一系列溶液中。添加1mM的HRP共底物H2O2溶液，同时在37℃下以1500rpm搅拌10分钟，以引发酚修饰的线型聚合物的HRP催化交联，从而在装饰的细胞周围形成水凝胶涂层。用PBS洗涤所得的带水凝胶涂层的细胞的悬浮液，并使用未装饰的Jurkats细胞作为对照，通过流式分选来评估荧光(λex＝494nm/λem＝520nm)的存在。此外，使用显微术(Nikon Eclipse Ti)对在各种浓度的线型聚合物下生成的带水凝胶涂层的细胞进行荧光(λex＝494nm/λem＝520nm)成像。
结果
荧光显微图像的分析证实，在存在0.05％至0.5％范围内的酚修饰的可降解聚丙烯酰胺线型聚合物的溶液的情况下，在BAM-HRP装饰的Jurkats细胞周围形成了水凝胶涂层。荧光随着聚合物浓度的增加而增加，这表明在酚修饰的可降解聚丙烯酰胺线型聚合物的较高0.5％浓度下，在Jurkats细胞周围形成了较厚的水凝胶涂层。
实施例2：带水凝胶涂层的细胞的酶介导制备
该实施例示出了使用通过可裂解接头装饰上HRP的细胞制备带水凝胶涂层的细胞。
材料和方法
A.可裂解BAM-S-S-HRP的制备
如图1的顶部反应方案中所示的那样用胱胺二盐酸盐修饰辣根过氧化物酶(HRP)(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)以提供具有二硫化物连接的游离胺基的HRP(HRP-S-S-NH2)。然后如图1的底部反应方案所示的那样使具有末端N-羟基-琥珀酰亚胺部分的BAM接头OE-080CS(NOF EUROPE GmbH；Frankfurt,Germany)与HRP-S-S-NH2反应。如实施例1中针对HRP与BAM接头偶联反应所述的那样进行HRP-S-S-NH2与BAM接头偶联反应。将HRP-S-S-NH2在PBS中的溶液，pH 7.4(3μL，75μM)添加到/>OE-080CSBAM接头在PBS中的溶液(1000μL，2.27μM)中。将所得混合物在室温下振荡30分钟，然后用20kD截留分子量(MWCO)Amicon超离心过滤器(EMD Millipore,Billerica,MA,USA)纯化，并通过相同的过滤器在PBS中浓缩至0.1mL。
B.用BAM-S-S-HRP装饰固定的Jurkats细胞
将(如实施例1中所述的那样制备)1百万个固定的Jurkats细胞的等分试样在4℃下以450rpm离心5分钟。去除上清液，并将细胞与100μLBAM-S-S-HRP溶液(1μM，在PBS中)一起温育10分钟。用含0.04％BSA的PBS将溶液体积定容至2mL。将溶液以450rpm离心5分钟，去除上清液。这种BSA洗涤重复3次。
C.BAM-S-S-HRP装饰的细胞的胶凝
将装饰有可裂解HRP-S-S-BAM部分的细胞连同2.5％如实施例1中所述的那样制备的可降解的酚修饰的聚丙烯酰胺线型聚合物溶液且还有至多2.5％水性去垢剂诸如F-108的溶液一起重悬于PBS中。
制备第二种水性“HRP释放”混合物，其包含2.5％可降解线型聚合物溶液和至多2.5％水性去垢剂(例如，F-108)以及20mM至200mM DTT。该溶液用于通过DTT裂解二硫键来从装饰的细胞中释放HRP。
如果期望所使用的BAM-HRP可裂解接头部分与可以在形成水凝胶的酚修饰的线型聚合物主链中使用的可降解键正交，则可以使用一系列替代的释放剂。该水溶液可以任选地包含浓度为0.05％至1％w/w的磁性纳米颗粒。
在生成氟表面活性剂稳定的液滴期间，使用微流体装置将含有悬浮的BAM-S-S-HRP装饰的细胞的溶液与等体积的含有DTT的HRP释放溶液混合。生成的液滴的尺寸范围为约30μm至约150μm。在液滴生成期间，DTT的存在逐渐引发从细胞中释放HRP，使得一些酶扩散到液滴的整个体积中。
在液滴生成后，将乳液包转移到联排管中，先向其中添加50至200μL富含HRP共底物H2O2的分隔油，再温和搅拌10至60分钟以引发水凝胶形成。
在胶凝完成后，乳液被破坏，并且将50μm至200μm的带水凝胶涂层的细胞在PBS中洗涤3次。
实施例3：抗体发现
该实施例描述了根据本文所公开的方法的一些实施方案的示例性抗体发现工作流程。
在该抗体发现工作流程中，靶抗原(即SARS-2三聚体刺突蛋白)与用作示例性交联催化部分的辣根过氧化物酶(HRP)缀合。然而，也可以使用其他酶促交联催化部分，诸如转谷氨酰胺酶；酪氨酸酶；和漆酶。在一些实验中，将靶抗原与报告寡核苷酸和荧光标签中的一者或两者偶联。在一些实验中，抗原被生物素酰化。
首先用SARS-2三聚体刺突抗原对包含感兴趣的B细胞或抗体受体片段的样品进行染色。在样品包含浆细胞的实验中，捕获试剂(抗Fc抗B2M F(ab’)2)用于将抗体锁定到细胞的表面上。
随后，将所有染色的细胞包封在单独分区(例如，液滴)中，之后仅在包含结合了感兴趣的抗原的细胞的液滴中诱导胶凝(经由基于膜锚部分的方法)(通过例如添加合适的共底物，例如过氧化氢(H2O2))。
在一些实验中，将链霉亲和素结合的HRP引入到单独液滴中。
在引入链霉亲和素-HRP后，引入共底物过氧化氢以引发胶凝形成，从而产生包含感兴趣的抗原特异性B细胞的带水凝胶涂层的细胞。
可以使用基于膜锚部分的方法制备如上所述的带水凝胶涂层的细胞，然后将这些细胞用于多种下游测定法，包括液滴内OE-PCR和液滴内克隆/连锁克隆以及批量BCR测序。
任选地，还进行通过细胞珠粒/凝胶珠粒(CBGB)工作流程的单细胞测序，诸如基于条形码的抗原图谱(BEAM)，并任选在引入一种或多种抗原或次级标记试剂后进行FACS富集，以实现感兴趣的抗体特性的荧光检测。
虽然为了清楚和理解的目的，已经通过举例和说明的方式较为详细地描述了本公开的前述公开内容，但是包括本文所述的实例、描述和实施方案的本公开是为了说明的目的，旨在是示例性的，并且不应该被解释为限制本公开。本领域技术人员将清楚，可以对本文所述的实例、描述和实施方案进行各种修改或改变，并且这些修改或改变将被包括在本公开和所附权利要求的精神和范围内。此外，本领域技术人员将认识到许多与本文所述的方法和程序等同的方法和程序。所有这些等同物应被理解为在本公开的范围内，并且被所附权利要求覆盖。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利或其他文献的公开内容明确地全文以引用的方式并入以用于所有目的，其程度如同每个此类单独出版物、专利、专利申请或其他文献被单独地具体指明全文以引用的方式并入本文以用于所有目的，并在本文中全面阐述。在冲突的情况下，将以本说明书(包括指定的术语)为准。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述了作者的主张，并且本申请人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应当清楚地理解，尽管本文提到了许多信息源，包括科学期刊文章、专利文献和教科书；但是该参考文献并不构成承认这些文献中的任何一个文献构成本领域公知常识的一部分。
本公开的附加实施方案在以下权利要求中阐述。

Claims (113)

1.一种分隔细胞的方法，包括：
a)生成分区，所述分区包含：
(i)包含细胞表面蛋白的细胞；
(ii)偶联至所述细胞表面蛋白的膜锚部分，其中所述膜锚部分包含交联催化部分；
(iii)包含交联前体部分的线型聚合物；
(iv)交联形成引发剂，以及
b)使所述分区经受足以允许在所述细胞上形成水凝胶涂层的条件。
2.一种分隔细胞的方法，包括：
(a)生成分区，所述分区包含：(i)包含多个交联催化部分的细胞，所述多个交联催化部分通过含膜锚部分的接头连接至其膜；和(ii)包含交联前体部分的线型聚合物；
(b)使所述分区与交联形成引发剂接触；由此形成所述细胞的水凝胶涂层；以及
(c)裂解所述接头；
由此释放所述交联催化部分，使得所述细胞的水凝胶涂层程度增加。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是细胞膜蛋白并且所述膜锚部分包含抗体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是免疫受体并且所述膜锚部分是靶抗原。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联催化部分经由接头连接至所述膜锚部分。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括：
裂解所述接头。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞的所述水凝胶涂层程度增加包括所述细胞的所述水凝胶涂层的厚度增加。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分区是离散液滴或孔。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述膜锚部分选自细胞膜的生物相容性锚定物(BAM)部分；抗体；针对细胞膜或表面蛋白的抗体；胆固醇-寡核苷酸部分；3’-胆固醇-TEG部分；胆固醇装饰的聚合物；和靶抗原。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述膜锚部分是包含油烯基部分的BAM部分。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述BAM部分包含油烯基-O-(CH2CH2O)n-CO-CH2CH2-COO部分；任选地，其中聚乙二醇基团的数量n为这样的数量，使得所述部分具有至少2000、至少4000或至少8000的分子量。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述膜锚部分是针对细胞表面蛋白的抗体；任选地，其中所述细胞表面蛋白是分化簇(“CD”)蛋白。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中所述接头包含可裂解部分，所述可裂解部分选自二硫化物间隔序列部分；氨基甲酸酯间隔序列部分；可光解的间隔序列；和UDG可裂解的间隔序列。
15.根据权利要求2至14中任一项所述的方法，其中裂解所述接头包括使所述分区与选自DTT和DETA的试剂接触。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述交联催化部分是选自以下的酶：过氧化物酶；转谷氨酰胺酶；酪氨酸酶；和漆酶；任选地，其中所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述交联催化部分是选自血色素和伞形酮的非酶化合物。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述交联催化部分是HRP，所述交联前体部分是酚，并且所述交联形成引发剂是包含过氧化物部分的化合物；任选地，其中包含过氧化物部分的所述化合物是H2O2。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述交联形成引发剂选自H2O2和O2。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述交联形成引发剂包含在胶束中。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中使所述分区与交联形成引发剂接触包括胶束介导的所述引发剂向所述分区中的转运。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述线型聚合物选自烯烃共聚物、聚烯烃、丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(噁唑啉)、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述线型聚合物还包含可修饰侧链。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述可修饰侧链包含胺部分。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，还包括在合适的反应条件下使所述带水凝胶涂层的细胞与可检测标签部分接触，所述可检测标签部分包含能够与所述水凝胶的所述可修饰侧链形成共价键的基团。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，还包括在合适的反应条件下使所述带水凝胶涂层的细胞与固相基底的表面接触，其中所述表面包含能够在所述反应条件下与所述水凝胶的所述可修饰侧链形成共价键的基团，由此所述带水凝胶涂层的细胞共价连接至所述固相基底。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫细胞表达抗原结合分子(ABM)或其抗原结合片段。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述ABM选自由抗体或其功能片段、免疫受体或其功能片段和免疫球蛋白或其功能片段组成的组。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述ABM是免疫球蛋白(Ig)。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述Ig选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM组成的组。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述Ig是IgG。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其中所述膜锚部分是靶抗原。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括在所述(a)生成所述分区之前，使所述免疫细胞与所述靶抗原接触，其中所述接触提供结合于所述靶抗原的免疫细胞。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述靶抗原选自由可溶性蛋白、短多肽、病毒样颗粒和膜结合蛋白组成的组。
37.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述靶抗原选自由pMHC单体和pMHC多聚体组成的组。
39.根据权利要求27至38中任一项所述的方法，还包括在所述(b)分隔之后，隔离和/或富集结合于所述靶抗原的所述免疫细胞。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述靶抗原偶联至第一报告寡核苷酸。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中所述ABM或其抗原结合片段偶联至第二报告寡核苷酸。
42.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中所述第一报告核苷酸和/或所述第二报告核苷酸缀合至标记剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述标记剂是磁性的或有荧光的。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述标记剂是有荧光的。
45.根据权利要求27至44中任一项所述的方法，其中所述分区还包含具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。
46.根据权利要求45所述的方法，还包括在所述分区中生成条形码化核酸分子，其中所述条形码化核酸分子包含：
(i)第一条形码化核酸分子，所述第一条形码化核酸分子包含所述第一报告寡核苷酸或所述第二报告寡核苷酸的序列或其反向互补序列和所述分区特异性条形码序列或其反向互补序列，以及
(ii)第二条形码化核酸分子，所述第二条形码化核酸分子包含编码由所述免疫细胞表达的所述ABM或其抗原结合片段的核酸序列或其反向互补序列以及所述分区特异性条形码序列或其反向互补序列。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一条形码化核酸分子和/或所述第二条形码化核酸分子还包含UMI序列。
48.根据权利要求27至47中任一项所述的方法，还包括确定所述第一条形码化核酸分子和所述第二条形码化核酸分子的序列。
49.根据权利要求48所述的方法，其中基于所述第二条形码化核酸分子的所述确定的序列来鉴定所述ABM或抗原结合片段。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述确定的序列包含核苷酸序列。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述确定的序列包含氨基酸序列。
52.根据权利要求33至51中任一项所述的方法，还包括基于所述生成的第一条形码化核酸分子来评估所述ABM或其抗原结合片段的亲和力。
53.根据权利要求34至52中任一项所述的方法，还包括使所述免疫细胞与以下物质接触：(i)对所述免疫细胞有很少或没有结合亲和力或者疑似有很少或没有结合亲和力的阴性对照抗原；和/或(ii)对所述免疫细胞有或疑似有结合亲和力的阳性对照剂。
54.根据权利要求48所述的方法，还包括基于所述第二条形码化核酸分子的所述确定的序列来鉴定和/或表征所述ABM或其抗原结合片段。
55.一种包含带水凝胶涂层的细胞的组合物，其中所述水凝胶涂层的厚度为至少5μm、至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少120μm、至少150μm、至少200μm或更多。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述水凝胶涂层的平均厚度为约5μm至约200μm、约25μm至约175μm、约30μm至约150μm或约50μm至约150μm。
57.根据权利要求55所述的组合物，其中所述细胞是免疫细胞。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的组合物，其中所述细胞包含通过膜锚部分连接至其膜的多个接头。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述多个接头以至少约500个分子/μm2、至少约1000个分子/μm2、至少约1500个分子/μm2、至少约2000个分子/μm2、至少约5000个分子/μm2或至少约10,000个分子/μm2的平均表面浓度连接至所述细胞。
60.根据权利要求58所述的组合物，其中所述多个接头以约500个分子/μm2至约15,000个分子/μm2、约1000个分子/μm2至约10,000个分子/μm2、约1500个分子/μm2至约7500个分子/μm2或约2000个分子/μm2至约5000个分子/μm2的平均表面浓度连接至所述细胞。
61.根据权利要求55至60中任一项所述的组合物，其中所述膜锚部分选自：细胞膜的生物相容性锚定物(BAM)部分；针对细胞表面蛋白的抗体；油烯基-PEG部分；胆固醇-寡核苷酸部分；3’-胆固醇-TEG部分；胆固醇装饰的聚合物；靶抗原。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述膜锚部分是包含油烯基部分的BAM部分。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中BAM部分包含油烯基-O-(CH2CH2O)n-CO-CH2CH2-COO部分；任选地，其中聚乙二醇基团的数量n为这样的数量，使得所述部分具有至少2000、至少4000或至少8000的分子量。
64.根据权利要求55至61中任一项所述的组合物，其中所述膜锚部分是针对细胞表面蛋白的抗体；任选地，其中所述细胞表面蛋白是分化簇(“CD”)蛋白。
65.根据权利要求55至64中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶包含交联的线型聚合物，其中所述交联包含酚部分。
66.根据权利要求55至65中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含分布于整个所述水凝胶中的交联催化酶，其中所述酶不连接至所述细胞或所述线型聚合物。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述交联催化酶选自过氧化物酶；转谷氨酰胺酶；酪氨酸酶；和漆酶；任选地，其中所述酶是辣根过氧化物酶。
68.根据权利要求55至67中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶涂层包含选自以下的聚合物：烯烃共聚物、聚烯烃、丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(噁唑啉)、乙烯基聚合物、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、甲醛树脂、聚氨酯、醚聚合物、纤维素、热塑性弹性体和热塑性聚氨酯。
69.根据权利要求69所述的组合物，其中所述聚合物还包含可修饰侧链；任选地，其中所述可修饰侧链包含胺部分。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中包含胺部分的所述可修饰侧链是氨基烷基部分；任选地，其中所述氨基烷基部分是氨基丙基基团。
71.根据权利要求69至70中任一项所述的组合物，还包含通过其5’端或3’端连接至所述可修饰侧链的寡核苷酸。
72.根据权利要求69至70中任一项所述的组合物，还包含连接至所述可修饰侧链的可检测标签部分。
73.根据权利要求55至72中任一项所述的组合物，其中所述带水凝胶涂层的细胞包含在离散液滴中。
74.一种细胞选择方法，包括：
(a)用包含催化部分的标记剂标记多个细胞，从而提供所述多个标记的细胞中的标记的细胞，其中所述标记的细胞包含所述催化部分；
(b)分隔所述多个细胞以提供多个分区，其中所述多个分区包括(i)包含所述标记的细胞和多种线型聚合物的第一分区以及(ii)包含未标记的细胞的第二分区；
(c)使所述第一分区经受一定条件以允许在所述标记的细胞上形成聚合物涂层，其中所述形成由所述催化部分使用所述多种线型聚合物在所述分区中催化；
(d)从所述多个分区中取出所述多个细胞以提供包含来自所述第一分区的所述带聚合物涂层的标记的细胞和来自所述第二分区的所述未标记的细胞的细胞混合物；以及
(e)将所述带聚合物涂层的标记的细胞从所述未标记的细胞分离以允许所述带聚合物涂层的标记的细胞的进一步处理。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述分区还包含催化剂以促进所述带聚合物涂层的标记的细胞的所述形成。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述催化部分共价连接至所述标记剂。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述催化部分经由可裂解接头共价连接至所述标记剂。
78.根据权利要求75所述的方法，其中所述分区还包含裂解剂。
79.根据权利要求77所述的方法，其中步骤(c)的所述条件允许通过所述裂解剂来裂解所述可裂解接头。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述裂解从所述标记剂释放所述催化部分。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述释放的催化部分使得所述标记的细胞的聚合物涂层程度增加。
82.根据权利要求74所述的方法，其中所述标记剂还包含报告寡核苷酸。
83.根据权利要求74至82中任一项所述的方法，还包括在所述(b)分隔之后，隔离和/或富集所述多个标记的细胞。
84.根据权利要求74至83中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述免疫细胞表达抗原结合分子(ABM)或其抗原结合片段。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述ABM选自由抗体或其功能片段、免疫受体或其功能片段和免疫球蛋白或其功能片段组成的组。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述ABM是免疫球蛋白(Ig)。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述Ig选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM组成的组。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述Ig是IgG。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的方法，其中所述膜锚部分是靶抗原。
91.根据权利要求90所述的方法，还包括在所述(a)生成所述分区之前，使所述免疫细胞与所述靶抗原接触，其中所述接触提供结合于所述靶抗原的免疫细胞。
92.根据权利要求84至91中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。
93.根据权利要求91所述的方法，其中所述靶抗原选自由可溶性蛋白、短多肽、病毒样颗粒和膜结合蛋白组成的组。
94.根据权利要求84至91中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述靶抗原选自由pMHC单体和pMHC多聚体组成的组。
96.根据权利要求84至95中任一项所述的方法，还包括在所述(b)分隔之后，隔离和/或富集结合于所述靶抗原的所述免疫细胞。
97.根据权利要求90至96中任一项所述的方法，其中所述靶抗原偶联至第一报告寡核苷酸。
98.根据权利要求86至97中任一项所述的方法，其中所述ABM或其抗原结合片段偶联至第二报告寡核苷酸。
99.根据权利要求97至98中任一项所述的方法，其中所述第一报告核苷酸和/或所述第二报告核苷酸缀合至标记剂。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述标记剂是磁性的或有荧光的。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述标记剂是有荧光的。
102.根据权利要求84至101中任一项所述的方法，其中所述分区还包含具有分区特异性条形码序列的多个核酸条形码分子。
103.根据权利要求102所述的方法，还包括在所述分区中生成条形码化核酸分子，其中所述条形码化核酸分子包含：
(i)第一条形码化核酸分子，所述第一条形码化核酸分子包含所述第一报告寡核苷酸或所述第二报告寡核苷酸的序列或其反向互补序列和所述分区特异性条形码序列或其反向互补序列，以及
(ii)第二条形码化核酸分子，所述第二条形码化核酸分子包含编码由所述免疫细胞表达的所述ABM或其抗原结合片段的核酸序列或其反向互补序列以及所述分区特异性条形码序列或其反向互补序列。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述第一条形码化核酸分子和/或所述第二条形码化核酸分子还包含UMI序列。
105.根据权利要求84至104中任一项所述的方法，还包括确定所述第一条形码化核酸分子和所述第二条形码化核酸分子的序列。
106.根据权利要求105所述的方法，其中基于所述第二条形码化核酸分子的所述确定的序列来鉴定所述ABM或抗原结合片段。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述确定的序列包含核苷酸序列。
108.根据权利要求106所述的方法，其中所述确定的序列包含氨基酸序列。
109.根据权利要求90至108中任一项所述的方法，还包括基于所述生成的第一条形码化核酸分子来评估所述ABM或其抗原结合片段的亲和力。
110.根据权利要求91至109中任一项所述的方法，还包括使所述免疫细胞与以下物质接触：(i)对所述免疫细胞有很少或没有结合亲和力或者疑似有很少或没有结合亲和力的阴性对照抗原；和/或(ii)对所述免疫细胞有或疑似有结合亲和力的阳性对照剂
111.根据权利要求105所述的方法，还包括基于所述第二条形码化核酸分子的所述确定的序列来鉴定和/或表征所述ABM或其抗原结合片段。
112.根据权利要求74所述的方法，还包括一种或多种参考抗原。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种参考抗原包含：
(i)对所述免疫细胞有很少或没有结合亲和力或者疑似有很少或没有结合亲和力的阴性对照抗原；和/或
(ii)对所述免疫细胞有或疑似有结合亲和力的阳性对照剂。
CN202180074478.7A 2020-09-23 2021-09-22 选择性酶促胶凝 Pending CN116802265A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63/082,325 2020-09-23
US202163193571P 2021-05-26 2021-05-26
US63/193,571 2021-05-26
PCT/US2021/051542 WO2022066760A1 (en) 2020-09-23 2021-09-22 Selective enzymatic gelation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116802265A true CN116802265A (zh) 2023-09-22

Family

ID=88040227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180074478.7A Pending CN116802265A (zh) 2020-09-23 2021-09-22 选择性酶促胶凝

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116802265A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110462060B (zh) 用于标记细胞的方法和组合物
US11739440B2 (en) Methods and systems for analysis of chromatin
US20230167432A1 (en) Methods and systems for analysis and identification of barcode multiplets
CN112639985A (zh) 用于代谢组分析的系统和方法
US20190323088A1 (en) Methods and compositions for labeling cells
CN111386134B (zh) 使用改进的聚合物形成珠的组合物、方法和系统
CN112262218A (zh) 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
CN111712579A (zh) 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
CN115135984A (zh) 可逆固定试剂及其使用方法
CN111699388A (zh) 用于单细胞处理的系统和方法
CN111051523A (zh) 功能化凝胶珠
CN115916972A (zh) 用于被固定样品的组合物和方法
CN113366117A (zh) 用于生物样品中转座酶介导的空间标记和分析基因组dna的方法
CN113811619A (zh) 用于处理来自细胞的rna的系统和方法
CN112703252A (zh) 用于最小化条形码交换的方法和系统
CN113439124A (zh) 使用主/复制阵列进行空间检测的方法
WO2022182785A1 (en) Drug screening methods
EP4022309B1 (en) Methods for analyte detection and analysis
US20230383283A1 (en) Methods and compositions for analyzing antigen binding molecules
US20220403375A1 (en) Methods for enriching nucleic acid libraries for target molecules that do not produce artefactual antisense reads
US20230295556A1 (en) Selective enzymatic gelation
CN116802265A (zh) 选择性酶促胶凝
US20240053337A1 (en) Compositions and methods for single cell analyte detection and analysis
CN117980500A (zh) 经由环化进行核酸处理
US20230304020A1 (en) Lentiviral-free cytosolic delivery of payloads via aptamers

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination