JP2022525340A - オリゴヌクレオチドコード化分子を加工または分析する方法および系 - Google Patents

オリゴヌクレオチドコード化分子を加工または分析する方法および系 Download PDF

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Abstract

本開示は、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する方法およびシステムを提供する。一実施形態において、方法は、分離媒体を提供することを含み、分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する；そして少なくとも２つのオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を、電気泳動によって、標的分子に対するオリゴヌクレオチドコード化分子の異なる標的活性に基づいて分離する種々の方法。本明細書中に開示される方法の利点として、限定されないが、標的分子に対するオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の標的活性の定性的データおよび定量的データを収集かつ計算することが挙げられ得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１４日出願の米国仮出願第６２／８１８，６４５号明細書の利益を主張し、この出願の内容は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドコード化ライブラリは、様々な特性および反応性を有する膨大な数の様々な分子のコンビナトリアル合成および識別を指示する有用な方法を提供し得る。一般に、オリゴヌクレオチドコード化分子は、コード化部分に繋がれた、オリゴヌクレオチド等のコーディング部分を含み得る。典型的には、コーディング部分は、コード化部分のコンビナトリアル合成を記録または指示する機能を果たし、そして合成後、コード化部分の構造を識別する機能を果たす。類似して、コーディング部分は、３Ｄプリンタ用の分子バーコードのようなものであり、これは、プリンタに何を製造すべきかを知らせ、そしてその後は、印刷後に製品を識別するために取り付けられたままである。
しかしながら、数百万から数兆個の異なるオリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリが合成されると、それらのコード化部分がどのような有用な特性を有し得るかを決定することが課題となる。オリゴヌクレオチドコード化分子の合成、および次世代シーケンシングは、オリゴヌクレオチドコード化分子を合成し、それらのコード化部分を迅速に識別し、かつそれらの有用な特性を決定するための、ますます効率的な方法をもたらす、強力な学術研究および産業研究の対象となっている。これらの進歩にも拘わらず、当該分子のコード化部分の有用性を分離、測定、かつ／または決定する方法は、遅れをとっている。
標的分子に対する結合標的活性に基づいて、オリゴヌクレオチドコード化分子を効率的に分離する必要性が依然として存在する。偽陽性および偽陰性の結果を排除または低減する必要性が依然として存在する。標的分子に対する個々のオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性に関する定性的データおよび／または定量的データを提供する必要性が依然として存在する。
本開示は、電気泳動およびオリゴヌクレオチドシーケンシングによって決定される標的分子へのオリゴヌクレオチドコード化分子の差次的な標的活性に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも１つの分解された（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）オリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集する方法およびシステムを提供する。本開示はまた、標的分子に対するオリゴヌクレオチドコード化分子の異なる標的活性に少なくとも部分的に基づいて、電気泳動によって少なくとも２つのオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を分離する方法およびシステムを提供する。本明細書中に開示される方法の利点として、例えば、標的分子に対するオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の標的活性の定性的データおよび定量的データを提供することが挙げられ得る。
少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する方法は、分離媒体を提供する工程であって、分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する、工程と；少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、分離媒体に導入する工程であって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と；少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と；分離媒体由来の少なくとも２つの別個の位置の少なくとも１つの位置をセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と；少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実行を可能にする工程と；少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分に対してＰＣＲを実行することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅する工程と；少なくとも１つの位置、および少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分の正体を加工することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する工程とを含む。
一実施形態では、本方法は、分離媒体を提供する工程であって、分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する、工程と；少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、分離媒体に導入する工程であって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と；少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と；分離媒体由来の少なくとも２つの別個の位置の少なくとも１つの位置をセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と；少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ＰＣＲの実行を可能にする工程と；少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分に対してＰＣＲを実行することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅する工程と；少なくとも１つの位置を、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分の正体と相関させることによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集する工程とを含む。
本方法の一実施形態では、少なくとも１つの標的分子は、細胞、オリゴヌクレオチド、タンパク質、酵素、リボソーム、およびナノディスクの少なくとも１つを含む。本方法の一実施形態では、記分離媒体は、粒子、ポリマー、および分離表面の少なくとも１つを含有し、少なくとも１つの標的分子は、分離媒体、粒子、ポリマー、および分離表面の少なくとも１つに連結されている。本方法の一実施形態では、粒子は、ポリマー粒子または金属コロイドを含む。本方法の一実施形態では、ポリマーは、少なくとも１つの標的分子の最低重量標的分子の１０％またはそれを超える分子量を有する。一実施形態では、本方法は、少なくとも１つの標的分子と、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分との間の少なくとも１つの標的活性に基づいて、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程を含む。本方法の一実施形態では、少なくとも１つの標的活性は、少なくとも１つの標的分子による少なくとも１つのオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の化学修飾を含む。本方法の一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、少なくとも１つのコード化部分は、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有し、少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックは、オリゴヌクレオチドの１～５個のコーディング領域によって識別される。本方法の一実施形態では、分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する。
本方法の一実施形態では、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（Ｉ）（Ｉ）Ｇ－Ｌ－Ｂ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂは、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有するコード化部分であり；
Ｌは、ＧをＢに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｂ中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Ｇの１～５個のコーディング領域によって別々に識別される。
本方法の一実施形態では、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩ）
（ＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは０または１であり；
Ｐは０または１であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが１であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇの１～５個のコーディング領域によって識別される。
本方法の一実施形態では、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ’－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇ’はオリゴヌクレオチドを含み、Ｇ’は、少なくとも２つのコーディング領域および少なくとも１つのヘアピンを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは、ゼロ～５の整数であり；
Ｐは、ゼロ～５の整数であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが、１～５の整数であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇ’の１～５個のコーディング領域によって識別される。
一実施形態では、本方法は、第１の分離処理を分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程をさらに含み、第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む。一実施形態では、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、第２の分離処理を分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することをさらに含み、第２の方向は、第１の方向に対して実質的に垂直であり、第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む。一実施形態では、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む。
前述の概要、および実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されよう。例示の目的で、好ましい一部の実施形態が、図面に示されている。図示される実施形態は、示される正確な詳細に限定されないことを理解すべきである。
図１は、本明細書中に開示される方法の一実施形態を示すフローチャートである。
図２は、本明細書中に開示される方法の一実施形態の図である。
図３は、標的活性分離のための電気泳動チャネルを成形する方法の実施形態の図である。
図４は、２つの異なる分離媒体を使用して二次元電気泳動を行う方法の一実施形態の図である。
図５は、オリゴヌクレオチドコード化分子を蛍光標識するための合成計画の化学図である。
図６Ａは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｂは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｃは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｄは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｅは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｆは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｇは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｈは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｉは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｊは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｋは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｌは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｍは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｎは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｏは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図６Ｐは、陽性対照化合物の化学構造を示す。
図７Ａは、濃度に基づく化合物の偏光蛍光のグラフを含有し、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、７２６、７２８、７３０、７３２はそれぞれ、図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、６Ｉ、６Ｊ、６Ｋ、６Ｌ、６Ｍ、６Ｎ、６Ｏ、６Ｐの陽性対照化合物に対応する。
図７Ｂは、濃度に基づく化合物の偏光蛍光のグラフを含有する。
図８Ａは、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物のクロマトグラムである。
図８Ｂは、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物のクロマトグラムである。
図８Ｃは、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物のクロマトグラムである。
図８Ｄは、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物のクロマトグラムである。
図９は、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物の混合物のクロマトグラムである。
図１０は、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物の混合物のクロマトグラムである。
図１１Ａは、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物の混合物のクロマトグラムである。
図１１Ｂは、標的活性分離プロトコルによって分離された対照化合物の混合物のクロマトグラムである。
図１２は、本明細書中に開示されるシステムおよび方法の実施形態を実施するためのコンピュータシステムの図である。
特に明記しない限り、全ての測定値は、標準メートル制におけるものである。
特に明記しない限り、単位測定値として直接使用される場合の接頭辞「ｕ」は、「マイクロ」を意味し、典型的には「μ」と略される。例えば、「ｕＬ」は、「マイクロリットル」または「μＬ」を表す。
特に明記しない限り、単語「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」の例は全て、それらが修飾する単語の１つ、または単語の複数を指し得る。
特に明記しない限り、語句「少なくとも１つの」は、１もしくはそれを超える対象物、または複数の対象物のあらゆる組合せを意味する。例えば、「Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３の少なくとも１つ」は、Ｈ１、Ｈ２、もしくはＨ３、またはそれらのあらゆる組合せを意味する。
特に明記しない限り、用語「約」は、記載されている非パーセンテージの数字の±１０％を指し、最も近い整数に丸められる。例えば、約１００ｍｍは、９０～１１０ｍｍを含み得る。特に明記しない限り、用語「約」は、パーセンテージの数字の±５％を指す。例えば、約２０％は、１５～２５％を含み得る。用語「約」が範囲に関して考察されている場合、当該用語は、下限未満の、そして上限を超える適切な量を指す。例えば、約１００～約２００ｍｍは、９０～２２０ｍｍを含み得る。
特に明記しない限り、用語「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイズすること」、「ハイブリダイズした」、および「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン－クリック塩基対合を含み、ＤＮＡについてはグアニン－シトシンおよびアデニン－チミン（Ｇ－ＣおよびＡ－Ｔ）対合が、そしてＲＮＡについてはグアニン－シトシンおよびアデニン－ウラシル（Ｇ－ＣおよびＡ－Ｕ）対合が挙げられる。典型的には、当該用語は、アンチコドン領域またはアンチコーディング領域と呼ばれるヌクレオチドの相補鎖についてのヌクレオチドの鎖の選択的認識の文脈において使用される。
語句「選択的にハイブリダイズしている」、「選択的ハイブリダイゼーション」、「選択的選別」、および「選択的認識」は、相補的オリゴヌクレオチド鎖の、非相補的オリゴヌクレオチド鎖に対する、５：１～１００：１、またはそれを超える選択性を指す。
用語「オリゴヌクレオチドコード化分子」は、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのコード化部分を含有する本開示の分子を指す。
用語「コーディング部分」は、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドコード化分子の一部を指し、当該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分をコード化し、かつこれを識別することができる。
用語「コード化部分」は、オリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分によってコードされ、かつこれによって識別され得る位置構築ブロックＢ１およびＢ２等の構築ブロックの構造を含有するオリゴヌクレオチドコード化分子の１またはそれを超える部分を指す。例えば、用語「コード化部分」は、コード化部分を合成するプロセスの一部として当該構造が加えられ得るとしても、例えば、リンカーを含まない。なぜなら、リンカーは、オリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分によってコード化されなかったためである。第２の例として、用語「コーディング部分」および「コード化部分」は、蛍光側鎖等の、コーディングプロセスの後に導入された分子構造を含まない。
語句「位置構築ブロックの総数」は、コード化部分内の構築ブロックの総数を指す。用語「構築ブロック」の意味は、文脈に従って変わり得る。用語「構築ブロック」は、一般に、コーディング部分内にコード化されており、かつコード化部分になされる化学変化を指す。構築ブロックの第１の例が、リンカーまたは別の構築ブロックと反応し、かつこれに結合されて、コード化部分の一部を形成することができる化学サブユニットである。第２の例として、構築ブロックは、化学部分の除去を含む化学変化であり得る。この具体例として、以下に限定されないが、エステルの加水分解、またはアミンもしくはアルデヒドもしくはアルコールの脱保護が挙げられる。第３の例として、リンカーまたは別の構築ブロックになされた、当該リンカーまたは構築ブロックの反応性を変化させる化学変化を示す構築ブロックが挙げられる。具体的な例として、以下に限定されないが、アルコールの、アルデヒドもしくはケトンへの酸化、アルデヒドもしくはケトンの、アルコールへの還元、ニトロ基の、アミンへの還元、アジドの、アミンへの還元、またはアミンの、ニトロ基もしくはアジドへの酸化が挙げられる。
用語「識別された」および「識別する」は、コーディング部分のコーディング領域またはコーディング領域の組合せと、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の構築ブロックの構造および／または配列との間に存在する相関を指す。一般に、コーディング領域の配列のこの相関は、たとえ配列がオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分のＰＣＲ生成コピーから間接的に得られる場合であっても、コード化部分の配列、構造、および／または予測される構造の推定または識別を可能にするように、コード化部分を構築するのに使用される合成工程の知識と組み合わされ得る。
用語「第１の」、「第２の」等は、どの対象物が参照されることとなるかを単に指定または区別する用語であると理解され、そして多くの場合、偶然最初に遭遇される順序に基づく。例えば、「第１の」配列は、偶然最初に使用される配列であり、そして第１のコーディング領域は、第１の配列に偶然に固定化され得る第１のコーディング領域である。特に明記しない限り、用語「第１の」、「第２の」等は、分子内の位置を指すものではない。例えば、第１のコーディング領域および第２のコーディング領域は、連続していてもいなくてもよく、そしてコーディング部分内で互いに近接していてもいなくてもよいことが理解される。
本開示において、分子式中のハイフンまたはダッシュは、共有結合またはハイブリダイゼーションを介して式の部分同士が直接的に連結されていることを示す。
特に明記しない限り、ヌクレオチド、整数値、およびパーセンテージの全範囲は、中間の整数および終点を全て含む。例えば、５～１０ヌクレオチドの範囲は、５、６、７、８、９、および１０ヌクレオチドを含むと理解されるであろう。
特定の実施形態において、本開示は、コーディング部分としての少なくとも１つのオリゴヌクレオチド部分、および少なくとも１つのコード化部分を含有するオリゴヌクレオチドコード化分子（ＯＥＭ）に関し、オリゴヌクレオチド部分は、コンビナトリアル化学を使用して少なくとも１つのコード化部分の合成を指示またはコード化した。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子のオリゴヌクレオチド部分は、オリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を識別することができるか、またはその推定を容易にすることができる。特定の実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも２つのコーディング領域を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド部分を含有し、少なくとも２つのコーディング領域の組合せが、コード化部分における構築ブロックの配列、またはコード化部分の構造に対応し、かつこれを識別または推定するのに使用され得る。特定の実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド部分が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されて、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド部分のコピーを生成することができる。一実施形態において、元のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド部分、またはそのコピーが配列決定されて、オリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも２つのコーディング領域の組合せの正体を決定することができる。特定の実施形態において、少なくとも２つのコーディング領域の組合せの正体は、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分を合成するのに使用される一連のコンビナトリアル化学工程に相関し得る。特定の実施形態において、コード化部分を合成するのに使用される一連のコンビナトリアル化学工程は、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分を識別することができるか、またはその推定を可能にすることができる。
オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリを合成する方法が、標的分子に対する数百万～数十億の分子の標的活性等の分子間特性を体系的に評価する能力に起因して、強力な学術研究および産業研究の焦点となっており、そして現在も続いている。例えば、標的分子ががん経路における重要な酵素であれば、研究者は、数百万～数十億個のオリゴヌクレオチドコード化分子のうちの１つまたはそれより多くのコード化部分が、その反応を触媒する速度を増減させるように当該酵素に結合することができるかを決定することができる。類似して、これは、適切な組合せが見出されるまで短時間で何百万もの組合せを電子的に試すことができるデバイスを使用することによって、デジタルロックに対する組合せを決定することに似ている。しかしながら、デジタルロックは、正しい一連の数字によってロック解除されるように設計されるが、生物学的標的は、構造の適切な組合せを有していない場合がある。しかし、うまくいけば、有効な治療法として市販されるほど十分にうまく機能することとなる１またはそれを超える分子が見出され得る。この課題に取り組むために、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリが、一種の誘導進化を使用して、所望の結合親和性を有し得る分子にますます近づき得る。例えば、オリゴヌクレオチドコード化分子が標的分子と弱く反応するならば、オリゴヌクレオチドコード化分子の次のライブラリが合成されて、最も有望な候補のコード化部分の構造変種を探索することができ、より一層良好な結合特性を有するコード化部分を見出すことが期待される。この誘導進化および評価は、次の分子が誘導進化研究用の開始点として選択されるように、有効な解決策が見出されるまで、または行き詰まりに達するまで進められ得る。
しかしながら、有用な特性を有する分子を発見するための、この研究分野の有望性にも拘わらず、大部分の研究は、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリを合成する効果的な方法を開発している最中である。また、コーディング部分またはそのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）コピーから、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分を配列決定して識別する次世代方法もかなり開発されている。また、配列決定データからより大きな次元性を引き出すための統計的技術を用いる多大な努力もなされている。オリゴヌクレオチドコード化分子が、所望の特性について標的分子に対してどのように試験されるかという問題については、あまり進展していない。
オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリが標的分子と反応するかを試験する伝統的な一方法が、「集団曝露（ｍａｓｓ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）」法であり、これは、ある場合には「パニング」と称される。集団曝露法は単純に、溶媒または媒体中で、標的分子を、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリまたはその一部に曝露するだけである。典型的には、標的分子が固定化されており、そしてオリゴヌクレオチドコード化分子が標的分子に結合する。曝露期間後、溶媒または媒体が除去されて、標的分子に付着されたか、またはこれと会合された強い結合オリゴヌクレオチドコード化分子を残す。当該強い結合オリゴヌクレオチドコード化分子は、ＰＣＲを使用して、コーディング部分のコピーを作製してから、コピーまたはオリジナルを配列決定して、強い結合コード化部分の構造をデコードかつ識別することによって、識別され得る。この方法は、どのメンバーまたは特定のオリゴヌクレオチドコード化分子が標的分子に強く結合し、またはこれと会合するかを発見することができる。しかしながら、この集団曝露法は、信頼性が低く、反復実験において識別される一連のバインダは、大きく変動し得る。典型的には、中程度の、または弱いバインダでしかないが、化学構造を生物学的活性と相関させる際の貴重な洞察を構造が提供し得る多くの分子がたとえ存在し得るにしても、最も強いバインダしか、毎回再現可能に捕捉されない。さらに、この方法は、試験チャンバ内に固定化されたままのメンバーが、チャンバそれ自体、またはテザリング媒体、または別のオリゴヌクレオチドコード化分子等の試験環境の一部の部分に結合する偽陽性を提供し得る。また、集団曝露法は、標的分子に弱く、中程度に、または一層強く結合する分子が、結合して、結合を解除して、その後、溶媒が除去されたときに洗い流され得るので、偽陰性をもたらす。結合して、結合を解除して、洗い流される分子は、決して回収も配列決定データで識別もされ得ないので、アッセイの損耗に起因するこの種の偽陰性は、実際のバインダを非バインダと区別できないようにする。偽陰性の第２の供給源は、多くの偽陽性の存在である。多くの場合、偽陽性は、配列決定データにおいて、実際のバインダよりも強いシグナルを与える。このような場合、実際のバインダを偽陽性から識別することができず、実際のバインダはノイズに埋もれてしまう。実際、この集団曝露法は、標的分子に対するオリゴヌクレオチドコード化分子の標的親和性を測定するためのデータを提供しない。この標準的な方法によって生成されるデータは、バイナリである：ＰＣＲおよび配列決定中に存在するとは、結合していることを意味する；そしてＰＣＲ中に存在しないとは、結合していないことを意味する。集団曝露法は、加工の観点からは効率的であり得るが、データ取得の観点からは非効率的であり、かつ限定的である。データを獲得することは、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリのハイスループットスクリーニングの主要な目標であるので、集団曝露法は、創薬プロセスにおいてボトルネックとなっている。
オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリが標的分子に結合するかを試験する別の伝統的な方法が、「集団曝露後電気泳動」法であり、場合によっては「ゲルシフトアッセイ」と称される。この方法では、集団曝露後電気泳動法は単純に、標的分子が結合していないことを除いて、前述の「集団曝露」法と同様にして、溶媒または媒体中で標的分子をオリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリに曝露するだけである。代わりに、標的分子に結合したオリゴヌクレオチドコード化分子、結合していない標的分子、および結合していないオリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリの混合物が、混合物を伝統的な電気泳動に供することによって精製される。伝統的な電気泳動は、分子のサイズと電荷間の差に基づいて、標的分子に結合したオリゴヌクレオチドコード化分子を分離し、これにより、オリゴヌクレオチドコード化分子に結合した標的分子を、結合していない標的分子および結合していないオリゴヌクレオチドコード化分子から分離することができる。この集団曝露に続く電気泳動の方法は、標的分子に結合したオリゴヌクレオチドコード化分子を、結合していないままのオリゴヌクレオチドコード化分子および標的分子から分離するという利点を有し得る。しかしながら、この従来技術は、同じ偽陰性の弱点があり、そして同じバイナリデータ、すなわち結合しているまたは結合していないを提供する。
本開示は、ある種の「標的活性電気泳動」を用いることによって、オリゴヌクレオチドコード化分子を分離する方法に関する。本明細書中に開示される方法の一般的な概要として、図１および図２を参照すると、本方法は、少なくとも１つの標的分子を含有する分離媒体を提供する工程１０２、２０２と；少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、分離媒体に導入する工程であって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分（「星形」）に作動可能に連結された（例えば、「Ｌ」）コーディング部分（例えば、「ＣＢＡ」）を含む、工程１０４、２０４と；少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する（稲妻記号のサイズによって示される相対的標的活性）工程１０６、２０６と；分離媒体由来の少なくとも２つの別個の位置の少なくとも１つの位置をセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成し、そして移動距離（Ｄ１またはＤ２として示されている）を測定することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程１０８、２０８と；少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ＰＣＲを可能にする工程１１０、２１０と；少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分に対してＰＣＲを実行することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅させる工程１１２、２１２と；分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分、またはそのＰＣＲコピーを配列決定して、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を識別する工程１１４、２１４と；少なくとも１つの位置を、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分の正体と相関させることによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集する工程１１６、２１６とを含む。
一般に、本方法は、オリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を、標的分子を含有する分離媒体に導入することと、電気泳動を使用して、標的分子を含有する分離媒体を通してオリゴヌクレオチドコード化分子を移動させることとを含み、それにより、オリゴヌクレオチドコード化分子は、標的分子と、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分との間の活性に少なくとも部分的に基づいて、分離される。次いで、一実施形態において、本方法は、分離または分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を含有する分離媒体をセグメント化することと、出発点またはサンプルウェルからの様々なセグメントの移動距離を測定することとを含んでもよい。次いで、一実施形態において、本方法は、分離媒体を加工することによって、オリゴヌクレオチドコード化分子を収穫して、オリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分のＰＣＲ増幅を可能にすることを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、オリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分のＰＣＲ増幅および配列決定を行うことと、次いで、配列データを相関させて、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分を識別することと、コーディング部分を配列決定することと、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の構造を識別または推定することとを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、コード化部分の正体を、分離媒体における移動距離または位置と相関させることによって、標的活性データを収集することを含んでもよい。
より詳細には、一実施形態において、本方法は、媒体中の標的分子を固定化してもよいし、標的分子の移動度を低下させてもよい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリを、サンプルウェルにて分離媒体に導入してもよい。次いで、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリを電気泳動に供して、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリを、媒体に通して移動させ、固定化された標的分子と接触させてもよい。さらに、一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子のライブラリを、標的分子との活性に部分的に基づいて、分離または分割されてもよい。一実施形態において、標的分子との活性が高いオリゴヌクレオチドコード化分子は、分離媒体を通る移動が失速するであろうが、標的分子との活性が低いオリゴヌクレオチドコード化分子は、移動があまり失速しないであろう。一実施形態において、十分な分離が達成されると、媒体を部分にセグメント化することによって、オリゴヌクレオチドコード化分子を含有するサンプル混合物の部分を回収してもよい。一実施形態において、当該部分を、溶媒中に溶解させて、または溶媒中に浸漬して、当該部分内のオリゴヌクレオチドコード化分子を溶媒に通過させることによって、単離してもよい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子の一部が回収されると、ＰＣＲを実施して、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分のコピーを形成することによって、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分を決定してもよい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分のコピーを配列決定してもよく、そして配列データを使用して、オリゴヌクレオチドコード化分子を識別し、かつ分離媒体におけるオリゴヌクレオチドコード化分子の移動距離を測定してもよい。
一実施形態において、本方法の一利点は、偽陰性を回避するか、または低減させることであり得る。この理由は、より強い電圧を印加することによって、一層強い結合するまたは反応するオリゴヌクレオチドコード化分子を回収することができるので、検出からの分子の消失に基づいて推定を行う必要がないからである。一実施形態において、本方法の利点は、オリゴヌクレオチドコード化分子の移動距離の測定が、標的分子に対するオリゴヌクレオチドコード化分子の親和性の定性的データおよび／または定量的データを提供することができることであり得る。対照的に、従来の方法は、分子毎のバイナリデータ、すなわち結合または非結合しか提供することができない。一実施形態において、本開示の方法の利点は、異なるタイプの相互作用を測定することを含み得る。例えば、従来の方法は、プローブ－標的親和性を測定することしかできない。対照的に、本明細書中に開示される方法は、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の化学反応性に関するデータを提供することができる。なぜなら、コード化部分と反応する、例えば反応を触媒する標的分子の化学反応性は、分離媒体を通る移動速度を遅くする傾向があるからである。
一実施形態において、本開示の方法は、捕捉かつ識別される実際のバインダの数を大幅に増大させることができる。第１に、実際のバインダは、アッセイの損耗に埋もれる可能性がはるかに低い。なぜなら、「洗浄」工程がないからである。集団曝露／パンニング法における洗浄工程は、液体の流れを使用しており、そして、標的から離れた、標的に結合することができない分子を移動させることが意図される。しかしながら、実際の効果は、結合していない分子を移動させるものである。すなわち、洗浄は、（ａ）結合することができない分子、および（ｂ）一時的にのみ結合が解除される分子の双方を等しく移動させることとなる。対照的に、本明細書中に開示される方法は、電気泳動を使用して、標的に結合していない分子を移動させるが、標的が存在するある場所から、標的が存在する別の場所に移動させる；これが、一時的にのみ結合が解除される分子に、再結合するより大きな機会を与える。このプロセスは、移動の経路に沿って何度も繰り返されるので、偽陰性としてアッセイの損耗に埋もれる化合物ははるかに少ない。第２に、システムにおける電圧は、一時的に、非特異的に結合する分子に対して非常に強く、かつ連続的な力をかけるので、当該分子は、洗浄プロセスによって除去されるよりも徹底的に除去される。より完全に除去されることで、当該化合物は、配列決定データにおいて生成するシグナルがより小さいので、実際のバインダのシグナルをかき消す可能性はより低い。正味の効果は、シグナル対ノイズ比の非常に大きな増大であり、そして実際のバインダとして識別される化合物の数の非常に大きな増大である。
一実施形態において、本方法は、分離媒体を提供することを含み、分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する。一実施形態において、分離媒体は一般に、当該媒体がオリゴヌクレオチドコード化分子の電気泳動を可能にする限り、限定されない。適切な分離媒体には、電気泳動に適した多孔質ゲルおよび緩衝系が含まれる。適切な多孔質ゲルとして、アガロース、ポリアクリルアミド、種々のヒドロゲル、およびデンプンが挙げられ得る。適切な緩衝系として、トリス／酢酸／ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）、トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）、トリス／ホウ酸（ＴＢ）、およびリチウム／ホウ酸（ＬＢ）が挙げられ得、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を表し、トリスはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを表す。ゲルの多孔性は、選択した緩衝系中の種々の濃度のゲル化材料を利用して制御することができる。
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つの標的分子を含有する分離媒体を提供することを含む。一実施形態において、標的分子を、分離媒体、粒子、ポリマー、および分離表面の少なくとも１つに結合するか、または繋げることによって、標的分子を固定化することもできるし、標的分子の移動度を低下させることもできる。一実施形態において、標的を分離媒体と接触させる前に、接触させている間に、または接触させた後に、標的分子を、粒子、ポリマー、および分離表面の少なくとも１つに結合させることもできるし、繋げることもできる。一実施形態において、標的分子は、アガロースゲル等の分離媒体に加える前に、粒子に結合するか、または繋がれる。一般に、電気泳動中に結合が安定である限り、一方の分子を表面または他方の分子に結合させる適切なあらゆる方法を使用することができる。
一実施形態において、タンパク質またはタンパク質複合体等の標的分子は、当該分野において知られている種々の結合方法を使用して、分離媒体、粒子、ポリマー、および分離表面が挙げられるアンカーに結合することができる。適切な結合方法として、アミド結合架橋、スルファミドまたはスルホン形成、弱反応性求電子相互作用、重合反応、ジスルフィド形成、エステル形成、クリック反応（銅とのアジドアルキン反応等）、ディールス・アルダー環化付加、交差メタセシス、およびマトリックス捕捉によるアルギン酸カルシウム固定化が挙げられる。
標的分子等の分子の、固体表面上への固定化は、天然分子の活性を隠すことができる分子の変形を引き起こす、または少なくともそのリスクがあることが知られている。標的分子の変形を回避または低減する方法は、標的分子の天然の活性を測定することを可能にするので、有利であり得る。一実施形態において、標的分子は、ポリマーまたはオリゴマー（分離媒体のポリマーおよび／またはオリゴマー以外）に付着され、結合され、強く会合され、または繋がれ、ポリマーまたはオリゴマーは、標的分子の最低分子量の１０％またはそれを超える（２０％～５０００％を含む）分子量を有する。一実施形態において、標的分子をポリマーまたはオリゴマーに繋げる利点は、オリゴヌクレオチドコード化分子、標的分子、およびポリマーまたはオリゴマーの組合せが、分離媒体を通って異なる速度で移動することができて、標的分子を変形させるリスクを排除または低減しながら、他の分子からの更なる分離を可能にすることであり得る。一実施形態において、標的分子をポリマーまたはオリゴマーに繋げる利点は、コーディング部分をＰＣＲ、そして配列決定して、コード化部分を識別する前に、オリゴヌクレオチドコード化分子、標的分子、およびポリマーまたはオリゴマーを、分離媒体から、例えば溶媒または緩衝液中に取り出すことができることであり得る。
一実施形態において、本方法は、分離媒体を含み、分離媒体は、粒子に結合されたか、または繋がれた標的分子を含有する。一実施形態において、粒子は、適切な抗標的タグで標識された組成物であってもよい。一実施形態において、粒子は、固体粒子、非晶質粒子、多孔質粒子、ポリマー粒子、金属コロイド、材料の混合物、またはモノマー電気泳動媒体であってもよい。適切な粒子として、イオン交換樹脂、シリカ粒子、ポリスチレン、アガロースビーズ、ビオチン標識アガロース、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ、ＴＥＮＴＡＧＥＬ（登録商標）樹脂ビーズ、デンドリマーポリマー（ポリエチレングリコールおよびポリスチレン等）、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（磁性粒子）；およびマトリックス捕捉によるアルギン酸カルシウム固定化が挙げられ得る。一実施形態において、標的分子を粒子に結合するか、または繋ぐ一利点は、標的分子が固定化されるか、または電気泳動中の移動が、結合していない標的分子と比較して遅くなることであり得る。
一実施形態において、標的分子を粒子に付着させるか、または繋げる利点は、粒子が分離媒体中で固定化されることであり得る。一実施形態において、標的分子は、ゲル電気泳動プレートの表面に付着されるか、またはその表面上に固定化され、ゲル電気泳動プレートは、ゲルが形成される表面である。一実施形態において、標的分子を粒子または表面に付着させるか、または繋ぐ利点は、標的分子の移動速度が分離の基礎として取り除かれるように、標的分子の移動が制限されるか、または妨げられることであり得る。
標的分子を分離媒体、粒子、ポリマー、または分離表面に選択的に結合することができる方法は、有利であり得る。なぜなら、異なる結合機構を使用することを可能にし、これが複数の実験にわたる検討から結合機構の選択を取り除くことができるからである。一実施形態において、コンジュゲートペア反応は、分離媒体、粒子、ポリマー、または分離表面にタグ付き標的分子を選択的に結合する。適切なコンジュゲートペア反応として、ニッケルＮＴＡもしくは抗Ｈｉｓ抗体を含有するか、または表面上に提示する粒子に対する、６～１０の整数のＨｉｓタグ（Ｈｉｓはヒスチジンである）、ストレプトアビジン、アビジンまたは抗ビオチン抗体を含有する粒子に対するビオチンタグ；ストレプトアビジンまたはアビジンを含有する粒子に対するストレプトアビジン結合ペプチド；Ｈａｌｏ－Ｔａｇタンパク質を提示する粒子に対するｈａｌｏ－Ｔａｇ；抗ＦＬＡＧ抗体を含有するか、または提示する粒子に対するＦＬＡＧタグ；カルモジュリンを含有するか、または提示する粒子に対するカルモジュリン結合タンパク質；グルタチオンを含有する粒子に対するグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ；セルロース粒子または分離媒体に対するセルロース結合ドメイン（ＣＢＰ）；抗タンパク質抗体を含有するか、もしくは提示する粒子に対する、または一般的な付着化学（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙ ｓｕｃｃｉｄｉｍｉｄｅ）またはカルボジイミド化学）によって粒子表面上のカルボキシル基と反応した表面リジン部分によって粒子に共有結合で繋がれた天然タンパク質；ビオチンもしくは抗ストレプトアビジン抗体を含有するか、または提示する粒子に対するストレプトアビジンタンパク質；および相補的オリゴヌクレオチドを含有するか、または提示する粒子に対するオリゴヌクレオチド標識タンパク質が挙げられる。
一実施形態において、本方法は、分離媒体中に標的分子を含む。一実施形態において、本方法は、サンプル、またはオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物が、分離媒体に導入される前に、標的分子を分離媒体中に加えるか、または混合することを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、標的分子を分離媒体に、または分離媒体によって接触するか、もしくは分離媒体によって含有される表面に固定化または結合することを含んでもよい。一実施形態において、標的分子は、幹細胞またはがん細胞が挙げられる細胞；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）が挙げられるオリゴヌクレオチド；天然細胞溶解物、標的過剰発現細胞溶解物；以下に限定されないが、シトクロム、キナーゼ、グルタミナーゼ、ホスホリラーゼが挙げられる天然タンパク質、突然変異タンパク質、ペプチド、酵素、リボソーム、リポソーム、合成分子、およびナノディスクであり得、これらの中には各々、一部または全ての混合物が含まれる。適切な合成分子には、薬物および汚染物質が含まれ得る。一実施形態において、ナノディスクは、疎水性エッジが２つの両親媒性タンパク質によって区切られているリン脂質の脂質二重層を含んでもよい。そのようなナノディスクは、多くの場合、膜タンパク質を研究するのに使用されている。一実施形態において、標的分子は、ナノチューブ、ポリマー、ナノ粒子、またはコロイドが挙げられる粒子に付着されている。
一実施形態において、標的分子は、移動軸に沿って分離媒体中に均一に、または実質的に均一に分配され得、移動軸は、分離媒体を横切る電圧の方向であり得る。一実施形態において、標的を、移動の方向に対して濃度勾配を増減させて分配して、オリゴヌクレオチドコード化分子の分離を増減させることができる。一実施形態において、標的分子を粒子またはポリマーに繋げて、次いで、媒体が固化またはゲル化する前に、繋がった標的を分離媒体中に混合して、混合物を遠心分離して、繋がった標的の濃度勾配を分離媒体内で提供することができる。標的をポリマーまたは粒子に繋げる一利点は、設計されたプロファイルに従って分離媒体中に標的を分配させるポリマーおよび粒子を選択することであり得る。例えば、分離媒体が固化またはゲル化したときに標的分子の２つの群またはバンドが形成されるように、均質な一群の標的分子を、２つの異なるサイズの粒子のうちの１つに繋ぐことができる。
一実施形態において、標的分子を、媒体が固化またはゲル化する前に、分離媒体中に混合して、混合物を遠心分離して、標的の濃度勾配を分離媒体内で提供することができる。適切な遠心分離法として、分画遠心分離、速度ゾーン遠心分離、および等密度遠心分離が挙げられ得る。一実施形態において、分離媒体中の標的材料の濃度勾配は、サイズ排除分画、材料の電気泳動、磁気標的の磁気分離、他のクロマトグラフィ分離技術由来の分離に基づく時限保持、または液体媒体中で標的を操作する適切なあらゆる方法によって提供され得る。
一実施形態において、本方法は、ある量の標的分子を、ある量の液体分離媒体と混合して、分離媒体中での標的分子濃度を提供することを含んでもよい。一実施形態において、分離媒体中の標的分子の濃度は、約５００μｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬに及んでもよい。一実施形態において、本方法は、標的分子を、粒子、ポリマー、またはオリゴマーと接触させるか、混合するか、または結合させて、次いで標的分子と、粒子、ポリマー、またはオリゴマーとの混合物を分離媒体に加えることを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、標的分子、および粒子、ポリマー、またはオリゴマーを、分離媒体に同時に、またはあらゆる順序で加えることを含んでもよい。
一実施形態において、本方法は、分離媒体を提供することを含み、分離媒体は、少なくとも１つの標的分子、および少なくとも１つのサンプル領域またはサンプルウェルを含有する。一実施形態において、本方法は、分離媒体を電気泳動プレートの平坦な表面上に加え、注ぎ、かつ／または成形して、略平坦な連続分離媒体を提供することを含む。そのような平坦な連続分離媒体を図４に示す、４０２。図３を参照すると、分離媒体を、図３に示すように、分離媒体のレーンに成形または形状化することができる。一実施形態において、本方法は、レーンの隆線を有する型を上面に設ける工程３０２と；レーンの隆線を有する型の上面上に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の適切なポリマーを注いでこれを架橋またはゲル化させる工程３０４と；レーンチャネルが上向きになるように成形ポリマーを配向させる工程３０６と；必要に応じて、注型物（ｍｏｌｄ ｏｆｆ）のセクションをブロックする工程３０８、３１０と；レーンチャネルを分離媒体で充填して、分離のレーンに形状化された分離媒体を形成する工程３１２とを含む。一実施形態において、注型物のセクションをブロックする材料を取り外して、サンプルウェル３１２を形成することができる。一実施形態において、分離媒体が固化またはゲル化した後に、サンプルウェルを切断して分離することができる。標的との活性が異なるオリゴヌクレオチドコード化分子のより高い解像度が、連続分離媒体またはキャピラリー電気泳動を使用する分離によってよりも標的活性電気泳動によって達成され得ることが発見された。理論により拘束されることを望むものではないが、キャピラリー電気泳動を使用する分離は、標的がタグ付けされないという利点があるが、オリゴヌクレオチドコード化分子は、標的に結合したときに、遊離しているものよりも大きな有効分子量を獲得することで、異なって移動する場合に分離が達成されると考えられる。しかしながら、達成可能な分離の程度は、結合していない可動性オリゴヌクレオチドコード化分子と、結合した可動性オリゴヌクレオチドコード化分子との異なる移動度に制限される。標的活性電気泳動は、より高い解像度を達成することができる。なぜなら、固定化された標的に結合するオリゴヌクレオチドコード化分子は、結合している間に全く動くことができない限り、実際上無限の分子量を獲得するが、結合していないオリゴヌクレオチドコード化分子は、依然として系の最大速度にて自由に動くからである。
一実施形態において、本方法は、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体中の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成することを含み、分離媒体は、分離レーンに成形または形状化され、分離レーンは、幅の半径および深さの半径を有し、幅の半径Ｒ１および深さの半径Ｒ２は、同じであっても異なってもよく、移動方向において分離レーンの長さに沿って増大しても、減少しても、一定のままであってもよい。
一実施形態において、本方法は、第１の分離処理を分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することを含んでよく、第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む。一実施形態において、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することを含んでもよい。方向または軸の文脈において、用語「実質的に」は、３０度以内を意味する。言及される方向と整列されているほど、結果が良好であることが理解される。第１の分離処理が十分であれば、更なる精製方法も分離方法も必要とされ得ない。しかしながら、第１の分離処理が所望の解像度を提供しなければ、その後の第２の処理または逐次的な処理を施してもよい。例えば、第１の処理を一方向に施した後に、第２の処理を、電気泳動条件を第２の方向に適用することによって施してもよい。
一実施形態において、本方法は、第２の分離処理を分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することを含み、第２の方向は、第１の方向に対して実質的に垂直であり、第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む。一実施形態において、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することを含む。本方法の一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子が、同じ分離媒体中に維持されている間に、第１および第２の分離処理を施す。一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子の混合物に二次元電気泳動を用いる利点は、異なる電圧、電圧の異なる変化もしくはランプ速度、または印加される第１の電圧パラメータに対するパルス電圧が挙げられる、異なる第２の電圧パラメータの印加に基づくオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物の分離の向上であり得る。この実施形態は、当該技術において知られている二次元電気泳動と一致する。
図４を参照して、一実施形態において、本方法は、少なくとも１つの標的分子を含有する第１の分離媒体を提供する工程４０２と；第１の分離処理を分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程であって、第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む、工程４０４と；第１の分離媒体の一部またはプラグを、例えば分離のライン、レーン、または軸に沿って、第１の分離媒体からセグメント化する工程４０６と；プラグを第１の分離媒体から第２の分離媒体のサンプルウェル中に挿入するか、または差し込む工程４０８、４１０と；第２の分離処理を分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を第２の分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程であって、第２の方向は、第１の方向に実質的に垂直であり、第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む、工程４１２とを含む。一実施形態において、本方法は、第２の分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することを含む。一実施形態において、第１および第２の分離媒体は、同じであっても異なってもよい。一実施形態において、第１の分離媒体は、第１の標的分子を含有してもよく、そして第２の分離媒体は、第２の標的分子を含有してもよく、第１の標的分子は、第２の標的分子と同じであっても異なってもよい。一実施形態において、第１の標的分子および第２の標的分子の濃度は、同じであっても異なってもよい。
一実施形態において、分離媒体は、少なくとも１つのサンプル領域またはサンプルウェルを含む。一実施形態において、少なくとも１つのサンプル領域は、少なくとも１つの標的分子を含有する領域から分離されており、分離は、１ｍｍ～１０ｃｍに及ぶ。一実施形態において、少なくとも１つのサンプル領域は、分離媒体に切り込まれた１またはそれを超える穴またはウェルを含んでもよい。一実施形態において、サンプル領域の利点は、電気泳動または電気泳動分離の前に、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを導入するための場所を含んでもよい。一実施形態において、本方法は、サンプル領域の縁部から、分解されたセグメントの縁部までの移動距離を測定することを含んでもよく、サンプル領域の縁部は、移動方向における縁部である。
一実施形態において、サンプルを電気泳動に供して、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子をサンプル領域から移動させて、少なくとも１つの標的分子と接触させることによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物またはその一部を標的分子と接触させることができる。電気泳動の方法は一般に、混合物の少なくとも一部を、標的分子に接触させ、かつ／または少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体に通して移動させることができる限り、限定されない。一実施形態において、電気泳動を用いる方法は、オリゴヌクレオチドコード化分子、標的分子、または、存在するならば、標的分子に繋がれた粒子もしくはポリマーの劣化を引き起こさないであろう。
一実施形態において、本方法は、第１の分離処理を分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することを含み、第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む。一実施形態において、本方法は、第２の分離処理を分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することを含み、第２の方向は、第１の方向に対して実質的に垂直であり、第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む。分離工程は、追加の分離処理を追加の電圧プロトコルについて追加の期間、必要に応じて追加の方向に施すことによって、望むだけ何回も繰り返すことができることが理解される。本方法の一実施形態において、第１の分離処理として、約５Ｖ～約１５０Ｖ、例えば約３０Ｖ～約１４０Ｖ、例えば約５０Ｖ～約１２０Ｖを、約１～５０時間、例えば約２～約４０時間、例えば約３～約３０時間の第１の持続時間印加する第１の電圧プロトコルが挙げられ得る。本方法の一実施形態において、第２の分離処理として、約２０Ｖ～約１５０Ｖ、例えば約３０Ｖ～約１４０Ｖ、例えば約５０Ｖ～約１２０Ｖを、約１～５０時間、例えば約２～約４０時間、例えば約３～約３０時間の第２の持続時間印加する第２の電圧プロトコルが挙げられ得る。一実施形態において、第１の処理プロトコルおよび第２の処理プロトコルは、それぞれ独立して、印加電圧を約１Ｖ／時～約５Ｖ／時の速度で増大させることを含んでもよい。一実施形態において、第１の処理プロトコルおよび第２の処理プロトコルは、それぞれ独立して、印加電圧を約１Ｖ／時～約５Ｖ／時の速度で低下させることを含んでもよい。異なる電圧プロトコルが、異なる長さの分離媒体に有用であり得ることが理解される。一般に、長さが長いほど、より短い分離時間を提供するには高い電圧が必要となる。一実施形態において、本方法は、分離媒体をアノードとカソードとの間に配置することと、分離媒体またはゲルに約１Ｖ／ｃｍ～約３５Ｖ／ｃｍに及ぶ電圧を印加することとを含んでもよい。一実施形態において、分離媒体は、約３ｃｍ～約７５ｃｍに及んでもよい。一実施形態において、第１の処理プロトコルおよび第２の処理プロトコルは、パルス電流を流すことを含んでもよい。一実施形態において、第１および第２の電圧プロトコルは、分離媒体を約２℃～約６０℃、例えば３℃～約１０℃、例えば１０℃～約３０℃、例えば３０℃～約４０℃の温度に加熱、冷却、または維持することを含んでもよい。
一実施形態において、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することを含んでもよい。特に明記しない限り、セグメント化に用いられる語句「実質的に垂直な方向」は、分離媒体を通るオリゴヌクレオチドコード化分子の移動方向から約７０°～約１２０°までの測定される角度にて分けること、または切断することを意味する。用語「セグメント化」は、一般に、分離媒体が部分に分かれる限り、限定されない。例えば、分離媒体がゲルである場合、セグメント化は、ゲルをセグメントに切断することを含み得る。一実施形態において、分離媒体がゲルである場合には、本方法は、ゲルを凍結することと、凍結ゲルを、メス、カミソリ、またはレーザーで切断することによって凍結ゲルをセグメント化することとを含んでもよい。加えて、分離媒体が液体である場合、セグメント化は、ピペッティングによってアリコートを取り出して、分解された液体セグメントを形成することを含んでもよい。図２を参照して、本方法の一実施形態において、分離媒体の１またはそれを超えるセグメントが分離媒体から分けられるか、もしくは切断される前に、その間に、またはその後に、分離媒体の１またはそれを超えるセグメントまたは分解されたセグメントの移動距離（例えば、Ｄ１、Ｄ２）が測定される。
一実施形態において、分離媒体のセグメント化の前に、間に、または後に、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工してＰＣＲを可能にすることができる。この工程は、一般に、ＰＣＲが可能となるように分離媒体が変更される限り、限定されない。一実施形態において、分離媒体が液体であれば、当該工程は本方法から省略することができる。一実施形態において、分離セグメントからオリゴヌクレオチドコード化分子の画分を取り出すことは、分離媒体の単離されたセグメントを溶媒中に、オリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも一部がセグメントから溶媒中に拡散するまで、浸漬するか、または湿潤させることを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、セグメントまたは分割セグメントを水または溶媒中に浸漬して、ＯＥＭを分離媒体から追い出すことを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、分離媒体の融解温度が約２０℃～約１００℃である場合には、セグメントまたは分解されたセグメントを緩衝溶液中で約２０℃～約１００℃に加熱することを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、セグメントまたは分解されたセグメントを約２０℃～約１００℃に加熱することと、ゲルを溶解することができる酵素を加えることとを含んでもよい。一実施形態において、分離媒体がアガロースである場合には、本方法は、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、アルファアガラーゼおよび／またはベータアガラーゼ、例えばβ－アガラ－ゼ Ｉ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡのＮＥＢ）が挙げられるアガラーゼ酵素を加えることによってＰＣＲを可能にすることを含んでもよい。
一実施形態において、方法が、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分に対してＰＣＲを実施することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅させて、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分のコピーを形成することを含んでもよい。ＰＣＲを使用して、分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を増幅させる利点として、注目する分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のシグナル対ノイズ比を向上させることが挙げられ得る。ＰＣＲを使用して、分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を増幅させる利点として、標的分子に不可逆的に結合したか、またはそうでなければ、予期しない反応に起因して分離媒体から取り出すことが困難であるコード化部分の正体を学習することが挙げられ得る。ＰＣＲの手順は、必要に応じて、当該分野において知られている変形によって適合させることができる。
一実施形態において、本方法は、オリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分を配列決定することによって、かつ／またはより見込みの高いことに、オリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分のＰＣＲコピーのコーディング部分を配列決定することによって、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の配列、構造、または予想される構造を識別または推定することを含んでもよい。オリゴヌクレオチドコード化分子、およびオリゴヌクレオチドコード化分子のＰＣＲコピーを配列決定するための手順は、次世代ＤＮＡシーケンシング、大規模並列またはディープシーケンシングを用いることが挙げられる、当該分野において知られている変形によって必要に応じて適合させることができ、当該変形は全て、これらの方法を使用して、時間および費用を節約することができるため、現在研究開発中である。一実施形態において、本方法は、コピー配列の画分の配列を識別して、オリゴヌクレオチドコード化分子の画分の各コーディング領域またはコーディング領域の組合せを識別するか、または相関させて、少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックを識別するか、または相関させることを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分は、オリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分またはそのコピー配列を配列決定することによって識別、決定、または推定され、これは、コーディング部分内のオリゴヌクレオチドの配列を、コード化部分を合成するのに使用した合成工程の配列と相関させることを含んでもよい。
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを、少なくとも１つの位置を少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分の正体と相関させることによって収集することを含んでもよい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子または分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の正体は、測定された移動距離と相関し得るか、一致し得るか、または関連し得る。標的分子に対する活性が低いオリゴヌクレオチドコード化分子は、標的分子に対する活性がより高いオリゴヌクレオチドコード化分子と比較して、分離媒体を通って迅速に移動することとなると考えられる。なぜなら、活性が高いものほど、反応中の進行が遅くなるか、または妨げられることとなるからである。さらに、理論により拘束されることを望むものではないが、標的分子と相互作用するオリゴヌクレオチドコード化分子は、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを有することとなると考えられ、ここでｋｏｎは、オリゴヌクレオチドコード化分子が標的分子と反応、相互作用、または会合する速度であり、そしてｋｏｆｆは、オリゴヌクレオチドコード化分子が標的分子から解離または分離する速度である。一般に、ＯＥＭは、親和性が緊密なほどゆっくりと移動し、そしてＯＥＭは、親和性が緩いほど速く移動することが観察される。しかしながら、標的活性は、必ずしも電気泳動移動に影響を及ぼす因子ではないことが理解される。例えば、電気泳動の速度は、より小さい分子サイズ、および正味の負電荷がより高い分子に基づいて、増大し得る。これらの因子は、適切な制御分子を導入することによって打ち消すことができる。他の電気泳動因子から標的活性を単離する別の方法が、オリゴヌクレオチドコード化分子あたり２またはそれを超えるコード化部分を導入することであり得る。例えば、１つのコード化部分を有するＯＥＭが、その移動を一保持時間だけ遅らせることが期待されるであろう。その場合、２つまたは３つのコード化部分を有するＯＥＭが、１つのコード化部分を有するＯＥＭよりも活性が２倍または３倍大きくなることとなり、それにより、２～３つのコード化部分を有するＯＥＭの移動は、保持時間が１．５倍～３倍しかないＯＥＭと比較して、遅くなるであろうというのも当然である。本明細書中で開示される方法の利点は、複数のコード化部分を有するＯＥＭの使用が、標的活性データを計算する目的のための他の因子に対する因子としての標的活性の単離であり得ることであり得る。そのような方法の利点として、シグナル対ノイズ比を高めるために複数のコード化部分を有するＯＥＭの使用が挙げられ得、それにより、標的活性が僅かにしか異ならないＯＥＭは、保持時間の差、したがって算出された標的反応性の差を拡大するためにＯＥＭ毎に複数のコード化部分を導入することによって、標的活性に基づいて分離または分割することができる。
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つのサンプル領域由来のオリゴヌクレオチドコード化分子の移動の第１の距離を測定することと、移動した距離を、オリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の識別と相関させることとを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、少なくとも１つのサンプル領域由来の第２のオリゴヌクレオチドコード化分子の移動の第２の距離を測定することと、移動した第２の距離を、第２のオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の識別と相関させることとを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、標的分子に対する第１のオリゴヌクレオチドコード化分子の、第２のオリゴヌクレオチドコード化分子に対する相対的または定性的な結合親和性を、第１の距離を第２の距離で割ることによって算出することを含んでもよい。
一実施形態において、本方法は、式（Ｉ）（Ｉ）Ｇ－Ｌ－Ｂ
に従う構造を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドコード化分子を含むことができ、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂは、少なくとも２つの構築ブロックを含有するコード化部分であり；
Ｌは、ＧをＢに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｂ中の各構築ブロックまたは位置構築ブロックは、位置に従って、Ｇの１～５個のコーディング領域によって別々に識別される。
一実施形態において、本方法は、式（ＩＩ）
（ＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドコード化分子を含むことができ、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは０または１であり；
Ｐは０または１であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが１であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇの１～５個のコーディング領域によって識別される。一実施形態において、式ＩＩの分子を使用する方法の利点として、２つのコード化部分を提示するＯＥＭの導入が挙げられ得る。（Ｂ１）Ｍおよび（Ｂ２）Ｋは、上述したように、単一のコード化部分を提示するＯＥＭと比較して、シグナル対ノイズ比を増大させることができる。
一実施形態において、本方法は、式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ’－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドコード化分子を含むことができ、式中、
Ｇ’はオリゴヌクレオチドを含み、Ｇ’は、少なくとも２つのコーディング領域および少なくとも１つのヘアピンを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは、ゼロ～５の整数であり；
Ｐは、ゼロ～５の整数であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが、１～５の整数であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇ’の１～５個のコーディング領域によって識別される。一実施形態において、式ＩＩの分子を使用する方法の利点として、２～１０個のコード化部分を提示するＯＥＭの導入が挙げられ得る。（Ｂ１）Ｍおよび（Ｂ２）Ｋは、上述したように、単一のコード化部分を提示するＯＥＭと比較して、シグナル対ノイズ比を大幅に増大させることができる。
特定の実施形態において、本開示はまた、オリゴヌクレオチドコード化分子を形成する方法に関する。特定の実施形態において、本開示は、本明細書中に開示されるアフィニティ電気泳動を使用することによってオリゴヌクレオチドコード化分子を分離して、標的分子に対するコード化部分の親和性を求める方法に関する。一実施形態において、アフィニティ電気泳動は、以下に限定されないが、標的分子に結合する能力、標的分子の特定の領域に結合する能力、既知の化合物に競合的または非競合的に結合する能力、他の抗標的分子に結合しない能力、標的分子の他の密接に関連するクラスまたはファミリーに結合しない能力、酵素によってなされる化学的変化に耐性である能力、酵素のファミリーによってなされる化学的変化に耐性である能力、酵素または酵素のファミリーによって容易に化学的に変化される能力、ある程度水溶性である能力、組織透過性である能力、および細胞透過性である能力が挙げられる所望の特性に基づいて、分子を分離することができる。
特定の実施形態において、式（Ｉ）の分子は、オリゴヌクレオチドコード化分子である。一実施形態において、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の分子は、式（Ｉ）の分子の亜種である。一実施形態において、式（ＩＩＩ）の分子は、式（ＩＩ）の分子の亜種である。式（Ｉ）の分子の特定の実施形態において、Ｇは、コード化部分の合成のために指示または選択されるオリゴヌクレオチドを含む。式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、（Ｂ１）Ｍおよび（Ｂ２）Ｋはそれぞれ、コード化部分を表す。式（Ｉ）の分子の特定の実施形態において、分子は、オリゴヌクレオチド部分、および少なくとも１つのコード化部分を含有する。Ｇ中のオリゴヌクレオチドの構造的特徴の多くが、式（Ｉ）の分子の少なくとも１つのコード化部分の合成を指示またはコード化していることに関して、そしてこの合成プロセスがオリゴヌクレオチドコード化分子の構造に課す分子構造の関係または相関に関して、本明細書中で考察されていることが理解される。式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）の分子のそれぞれＧまたはＧ’におけるオリゴヌクレオチドの構造的特徴の多くが、式（Ｉ）の分子を調製するために使用される合成工程を識別し、相関させ、またはその推定を容易にする、ＧもしくはＧ’中のオリゴヌクレオチド、またはそのＰＣＲコピーの能力に関して考察されていることが理解される。したがって、コード化部分の構築ブロックの配列および／または構造と、オリゴヌクレオチド部分のコーディング領域の配列または配列の組合せとの間に相関があることが理解される。式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の分子の一実施形態において、Ｇは少なくとも１つのヘアピンを含み、Ｇ’と表すことができる。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’は、オリゴヌクレオチドを含むか、またはオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、コーディング領域の１％～１００％、例えば約５０％～１００％、例えば約９０％～１００％が一本鎖である。特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端コーディング領域を含有し、末端コーディング領域のうちの１つまたは２つが一本鎖である。特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端コーディング領域を含有し、末端コーディング領域のうちの１つまたは２つが二本鎖である。
本開示で使用される用語「ヘアピン構造」は、質量パーセントで６０％～１００％のヌクレオチドを含有し、かつオリゴヌクレオチドＧの末端コーディング領域にハイブリダイズしてＧ’を形成することができる分子構造を指す。ヘアピン構造の特定の実施形態において、ヘアピン構造は、単一の連続したポリマー鎖を形成し、かつ少なくとも１つの重複部分（一般に「ステム」と呼ばれる）を含有し、ここで重複部分は、同じヘアピン構造の相補的配列にハイブリダイズするヌクレオチドの配列を含有する。ヘアピン構造の特定の実施形態において、架橋構造は、２つの別個のオリゴヌクレオチド鎖を連結する；前記架橋構造は、２～２０ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位、例えば３～１５ＰＥＧ単位、例えば６～１２ＰＥＧ単位のＰＥＧポリマーから構成されてもよい。ヘアピン構造の特定の実施形態において、架橋構造は、最大３０個の炭素のアルカン鎖、または最大２０単位のポリグリシン鎖で構成されてもよいし、反応性官能基を有する他の何らかの鎖で構成されてもよい。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドは、２～約２１個のコーディング領域、例えば３～１０個のコーディング領域、例えば３～５個のコーディング領域が挙げられる少なくとも２つのコーディング領域を含有する。特定の実施形態において、コーディング領域の数が２を下回るならば、コーディング領域の組合せは存在し得ないであろう。特定の実施形態において、コーディング領域の数が２０を超えるならば、合成の非効率性が、正確な合成に干渉する虞がある。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、少なくとも２つのコーディング領域の約５０％～１００％が、約６～約５０ヌクレオチド、例えば約１２～約４０ヌクレオチド、例えば約８～約３０ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態において、コーディング領域が約６ヌクレオチド未満しか含有しなければ、コーディング領域は、コード化部分の合成を正確に指示することができない。特定の実施形態において、コーディング領域が約５０ヌクレオチド超を含有するならば、コーディング領域は交差反応性になる虞がある。そのような交差反応性は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子のコード化部分を合成するのに使用される合成工程を正確に指示かつ識別するコーディング領域の能力に干渉するであろう。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドの目的が、相補的なアンチコーディング鎖（ａｎｔｉ－ｃｏｄｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）に選択的にハイブリダイズすることによって、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の分子の少なくとも１つのコード化部分の合成を指示することである。特定の実施形態において、コーディング領域は、相補鎖とのハイブリダイゼーションを容易にするような一本鎖である。特定の実施形態において、コーディング領域の７０％～１００％、例えば８０％～９９％、例えば８０～９５％が一本鎖である。コーディング領域に対する相補鎖は、存在する場合、合成中に式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子のコード化部分をコード化する工程の後に加えられ得ることが理解される。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドを含有してもよい。適切なヌクレオチドとして、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）が挙げられるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の天然のヌクレオチド、ならびにアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）が挙げられるＲＮＡ（リボ核酸）の天然のヌクレオチドが挙げられる。他の適切な塩基として、天然の塩基、例えば、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、イノシン、ジアミノプリン；塩基類似体、例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－メチルシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、４－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）アミノ）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン、４－アミノ－５－（ヘプタ－１，５－ジイン－１－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン、６－メチル－３，７－ジヒドロ－２Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン、３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン、および２－チオシチジン；修飾ヌクレオチド、例えば２’－置換ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル化塩基および２’－フルオロ塩基；修飾された糖、例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース；ならびに／または修飾リン酸基、例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのポリマーであると理解される。用語「ポリマー」および「オリゴマー」は、本明細書中で互換的に使用される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、連続する塩基を含有する必要はない。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドに、リンカー部分または非ヌクレオチド分子を散在させてもよい。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、Ｇ中のオリゴヌクレオチドは、約６０％～１００％、例えば約８０％～９９％、例えば約８０％～９５％のＤＮＡヌクレオチドを含有する。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約６０％～１００％、例えば約８０％～９９％、例えば約８０％～９５％のＲＮＡヌクレオチドを含有する。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、重複するコーディング領域が、約３０％～１％、例えば約２０％～１％、例えば約１０％～２％の同じヌクレオチドのみを共有するという条件では、コーディング領域のうちの少なくとも２つは、同一の広がりを有するように重複する。式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドは、約４０％～１００％、例えば約６０％～１００％、例えば約８０％～１００％一本鎖である。式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、コーディング領域の少なくとも２つは隣接している。式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、少なくとも２つのコーディング領域は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の分子のコード化部分の合成を指示も記録もしないヌクレオチドの領域によって分離されている。
用語「非コーディング領域」は、存在する場合、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子のコード化部分の合成を指示するヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズすることができないか、または合成中に式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子を選別するために使用されるあらゆるアンチコーディングオリゴヌクレオチドに対応しないオリゴヌクレオチドの領域を指す。特定の実施形態において、非コーディング領域は、必要に応じて存在する。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１～約２０個の非コーディング領域、例えば２～約９個の非コーディング領域、例えば２～約４個の非コーディング領域を含有する。特定の実施形態において、非コーディング領域は、約４～約５０ヌクレオチド、例えば約１２～約４０ヌクレオチド、例えば約８～約３０ヌクレオチドを含有する。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、非コーディング領域の一目的が、コーディング領域を分離して、クロスハイブリダイゼーションを回避または低減することである。なぜなら、クロスハイブリダイゼーションは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の分子のコード化部分の正確なコーディングに干渉することとなるからである。特定の実施形態において、非コーディング領域の一目的が、分子式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）に、ハイブリダイゼーションまたはコーディングだけではない機能を加えることである。特定の実施形態において、非コーディング領域のうちの１またはそれより多くは、標識、例えば蛍光標識または放射性標識で修飾されているオリゴヌクレオチドの領域であってもよい。そのような標識は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の分子の可視化または定量化を容易にすることができる。特定の実施形態において、非コーディング領域のうちの１またはそれより多くは、加工を容易にする官能基またはテザーで修飾されている。特定の実施形態において、非コーディング領域のうちの１またはそれより多くが二本鎖であり、これによりクロスハイブリダイゼーションが低減される。特定の実施形態において、非コーディング領域は、必要に応じて存在することが理解される。特定の実施形態において、適切な非コーディング領域は、オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅に干渉しない。
特定の実施形態において、コーディング領域のうちの１またはそれより多くは、標識、例えば蛍光標識または放射性標識で修飾されている、ＧまたはＧ’中のオリゴヌクレオチドの領域であり得る。そのような標識は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の分子の可視化または定量化を容易にすることができる。特定の実施形態において、コーディング領域のうちの１またはそれより多くは、加工を容易にする官能基またはテザーで修飾されている。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、ＧまたはＧ’は、式（ＣＮ－（ＺＮ－ＣＮ＋１）Ａ）または（ＺＮ－（ＣＮ－ＺＮ＋１）Ａ）によって表される配列を含み、式中、Ｃはコーディング領域であり、Ｚは非コーディング領域であり、Ｎは１～２０の整数であり、Ａは１～２０の整数である；各非コーディング領域は、０～５０ヌクレオチドを含有し、必要に応じて二本鎖である。式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、コーディング領域の各々または大部分は、６～５０ヌクレオチドを含有する。式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、コーディング領域の各々または大部分は、８～３０ヌクレオチドを含有する。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、位置Ｍにおける位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける位置構築ブロックＢ２の約１０％～１００％、例えば約２０％～１００％、例えば約３０％～１００％、例えば約５０％～１００％、例えば約７０％～１００％、例えば約９０％～１００％は、２、３、４、または５個のコーディング領域の組合せと相関する。逆に、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、位置Ｍにおける位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける位置構築ブロックＢ２の０～約９０％、例えば０～約１０％、例えば０～約２０％、例えば０～約３０％、例えば０～約５０％、例えば０～約７０％は、単一のコーディング領域と相関するか、またはそれによって識別される。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、Ｂは、位置構築ブロックを表す。本開示で使用される語句「構築ブロック」または「位置構築ブロック」は、より大きな分子構造を形成するサブユニットとして一緒に結合した一連の個々の構築ブロック単位中の１単位を意味する。特定の実施形態において、（Ｂ１）Ｍおよび（Ｂ２）Ｋは、それぞれ独立して、Ｍ個およびＫ個の単位をそれぞれ有するポリマー鎖を形成するように一緒に結合した一連の個々の構築ブロックを表す。例えば、Ｍが１０である場合、（Ｂ）１０は、構築ブロック単位の鎖：Ｂ１０－Ｂ９－Ｂ８－Ｂ７－Ｂ６－Ｂ５－Ｂ４－Ｂ３－Ｂ２－Ｂ１を指す。例えば、Ｍが３であり、かつＫが２である場合、式（Ｉ）は、以下の式によって正確に表すことができる：
［（（Ｂ１）３－（Ｂ１）２－（Ｂ１）１－Ｌ１］Ｏ－Ｇ－［（Ｌ２－（Ｂ２）１－（Ｂ２）２］Ｐ。
ＭおよびＫはそれぞれ独立して、Ｂの個々の単位毎の位置識別子として機能すること、そしてＢ１またはＢ２の「１」または「２」は、どの鎖が言及されているかを区別する機能を果たすに過ぎないことが理解される。
本開示における用語「構築ブロック」の正確な定義は、その文脈に依存する。「構築ブロック」は、他の化学構造単位に化学的に連結され得る化学構造単位である。特定の実施形態において、構築ブロックは、１つ、２つ、またはそれを超える反応性化学基を有し、これにより構築ブロックは、構築ブロックが他の化学構造単位に連結する化学反応を受けることができる。化学結合を形成する反応を構築ブロックが受ける場合、構築ブロックの反応性化学基の一部または全てが失われ得ることが理解される。例えば、溶液中の構築ブロックは、２つの反応性化学基を有し得る。この例では、溶液中の構築ブロックは、構築ブロックの鎖の一部である構築ブロックの反応性化学基と反応して、鎖の長さを増大させるか、または鎖から分枝を延長させることができる。構築ブロックが溶液の文脈において、または反応物質として言及される場合、構築ブロックは、少なくとも１つの反応性化学基を含有すると理解されることとなるが、２またはそれを超える反応性化学基を含有してもよい。構築ブロックが、構築ブロックよりもそれ自体で大きいポリマー、オリゴマー、または分子の文脈において言及される場合、構築ブロックは、化学反応性基のうちの１つまたはそれより多くが反応したこととなるとしても、構築ブロックの構造を、より大きい分子の（モノマー）単位として有することが理解されるであろう。
構築ブロックとして使用することができる分子または化合物の種類は、一般に、ある構築ブロックが別の構築ブロックと反応して共有結合を形成することができる限り、限定されない。特定の実施形態において、構築ブロックは、末端単位として機能する１つの化学反応性基を有する。特定の実施形態において、構築ブロックは、１、２、３、４、５、または６個の適切な反応性化学基を有する。特定の実施形態において、Ｂの位置構築ブロックは、それぞれ独立して、１、２、３、４、５、または６個の適切な反応性化学基を有する。構築ブロックに適した反応性化学基として、第一級アミン、第二級アミン、カルボン酸、チオ酸、第一級アルコール、第二級アルコール、エステル、チオール、イソシアナート、イソチオシアナート、クロロホルマート、スルホニルクロリド、スルホニルフルオリド、チオノカルボナート、ハロゲン化ヘテロアリール、アルデヒド、ケトン、ハロアセタート、ハロゲン化アリール、アジド、ハロゲン化物、トリフラート、ジエン、ジエノフィル、ボロン酸、ボロン酸エステル、アルファ－ベータ不飽和ケトン、シアノ－アクリルアミド、マレイミド、アルキン、およびアルケンが挙げられる。
カップリング化学がオリゴヌクレオチドの存在と適合する場合に限り、あらゆるカップリング化学を使用して構築ブロックを連結することができる。例示的なカップリング化学として、ＤＮＡ連結アミン等のアミンの、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸または他の様々に置換されたカルボン酸との反応によるアミドの形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、イソシアナートおよび別のアミンとの反応（尿素化）による尿素の形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、クロロホルマート（カルバモイル化）およびアルコールとの反応によるカルバマートの形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、スルホニルクロリドとの反応によるスルホンアミドの形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、チオノカルボナートおよび別のアミンとの反応（チオ尿素化）によるチオ尿素の形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、ハロゲン化ヘテロアリール（ＳＮＡｒ）との反応によるアニリンの形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、アルデヒドとの反応に続く還元（還元的アミノ化）による二級アミンの形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、クロロアセタートによるアシル化に続く、別のアミンによる塩化物置換（ＳＮ２反応）によるペプトイドの形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、ハロゲン化アリールで置換されたカルボン酸によるアシル化に続く、ハロゲン化物の、置換アルキンによる置換（薗頭反応）によるアルキン含有化合物の形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、ハロゲン化アリールで置換されたカルボン酸によるアシル化に続く、ハロゲン化物の、置換ボロン酸による置換（鈴木反応）によるビアリール化合物の形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、シアヌル酸クロリドとの反応に続く、別のアミン、フェノール、またはチオールとの反応（シアヌル化（ｃｙａｎｕｒｙｌａｔｉｏｎ）、芳香族置換）による置換トリアジンの形成；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、ハロゲン化物またはトリフラート等の適切な脱離基で置換されたカルボン酸によるアシル化に続く、脱離基の、別のアミンによる置換（ＳＮ２／ＳＮ１反応）による第二級アミンの形成；ならびにアミンをアルケンまたはアルキンを有する化合物で置換して、生成物をアジドまたはアルケンと反応させる（ディールス・アルダー反応およびヒュスゲン反応）ことによる環状化合物の形成が挙げられる。反応の特定の実施形態において、第一級アミン、第二級アミン、カルボン酸、第一級アルコール、エステル、チオール、イソシアナート、クロロホルマート、スルホニルクロリド、チオノカルボナート、ハロゲン化ヘテロアリール、アルデヒド、クロロアセタート、ハロゲン化アリール、アルケン、ハロゲン化物、ボロン酸、アルキン、およびアルケンが挙げられる、アミン基と反応する分子は、約３０～約５００ダルトンの分子量を有する。
カップリング反応の特定の実施形態において、上記化学のいずれかを使用して、ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンを、アミン、チオール、ハロゲン化物、ボロン酸、アルキン、またはアルケン等の二次反応基を有する分子で置換することによって、第１の構築ブロックを加えてもよい。次いで、二次反応性基を、適切な反応性基を有する構築ブロックと反応させてもよい。例示的な二次反応性基カップリング化学として、ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、Ｆｍｏｃアミノ酸によるアシル化に続く、保護基の除去、および新たに脱保護されたアミンの、アルデヒドおよび水素化ホウ素による還元的アミノ化；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、アルデヒドもしくはケトン、および水素化ホウ素による還元的アミノ化に続く、たった今置換されたアミンの、シアヌル酸クロリドとの反応に続く、トリアジン由来の別の塩化物の、チオール、フェノール、もしくは別のアミンによる置換；ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、ハロゲン化ヘテロアリールによって置換されたカルボン酸によるアシル化に続く、別のアミンもしくはチオールとのＳＮＡｒ反応による、ハロゲン化物の置換、およびアニリンもしくはチオエーテルの形成；ならびに薗頭反応における、ＤＮＡ連結アミンが挙げられるアミンの、ハロ芳香族基によって置換されたカルボン酸によるアシル化に続く、ハロゲン化物の、アルキンによる置換；またはボロン酸エステルを介した鈴木反応における、ハロゲン化物の、アリール基による置換が挙げられる。
特定の実施形態において、カップリング化学は、当該分野において知られている適切な結合形成反応に基づく。例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９２），Ｃｈａｐｔｅｒｓ １０ ｔｏ １６；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ｐｌｅｎｕｍ（１９９０），Ｃｈａｐｔｅｒｓ １－１１；およびＣｏｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７），Ｃｈａｐｔｅｒｓ １３ ｔｏ ２０参照；これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、構築ブロックは、構築ブロックを付着させるために使用される反応基に加えて、１またはそれを超える官能基を含んでもよい。当該追加の官能基のうちの１つまたはそれより多くを保護して、これらの官能基の所望されない反応を防ぐことができる。適切な保護基が、種々の官能基について、当該技術において知られている（Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。特に有用な保護基として、ｔ－ブチルエステルおよびエーテル、アセタール、トリチルエーテルおよびアミン、アセチルエステル、トリメチルシリルエーテル、トリクロロエチルエーテルおよびエステル、ならびにカルバマートが挙げられる。
構築ブロックの種類は、一般に、構築ブロックが他の構築ブロックと共有結合を形成することができる１またはそれを超える反応性基と適合性である限り、限定されない。適切な構築ブロックとして、以下に限定されないが、ペプチド、糖類、糖脂質、脂質、プロテオグリカン、糖ペプチド、スルホンアミド、核タンパク質、尿素、カルバマート、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド、アミド、ビニローグスルホンアミドペプチド、エステル、糖類、カルボナート、ペプチジルホスホナート、アザチド、ペプトイド（オリゴＮ－置換グリシン）、エーテル、エトキシホルムアセタールオリゴマー、チオエーテル、エチレン、エチレングリコール、ジスルフィド、アリーレンスルフィド、ヌクレオチド、モルホリノ、イミン、ピロリノン、エチレンイミン、アセタート、スチレン、アセチレン、ビニル、リン脂質、シロキサン、イソシアニド、イソシアナート、およびメタクリラートが挙げられる。特定の実施形態において、式（Ｉ）の（Ｂ１）Ｍまたは（Ｂ２）Ｋは、それぞれ独立して、ポリペプチド、多糖、ポリ糖脂質、ポリ脂質、ポリプロテオグリカン、ポリグリコペプチド、ポリスルホンアミド、ポリヌクレオタンパク質、ポリ尿素、ポリカルバマート、ポリビニローグポリペプチド、ポリアミド、ポリビニローグスルホンアミドペプチド、ポリエステル、多糖、ポリカルボナート、ポリペプチジルホスホナート、ポリアザチド、ポリペプトイド（オリゴＮ－置換グリシン）、ポリエーテル、ポリチオホルムアセタール（ｐｏｌｙｔｈｏｘｙｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）オリゴマー、ポリチオエーテル、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリジスルフィド、ポリアリーレンスルフィド、ポリヌクレオチド、ポリモルホリノ、ポリイミン、ポリピロリノン、ポリエチレンイミン、ポリアセタート、ポリスチレン、ポリアセチレン、ポリビニル、ポリリン脂質、ポリシロキサン、ポリイソシアニド、ポリイソシアナート、およびポリメタクリラートが挙げられる、Ｍ個の単位またはＫ個の単位をそれぞれ有する構築ブロックのポリマーを表す。式（Ｉ）の分子の特定の実施形態において、構築ブロックの約５０％～約１００％、例えば約６０％～約９５％、例えば約７０％～約９０％は、約３０～約５００ダルトン、例えば約４０～約３５０ダルトン、例えば約５０～約２００ダルトンの分子量を有する。
２つの反応性基を有する構築ブロックは、各構築ブロックを単位として含有する直鎖状オリゴマーもしくはポリマー構造、または直鎖状非ポリマー分子を形成するであろうと理解される。また、３またはそれを超える反応性基を有する構築ブロックは、３またはそれを超える反応性基を有する各構築ブロックにて分枝を有する分子を形成し得ることが理解される。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、Ｌ、Ｌ１、およびＬ２は、それぞれ独立して、リンカーを表す。用語「リンカー分子」は、反応してリンカーを形成することができる２またはそれを超える反応性基を有する分子を指す。用語「リンカー」は、Ｇ、またはＧ’のヘアピン構造を構築ブロックに作動可能に連結または共有結合する分子の一部を指す。用語「作動可能に連結された」は、ＰＣＲ増幅が挙げられる、オリゴヌクレオチドコード化分子が受けると予想される種々の操作の全体を通じて付着されたままであるように、２またはそれを超える化学構造が一緒に付着または共有結合されていることを意味する。
式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、Ｌ１は、Ｂ１をＧまたはＧ’にそれぞれ作動可能に連結するリンカーである。式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、Ｌ２は、Ｂ２をＧまたはＧ’にそれぞれ作動可能に連結するリンカーである。特定の実施形態において、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、特定の順序なく、Ｌ１の反応性官能基の一方を、Ｂ１の反応性基に反応させ、かつＬ１の他方の反応性官能基をＧの反応性官能基、もしくはＧ’のヘアピンに反応させることによって、または特定の順序なく、Ｌ２の反応性官能基の一方を、Ｂ２の反応性基に反応させ、かつＬ２の他方の反応性官能基を、Ｇの反応性官能基、もしくはＧ’のヘアピンに反応させることによって、Ｂ１をＧまたはＧ’に連結する二官能性分子である。Ｇ’のヘアピンの分子の特定の実施形態において、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、Ｂ１およびＧまたはＢ２およびＧの化学反応性基の、ＰＥＧ（例えば、アジド－ＰＥＧ－ＮＨＳ、またはアジド－ＰＥＧ－アミン、またはジアジド－ＰＥＧ）、またはアルカン酸鎖部分（例えば、５－アジドペンタン酸、（Ｓ）－２－（アジドメチル）－１－Ｂｏｃ－ピロリジン、４－アジドアニリン、または４－アジド－ブタン－１－酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）が挙げられる市販のリンカー分子との反応から形成されるリンカー；チオール反応性リンカー、例えば、ＰＥＧ（例えば、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ ＮＨＳ－ＰＥＧ－マレイミド）、アルカン鎖（例えば、３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）－プロピオン酸－Ｏｓｕまたはスルホスクシンイミジル６－（３’－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノアート））であるもの；オリゴヌクレオチド合成用のアミダイト、例えば、アミノ修飾剤（例えば、６－（トリフルオロアセチルアミノ）－ヘキシル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホルアミダイト）、チオール修飾剤（例えば、５－トリチル－６－メルカプトヘキシル）－１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、または化学的に共反応性のペア修飾剤（例えば、６－ヘキシン－１－イル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホルアミダイト、３－ジメトキシトリチルオキシ－２－（３－（３－プロパルギルオキシプロパンアミド）プロパンアミド）プロピル－１－Ｏ－スクシノイル、長鎖アルキルアミノＣＰＧ、または４－アジド－ブタン－１－酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル））；ならびにそれらの互換性のある組合せである。
式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、Ｇ’のヘアピンを、Ｈ１またはＨ２と示す場合があり、各ヘアピンは独立して、約２０～約９０ヌクレオチド、例えば約３２～約８０ヌクレオチド、例えば約４５～約８０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｈ１およびＨ２は、それぞれ独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の、例えば１～５、例えば２～４、例えば２～３個の、リンカー分子との、または、必要に応じて、構築ブロックとの反応を促進するための適切な官能基で修飾されたヌクレオチドを含有し、以下に限定されないが、Ｈ１およびＨ２が、それぞれ独立して、５’－ジメトキシトリチル－５－エチニル－２’－デオキシウリジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（５－エチニル－ｄＵ－ＣＥホスホルアミダイトとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから購入））等の塩基を使用して合成されている場合が挙げられる。特定の実施形態において、Ｈ１およびＨ２は、それぞれ独立して、以下に限定されないが、３－ジメトキシトリチルオキシ－２－（３－（５－ヘキシンアミド）プロパンアミド）プロピル－１－Ｏ－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（アルキン－修飾剤セリノールホスホルアミダイトとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ製））および無塩基アルキンＣＥＰ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）が挙げられる、リンカー分子との、または、必要に応じて、構築ブロックとの反応を促進するのに適した官能基を有する非ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｈ１およびＨ２は、それぞれ独立して、既にリンカーを有する修飾塩基を有するヌクレオチドを含み、例えば、Ｈ１およびＨ２は、それぞれ独立して、以下に限定されないが、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－Ｎ８－［６－（トリフルオロアセチルアミノ）－ヘキサ－１－イル］－８－アミノ－２’－デオキシアデノシン－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（アミノ修飾剤Ｃ６ ｄＡとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから購入））、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－［６－（トリフルオロアセチルアミノ）－ヘキサ－１－イル］－２’－デオキシグアノシン－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（アミノ修飾剤Ｃ６ ｄＧとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから購入））、５’－ジメトキシトリチル－５－［３－メチル－アクリレート］－２’－デオキシウリジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（Ｃａｒｂｏｘｙ ｄＴとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから購入））、５’－ジメトキシトリチル－５－［Ｎ－（（９－フルオレニルメトキシカルボニル）－アミノヘキシル）－３－アクリルイミド］－２’－デオキシウリジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（Ｆｍｏｃ－アミノ修飾剤Ｃ６ ｄＴとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ））、５’－ジメトキシトリチル－５－（オクタ－１，７－ジイニル）－２’－デオキシウリジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（Ｃ８アルキンｄＴとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ））、５’－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－［Ｎ－（６－（３－ベンゾイルチオプロパノイル）－アミノヘキシル）－３－アクリルアミド］－２’デオキシウリジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（Ｓ－Ｂｚ－チオール修飾剤Ｃ６－ｄＴとも呼ばれる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ））、および５－カルボキシｄＣ ＣＥＰ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）、Ｎ４－ＴｒｉＧｌ－アミノ２’デオキシシチジン（ＩＢＡ ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）等の塩基を使用して合成することができる。Ｈ１およびＨ２において修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドに適した官能基として、以下に限定されないが、第一級アミン、第二級アミン、カルボン酸、第一級アルコール、エステル、チオール、イソシアナート、クロロホルマート、スルホニルクロリド、チオノカルボナート、ハロゲン化ヘテロアリール、アルデヒド、クロロアセタート、ハロゲン化アリール、ハロゲン化物、ボロン酸、アルキン、アジド、およびアルケンが挙げられる。
特定の実施形態において、ヘアピン構造Ｈ１およびＨ２のうちの１つまたはそれより多くは、蛍光標識または放射性標識等の標識で修飾されていてもよい。そのような標識は、式（ＩＩＩ）の分子の可視化または定量化を容易にすることができる。特定の実施形態において、ヘアピン構造Ｈ１およびＨ２のうちの１つまたはそれより多くは、加工を容易にする官能基またはテザーで修飾されている。
式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、Ｈ１およびＨ２のヘアピン構造の利点は、一方または双方が、式（ＩＩＩ）の分子の一方または双方の端部での複数のコード化部分の多重ディスプレイ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｌａｙ）を可能にし得ることである。理論により拘束されることを望むものではないが、本開示のオリゴヌクレオチドコード化分子の一方または双方の端部での複数のコード化部分の多重ディスプレイは、特定の条件下での選択特性の向上を提供すると考えられる。例えば、コード化化合物の多価ディスプレイは、結合力効果（ａｖｉｄｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔ）によって見かけの親和性を増大させることができる。
式（ＩＩＩ）の式（ＩＩ）の分子の特定の実施形態において、位置Ｍにおける位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける位置構築ブロックＢ２の約１０％～１００％、例えば約２０％～１００％、例えば約３０％～１００％、例えば約５０％～１００％、例えば約７０％～１００％、例えば約９０％～１００％は、２、３、４、または５個のコーディング領域の組合せと相関する。逆に、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の分子の特定の実施形態において、位置Ｍにおける位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける位置構築ブロックＢ２の０～約９０％、例えば０～約１０％、例えば０～約２０％、例えば０～約３０％、例えば０～約５０％、例えば０～約７０％は、単一のコーディング領域と相関するか、またはそれによって識別される。
本開示は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子が挙げられるオリゴヌクレオチドコード化分子を合成する方法に関する。式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子を合成する方法の特定の実施形態において、本方法は、一連の「選別および反応」工程を使用し、ここで、コーディング領域の異なる組合せを含有するオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物が、ハイブリダイゼーションアレイ上に固定化されたアンチコーディングオリゴマーとのオリゴヌクレオチドコード化分子の１またはそれを超えるコーディング領域の選択的ハイブリダイゼーションによってサブプールに選別される。本方法の特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドコード化分子をサブプールに選別する利点は、この分離が、オリゴヌクレオチドコード化分子のサブプールを更なる化学加工のために組み合わせるか混合する前に、別々の反応条件下で、各サブプールを、Ｂ１および／またはＢ２を含む位置構築ブロックＢと反応させることを可能にすることである。本方法の特定の実施形態において、選別および反応プロセスを繰り返して、一連の位置構築ブロックを加えることができる。本方法の特定の実施形態において、選別および反応方法を使用して構築ブロックを加える利点は、分子のコード化部分の各位置構築ブロックの正体が、構築ブロックの付加前にオリゴヌクレオチドコード化分子を選択的に分離または選別するために使用した１、２、３、４、または５個のコーディング領域に相関し得ることである。
特定の実施形態において、１またはそれを超える構築ブロックは、単一の選別工程を使用してオリゴヌクレオチドコード化分子をサブプールに分離して、オリゴヌクレオチドコード化分子を構築ブロックと反応させてから再混合することによって、加えてもよい。そのような実施形態において、合成中にオリゴヌクレオチドコード化分子を選別するのに使用される一コーディング領域は、その位置に従って構築ブロックを一意的に識別するか、または相関させるであろう。なぜなら、使用されるコーディング領域の正体は、加えられる位置構築ブロックの正体を含むであろう構築ブロックを加えるのに使用される反応の正体に相関し得るからである。
特定の実施形態において、１またはそれを超える構築ブロックは、２、３、４、または５つの選別工程、オリゴヌクレオチドコード化分子の、構築ブロックとの反応、およびその後の再混合によって、加えてもよい。そのような実施形態において、合成中にオリゴヌクレオチドコード化分子を選別するのに使用される組合せまたは一連のコーディング領域は、その位置に従って構築ブロックを一意的に識別するか、または相関させるであろう。なぜなら、使用される組合せまたは一連のコーディング領域は、加えられる位置構築ブロックの正体または構造を含むであろう構築ブロックを加えるのに使用される反応の正体に相関し得るからである。
特定の実施形態において、合成方法は、独立して、所望通り、単一の選別工程（単項式（ｍｏｎｏｎｏｍｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））または一連の選別工程（多項式（ｍｕｌｔｉｎｏｍｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））から切り替えられてもよい。本方法の特定の実施形態において、位置Ｍにおける位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける位置構築ブロックＢ２の約１０％～１００％、例えば約２０％～１００％、例えば約３０％～１００％、例えば約５０％～１００％、例えば約７０％～１００％、例えば約９０％～１００％は、一連の２、３、４、または５つの選別工程によって加えられる。一連の選別工程を使用して、追加された位置構築ブロックの量が１０％未満であれば、より低コストかつより効率的な合成の利点は、認識されない。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子は、プール中の分子間で同一である１またはそれを超えるコーディング領域を含み得ることが理解されるが、プール中の分子の全てではないにしても大部分は、コーディング領域の異なる組合せを有するであろうことも理解される。本方法の特定の実施形態において、コーディング領域の異なる組合せを有する分子のプールの利点は、異なる組合せが、多数の異なるコード化部分を有するオリゴヌクレオチドコード化分子をコードし得ることである。
特定の実施形態において、合成方法は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションアレイを提供することを含む。ハイブリダイゼーションアレイを提供する工程は、一般に限定されず、当該分野において知られている技術を使用してハイブリダイゼーションアレイを製造すること、またはハイブリダイゼーションアレイを商業的に購入することを含む。本方法の特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションアレイは、表面上に固定化されたアンチコドンオリゴマーを有する少なくとも２つの別個の領域の基材を含む。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションアレイの各領域は、様々な固定化アンチコドンオリゴマーを含有し、アンチコドンオリゴマーは、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を含む式（Ｉ）の分子の１またはそれを超えるコーディング領域とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド配列である。本方法の特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションアレイは、２またはそれを超えるチャンバを使用する。本方法の特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションアレイのチャンバは、粒子の表面上に固定化されたアンチコドンオリゴマーを有するビーズ等の粒子を含有する。本方法の特定の実施形態において、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を含む式（Ｉ）の分子をアレイ上に固定化する利点は、この工程が、１またはそれを超えるコーディング領域の特定のオリゴヌクレオチド配列に基づいて、分子を分子のサブプールに選別または選択的に分離することを可能にすることである。特定の実施形態において、分子の分離されたサブプールを、その後、更なるハイブリダイゼーション工程または化学反応加工のために、アレイから反応チャンバ中に別々に放出するか、または取り外してもよい。特定の実施形態において、放出する工程は、必要に応じて存在し、一般に限定されず、加熱すること、変性剤を使用すること、または分子をｐＨ≧１２の緩衝液に曝露することによって、分子を脱ハイブリダイズさせることを含んでもよい。特定の実施形態において、様々な固定化オリゴヌクレオチドを含有するアレイのチャンバまたは領域は、各チャンバまたは領域の内容物が、更なる化学加工のためにウェルのアレイ中に流入することを可能にするように配置されていてもよい。
特定の実施形態において、本方法は、Ｂ１および／またはＢ２を含む少なくとも１つの構築ブロックＢを、オリゴヌクレオチドコード化分子と反応させて、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の分子のサブプールを形成することを含み、式中、Ｂ１および／またはＢ２は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）について先で定義される通りである。特定の実施形態において、構築ブロックＢ１および／またはＢ２は、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の分子の前、間、または後に、容器に加えることができる。容器は、構築ブロックＢ１および／またはＢ２をオリゴヌクレオチドコード化分子と反応かつ共有結合させて、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の分子を形成するのに使用される化学に応じて、酸性、塩基性、または中性の条件下で溶媒および共反応物を含有してもよいことが理解される。
本方法の特定の実施形態において、増幅工程は、当該分野において知られているＰＣＲ技術を使用して、それぞれ式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）のＧまたはＧ’内のオリゴヌクレオチドのコピー配列を生じさせることを含む。本方法の特定の実施形態において、コピー配列は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の少なくとも２つのコーディング領域のコピーを含有する。特定の実施形態において、少なくとも１つのプローブ分子からＧまたはＧ’内のオリゴヌクレオチドを増幅する一利点として、オリゴヌクレオチドコード化分子を標的分子から容易に取り外すことができないにしても、オリゴヌクレオチドコード化分子のどのコード化部分が標的分子に結合することができるかを検出する能力が挙げられる。特定の実施形態において、増幅の利点は、膨大な多様性を有する分子のライブラリを生成することを可能にすることである。この膨大な多様性は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）のあらゆる所与の分子の数が少ないという代償を払う。ＰＣＲによって増幅することで、容易に検出可能な数に達するまで数を増大させることによって、非常に少数で存在するオリゴヌクレオチド配列の識別が可能となる。次いで、ＤＮＡ配列決定およびコピー配列の分析により、標的に結合することができた式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）のオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分を識別することもできるし、これに相関させることもできる。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）の分子のライブラリ、またはその認識可能な変形物の合成および分析は、国際公開第２０１７／２１８２９３号、国際公開第２０１８／２０４４２０号、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５２４９４号明細書（出願時に公開されていない）に以前に開示されており、これらの出願はそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
例示的な実施形態
実施形態１．少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子についての標的活性データを収集する方法であって：
分離媒体を提供する工程であって、分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する、工程と；
少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、分離媒体に導入する工程であって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と；
少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と；
分離媒体由来の少なくとも２つの別個の位置の少なくとも１つの位置をセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と；
少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ＰＣＲの実行を可能にする工程と；
少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分に対してＰＣＲを実行することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅する工程と；
少なくとも１つの位置を、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分の正体と相関させることによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集する工程と
を含む、方法。
実施形態２．少なくとも１つの標的分子は、細胞、オリゴヌクレオチド、タンパク質、酵素、リボソーム、およびナノディスクの少なくとも１つを含む、実施形態１または３～１５のいずれかの方法。
実施形態３．分離媒体は、粒子、ポリマー、および分離表面の少なくとも１つを含有し、少なくとも１つの標的分子は、分離媒体、粒子、ポリマー、および分離表面の少なくとも１つに連結されている、実施形態１～２または４～１５のいずれかの方法。
実施形態４．粒子は、ポリマー粒子または金属コロイドを含む、実施形態１～３または５～１５のいずれかの方法。
実施形態５．ポリマーは、少なくとも１つの標的分子の最低重量標的分子の１０％またはそれを超える分子量を有する、実施形態１～４または６～１５のいずれかの方法。
実施形態６．少なくとも１つの標的分子と、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分との間の少なくとも１つの標的活性に基づいて、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程をさらに含む、実施形態１～５または７～１５のいずれかの方法。
実施形態７．少なくとも１つの標的活性は、少なくとも１つの標的分子による少なくとも１つのオリゴヌクレオチドコード化分子のコード化部分の化学修飾を含む、実施形態１～６または８～１５のいずれかの方法。
実施形態８．オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、
少なくとも１つのコード化部分は、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有し、
少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックは、オリゴヌクレオチドの１～５個のコーディング領域によって識別され、
分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、実施形態１～７または９～１５のいずれかの方法。
実施形態９．少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（Ｉ）（Ｉ）Ｇ－Ｌ－Ｂ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂは、少なくとも２つの構築ブロックを含有するコード化部分であり；
Ｌは、ＧをＢに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｂ中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Ｇの１～５個のコーディング領域によって別々に識別される、実施形態１～８または１０～１５のいずれかの方法。
実施形態１０．少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩ）
（ＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは０または１であり；
Ｐは０または１であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが１であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇの１～５個のコーディング領域によって識別される、実施形態１～９または１１～１５のいずれかの方法。
実施形態１１．少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ’－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇ’はオリゴヌクレオチドを含み、Ｇ’は、少なくとも２つのコーディング領域および少なくとも１つのヘアピンを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは、ゼロ～５の整数であり；
Ｐは、ゼロ～５の整数であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが、１～５の整数であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇ’の１～５個のコーディング領域によって識別される、実施形態１～１０または１２～１５のいずれかの方法。
実施形態１２．第１の分離処理を分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程をさらに含み、
第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む、実施形態１～１１または１３～１５のいずれかの方法。
実施形態１３．分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、実施形態１～１２または１４～１５のいずれかの方法。
実施形態１４．第２の分離処理を分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することをさらに含み、第２の方向は、第１の方向に対して実質的に垂直であり、
第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む、実施形態１～１３または１５のいずれかの方法。
実施形態１５．分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、実施形態１～１４のいずれかの方法。
さらに例示的な実施形態
実施形態１Ａ
分離媒体を提供する工程であって、分離媒体は、少なくとも１つの標的分子および少なくとも１つのサンプル領域を含有する、工程と；
少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、分離媒体のサンプル領域に導入する工程であって、オリゴヌクレオチドコード化分子は、コード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と；
サンプルを電気泳動に供することによって、混合物の少なくとも一部を、分離媒体中の標的に接触させる工程と
を含む、方法。
実施形態２Ａ．コーディング部分は、少なくとも１つのコード化部分に連結されたオリゴヌクレオチドを含有し、
オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、
少なくとも１つのコード化部分は、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有し、
少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックは、１～５個のコーディング領域によって識別され；
分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、実施形態１Ａの方法。
実施形態３Ａ．少なくとも１つの標的分子は、細胞、オリゴヌクレオチド、タンパク質、酵素、リボソーム、およびナノディスクの少なくとも１つを含む、実施形態１Ａの方法。
実施形態４Ａ．少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（Ｉ）（Ｉ）Ｇ－Ｌ－Ｂ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂは、少なくとも２つの構築ブロックを含有するコード化部分であり；
Ｌは、ＧをＢに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｂ中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Ｇの１～５個のコーディング領域によって別々に識別される、実施形態１Ａの方法。
実施形態５Ａ．少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩ）
（ＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは０または１であり；
Ｐは０または１であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが１であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇの１～５個のコーディング領域によって識別される、実施形態１Ａの方法。
実施形態６Ａ．少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ’－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇ’はオリゴヌクレオチドを含み、Ｇ’は、少なくとも２つのコーディング領域および少なくとも１つのヘアピンを含み；
Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ１は、Ｂ１をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ２は、Ｂ２をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは、ゼロ～５の整数であり；
Ｐは、ゼロ～５の整数であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが、１～５の整数であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇ’の１～５個のコーディング領域によって識別される、実施形態１Ａの方法。
実施形態７Ａ．
分離媒体に第１の方向に電圧を印加することによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程をさらに含む、実施形態１Ａの方法。
実施形態８Ａ
分離媒体を、分離セグメントを形成するために第１の方向に対して実質的に垂直である第１の分ける方向に分けることによってオリゴヌクレオチドコード化分子の画分を単離する工程をさらに含む、実施形態１Ａの方法。
実施形態９Ａ
オリゴヌクレオチドコード化分子の画分を分離セグメントから取り出して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分を形成する工程と；
オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分からオリゴヌクレオチドを増幅して、コピー配列の画分を形成する工程と、
コピー配列の画分を配列決定して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分の各コーディング領域またはコーディング領域の組合せを識別して、少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックを識別する工程と
をさらに含む、実施形態８Ａの方法。
実施形態１０Ａ．
分離媒体に第２の方向に電圧を印加することによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程であって、第２の方向は、第１の方向に対して実質的に垂直である、工程をさらに含む、実施形態７Ａの方法。
実施形態１１Ａ
分離媒体を２つの方向に分けることによってオリゴヌクレオチドコード化分子の画分を単離する工程であって、２つの方向は、それぞれ独立して、矩形の分離セグメントを形成するように、第１および第２の方向に対して実質的に垂直である、工程をさらに含む、実施形態１０Ａの方法。
実施形態１２Ａ
オリゴヌクレオチドコード化分子の画分を分離セグメントから取り出して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分を形成する工程と；
オリゴヌクレオチドコード化分子の矩形の回収画分からオリゴヌクレオチドを増幅して、コピー配列の画分を形成する工程と、
コピー配列の画分を配列決定して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分の各コーディング領域またはコーディング領域の組合せを識別して、少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックを識別する工程と
をさらに含む、実施形態１１Ａの方法。
実施形態１３Ａ．分離媒体は、粒子およびポリマーの少なくとも１つを含有し、そして少なくとも１つの標的分子は、粒子およびポリマーの少なくとも１つに連結されている、実施形態１Ａの方法。
実施形態１４Ａ
電気泳動システムであって、
多孔質ゲルと；
多孔質ゲル内の少なくとも１つの標的分子と；
多孔質ゲル内の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子と
を含む分離媒体を含み、
オリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分に連結されたオリゴヌクレオチドを含有し、
オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、
少なくとも１つのコード化部分は、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有し、
各コード化部分の各位置構築ブロックは、２～５個のコーディング領域によって識別される、電気泳動システム。
実施形態１５Ａ．多孔質ゲルはさらに：
粒子およびポリマーの少なくとも１つを含み、少なくとも１つの標的分子は、粒子およびポリマーの少なくとも１つに連結されている、実施形態１４Ａの電気泳動システム。
コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実施するように、例えば、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図１２は、シングルコアプロセッサでもマルチコアプロセッサでも、並列処理用の複数のプロセッサでもあり得る中央処理装置（ＣＰＵ、また、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）１２０５を含むコンピュータシステム１２０１を示す。また、コンピュータシステム１２０１は、メモリまたはメモリ位置１２１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）と、電子記憶ユニット１２１５（例えば、ハードディスク）と、１またはそれを超える他のシステムと通信するための通信インターフェース１２２０（例えば、ネットワークアダプタ）と、周辺装置１２２５、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、および／または電子ディスプレイアダプタとを含む。メモリ１２１０、記憶ユニット１２１５、インターフェース１２２０、および周辺装置１２２５は、マザーボード等の通信バス（実線）を介してＣＰＵ１２０５と通信する。記憶ユニット１２１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）であってもよい。コンピュータシステム１２０１は、通信インターフェース１２２０の助力によって、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１２３０に動作可能に接続され得る。ネットワーク１２３０は、Ｉｎｔｅｒｎｅｔ、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはＩｎｔｅｒｎｅｔと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであってもよい。ネットワーク１２３０は、場合によっては、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１２３０は、クラウドコンピューティング等の分散コンピューティングを可能にし得る、１またはそれを超えるコンピュータサーバを含んでもよい。ネットワーク１２３０は、場合によっては、コンピュータシステム１２０１の助力によって、コンピュータシステム１２０１に接続されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実施することができる。
ＣＰＵ１２０５は、プログラムまたはソフトウェアで具現化することができる機械可読命令のシークエンスを実行することができる。命令は、メモリ１２１０等のメモリ位置内に記憶することができる。命令は、ＣＰＵ１２０５を対象とすることができ、これは、その後、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ１２０５をプログラムまたは他の方法で構成することができる。ＣＰＵ１２０５によって実行される動作の例として、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックが挙げられ得る。
ＣＰＵ１２０５は、集積回路等の回路の一部であってもよい。システム１２０１の１またはそれを超える他の構成要素を回路に含めてもよい。場合によっては、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
記憶ユニット１２１５は、ドライバ、ライブラリ、および保存されたプログラム等のファイルを記憶することができる。記憶ユニット１２１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザ選好およびユーザプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム１２０１は、場合によっては、イントラネットまたはＩｎｔｅｒｎｅｔを介してコンピュータシステム１２０１と通信しているリモートサーバ上に位置する等、コンピュータシステム１２０１の外部にある１またはそれを超える追加のデータ記憶ユニットを含んでもよい。
コンピュータシステム１２０１は、ネットワーク１２３０を介して１またはそれを超えるリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１２０１は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例として、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、ＡＰＰＬＥ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、ＳＡＭＳＵＮＧ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、ＡＰＰＬＥ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）対応デバイス、ＢＬＡＣＫＢＥＲＲＹ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザは、ネットワーク１２３０を介してコンピュータシステム１２０１にアクセスすることができる。
本明細書中に記載される方法は、例えばメモリ１２１０または電子記憶ユニット１２１５等のコンピュータシステム１２０１の電子記憶位置に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施されてもよい。機械実行可能コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供されてもよい。使用中、コードは、プロセッサ１２０５によって実行されてもよい。場合によっては、コードは、記憶ユニット１２１５から取り出されて、プロセッサ１２０５による容易なアクセスのためにメモリ１２１０に記憶されてもよい。一部の状況において、電子記憶ユニット１２１５が排除されてもよく、そして機械実行可能命令がメモリ１２１０に記憶される。
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械に使用するためにプリコンパイルされかつ構成してもよいし、ランタイム中にコンパイルしてもよい。コードは、プリコンパイルされた様式またはその場でコンパイルされた（ａｓ－ｃｏｍｐｉｌｅｄ）様式でコードを実行することを可能にするように選択することができるプログラミング言語で供給してもよい。
コンピュータシステム１２０１等の、本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで具現化することができる。本技術の種々の態様が、典型的には、ある種の機械可読媒体上に担持されるか、またはそれで具現化される機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連データの形態の、「製品」または「製造品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク等の電子記憶ユニットに記憶されてもよい。「記憶」タイプの媒体として、コンピュータ、プロセッサ等の有形メモリ、または種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等のその関連モジュールのいずれかまたは全てが挙げられ得、これらは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一過性記憶を提供することができる。ソフトウェアの全てまたは一部が、Ｉｎｔｅｒｎｅｔまたは種々の他の電気通信ネットワークを介して時々通信されてもよい。そのような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたはプロセッサへの、例えば管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。ゆえに、ソフトウェア要素を搭載し得る別のタイプの媒体として、ローカルデバイス間の物理インターフェース、有線および光の陸線ネットワーク、ならびに種々のエアリンクを介して使用されるような、光波、電波、および電磁波が挙げられる。有線リンクまたは無線リンク、光リンク等、そのような波を搬送する物理的要素もまた、ソフトウェアを搭載する媒体と考えることができる。非一過性の有形「記憶」媒体に制限されない限り、本明細書で使用される用語、例えばコンピュータまたは機械の「可読媒体」は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与するあらゆる媒体を指す。
それゆえに、コンピュータ実行可能コード等の機械可読媒体は、以下に限定されないが、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体が挙げられる多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体として、例えば、光ディスクまたは磁気ディスク、例えば、あらゆるコンピュータ内のあらゆる記憶装置が挙げられ、例えば、図面に示されるデータベース等を実施するのに使用され得る。揮発性記憶媒体として、動的メモリ、例えば、コンピュータプラットフォームのメインメモリが挙げられる。有形伝送媒体として、同軸ケーブル；銅ワイヤおよび光ファイバ（コンピュータシステム内にバスを構成するワイヤが挙げられる）が挙げられる。搬送波伝送媒体は、例えば、無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるような、電気信号もしくは電磁信号、または音波もしくは光波の形態をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態として、例えば：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他のあらゆる磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、他のあらゆる光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する他のあらゆる物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、他のあらゆるメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を運搬する搬送波、そのような搬送波を運搬するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読むことができる他のあらゆる媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１またはそれを超える命令の１またはそれを超えるシーケンスを、実行用のプロセッサに搬送することに関与し得る。
コンピュータシステム１２０１は、例えば、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）１２４０を含む電子ディスプレイ１２３５を含んでもよいし、これと通信してもよい。ＵＩの例として、限定されないが、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザインターフェースが挙げられる。
本開示の方法およびシステムは、１またはそれを超えるアルゴリズムによって実施することができる。アルゴリズムは、中央処理ユニット１２０５による実行時に、ソフトウェアによって実施することができる。アルゴリズムは、例えば、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集する方法を実施することができる。
本開示の種々の実施形態が、以下の実施例によって説明されるが、これらに限定されない。当業者であれば、本明細書に列挙された工程または工程の一部を達成するための多くの等価の技術を認識するであろう。
実施例１．ＤＮＡオリゴヌクレオチドに連結した合成化合物の調製。
活性化された酸を反応性遊離アミンにカップリングさせる反応により、化合物の大規模な収集物または個々の化合物を迅速かつ効率的に生じさせることを可能にすることは、ＤＮＡ修飾の当業者によって理解されるであろう。
実施例１Ａ．ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）樹脂上へのＤＮＡの固定化
反応性アミンハンドルに連結されたＤＮＡオリゴに化学修飾を行うために、先ずＤＮＡをＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）樹脂上に固定化する。３８４ウェルフィルタープレート（Ｅ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＥＫ－２２８８）内の各ウェルに、４０ｕＬの１：１ ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）：保存溶液を加えた。ウェルをプレート真空マニホールドで７０ｕＬの水で２回洗浄してから、７０ｕＬの結合緩衝液（蒸留水中１０ｍＭ ＡｃＯＨ）で２回洗浄した。プレートを遠心分離機で２０００ｒｐｍにて１分間スピンして、ウェルから全ての液体を乾燥させた。４０ｕＬの結合緩衝液および１０ｕＬの１００ｎｇ／ｕＬの適切なアミン連結ＤＮＡオリゴを各ウェルに加えて、ウェルを広口径チップ（Ｒａｉｎｉｎ）を用いて研和して、室温にて１０分間インキュベートした。プレートをレシーバプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ ＲＥＦ ７８１２０１）中に２０００ＲＰＭにて１分間スピンした。収集プレート内の溶離液を樹脂の上部に加えて、ウェルを研和して、室温にて５分間インキュベートした。プレートをレシーバプレート中に再びスピンして（２０００ＲＰＭ、１分間）、各溶離液ウェルをＤＮＡ濃度についてナノドロップによって分析して、捕捉効率を評価した。測定したＤＮＡ濃度が１ｎｇ／ｕＬを超えれば、溶離液を樹脂に３回目に加えて、もう５分間インキュベートして、スピンアウトおよび測定を繰り返した。測定したＤＮＡ濃度が１ｎｇ／ｕＬ未満であれば、ウェルを真空マニホールド（３×７０ｕＬの結合緩衝液、３×７０ｕＬの水、３×７０ｕＬのメタノール）で洗浄した。
実施例１Ｂ．活性化された酸の生成、一般的な手順、および反応性アミンに連結したＤＮＡオリゴへのカップリング。
酸部分を含有する化合物をＤＮＡオリゴマーの遊離アミンにカップリングさせるために、酸を以下の様式で活性化させる。各酸について、酸の分子量によって算出して、８０：２０ ＤＭＦ：ＭｅＯＨおよび濃度４００ｍＭの溶液を調製した。４０ｍＭ ＨｏＡＴ（５．５ｍｇ）の１ｍＬ溶液を、８０：２０ ＤＭＦ：ＭｅＯＨ中で調製した。使用直前に、１００ｍＭ ＥＤＣ＊ＨＣｌ ７．７ｍｇのストック溶液を、４００ｕＬのＭｅＯＨに溶解させた。活性化された酸を生成するために、１５ｕＬの所望の酸（４００ｍＭ）に、１５ｕＬのＨｏＡＴ（４０ｍＭ）に続いて３０ｕＬのＤＭＦ：ＭｅＯＨ ８０：２０を、そして最後に６０ｕＬのＥＤＣ＊ＨＣｌ溶液（１００ｍＭ）を加えて、混合物をＲＴにて５分間インキュベートした。
実施例１Ｃ．活性化された酸によるＤＮＡのアシル化、一般的な手順
活性化された酸溶液を、反応性アミンハンドルに連結されたＤＮＡオリゴにカップリングさせるために、フィルタープレート内の実施例１Ａ由来の固定化されたＤＮＡを、真空マニホールドで、７０ｕＬのＤＭＦ：ＭｅＯＨ ８０：２０中４００ｍＭ ＤＩＰＥＡで３回洗浄してから、７０ｕＬのＭｅＯＨで３回洗浄した。次いで、フィルタープレートをゴム栓上に置いて、ウェルが流出するのを防いだ。各ウェルに、実施例１Ｂで調製した７０ｕＬの所望の活性化された酸溶液を加えて、ウェルを研和した。ウェルを金属テープシール（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．＃６５６９）でシールして、インキュベートした（ＲＴ，１時間）。次いで、プレートからシールを外して、真空マニホールドを介して溶液を除去した。プレート底部をゴム栓でシールして、活性化された酸の新しいアリコート（７０ｕＬ）を適切なウェルに加えて、研和して、プレート上部を金属テープシールでシールして、インキュベートした（ＲＴ、１時間）。インキュベーション後、プレートシールを外して、溶液を真空マニホールドによって除去して、ウェルを洗浄した（３×、７０ｕＬ、８０：２０ ＤＭＦ：ＭｅＯＨ）。
実施例１Ｄ．アミン保護基フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の除去
ＤＮＡ連結反応性アミンを、活性化された酸とカップリングさせ、反応させた（実施例１Ｃ）。Ｆｍｏｃ保護酸をアシル化したウェルについて、６０ｕＬの４－メチルピペリジン（２０％ｖ／ｖ、ＤＭＦ）を加えて、１０分間インキュベートした。溶液を真空マニホールドによって除去して、ウェルを洗浄した（３×７０ｕＬ ＤＭＦ、３×７０ｕＬ ＭｅＯＨ、３×７０ｕＬ ＤＩ水）。プレートをスピンダウンして、微量の液体を除去した（１分、２０００ＲＰＭ）。この新たに修飾されたＤＮＡオリゴを、溶出してもよいし（実施例１Ｅ）、追加のカップリングを行って（実施例１Ｃ～１Ｄに従う）化合物を伸長させてもよい。
実施例１Ｅ．合成的に修飾されたオリゴヌクレオチドのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）からの溶出、回収、および精製
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）樹脂に固定化されながらＤＮＡ連結反応性アミンを修飾する反応の後に、ＤＮＡ化合物構築物を、分析および精製のためにウェルから収集プレート中に溶出してもよい。ウェルに３３ｕＬの溶出緩衝液（蒸留水中１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＨ）を加えて、研和して、５分間インキュベートした。フィルタープレートをレシーバプレート上に置いて、遠心分離（１分、２０００ＲＰＭ）によって溶液を収集した。これらの工程をもう２回繰り返して、９９ｕＬの溶出緩衝液中に溶出ＤＮＡを得た。回収した溶離液に２．５ｕＬの１Ｍ酢酸（最終濃度２５ｍＭ）を加えて、溶離液が酸性になるのを防ぎながら５０％のＮａＯＨを中和した。注目する特定の化合物－ＤＮＡ構築物に最適化したＨＰＬＣ法を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣによってＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃｌａｒｉｔｙ ２．６ｕｍ Ｏｌｉｇｏ－ＸＴ １００ Ａカラム（５０×２．１ｍｍ）でサンプルを精製した。
実施例１Ｆ．ＤＮＡに付加される全長コード化陽性対照分子の合成および生成。
当業者であれば、実施例１Ａ～１Ｅ由来の合成分子で修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチド等の修飾プライマーを利用して、より長いＤＮＡ構築物を生成できることを理解するであろう。ＢＣＡ陽性対照を、記載のように選択したＤＮＡオリゴヌクレオチドに合成した。精製した化合物－ＤＮＡハイブリッドを、プライマーとして、化合物の正体に特異的な全長鎖鋳型を使用する標準的なＰＣＲに使用した。簡潔には、Ｚａ’－Ａ（０９７－１０７）－Ｚｂｉ－Ｂｉ－Ｚｂｆ－Ｂｆ－Ｚｃｉ－Ｃｉ－Ｚｃｆ－Ｃｆ－Ｚｄ－Ｄ００１－Ｚｆからなる鋳型鎖を、１ｕＬの１０ｕＭ化合物－Ｚａ－ＤＮＡハイブリッドに加えて、２５ｕＬのＱ５ ＰＣＲ反応にした。当業者であれば、最適化されたＰＣＲプログラムを実行して、ＤＮＡコード化ライブラリコーディング部分の長さおよび組成を模倣した「完全長」２３４オリゴヌクレオチドコードを生成したことを理解するであろう。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キットの標準プロトコルを用いて、生成物を精製した。
実施例２ 直交反応条件によるＤＮＡオリゴヌクレオチド上の蛍光標識化合物
ＤＮＡに連結した、結合親和性が知られている化合物を生成および精製するために、修飾ヌクレオチドを利用して蛍光化合物を付着させて、ＤＮＡを可視化する。フルオロフォア（この実施例ではフルオレセイン）の付着は、結合親和性の決定を可能にし、そして表面、ゲル、またはサンプル上の化合物の位置を可視化するのに利用することもできることが当該技術において知られている。
２Ａ．市販のアルキン修飾オリゴヌクレオチドを含有する修飾ＤＮＡコードの利用。
当業者によく知られているように、直交反応性ハンドル、この場合ではアルキンの利用により、注目する化合物から遠位部位への合成修飾が可能となる。蛍光化合物を生成するために、反応性アミン連結末端（５ＡｍＭＣ６）を有するアルキン修飾ＤＮＡヌクレオチド（ｉ５ＯｃｔｄＵ）オリゴヌクレオチドを、実施例１Ｂ～１Ｅのように、所望の化合物（図６に示す）の合成に使用して、精製した。精製後、サンプルを、ｓｐｅｅｄ－ｖａｃによって乾燥させて、２０ｕＬのＤＩ水中に溶解させた。この溶液に、１０ｕＬの７．３ｍＭ ５－ＦＡＭアジド（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ，Ｃａｔ．＃Ｃ４１３０）を加えてから、８０ｕＬの新たに調製したクリック反応緩衝液（水中１２０ｍＭホスファート、１．２ｍＭアミノグアニジン、３ｍＭトリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン、６ｍＭ硫酸銅、１２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム）を加えて、インキュベートした（３０分、室温）。インキュベーション後、８０ｕＬのクリッククエンチ緩衝液（脱イオン水中１００ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、０．００２％ＳＤＳ）に続いて５００ｕＬの結合緩衝液を加えた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ溶液に、４０ｕＬのＤＥＡＥ樹脂を加えて、穏やかに振盪しながらインキュベートした（２０分、室温）。チューブをベンチトップ遠心分離機で１分間スピンダウンして、上清をピペッティングによって除去した。樹脂を５０ｕＬの水中に再懸濁させて、３８４ウェルフィルタープレートに移した。ウェルを真空マニホールド（３×７０ｕＬ ＤＩ水、３×７０ｕＬ ＭｅＯＨ、１×７０ｕＬ ＤＭＳＯ、３×７０ｕＬメタノール、３×７０ｕＬ水）で洗浄した。上記の手順を使用してＤＮＡを溶出した（３×３３ｕＬ溶出緩衝液を収集プレートに入れた）。１０ｕＬの１００ｍＭ ＡｃＯＨを使用して溶離液を中和した。標準的な方法を使用するＨＰＬＣを使用してサンプルを精製した。
実施例３ 蛍光偏光を使用した、溶液中の標的とのＤＮＡ上の蛍光化合物の結合親和性測定。
１．可溶性タンパク質による陽性対照蛍光偏光、一般的な手順
図６は、使用した陽性対照化合物を示す。
ＤＮＡに共有結合的に繋がれた化合物は、非修飾の天然化合物と比較して、修飾された、より高いもしくはより低い、または変化していない親和性プロファイルを有し得ることが当業者によって理解されるであろう。これに取り組むために、一般的な結合アッセイ、蛍光偏光を使用して、直交化学を利用して蛍光標識することができるＤＮＡオリゴヌクレオチドに繋がれた部分として合成した、選択した陽性対照分子を評価した。ＤＮＡ上の陽性対照化合物（図６に示す）を１×トリスホウ酸緩衝液（４５ｍＭ、ｐＨ８．１９）中に個々に希釈して、１ｍＬの緩衝液中２０ｎＭの最終濃度にした。この２０ｎＭストック溶液の１：１希釈を行って、１０ｎＭストック溶液を生成した。ＢＣＡ－ＩＩの１００ｕＭストック溶液を、１×トリスホウ酸緩衝液中に作製した。３８４ウェルポリスチレンＦ底小容量ハイベース非結合黒色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ－ｏｎｅ，Ｃａｔ．＃７８４９００）に、適切な化合物の１０ｕＬの２０ｎＭストック溶液を、カラム１において加えた。カラム２～２０において、１０ｕＬの適切な化合物１０ｎＭストック溶液を加えた。カラム１に、１０ｕＬの１００ｕＭストックＢＣＡ－ＩＩタンパク質溶液を加えて、ウェルを研和して、１０ｕＬのウェルをウェルカラム２に移して、ピペッティングによって混合した。このプロセスをウェル２０まで繰り返した。この手順により、その後の各ウェルにおいて、ストックタンパク質濃度の１：１希釈が得られ、これによって、５０ｕＭ～９５ｐＭの範囲が得られる一方、蛍光標識されたＤＮＡ－化合物の濃度は、一定の１０ｎＭのままである。４８５／５３０の励起／発光および予めプログラムされた蛍光偏光法を使用して、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ ５プレートリーダーによってプレートを読んだ。得られた値をグラフ化して、結果をヒルの式に適合させて、ナノモル濃度値で記録される結合親和性（Ｋｄ）を得た。
実施例４ 形質陽性分子対形質陰性分子の選択用のアフィニティ電気泳動保持レーンの生成。
実施例４Ａ：固定化用の捕捉部分による標的タンパク質の標識化を効率的に生成すること
当業者によって認識されるように、タンパク質の修飾は広く当り前に使用されており、本実施例では、ウシ赤血球由来の炭酸脱水酵素アイソザイムＩＩをビオチンで修飾して、ストレプトアビジン被覆粒子に対する標的の捕捉を可能にした。これを達成するために、ウシ赤血球由来の２５ｍｇ（０．８３３μｍｏｌ）の炭酸脱水酵素アイソザイムＩＩ（ｓｉｇｍａ Ｃ２５５２－２５ＭＧ）を、４５０ｕＬのＰＢＳ（ｐＨ７．８）に加えた。この溶液に、５５０ｕＬのＰＢＳ（ｐＨ７．８）中に溶解した１．５ｍｇ（２．５μｍｏｌ、３当量。）のＮＨＳ－ｄＰｅｇ４－ビオチン（Ｓｉｇｍａ ＱＢＤ １０２００）を加えた。この混合物（タンパク質の最終濃度８００ｕＭ）を４℃にて一晩置いた。このビオチン化タンパク質を、更なる工程において精製することなく使用した。
実施例４Ｂ：ストレプトアビジン標識アガロース樹脂上への固定化標的の生成
ビオチン化標的タンパク質（ウシ炭酸脱水酵素アイソザイムＩＩ）を、注目する樹脂上に固定化した。これを達成するために、５０ｍＬファルコンチューブ中に、１０．６ｍＬのＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ ＃２０３６１）の５０％スラリーを加えた。樹脂を、以下の手順によってトリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８．１９）で２回洗浄した：スラリーを１０００ＲＰＭにて１分間遠心分離して、上清をピペットによって除去して、これに５ｍＬのトリスホウ酸緩衝液を加え、そして手順を繰り返した。２回目の洗浄液を除去した後に、先のように調製した１ｍＬの８００ｕＭビオチン化ウシ炭酸脱水酵素を加えた。このスラリーを、穏やかな撹拌によって混合して、室温にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを遠心分離して（１０００ＲＰＭ、１分）、樹脂が「湿った」ままになるように注意しながら、上清を慎重に除去した。
実施例４Ｃ：代替のストレプトアビジン標識樹脂粒子上への固定化標的の生成。
当業者によって認識され得るように、実施例４Ｂに記載する固定化技術は、代替の樹脂タイプに対応するように容易に変更することができる。本実施例では、ストレプトアビジン被覆シリカ粒子（Ｓｐｈｅｒｏ ＳＶＳＩＰ－０５－５ ０．４～０．６ｕｍ）、ストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（Ｓｐｈｅｒｏ ＳＶＰ－０５－１０ ０．４～０．６９ｕｍ）、およびストレプトアビジン被覆アガロース粒子（より低いローディング容量Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ２０３４７）を、先と同じ手順に供して、標的タンパク質で被覆した粒子を得た。
実施例４Ｄ 低融点アガロースおよび標的標識粒子を利用したアフィニティ電気泳動保持アガロース混合物の生成。
標的被覆粒子を、電気泳動に適した多孔質媒体に固定化するには、当業者であれば、サンプル調製の温度を制御して、標的のアンフォールディングを妨げることができることを認識するであろう。この制御を達成して、分離媒体中に固定化標的粒子を生成するために、低融点アガロースを使用した。４グラムのＵｌｔｒａＰｕｒｅ低融点アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １６５２０）を含有するビーカーに、１００ｍＬの０．５×トリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８．１９）を加えて、４％アガロース溶液を生成した。ビーカーを、全てのアガロースが溶解して、最小限の気泡が観察されるまで、高で１分間隔で、間に短時間撹拌しながら、マイクロ波照射した。溶解したゲルを、２本の５０ｍＬファルコンチューブに移して、冷却して、加熱ブロック内で４２℃にて維持した。それとは別に、２％低融点アガロース溶液を、上記のように、２グラムの低融点アガロースおよび１００ｍＬの０．５×トリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８．１９）を使用して調製した。標的タンパク質をロードした、５．３ｍＬの沈降した高容量ストレプトアビジン樹脂のサンプルを、加熱ブロック中で４２℃に温めた。温めた標的粒子に、８ｍＬの４％低融点アガロースを４２℃にて加えた。スラリーを、ピペットチップによって徹底的に、気泡が入らないように注意しながら混合する。この混合物は、カスタム電気泳動モールド（半円筒４ｍｍ高さ８ｍｍ断面）を使用して、９ｃｍアフィニティ電気泳動保持レーンの４つのレーンを生成することができる。認識されるように、この調製物の規模は、標的の利用可能性、粒子の利用可能性、または所望のレーンの数および長さに応じて、より少ない量またはより多い量に調整することができる。調製した２％アガロース溶液を利用して、アガロース保持レーン内にサンプルのローディングポイントを生じさせた。手短に言うと、ローディングコーム（以下に記載する寸法）をゲルモールドの上部から１ｃｍに置き、そして２％アガロースを加えて、半円筒形のロードポイントを取り囲む。２％アガロースを室温にて固化させて、ロードコームをゲルから慎重に取り外すと、各レーン内に、ライブラリまたは所望のサンプルを含有する１５ｕＬのローディング溶液を保持することができる凹部が生じる。
モールドは、無料のオンラインソフトウェアＴＩＮＫＥＲＣＡＤ（登録商標）で設計した。設計仕様は、以下の通りである；ベースＬ×Ｗ×Ｄ １９×９×１深さ、ベースを２つの側部の壁でひとまとめに挟んだ（ｂｒａｃｋｅｔ）（１９×０．５×０．８ｃｍ）。ベースの上に、１９×０．８×０．４ｃｍの寸法を有する６つの等間隔（０．５ｃｍ間隔）の半円筒（図３、３０２参照）を印刷した。画像に示す「ローディングコーム」を、寸法Ｌ×Ｗ×Ｄが８．８×１×０．４ｃｍでベース上に印刷した。「ローディングコームベース」上に、高さ０．３ｃｍ、幅０．６ｃｍの６つの半円筒を印刷し、半円筒間の間隔は０．６ｃｍであり、半円筒をひとまとめに挟むのは、注がれるモールドの縁部をおおって適合する２つの矩形（０．３×０．３×０．３×ｃｍ）であり、これによりコームは、調製されたモールド内の中央に着座して、半円筒をハーフパイプ内の中央に配置させる。印刷は、一般的に利用されるＡＢＳ（アクリロニトリルブタジエンスチレン）印刷材料によるＳＴＲＡＴＡＳＹＳ（登録商標）ＵＰＲＩＮＴ（登録商標）ＳＥ Ｐｌｕｓ ３Ｄプリンタを利用するＵＰＳストアによって実行した。
レーン調製および画像化のための分割選択モールドを生成するために、先ず、上記の３ｄ印刷モールドに、エアロゾルＳＭＯＯＴＨ－ＯＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｏｌｄ Ｒｅｌｅａｓｅを軽く噴霧して、３ｄ印刷モールド上に均一な軽い被覆を生じさせた。モールドの開いた末端を、マスキングテープを使用してシールして、ＳＭＯＯＴＨ－ＯＮ（登録商標）ＣＬＥＡＲＦＬＥＸ（登録商標）５０（製造業者の指示に従って、徹底的に混合して、２分間超音波処理して気泡を除去して、１：２ Ａ：Ｂの重量比で調製した）を、気泡が入らないように慎重に注いで、一晩固化させた。固化後、ｃｌｅａｒ－ｆｌｅｘ５０モールドを慎重に取り出して、アガロースゲルで充填することができる半円筒レーンを生成した。モールドを水および７０％エタノールで十分に洗浄して、さらに変更することなく利用した。
分割選択ゲルレーン
実施例４Ｅ．ローディングポイントを有する完全アフィニティ電気泳動保持レーンの生成。
完全アフィニティ電気泳動保持レーン構築物を生じさせるために、標的をロードした保持粒子を含有する多孔質アガロース中へのサンプルの導入を可能にするためのサンプルローディングポイントを生成してもよい。特注の印刷されたロードポイントコームを使用して、先に調製した２％低融点アガロースを、フィルタープラグによってブロックしたモールド中に注ぐ。ゲルを室温に冷却して、アガロースを固化させて、コームを慎重に取り外す。ロードウェルを、いかなる不一致も穴もないか検査する。コームをローディングウェル領域中に静かに再配置して、過剰なゲルを切って取り除く。別の新しいフィルタープラグを、ロード領域の縁部から適切な距離（約１～９ｃｍまたはあらゆるカスタム距離）に置いて、ロードした標的粒子／低融点アガロース混合物をレーン中にピペットで入れて、室温に冷却して、ゲルの「捕捉領域」を生じさせるように固化させる。フィルタープラグを切って取り除いて、「捕捉領域」の端部に２％ＬＭＰアガロースを加えてレーンを端部まで満たして、保持「捕捉領域」に遭遇した後にサンプル分子が移動するための追加の距離を提供する。
実施例５．電気泳動中の親和性に基づく、ＤＮＡに付着した既知の結合分子の分画および分離：
実施例５Ａ．標的活性電気泳動保持レーンを通る蛍光陽性対照電気泳動
ａ．図７Ａ、図７Ｂ、および図８Ａ～８Ｄ
アフィニティクロマトグラフィの当業者によって理解され得るように、生成されたアフィニティ電気泳動保持レーンは、標的と相互作用して、電気泳動中にゲルを通る動きを遅らせる分子の共鳴時間に依存する分画として機能することとなる。高ローディングストレプトアビジンアガロースおよび固定化標的からなる標的ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ捕捉領域を有するゲルレーンを、上記のように生成した。当該レーンに、１２μＬの単一陽性対照化合物（図６）、または蛍光標識陽性対照（図６）の、２００ｎｇの各化合物との混合物（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図９、および図１０）、および２μＬのゲルローディング緩衝液をロードした。ゲルを４０Ｖで１８時間泳動して、一定の間隔で画像化して、青色プレートを使用するＢｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃｋ ＥＺ Ｉｍａｇｅｒで分離の進行を追跡した。図６に見られるように、個々の化合物実験は、合成的に修飾されたオリゴヌクレオチドの親和性に対応する保持因子（Ｒｆ）をもたらした。これらの対照分子の混合物を、同様にして加えて分離することができた（図８Ａ～８Ｄ、図９、および図１０）。
実施例５Ｂ．異なる粒子タイプおよびローディング密度のアフィニティ電気泳動保持レーンを通る蛍光陽性対照電気泳動。
ａ．図１０
可変的な密度および粒子タイプを有する分離媒体の使用により、形質の増強の可能性を有する代替的な保持能力が提供される。これを評価するために、標的を３ｃｍで捕捉した以下の保持領域を含有するレーンを生成した：１．標的を捕捉したストレプトアビジン標識ポリスチレン、２．標的を捕捉したストレプトアビジン標識シリカ、３．高ローディングストレプトアビジンアガロース、４．低ローディングストレプトアビジンアガロース（粒子密度は３と同一であった）、５．レーン３に対して１／４の密度の高ローディングストレプトアビジンアガロース（総標的量は４と同一であった）。これにより、粒子タイプ、表面ディスプレイ標的密度、および標的粒子密度を探索する。親和性が３６２ｎＭ（化合物１０）および７１６０ｎＭ（化合物５）である化合物、およびトレーサーとしてフルオレセインを使用して、実験を行った。電気泳動を、９０Ｖにて３時間行った。
実施例５Ｃ．全長コードディングオリゴヌクレオチドおよびコード化分子の分離
本方法の有用性は、形質陽性化合物を形質陰性化合物から分離し、かつ形質陽性化合物を、標的に対する親和性によって分画するようにして、形質陽性化合物を形質陰性化合物から分離し、かつ配列決定して、コーディング領域を、そしてそれによってコード化化合物を識別する能力にある。電気泳動の前に、ゲル装置をＤＩ水で洗浄する。装置を、２Ｌの０．５×ＴＢ緩衝液で満たして、水浴（ゲル装置のラインの下）のデリ冷蔵庫内に置いて、４℃に冷却する。レーンがローディングされているゲルモールドを装置に入れて、３０分間冷却した。調製した分割選択ゲル（標的タンパク質をロードした高ローディングストレプトアビジンアガロースを使用する、３ｃｍの捕捉領域）に、２ｕＬの紫色のゲルローディング緩衝液（ＮＥＢ ＃Ｂ７０２４Ｓ）、１００ｎｇのダミーライブラリ（１６００万個のユニークなライブラリコードからなるが、合成的に修飾された化合物ではない）、および、実施例１Ｆにおいて生成され、そしてダミーライブラリサンプルから独立して、かつユニークにコード化されるウシ炭酸脱水酵素ＩＩの各陽性対照（表ＸＡ）の５０，０００コピーを含有する１２ｕＬのサンプルを加えた。サンプルを９０Ｖにて５時間電気泳動した。
実施例５Ｄ 保持媒体の物理的パーティション化
当業者によって認識され得るように、クリーンルーム技術の必要性は、サンプルの相互汚染を防ぐために最も重要である。これを達成するために、ゲルを泳動後に層流フード中に移す。アフィニティ選択ゲルを、１ｍｍの４４スライスにパーティション化して、滅菌ＰＣＲプレートに移す。人差し指の間に保持されて、ゲルスライス上に押し下げられる、１２枚の脱脂したカミソリ刃のスタックを使用して、スライスを生成する。ＰＣＲウェル位置は、ゲルスライスの位置に直接対応する。
実施例５Ｅ アフィニティ電気泳動保持アガロースゲルレーンからのＤＮＡオリゴヌクレオチドの回収
パーティション化されたスライス各々からコーディングＤＮＡのＰＣＲコピーを生成するために、ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅に適した形態で回収してもよい。これを達成するために、先で生成した個々のゲルスライスを含有するＰＣＲプレートを、サーモサイクラー内で９５℃に５分間加熱する。プレートをスピンダウンして（２０００ＲＰＭ、１分）、各ウェルに、３ｕＬの１０×Ｂ－アガラ－ゼＩ緩衝液、および、５０，０００分子の陽性対照ＤＮＡ配列を含有する５ｕＬの水を加えて、３０ｕＬの総容量を得る。プレートを再び９５℃に１０分間加熱して、４２℃の加熱ブロック内に置く。サンプルを、４２℃の加熱ブロックで１０分間保持してから、各ウェルに２ｕＬのＢ－アガラーゼ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｃａｔ＃ Ｍ０３９２Ｌ）を加える。次いで、プレートをインキュベートする（１時間、４２℃）。インキュベーション後、プレートをスピンダウンする（２０００ＲＰＭ、１分）。必要に応じて、プレートをシールして－２０℃にて保存することができる。この手順は、もはやゲル化することができず、かつＰＣＲによって進行工程において増幅し得るサンプルを生成する。
実施例５Ｆ 特定のインデックス付けオリゴヌクレオチドプライマーのＰＣＲ導入による個々のゲルスライスのインデックス付け（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）
アフィニティ選択ゲルに関して、回収したＤＮＡの位置を識別するために、インデックス付けオリゴヌクレオチドを、親コーディングＤＮＡ鎖の全ての増幅されたＰＣＲコピー上に導入する。これを、ウェル上で生成された溶解ゲルサンプルから達成するために、ウェルを研和して、１５ｕＬを新しい９６ウェルプレートに移す。各ゲルスライスは、ｚｄ’－Ｄ００２’～Ｄ０９６’－Ｚｆインデックスで個別にインデックス付けされる。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ Ｍ ０４９２Ｌ）を用いて、合計５ｍＬのマスターミックスを調製する。各ウェルに、１．２５ｕＬのＤ－インデックス付けプライマー（１０ｕＭ）および１．２５ｕＬのＩｌｌｕｍｉｎａ－Ｚａ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ｕＭ）を加えて、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｉｌｌｕｍ＿Ｚａ＿Ｔ７３で１２サイクル実行する。
実施例５Ｇ 配列決定のためのＩｌｌｕｍｉｎａ ＺａおよびＩｌｌｕｍｉｎａ Ｚｆプライマーセットのインデックス導入を伴う事後増幅（ｐｏｓｔ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
コーディング領域およびインデックス付けされた領域を配列決定して、コード化された化合物構造を適切に割り当てるために、配列決定プライマーセットを導入してもよい。Ｉｌｌｕｍｉｎａプライマーセットを、標準的なＰＣＲプロトコルを用いて導入する。簡潔には、インデックス付けされた各ゲルスライスウェルから２ｕＬを取り出して、新しい９６ウェルＰＣＲプレートに移す。これらのウェルに、Ｉｌｌｕｍｉｎａプライマーセットを含有する２３ｕＬのＱ５マスターミックスを加える。プロトコルＩｌｌｕｍ＿Ｚａ－Ｔ７３を用いて、サンプルを１０サイクル実行する。増幅後、各ウェル由来の２ｕＬアリコートをプールして、１０ｕＬのプールしたＰＣＲ反応あたり１ｕＬのＥｘｏ－Ｉ（ＮＥＢ Ｍ ０２９３－Ｌ）を加える。組み合わせたサンプルを、３７℃にて３０分間インキュベートしてから、８０℃にて１５分間熱不活化する。組み合わせた、エキソヌクレアーゼ処理したサンプルを、ＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲクリーンアップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃａｔ．＃Ｋ０７０１）を使用して精製する。サンプルの純度を、２％アガロースゲルおよびデンシトメトリを使用して評価して、ＤＮＡの量を定量化する。精製したＤＮＡを、ＮＧＳ配列決定に提出する。
実施例５Ｈ 配列決定のためのＩｌｌｕｍｉｎａ ＺａおよびＩｌｌｕｍｉｎａ Ｚｆプライマーセットのインデックス導入を伴う事後増幅
ａ．図１１Ａ
実施例５Ｆで調製したＤＮＡサンプルを、ＤＮＡ配列決定に供する。事後加工方法は、サンプル中の陽性対照分子および位置インデックスをコード化するＡ０９７－Ａ１０７コーディング領域を単離かつ識別して、コードが由来するスライスを決定する。配列決定カウントをゲルスライスによってプロットし（図１１Ａ）、親和性が最良である化合物は、親和性がより低い化合物と比較して、高度に保持されており、そして単離、配列決定、かつ識別することができる。

Claims (15)

  1. 少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する方法であって：
    分離媒体を提供する工程であって、前記分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する、工程と；
    少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、前記分離媒体に導入する工程であって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と；
    前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と；
    前記分離媒体由来の前記少なくとも２つの別個の位置の少なくとも１つの位置をセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と；
    前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実行を可能にする工程と；
    前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コーディング部分に対してＰＣＲを実行することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅する工程と；
    前記少なくとも１つの位置、および前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記少なくとも１つのコード化部分の正体を加工することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する工程と
    を含む、方法。
  2. 前記少なくとも１つの標的分子は、細胞、オリゴヌクレオチド、タンパク質、酵素、リボソーム、およびナノディスクからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分離媒体は、粒子、ポリマー、および分離表面からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含有し、前記少なくとも１つの標的分子は、前記分離媒体、前記粒子、前記ポリマー、および前記分離表面の少なくとも１つに連結されている、請求項１に記載の方法。
  4. 前記粒子は、ポリマー粒子または金属コロイドを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ポリマーは、前記少なくとも１つの標的分子の最低重量標的分子の１０％またはそれを超える分子量を有する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つの標的分子と、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分との間の少なくとも１つの標的活性に基づいて、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの標的活性は、前記少なくとも１つの標的分子による前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分の化学修飾を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、
    前記少なくとも１つのコード化部分は、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有し、
    前記少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックは、前記オリゴヌクレオチドの１～５個のコーディング領域によって識別され、
    前記分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（Ｉ）（Ｉ）Ｇ－Ｌ－Ｂ
    に従う構造を有し、式中、
    Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
    Ｂは、少なくとも２つの構築ブロックを含有するコード化部分であり；
    Ｌは、ＧをＢに作動可能に連結するリンカーであり；
    Ｂ中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Ｇの１～５個のコーディング領域によって別々に識別される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩ）
    （ＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
    に従う構造を有し、式中、
    Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
    Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
    Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
    Ｌ１は、Ｂ１をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
    Ｌ２は、Ｂ２をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
    Ｏは０または１であり；
    Ｐは０または１であるが；
    ＯおよびＰの少なくとも１つが１であることを条件とし；
    位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇの１～５個のコーディング領域によって識別される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩＩ）
    （ＩＩＩ）［（Ｂ１）Ｍ－Ｌ１］Ｏ－Ｇ’－［（Ｌ２－（Ｂ２）Ｋ］Ｐ
    に従う構造を有し、式中、
    Ｇ’はオリゴヌクレオチドを含み、Ｇ’は、少なくとも２つのコーディング領域および少なくとも１つのヘアピンを含み；
    Ｂ１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
    Ｂ２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ１およびＢ２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
    Ｌ１は、Ｂ１をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
    Ｌ２は、Ｂ２をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
    Ｏは、ゼロ～５の整数であり；
    Ｐは、ゼロ～５の整数であるが；
    ＯおよびＰの少なくとも１つが、１～５の整数であることを条件とし；
    位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ２は、Ｇ’の１～５個のコーディング領域によって識別される、請求項１に記載の方法。
  12. 第１の分離処理を前記分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程をさらに含み、
    前記第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記分離媒体由来の前記少なくとも１つの位置を、前記第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 第２の分離処理を前記分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することをさらに含み、前記第２の方向は、前記第１の方向に対して実質的に垂直であり、
    前記第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記分離媒体由来の前記少なくとも１つの位置を、前記第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

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