JP2022525340A - オリゴヌクレオチドコード化分子を加工または分析する方法および系 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年3月14日出願の米国仮出願第62/818,645号明細書の利益を主張し、この出願の内容は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
Bは、少なくとも2つの位置構築ブロックを含有するコード化部分であり;
Lは、GをBに作動可能に連結するリンカーであり;
B中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Gの1~5個のコーディング領域によって別々に識別される。
(II)[(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をGに作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をGに作動可能に連結するリンカーであり;
Oは0または1であり;
Pは0または1であるが;
OおよびPの少なくとも1つが1であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、Gの1~5個のコーディング領域によって識別される。
(III)[(B1)M-L1]O-G’-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
G’はオリゴヌクレオチドを含み、G’は、少なくとも2つのコーディング領域および少なくとも1つのヘアピンを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
Oは、ゼロ~5の整数であり;
Pは、ゼロ~5の整数であるが;
OおよびPの少なくとも1つが、1~5の整数であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、G’の1~5個のコーディング領域によって識別される。
に従う構造を有する1つまたは複数のオリゴヌクレオチドコード化分子を含むことができ、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
Bは、少なくとも2つの構築ブロックを含有するコード化部分であり;
Lは、GをBに作動可能に連結するリンカーであり;
B中の各構築ブロックまたは位置構築ブロックは、位置に従って、Gの1~5個のコーディング領域によって別々に識別される。
(II)[(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有する1つまたは複数のオリゴヌクレオチドコード化分子を含むことができ、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をGに作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をGに作動可能に連結するリンカーであり;
Oは0または1であり;
Pは0または1であるが;
OおよびPの少なくとも1つが1であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、Gの1~5個のコーディング領域によって識別される。一実施形態において、式IIの分子を使用する方法の利点として、2つのコード化部分を提示するOEMの導入が挙げられ得る。(B1)Mおよび(B2)Kは、上述したように、単一のコード化部分を提示するOEMと比較して、シグナル対ノイズ比を増大させることができる。
(III)[(B1)M-L1]O-G’-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有する1つまたは複数のオリゴヌクレオチドコード化分子を含むことができ、式中、
G’はオリゴヌクレオチドを含み、G’は、少なくとも2つのコーディング領域および少なくとも1つのヘアピンを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
Oは、ゼロ~5の整数であり;
Pは、ゼロ~5の整数であるが;
OおよびPの少なくとも1つが、1~5の整数であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、G’の1~5個のコーディング領域によって識別される。一実施形態において、式IIの分子を使用する方法の利点として、2~10個のコード化部分を提示するOEMの導入が挙げられ得る。(B1)Mおよび(B2)Kは、上述したように、単一のコード化部分を提示するOEMと比較して、シグナル対ノイズ比を大幅に増大させることができる。
[((B1)3-(B1)2-(B1)1-L1]O-G-[(L2-(B2)1-(B2)2]P。
例示的な実施形態
分離媒体を提供する工程であって、分離媒体は、少なくとも1つの標的分子を含有する、工程と;
少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、分離媒体に導入する工程であって、少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも1つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と;
少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも2つの別個の位置に分離することによって、少なくとも2つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と;
分離媒体由来の少なくとも2つの別個の位置の少なくとも1つの位置をセグメント化して、少なくとも1つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも2つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と;
少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、PCRの実行を可能にする工程と;
少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子のコーディング部分に対してPCRを実行することによって、少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも1つのコード化部分を増幅する工程と;
少なくとも1つの位置を、少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも1つのコード化部分の正体と相関させることによって、少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集する工程と
を含む、方法。
少なくとも1つのコード化部分は、少なくとも2つの位置構築ブロックを含有し、
少なくとも1つのコード化部分の各位置構築ブロックは、オリゴヌクレオチドの1~5個のコーディング領域によって識別され、
分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、実施形態1~7または9~15のいずれかの方法。
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
Bは、少なくとも2つの構築ブロックを含有するコード化部分であり;
Lは、GをBに作動可能に連結するリンカーであり;
B中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Gの1~5個のコーディング領域によって別々に識別される、実施形態1~8または10~15のいずれかの方法。
(II)[(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をGに作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をGに作動可能に連結するリンカーであり;
Oは0または1であり;
Pは0または1であるが;
OおよびPの少なくとも1つが1であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、Gの1~5個のコーディング領域によって識別される、実施形態1~9または11~15のいずれかの方法。
(III)[(B1)M-L1]O-G’-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
G’はオリゴヌクレオチドを含み、G’は、少なくとも2つのコーディング領域および少なくとも1つのヘアピンを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
Oは、ゼロ~5の整数であり;
Pは、ゼロ~5の整数であるが;
OおよびPの少なくとも1つが、1~5の整数であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、G’の1~5個のコーディング領域によって識別される、実施形態1~10または12~15のいずれかの方法。
第1の分離処理は、第1の電圧プロトコルおよび第1の持続時間を含む、実施形態1~11または13~15のいずれかの方法。
第2の分離処理は、第2の電圧プロトコルおよび第2の持続時間を含む、実施形態1~13または15のいずれかの方法。
実施形態1A
分離媒体を提供する工程であって、分離媒体は、少なくとも1つの標的分子および少なくとも1つのサンプル領域を含有する、工程と;
少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、分離媒体のサンプル領域に導入する工程であって、オリゴヌクレオチドコード化分子は、コード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と;
サンプルを電気泳動に供することによって、混合物の少なくとも一部を、分離媒体中の標的に接触させる工程と
を含む、方法。
オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つのコーディング領域を含有し、
少なくとも1つのコード化部分は、少なくとも2つの位置構築ブロックを含有し、
少なくとも1つのコード化部分の各位置構築ブロックは、1~5個のコーディング領域によって識別され;
分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、実施形態1Aの方法。
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
Bは、少なくとも2つの構築ブロックを含有するコード化部分であり;
Lは、GをBに作動可能に連結するリンカーであり;
B中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Gの1~5個のコーディング領域によって別々に識別される、実施形態1Aの方法。
(II)[(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をGに作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をGに作動可能に連結するリンカーであり;
Oは0または1であり;
Pは0または1であるが;
OおよびPの少なくとも1つが1であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、Gの1~5個のコーディング領域によって識別される、実施形態1Aの方法。
(III)[(B1)M-L1]O-G’-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
G’はオリゴヌクレオチドを含み、G’は、少なくとも2つのコーディング領域および少なくとも1つのヘアピンを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
Oは、ゼロ~5の整数であり;
Pは、ゼロ~5の整数であるが;
OおよびPの少なくとも1つが、1~5の整数であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、G’の1~5個のコーディング領域によって識別される、実施形態1Aの方法。
分離媒体に第1の方向に電圧を印加することによって、少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程をさらに含む、実施形態1Aの方法。
分離媒体を、分離セグメントを形成するために第1の方向に対して実質的に垂直である第1の分ける方向に分けることによってオリゴヌクレオチドコード化分子の画分を単離する工程をさらに含む、実施形態1Aの方法。
オリゴヌクレオチドコード化分子の画分を分離セグメントから取り出して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分を形成する工程と;
オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分からオリゴヌクレオチドを増幅して、コピー配列の画分を形成する工程と、
コピー配列の画分を配列決定して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分の各コーディング領域またはコーディング領域の組合せを識別して、少なくとも1つのコード化部分の各位置構築ブロックを識別する工程と
をさらに含む、実施形態8Aの方法。
分離媒体に第2の方向に電圧を印加することによって、少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程であって、第2の方向は、第1の方向に対して実質的に垂直である、工程をさらに含む、実施形態7Aの方法。
分離媒体を2つの方向に分けることによってオリゴヌクレオチドコード化分子の画分を単離する工程であって、2つの方向は、それぞれ独立して、矩形の分離セグメントを形成するように、第1および第2の方向に対して実質的に垂直である、工程をさらに含む、実施形態10Aの方法。
オリゴヌクレオチドコード化分子の画分を分離セグメントから取り出して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分を形成する工程と;
オリゴヌクレオチドコード化分子の矩形の回収画分からオリゴヌクレオチドを増幅して、コピー配列の画分を形成する工程と、
コピー配列の画分を配列決定して、オリゴヌクレオチドコード化分子の回収画分の各コーディング領域またはコーディング領域の組合せを識別して、少なくとも1つのコード化部分の各位置構築ブロックを識別する工程と
をさらに含む、実施形態11Aの方法。
電気泳動システムであって、
多孔質ゲルと;
多孔質ゲル内の少なくとも1つの標的分子と;
多孔質ゲル内の少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子と
を含む分離媒体を含み、
オリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも1つのコード化部分に連結されたオリゴヌクレオチドを含有し、
オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つのコーディング領域を含有し、
少なくとも1つのコード化部分は、少なくとも2つの位置構築ブロックを含有し、
各コード化部分の各位置構築ブロックは、2~5個のコーディング領域によって識別される、電気泳動システム。
粒子およびポリマーの少なくとも1つを含み、少なくとも1つの標的分子は、粒子およびポリマーの少なくとも1つに連結されている、実施形態14Aの電気泳動システム。
本開示は、本開示の方法を実施するように、例えば、少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性データを収集するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図12は、シングルコアプロセッサでもマルチコアプロセッサでも、並列処理用の複数のプロセッサでもあり得る中央処理装置(CPU、また、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」)1205を含むコンピュータシステム1201を示す。また、コンピュータシステム1201は、メモリまたはメモリ位置1210(例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ)と、電子記憶ユニット1215(例えば、ハードディスク)と、1またはそれを超える他のシステムと通信するための通信インターフェース1220(例えば、ネットワークアダプタ)と、周辺装置1225、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、および/または電子ディスプレイアダプタとを含む。メモリ1210、記憶ユニット1215、インターフェース1220、および周辺装置1225は、マザーボード等の通信バス(実線)を介してCPU1205と通信する。記憶ユニット1215は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット(またはデータリポジトリ)であってもよい。コンピュータシステム1201は、通信インターフェース1220の助力によって、コンピュータネットワーク(「ネットワーク」)1230に動作可能に接続され得る。ネットワーク1230は、Internet、インターネットおよび/もしくはエクストラネット、またはInternetと通信しているイントラネットおよび/もしくはエクストラネットであってもよい。ネットワーク1230は、場合によっては、電気通信および/またはデータネットワークである。ネットワーク1230は、クラウドコンピューティング等の分散コンピューティングを可能にし得る、1またはそれを超えるコンピュータサーバを含んでもよい。ネットワーク1230は、場合によっては、コンピュータシステム1201の助力によって、コンピュータシステム1201に接続されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実施することができる。
活性化された酸を反応性遊離アミンにカップリングさせる反応により、化合物の大規模な収集物または個々の化合物を迅速かつ効率的に生じさせることを可能にすることは、DNA修飾の当業者によって理解されるであろう。
実施例1A.SEPHAROSE(登録商標)樹脂上へのDNAの固定化
反応性アミンハンドルに連結されたDNAオリゴに化学修飾を行うために、先ずDNAをSEPHAROSE(登録商標)樹脂上に固定化する。384ウェルフィルタープレート(E&K Scientific,EK-2288)内の各ウェルに、40uLの1:1 DEAE SEPHAROSE(登録商標):保存溶液を加えた。ウェルをプレート真空マニホールドで70uLの水で2回洗浄してから、70uLの結合緩衝液(蒸留水中10mM AcOH)で2回洗浄した。プレートを遠心分離機で2000rpmにて1分間スピンして、ウェルから全ての液体を乾燥させた。40uLの結合緩衝液および10uLの100ng/uLの適切なアミン連結DNAオリゴを各ウェルに加えて、ウェルを広口径チップ(Rainin)を用いて研和して、室温にて10分間インキュベートした。プレートをレシーバプレート(greiner bio-one REF 781201)中に2000RPMにて1分間スピンした。収集プレート内の溶離液を樹脂の上部に加えて、ウェルを研和して、室温にて5分間インキュベートした。プレートをレシーバプレート中に再びスピンして(2000RPM、1分間)、各溶離液ウェルをDNA濃度についてナノドロップによって分析して、捕捉効率を評価した。測定したDNA濃度が1ng/uLを超えれば、溶離液を樹脂に3回目に加えて、もう5分間インキュベートして、スピンアウトおよび測定を繰り返した。測定したDNA濃度が1ng/uL未満であれば、ウェルを真空マニホールド(3×70uLの結合緩衝液、3×70uLの水、3×70uLのメタノール)で洗浄した。
実施例1B.活性化された酸の生成、一般的な手順、および反応性アミンに連結したDNAオリゴへのカップリング。
酸部分を含有する化合物をDNAオリゴマーの遊離アミンにカップリングさせるために、酸を以下の様式で活性化させる。各酸について、酸の分子量によって算出して、80:20 DMF:MeOHおよび濃度400mMの溶液を調製した。40mM HoAT(5.5mg)の1mL溶液を、80:20 DMF:MeOH中で調製した。使用直前に、100mM EDC*HCl 7.7mgのストック溶液を、400uLのMeOHに溶解させた。活性化された酸を生成するために、15uLの所望の酸(400mM)に、15uLのHoAT(40mM)に続いて30uLのDMF:MeOH 80:20を、そして最後に60uLのEDC*HCl溶液(100mM)を加えて、混合物をRTにて5分間インキュベートした。
実施例1C.活性化された酸によるDNAのアシル化、一般的な手順
活性化された酸溶液を、反応性アミンハンドルに連結されたDNAオリゴにカップリングさせるために、フィルタープレート内の実施例1A由来の固定化されたDNAを、真空マニホールドで、70uLのDMF:MeOH 80:20中400mM DIPEAで3回洗浄してから、70uLのMeOHで3回洗浄した。次いで、フィルタープレートをゴム栓上に置いて、ウェルが流出するのを防いだ。各ウェルに、実施例1Bで調製した70uLの所望の活性化された酸溶液を加えて、ウェルを研和した。ウェルを金属テープシール(Corning,Cat.#6569)でシールして、インキュベートした(RT,1時間)。次いで、プレートからシールを外して、真空マニホールドを介して溶液を除去した。プレート底部をゴム栓でシールして、活性化された酸の新しいアリコート(70uL)を適切なウェルに加えて、研和して、プレート上部を金属テープシールでシールして、インキュベートした(RT、1時間)。インキュベーション後、プレートシールを外して、溶液を真空マニホールドによって除去して、ウェルを洗浄した(3×、70uL、80:20 DMF:MeOH)。
実施例1D.アミン保護基フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)の除去
DNA連結反応性アミンを、活性化された酸とカップリングさせ、反応させた(実施例1C)。Fmoc保護酸をアシル化したウェルについて、60uLの4-メチルピペリジン(20%v/v、DMF)を加えて、10分間インキュベートした。溶液を真空マニホールドによって除去して、ウェルを洗浄した(3×70uL DMF、3×70uL MeOH、3×70uL DI水)。プレートをスピンダウンして、微量の液体を除去した(1分、2000RPM)。この新たに修飾されたDNAオリゴを、溶出してもよいし(実施例1E)、追加のカップリングを行って(実施例1C~1Dに従う)化合物を伸長させてもよい。
実施例1E.合成的に修飾されたオリゴヌクレオチドのSEPHAROSE(登録商標)からの溶出、回収、および精製
SEPHAROSE(登録商標)樹脂に固定化されながらDNA連結反応性アミンを修飾する反応の後に、DNA化合物構築物を、分析および精製のためにウェルから収集プレート中に溶出してもよい。ウェルに33uLの溶出緩衝液(蒸留水中1.5M NaCl、50mM NaOH)を加えて、研和して、5分間インキュベートした。フィルタープレートをレシーバプレート上に置いて、遠心分離(1分、2000RPM)によって溶液を収集した。これらの工程をもう2回繰り返して、99uLの溶出緩衝液中に溶出DNAを得た。回収した溶離液に2.5uLの1M酢酸(最終濃度25mM)を加えて、溶離液が酸性になるのを防ぎながら50%のNaOHを中和した。注目する特定の化合物-DNA構築物に最適化したHPLC法を使用して、Agilent 1200 HPLCによってPhenomenex Clarity 2.6um Oligo-XT 100 Aカラム(50×2.1mm)でサンプルを精製した。
実施例1F.DNAに付加される全長コード化陽性対照分子の合成および生成。
当業者であれば、実施例1A~1E由来の合成分子で修飾されたDNAオリゴヌクレオチド等の修飾プライマーを利用して、より長いDNA構築物を生成できることを理解するであろう。BCA陽性対照を、記載のように選択したDNAオリゴヌクレオチドに合成した。精製した化合物-DNAハイブリッドを、プライマーとして、化合物の正体に特異的な全長鎖鋳型を使用する標準的なPCRに使用した。簡潔には、Za’-A(097-107)-Zbi-Bi-Zbf-Bf-Zci-Ci-Zcf-Cf-Zd-D001-Zfからなる鋳型鎖を、1uLの10uM化合物-Za-DNAハイブリッドに加えて、25uLのQ5 PCR反応にした。当業者であれば、最適化されたPCRプログラムを実行して、DNAコード化ライブラリコーディング部分の長さおよび組成を模倣した「完全長」234オリゴヌクレオチドコードを生成したことを理解するであろう。Thermo Scientific GeneJet PCR精製キットの標準プロトコルを用いて、生成物を精製した。
DNAに連結した、結合親和性が知られている化合物を生成および精製するために、修飾ヌクレオチドを利用して蛍光化合物を付着させて、DNAを可視化する。フルオロフォア(この実施例ではフルオレセイン)の付着は、結合親和性の決定を可能にし、そして表面、ゲル、またはサンプル上の化合物の位置を可視化するのに利用することもできることが当該技術において知られている。
2A.市販のアルキン修飾オリゴヌクレオチドを含有する修飾DNAコードの利用。
当業者によく知られているように、直交反応性ハンドル、この場合ではアルキンの利用により、注目する化合物から遠位部位への合成修飾が可能となる。蛍光化合物を生成するために、反応性アミン連結末端(5AmMC6)を有するアルキン修飾DNAヌクレオチド(i5OctdU)オリゴヌクレオチドを、実施例1B~1Eのように、所望の化合物(図6に示す)の合成に使用して、精製した。精製後、サンプルを、speed-vacによって乾燥させて、20uLのDI水中に溶解させた。この溶液に、10uLの7.3mM 5-FAMアジド(Lumiprobe,Cat.#C4130)を加えてから、80uLの新たに調製したクリック反応緩衝液(水中120mMホスファート、1.2mMアミノグアニジン、3mMトリス(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン、6mM硫酸銅、12mMアスコルビン酸ナトリウム)を加えて、インキュベートした(30分、室温)。インキュベーション後、80uLのクリッククエンチ緩衝液(脱イオン水中100mMトリス、10mM EDTA、0.005%Tween(登録商標)、0.002%SDS)に続いて500uLの結合緩衝液を加えた。Eppendorfチューブ溶液に、40uLのDEAE樹脂を加えて、穏やかに振盪しながらインキュベートした(20分、室温)。チューブをベンチトップ遠心分離機で1分間スピンダウンして、上清をピペッティングによって除去した。樹脂を50uLの水中に再懸濁させて、384ウェルフィルタープレートに移した。ウェルを真空マニホールド(3×70uL DI水、3×70uL MeOH、1×70uL DMSO、3×70uLメタノール、3×70uL水)で洗浄した。上記の手順を使用してDNAを溶出した(3×33uL溶出緩衝液を収集プレートに入れた)。10uLの100mM AcOHを使用して溶離液を中和した。標準的な方法を使用するHPLCを使用してサンプルを精製した。
1.可溶性タンパク質による陽性対照蛍光偏光、一般的な手順
図6は、使用した陽性対照化合物を示す。
DNAに共有結合的に繋がれた化合物は、非修飾の天然化合物と比較して、修飾された、より高いもしくはより低い、または変化していない親和性プロファイルを有し得ることが当業者によって理解されるであろう。これに取り組むために、一般的な結合アッセイ、蛍光偏光を使用して、直交化学を利用して蛍光標識することができるDNAオリゴヌクレオチドに繋がれた部分として合成した、選択した陽性対照分子を評価した。DNA上の陽性対照化合物(図6に示す)を1×トリスホウ酸緩衝液(45mM、pH8.19)中に個々に希釈して、1mLの緩衝液中20nMの最終濃度にした。この20nMストック溶液の1:1希釈を行って、10nMストック溶液を生成した。BCA-IIの100uMストック溶液を、1×トリスホウ酸緩衝液中に作製した。384ウェルポリスチレンF底小容量ハイベース非結合黒色プレート(Greinerbio-one,Cat.#784900)に、適切な化合物の10uLの20nMストック溶液を、カラム1において加えた。カラム2~20において、10uLの適切な化合物10nMストック溶液を加えた。カラム1に、10uLの100uMストックBCA-IIタンパク質溶液を加えて、ウェルを研和して、10uLのウェルをウェルカラム2に移して、ピペッティングによって混合した。このプロセスをウェル20まで繰り返した。この手順により、その後の各ウェルにおいて、ストックタンパク質濃度の1:1希釈が得られ、これによって、50uM~95pMの範囲が得られる一方、蛍光標識されたDNA-化合物の濃度は、一定の10nMのままである。485/530の励起/発光および予めプログラムされた蛍光偏光法を使用して、Spectramax M 5プレートリーダーによってプレートを読んだ。得られた値をグラフ化して、結果をヒルの式に適合させて、ナノモル濃度値で記録される結合親和性(Kd)を得た。
実施例4A:固定化用の捕捉部分による標的タンパク質の標識化を効率的に生成すること
当業者によって認識されるように、タンパク質の修飾は広く当り前に使用されており、本実施例では、ウシ赤血球由来の炭酸脱水酵素アイソザイムIIをビオチンで修飾して、ストレプトアビジン被覆粒子に対する標的の捕捉を可能にした。これを達成するために、ウシ赤血球由来の25mg(0.833μmol)の炭酸脱水酵素アイソザイムII(sigma C2552-25MG)を、450uLのPBS(pH7.8)に加えた。この溶液に、550uLのPBS(pH7.8)中に溶解した1.5mg(2.5μmol、3当量。)のNHS-dPeg4-ビオチン(Sigma QBD 10200)を加えた。この混合物(タンパク質の最終濃度800uM)を4℃にて一晩置いた。このビオチン化タンパク質を、更なる工程において精製することなく使用した。
実施例4B:ストレプトアビジン標識アガロース樹脂上への固定化標的の生成
ビオチン化標的タンパク質(ウシ炭酸脱水酵素アイソザイムII)を、注目する樹脂上に固定化した。これを達成するために、50mLファルコンチューブ中に、10.6mLのHigh Capacityストレプトアビジンアガロース樹脂(Thermo #20361)の50%スラリーを加えた。樹脂を、以下の手順によってトリスホウ酸緩衝液(pH8.19)で2回洗浄した:スラリーを1000RPMにて1分間遠心分離して、上清をピペットによって除去して、これに5mLのトリスホウ酸緩衝液を加え、そして手順を繰り返した。2回目の洗浄液を除去した後に、先のように調製した1mLの800uMビオチン化ウシ炭酸脱水酵素を加えた。このスラリーを、穏やかな撹拌によって混合して、室温にて2時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを遠心分離して(1000RPM、1分)、樹脂が「湿った」ままになるように注意しながら、上清を慎重に除去した。
実施例4C:代替のストレプトアビジン標識樹脂粒子上への固定化標的の生成。
当業者によって認識され得るように、実施例4Bに記載する固定化技術は、代替の樹脂タイプに対応するように容易に変更することができる。本実施例では、ストレプトアビジン被覆シリカ粒子(Sphero SVSIP-05-5 0.4~0.6um)、ストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子(Sphero SVP-05-10 0.4~0.69um)、およびストレプトアビジン被覆アガロース粒子(より低いローディング容量Thermofisher 20347)を、先と同じ手順に供して、標的タンパク質で被覆した粒子を得た。
実施例4D 低融点アガロースおよび標的標識粒子を利用したアフィニティ電気泳動保持アガロース混合物の生成。
標的被覆粒子を、電気泳動に適した多孔質媒体に固定化するには、当業者であれば、サンプル調製の温度を制御して、標的のアンフォールディングを妨げることができることを認識するであろう。この制御を達成して、分離媒体中に固定化標的粒子を生成するために、低融点アガロースを使用した。4グラムのUltraPure低融点アガロース(Invitrogen 16520)を含有するビーカーに、100mLの0.5×トリスホウ酸緩衝液(pH8.19)を加えて、4%アガロース溶液を生成した。ビーカーを、全てのアガロースが溶解して、最小限の気泡が観察されるまで、高で1分間隔で、間に短時間撹拌しながら、マイクロ波照射した。溶解したゲルを、2本の50mLファルコンチューブに移して、冷却して、加熱ブロック内で42℃にて維持した。それとは別に、2%低融点アガロース溶液を、上記のように、2グラムの低融点アガロースおよび100mLの0.5×トリスホウ酸緩衝液(pH8.19)を使用して調製した。標的タンパク質をロードした、5.3mLの沈降した高容量ストレプトアビジン樹脂のサンプルを、加熱ブロック中で42℃に温めた。温めた標的粒子に、8mLの4%低融点アガロースを42℃にて加えた。スラリーを、ピペットチップによって徹底的に、気泡が入らないように注意しながら混合する。この混合物は、カスタム電気泳動モールド(半円筒4mm高さ8mm断面)を使用して、9cmアフィニティ電気泳動保持レーンの4つのレーンを生成することができる。認識されるように、この調製物の規模は、標的の利用可能性、粒子の利用可能性、または所望のレーンの数および長さに応じて、より少ない量またはより多い量に調整することができる。調製した2%アガロース溶液を利用して、アガロース保持レーン内にサンプルのローディングポイントを生じさせた。手短に言うと、ローディングコーム(以下に記載する寸法)をゲルモールドの上部から1cmに置き、そして2%アガロースを加えて、半円筒形のロードポイントを取り囲む。2%アガロースを室温にて固化させて、ロードコームをゲルから慎重に取り外すと、各レーン内に、ライブラリまたは所望のサンプルを含有する15uLのローディング溶液を保持することができる凹部が生じる。
モールドは、無料のオンラインソフトウェアTINKERCAD(登録商標)で設計した。設計仕様は、以下の通りである;ベースL×W×D 19×9×1深さ、ベースを2つの側部の壁でひとまとめに挟んだ(bracket)(19×0.5×0.8cm)。ベースの上に、19×0.8×0.4cmの寸法を有する6つの等間隔(0.5cm間隔)の半円筒(図3、302参照)を印刷した。画像に示す「ローディングコーム」を、寸法L×W×Dが8.8×1×0.4cmでベース上に印刷した。「ローディングコームベース」上に、高さ0.3cm、幅0.6cmの6つの半円筒を印刷し、半円筒間の間隔は0.6cmであり、半円筒をひとまとめに挟むのは、注がれるモールドの縁部をおおって適合する2つの矩形(0.3×0.3×0.3×cm)であり、これによりコームは、調製されたモールド内の中央に着座して、半円筒をハーフパイプ内の中央に配置させる。印刷は、一般的に利用されるABS(アクリロニトリルブタジエンスチレン)印刷材料によるSTRATASYS(登録商標)UPRINT(登録商標)SE Plus 3Dプリンタを利用するUPSストアによって実行した。
レーン調製および画像化のための分割選択モールドを生成するために、先ず、上記の3d印刷モールドに、エアロゾルSMOOTH-ON(登録商標)Universal Mold Releaseを軽く噴霧して、3d印刷モールド上に均一な軽い被覆を生じさせた。モールドの開いた末端を、マスキングテープを使用してシールして、SMOOTH-ON(登録商標)CLEARFLEX(登録商標)50(製造業者の指示に従って、徹底的に混合して、2分間超音波処理して気泡を除去して、1:2 A:Bの重量比で調製した)を、気泡が入らないように慎重に注いで、一晩固化させた。固化後、clear-flex50モールドを慎重に取り出して、アガロースゲルで充填することができる半円筒レーンを生成した。モールドを水および70%エタノールで十分に洗浄して、さらに変更することなく利用した。
分割選択ゲルレーン
実施例4E.ローディングポイントを有する完全アフィニティ電気泳動保持レーンの生成。
完全アフィニティ電気泳動保持レーン構築物を生じさせるために、標的をロードした保持粒子を含有する多孔質アガロース中へのサンプルの導入を可能にするためのサンプルローディングポイントを生成してもよい。特注の印刷されたロードポイントコームを使用して、先に調製した2%低融点アガロースを、フィルタープラグによってブロックしたモールド中に注ぐ。ゲルを室温に冷却して、アガロースを固化させて、コームを慎重に取り外す。ロードウェルを、いかなる不一致も穴もないか検査する。コームをローディングウェル領域中に静かに再配置して、過剰なゲルを切って取り除く。別の新しいフィルタープラグを、ロード領域の縁部から適切な距離(約1~9cmまたはあらゆるカスタム距離)に置いて、ロードした標的粒子/低融点アガロース混合物をレーン中にピペットで入れて、室温に冷却して、ゲルの「捕捉領域」を生じさせるように固化させる。フィルタープラグを切って取り除いて、「捕捉領域」の端部に2%LMPアガロースを加えてレーンを端部まで満たして、保持「捕捉領域」に遭遇した後にサンプル分子が移動するための追加の距離を提供する。
実施例5A.標的活性電気泳動保持レーンを通る蛍光陽性対照電気泳動
a.図7A、図7B、および図8A~8D
アフィニティクロマトグラフィの当業者によって理解され得るように、生成されたアフィニティ電気泳動保持レーンは、標的と相互作用して、電気泳動中にゲルを通る動きを遅らせる分子の共鳴時間に依存する分画として機能することとなる。高ローディングストレプトアビジンアガロースおよび固定化標的からなる標的ウシ炭酸脱水酵素II捕捉領域を有するゲルレーンを、上記のように生成した。当該レーンに、12μLの単一陽性対照化合物(図6)、または蛍光標識陽性対照(図6)の、200ngの各化合物との混合物(図8A、図8B、図8C、図8D、図9、および図10)、および2μLのゲルローディング緩衝液をロードした。ゲルを40Vで18時間泳動して、一定の間隔で画像化して、青色プレートを使用するBio-Rad Gel Dock EZ Imagerで分離の進行を追跡した。図6に見られるように、個々の化合物実験は、合成的に修飾されたオリゴヌクレオチドの親和性に対応する保持因子(Rf)をもたらした。これらの対照分子の混合物を、同様にして加えて分離することができた(図8A~8D、図9、および図10)。
実施例5B.異なる粒子タイプおよびローディング密度のアフィニティ電気泳動保持レーンを通る蛍光陽性対照電気泳動。
a.図10
可変的な密度および粒子タイプを有する分離媒体の使用により、形質の増強の可能性を有する代替的な保持能力が提供される。これを評価するために、標的を3cmで捕捉した以下の保持領域を含有するレーンを生成した:1.標的を捕捉したストレプトアビジン標識ポリスチレン、2.標的を捕捉したストレプトアビジン標識シリカ、3.高ローディングストレプトアビジンアガロース、4.低ローディングストレプトアビジンアガロース(粒子密度は3と同一であった)、5.レーン3に対して1/4の密度の高ローディングストレプトアビジンアガロース(総標的量は4と同一であった)。これにより、粒子タイプ、表面ディスプレイ標的密度、および標的粒子密度を探索する。親和性が362nM(化合物10)および7160nM(化合物5)である化合物、およびトレーサーとしてフルオレセインを使用して、実験を行った。電気泳動を、90Vにて3時間行った。
実施例5C.全長コードディングオリゴヌクレオチドおよびコード化分子の分離
本方法の有用性は、形質陽性化合物を形質陰性化合物から分離し、かつ形質陽性化合物を、標的に対する親和性によって分画するようにして、形質陽性化合物を形質陰性化合物から分離し、かつ配列決定して、コーディング領域を、そしてそれによってコード化化合物を識別する能力にある。電気泳動の前に、ゲル装置をDI水で洗浄する。装置を、2Lの0.5×TB緩衝液で満たして、水浴(ゲル装置のラインの下)のデリ冷蔵庫内に置いて、4℃に冷却する。レーンがローディングされているゲルモールドを装置に入れて、30分間冷却した。調製した分割選択ゲル(標的タンパク質をロードした高ローディングストレプトアビジンアガロースを使用する、3cmの捕捉領域)に、2uLの紫色のゲルローディング緩衝液(NEB #B7024S)、100ngのダミーライブラリ(1600万個のユニークなライブラリコードからなるが、合成的に修飾された化合物ではない)、および、実施例1Fにおいて生成され、そしてダミーライブラリサンプルから独立して、かつユニークにコード化されるウシ炭酸脱水酵素IIの各陽性対照(表XA)の50,000コピーを含有する12uLのサンプルを加えた。サンプルを90Vにて5時間電気泳動した。
実施例5D 保持媒体の物理的パーティション化
当業者によって認識され得るように、クリーンルーム技術の必要性は、サンプルの相互汚染を防ぐために最も重要である。これを達成するために、ゲルを泳動後に層流フード中に移す。アフィニティ選択ゲルを、1mmの44スライスにパーティション化して、滅菌PCRプレートに移す。人差し指の間に保持されて、ゲルスライス上に押し下げられる、12枚の脱脂したカミソリ刃のスタックを使用して、スライスを生成する。PCRウェル位置は、ゲルスライスの位置に直接対応する。
実施例5E アフィニティ電気泳動保持アガロースゲルレーンからのDNAオリゴヌクレオチドの回収
パーティション化されたスライス各々からコーディングDNAのPCRコピーを生成するために、DNAを、PCR増幅に適した形態で回収してもよい。これを達成するために、先で生成した個々のゲルスライスを含有するPCRプレートを、サーモサイクラー内で95℃に5分間加熱する。プレートをスピンダウンして(2000RPM、1分)、各ウェルに、3uLの10×B-アガラ-ゼI緩衝液、および、50,000分子の陽性対照DNA配列を含有する5uLの水を加えて、30uLの総容量を得る。プレートを再び95℃に10分間加熱して、42℃の加熱ブロック内に置く。サンプルを、42℃の加熱ブロックで10分間保持してから、各ウェルに2uLのB-アガラーゼ酵素(New England BioLabs Cat# M0392L)を加える。次いで、プレートをインキュベートする(1時間、42℃)。インキュベーション後、プレートをスピンダウンする(2000RPM、1分)。必要に応じて、プレートをシールして-20℃にて保存することができる。この手順は、もはやゲル化することができず、かつPCRによって進行工程において増幅し得るサンプルを生成する。
実施例5F 特定のインデックス付けオリゴヌクレオチドプライマーのPCR導入による個々のゲルスライスのインデックス付け(indexing)
アフィニティ選択ゲルに関して、回収したDNAの位置を識別するために、インデックス付けオリゴヌクレオチドを、親コーディングDNA鎖の全ての増幅されたPCRコピー上に導入する。これを、ウェル上で生成された溶解ゲルサンプルから達成するために、ウェルを研和して、15uLを新しい96ウェルプレートに移す。各ゲルスライスは、zd’-D002’~D096’-Zfインデックスで個別にインデックス付けされる。Q5 High-Fidelity 2×Master Mix(NEB M 0492L)を用いて、合計5mLのマスターミックスを調製する。各ウェルに、1.25uLのD-インデックス付けプライマー(10uM)および1.25uLのIllumina-Za Primer(10uM)を加えて、Protocol Illum_Za_T73で12サイクル実行する。
実施例5G 配列決定のためのIllumina ZaおよびIllumina Zfプライマーセットのインデックス導入を伴う事後増幅(post-amplification)
コーディング領域およびインデックス付けされた領域を配列決定して、コード化された化合物構造を適切に割り当てるために、配列決定プライマーセットを導入してもよい。Illuminaプライマーセットを、標準的なPCRプロトコルを用いて導入する。簡潔には、インデックス付けされた各ゲルスライスウェルから2uLを取り出して、新しい96ウェルPCRプレートに移す。これらのウェルに、Illuminaプライマーセットを含有する23uLのQ5マスターミックスを加える。プロトコルIllum_Za-T73を用いて、サンプルを10サイクル実行する。増幅後、各ウェル由来の2uLアリコートをプールして、10uLのプールしたPCR反応あたり1uLのExo-I(NEB M 0293-L)を加える。組み合わせたサンプルを、37℃にて30分間インキュベートしてから、80℃にて15分間熱不活化する。組み合わせた、エキソヌクレアーゼ処理したサンプルを、GeneJet PCRクリーンアップキット(Thermo Cat.#K0701)を使用して精製する。サンプルの純度を、2%アガロースゲルおよびデンシトメトリを使用して評価して、DNAの量を定量化する。精製したDNAを、NGS配列決定に提出する。
実施例5H 配列決定のためのIllumina ZaおよびIllumina Zfプライマーセットのインデックス導入を伴う事後増幅
a.図11A
実施例5Fで調製したDNAサンプルを、DNA配列決定に供する。事後加工方法は、サンプル中の陽性対照分子および位置インデックスをコード化するA097-A107コーディング領域を単離かつ識別して、コードが由来するスライスを決定する。配列決定カウントをゲルスライスによってプロットし(図11A)、親和性が最良である化合物は、親和性がより低い化合物と比較して、高度に保持されており、そして単離、配列決定、かつ識別することができる。
Claims (15)
- 少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する方法であって:
分離媒体を提供する工程であって、前記分離媒体は、少なくとも1つの標的分子を含有する、工程と;
少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、前記分離媒体に導入する工程であって、前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも1つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と;
前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも2つの別個の位置に分離することによって、少なくとも2つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と;
前記分離媒体由来の前記少なくとも2つの別個の位置の少なくとも1つの位置をセグメント化して、少なくとも1つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも2つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と;
前記少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の実行を可能にする工程と;
前記少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コーディング部分に対してPCRを実行することによって、前記少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも1つのコード化部分を増幅する工程と;
前記少なくとも1つの位置、および前記少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記少なくとも1つのコード化部分の正体を加工することによって、前記少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する工程と
を含む、方法。 - 前記少なくとも1つの標的分子は、細胞、オリゴヌクレオチド、タンパク質、酵素、リボソーム、およびナノディスクからなる群より選択される少なくとも1つのメンバーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分離媒体は、粒子、ポリマー、および分離表面からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーを含有し、前記少なくとも1つの標的分子は、前記分離媒体、前記粒子、前記ポリマー、および前記分離表面の少なくとも1つに連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記粒子は、ポリマー粒子または金属コロイドを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ポリマーは、前記少なくとも1つの標的分子の最低重量標的分子の10%またはそれを超える分子量を有する、請求項3に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの標的分子と、前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分との間の少なくとも1つの標的活性に基づいて、前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの標的活性は、前記少なくとも1つの標的分子による前記少なくとも1つのオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分の化学修飾を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つのコーディング領域を含有し、
前記少なくとも1つのコード化部分は、少なくとも2つの位置構築ブロックを含有し、
前記少なくとも1つのコード化部分の各位置構築ブロックは、前記オリゴヌクレオチドの1~5個のコーディング領域によって識別され、
前記分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式(I)(I)G-L-B
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
Bは、少なくとも2つの構築ブロックを含有するコード化部分であり;
Lは、GをBに作動可能に連結するリンカーであり;
B中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Gの1~5個のコーディング領域によって別々に識別される、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式(II)
(II)[(B1)M-L1]O-G-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
Gは、少なくとも2つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をGに作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をGに作動可能に連結するリンカーであり;
Oは0または1であり;
Pは0または1であるが;
OおよびPの少なくとも1つが1であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、Gの1~5個のコーディング領域によって識別される、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式(III)
(III)[(B1)M-L1]O-G’-[(L2-(B2)K]P
に従う構造を有し、式中、
G’はオリゴヌクレオチドを含み、G’は、少なくとも2つのコーディング領域および少なくとも1つのヘアピンを含み;
B1は位置構築ブロックであり、Mは1~20の整数を表し;
B2は位置構築ブロックであり、Kは1~20の整数を表し、B1およびB2は同じであるか、または異なっており、MおよびKは同じであるか、または異なっており;
L1は、B1をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
L2は、B2をG’に作動可能に連結するリンカーであり;
Oは、ゼロ~5の整数であり;
Pは、ゼロ~5の整数であるが;
OおよびPの少なくとも1つが、1~5の整数であることを条件とし;
位置Mにおける各位置構築ブロックB1および/または位置Kにおける各位置構築ブロックB2は、G’の1~5個のコーディング領域によって識別される、請求項1に記載の方法。 - 第1の分離処理を前記分離媒体にわたって第1の方向に施すことによって、前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも2つの別個の位置に分離する工程をさらに含み、
前記第1の分離処理は、第1の電圧プロトコルおよび第1の持続時間を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記分離媒体由来の前記少なくとも1つの位置を、前記第1の方向に対して実質的に垂直な第1のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも1つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 第2の分離処理を前記分離媒体にわたって第2の方向に施すことによって、前記少なくとも2つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体の少なくとも2つの別個の位置に分離することをさらに含み、前記第2の方向は、前記第1の方向に対して実質的に垂直であり、
前記第2の分離処理は、第2の電圧プロトコルおよび第2の持続時間を含む、請求項13に記載の方法。 - 前記分離媒体由来の前記少なくとも1つの位置を、前記第1のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第2のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも1つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも1つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
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