JPWO2020186174A5

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Publication number: JPWO2020186174A5
Application number: JP2021555389A
Authority: JP
Publication date: 2023-03-20

Description

一実施形態では、本方法は、第１の分離処理を分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程をさらに含み、第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む。一実施形態では、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、第２の分離処理を分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することをさらに含み、第２の方向は、第１の方向に対して実質的に垂直であり、第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む。一実施形態では、本方法は、分離媒体由来の少なくとも１つの位置を、第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する方法であって：
分離媒体を提供する工程であって、前記分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する、工程と；
少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、前記分離媒体に導入する工程であって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と；
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と；
前記分離媒体由来の前記少なくとも２つの別個の位置の少なくとも１つの位置をセグメント化して、少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と；
前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実行を可能にする工程と；
前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コーディング部分に対してＰＣＲを実行することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅する工程と；
前記少なくとも１つの位置、および前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記少なくとも１つのコード化部分の正体を加工することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する工程と
を含む、方法。
（項目２）
前記少なくとも１つの標的分子は、細胞、オリゴヌクレオチド、タンパク質、酵素、リボソーム、およびナノディスクからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記分離媒体は、粒子、ポリマー、および分離表面からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含有し、前記少なくとも１つの標的分子は、前記分離媒体、前記粒子、前記ポリマー、および前記分離表面の少なくとも１つに連結されている、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記粒子は、ポリマー粒子または金属コロイドを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ポリマーは、前記少なくとも１つの標的分子の最低重量標的分子の１０％またはそれを超える分子量を有する、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記少なくとも１つの標的分子と、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分との間の少なくとも１つの標的活性に基づいて、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１つの標的活性は、前記少なくとも１つの標的分子による前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分の化学修飾を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、
前記少なくとも１つのコード化部分は、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有し、
前記少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックは、前記オリゴヌクレオチドの１～５個のコーディング領域によって識別され、
前記分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（Ｉ）（Ｉ）Ｇ－Ｌ－Ｂ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂは、少なくとも２つの構築ブロックを含有するコード化部分であり；
Ｌは、ＧをＢに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｂ中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Ｇの１～５個のコーディング領域によって別々に識別される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩ）
（ＩＩ）［（Ｂ _１） _Ｍ－Ｌ _１］ _Ｏ－Ｇ－［（Ｌ _２－（Ｂ _２） _Ｋ］ _Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂ _１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ _２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ _１およびＢ _２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ _１は、Ｂ _１をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ _２は、Ｂ _２をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは０または１であり；
Ｐは０または１であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが１であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ _１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ _２は、Ｇの１～５個のコーディング領域によって識別される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）［（Ｂ _１） _Ｍ－Ｌ _１］ _Ｏ－Ｇ’－［（Ｌ _２－（Ｂ _２） _Ｋ］ _Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇ’はオリゴヌクレオチドを含み、Ｇ’は、少なくとも２つのコーディング領域および少なくとも１つのヘアピンを含み；
Ｂ _１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ _２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ _１およびＢ _２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ _１は、Ｂ _１をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ _２は、Ｂ _２をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは、ゼロ～５の整数であり；
Ｐは、ゼロ～５の整数であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが、１～５の整数であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ _１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ _２は、Ｇ’の１～５個のコーディング領域によって識別される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
第１の分離処理を前記分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程をさらに含み、
前記第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記分離媒体由来の前記少なくとも１つの位置を、前記第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
第２の分離処理を前記分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することをさらに含み、前記第２の方向は、前記第１の方向に対して実質的に垂直であり、
前記第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記分離媒体由来の前記少なくとも１つの位置を、前記第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、項目１４に記載の方法。

Claims

少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する方法であって：
分離媒体を提供する工程であって、前記分離媒体は、少なくとも１つの標的分子を含有する、工程と；
少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の混合物を含有するサンプルを、前記分離媒体に導入する工程であって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、少なくとも１つのコード化部分に作動可能に連結されたコーディング部分を含む、工程と；
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離することによって、少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を形成する工程と；
前記分離媒体由来の前記少なくとも２つの別個の位置の少なくとも１つの位置をセグメント化して、少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を含む少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも２つの異なる分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子から前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫する工程と；
前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を加工して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実行を可能にする工程と；
前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コーディング部分に対してＰＣＲを実行することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の少なくとも１つのコード化部分を増幅する工程と；
前記少なくとも１つの位置、および前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の前記少なくとも１つのコード化部分の正体を加工することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子の標的活性を決定する工程と
を含む、方法。
前記少なくとも１つの標的分子は、細胞、オリゴヌクレオチド、タンパク質、酵素、リボソーム、およびナノディスクからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１に記載の方法。
前記分離媒体は、粒子、ポリマー、および分離表面からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含有し、前記少なくとも１つの標的分子は、前記分離媒体、前記粒子、前記ポリマー、および前記分離表面の少なくとも１つに連結されている、請求項１に記載の方法。
前記粒子は、ポリマー粒子または金属コロイドを含む、請求項３に記載の方法。
前記ポリマーは、前記少なくとも１つの標的分子の最低重量標的分子の１０％またはそれを超える分子量を有する、請求項３に記載の方法。
前記少なくとも１つの標的分子と、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分との間の少なくとも１つの標的活性に基づいて、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を分離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つの標的活性は、前記少なくとも１つの標的分子による前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドコード化分子の前記コード化部分の化学修飾を含む、請求項６に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのコーディング領域を含有し、
前記少なくとも１つのコード化部分は、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有し、
前記少なくとも１つのコード化部分の各位置構築ブロックは、前記オリゴヌクレオチドの１～５個のコーディング領域によって識別され、
前記分離媒体は、多孔質ゲルおよび緩衝系を含有する、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（Ｉ）
（Ｉ）Ｇ－Ｌ－Ｂ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、位置構築ブロックをコードする少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂは、少なくとも２つの位置構築ブロックを含有するコード化部分であり；
Ｌは、ＧをＢに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｂ中の各位置構築ブロックは、位置に従って、Ｇの１～５個のコーディング領域によって別々に識別される、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩ）
（ＩＩ）［（Ｂ_１）_Ｍ－Ｌ_１］_Ｏ－Ｇ－［（Ｌ_２－（Ｂ_２）_Ｋ］_Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇは、位置構築ブロックをコードする少なくとも２つのコーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂ_１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ_２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ_１およびＢ_２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ_１は、Ｂ_１をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ_２は、Ｂ_２をＧに作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは０または１であり；
Ｐは０または１であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが１であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ_１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ_２は、Ｇの１～５個のコーディング領域によって識別される、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子は、式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）［（Ｂ_１）_Ｍ－Ｌ_１］_Ｏ－Ｇ’－［（Ｌ_２－（Ｂ_２）_Ｋ］_Ｐ
に従う構造を有し、式中、
Ｇ’は、位置構築ブロックをコードする少なくとも２つのコーディング領域および少なくとも１つのヘアピンを含むオリゴヌクレオチドを含み；
Ｂ_１は位置構築ブロックであり、Ｍは１～２０の整数を表し；
Ｂ_２は位置構築ブロックであり、Ｋは１～２０の整数を表し、Ｂ_１およびＢ_２は同じであるか、または異なっており、ＭおよびＫは同じであるか、または異なっており；
Ｌ_１は、Ｂ_１をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｌ_２は、Ｂ_２をＧ’に作動可能に連結するリンカーであり；
Ｏは、ゼロ～５の整数であり；
Ｐは、ゼロ～５の整数であるが；
ＯおよびＰの少なくとも１つが、１～５の整数であることを条件とし；
位置Ｍにおける各位置構築ブロックＢ_１および／または位置Ｋにおける各位置構築ブロックＢ_２は、Ｇ’の１～５個のコーディング領域によって識別される、請求項１に記載の方法。
第１の分離処理を前記分離媒体にわたって第１の方向に施すことによって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体内の少なくとも２つの別個の位置に分離する工程をさらに含み、
前記第１の分離処理は、第１の電圧プロトコルおよび第１の持続時間を含む、請求項１に記載の方法。
前記分離媒体由来の前記少なくとも１つの位置を、前記第１の方向に対して実質的に垂直な第１のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を含む前記少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
第２の分離処理を前記分離媒体にわたって第２の方向に施すことによって、前記少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドコード化分子を、前記分離媒体の少なくとも２つの別個の位置に分離することをさらに含み、前記第２の方向は、前記第１の方向に対して実質的に垂直であり、
前記第２の分離処理は、第２の電圧プロトコルおよび第２の持続時間を含む、請求項１３に記載の方法。
前記分離媒体由来の前記少なくとも１つの位置を、前記第１のセグメント化方向に対して実質的に垂直な第２のセグメント化方向にセグメント化して、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を含む前記少なくとも１つの分解されたセグメントを形成することによって、前記少なくとも１つの分解されたオリゴヌクレオチドコード化分子を収穫することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。