KR20210139259A

KR20210139259A - 면역조절 중간엽 줄기 세포

Info

Publication number: KR20210139259A
Application number: KR1020217029168A
Authority: KR
Inventors: 잔 스파스; 사라 브룩스
Original assignee: 글로벌 스템 셀 테크놀로지
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2021-11-22
Also published as: CA3132414A1; BR112021017738A8; JP2022524764A; MX2021010739A; EP3938494A1; CN113677789A; WO2020182935A1; BR112021017738A2; US20220154147A1; AU2020235912A1

Abstract

본 발명은 중간엽 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성이고; MHC 클래스 II 분자에 대하여 음성인 분리된 중간엽 줄기 세포로서, 상기 세포는 염증 환경 또는 조건에 존재할 때 면역조절 프로스타글란딘 E2 사이토카인을 분비하는, 분리된 중간엽 줄기 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 세포를 포함하는 세포 조성물, 및 면역-관련 질환 및 염증 조건 치료에서 그 용도에 관한 것이다.

Description

면역조절 중간엽 줄기 세포

본 발명은 분리된 중간엽 줄기 세포 및 상기 중간엽 줄기 세포를 포함하는 세포 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 세포 조성물은 면역 체계를 조절하기 위하여 면역-관련 질환 및 염증 과정의 치료에 사용될 수 있다.

중간엽 줄기 세포(MSCs: mesenchymal stem cells)는 자기 재생, 클론 세포군의 생산, 및 다중계통 분화를 특징으로 하는 다능성 세포이다. 이는 거의 모든 조직에 존재하며 조직 수복 및 재생에 있어서 중요한 역할을 한다. 또한, MSCs는 선천성 및 적응 면역계 모두에서 면역 세포와의 상호 작용을 통하여 광범위한 면역조절 특성을 가져, 다양한 이펙터 기능의 면역억제를 야기한다. 이들의 면역조절 기능은 직접적인 세포-대-세포 접촉, 사이토카인의 분비 및/또는 이들 메커니즘 모두의 조합에 의하여 발휘된다.

면역 반응과 MSC 상호 작용의 메커니즘은 다인성이고, 직접적인 세포-대-세포 접촉, 사이토카인 분비 및/또는 이들 메커니즘 모두의 조합에 의하여 발휘된다. MSCs는 B 세포, T 세포, 수지상 세포(DCs), 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식 세포를 포함하는 많은 종류의 면역 세포와 상호 작용하는 능력을 가진다. 다른 한편으로, 상기 세포-세포 접촉에 의존하는 상호 작용은 MSC-조절 면역 억제를 유도하기 위하여 가용성 면역 인자의 분비에 의존한다. 다수의 면역-조절 인자, 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 이러한 특정한 조절자는 염증 반응을 조절하고 면역 프로파일의 균형을 유지한다.

MSCs, 특히 동종(allogenic) MSCs는 많은 질환에서 세포요법에 대한 큰 잠재력을 가지나, 숙주 면역 반응이 세포를 거부하므로 조직 치유 효능 및/또는 질환 결과가 보증되지 않는다. 예를 들어, 특정 MSCs를 선택함으로써, MSC 면역억제 잠재력을 개선하고 생착(engraftment)을 연장하기 위한 많은 노력이 행하여져 왔다.

US 2011 031 149 6은 상처 치유 또는 골절 치유를 촉진하기 위한 MSCs의 조성물, 및 MSCs를 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는 상처 치유 또는 골절 치유를 촉진하는 방법을 제공한다.

US 2014 001 778 7은 염증을 선택적으로 촉진 또는 억제하는 분리, 활성화된 MSCs, 및 이를 생산 및 이용하는 방법을 제공한다. US '787은 줄기 세포 기반 치료법의 개선을 위하여 세포를 균일하게 제조하기 위하여 MSCs의 면역 조절 반응에 영향을 미치는 특정 Toll 유사 수용체의 자극을 이용한다.

EP 342 936 0은 하나 이상의 마커의 발현에 근거하여 증가된 효능을 가지는 MSCs 및 그의 MSCs가 증가된 효능을 가지는 기증자를 선택하는 방법을 제공한다.

EP 106 605 2는 숙주의 이식 거부 반응을 감소 또는 억제하기에 효과적인 양의 MSCs로 수용자를 처리함으로써 수용자 내 이식에 대한 면역 반응을 감소시키는 방법을 개시한다. EP'052는 동종항원에 대한 T 세포 반응 억제에 주력한다.

그러나, 큰 치료 안전성 및 효능을 가지는 개선된 면역조절 MSC에 대한 요구가 당업계에 남아 있다.

본 발명은 대표적인 염증 환경에서 특정 면역-관련 특성을 특징으로 하는 분리된 MSC를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 청구항 1에 따른 분리된 MSC를 제공한다.

두번째 측면에서, 본 발명은 분리된 MSCs를 포함하는 청구항 7에 따른 세포 조성물을 제공한다.

최종 측면에서, 본 발명은 청구항 12에 따른, 면역-관련 질환 및 염증 과정의 치료에 사용하기 위한 세포 조성물을 제공한다.

본 발명은 특정 면역조절 특징을 가지는 분리된 MSCs, 상기 분리된 MSCs를 포함하는 세포 조성물, 및 면역 관련 질환 및 염증 과정의 치료를 위한 그의 용도를 제공한다.

도 1은 MSCs 및 PBMCs에 의한 PgE2의 증가된 분비가 평가되는, 효소 면역 측정(ELISA) 실험의 도해적 표현이다.
도 2는 MSCs에 의한 TGF-β의 증가된 발현이 기록되는, ELISA 실험의 도해적 표현이다.
도 3은 MSCs 및 PBMCs에 의한 IL-6의 증가된 분비가 평가되는, ELISA 실험의 도해적 표현이다.
도 4는 PBMCs에 의한 TNF-α의 감소된 발현을 보이는, ELISA 실험의 도해적 표현이다.
도 5는 말로부터 분리된 MSCs 상에 MHC 클래스 II 분자의 부재를 보인다.

본 발명은 특정 면역조절 특징을 가지는 분리된 MSCs에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상기 분리된 MSCs를 포함하는 세포 조성물, 및 면역 관련 질환 및 염증 과정의 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 분리된 MSCs는 면역조절 특성을 가지며, 따라서 숙주의 면역원성 반응이 피해지므로 세포 이식에 바람직하다.

달리 정의하지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어를 포함하는 본 발명을 개시하는데 사용되는 모든 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 추가적인 지침에 의하여, 본 발명의 교시에 대한 보다 나은 이해를 위하여 용어의 정의가 포함된다.

본원에 사용되는 다음 용어들을 다음과 같은 의미들을 가진다:

본원에 사용되는 단수 형태는 문맥상 반대임이 분명하지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 예로서, "구획"은 하나 또는 하나 보다 많은 구획을 의미한다.

본원에 사용되는, 변수, 양, 시간 지속 기간 등과 같은 측정 가능한 값에 적용되는 "약"은, 그러한 변화가 본 발명에서 수행에 적절한 한에 있어서는, 명시된 값의 및 그로부터 +/-20% 이하, 바람직하게 +/-10% 이하, 더 바람직하게 +/-5% 이하, 더 바람직하게 +/-1% 이하, 및 여전히 더 바람직하게 +/-0.1% 이하의 변화를 포함하는 것으로 여겨진다. 그러나, 수식어 "약"이 적용되는 값 자체 또한 구체적으로 개시되는 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용되는 "포함", "포함하는" 및 "포함하다"는 "함유", "함유하는" 및 "함유하다"와 동의어이고, 뒤따라 오는 것, 예를 들어 성분의 존재를 명시하는 포괄적 또는 개방형(open-ended) 용어이며, 당업계에 공지되거나 개시된 추가적인 인용되지 않은 성분, 특징, 요소, 부재, 단계들의 존재를 배제 또는 제외하지 않는다.

종점들에 의한 수치 범위의 인용은 인용된 종점들 뿐아니라 그 범위 내 포함되는 모든 수 및 부분들을 포함한다.

정의

용어 "분리된(isolated)"은 세포 배양 검사 및 기준에 상응하는 세포의 특성 연구 (및 가능하고 요구될 때 물리적 분리), 또는 (FACS에 의해서와 같은) 항원의 존재/부재 및/또는 세포 크기에 따른 세포의 자동화된 분류에 근거한 적절한 세포 생물학 기법을 적용하여 수행될 수 있는, 세포 배양 또는 혈액과 같은 생물학적 샘플로부터 세포의 물리적 확인 및 분리 모두를 의미한다. 일부 구현예에서, 용어 "분리하는" 또는 "분리"는 특히 유세포 분석을 수행함으로써 세포를 물리적 분리 및/또는 정량하는 추가적 단계를 포함할 수 있다.

용어 "중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)" 또는 "MSC"는 시험관내 배양될 때 또는 생체내 존재할 때, 특정 세트의 표면 항원을 발현하고, 이에 제한되지 않으나 지방세포, 연골세포 및 골세포를 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성, 자가-재생 세포를 의미한다.

본원에 사용되는 "염증 환경(inflammatory environment)" 또는 "염증 조건(inflammatory condition)"은 (i) 전염증성(proinflammatory) 면역 세포, 전염증성 사이토카인 또는 전염증성 케모카인 중 적어도 하나의 증가; 및 (ii) 항-염증성(anti-inflammatory) 면역 세포, 항-염증성 사이토카인 또는 항-염증성 케모카인 중 적어도 하나의 감소를 특징으로 하는 상태 또는 조건을 의미한다. 바람직하게, 본원에 사용되는 "염증 환경" 또는 "염증 조건"는 적어도 15% 증식 T-림프구를 포함하고, 상기 림프구는 적어도 T 헬퍼 (Th)1 및 Th2 세포를 포함하고, ml 당 적어도 7 pg TNF-α 및/또는 ml 당 적어도 13 pg TGF-β를 생산한다.

용어 "항-염증성", "항-염증", "면역억제성" 및 "면역억제제"는 국소 염증 (이에 제한되지 않으나, 고열, 통증, 종창, 발적, 및 기능 손실과 같은) 중 적어도 하나의 지표의 감소를 특징으로 하는 상태 또는 조건, 및/또는 (i) 전-염증성 면역 세포, 전-염증성 사이토카인, 또는 전-염증성 케모카인 중 적어도 하나의 감소; 및 (ii) 항-염증성 면역 세포, 항-염증성 사이토카인, 또는 항-염증성 케모카인 중 적어도 하나의 증가를 특징으로 하는 전신 상태 변화를 의미한다.

본 발명의 용어 "말초 혈액 단핵 세포" 또는 "PBMCs"는 림프구 (T-림프수, B-림프수 및 자연 살해(NK) 세포) 및 단핵구인 임의의 말초 혈액 세포를 포함한다. 바람직하게, 본 발명에서 상기 T-림프구의 적어도 20.5%가 CD3에 대하여 양성이고 및/또는 상기 B-림프구의 적어도 19.8%가 CD138에 대하여 양성이다.

본원에 사용되는 용어 "양성(positive)"은 생물학적 활성 및/또는 세포 표면 상, 세포내 및/또는 분비되는 생물학적 마커의 존재를 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 세포 또는 세포 조성물은 생물학적 활성 및/또는 마커에 대하여, 각각 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%, 또는 60% 내지 99%, 또는 70% 내지 90%에 대하여, 양성이다.

본원에 사용되는 용어 "음성(negative)"은 생물학적 활성 및/또는 세포 표면 상, 세포내 및/또는 분비되는 생물학적 마커의 부재를 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 세포 또는 세포 조성물은 생물학적 활성 및/또는 마커에 대하여, 각각 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만에 대하여, 음성이다.

본 발명의 "집단 배가 시간(population doubling time)" 또는 "PDT"는 식: In(N_f/N_i)In(2)에 의하여 계산되며, 여기서 N_f는 세포 탈착 후 최종 세포수이고 N_i는 시간 지점 0에서 최초 세포수이다.

용어 "항-응고제"는 혈액 응고를 억제할 수 있는 조성물을 의미한다. 본 발명에서 항응고제의 예는 EDTA 또는 헤파린을 포함한다.

본 발명에서 용어 "버피 코트(buffy coat)"는, 바람직하게 밀도 구배 원심법에 의하여 얻어지는, 백혈구 및 혈소판이 풍부한, 응고되지 않은 혈액 부분으로 이해될 것이다.

용어 "혈액-인터페이즈(blood-inter-phase)"는 주로 적혈구 및 다형핵 세포로 구성되는 하부와 혈장으로 구성되는 상부 사이에 위치하는, 바람직하게 밀도 구배에 의하여 얻어지는, 혈액 부분으로 이해될 것이다. 상기 혈액 인터페이즈는 단핵구, 림프구 및 MSCs를 포함하는 혈액 단핵 세포(BMCs)의 공급원이다.

본원에 사용되는 용어 "현탁 직경(suspension diameter)"은 현탁되고 있는 세포의 평균 직경으로 이해될 것이다. 직경 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가능한 방법은 유세포 분석, 공초점 현미경, 이미지 세포 분석(image cytometer) 또는 기타 당업계에 공지된 방법들이다.

용어 "환자", "대상", "동물" 또는 "포유류"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 치료될 포유류 대상을 의미한다.

용어 "유도하는" 또는 "유도되는"은 다능(multipotent) 또는 만능(pluripotent) 세포 내 세포 유형 특이 유전자 또는 분자를 활성화함으로써, 그러한 세포를 더 정의되고, 특화 또는 분화된 세포 계통 또는 세포 유형으로 하는 과정으로 이해될 것이다.

용어 "치료적으로 효과적인 양"은 증상을 감소시키거나 질환 상태를 개선하는데 효과적인 화합물 또는 조성물의 최소량 또는 농도이다.

용어 "치료(treatment)"는 병적 상태 또는 장애를 감소 또는 방지하기 위한 치료적(therapeutic), 예방적(prophylactic) 또는 방지적(preventive) 조치 모두를 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "시험관내(in vitro)"는 생체 바깥쪽 또는 외부를 나타낸다. 본원에 사용되는 용어 "시험관내"는 "생체외(ex vivo)"를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "생체외"은 전형적으로 생체로부터 제거되고 생체 외부, 예를 들어 배양 용기 또는 바이오리액터 내에서 유지 또는 증식되는 조직 또는 세포를 의미한다.

기재

본 발명은 특정 유형의 MSC, 이러한 MSCs를 포함하는 조성물 및 이의 임상적 용도에 관한 것이다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 중간엽 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성이고, MHC 클래스 II 분자에 대하여 음성인 분리된 MSC를 제공한다. 상기 세포는 염증 환경 또는 조건에 존재할 때 면역조절 PgE2 사이토카인을 분비한다.

염증 환경 또는 조건은 혈액의 면역 세포 동원(recruitment)을 특징으로 한다. 염증 매개체(inflammatory mediator)는 프로스타글란딘, IL-1β, TNF-α. IL-6 및 IL-15와 같은 염증성 사이토카인, IL-8과 같은 케모카인, 및 TNF-α, IFN-γ와 같은 기타 염증성 단백질을 포함한다. 이들 매개체는 주로 단핵구, 대식세포, T-세포, B-세포에 의하여 생산되어 염증 부위에서 백혈구를 동원하고 이어서 자극 및 억제 상호작용의 복잡한 네트워크를 자극하여 조직을 염증 과정으로부터 동시에 파괴하고 치유한다.

프로스타글란딘 E2 (PgE2)는 프로스타글란딘 패밀리의 서브타입이다. PgE2는 순차적 효소 반응을 통하여 막 인지질로부터 배출되는 아라키돈산(AA)으로부터 합성된다. 프로스타글란딘-엔도퍼옥시다아제 신타아제(prostaglandin-endoperoxidase synthase)로 알려진 시클로옥시게나아제-2 (COX-2)는 AA를 프로스타글란딘 H₂ (PgH₂)로 전환시키고, PgE2 신타아제는 PgH₂를 PgE₂로 이성화한다. 속도 제한 효소로서, COX-2는 성장 인자, 염증성 사이토카인 및 종양 촉진자에 의한 자극을 포함하는 생리적 조건에 반응하여 PgE₂ 합성을 조절한다.

특정 구현예에서, 염증 환경에 존재하는 상기 MSCs는 가용성 면역 인자 프로스타글란딘 E2 (PgE2)를 ml 당 10³ 내지 10⁶ 피코그램(picogram) 범위의 농도로 분비하여 MSC-조절 면역억제를 유도한다.

이러한 특정 농도 범위 내 MSCs의 PgE2 분비는 시험관내 항-염증성 과정을 자극하고, 적절한 세포 유형으로 분화하는 능력과 함께, 이들을 세포 이식(cellular transplantation)에 바람직하게 만든다.

본 발명의 분리된 MSCs는 중간엽 마커(mesenchymal markers) CD29, CD44 및 CD90의 존재를 특징으로 한다. 후자에 의하여, 얻어지는 MSCs의 순도를 분석할 수 있고, MSCs의 백분율을 결정할 수 있다.

CD29는 인테그린 베타 1 유전자에 의하여 인코딩되는 세포 표면 수용체이며, 상기 수용체는 다른 단백질들과 복합체를 형성하여 리간드의 결합시 생리학적 활성을 조절한다. CD44 항원은 세포-세포 상호 작용, 세포 부착 및 이동에 수반되는 세포 표면 당단백질이다. 또한, CD44는 히알루론산에 대한 수용체이며, 오스테오폰틴(osteopontin), 콜라겐 및 기질 금속 단백분해효소(MMPs)와 같은 기타 리간드들과 상호 작용할 수도 있다. CD90 항원은 MSCs와 같은 줄기 세포에 대한 마커로서 간주되는 보존된(conserved) 세포 표면 단백질이다. CD29/CD44/CD90에 대하여 삼중으로 양성인 본 발명의 분리된 MSC는 당업자로 하여금 MSC의 신속하고 분명한 선택을 가능케 하고, 추후 다운스트림 적용을 위하여 흥미있는 MSC 생물학적 특성들을 제공한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 MSCs는 전형적인 MSC 마커인 비멘틴(vimentin), 피브로넥틴(fibronectin), Ki67, 또는 이의 조합에 대하여 양성이다. 또한, 본 발명의 분리된 MSC는 주조직적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex (MHC)) Class II 분자, 바람직하게 현재 알려진 모든 MHC Class II 분자들의 부재를 특징으로 하며, 상기 세포를 말(equine) 세포 요법과 같은 포유류에 대한 세포 요법에 사용될 수 있는 세포로 분류한다. 분리된 MSCs가 부분적으로 분화될 때에도, 상기 MSCs는 MHC 클래스 II 분자에 대하여 음성으로 유지된다.

MSCs는 일반적으로 그 표면 상에 MHC 클래스 I 항원을 발현하나, 제한된 양의 MHC 클래스 II를 발현한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 분리된 MSCs는 MHC 클래스 I 마커에 대해서도 음성이다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 MSC는 MHC 클래스 I 및 II 마커에 대하여 음성이고, 상기 세포는 극히 낮은 면역원성 표현형을 나타낸다.

이러한 MSCs의 면역 특성은 수용자 면역계가 세포 이식 후 세포, 바람직하게 동종(allogenic) 세포를 인식 및 거부하는 능력을 제한한다. 면역 반응을 조절하는 인자들의 MSCs에 의한 생산은 국소 자극 하에 적절한 세포 유형으로 분화하는 이들의 능력과 함께 이들을 세포요법에 대하여 바람직한 줄기 세포로 만든다.

다른 추가적 구현예에서, 상기 MSCs는 조혈세포에 대한 마커인 CD45 항원에 대하여 음성이다.

가장 바람직한 구현예에서, 상기 분리된 MSC는

- 중간엽 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성;

- 비멘틴, 피브로넥틴, Ki67 또는 이의 조합으로 이루어지는 군 내 포함되는 하나 이상의 마커에 대하여 양성;

- MHC 클래스 I 및/또는 II 분자에 대하여 음성; 및

- 조혈 마커 CD45에 대하여 음성이고,

상기 세포는 염증 환경 또는 조건에 존재할 때 면역조절 PgE2 사이토카인을 ml 당 10³ 내지 10⁶ 피코그램의 농도로 분비한다.

일반적으로, 문헌에 공개된 특정 세포 유형에 대한(예를 들어, 중간엽, 간, 조혈, 상피, 내피 마커) 또는 특정 편재화를 가지는(예를 들어, 세포 내, 세포 상 또는 분비) 세포 마커를 확인 및 특성화하기 위한 기술은 MSCs 특성 연구에 적절한 것으로 간주될 수 있다. 이러한 기술은 두 가지 범주로 나눌 수 있다: 분석 중 세포 온전성 유지를 허용하는 것, 및 그러한 세포를 사용하여 생성되는 추출물(단백질, 핵산, 막 등을 포함)을 기반으로 하는 것. 이러한 마커를 확인하고 이들을 양성 또는 음성으로 측정하기 위한 기술들 중, 세포 배지의 면역세포화학 또는 분석은 소량의 세포로도 세포를 파괴하지 않고 마커 검출을 허용하므로 (웨스턴 블롯 또는 유세포 분석의 경우에서와 같이) 바람직하다.

분리된 MSCs의 관련 생물학적 특징은 유세포 분석, 면역세포화학, 질량 분석법, 겔 전기영동, 면역분석 (예를 들어, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 면역침전, ELISA), 핵산 증폭 (예를 들어, 실시간 RT-PCR), 효소 활성, 오믹스(omics)-기법 (프로테오믹스, 리피도믹스, 글리코믹스, 트랜스크립토믹스, 메타볼로믹스) 및/또는 기타 생물학적 활성과 같은 기술을 이용하여 확인될 수 있다.

바람직한 구현예에서, MSC는 염증 환경 또는 조건에 존재할 때 IL-6, IL-10, TGF-β, NO 또는 이의 조합으로부터 선택되는 분자 중 적어도 하나의 증가된 분비, 및 IL-1의 감소된 분비를 가진다. 상기한 것과 동일한 특징을 가지나 염증 환경 또는 조건에 놓여지지 않은 중간엽 줄기 세포와 비교를 행할 수 있다.

바람직하게, 상기 MSC는 상기 인자들 중 2 이상과 함께 PgE2의 증가된 분비를 가진다.

PgE2, IL-6, IL-10, TGF-β 및 NO는 T 세포 및 B 세포와 같은 주요 면역 세포군의 증식 및 작용을 억제하는 것을 보조한다. 또한, MSCs는 그 표면 상에 낮은 수준의 MHC 클래스 I 분자를 발현하고 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 대하여 음성이어서, 면역원성 반응에서 벗어난다. 또한, 본 발명의 분리된 MSCs는 상기 인자들의 증가된 분비에 의하여 백혈구 증식을 억제함으로써, 다시 한번 숙주의 면역원성 반응을 방지하는 것을 보조한다.

본 발명에 따른 MSCs는 이에 제한되지 않으나 골수, 지방질, 근육, 탯줄 혈액, 말초 혈액, 간, 태반, 피부, 양수를 포함하는 다양한 조직 또는 체액으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 상기 MSCs는 혈액, 더 바람직하게 말초혈액으로부터 유래된다. 본 발명의 MSCs는 당업계에 공지된 임의의 표준 프로토콜에 의하여 얻을 수 있다.

구현예에서, 상기 MSCs는 MSCs가 혈액 또는 혈액상(blood phase)으로부터 분리되고 상기 세포가 저-글루코스 배지 내 배양 및 증식되는 방법을 통하여 얻을 수 있다.

구현예에서, 이러한 방법은 다음 단계를 포함한다:

a. 항응고제로 코팅된 샘플 바이알 내에, 기증자로부터 하나 이상의 혈액 샘플을 수집하는 단계;

b. 상기 혈액 샘플을 원심분리하여, 혈장-상, 버피 코트 및 적혈구 상으로 구성되는, 3-상 분포를 얻는 단계;

c. 상기 버피 코트를 수집하고 밀도 구배에 로딩하는 단계;

d. 상기 단계 c)의 밀도 구배로부터 얻어진 혈액 인터페이즈(blood-inter-phase)를 수집하는 단계;

e. 원심분리에 의하여 상기 혈액 인터페이즈부터 MSCs를 분리하는 단계;

f. 배양 내 2.5 x 10⁵/cm² 내지 5 x 10⁵/cm² MSCs로 시딩하고, 이들을 덱사메타손, 항생제 및 혈청이 보충된 저-글루코스 성장 배지 내에 유지하는 단계.

지나치게 조밀한 시딩은 증식 중 대량의 세포사 및 비-균질한 MSCs 군을 초래할 것이고 지나치게 분산된 시딩은 MSCs의 콜로니 형성이 거의 없거나 없게 하여, 증식이 불가능 또는 거의 불가능하거나, 지나치게 시간이 많이 걸릴 것이므로, 시딩 횟수는 궁극적으로 순수하고 생존 가능한 MSCs 군을 허용 가능한 농도로 얻기 위하여 중요하다. 상기 두 경우 모두, 세포의 생존률에 부정적인 영향을 미칠 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 분리된 MSCs는 높은 세포 생존률을 가지며, 상기 세포의 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 100%가 생존 가능하다.

상기 혈액-인터페이즈는 단핵구, 림프구 및 MSCs를 포함하는 혈액 단핵 세포(BMCs)의 공급원이다. 바람직하게, 림프구는 37℃에서 세척 제거되고, 단핵구는 이의 생존 유지를 위하여 필요한 사이토카인의 부재 하에 2 주 이내에 사멸된다. 이러한 방식으로, MSCs를 정제한다. MSCs의 혈액 인터페이즈로부터 분리는 바람직하게 혈액 인터페이즈의 원심 분리 후 세포 펠릿을 인산 완충액과 같은 적합한 완충액으로 적어도 1회 세척함으로써 행하여진다.

추가적인 구현예에서, 본 발명의 분리된 MSCs는 단핵구 및 대식세포에 대하여 모두 0% 내지 7.5% 범위 내에서 음성이다.

특히, 중간엽 세포는 증식 배지 내에 적어도 2주 유지된다. 바람직하게, 분리된 MSCs의 특정한 특징들이 1% 덱사메타손을 가지는 증식 배지 내에서 유지되므로, 1% 덱사메타손을 가지는 증식 배지가 사용된다.

2 주(14 일), 바람직하게 3 주(21 일)의 최소 기간 후, MSC 콜로니가 배양병 내에 보이기 시작할 것이다. 그 후의 단계 g)에서, 적어도 6 x 10³ 줄기 세포/cm²를 MSCs 증식을 위한 저-글루코스, 혈청 및 항생제를 함유하는 증식 배지로 옮긴다. 바람직하게, MSCs의 증식은 최소 다섯 개의 세포 계대(passage)에서 일어날 것이다. 이러한 방식으로, 충분한 세포가 얻어질 수 있다. 바람직하게, 세포는 70% 내지 80% 컨플루언시(confluency)에서 분열된다. MSCs는 배양 내 50 계대까지 유지될 수 있다. 그 후, 활력(vitality) 손실 위험, 노화 현상(senescence) 또는 돌연변이 형성이 일어난다.

추가적 구현예에서, 분리된 MSC의 증식 동안 각각의 계대 사이의 집단 배가 시간(PDT)은 트립신 처리 후 0.7 내지 3 일이다.

상기 분리된 MSCs의 증식 동안 각각의 계대 사이의 PDT는 바람직하게 트립신 처리 후 0.7 내지 2.5 일이다.

바람직한 구현예에서, 상기 분리된 MSC는 방추형(spindle-shaped) 형태를 가진다.

본 발명의 분리된 MSC의 형태 특성 연구는 상기 세포를 가늘고 긴(elogated), 섬유아세포-유사, 방추형 세포로서 분류한다. 이러한 세포 유형은 주로 삼각형 또는 성상 세포 형상을 나타내는 적은 자가-재생 세포를 가지는 다른 MSCs 군, 및 두드러진 핵과 큰, 입방형 또는 편평한 패턴을 가지는 MSCs 군으로부터 구분된다. 생물학적 마커와 함께 이러한 특정 형태학적 특징을 가지는 MSCs의 선택은 당업자로 하여금 본 발명의 MSCs 분리를 가능케 한다. 세포의 형태학적 분석은 위상차 현미경(phase contrast microscopy)을 사용하여 당업자에 의하여 용이하게 수행될 수 있다. 그 외에, MSCs의 크기 및 입도는 유세포 분석 또는 당업자에게 공지된 기타 기법에서 전방 및 측면 산점도를 이용하여 평가될 수 있다.

원한다면, 분리된 MSCs는 성체 세포(adult cells)로 유도 또는 분화될 수 있다. 유도 또는 분화는 바람직하게 특정한 증식 인자 및/또는 기타 분화 인자 및/또는 유도 인자를 세포의 배지에 첨가함으로써 행하여진다. 이러한 인자들의 특성은 결정적으로 분화 및 원하는 성체 세포 유형에 달려 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 MSCs는 힘줄세포(tenocytes), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocytes), 근세포(myocytes), 지방세포(adipocytes), 또는 섬유아세포(fibroblasts)로 분화될 수 있다. 시험관내 분화는 MHC 클래스 I 및 II의 발현 증가를 초래한다. 따라서, 우리의 분화 프로토콜이 이러한 마커들의 증가를 보이지 않았다는 것은 유의미하다. MHC 클래스 II 발현은 MSCs 내에 완전히 부재한 반면, MHC 클래스 I은 MSCs 내에서 낮은 수준으로 발현되었다.

더 바람직한 구현예에서, MSC는 10 내지 100 ㎛의 현탁 직경을 가진다.

본 발명의 분리된 MSCs는 크기/현탁 직경을 기준으로 하여 선택되었다. 바람직하게, MSCs는 10 내지 100 ㎛, 더 바람직하게 15 내지 80 ㎛, 더 바람직하게 20 내지 75 ㎛, 더 바람직하게 25 내지 50 ㎛의 세포 크기를 가진다. 바람직하게, 세포 크기를 기준으로 한 세포의 선택은 여과 단계에 의하여 일어난다. 예를 들어, 바람직하게 저-글루코스 DMEM 배지 내 희석되는, ml 당 10⁴ 내지 10⁷ MSCs 범위의 세포 농도를 가지는 분리된 MSCs를, 세포를 40 ㎛ 필터를 사용하여 2회 여과 단계를 통과시키는 여과 시스템에 의하여 크기에 따라 선택한다. 2회 또는 복수 여과 단계가 바람직하다. 후자는 많은 단세포군을 제공하고 세포 응집체의 존재를 방지한다. 이러한 세포 응집체는 동결에 의한 세포 보존 동안 세포사를 야기할 수 있고, 모두 세포의 추가적 다운스트림 적용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 세포 응집체는 정맥 내 투여시 모세혈관 색전증의 발생 위험을 높일 수 있다.

추가적 구현예에서, 분리된 MSC는 PBMCs 내 PgE2, IL-6, IL-10, NO 또는 이의 조합의 분비를 유도하고, 및/또는 TNF-α, IFN-γ, IL-1 또는 이의 조합의 분비를 억제한다.

염증 환경에서, MSCs는 숙주의 면역 반응을 조절하는 복수의 인자들을 분비한다. 또한, MSCs는 PgE2, IL-6, IL-10, NO 또는 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자의 분비를 유도하는 자극 효과를 가진다. 염증 환경에서 MSCs의 PBMCs에 대한 자극 효과 다음으로, MSCs는 PBMCs의 분비에 대한 억제 효과를 또한 가져, TNF-α, IFN-γ, IL-1 또는 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 감소시킨다. MSCs는 염증 환경에서 조절 효과를 가져, 이들을 모든 종류의 질환, 특히 면역 질환 치료에 유용하게 한다.

바람직한 구현예에서, 염증 환경에서 MSCs의 면역조절 활성은 MSCs 및 PBMCs가 1:0.001 내지 1:1000 범위의 비로 존재할 때 최적이다. 특히 바람직한 MSCs 대 PBMCs의 비는 1:500, 더 바람직하게 1:100, 더 바람직하게 1:10이다.

특히 바람직한 구현예에서, MSC는 혈액, 바람직하게 말초 혈액으로부터 분리된다. 혈액은 MSCs의 최적의 공급원인 것으로 보인다. 혈액은 비-침습성 및 무통증 공급원일뿐 아니라, 수집하기 단순하고 안전하여, 결과적으로 용이하게 접근 가능하다. 혈액은 모든 포유류, 특히 말, 인간, 고양이, 개, 설치류 등으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 상기 기원은 말(equine)이다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 적어도 60%의 본 발명의 분리된 MSCs를 포함하는 세포 조성물로서, 상기 세포의 적어도 95%가 단세포인 세포 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 90% MSCs를 포함한다. 더 바람직하게, 상기 세포 조성물은 적어도 95% MSCs, 더 바람직하게 적어도 99%를 포함한다. 구현예에서, 상기 세포 조성물은 본 발명의 MSCs를 100% 포함하는 순수한 조성물이다.

바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 75%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더 바람직하게 적어도 85%, 가장 바람직하게 적어도 90%의 단세포를 포함한다. 바람직하게, 상기 세포는 10 내지 100 ㎛의 현탁 직경을 가지고, 상기 세포의 단세포 특성 및 상기 세포의 직경은 세포요법과 같은 임의의 다운스트림 적용 및 세포의 활력을 위하여 중요하다.

상기 조성물의 더 바람직한 구현예에서, 상기 분리된 MSCs는 CD29에 대하여 95% 내지 100% 범위에서 양성이고, CD90에 대하여 95% 내지 100% 범위에서 양성이고, CD44에 대하여 80% 내지 100% 범위, 더 바람직하게 90% 내지 100%, 가장 바람직하게 95% 내지 100% 범위에서 양성이고, MHC 클래스 II 분자에 대하여 0% 내지 5%, 더 바람직하게 0% 내지 2% 범위에서 음성이다. 또한, 상기 MSC는 MHC 클래스 I 분자에 대하여 0% 내지 60%, 더 바람직하게 0% 내지 50%, 더 바람직하게 0% 내지 45% 범위에서 음성이다. 상기 조성물의 추가적 구현예에서, 상기 MSCs는 CD45에 대하여 0% 내지 7.5% 범위 내에서 음성이다.

더 바람직한 구현예에서, 상기 조성물 내 포함되는 MSCs는 적어도 90%, 더 바람직하게 95%, 더 바람직하게 99%, 더 바람직하게 100%의 세포 생존률을 가진다.

본 발명의 다른 구현예는 이전의 구현예들 중 임의의 것에 따른 MSCs 조성물의 분화에 의하여 얻어지는 세포 조성물로서, 상기 세포 조성물의 세포는 힘줄세포, 연골세포, 골세포, 근세포, 지방세포, 각질형성세포(keratinocytes), 뉴런 또는 섬유아세포인 세포 조성물에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포 조성물은 치료적으로 효과적인 양의 분리된 MSCs를 포함하고, 바람직하게 상기 조성물은 ml 당 10⁵ 내지 10⁷의 상기 분리된 MSCs를 포함한다.

대상에게 치료 이점을 생산하는 최소 치료 효과 투여량은 ml 당 적어도 10⁵의 상기 분리된 MSCs이다. 상기 MSCs는 세포 조성물 내 희석될 수 있다. 바람직하게, 상기 세포 조성물은 ml 당 10⁵ 내지 5 x 10⁵ 분리된 MSCs를 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 세포 조성물은 혈소판-풍부 혈장(PRP), 히알루론산, 히알루론산계 조성물, 글리코사미노글리칸, 또는 글리코사미노글리칸계 조성물로 구성되는 군으로부터 선택되는 성분으로 보충될 수 있다. 이러한 담체 물질을 가지는 조성물은 어떠한 경우 조성물의 유효성을 증가시키거나 상승 효과를 창출하기 위하여 바람직할 수 있다. 예를 들어, 상기 담체 물질은 세포 조성물 내 MSCs의 호밍 성능(homing capacities) 및 면역 조절 효과를 보조한다.

상기 세포 조성물의 추가적 구현예에서, 상기 분리된 MSCs는 PBMCs의 존재 하에 있을 때 PgE2, IL-6, IL-1, TGF-β, NO 또는 이의 조합을 발현한다.

상기 세포 조성물의 바람직한 구현예에서, 상기 분리된 MSCs는, PBMCs의 존재 하에 있을 때, PBMCs 내 PgE2, IL-6, IL-1, NO 또는 이의 조합의 발현을 유도하고, 및/또는 PBMCs 내 TNF-α, IFN-γ, IL-1 또는 이의 조합의 분비를 억제한다.

상기 분리된 MSCs는 PBMCs의 존재 하에 면역조절 인자를 분비하는 생물학적 성능을 유지한다. PgE2 또는 기타 인자의 분비와 같은 MSCs의 자극 효과 후 PBMCs에 의하여 매개되는 면역 반응은 MSCs가 면역억제 작용을 추가적으로 발휘하기 위하여 중요하다.

또한, MSCs 및 PBMCs의 비는 중요한 인자이다. 따라서, 상기 세포 조성물의 더 바람직한 구현예는 1:0.001 내지 1:1000 비의 MSCs 및 PBMCs의 존재에 관한 것이다. 상기 MSCs 및 PBMCs의 비는 바람직하게 1:500, 더 바람직하게 1:100, 더 바람직하게 1:10이다.

시험관내 시험은 이러한 비가 염증 환경에서 MSCs의 효율적인 면역조절을 야기함을 입증하였다. 동일한 결과가 생체내에 예상되므로, 효율적이고 안전한 세포요법이 되게 한다.

다른 추가적 구현예에서, 상기 세포 조성물은 PBMCs의 존재 하에 있을 때, ml 당 10³ 내지 10⁶ 피코그램의 농도로 PgE2를 발현할 것이다.

상기 세포 조성물 내 PBMCs의 존재 하에 ml 당 10⁵ 내지 10⁷, 더 바람직하게 10⁵ 내지 10⁶의 분리된 MSCs의 농도는 면역억제 인자 PgE2의 분비에 의하여 특징지어지며, 상기 양의 세포는 ml 당 10³ 내지 10⁶ 피코그램 범위로 PgE2를 분비할 것이다. 바람직하게, ml 당 10⁴ 내지 10⁵ 피코그램 PgE2가 상기 세포 조성물 내 MSCs에 의하여 분비되어 면역적격(immunocompetent) 세포를 충분히 제한한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 조성물은 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 병변 재, 동맥 내, 국부, 결막 하 주사 또는 국소관류에 의한 대상 내 투여를 위하여 제제화된다.

특히 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 대상에 동종(allogenic) 투여를 위하여 사용될 수 있다. 동종 사용은 상이한 기증자가 스크리닝될 수 있고 최적의 기증자가 선택될 수 있으므로 MSCs의 품질의 더 나은 조절을 허용한다. 기능적 MSCs의 제조 관점에서, 이는 필수적이다. 이는 세포 품질을 보증할 수 없는 MSCs의 자가(autologous) 사용과 대조적이다.

예를 들어, 혈액 MSCs를 분리할 때, 후에 그의 분리된 MSCs의 수용자이기도 한, 기증자로부터의 혈액을 사용하였다. 다른 구현예에서, 기증자가 바람직하게 기증자의 혈액으로부터 분리된 MSCs의 수용자와 동일한 가족, 성별 또는 인종인, 기증자로부터의 혈액을 사용한다. 특히, 줄기 세포를 통한 병리 또는 질환의 수평 전파(horizontal transmission) 위험을 방지하기 위하여, 기증자들은 통상적인 현재 전파 가능한 질환 또는 병에 대하여 시험될 것이다. 바람직하게, 기증 동물은 격리되어 유지된다. 기증 말을 사용할 때, 이는 예를 들어 다음의 병리, 바이러스 또는 기생충에 대하여 시험될 수 있다: 말전염성빈혈(equine infectious anemia(EIA)), 말 비강폐렴(equine rhinopneumonitis(EHV-1, EHV4), 말 바이러스성 동맥염(equine viral arteritis(EVA)), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus(WNV)), 아프리카마역(African horse Scikness(AHS)), 구역(dourine(트리파노소마(Trypanosoma)), 말 피로플라즈마병(equine piroplasmosis), 마비저(glanders (mallues, glanders)), 말 인플루엔자(equine influenza), 라임병(Lyme borreliosis(LB)) (보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), Lyme disease).

본 발명에 따른 조성물은 조성물의 장시간 저장을 허용하기 위하여 바람직하게 동결될 것이다. 바람직하게, 상기 조성물은 -20℃ 이하 온도와 같은 낮은 일정 온도에서 동결될 것이다. 이러한 조건은 조성물의 안전한 저장을 허용하고, 조성물 내 세포가 저장 중 및 해동시 그들의 높은 세포 생존률뿐 아니라 그들의 생물학적 및 형태학적 특징을 유지하는 것을 가능케 한다.

더 바람직한 구현예에서, 상기 세포 조성물은 임의로 액체 질소 내에서 -80℃의 최대 온도에서 적어도 6 개월 동안 저장될 수 있다.

MSCs의 동결에 있어서 중요한 인자는 극저온 배지의 조성, 특히 DMSO의 농도이다. DMSO는 동결 과정 중 배지 내 결정 형성을 방지하나, 고농도에서 세포에 독성일 수 있다. 바람직한 구현예에서, DMSO의 농도는 20% 이하, 더 바람직하게 15% 이하, 더 바람직하게 극저온유체 내 DMSO의 농도는 10%를 구성한다. 상기 극저온 배지는 저-글루코스 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)과 같은 저-글루코스 배지를 더 포함한다.

그 후, 상기 세포 조성물은 바람직하게 실온 주위의 온도, 바람직하게 20 내지 37℃, 더 바람직하게 25 내지 37℃의 온도에서 및 최대 20 분, 바람직하게 최대 10 분, 더 바람직하게 최대 5 분 동안 투여 전 해동된다.

또한, 상기 조성물의 활력을 보호하기 위하여, 상기 조성물은 해동 후 2 분 이내에 투여된다.

바람직하게, 본 발명은 수의학 분야에 적용된다. 상기 조성물은 포유류, 바람직하게 개, 고양이, 말 또는 원숭이인 대상에 투여될 수 있다.

세 번째 측면에서, 본 발명은 대상, 바람직하게 포유류 대상 내 면역-관련 질환 및/또는 염증 과정의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 세포 조성물을 제공한다.

특히, 상기 면역-관련 질환은 자가면역 질환, 아토피 피부염, 알러지, 류마티스 관절염, 및 관절염으로 구성되는 군으로부터 선택되고; 상기 염증 과정은 퇴행성관절염, 골관절염, 고열, 폐 천식, 및 건염으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 본 발명의 구현예에서, 상기 세포 조성물은 상기 열거한 치료에 사용되며, 치료 당 10⁵ 내지 10⁷의 상기 분리된 MSCs가 투여되고, 바람직하게 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 병변 재, 동맥 내, 국부, 결막하 주사 또는 국소관류에 의하여 투여된다.

본 발명을 다음의 비-제한적 실시예에 의하여 더욱 기재하며, 이들 실시예들은 본 발명을 추가로 예시하며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않고 이와 같이 해석되지 않아야 한다.

실시예

본 발명은 앞서 기재한 임의의 형태의 구현예로 제한되지 않으며, 첨부되는 청구항의 재검토없이 제시되는 제조 실시예에 일부 변경을 가할 수 있는 것으로 가정된다.

실시예 1: 면역분석 기법 ELISA에 의한, 분리된 MSCs에 의한 PgE2 분비 정량

항응고제로서 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 함유하는 튜브 내에 힘줄의 만성 염증을 가지는 말로부터의 말초혈액 50 ml를 수집하여, 말 말초혈액 단핵세포(ePBMCs)를 얻었다. 상기 EDTA 튜브를 20 분 동안 원심분리한 다음, 버피 코트를 살균 15 ml 튜브 내로 수집하였다. 상기 버피 코트를 인산 완충액, 1 x PBS로 2회 희석하였다. 상기 용액을 이어서 Percoll (1.35 g/ml)로 처리하고 15 분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 인터페이즈(interphase)를 수집하고 1 x PBS로 원심분리에 의하여 8 분 동안 세척하고, 2회 반복하였다. 상기 펠릿을 재현탁하고 세포를 계수하였다. 계수 후, PBMCs를 먼저 라벨링하고, 96-웰 플레이트 내 시딩하고, MSCs의 존재 또는 부재 하에 베타 머캅토-에탄올을 함유하는 증식 배지 내에서 증식시켰다. 25 x 10⁶ ePBMCs를 MSCs와 특정 비로 플라스크 (T75 플라스크) 당 시딩하였으며, 여기서 MSCs 및 PBMCs의 비는 1:10이다. 96 시간 인큐베이션 후 MSCs 및 PBMCs로부터의 상청액을 얻었으며, 면역분석에 사용하였다. 자극된 PBMCs 및 MSCs를 포함하는 시험 샘플 다음으로, 양성 및 음성 대조군을 PgE2 분비에 대하여 평가하였다.

PgE2 분비를 효소면역측정 ELISA 키트 경쟁적 ELISA (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)를 사용하여 정량하였다. ELISA 플레이트를 항-말 PgE2 모노클론 항체로 밤새 코팅하고, 세척하고, 상기 샘플들, 시험 및 대조 샘플과 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 다시 세척하고, 항-말 PgE2 비오틴-표지 모노클론 항체와 인큐베이션하고, 세척하고, 아비딘, 호스래디쉬 퍼옥시다아제와 인큐베이션하고, 다시 세척하고, 퍼옥시다아제 기질과 인큐베이션하고, 플레이트 리더 상에서 405 nm에서 판독하였다.

도 1에 나타내는 바와 같이, 500,000 pg/ml 이상의 세포 증가가 평가되므로, MSCs 내 PgE2의 분비가 염증 환경에서 유도된다.

실시예 2: ELISA에 의한, MSCs 및 PBMCs에 의한 TGF-β 및 IL-6 분비 정량

TGF-β 및 IL-6 분비를 경쟁적 ELISA 키트 (Cusabio, USA)를 사용하여 정량하였다. 경쟁적 억제 효소 면역분석 기법은 실시예 1에서 앞서 기재한 PgE2 경쟁적 ELISA 키트와 동일한 원리를 따른다.

PBMCs 내 IL-6 분비 증가뿐 아니라, MSCs에 의한 TGF-β 및 IL-6 분비 증가가 모니터링된다. 도 2는 거의 2배의 TGF-β 농도로 MSCs에 의한 TGF-β의 분비 증가를 보인다. MSCs 및 PBMCs에 의한 IL-6의 분비는 도 3에 도시하는 바와 같이 음성 대조군보다 거의 18 배 더 높다.

실시예 3: ELISA에 의한, PBMCs에 의한 TNF-α 발현 정량

TNF-α 발현을 경쟁적 ELISA 키트(Invitrogen, USA)를 사용하여 측정하였다. ELISA 플레이트를 항-말 TNF-α 모노클론 항체로 밤새 코팅하고, 세척하고, 상기 샘플들, 시험 및 대조 샘플과 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 다시 세척하고, 항-말 PgE2 비오틴-표지 모노클론 항체와 인큐베이션하고, 세척하고, 스트렙트아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다아제와 인큐베이션하고, 다시 세척하고, 퍼옥시다아제 기질과 인큐베이션하고, 플레이트 리더 상에서 405 nm에서 판독하였다.

MSCs 존재 하에 PBMCs에 의한 TNF-α 분비 감소를 정량하였다. 도 4에 보이는 바와 같이, 231 pg/ml에서 77 pg/ml로 감소가 정량되므로, MSCs의 조절 효과는 3 배로 PBMCs의 TNF-α 분비를 억제한다.

실시예 4: 유세포 분석에 의한 MSCs의 면역표현형 특성 연구

몇몇 줄기 세포 마커의 발현을 유세포 분석에 의하여 평가하여 MSCs를 면역표현형으로 특성화하였다. 전형적인 거부 단백질인 조직적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex) 클래스 II의 발현을 천연 MSCs 및 염증 환경 내 MSCs 상에서 평가하였다. 시리즈 당 4 x 10⁵ 세포를 사용하였고, 일차 항체 마우스 항-말 MHC 클래스 II IgG1 (Abd Serotec, 1:50)로 표지하였다. 세포를 얼음 위에서 어두운 곳에서 일차 항체와 15 분 동안 인큐베이션하고, 1% 소혈청 알부민(BSA)를 함유하는 DMEM으로 구성되는 세척 완충액 내에서 2회 세척하였다. 2차 토끼 항-마우스-FITC (Abcam, 1:100) 항체를 사용하여 어두운 곳에서 얼음 위에서 15 분 인큐베이션 후 양성 세포를 확인하였다. 최종적으로, 모든 세포를 세척 완충액 내에서 3회 세척하고, 적어도 10³ 세포를 488 nm 고체 상태 및 63 nm HeNe 레이저를 구비하는 형광활성세포분류기(FACS: fluorescene activated cell sorter) Canto 유세포 분석기(Becton Dickson Immunocytometry systems)를 사용하여 평가하고, 데이터를 이어서 FACS Diva 소프트웨어로 분석하였다. 백그라운드 시그널을 확립하기 위하여, 모든 분석은 (i) 자가형광 및 (ii) 아이소타입(isotype)-특이적 IgG's와 인큐베이션된 대조 세포를 기준으로 하였다. 모든 아이소타입을 면역글로불린 서브타입에 매칭시켰으며, 상응하는 항체와 동일한 단백질 농도로 사용하였다.

천연 (데이터 도시하지 않음) MSCs 및 염증 환경 내 MSCs (도 5 참조)는 MHC 클래스 II 분자에 대하여 음성이다.

Claims

a. 중간엽 마커 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 양성이고;
b. MHC 클래스 II 분자에 대하여 음성인, 분리된 중간엽 줄기 세포로서,
상기 세포는 염증 환경 또는 조건에 존재할 때 면역조절 프로스타글란딘 E2 사이토카인을 분비하는, 분리된 중간엽 줄기 세포.
제1항에 있어서,
상기 세포는 염증 환경 또는 조건에 존재할 때 IL-6, IL-10, TGF-β, NO 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분자가 증가된 분비, 및 IL-1의 감소된 분비를 나타내는, 중간엽 줄기 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 세포는 10 내지 100 ㎛의 현탁 직경을 갖는, 중간엽 줄기 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 방추형 형태를 갖는, 중간엽 줄기 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 말초혈액 단핵 세포 내 PgE2, IL-6, IL-10, NO 또는 이의 조합의 분비를 유도하고/하거나, PBMCs 내 TNF-α, IFN-γ, IL-1 또는 이의 조합의 분비를 억제하는, 중간엽 줄기 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 혈액, 바람직하게 말초혈액으로부터 분리되어 있는, 중간엽 줄기 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 분리된 중간엽 줄기세포(MSCs; Mesenchymal stem cell)를 60% 이상 포함하는 세포 조성물로서, 상기 세포의 적어도 95%가 단세포인, 세포 조성물.
제7항에 있어서,
상기 분리된 MSCs는 PBMCs의 존재 하에 있을 때 PgE2, IL-6, IL-10, TGF-β, NO 또는 이의 조합을 발현하는, 세포 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 MSCs는 PBMCs의 존재 하에 있을 때 PBMCs 내 PgE2, IL-6, IL-10, NO 또는 이의 조합의 발현을 유도하고/하거나, PBMCs 내 TNF-α, IFN-γ, IL-1 또는 이의 조합의 분비를 억제하는, 세포 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 MSCs 및 PBMCs는 1:0.001 내지 1:1000의 비로 존재하는, 세포 조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 PBMCs의 존재 하에 있을 때 PgE2를 ml당 10³ 내지 10⁶ 피코그램의 농도로 발현하는, 세포 조성물.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
개체, 바람직하게 포유류 개체에서 면역-관련 질환 및/또는 염증 과정 치료에 사용하기 위한, 세포 조성물.
제12항에 있어서,
치료 당 10⁵ 내지 10⁷의 상기 분리된 MSCs가 투여되고, 상기 투여는 바람직하게 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 병변 내, 동맥 내, 국부, 결막하 주사 또는 국소관류에 의한 것인, 세포 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 면역-관련 질환은 자가면역 질환, 아토피 피부염, 알러지, 류마티스 관절염, 및 관절염으로 구성되는 군으로부터 선택되고; 상기 염증 과정은 퇴행성관절염, 골관절염, 고열, 폐 천식, 및 건염으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 세포 조성물.