KR20210138655A - 근위축성 측삭 경화증의 치료용 의약 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 근위축성 측삭 경화증을 치료하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 간엽계 줄기세포를 포함하고, 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는, 근위축성 측삭 경화증의 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
Description
관련 출원
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2019-046572(2019년 3월 14일 출원)의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
기술분야
본 발명은 근위축성 측삭 경화증을 치료하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 간엽계 줄기세포를 포함하고, 정맥내 투여되는, 근위축성 측삭 경화증의 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS)은 운동 신경이 선택적으로 장애되는 진행성의 신경 변성 질환이며, 근본적인 치료법이 없는 원인 불명의 중증 질병이다. ALS는 가족성 ALS와 산발성 ALS로 크게 구별되고, 전체의 약 5％를 차지하는 가족성 ALS 환자의 약 22％에서는 슈퍼옥시드 디스무타아제(SOD1)의 유전자에 변이가 있는 것이 보고되어 있다. SOD1 이외에도, TDP43, FUS/TLS, C9orf72 등이 ALS의 원인 유전자로서 보고되어 있다.
ALS 환자와 동물의 ALS 모델에 공통된 메커니즘의 하나로서 혈관 뇌 관문(BBB) 및 혈액 척수 관문(BSCB)의 파탄이 알려져 있다. ALS 발증 초기부터 보이는 BBB/BSCB의 파탄은 여러가지 신경 장애를 일으키는 것으로부터, ALS의 원인의 하나로서 주목받고 있다(비특허문헌 1-4). ALS는 신경염증이나 운동 신경의 탈락 등 여러가지 증상이 합병되기 때문에, 이러한 다양한 증상에 효과가 있는 치료법이 요망되고 있다.
간엽계 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC)에는, 신경 보호 작용이나 BBB수복 작용이 있는 것이 알려져 있다. 발명자들은 뇌경색 환자에게 MSC를 정맥 투여함으로써, 운동 기능의 개선이나 손상 부위의 수복이 보이는 것을 보고하고 있다(특허문헌 1-3). 또한, 척수 손상 환자에게 MSC를 정맥 투여함으로써, 기능 회복, 축삭 재생의 촉진, 손상 부위의 저감이 보이는 것도 보고하고 있다(특허문헌 2 및 3).
MSC는 다양한 신경 영양 인자를 분비함을 알고 있고, 그 중에서도 아교 세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF)에는 운동 신경 세포를 보호하는 효과가 확인되어 있다(비특허문헌 5). 발명자들은 뇌경색 모델 래트의 뇌 조직 중(경색 영역)에 포함되는 GDNF의 양을 ELISA로 측정하여, MSC 투여군에서는 대조군에 비하여 유의미하게 GDNF의 양이 많은 것을 확인하고 있다(비특허문헌 6). 고텔프(Gothelf) 등은 MSC를 bFGF나 PDGF를 포함하는 분화 배지에서 배양하여 신경 영양 인자를 분비하는 세포로 분화 유도하고, 이것을 ALS 환자의 지주막 아래 또는 근육 내에 주입함으로써, ALS를 치료하는 방법을 개시하고 있다(특허문헌 4). 란자(Lanza) 등은 혈관 아세포로부터 분화 유도한 간엽계 간질 세포를 포함하는 불필요한 면역 응답을 치료하기 위한 의약 조성물을 개시하고 있고, 대상 질환의 리스트에는 ALS도 기재되어 있지만, 구체적인 약리 효과는 나타나 있지 않다(특허문헌 5).
Winkler et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.111(11): ppE1035-E1042
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Nicaise et al., 2009, Brain Res., Vol.1301: pp152-162
Sasaki et al., 2015, Neuropathology, Vol.35(6): pp518-528
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Horita et al., 2006, J. Neurosci, Res. Vo.84(7): pp1495-1504
본 발명의 과제는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 여러가지 증상을 치료하기 위한 새로운 수단을 제공하는 데 있다.
발명자들은 ALS 모델 래트를 사용하여, 증상의 자연 경과를 운동 기능 및 조직학적 관점에서 다면적으로 평가하고, 중등도 및 중증 스테이지의 어떤 경우에 있어서도 MSC의 정맥내 투여에 의해 증상의 진행이나 경감이 가능함을 확인하였다. 또한, 보다 효과가 높은 투여 방법을 검토하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (6)에 관한 것이다.
(1) 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 의약 조성물로서, 간엽계 줄기세포를 포함하고, 정맥내 투여되는 의약 조성물.
(2) 2회 이상 투여되는, (1)에 기재된 의약 조성물.
(3) 1회의 투여로, 106개 이상의 간엽계 줄기세포가 투여되는, (1) 또는 (2)에 기재된 의약 조성물.
(4) 상기 간엽계 줄기세포가 골수 또는 혈액 유래의 간엽계 줄기세포인, (1) 내지 (3)의 어느 것에 기재된 의약 조성물.
(5) 상기 간엽계 줄기세포가 상기 환자의 골수 또는 혈액 유래의 간엽계 줄기세포인, (1) 내지 (4)의 어느 것에 기재된 의약 조성물.
(6) 상기 간엽계 줄기세포가 CD24 음성인, (1) 내지 (5)의 어느 것에 기재된 의약 조성물.
본 발명의 의약 조성물은 BBB/BSCB의 파탄을 억제함과 함께, 신경 영양 인자의 발현을 높임으로써, 신경 장애를 방지하는 것을 기대할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 증상의 진행 정도에 구애되지 않고, 운동 기능의 저하를 억제하고, 생존 기간을 연장할 수 있기 때문에 ALS의 유효한 치료 방법이 될 수 있다.
도 1은, ALS 모델 래트(SOD1G93A 변이 유전자 도입 래트)의 자연 경과를 행동 평가에 의해 나타낸다. 종축은 BBB 스코어, 횡축은 일수.
도 2는, ALS 모델 래트의 조직상(KB 염색)을 나타낸다. 자색: 신경 세포 및 아교 세포(작은 세포), 청색: 미엘린.
도 3은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 행동 평가를 나타낸다. (A) BBB 스코어(실선: MSC 투여군, 파선: 비히클 투여군), (B) BBB 스코어의 변화량(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 4는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 생존 기간의 평가를 나타낸다. (A) 카플란 메이어 곡선(실선: MSC 투여군, 파선: 비히클 투여군), (B) 40일 후의 생존율(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 5는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 척수의 운동 신경 세포수의 평가를 나타낸다. 투여 후 14일째의 척수(요수) 전각의 조직상((A) 비히클 투여군, (B) MSC 투여군, 화살표는 운동 신경 세포), 및 (C) 운동 신경 세포수의 그래프(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 6은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 BBB/BSCB 파탄의 평가를 나타낸다. 뇌피질의 염색상((A) 비히클 투여군, (B) MSC 투여군), 화살표는 운동 신경 세포), (C) 에반스 블루 누출 영역의 면적(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군, 좌측으로부터 뇌피질, 뇌간(연수), 경수, 요수의 각 부위의 누출 영역을 나타낸다).
도 7은, 정량적 RT-PCR에 의한 Nrtn 발현량(배수 변화)을 나타낸다(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 8은, ALS 모델 래트(중증-스테이지)의 행동 평가를 나타낸다(실선: MSC 투여군, 파선: 비히클 투여군).
도 9는, ALS 모델 래트(중증-스테이지)의 생존 기간의 평가를 나타낸다(상: MSC 투여군, 하: 비히클 투여군).
도 10은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 복수회 투여에 의한 행동 평가를 나타낸다. (A) BBB 스코어(실선: 복수회 MSC 투여군, 파선: 단회 MSC 투여군, 점선: 비히클 투여군), (B) BBB 스코어의 변화량(백색: 복수회 MSC 투여군, 회색: 단회 MSC 투여군, 흑색: 비히클 투여군).
도 11은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 복수회 투여에 의한 장기적인 운동 기능 평가를 나타낸다(실선: 복수회 MSC 투여군, 파선: 단회 MSC 투여군, 점선: 비히클 투여군).
도 12는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 복수회 투여에 의한 생존 기간의 평가를 나타낸다(실선: 복수회 MSC 투여군, 파선: 단회 MSC 투여군, 점선: 비히클 투여군).
도 13은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 투여량의 평가를 나타낸다(3일, 7일, 14일: 어느 것이든, 그래프 좌측으로부터 비히클 투여군, 저용량 MSC 투여군(1.0×105개, n=3), 통상량 MSC 투여군(1.0×106개, n=4), 고용량 MSC 투여군(1.0×107개, n=3)).
도 14는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 투여 방법의 평가를 나타낸다(3일, 7일, 14일: 어느 것이든, 그래프 좌측으로부터 비히클 수강내 투여군, MSC 수강내 투여군, MSC 정맥내 투여군).
도 2는, ALS 모델 래트의 조직상(KB 염색)을 나타낸다. 자색: 신경 세포 및 아교 세포(작은 세포), 청색: 미엘린.
도 3은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 행동 평가를 나타낸다. (A) BBB 스코어(실선: MSC 투여군, 파선: 비히클 투여군), (B) BBB 스코어의 변화량(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 4는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 생존 기간의 평가를 나타낸다. (A) 카플란 메이어 곡선(실선: MSC 투여군, 파선: 비히클 투여군), (B) 40일 후의 생존율(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 5는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 척수의 운동 신경 세포수의 평가를 나타낸다. 투여 후 14일째의 척수(요수) 전각의 조직상((A) 비히클 투여군, (B) MSC 투여군, 화살표는 운동 신경 세포), 및 (C) 운동 신경 세포수의 그래프(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 6은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)의 BBB/BSCB 파탄의 평가를 나타낸다. 뇌피질의 염색상((A) 비히클 투여군, (B) MSC 투여군), 화살표는 운동 신경 세포), (C) 에반스 블루 누출 영역의 면적(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군, 좌측으로부터 뇌피질, 뇌간(연수), 경수, 요수의 각 부위의 누출 영역을 나타낸다).
도 7은, 정량적 RT-PCR에 의한 Nrtn 발현량(배수 변화)을 나타낸다(흑색: MSC 투여군, 백색: 비히클 투여군).
도 8은, ALS 모델 래트(중증-스테이지)의 행동 평가를 나타낸다(실선: MSC 투여군, 파선: 비히클 투여군).
도 9는, ALS 모델 래트(중증-스테이지)의 생존 기간의 평가를 나타낸다(상: MSC 투여군, 하: 비히클 투여군).
도 10은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 복수회 투여에 의한 행동 평가를 나타낸다. (A) BBB 스코어(실선: 복수회 MSC 투여군, 파선: 단회 MSC 투여군, 점선: 비히클 투여군), (B) BBB 스코어의 변화량(백색: 복수회 MSC 투여군, 회색: 단회 MSC 투여군, 흑색: 비히클 투여군).
도 11은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 복수회 투여에 의한 장기적인 운동 기능 평가를 나타낸다(실선: 복수회 MSC 투여군, 파선: 단회 MSC 투여군, 점선: 비히클 투여군).
도 12는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 복수회 투여에 의한 생존 기간의 평가를 나타낸다(실선: 복수회 MSC 투여군, 파선: 단회 MSC 투여군, 점선: 비히클 투여군).
도 13은, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 투여량의 평가를 나타낸다(3일, 7일, 14일: 어느 것이든, 그래프 좌측으로부터 비히클 투여군, 저용량 MSC 투여군(1.0×105개, n=3), 통상량 MSC 투여군(1.0×106개, n=4), 고용량 MSC 투여군(1.0×107개, n=3)).
도 14는, ALS 모델 래트(중등도-스테이지)에 있어서의 MSC 투여 방법의 평가를 나타낸다(3일, 7일, 14일: 어느 것이든, 그래프 좌측으로부터 비히클 수강내 투여군, MSC 수강내 투여군, MSC 정맥내 투여군).
1. 근위축성 측삭 경화증
근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS)은 운동 신경이 선택적으로 장애되는 진행성의 신경 변성 질환이다. ALS는 가족성 ALS와 산발성 ALS로 크게 구별되는데, 대부분은 산발성(95％)이다. ALS는 진행성이며, 이환되면 증상이 가벼워지는 경우는 없고, 점차 전신의 근육이 움직이지 않게 되고, 최종적으로는 호흡 부전에 의해 죽음에 이른다. 현재 시점에서 ALS의 발증 원인은 불분명하며, 근본적인 치료법도 존재하지 않는다.
최근, 혈관 뇌 관문(BBB) 및 혈액 척수 관문(BSCB)의 파탄이 야기하는 신경 장애가 ALS의 원인의 하나로서 주목받고 있다. MSC는 여러가지 신경 영양 인자를 분비하는 것이 알려져 있는데, 발명자들은 MSC를 정맥내 투여에 의해, 이환 부위에 있어서 GDNF 발현이 높아지는 것을 확인하고 있다. 또한, MSC의 정맥내 투여에 의해, GDNF 패밀리의 하나인 뉴르투린(Neurturin(Nrtn))의 발현이 환부에서 증가함을 확인하고 있다(나중에 게시된 실시예).
2. 간엽계 줄기세포
본 발명의 의약 조성물에서 사용되는 「간엽계 줄기세포」란, 간엽계 조직의 간질 세포 중에 미량으로 존재하는 다분화능 및 자기 복제능을 갖는 줄기세포이며, 뼈 세포, 연골 세포, 지방 세포 등의 결합 조직 세포로 분화될뿐만 아니라, 신경 세포나 심근 세포로의 분화능을 갖는 것이 알려져 있다.
간엽계 줄기세포의 소스로서는, ES 세포나 유도 다능성 줄기세포(iPS 세포)로부터 분화 유도된 세포여도 되고, 주화된 세포여도 되고, 생체로부터 단리·증식시킨 세포여도 된다. 생체의 경우, 골수, 말초혈, 제대혈, 태아배, 뇌 등을 들 수 있는데, 골수 또는 혈액 유래의 간엽계 줄기세포, 특히 골수 간엽계 줄기세포, 그 중에서도 인간 골수 간엽계 줄기세포가 바람직하다. 골수 유래의 간엽계 줄기세포는, 1) 현저한 효과를 기대할 수 있고, 2) 부작용의 위험성이 낮고, 3) 충분한 도너 세포의 공급을 기대할 수 있고, 4) 비침습적인 치료이며 자가 이식이 가능하므로, 5) 감염증의 리스크가 낮고, 6) 면역 거절 반응의 걱정이 없고, 7) 윤리적 문제가 없고, 8) 사회적으로 받아들여지기 쉽고, 9) 일반적인 의료로서 널리 정착되기 쉽다는 등의 이점이 있다. 또한, 골수 이식 요법은 이미 임상의 현장에서 사용되고 있는 치료이며, 안전성도 확인되어 있다. 또한, 골수 유래의 줄기세포는 유주성이 높고, 국소에 대한 이식뿐만 아니라, 정맥내 투여에 의해서도 목적으로 하는 손상 조직에 도달하여 치료 효과를 기대할 수 있다.
세포는 타가 세포 유래여도 되고, 자가 세포 유래여도 되지만, 자가 세포 유래(환자 자신의 세포에서 유래한다) 간엽계 줄기세포가 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 간엽계 줄기세포는 미분화된 상태인 것이 바람직하다. 미분화된 상태의 세포는 증식률 및 생체내 도입 후의 생존율이 높기 때문이다. 미분화인 것은, 예를 들어 분화 마커인 CD24 음성에 의해 확인할 수 있다. 발명자들은 그러한 세포의 취득 방법도 개발하였고, 그 상세는 WO2009/002503호에 기재되어 있다.
발명자들이 개발한 상기 방법에서는, 골수액 등으로부터 항응고제(헤파린 등)와 실질적으로 접촉하지 않는 조건에서 분리한 세포를, 동종 혈청(바람직하게는 자가 혈청; 인간용 의약 조성물에서는 인간 혈청)을 포함하고, 또한 항응고제(헤파린 등)를 포함하지 않거나 혹은 극히 저농도로 포함하는 배지를 사용하여 증식시킨다. 「항응고제를 포함하지 않거나 혹은 극히 저농도로 포함한다」란, 항응고제로서 유효량의 항응고제를 포함하지 않는 것을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어 헤파린이나 그의 유도체이면, 통상 항응고제로서의 유효량은 약 20 내지 40μ/mL 정도인데, 발명자가 개발한 방법에서는, 미리 시료 채취를 위한 채혈관에 첨가하는 양을 최소한으로 함으로써 생체로부터 채취된 시료 중의 양은 5U/mL 미만, 바람직하게는 2U/mL 미만, 더욱 바람직하게는 0.2U/mL 미만이 되고, 세포를 배양할 때에 배지 중에 존재하는 양은, 배지의 용적에 대하여 0.5U/mL 미만, 바람직하게는 0.2U/mL 미만, 더욱 바람직하게는 0.02U/mL 미만이 된다(WO2009/034708호 참조).
배지에 있어서의 세포의 밀도는 세포의 성질 및 분화의 방향성에 영향을 준다. 간엽계 줄기세포의 경우, 배지 중의 세포 밀도가 8,500개/㎠를 초과하면 세포의 성질이 변화되어버리기 때문에, 최대라도 8,500개/㎠ 이하로 계대 배양시키는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 5,500개/㎠ 이상이 된 시점에서 계대 배양시킨다.
발명자들이 개발한 상기 방법에서는 인간 혈청 함유 배지를 사용하기 때문에, 혈청 도너의 부담을 고려하여 배지 교환은 가능한 한 적은 횟수인 것이 바람직하고, 예를 들어 적어도 주 1회, 보다 바람직하게는 주 1 내지 2회의 배지 교환을 행한다.
배양은 세포의 총 수가 108개 이상이 될 때까지 계대 배양을 반복하여 행한다. 필요로 되는 세포수는 사용 목적에 따라서 변화될 수 있는데, 예를 들어 뇌경색 등의 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 이식에 필요하게 되는 간엽계 줄기세포의 수는 107개 이상, 본 발명에서는 106개 이상으로 생각된다. 발명자들이 개발한 방법에 의하면, 12일간 정도에서 107개의 간엽계 줄기세포를 얻을 수 있다.
증식된 간엽계 줄기세포는 필요에 따라, 사용될 때까지 동결 보존 등의 방법으로(예를 들어, -152℃의 초저온 냉동고에서) 보존해도 된다. 동결 보존에는 혈청(바람직하게는 인간 혈청, 보다 바람직하게는 자가 혈청), 덱스트란, DMSO를 포함하는 배지(RPMI 등의 포유 동물 세포용의 배지)를 동결 보존액으로서 사용한다. 예를 들어, 통상의 여과 멸균한 RPMI 20.5mL와, 환자로부터 채취한 자기 혈청 20.5mL, 덱스트란 5mL, DMSO 5mL를 포함하는 동결 보존액에 세포를 현탁하여 -150℃에서 동결 보존할 수 있다. 예를 들어 DMSO로서는, 니프로 가부시키가이샤제의 크라이오서브, 덱스트란은 오츠카 세이야쿠제의 저분자 덱스트란 L주를 사용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
상기와 같이 하여 조제한 간엽계 줄기세포는, a) 간엽계 줄기세포를 포함하는 배양물에 사이토카인을 첨가하고, 간엽계 줄기세포가 CX3CL1을 발현하고 있음을 확인하거나, 혹은 b) 간엽계 줄기세포가 EGFR 및/또는 ITGA4를 발현하고 있음을 확인함으로써, 당해 간엽계 줄기세포의 품질·기능을 확인해도 된다.
사용하는 「염증성 사이토카인」으로서는, TNF-α, INFγ, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18을 들 수 있고, 그 중에서도 TNF-α, INFγ, 및 IL-6을 포함하는 것이 바람직하고, TNF-α, INFγ, 및 IL-6의 혼합물을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 방법은 (사이토카인 미첨가) 배양물 중에 있어서의 BDNF, VEGF, 및 HGF로부터 선택되는 어느 하나 이상의 존재를 확인하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 특히, BDNF 및/또는 VEGF의 존재를 확인하는 것이 중요하며, BDNF의 존재를 확인하는 것이 가장 중요하다.
염증성 사이토카인의 첨가에 의해 간엽계 줄기세포가 CX3CL1을 발현하면, 당해 간엽계 줄기세포는 염증 조정 작용(면역 조정 작용)이 우수할 것을 기대할 수 있고, 간엽계 줄기세포의 90％ 이상이 EGFR 및/또는 ITGA4를 발현하고 있으면, 당해 간엽계 줄기세포는 손상 부위에 대한 집적능이 우수할 것을 기대할 수 있다. 또한, 배지 중에 BDNF, VEGF, 및 HGF 등의 영양 인자 중 어느 것이 존재하면 신경 보호 작용이 높은 간엽계 줄기세포를 포함할 것을 기대할 수 있고, 그 중에서도 BDNF 및/또는 VEGF의 존재, 특히 BDNF의 존재는 신경 보호 작용이 높은 MSC의 중요한 지표일 수 있다. 간엽계 줄기세포는 미자극으로도 BDNF, VEGF 및/또는 HGF를 분비하는데, 분비능의 확인은 미자극의 세포로부터의 분비를 평가해도 되고, 염증성 사이토카인 자극 후의 세포로부터의 분비를 평가해도 된다.
상기 CX3CL1, EGFR, ITGA4, BDNF, VEGF, HGF의 발현은 유전자 레벨보다 단백 레벨에서의 발현을 지표로 하는 것이 바람직하고, EGFR이나 ITGA4 등의 세포 표면 단백의 경우에는, 간편함과 감수성의 점에서 플로 사이토메트리(FCM)를 사용하여 측정하는 것이 바람직하고, CX3CL1, BDNF, VEGF, HGF 등의 분비 단백의 경우에는, 간편함과 감수성의 점에서 비즈 어세이를 사용하는 것이 바람직하다.
3. 본 발명의 의약 조성물
본 발명의 의약 조성물은 ALS를 치료하기 위한 의약 조성물로서, 간엽계 줄기세포를 포함하고, 정맥내 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 간엽계 줄기세포의 세포수는 많을수록 바람직하지만, 환자에 대한 투여 시기나, 배양에 요구되는 시간을 감안하면, 효과를 나타내는 최소량인 것이 실용적이다. 따라서 본 발명의 의약 조성물의 바람직한 양태에 있어서, 1회의 투여에 포함되는 간엽계 줄기세포의 세포수는 106개 이상, 바람직하게는 5×106개 이상, 보다 바람직하게는 107개 이상, 보다 바람직하게는 5×107개 이상, 보다 바람직하게는 108개 이상, 더욱 바람직하게는 5×108개 이상이다.
본 발명의 의약 조성물은 정맥내 투여 제제이다. 정맥내 투여 제제는 수성 또는 비수성의 등장성 무균 용액 또는 현탁액의 형태이며, 예를 들어 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리 식염수, 배지(특히, RPMI 등의 포유 동물 세포의 배양에 사용되는 배지), PBS 등의 생리 완충액, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등을 적절히 조합하여, 적절한 단위 투여 형태로 제제화된다.
주사용의 수용액으로서는, 예를 들어 생리 식염수, 배지, PBS 등의 생리 완충액, 포도당이나 기타의 보조제를 포함하는 등장액, 예를 들어 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨 등을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜이나 비이온성 계면 활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80, HCO-50 등과 병용해도 된다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 대상이 되는 ALS는 가족성인지 산발성인지를 막론하고, 경증인지 중증인지도 묻지 않는다. 경증의 ALS의 경우에는, 본 발명의 의약 조성물의 투여에 의해 증상의 개선과 진행 억제를 기대할 수 있고, 중등도부터 중증의 ALS의 경우에는 진행 억제를 기대할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 횟수나 투여 간격은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 치료 효과를 기대할 수 있는 한 복수회 반복하여 투여할 수 있다. 첫회 투여 후, 증상이 진행될 때마다 투여해도 되고, 정기적으로 투여해도 된다. 따라서, 투여 간격은 증상에 따라 1개월에서 10수년, 예를 들어 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년 내지 10수년일 수 있다. 투여를 반복함으로써, 증상을 좋은 상태로 유지할 수 있고, 생존 기간도 늘릴 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 공지된 ALS 치료약, 예를 들어 리루졸, 에다라본, 페니실린, β락탐계 항생 물질 등과 병용할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 BBB/BSCB의 파탄을 억제함과 함께, 신경 영양 인자의 발현을 촉진하고, 신경 장애를 억제할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 증상의 진행 정도에 구애되지 않고, 운동 기능의 저하를 억제하고, 생존 기간을 연장할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 래트 골수 유래 간엽계 줄기세포의 조제
이하의 실시예에서 사용하는 MSC는 기보에 따라, 이하의 수순으로 조제하였다.
실험은 삿포로 의과대학의 동물 실험 관리 규정에 따라서 실시하였다. 기보에 따라서, 성숙 SD 래트의 대퇴골로부터 얻은 골수를 둘베코의 개변 이글 배지(DMEM)로 25ml로 희석하고, 가열 불활성화한 10％ FBS, 2mM 1-글루타민, 100U/ml페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신을 첨가하고, 5％ CO2 분위기 하 37℃에서 3일간 인큐베이트했다(Kim S. et al., Brain Res. 2006; 1123: 27-33. Ukai R. et al., J. Neurotrauma. 2007; 24: 508-520.). 전면생장이 될 때까지 배양하고, 접착 세포를 트립신-EDTA로 박리하고, 1x104개/ml의 밀도로 3회 계대 배양하여 간엽계 줄기세포(MSC)를 얻었다.
실시예 1: ALS 모델 래트의 자연 경과
1. 행동 평가
방법
ALS 모델 래트(SOD1 래트(SD Tg(SOD1G93A)L26H))는 타코닉 바이오사이언스로부터 구입하고, 행동 평가를 행하였다. SOD1 래트는 SOD1 유전자 변이(SOD1G93A)를 갖고, 인간 ALS의 병태를 매우 잘 재현하는 것이 알려져 있다(https://www.taconic.com/rat-model/sod1-rat).
결과
발증은 테일 다운 또는 뒷다리 이상 보행으로서 나타나고, 급속하게(약 10일간) 뒷다리 마비로 진행되었다. 중등도(중등도-스테이지: BBB 스코어 15 내지 11)에서, 래트는 전형적으로는 한쪽 다리에 최초의 마비가 나타났다. 중증(중증-스테이지: BBB 스코어 10 내지 8)에서는 양쪽 발이 마비되지만, 앞다리를 사용하여 걸을 수 있었다. 말기(말기-스테이지)에는, 래트는 직립 반사를 할 수 없게 되었다(도 1).
2. 조직학적 평가
방법
ALS 모델 래트의 자연 경과를 조직학적으로 평가하기 위해서, 뒷다리 운동 기능 평가의 지표인 BBB 스코어가 21점, 11점, 0점인 래트의 척수를 클루버-바레라(Kluver-Barrera) 염색(이하 KB 염색)에 의해 신경 세포와 미엘린을 염색하고, 운동 신경 세포수의 변화를 관찰하였다. BBB 스코어는 오픈 필드에 래트를 넣어서 5분간 자유롭게 여기 저기 움직이게 하고, 뒷다리의 운동 기능을 평가하는 방법이다(정상 21점, 증상 악화에 따라 점수가 낮아지고 11점에서 보행 곤란, 0점이 가장 나쁘고 보행 불가).
ALS 모델 래트를 마취약(케타민 100mg/kg, 자일라진 20mg/kg)으로 깊게 마취를 가하고, PBS 및 4％ 파라포름알데히드를 포함하는 0.1M 포스페이트 완충제(4％ PFA)로 관류 고정을 행하였다. 척수를 취출하고 각각 C1, T6, L4 영역으로 잘라나누고 4％ PFA로 밤새 고정하였다. 고정 후 파라핀 포매를 행하고, 10㎛ 두께의 절편을 잘라내어 슬라이드 글래스에 첩부하였다. 그 후, KB 염색을 행하여 형광 현미경(KEYENCE BZ9000)으로 촬영을 행하였다.
결과
도 2에 염색상을 나타낸다. 정상(BBB 스코어 21)으로부터 중등도(BBB 스코어 11)로 증상이 진행되면 경수(C1), 흉수(T6), 요수(L4)의 어떤 경우든 운동 신경 세포(700㎛2 이상의 큰 세포)의 수가 적어졌다. 또한 말기 증상(BBB 스코어 0)이 된 래트의 경수, 흉수에는 신경 세포의 잔존을 확인할 수 있었지만, 요수에서는 신경 세포가 거의 완전히 상실되어 있었다.
실시예 2: ALS 모델 래트에 있어서의 MSC 정맥 투여의 효과(연구 1: 중등도-스테이지)
1. 행동 평가
방법
BBB 스코어가 15점으로 저하된 ALS 모델 래트를 MSC 투여군(n=6)과 비히클 투여군(n=13)의 2군으로 나누고, MSC 투여군에는 1mL의 비히클(fresh DMEM)에 MSC를 (1.0×106개) 용해시킨 용액을, 경정맥(經靜脈)적으로 대퇴정맥으로부터 투여하였다. 비히클 투여군에는 1mL의 DMEM을 경정맥적으로 투여하였다. 면역 억제제인 시클로스포린 A(10mg/kg)를 모든 래트에 대하여 MSC 및 비히클 투여의 전날부터 말기-스테이지가 될 때까지 매일 복강내 투여하였다.
행동 평가는 BBB 스코어를 사용하여 행하고, 주에 2회 이상, 오픈 필드에 래트를 넣어서 5분간 자유롭게 여기 저기 움직이게 하고 뒷다리의 운동 기능을 평가하였다. 평가자는 래트가 어느 치료군에 속하는지 모르게 하였다.
결과
BBB 스코어의 저하는 MSC 투여군에서 유의미하게 억제되었다(도 3의 (A)). 특히 투여 3일째의 평가에서는 MSC 투여군에서 증상의 개선이 관찰되었다. BBB 스코어의 변화량을 나타낸다. BBB 스코어의 변화량은, MSC 투여군에서는 비히클 투여군보다 작았다(도 3의 (B)).
2. 생존 기간
방법
행동 평가를 실시한 래트에 대해서, MSC 혹은 비히클 투여 후 40일간의 생존율을 카플란 메이어 곡선을 사용하여 평가하였다.
결과
40일 후에 비히클 투여군에서는 반수 이상이 사망했지만, MSC 투여군에서는 80％ 이상이 살아 남았다(도 4).
3. 척수 운동 신경 세포수
방법
BBB 스코어가 15점으로 저하된 ALS 모델 래트를 MSC 투여군(n=3)과 비히클 투여군(n=6)의 2군으로 나누고, 상기와 마찬가지로 MSC 혹은 비히클을 투여하고, 투여 후 14일째에 척수(요수) 전각 운동 신경 세포를 비교하였다. 면역 억제제인 시클로스포린 A(10mg/kg)를 모든 래트에 대하여 MSC 및 비히클 투여의 전날부터 투여 14일 후의 최종 평가일까지 매일 복강내 투여하였다. 운동 신경 세포의 정의는 면적이 700㎛2 이상인 세포로 하였다.
결과
MSC 투여군은 비히클 투여군과 비교하여 유의미하게 많은 운동 신경 세포가 보존되어 있었다(도 5).
4. 혈액 뇌 관문/혈액 뇌척수 관문(BBB/BSCB)의 파탄
방법
BBB 스코어가 15점으로 저하된 ALS 모델 래트를 MSC 투여군(n=4)과 비히클 투여군(n=4)의 2군으로 나누고, 상기와 마찬가지로 MSC 혹은 비히클을 투여하고, 투여 후 14일째에 혈액 뇌 관문/혈액 뇌척수 관문(BBB/BSCB)의 파탄을 평가하기 위해서, 각각의 래트에 4％ 에반스 블루(EvB, Sigma, 4ml/kg)를 미정맥으로부터 투여하였다. 1시간 후에 마취약(케타민 100mg/kg, 자일라진 20mg/kg)으로 깊게 마취를 가하고, PBS 및 4％ PFA로 관류 고정하였다. 뇌 및 척수를 취출한 후, 뇌, 뇌간(연수), 경수, 요수의 4 부위로 나누어서 각각 OCT 화합물로 포매하고 -80℃로 냉각한 아세톤 중에서 동결시켰다. 크라이오스탯을 사용하여 20㎛ 절편을 100㎛ 간격으로 9매 잘라내서 슬라이드 글래스에 첩부하였다. DAPI로 대비 염색을 행하고 VECTASHIELD(Vector Laboratories)를 사용하여 커버 슬라이드를 가하였다. 절편은 공초점 현미경을 사용하여 관찰하고, 혈관 외로 누출된 에반스 블루의 면적을 Image J 소프트웨어(NIH)를 사용하여 측정하였다. Ex/Em(DAPI에 대해 405㎚, FITC-렉틴에 대해 488㎚, 그리고 EvB에 대해 561㎚; LSM780 ELYRA S.1 system, Zeiss).
결과
뇌피질, 뇌간(연수), 경수, 요수 어느 것에 있어서도 MSC 투여군에서는 유의미하게 에반스 블루의 누출이 적음이 확인되어, BBB/BSCB의 파탄이 억제 또는 수복되어 있음을 확인할 수 있었다(도 7).
5. Nrtn의 발현 해석(정량적 RT-PCR)
방법
BBB 스코어가 15점으로 저하된 ALS 모델 래트를 MSC 투여군(n=4)과 비히클 투여군(n=4)의 2군으로 나누고, 상기와 마찬가지로 MSC 혹은 비히클을 투여하고, 24시간 후에 마취약으로 깊게 마취를 가한 후, 척수(요수)를 취출하고, RNeasy Plus mini kit(QIAGEN, Venlo, The Netherlands)를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA의 품질은 Bioanalyzer RNA 6000 nano kit(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 RIN 수를 확인하고, RIN>8.0인 샘플만을 사용하였다. 정량은 qRT-PCR법으로 행하고, TaqMan(등록 상표) 우라실-N 글리코실라제(UNG)를 갖는 Universal Master Mix II 및 TaqMan(등록 상표) Gene Expression assays(Gapdh, Rn01775763_g1; Nrtn), 7500 software v2.3을 갖는 PRISM7500(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용하였다. ΔΔCt법을 사용하고, 내인성 컨트롤은 Gapdh로 하고, 비히클 투여군에 대한 MSC 투여군의 유전자 발현비를 비교했다(n=4). 서멀 사이클러의 프로토콜은 이하와 같다.
50℃ 2분, 95℃ 10분 후, 95℃ 15초, 60℃ 1분을 40 사이클.
결과
MSC 투여군에서 유의미하게 Nrtn의 발현량이 높았다(도 7). Nrtn은 GDNF 패밀리의 하나이며, 그의 mRNA 발현이 유의미하게 MSC 투여군에서 증가함이 확인되었다. 이 결과로부터, MSC 이식에 의해 척수 전각의 운동 신경 세포에 대한 신경 영양 작용이 발휘되어, 조직학적으로는 잔존 신경 세포수가 많아지고, 그에 의해 신경 증상에서의 치료 효과로 결부되었다고 생각된다.
실시예 3: ALS 모델 래트에 있어서의 MSC 정맥 투여의 효과(연구 2: 중증-스테이지)
방법
BBB score가 11점으로 저하된 중증 운동 기능 장애를 나타낸 ALS 모델 래트를 2군으로 나누고, MSC 투여군(n=6)에는 1mL의 비히클(fresh DMEM)에 MSC(1.0×106개)를 용해시키고, 경정맥적으로 대퇴정맥으로부터 투여하였다. 비히클 투여군(n=7)에는 1mL의 비히클(fresh DMEM)을 경정맥적으로 투여하고, 운동 기능 및 생존 기간을 평가하였다. 면역 억제제인 시클로스포린 A(10mg/kg)를 모든 래트에 대하여 MSC 및 비히클 투여의 전날부터 말기-스테이지가 될 때까지 매일 복강내 투여하였다.
결과
운동 기능의 저하는 비히클 투여군(n=7)에 비하여 MSC 투여군(n=6)에서 유의미하게 억제되고(도 8), 생존 기간도 유의미하게 연장되었다(도 9).
실시예 4: ALS 모델 래트에 있어서의 MSC 복수회 투여의 효과
1. 행동 평가
방법
BBB 스코어가 15점으로 저하된 중등도의 운동 기능 장애를 나타낸 ALS 모델 래트에 대하여 MSC(1.0×106개)를 1주일 간격으로 1회씩, 복수회 정맥내 투여를 행하였다. 복수회 투여군(n=9)의 운동 기능을 BBB 스코어로 평가하고, 단회 투여군(n=5) 및 비히클 투여군(n=6)과 비교하였다. 면역 억제제인 시클로스포린 A(10mg/kg)를 모든 래트에 대하여 MSC 및 비히클 투여의 전날부터 최종 평가일까지 매일 복강내 투여하였다.
결과
MSC의 복수회 투여군에서는 1회째뿐만 아니라 2회째의 투여에서도 운동 기능의 개선이 보였다(도 10). 투여 7일째, 14일째 모두 비히클 투여군에 비하여 유의미하게 운동 기능을 억제하였다.
2. 장기적 운동 기능
방법
MSC 복수회 투여군(n=7)의 장기적인 운동 기능의 변화를 MSC 단회 투여군(n=6) 및 비히클 투여군(n=13)과 비교하였다. 면역 억제제인 시클로스포린 A(10mg/kg)를 모든 래트에 대하여 MSC 및 비히클 투여의 전날부터 말기-스테이지가 될 때까지 매일 복강내 투여하였다.
결과
복수회 투여군에서는 단회 투여군, 비히클 투여군보다 장기간 운동 기능을 유지할 수 있었다(도 11).
3. 생존 기간
방법
MSC 복수회 투여군(n=7)의 생존 기간을 MSC 단회 투여군(n=6) 및 비히클 투여군(n=13)과 비교하였다.
결과
복수회 투여군에서는 단회 투여군, 비히클 투여군보다 유의미하게 생존 기간이 연장되었다(도 12).
실시예 5: ALS 모델 래트에 있어서의 MSC 투여량에 의한 효과의 차이
방법
MSC 투여량을 저용량군(1.0×105개, n=3), 통상량(1.0×106개, n=4), 고용량(1.0×107개, n=3)의 3군으로 나누고, BBB 스코어가 15점으로 저하된 ALS 모델 래트에 경정맥내 투여하고, BBB 스코어의 변화량을 비히클 투여군(n=6)과 비교하였다.
면역 억제제인 시클로스포린 A(10mg/kg)를 모든 래트에 대하여 MSC 및 비히클 투여의 전날부터 최종 평가일까지 매일 복강내 투여하였다.
결과
통상량 및 고용량 투여군에서 유의미하게 운동 기능 저하가 억제되었다(도 13).
실시예 6: ALS 모델 래트에 있어서의 MSC 투여 방법에 의한 효과의 차이
방법
MSC의 투여 방법을 정맥내 투여(n=3)와 수강내 투여(n=3)의 2군으로 나누어, 뒷다리 운동 기능의 변화를 비히클 수강내 투여군(n=3)과 비교하였다. 정맥내 투여군은 1mL의 DMEM에 용해한 MSC 1.0×106개를 대퇴정맥으로부터 투여하고, 수강내 투여군은 1.0×105개의 MSC를 헤밀톤 시린지(HAMILTON)를 사용하여 소뇌연수조 내에 투여하였다. 면역 억제제인 시클로스포린 A(10mg/kg)를 모든 래트에 대하여 MSC 및 비히클 투여의 전날부터 최종 평가일까지 매일 복강내 투여하였다.
결과
투여 14일째의 평가에서는 정맥내 투여군에서 유의미하게 운동 기능 저하가 억제되었다. 또한, 투여 3일째에는 정맥내 투여군에서 증상의 개선이 확인되었다(도 14).
본 발명의 의약 조성물은 BBB/BSCB의 파탄을 방지함과 함께, 신경 영양 인자의 분비를 촉진하고, 신경 장애를 억제함으로써, ALS의 진행을 억제하고, 생존 기간을 연장할 수 있다. 본 발명에 따르면, 지금까지 유효한 치료 방법이 없었던 ALS의 치료가 가능해진다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 도입하는 것으로 한다.
Claims (6)
- 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 의약 조성물로서, 간엽계 줄기세포를 포함하고, 정맥내 투여되는 의약 조성물.
- 제1항에 있어서, 2회 이상 투여되는 의약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 1회의 투여로, 106개 이상의 간엽계 줄기세포가 투여되는 의약 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포가 골수 또는 혈액 유래의 간엽계 줄기세포인 의약 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포가 상기 환자의 골수 또는 혈액 유래의 간엽계 줄기세포인 의약 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간엽계 줄기세포가 CD24 음성인 의약 조성물.
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