KR20210136731A

KR20210136731A - 엑소좀 유래 rna를 이용한 비침습적 대장암 진단 및 분석법

Info

Publication number: KR20210136731A
Application number: KR1020200055410A
Authority: KR
Inventors: 노태영; 신설화; 강병희
Original assignee: 시스젠랩 주식회사
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2021-11-17
Also published as: KR20220025797A; KR102380898B1; KR102539423B1

Abstract

본 발명에 의하면, 대장암 환자의 조직 생검을 통하지 않고 분변 등에 포함된 대장암 조직 유래 엑소좀을 순수 분리하고, 차세대 염기서열 분석 기술을 통한 RNA 프로파일링을 실시함으로써 비침습적 진단을 위한 RNA를 확보할 수 있다. 따라서, 대장암 조직의 엑소좀 유래 RNA 정보로부터 대장암과 관련되어 있다고 알려진 miRNA를 검증할 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 종류의 miRNA를 포함한 작은 RNA(small RNA)를 발굴할 수 있어 신규의 대장암 마커를 발굴할 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

Description

엑소좀 유래 RNA를 이용한 비침습적 대장암 진단 및 분석법{Non-invasive diagnosis and analysis of colorectal cancer using RNA isolated from exosomes}

본 발명은 대장암 환자의 시료에 포함된 암 조직 유래 엑소좀을 분리하고, 여기에 포함된 RNA를 차세대 염기서열 분석 기술을 활용하여 분석함으로써 대장암의 비침습적 조기 진단 또는 예후 예측을 위한 마커를 발굴하는 방법 및 발굴된 마커를 이용한 대장암 진단 및 분석 기술에 관한 것이다.

대부분의 세포는 다양한 크기와 성분을 가지는 세포 내 기원의 세포외 소낭을 분비할 수 있는 능력을 가지고 있는데, 엑소좀은 그 중에 크기가 가장 작은(50-90 nm) 막소낭이다. 기원세포에서 유래한 엑소좀은 핵산(RNA와 DNA)과 단백질이 포함되어 있어서, 수여세포로 이들이 전달될 때 수여세포의 유전자 발현 및 억제를 비롯하여 다양한 분자 생물학적 기능 조절 작용을 통해, 수여세포의 기능에 영향을 미치는 핵심적인 세포 간 신호 전달 물질로 간주되고 있다.

일반적으로, 암세포는 정상 세포에 비하여 많은 양의 엑소좀을 배출하는 것으로 알려져 있다. RNA 중 miRNA를 비롯한 50 뉴클레오티드 이하의 짧은 길이 RNA는 세포 내에서 유전자의 발현을 억제하는 기능을 하고 있는 것으로 알려져 있으며, 엑소좀의 RNA는 전장(full length) mRNA 보다는 분절된 짧은 길이의 RNA(small RNA) 형태로 대부분 존재하기 때문에, 암세포 유래 엑소좀 RNA의 임상적 중요성은 점점 커지고 있다.

한편, 대장암은 환경적인 요인과 유전적인 요인으로 발병하는 것으로 알려져 있으며, 1980년대 이후 현재까지 꾸준히 발병률이 증가하고 있는 암으로, 2017년 국내 통계에 의하면 위암에 이어 두 번째로 많이 발생한 암으로, 총 28,111건으로 전체 암 발생(232,255건)의 12.1%를 차지하였다. 대장암 진단은 수지검사, 대장이중조영, S상 결장경 및 대장 내시경 등을 이용한 검사를 통하여 이루어지고, 의심 부위의 조직검사를 통하여 확진이 가능하다. 대장암의 발병 기전과 진단을 위한 연구를 통하여 특정 단백질과 miRNA가 대장암 발병과 관련이 있다는 결과들이 발표되고 있다.

대개의 경우, 대장 전체의 관찰이 가능하고, 조직검사까지 동시에 할 수 있는 대장 내시경이 대장암 진단을 위한 가장 효과적이면서 정확한 검사 방법으로 많이 추천되고 있다. 하지만, 대장 내시경의 경우 검사 전 대장정결이 필요하고, 수면 내시경이 아닐 경우 환자가 불편할 수 있으며, 암 등으로 대장 내강이 막혀 있으면 더 이상 검사를 진행할 수 없는 문제점이 있다.

대한민국공개특허 제10-2019-0113108호

비침습적인 방법을 통한 대장암 진단의 필요성이 대두됨에 따라, 본 발명자들은 대장암 환자의 시료로부터 분리한 암 조직 유래 엑소좀으로부터 RNA 중 사이즈가 작은 RNA(small RNA)만을 선별적으로 추출하고, 이를 대상으로 차세대 염기서열 분석을 실시하여 엑소좀 내 miRNA를 포함하는 RNA의 분석 및 프로파일링을 실시하여, 비침습적 방법으로 대장암을 진단할 수 있는 진단 마커를 발굴하는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측을 위한 마커를 발굴하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 대장암 환자로부터 채취된 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; (b) 분리된 엑소좀으로부터 RNA를 분리하는 단계; (c) 분리된 RNA에 대하여 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing)을 실시하여 서열 데이터를 얻는 단계; (d) 얻어진 서열 데이터를 참조 RNA 데이터베이스와 비교하여 RNA를 동정하는 단계; (e) 동정된 RNA 중에서 검출 빈도(read count)가 높은 하나 이상의 RNA를 대장암 진단 또는 예후 예측용 마커로 선별하는 단계; 및 (f) 대장암 환자로부터 채취된 시료를 이용하여 단계 (e)에서 마커로 선정된 RNA의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측을 위한 마커를 발굴하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 대장암 환자로부터 채취된 분변, 분변 세척액, 소변, 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택된 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 RNA는 1 내지 200개의 뉴클레오티드를 갖는 작은 RNA(small RNA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)는 핵산 분리시약을 사용하여 엑소좀으로부터 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA에 대하여 Urea-PAGE(Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 실시하여 목적하는 크기의 RNA를 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 참조 RNA 데이터베이스는 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR, RefSeq, 및 Ensemble 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 데이터베이스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (d)에서 RNA의 동정은 얻어진 서열 데이터를 참조 RNA 데이터베이스와 비교하여, 알려진 RNA(예컨대, miRNA) 또는 신규한 RNA로 분류할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (e)는 검출 빈도(read count)가 3 이상인 RNA를 선별할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (f)에서 마커 RNA의 존재 여부의 확인은 마커 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 발굴된 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 RNA는 (1) hsa-mir-3622a, (2) hsa-mir-215, (3) hsa-mir-93, (4) hsa-mir-4802, (5) hsa-mir-21, (6) hsa-mir-192, (7) hsa-mir-22, (8) hsa-mir-194-2, (9) hsa-mir-200c, (10) hsa-mir-200b, (11) hsa-mir-194-1, (12) hsa-mir-200a, (13) hsa-mir-30d, 및 (14) hsa-mir-30e로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 대장암 환자의 조직 생검을 통하지 않고 분변 등에 포함된 대장암 조직 유래 엑소좀을 순수 분리하고, 차세대 염기서열 분석 기술을 통한 RNA 프로파일링을 실시함으로써 비침습적 진단을 위한 RNA를 확보할 수 있다. 따라서, 대장암 조직의 엑소좀 유래 RNA 정보로부터 대장암과 관련되어 있다고 알려진 miRNA를 검증할 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 종류의 miRNA를 포함한 RNA를 발굴할 수 있어 신규의 대장암 마커를 발굴할 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전체 실험과정 및 분석방법에 대한 흐름도를 보여주는 도이다.
도 2는 실시예 3과 관련된 도로서, 실시예 2에서 추출한 엑소좀 RNA를 대상으로 15% Urea-PAGE(Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 실시한 후 RNA를 염색한 사진을 보여주는 도이다.
도 3은 RNA 염기서열 분석 파이프라인에 대한 모식도를 보여주는 도이다.
도 4는 실시예 6과 관련된 도로서, Sample 1, 2 및 3에 대한 14개의 miRNA 프라이머를 이용해 PCR을 실시하고 1.5% 아가로스 젤에 전기영동 한 결과를 보여주는 도이다. 각 웰별로 miRNA 프라이머 이름과 결합 온도(Ta)를 표에 기재하였다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측을 위한 마커를 발굴하는 방법을 제공한다:

(a) 대장암 환자로부터 채취된 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계;

(b) 분리된 엑소좀으로부터 RNA를 분리하는 단계;

(c) 분리된 RNA에 대하여 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing)을 실시하여 서열 데이터를 얻는 단계;

(d) 얻어진 서열 데이터를 참조 RNA 데이터베이스와 비교하여 RNA를 동정하는 단계;

(e) 동정된 RNA 중에서 검출 빈도(read count)가 높은 하나 이상의 RNA를 대장암 진단 또는 예후 예측용 마커로 선별하는 단계; 및

(f) 대장암 환자로부터 채취된 시료를 이용하여 단계 (e)에서 마커로 선정된 RNA의 존재 여부를 확인하는 단계.

본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"은 나노 단위 크기(예컨대, 50-90 nm)를 갖는 소낭 구조를 갖는 세포밖 소포체를 의미하며, 유래되는 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질이중막에 의해 엑소좀 내부와 외부가 분리된 구조를 가지며, 세포의 세포막 지질, 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분 등을 가지고 있다. 엑소좀은 세포 간의 mRNA, miRNA, DNA, 및 단백질의 운송을 매개하고 세포 내외의 신호전달 및 상호작용에 중요한 역할을 한다.

상기 대장암 환자로부터 채취된 시료는 비침습적으로 획득될 수 있는 시료로서, RNA를 포함하고 있는 모든 시료를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 시료는 대장암 환자로부터 채취된 분변, 분변 세척액, 소변, 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 시료는 대장암 환자로부터 채취된 분변 또는 이의 세척액일 수 있으며, 상기 분변 세척액은 분변을 적절한 버퍼로 세척하여 얻은 용액 샘플을 원심분리 하여 불순물을 제거하는 과정을 통하여 준비할 수 있다.

상기 단계 (a)에서 엑소좀의 분리는 엑소좀 분리 방법으로 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 초원심분리(ultra-centrifugation isolation), 크기별 제외법(size exclusion), 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation), 미세유체 기술(microfluidics chip) 및 폴리머를 이용한 방법(polymeric method) 등을 사용하여 엑소좀을 분리할 수 있다. 또한, 시판중인 엑소좀 분리용 키트(예컨대, Exo2D^TM EV isolation kit)를 사용하여 엑소좀을 분리할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “RNA”는 리보오스(ribose)를 기반으로 뉴클레오티드를 이루는 핵산의 한 종류로서, 핵염기(Nucleobase)로 DNA와 달리 티민 대신 우라실을 갖는다. 본 발명의 목적 상 상기 RNA는 엑소좀으로부터 분리된 RNA를 의미하며, 작은 RNA(small RNA)를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “작은 RNA(small RNA)”는 200 nt(뉴클레오티드) 이하의 크기를 갖는 mRNA 조각, 또는 보통 비번역 RNA 분자로서, microRNA(miRNA)뿐만 아니라, piwi-interacting RNA(piRNA), small interfering RNA(siRNA), small nucleolar RNA(snoRNA), tRNA-derived small RNA(tsRNA), small rDNA-derived RNA(srRNA) 및 small nuclear RNA를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀으로부터 분리되는 작은 RNA(small RNA)는 1 내지 200개의 뉴클레오티드를 갖는 RNA일 수 있다. 하나의 특정예에서, 상기 작은 RNA는 10 내지 100개, 10 내지 90개, 10 내지 80개, 10 내지 70개, 10 내지 60개, 10 내지 50개, 10 내지 40개 또는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖는 RNA일 수 있으며, 예를 들어, 상기 작은 RNA는 12 내지 28개의 뉴클레오티드, 15 내지 26개의 뉴클레오티드 또는 17 내지 25개의 뉴클레오티드를 갖는 RNA일 수 있다.

상기 단계 (b)에서는 당업계에 알려진 RNA 분리 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 핵산 분리시약(예컨대, 트리졸(Trizol), 트리톤 X-100(Triton X-100) 등)을 사용하여 엑소좀으로부터 전체 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA에 대하여 전기영동(예컨대, Urea-PAGE, Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis)을 실시하여 얻은 miRNA를 포함하는 작은 사이즈(예컨대, 17-25 뉴클레오티드)의 RNA 밴드로부터 목적하는 크기의 RNA를 용출시켜 분리할 수 있다.

단계 (c)에서는 단계 (b)에서 분리한 RNA에 대하여 차세대 염기서열 분석(NGS, Next generation sequencing)을 실시하여 서열 데이터를 얻는다. 상기 차세대 염기서열 분석은 유전체의 염기서열의 고속 분석 방법으로서, High-throughput sequencing, Massive parallel sequencing 또는 Second-generation sequencing 이라고도 불리우며, 기존 Sanger 염기서열 분석과 달리 많은 수의 DNA 조각을 병렬로 처리하는 데 특징이 있다. 차세대 염기서열 분석의 등장으로 유전체 분석에 필요한 비용이 급격히 낮아져 많은 분야에서 다양하게 사용되고 있다.

본 발명에서는, 단계 (c)에서 얻은 서열 데이터를 참조 RNA 데이터베이스와 비교하여 RNA를 동정하게 된다. RNA들의 서열, 정보 및 특징들을 저장, 관리하는 데이터베이스들이 구축되었으며, 본 발명에서는 이러한 RNA 데이터베이스와 단계 (c)에서 얻은 서열 데이터를 비교하여 엑소좀으로부터 분리한 RNA를 동정한다.

본 발명에 있어서, 상기 참조 RNA 데이터베이스는 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR, RefSeq, 및 Ensemble 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 데이터베이스를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (d)에서 RNA의 동정은 얻어진 서열 데이터를 참조 RNA 데이터베이스와 비교하여, 알려진 RNA(예컨대, miRNA) 또는 참조 데이터베이스에 없는 신규한 RNA로 분류할 수 있다.

단계 (e)에서는 단계 (d)를 통하여 동정한 RNA 중에서 검출 빈도(read count)가 높은 하나 이상의 RNA를 대장암 진단 또는 예후 예측용 마커로 선별한다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (e)에서는 검출 빈도가 3 이상인 RNA를 선별할 수 있다. 예를 들어, 단계 (e)에서는 검출 빈도가 3 이상, 5 이상, 10 이상, 12 이상 또는 15 이상인 RNA를 마커로서 선별할 수 있다. 선별 기준으로서의 검출 빈도는 RNA들의 전체적인 검출 빈도의 분포에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 검출 빈도가 높은 상위 수개(예컨대, 5개, 7개, 10개 등)의 작은 RNA들을 마커로서 선별할 수 있다.

본 발명의 방법은 단계 (e)에서 선별된 마커 RNA를 검증하는 단계 (f)를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 검증 단계는 대장암 환자로부터 채취된 시료를 이용하여 단계 (e)에서 선별된 마커 RNA의 존재 여부를 확인하여 실시될 수 있다. 상기 선별된 마커 RNA의 존재 여부의 확인은, 예를 들어, 마커 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 후 전기영동을 통하여 확인할 수 있다. 이와 같은 검증 단계를 통하여 시료에 단계 (e)에서 선별된 마커 RNA가 존재하는 것으로 확인된 경우, 단계 (e)에서 선별된 마커 RNA를 더욱 더 신뢰성 있는 대장암 진단 마커로서 판단할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의하여 발굴된 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA는 (1) hsa-mir-3622a, (2) hsa-mir-215, (3) hsa-mir-93, (4) hsa-mir-4802, (5) hsa-mir-21, (6) hsa-mir-192, (7) hsa-mir-22, (8) hsa-mir-194-2, (9) hsa-mir-200c, (10) hsa-mir-200b, (11) hsa-mir-194-1, (12) hsa-mir-200a, (13) hsa-mir-30d, 및 (14) hsa-mir-30e로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 본 발명에 따른 바이오마커(RNA)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 바이오마커 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적(complementary)인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어, “상보적”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 “상보적”은 용어 “완전 상보적(perfectly complementary)”과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형(template) 서열의 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 실시할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상술한 본 발명의 조성물을 포함하는 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상술한 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하므로, 이 두 발명 사이의 공통된 부분은 그 기재를 생략한다.

본 발명의 키트는 본 발명에 따른 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 대장암의 진단 키트로 사용되기에 적합하도록 당분야에서 일반적으로 사용되는 도구나 시약 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 내부 대조군(internal control)으로 사용할 수 있는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어 “증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR)은 미국 특허 제4683195호, 제4683202호, 제4800159호에 개시되어 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료는 표지(labeling) 될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 대변 세척액에서 엑소좀 분리

대장암 환자 3명의 분변을 PBS(Phosphate buffered saline) 버퍼로 세척한 용액 샘플을 하나의 15 ml 튜브에 모아주었다. 3,000g, 4℃에서 15분간 원심분리를 하여 침전된 불순물을 제거하였다. 상층액을 새로운 15 ml 튜브에 옮겨준 뒤 상층액 4.5 ml의 1/5에 해당하는 0.9 ml의 Exo2D-EV isolation kit for RNA solution(엑소좀플러스, 한국)을 첨가하여 4℃에서 30분간 잘 섞어주었다. 원심분리기로 3,000g, 4℃에서 30분간 분리하여 상층액은 버리고, 흰색 침전물을 PBS에 용해시켜 새 1.5 ml 튜브에 옮겨주었다. 총 부피를 측정한 후 엑소좀의 막에 존재하는 단백질을 Qubit^TM Protein Assay 키트를 이용하여 정량하였다. 동일한 실험을 총 세 번에 걸쳐 실시하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

샘플명	엑소좀 단백질 양
Sample 1	146.4 μg
Sample 2	385 μg
Sample 3	236 μg

실시예 2. 엑소좀에서 RNA 추출

분리한 엑소좀에 트리졸 LS 용액(TRIzol LS Reagent, Thermo Fisher Science, USA) 1 ml을 첨가하여 잘 섞어주고, 상온에 2-5분 동안 방치 후 0.2 ml의 클로로포름을 첨가하여 잘 섞은 뒤 상온에 5분간 방치하였다. 12,000g, 4℃에서 15분간 원심분리를 하여 상층액만 새 1.5 ml 튜브에 옮겨주었다. 상층액과 동량의 아이소프로판올을 첨가하여 잘 섞어준 후 -80℃에 30분 이상 방치하였다. 이후 12,000g, 4℃에서 30분간 원심분리 하여 상층액은 제거해 주었고, 세척을 위해 70% 에탄올을 첨가하여 12000g, 4℃에서 10분간 원심분리를 하였다. 상층액을 제거하고 침전물의 에탄올을 모두 말려준 후에 DEPC(Diethyl pyrocarbonate) 처리한 증류수 10 ㎕에 녹여주었다. Qubit^TMRNA Assay 키트를 이용하여 RNA를 정량하였다. 동일한 실험을 총 세 번에 걸쳐 실시하였다.

실시예 3. 엑소좀 전체 RNA에서 작은 사이즈의 RNA 분리

엑소좀 전체 RNA에서 miRNA를 포함하는 작은 사이즈의 RNA를 분리하기 위하여, 15% Urea-polyacrylamide 젤[6.3 g Urea, 5.625 ml 40% 아크릴아미드 용액, 1.5 ml 10X TBE(Tris 108 g, 붕산 55 g, 0.5 M EDTA 40 ml, pH 8.3 in 1L), 100 ㎕ 10% APS(Ammonium persulphate), 5 ㎕ TEMED(Tetramethylethylenediamine) 및 DEPC 처리한 증류수로 최종 15 ml의 부피로 맞추어줌]을 1.5 mm 두께로 준비하고, 엑소좀 유래 샘플 RNA와 RNA 사이즈 마커에 로딩 다이(dye)를 첨가하여 각 웰(well)에 로딩한 뒤, 150V, 5분간 전기영동 후에 250V, 30분 이상 전기영동을 진행해 젤의 거의 끝까지 RNA를 내려주었다. 이후 2 ㎕ 10,000X SYBR Gold 용액을 20 ml 1X TBE에 첨가하여 젤을 넣고 15분간 RNA를 염색해 주고, 자외선(UV, Ultraviolet)을 이용해 RNA가 사이즈별로 분리됨을 확인하였다(도 2). miRNA를 포함하는 작은 사이즈(17-25 뉴클레오타이드)의 RNA 밴드를 잘라서 새 1.5 ml 튜브에 넣어주었다.

ZR small-RNA PAGE Recovery 키트의 RNA 회수 버퍼(Recovery buffer) 400 ㎕를 첨가하여 Squisher-Single을 이용해 젤을 부수어 주었다. 잘게 부수어진 젤과 RNA 회수 버퍼 모두를 Collection Tube 위의 Zymo-Spin ⅢCG 컬럼에 옮겨주고, 120,00g에서 10분간 원심분리를 하였다. 통과액을 새 1.5 ml 튜브에 옮겨주고, 통과액 부피의 2배에 해당하는 부피만큼 RNA MAX 버퍼를 첨가하여 잘 섞어주었다. 600 ㎕씩 두 번에 걸쳐서 Collection Tube 위의 Zymo-Spin IC 컬럼에 옮겨 12,000g에서 30초간 원심분리 하여 통과시킨 후 통과액은 버려주었다. 400 ㎕의 RNA Prep 버퍼를 첨가하여 12,000g에서 1분간 원심분리 하여 통과액을 제거하였다. 800 ㎕의 RNA 세척 버퍼(Wash Buffer)를 첨가하여 12,000g에서 30초간 원심분리 하여 통과액을 제거하고, 400 ㎕의 RNA 세척 버퍼를 첨가하여 12,000g에서 30초간 원심분리를 하여 통과액을 버려주었다. 12,000g에서 2분간 빈 Collection Tube에서 Zymo-Spin IC 컬럼을 원심분리 하여 컬럼 안의 세척 버퍼를 완전히 제거시켜 주었다. Zymo-Spin IC 컬럼을 새 1.5 ml 튜브로 옮겨준 뒤 6-10 ㎕의 DNase/RNase-Free Water를 컬럼 매트릭스에 바로 넣고, 상온에서 1분간 방치하였다. 10,000g에서 1분간 원심분리 하여 miRNA를 용출시켰다. Qubit^TMRNA Assay 키트를 이용하여 miRNA를 정량하였다. 동일한 실험을 총 세 번에 걸쳐 실시하였다.

실시예 4. 작은 사이즈 RNA의 차세대 염기서열 데이터 생산

miRNA 라이브러리 제작은 NEXTFLEX^TM Small RNA-Seq 키트 v3를 이용하였다. 3′어댑터 연결을 위해 miRNA의 부피를 DEPC 증류수를 이용해 10.5 ㎕로 높여준 뒤 70℃에서 2분간 반응시켜주고 바로 얼음통에 옮겨주었다. 10.5 ㎕의 miRNA에 1 ㎕의 NEXTFLEX 3′4N Adenylated Adapter(1/4 희석함), 7 ㎕의 NEXTFLEX 3′Ligation 버퍼와 1.5 ㎕의 NEXTFLEX 3′Ligation Enzyme Mix를 첨가하여 20℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응물에서 miRNA만을 정제하기 위하여, 반응물의 부피를 50 ㎕로 DEPC 증류수를 이용해 높여준 뒤 페놀/클로로포름 용액을 50 ㎕ 첨가하여 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 상층액을 새 1.5 ml 튜브에 옮겨주고, 5 ㎕의 3 M 아세트산나트륨(Sodium acetate, NaOAc), 1 ㎕의 20 mg/ml 글리코겐 및 125 ㎕의 100% 에탄올을 첨가하여 -80℃에서 30분 이상 방치하였다. 12,000g, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 70% 에탄올을 이용해 침전물을 세척해 준 후 에탄올을 완전히 제거하고, 11.5 ㎕의 DEPC 증류수로 녹여주었다. 남아있는 어댑터를 불활성화 시키기 위하여, 2 ㎕의 NEXTFLEX^TM Adapter Inactivation 버퍼와 0.5 ㎕의 NEXTFLEX^TM Adapter Inactivation 효소를 첨가하여 12℃에서 15분, 50℃에서 20분간 반응시켜 주었다. 이어서 5′어댑터 연결을 위하여, 1.5 ㎕의 NEXTFLEX^TM 5′4N 어댑터(1/4 희석함), 7.5 ㎕의 NEXTFLEX^TM 5′Ligation 버퍼와 2 ㎕의 NEXTFLEX 5′Ligation Enzyme Mix를 첨가하여 20℃에서 16시간 동안 반응시켰다. cDNA 합성을 위해 3′과 5′어댑터가 연결된 miRNA 25 ㎕에 13 ㎕ NEXTFLEX^TM RT 버퍼와 2 ㎕의 M-MuLV 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 첨가하여 42℃에서 30분, 90℃에서 10분간 반응시켰다.

반응물에서 cDNA가 포함된 핵산을 정제하기 위하여, 반응물의 부피를 50 ㎕로 DEPC 증류수를 이용해 높여준 뒤 페놀/클로로포름 용액을 50 ㎕ 첨가하여 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 상층액을 새 1.5 ml 튜브에 옮겨주고, 5 ㎕의 3 M 아세트산나트륨(Sodium acetate, NaOAc), 1 ㎕의 20 mg/ml 글리코겐 및 125 ㎕의 100% 에탄올을 첨가하여 -80℃에서 30분 이상 방치하였다. 12,000g, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 70% 에탄올을 이용해 침전물을 세척해 준 후 에탄올을 완전히 제거하고, 18 ㎕의 DEPC 증류수로 녹여주었다. 정제한 cDNA를 증폭하기 위하여, 1 ㎕의 NEXTFLEX^TM Universal Primer, 1 ㎕의 NEXTFLEX^TM Barcoded Primer와 5 ㎕의 NEXTFLEX^TM Small RNA PCR Master Mix를 첨가하여 95℃에서 2분간 단일가닥으로 분리하고, 95℃에서 20초, 60℃에서 30초, 72℃에서 15초를 25 사이클 반복해 증폭, 72℃에서 2분간 안정화 시켜주는 PCR을 진행하였다.

PCR 산물 정제는 ZR DNA Clean & Concentrator 키트를 이용하였다. PCR 산물 25 ㎕에 125 ㎕의 DNA Binding 버퍼를 첨가하여 섞어주었다. Collection Tube 위의 Zymo-Spin IC 컬럼에 옮겨준 후 12,000g에서 30초간 원심분리 하여 통과시킨 후 통과액은 버려주었다. 200 ㎕의 DNA 세척 버퍼를 첨가하여 12,000g에서 30초간 원심분리 하여 통과액을 제거하였다. 동일한 세척 단계를 한 번 더 반복하여 진행하였다. Zymo-Spin IC 컬럼을 새 1.5 ml 튜브로 옮겨준 뒤 6 ㎕의 DNA 용출 버퍼(Elution Buffer)를 컬럼 매트릭스에 바로 넣고 상온에서 1분간 방치하였다. 10,000g에서 30초간 원심분리 하여 miRNA 라이브러리를 용출시켰다. Qubit^TM DNA Assay 키트를 이용하여 miRNA 라이브러리를 정량하였다.

동일한 실험을 총 세 번에 걸쳐 실시하였다. 각 실험별로 만들어진 라이브러리 샘플을 Sample 1, Sample 2 및 Sample 3으로 명명하였다.

Illumina사의 HiSeq 2500 플랫폼 시스템을 이용하여 100 base의 길이로 paired-end 형식으로 총 3 Gb(Gigabases) 정도 데이터를 얻었다. Sample 1과 Sample 2에 대해서만 차세대 염기서열 분석을 진행하였다.

실시예 5. 대장암 엑소좀 유래 RNA 분석

차세대 염기서열 분석 기술을 이용하여 생산한 RNA 로우 리드(raw read) 데이터 분석은 우선 시퀀싱 라이브러리 제작 과정에서 포함된 어댑터 시퀀스를 제거 과정을 거치고, miRNA를 찾는 데에 특화된 분석 프로그램인 miRDeep2를 사용해 알려진 miRNA와 신규 miRNA를 찾았고, 시퀀스의 검출 빈도(read count)를 고려하여 정량화하였다. 이 과정에서 사람 miRBase 22.1 버전의 참조 데이터베이스를 이용하여 로우 리드와 비교하여 알려진 miRNA 염기서열 정보를 확인하였다(도 3). 검출된 전체 RNA 시퀀스 데이터를 검출 빈도에 따라 분류하였다. 선별한 Sample 1 및 Sample 2 miRNA 의 로우 데이터 예시를 각각 표 2 및 3에 나타내었다.

실시예 6. 시퀀싱을 통해 얻은 작은 사이즈 RNA 데이터의 유효성 검증

선별 분류된 miRNA 데이터 중 검출 빈도 상위 10개의 miRNA에 대한 검증은 PCR을 이용하였다. 먼저, 정확한 PCR을 진행하기 위해 T 벡터(vector)에 miRNA 라이브러리를 연결하였다. miRNA 라이브러리 샘플 2.5 ㎕에 1 ㎕의 10X ThermoPol 버퍼(NEB), 2 ㎕ 1 mM dATP, 0.1 ㎕ Taq DNA 중합효소(NEB) 및 증류수 4.4 ㎕를 첨가하여 72℃에서 20분간 반응시켜서 T 벡터에 miRNA 라이브러리가 연결 가능하도록 dATP를 붙여주었다. 이후 Promega사의 pGEM-T Easy 벡터 시스템을 이용하여 T 벡터와 연결하였는데, 5 ㎕의 pGEM-T easy 벡터, 16.5 ㎕의 2X rapid ligation 버퍼 및 2 ㎕의 T4 DNA ligase를 첨가하여 25℃에서 1시간, 16℃에서 16시간 동안 반응시켰다.

각 miRNA의 서열 일부에 대한 프라이머와 T 벡터의 SP6 프로모터 서열에 대한 프라이머(서열번호 15)를 사용하여 PCR을 하였다. T 벡터에 연결된 miRNA 라이브러리를 1/10 희석하여 1 ㎕를 PCR 주형(template)으로 이용하였고, 각 프라이머마다 최적의 Ta(annealing temperature)로 PCR을 50 사이클 진행하여 증폭하였다. PCR 산물 20 ㎕ 중 5 ㎕를 1.5% 아가로스 젤에 전기영동을 하여 miRNA 서열에 대한 밴드를 확인하였다.

PCR 검증은 Sample 1과 Sample 2의 검출 빈도(Read count) 상위 10개 중 두 샘플에서 겹치지 않는 4개를 포함하여 총 14개의 miRNA 프라이머(표 4)에 대해서 진행하였다. 그리고, 차세대 염기서열 분석을 진행하지 않은 Sample 3에 대해서도 14개의 miRNA 프라이머에 대해 PCR 검증을 하였다. 실험결과는 도 4에 나타내었다.

Lane No.	Name	miRNA 프라이머 서열	서열번호
1	hsa-mir-3622a	CGGGAGCTAAGGTGAGGC	1
2	hsa-mir-215	GACCTATGAATTGACAGA	2
3	hsa-mir-93	CAAAGTGCTGTTCGTGCAGG	3
4	hsa-mir-4802	TCTGCATGGATGGAAACC	4
5	hsa-mir-21	TTATCAGACTGATGTTG	5
6	hsa-mir-192	ACCTATGAATTGACAGC	6
7	hsa-mir-22	ACTGCCGGGTAATGATG	7
8	hsa-mir-194-2	AACAGCAACTCCATGTGGAA	8
9	hsa-mir-200c	AGCTGCCAGTTGAAGAAC	9
10	hsa-mir-200b	ATACTGCCTGGTAATGAT	10
11	hsa-mir-194-1	TAACAGCAACTCCATGTGGA	11
12	hsa-mir-200a	ACTGTCTGGTAACGATG	12
13	hsa-mir-30d	TAAACATCCCCGACTGGA	13
14	hsa-mir-30e	GTAAACATCCTTGACTGGAA	14

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Sysgenlab Inc. <120> Non-invasive diagnosis and analysis of colorectal cancer using RNA isolated from exosomes <130> MP20-065 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-3622a <400> 1 cgggagctaa ggtgaggc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-215 <400> 2 gacctatgaa ttgacaga 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-93 <400> 3 caaagtgctg ttcgtgcagg 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-4802 <400> 4 tctgcatgga tggaaacc 18 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-21 <400> 5 ttatcagact gatgttg 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-192 <400> 6 acctatgaat tgacagc 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-22 <400> 7 actgccgggt aatgatg 17 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-194-2 <400> 8 aacagcaact ccatgtggaa 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-200c <400> 9 agctgccagt tgaagaac 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-200b <400> 10 atactgcctg gtaatgat 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-194-1 <400> 11 taacagcaac tccatgtgga 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-200a <400> 12 actgtctggt aacgatg 17 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-30d <400> 13 taaacatccc cgactgga 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hsa-mir-30e <400> 14 gtaaacatcc ttgactggaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for SP6 promoter <400> 15 taaatccact gtgatatctt 20

Claims

하기의 단계를 포함하는 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측을 위한 마커를 발굴하는 방법:
(a) 대장암 환자로부터 채취된 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
(b) 분리된 엑소좀으로부터 RNA를 분리하는 단계;
(c) 분리된 RNA에 대하여 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing)을 실시하여 서열 데이터를 얻는 단계;
(d) 얻어진 서열 데이터를 참조 RNA 데이터베이스와 비교하여 RNA를 동정하는 단계;
(e) 동정된 RNA 중에서 검출 빈도(read count)가 높은 하나 이상의 RNA를 대장암 진단 또는 예후 예측용 마커로 선별하는 단계; 및
(f) 대장암 환자로부터 채취된 시료를 이용하여 단계 (e)에서 마커로 선정된 RNA의 존재 여부를 확인하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 시료는 대장암 환자로부터 채취된 분변, 분변 세척액, 소변, 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 RNA는 1 내지 200개의 뉴클레오티드를 갖는 작은 RNA(small RNA)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (b)는 핵산 분리시약을 사용하여 엑소좀으로부터 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA에 대하여 Urea-PAGE(Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 실시하여 목적하는 크기의 RNA를 분리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 참조 RNA 데이터베이스는 miRBase, ASRP, micro RNA map, miRGen, CoGemiR, RefSeq, 및 Ensemble로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 데이터베이스인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (d)에서 RNA의 동정은 얻어진 서열 데이터를 참조 RNA 데이터베이스와 비교하여, 알려진 RNA 또는 신규한 RNA로 분류하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (e)는 검출 빈도(read count)가 3 이상인 RNA를 선별하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (f)에서 마커 RNA의 존재 여부의 확인은 마커 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 발굴된 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 RNA는 하기 14개의 miRNA로부터 선택된 하나 이상의 miRNA인 것을 특징으로 하는, 조성물:
(1) hsa-mir-3622a,
(2) hsa-mir-215,
(3) hsa-mir-93,
(4) hsa-mir-4802,
(5) hsa-mir-21,
(6) hsa-mir-192,
(7) hsa-mir-22,
(8) hsa-mir-194-2,
(9) hsa-mir-200c,
(10) hsa-mir-200b,
(11) hsa-mir-194-1,
(12) hsa-mir-200a,
(13) hsa-mir-30d, 및
(14) hsa-mir-30e.
제9항의 조성물을 포함하는, 대장암의 비침습적 진단 또는 예후 예측용 키트.