KR20210136417A - 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 뮤코닉산 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 바이오 유래의 TPA 또는 아디프산의 전구체인 뮤코닉산을 효과적으로 생산할 수 있는 유전자재조합 미생물을 개시한다. 구체적으로, 일 측면에서, 본 발명은 뮤코닉산 생산용 벡터에 목적 유전자인 뮤코닉산 생산 유전자를 고효율로 발현시킬 수 있는 oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 fusA 유전자의 프로모터를 도입함으로써, 상기 벡터로 형질전환된 대장균은 형질전환 전의 대장균 및 다른 프로모터를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균보다 우수한 뮤코닉산 생산능을 가질 수 있다.
Description
본 명세서에는 뮤코닉산 생산능을 갖는 신규한 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 뮤코닉산 생산방법이 개시된다.
[국가지원 연구개발에 대한 설명]
본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ013187022018, PJ013187022019, PJ013187022020)의 지원에 의해 이루어진 것이다.
에너지 및 화학물질의 원재료로 사용되는 화석연료는 지속적인 유가상승 및 자원고갈과 함께 지구온난화를 포함한 각종 환경-경제적 문제에 직면하고 있으며, 이를 보완하기 위한 친환경적이고 재생 가능한 대체물질을 찾는 노력이 계속되고 있다. 그 중에서도 미생물을 이용한 생합성 전략이 활발하게 연구되고 있으며, 특히 특정 대사경로가 유전공학적으로 재설계된 재조합미생물을 이용한 다양한 화학물질, 바이오연료, 아미노산 및 식물체의 2차대사산물 등을 생합성 하는 것이 가능해 졌다.
현재 세계 고분자시장은 바이오 유래의 환경친화적 원료의 사용을 요구받고 있으며 이에 따라 코카콜라, 펩시와 같은 거대 음료회사들이 100% 식물 유래의 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 개발에 총력을 기울이고 있다. 한편, PET와 유사한 구조를 가지면서도 독특한 특성을 갖는 PTT(폴리트리메틸렌테레프탈레이트) 역시 잠재력 높은 시장규모를 가질 뿐만 아니라, 연평균 17%의 고성장을 진행 중에 있다. 따라서 PET와 같이 PTT 역시 바이오 유래의 환경친화적 고분자합성이 필요한 시점이다. 현재 PTT는 석유 유래의 TPA(terephthalic acid)와 바이오 유래의 1,3-PDO(1,3-프로판디올)와의 축합반응에 의한 합성을 통해 생산이 이루어지고 있다. 한편, 바이오 유래의 1,3-PDO에 대한 연구가 활발히 진행된 것에 비해 바이오 유래의 TPA 연구는 전 세계적으로 매우 미비한 형편이다. 특히 대부분의 TPA(terephthalic acid)에 관한 연구가 석유화학물질을 출발점으로 하고 있기 때문에 바이오 유래의 친환경적인 TPA 생산공정의 개발 필요성이 대두되고 있다. 그러나 생물공정을 이용하여 바이오 유래의 탄소원으로부터 직접적으로 TPA를 생합성하는 공정은 아직까지 개발되지 못하고 있다. 따라서 환경친화적인 TPA 생산을 위해 먼저 생물공정을 통해 바이오 유래의 TPA 전구체를 생산하고, 생물공정을 통해 생산된 TPA 전구체를 화학합성공정을 통하여 TPA로 전환시키는 융합생산공정의 개발이 필요하다.
시스,시스-뮤코닉산(cis,cis-muconic acid, CCM)은 합성수지와 생분해성 고분자를 합성하는 물질로, TPA 합성을 위한 바이오 유래의 전구체로서의 용도 외에도 아디프산의 전구체로도 잘 알려져 있다. 아디프산(adipic acid)은 나일론, 윤활유, 플라스틱, 가소제 등의 다양한 물질의 전구체 역할을 함으로써 전 세계적으로 연간 2 X 109 ㎏ 정도의 많은 양이 소비되고 있다. 하지만 현재 아디프산이 합성될 때 사용되는 벤젠 유래의 사이클로헥산은 산화되는 과정에서 지구온난화를 야기하는 N2O를 발생시키는 문제를 가지고 있다. 또한 각 단계별 다양한 중간화학물질은 인체에 유해할 뿐만 아니라 발암물질로도 알려져 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 바이오 유래의 재생 가능한 원료를 이용한 아디프산 생산공정의 개발이 필요하다.
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일 측면에서, 본 발명은 뮤코닉산 생산 유전자 고효율 발현 벡터, 이를 포함하는 대장균 및 이를 이용한 뮤코닉산 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 서열번호 1의 oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 서열번호 2의 fusA 유전자의 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 다운스트림(downstream) 영역에 asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, aroY opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 catA opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 유전자재조합 대장균을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 유전자재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 시스,시스-뮤코닉산의 생산방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명에 의한 재조합 벡터로 형질전환된 대장균은 높은 뮤코닉산 생산능을 보유함으로써, 바이오 유래의 TPA 또는 아디프산의 전구체인 뮤코닉산을 효과적으로 생산할 수 있다. 구체적으로, 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터에 특정 프로모터를 도입함으로써, 뮤코닉산 생산 유전자의 발현량이 증가하여 뮤코닉산의 전구체인 DHS를 빠르게 뮤코닉산으로 전환시킬 수 있고, 결과적으로 크게 향상된 뮤코닉산 생산능을 가질 수 있다. 또한, 인덕션(induction) 없이 뮤코닉산의 생산이 가능한 프로모터를 도입함으로써 시간 및 비용 측면에서 보다 경제적으로 뮤코닉산을 생산할 수 있다.
도 1은 대장균내 방향족 아미노산 및 시스,시스-뮤코닉산의 생합성경로 및 조절경로를 나타낸 것으로, 도 1에 기재된 축약어는 다음과 같다: E4P(erythrose-4-phosphate), PEP(phosphoenolpyruvate), DAHP(3-deoxy-d-arabinoheptulosonate-7-phosphate), DHQ(dehydroquinate), DHS(3-dehydroshikimate), SA(Shikimate), PCA(Protocatechuic acid), CA(Catechol), CCM(cis,cis-muconic acid).
도 2는 재조합 플라스미드 지도로서 (좌) poppA 및 (우) pfusA를 나타낸 것이다.
도 3은 서로 다른 프로모터가 도입된 균주들을 배양한 후 HPLC 분석을 통하여 각 대사산물의 생산량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 유전자가 결손된 유전자재조합 미생물들에 oppA 유전자 프로모터 및 뮤코닉산 생산용 외래유전자를 도입한 균주의 5L 배양기 배양에서의 뮤코닉산 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 유전자가 결손된 유전자재조합 미생물들에 뮤코닉산 생산용 외래유전자, 및 fusA 유전자 프로모터 또는 lac 프로모터를 도입한 균주의 5L 배양기 배양에서의 뮤코닉산 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 aroE, tyrR, ptsG 및 pykF 유전자가 결손된 유전자재조합 미생물들에 뮤코닉산 생산용 외래유전자, 및 fusA 유전자 프로모터, oppA 유전자 프로모터 또는 lac 프로모터를 도입한 균주의 5L 배양기 배양에서의 뮤코닉산 생산량을 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 플라스미드 지도로서 (좌) poppA 및 (우) pfusA를 나타낸 것이다.
도 3은 서로 다른 프로모터가 도입된 균주들을 배양한 후 HPLC 분석을 통하여 각 대사산물의 생산량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 유전자가 결손된 유전자재조합 미생물들에 oppA 유전자 프로모터 및 뮤코닉산 생산용 외래유전자를 도입한 균주의 5L 배양기 배양에서의 뮤코닉산 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 유전자가 결손된 유전자재조합 미생물들에 뮤코닉산 생산용 외래유전자, 및 fusA 유전자 프로모터 또는 lac 프로모터를 도입한 균주의 5L 배양기 배양에서의 뮤코닉산 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 aroE, tyrR, ptsG 및 pykF 유전자가 결손된 유전자재조합 미생물들에 뮤코닉산 생산용 외래유전자, 및 fusA 유전자 프로모터, oppA 유전자 프로모터 또는 lac 프로모터를 도입한 균주의 5L 배양기 배양에서의 뮤코닉산 생산량을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
시스,시스-뮤코닉산은 나일론, 플라스틱, 코팅제, PTT(polytrimethylene terephthalateT), 수지 등을 합성하기 위해 전구물질로 사용되고 있는 중요한 플랫폼 화학물질이다. 생분해성 중간물질, 테레프탈산과 같이 시스,시스-뮤코닉산의 구조이성질체들은 다양한 제품에 적용 될 수 있다. 상기 시스,시스-뮤코닉산은 주로 석유 기반의 벤젠으로부터 고농도 중금속 촉매를 이용해 합성되고 있기 때문에 심각한 환경적 문제와 경제적 문제에 부딪치고 있다. 따라서 이런 문제점들을 보완하고자 친환경적이고 지속적으로 재생 가능한 시스,시스-뮤코닉산 생합성 방법들이 연구되고 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 사용되는 대장균(Escherichia coli)은 그람음성 호기성 세균으로 독성이 없으며, 성장이 매우 빠르고 실험실과 산업현장에서 쉽고 저렴하게 키울 수 있다는 장점을 가지고 있다. 그러나 대장균 내에는 뮤코닉산을 합성할 수 있는 유전자들이 존재하지 않기 때문에, 뮤코닉산을 생산하기 위하여는 외래유전자의 도입이 필요하다. 본 발명자는 이미 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0120236호에서 시스,시스-뮤코닉산의 합성을 위하여 대장균 내에 3개의 외래유전자를 도입함으로써 방향족 아미노산 생합성경로의 중간물질인 DHS로부터 시스,시스-뮤코닉산이 생합성 되는 것을 확인한 바 있으며, 상기 특허문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.
본 발명자는 상기 연구에서 나아가, 시스,시스-뮤코닉산의 생산량을 증가시키고자 대장균 내에 상기 3개의 뮤코닉산 생산 유전자를 고효율로 발현시키는 프로모터(promoter)로서, oppA 유전자의 프로모터 또는 fusA 유전자의 프로모터를 추가로 도입하였다.
상기 oppA 유전자 또는 fusA 유전자는 대장균 내에서 특히 높은 발현율을 보이는 유전자로서, 상기 oppA 유전자 또는 fusA 유전자의 프로모터를 도입함으로써, 목적 유전자인 뮤코닉산 생산용 외래유전자의 발현량을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 이때 상기 oppA 유전자의 프로모터는 서열번호 28의 염기서열을 포함하며, 상기 fusA 유전자의 프로모터는 서열번호 29의 염기서열을 포함한다.
뮤코닉산 생산 공정에서, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)와 같은 인듀서(inducer)를 사용할 경우, 생산 비용이 매우 높아질 수 있으며, 인듀서를 사용함으로써 생산 안정성을 유지할 수 없는 단점이 있다. 본 발명은 대장균 내에서 항시 높은 발현율로 발현되는 oppA 또는 fusA 유전자의 프로모터를 도입함으로써, 인듀서를 사용할 필요 없이 뮤코닉산 생산용 외래유전자의 발현량을 효과적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 대장균은 E. coli AB2834(구입기관: E. coli Genetic Stock Center, 기탁번호: AB2834)일 수 있으며, 상기 E. coli AB2834에 대하여 특정 유전자들을 불활성화시키거나 과발현 시킴으로써 본 발명에 따른 DHS 생합성이 증가된 유전자재조합 대장균을 제조할 수 있다.
즉, 일 실시예에 있어서, 상기 유전자재조합 대장균의 출발물질인 원균주는 상기 E. coli AB2834일 수 있다.
이에 본 발명에 따른 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터는 서열번호 1의 oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 서열번호 2의 fusA 유전자의 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 다운스트림(downstream) 영역에 asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, aroY opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 catA opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세 폴리뉴클레오티드의 각 업스트림(upstream)에 대장균 유래의 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, rbs)를 포함하고, 상기 세 폴리뉴클레오티드 중 첫 번째 전사되는 폴리뉴클레오티드의 리보솜 결합부위(rbs)의 업스트림(upstream)에 상기 oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 fusA 유전자의 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터는 lac 프로모터(promoter), lac 오퍼레이터(operator) 및 cap 결합 부위(cap binding site)가 제거된 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 재조합 벡터는 lac 프로모터(promoter), lac 오퍼레이터(operator) 및 cap 결합 부위(cap binding site)가 제거된 벡터에 세 폴리뉴클레오티드를 삽입하고, 상기 세 폴리뉴클레오티드의 업스트림(upstream) 방향에 삽입된 대장균 유래의 리보솜 결합 부위(RBS)의 업스트림에 상기 oppA 유전자의 프로모터 또는 fusA 유전자의 프로모터를 삽입하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세 폴리뉴클레오티드 중 첫 번째 전사되는 폴리뉴클레오티드는 asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, aroY opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 catA opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중에서 선택되는 어느 하나이며, 상기 세 유전자의 배열 순서는 상기 유전자가 기재된 순서로 한정되지 않는다. 예를 들면, 세 유전자는 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터 내에 aroY opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 catA opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 순으로 배열될 수 있다. 또는, catA opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, aroY opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 순으로 배열될 수 있다.
도 1을 참고로 하면, 대장균의 탄수화물 대사경로 중에는 방향족 아미노산인 페닐알라닌(Phenylalanine,Phe), 타이로신(Tyrosine,Tyr), 트립토판(Tryptophan,Try)을 생합성하는 경로가 있다. 이 때 중간물질인 DHS (3-dehydroshikimate)로부터 뮤코닉산을 생산하기 위하여는 일 실시예에 있어서 대장균에 세 종류의 외래유전자를 도입할 수 있다. 구체적으로, DHS 탈수효소(DHS dehydratase)를 코딩하는 asbF, PCA 탈카르복실화효소(protocatechuic acid decarboxylase)를 코딩하는 aroY, 카테콜 1,2-산소화효소(catechol 1,2-dioxygenase)를 코딩하는 catA이다. 이러한 3종의 외래유전자의 도입으로 DHS로부터 PCA, 카테콜을 거쳐 뮤코닉산을 합성할 수 있게 된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 실시예는 상기 세 종류의 외래유전자를 대장균에 도입함에 있어서 대장균에서의 발현율을 증가시킴으로써 뮤코닉산 생산능을 향상시키기 위하여, 상기 asbF, aroY 및 catA를 대장균 코돈으로 변형한 염기서열인 asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, aroY opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 catA opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 그리고 상기 세 폴리뉴클레오티드와, 상기 세 폴리뉴클레오티드의 각 업스트림(upstream)에 대장균 유래의 리보솜 결합 부위(ribosome binding site)를 포함하고, 상기 세 폴리뉴클레오티드 중 첫 번째 전사되는 폴리뉴클레오티드의 리보솜 결합부위(rbs)의 업스트림에 oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 fusA 유전자의 프로모터(promoter)를 포함하는 재조합벡터로 제조할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3을 포함하고, 상기 aroY op 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4을 포함하며, 상기 catA op 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5을 포함할 수 있다. 상기 리보솜 결합 부위는 서열번호 6를 포함할 수 있다. 일 실시예는 상기와 같이 제조한 재조합벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
이로써 상기와 같은 asbF opt , aroY opt 및 catA opt 를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 대장균은 상기 세 외래유전자 각각을 단일 오페론 구조로 포함함으로써, 상기 asbF opt , aroY opt 및 catA opt 를 코딩하는 각 폴리뉴클레오티드의 전사량이 0.9~1.1 : 0.9~1.1 : 0.9~1.1로 구현될 수 있다.
상기 세 종류의 폴리뉴클레오티드는 각각의 해당 효소인 DHS 탈수효소(DHS dehydratase), PCA 탈카르복실화효소(protocatechuic acid decarboxylase), 카테콜 1,2-산소화효소(catechol 1,2-dioxygenase)를 효율적으로 발현시켜준다. 특히, oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 fusA 유전자의 프로모터(promoter)를 도입함으로써 상기 세 종류의 뮤코닉산 생산 외래유전자의 발현량이 크게 향상될 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 상기와 같은 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터로 형질전환된 유전자재조합 대장균을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 도 1의 방향족 아미노산 생합성경로에서 DHS를 합성하는데 필요한 경로를 제외한 다른 경쟁경로들을 제거하기 위하여, 상기 대장균은 aroE 유전자; 및 tyrR 및 ptsG 유전자; tyrR, ptsG 및 pykA 유전자; tyrR, ptsG 및 pykF 유전자; 또는 tyrR, ptsG, pykA 및 pykF 유전자가 불활성화된 것일 수 있으며, 결과적으로 상기 유전자재조합 대장균은 상기 유전자들의 불활성화로 시스,시스-뮤코닉산의 전구체인 DHS(3-dehydroshikimate) 생합성이 증가된 것일 수 있다. 또한, 상기 네 유전자의 불활성화 순서는 상기 유전자가 기재된 순서로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 상기 용어 "불활성화"는 특정 유전자의 일부 또는 전부를 제거(deletion)하거나 특정 유전자 안에 다른 서열을 첨가(addition)하거나 특정 유전자를 다른 유전자로 치환(substitution)하는 것을 모두 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 유전자의 불활성화는 상기 대장균에서 상기 유전자가 결손(deletion)에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 대장균은 aroE 유전자가 결손되어, aro E 효소 활성이 상실된 대장균일 수 있다. 일 실시예로서 상기 aroE를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 aro E 효소 활성이 상실된 대장균으로는 예를 들어 E.coli AB2834(구입기관: E. coli Genetic Stock Center)를 사용할 수 있다. 상기 aro E유전자는 DHS(3-dehydroshikimic acid)를 SA(shikimic acid)로 전환시키는 DHS 탈수효소를 코딩하는 유전자로 aroE 유전자가 결손되면 DHS가 SA로 전환되는 것을 차단하여 DHS가 방향족 아미노산 생합성에 이용되는 것을 차단함으로써 대사 흐름을 뮤코닉산 생합성 쪽으로 바꾸어 줄 수 있어 상기 aroE 유전자가 결손된 대장균을 사용하면 뮤코닉산의 생합성 효율을 더욱 증가시킬 수 있다. 또한 방향족 아미노산의 생합성이 차단되면 대사경로 초기물질인 PEP(phosphoenolpyruvate)와 E4P(erythrose-4-phosphate)가 DAHP로의 전환에 대한 피드백 억제(feedback inhibition)의 해제(저해)가 일어나 뮤코닉산 생합성으로의 대사흐름이 원활해진다. 다만 aroE 유전자의 결손으로 방향족 아미노산이 합성되지 않으므로 배양배지에 방향족 아미노산을 첨가해 주어야 하는데 이때 과량의 방향족 아미노산을 첨가해 주면 다시 피드백 억제(feedback inhibition)가 일어나므로 세심한 주의가 필요하다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 대장균으로부터 tyrR, ptsG, pykA 및 pykF 유전자 중 하나 이상을 추가로 결손시키는 방법은 구체적으로 결손을 위한 플라스미드 제작단계, 형질전환단계, 단일 재조합(single recombination) 유도 단계 및 이중 재조합(double recombination)을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 결손을 위한 플라스미드 제작단계는 결손시키고자 하는 유전자의 상부(up region)과 하부(down region)를 대장균 자살벡터(suicide vector)에 클로닝(cloning)하고 이를 증류수에 녹인 순수한 DNA를 준비하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 단계는 상기 제조된 결손을 위한 플라스미드, 즉 결손 플라스미드(deletion plasmid)를 원하는 균주에 도입하기 위해 균주에 전기천공법을 사용하여 상기 결손 플라스미드를 삽입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단일 재조합 유도 단계는 상기 결손 플라스미드가 삽입된 형질전환체에서 단일 재조합을 유도하기 위해서 온도를 30-45℃로 올려준 후 클로람페니콜이 첨가된 LB 배지(broth)에 배양한 후, 클로람페니콜이 첨가된 LB 플레이트에 도말하고 30-45℃에서 배양하여 크로모좀에 단일 재조합되지 않은 균주들을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 이중 재조합 유도단계는 상기 단일 재조합된 균주를 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지에 30-45℃의 온도에서 배양하여 이중 재조합, 즉 유전자의 결손을 유도하고, 상기 배양된 균주들을 10% 수크로스가 들어간 LB 플레이트에 도말하여 플라스미드가 제거되고 유전자가 결손된 균주를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 tyrR 유전자는 아미노산 생합성경로 중에서 DHAP 생성효소(2-dehydro-3-deooxy-phosphoheptonate-aldolase)를 코딩하고 있는 aroG 유전자를 조절한다. 상기 tyrR 유전자가 코딩하고 있는 TyrR 이라는 단백질은 티로신 억제제로, 티로신이 배지 내에 존재할 때 aroG 유전자의 발현을 억제하는 기능을 가지며 이는 이후의 대사경로에 영향을 미치게 된다. 따라서 tyrR 유전자를 불활성화시킬 경우, 티로신의 유무와 상관없이 aroG 유전자는 계속 발현될 것이므로, DHS를 지속적으로 생합성할 수 있다. 한편 tyrR 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 ptsG 유전자는 세포 밖에 존재하는 글루코스를 세포 내로 이동시키는데 관여한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 글루코스 포스포트란스페라아제 IIBC(Glc); 글루코스 퍼미아제는 세포 밖에 존재하는 글루코스를 세포 내로 이동시키면서 DHS의 전구체인 PEP를 피루베이트로 전환시켜 세포 내의 DHS 축적량을 감소시킬 수 있다. ptsG 유전자를 불활성화 시킨다 하여도, 글루코스를 글루코스-6P (G6P)로 전환시켜주는 또 다른 유전자들 (galM 유전자, glk 유전자 등)이 대장균 내에 존재하므로 글루코스 소모량에는 큰 영향이 없을 것이다. 본 발명의 일 실시예는 ptsG 유전자 양쪽에 상동 아르마딜로(homologue arm)을 PCR을 통해 확보한 후 상동 재조합 방법을 이용하여 aroE 유전자와 tyrR 유전자가 불활성화된 균주에서 ptsG 유전자의 불활성화를 진행할 수 있다. 한편 상기 ptsG 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 pykA 및 pykF유전자는 상기 ptsG 유전자와 마찬가지로 DHS의 전구체인 PEP를 피루베이트로 전환시키는데 관여한다. 상기 pykA 유전자가 코딩하는 피루베이트 키나아제II 와 pykF 유전자가 코딩하는 피루베이트 키나아제I은 각각 PEP를 피루베이트로 전환시켜 탄소원이 TCA(trichloroacetic acid) 사이클에 들어가서 에너지를 만드는데 관여한다. 상기 두 유전자를 불활성화할 경우 DHS의 전구체인 PEP를 사용하는 면에서 유리하다. 한편, 상기 pykA 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 pykF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 aroE 유전자; 및 tyrR 및 ptsG 유전자, tyrR, ptsG 및 pykA 유전자, 또는 tyrR, ptsG, pykA 및 pykF 유전자가 불활성화되어 있으며, DHS로부터 뮤코닉산을 생합성하는데 필요한 유전자로서 asbF, aroY 및 catA를 각각 코딩하는 유전자가 도입되고, 상기 뮤코닉산 생산 유전자를 고효율로 발현시키기 위한 oppA 유전자의 프로모터 또는 fusA 유전자의 프로모터가 도입된 유전자재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 시스,시스-뮤코닉산 생산방법을 제공할 수 있다.
상기 유전자재조합 대장균을 배양하는 단계는 일 실시예에 있어서, 인덕션(induction) 과정을 거치지 않을 수 있다. 구체적으로, 일 실시예로서의 상기 시스,시스-뮤코닉산 생산방법은 다음과 같다: LBG agar 배지에서 24시간 동안 고체배양을 진행한 후, 단일 콜로니를 5ml의 LBG 배지에 접종하여 15시간 동안 배양한다. 그 다음 접종량 1%로 2차 성장배양을 동일하게 20ml의 LBG 배지에서 6시간 동안 배양한다. 그 후 다시 1%의 접종량으로 생산 발효기에 접종한다. 작업 용량(working volume)은 2L이고, pH는 10N NaOH와 3N HCl을 이용하여 pH 7로 고정한다. 그 후 초기 당이 모두 소모되는 시점부터 feeding(glucose 600g/L) 배지를 연속적으로 투입시키면서 배양한다.
이하, 본 발명의 내용을 제조예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 제조예 및 시험예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이러한 제조예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[제조예]
본 발명의 일 실시예에 따른 유전자재조합 대장균을 하기의 방법에 따라 제조하였다.
배지 및 배양조건
세포 증식, 접종 준비 및 결손 플라스미드 제조를 위하여, 모든 대장균 균주들을 LB(Luria-Bertani) 배지 또는 아가플레이트에서 37℃에서 성장시켰다. 상기 LB 배지는 1L 기준 트립톤 10 g, NaCl 5 g, 효모추출물 5 g을 포함한다. 다양한 농도의 적절한 항생제 또는 수크로스(sucrose), 구체적으로 100 μg/ml의 앰피실린(ampicillin), 25 μg/ml의 클로람페니콜(chloramphenicol) 및 10% 수크로스를 더 포함하는 LB 배지에서 플라스미드가 제거된 콜로니(colony)를 선택하였다.
박테리아 균주 및 플라스미드
E.coli 유전자 스톡으로부터 aorE 유전자가 결손된 균주인 E.coli AB2834 균주를 얻었다. 대장균 E. coli DH5α(구입처: TaKaRa)를 재조합 플라스미드 제조 시 호스트로 사용하였다. 플라스미드 pUC19(구입처: Addgene)를 유전자 결손을 위한 중간 벡터로 사용하였다. 플라스미드 pKOV(구입처: Addgene)을 제한효소(업스트립 절편: BamHI & XbaI, 다운스트림 절편: XbaI & SalI)의 사용에 의한 결손 벡터로서 사용하였다. 유전자 과발현 및 발현이 활성화된 플라스미드 pUC18는 Addgene에서 구입하였다. 제조된 플라스미드는 시퀀싱 및 제한효소분석에 의해 확인하였다. 본 실험에서 사용되거나 제조된 모든 균주들 및 플라스미드들을 하기 표 1 및 표 2에 나열하였다. 하기 표 1에서 "AB2834 △aroE"는 aorE 유전자가 결손된 균주인 E.coli AB2834를 나타내는 것이나, aroE 유전자가 결손된 것임을 명확히 표시하기 위한 것이다. 하기 표 2에서 용어 "UP & DOWN"은 타겟 유전자들을 결손(deletion)시키기 위한 플라스미드의 제조시 결손되는 유전자의 위쪽 유전자 단편인 up region(up steam, left region, forward region) 및 유전자 아래쪽 단편인 down region(down steam, right region)을 의미한다.
본 실험에서, 표준 프로토콜이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reactions, PCR) 증폭, DNA 정제, 플라스미드 추출, 효소 절단(restriction) 및 라이게이션(ligation) 반응을 위해 사용되었다. 본 실험에 사용된 프라이머들은 하기 표 3에 나열하였다.
미생물( E. coli ) | 관련 특성 |
E. coli DH5α | lacZ ¢M15 hsdR recA |
E. coli AB2834 | aroE353 (aroE 결손 E. coli) |
△ER | AB2834 △aroE △tyrR |
△ER/poppA | AB2834 △aroE △tyrR/poppA |
△ERG | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG |
△ERG/poppA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG/poppA |
△ERGA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA |
△ERGA/poppA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA / poppA |
△ERGA/pfusA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA / pfusA |
△ERGA/plac | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA / pMESK1 |
△ERGF | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykF |
△ERGF/poppA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykF / poppA |
△ERGF/pfusA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykF / pfusA |
△ERGF/plac | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykF / pMESK1 |
△ERGAF | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA △pykF |
△ERGAF/poppA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA △pykF / poppA |
△ERGAF/pfusA | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA △pykF / pfusA |
△ERGAF/plac | AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA △pykF / pMESK1 |
플라스미스(벡터) | 관련 특성 |
pUC19 | AmpR, lacZα, f1 ori, lac promoter(multiple cloning site) |
pKOV | CmR, sacB, Rep101, f1 ori |
pUC18βlacZ | lacZα결손 pUC18 |
pMESK1 | asbF opt , aroY opt , catA opt 포함 pUC18βlacZ |
pMESK4 | asbF opt , aroY opt , catA opt 포함 lac promoter, lac operator, cap binding site 제거 pUC18 |
poppA | oppA 유전자 프로모터 삽입 pMESK4 |
pfusA | fusA 유전자 프로모터 삽입 pMESK4 |
prmf | rmf 유전자 프로모터 삽입 pMESK4 |
prnpB | rnpB 유전자 프로모터 삽입 pMESK4 |
pdps | dps 유전자 프로모터 삽입 pMESK4 |
pKOV-△tyrR | tyrR UP & DOWN 함유 pKOV |
pKOV-△ptsG | ptsG UP & DOWN 함유 pKOV |
pKOV-△pykA | pykA UP & DOWN 함유 pKOV |
pKOV-△pykF | pykF UP & DOWN 함유 pKOV |
프라이머 | 서열번호 | Sequence (5'→3') | Target |
ptsG_UP_F | 12 | TTACATATGCGGGATCCGGTAGGCGAACGT | AB2834 |
ptsG_UP_R | 13 | CATGGTTTTAACCATCTAGACATAGGCAACAACTCGAGCCAGCGCGGATA | AB2834 |
ptsG_DOWN_F | 14 | TCCACGCGATTCTAGAAGGCCTGGCATTCCCAAGCTTTATTCTTCTGGGG | AB2834 |
ptsG_DOWN_R | 15 | GTCGACCTACGCCAGCTATA | AB2834 |
tyrR_UP_F | 16 | CAGGTGATGGATGTCGACAAACCACTACCG | AB2834 |
tyrR_UP_R | 17 | TCGACAGAGAGCAAAGCTTCAGGCAACGCC | AB2834 |
tyrR_DOWN_F | 18 | ACTGACACAACTCGAGGGTTCTGAGCTGCG | AB2834 |
tyrR_DOWN_R | 19 | GCATCGCAACGCCTGGATCCGCCAATAGCT | AB2834 |
pykA_UP_F | 20 | CGTTTCTAGACACCGTCTCGAGGTTCAGTTCGAC | AB2834 |
pykA_UP_R | 21 | CCGCCAAGGATCCGTGATCCCATTCT | AB2834 |
pykA_DOWN_F | 22 | CAACCGCGCCGTCGACTTGCTC | AB2834 |
pykA_DOWN_R | 23 | CAAACGGCTTCTAGACGTTCAAGCTTGGCAACAA | AB2834 |
pykF_UP_F | 24 | GAATATCAGGATCCAGCTTACCGCCTCATCCT | AB2834 |
pykF_UP_R | 25 | GCAACAAAGTCTAGACCTTGTTCGCAACCA | AB2834 |
pykF_DOWN_F | 26 | GAACAGCCGTCACTAGTTCAACAATGACAAC | AB2834 |
pykF_DOWN_R | 27 | ACAGCGTCGACTTGCGCGTCAGTTCA | AB2834 |
유전자재조합
유전자 불활성화가 상동 재조합 시스템에 사용되었다. 먼저, 전기천공법에 의해 결손 벡터를 수용 균주에 삽입하고, 단일 재조합을 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 이중(double) 재조합 균주들을 25 mg/L의 클로람페니콜 및 10 % 수크로스를 포함하는 LB 플레이트에 선택하고, PCR 증폭을 통해 확인하였다. 모든 제조된 플라스미드들은 시퀸싱 및 제한효소 분석에 의해 확인하였다.
플라스크 배양 조건
뮤턴트 균주들을 스톡으로부터 분리하여 적절한 항생제들을 함유한 LB 배지에 넣고 37℃에서 배양하였다. 1차 성장 배양(1st seed culture)은 단일 콜로니와 함께 30ml의 LB 배지에서 30℃에서 220 rpm으로 12시간 동안 배양함으로써 이루어졌다. 2차 성장 배양(2nd seed culture)은 5ml의 LB 배지에서 30℃에서 220 rpm으로 6시간 동안 배양함으로써 이루어졌으며, 이후 본배양(main culture)은 50ml의 대장균 생산배지에서 30℃에서 220 rpm으로 24시간 동안 배양함으로써 이루어졌다.
상기 실험에서 상기 수용균주에 결손 벡터를 삽입하여 타겟유전자를 결손시키는 방법은 하기와 같다.
-결손 벡터(플라스미드) 제작단계: 결손하고자 하는 유전자(tyrR, ptsG, pykA 및 pykF)의 up region과 down region을 대장균 자살벡터인 pKO V vector에 클로닝하고, 상기 유전자를 플라스미트 프렙 키트(plasmid prep kit)를 이용하여 3차 증류수에 녹인 순수한 DNA를 준비한다.
-형질전환 단계: 준비한 결손 벡터를 원하는 균주에 도입하기 위해 균주를 OD600에서 0.8과 1사이의 균주를 취하여 10% 글리세롤를 이용하여 배지를 제거한다. 10% 글리세롤에 현탁한 세포 50μl에 준비한 결손 벡터 DNA 2μl를 섞어서 BioRad Micro Pulsar의 기계와 2mm 간격의 큐벳(Cuvette)을 이용해 전기천공법을 수행한다. 상기 세포에 LB 배지를 1ml을 첨가한 후 30℃에서 한시간 배양하고, 이를 클로람페니콜이 첨가된 LB 플레이트에 도말한 후 30℃에서 배양한 후 형질전환체를 선별한다.
-단일 재조합(single recombination) 유도 단계: 형질전환체에서 단일 재조합을 유도하기 위해서 37℃로 온도를 올려준 후 클로람페니콜이 첨가된 LB 배지에 배양한 후 클로람페니콜이 첨가된 LB 플레이트에 도말한 후 37℃에서 키워 크로모좀에 단일 재조합되지 않은 균주들을 제거한다.
-이중 재조합(Double recombination) 유도 단계: 단일 재조합된 균주를 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지 37℃에서 배양하여 이중 재조합, 즉 유전자의 결손을 유도한다. 배양된 균주들을 10% 수크로스가 들어간 LB 플레이트에 도말하여 플레이트가 제거되고 유전자가 결손된 균주를 선별한다.
oppA
유전자 프로모터가 도입된 재조합 벡터(poppA)의 제조
플라스미드 pUC18을 기반으로 lac promoter, lac operator, cap binding site가 제거된 pUC18 플라스미드에 세 외래유전자인 asbF opt , aroY opt 및 catA opt 를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 pMESK4 플라스미드를 제작하였다. pMESK4 플라스미드에 상기 세 외래유전자의 업스트림(upstream)에 oppA 유전자 프로모터를 클로닝하여, poppA 플라스미드 벡터를 제조하였다(도 2 좌측 도면 참조).
상기 제조된 poppA 플라스미드의 염기서열은 서열번호 30의 염기서열을 포함한다.
fusA
유전자 프로모터가 도입된 재조합 벡터(pfusA)의 제조
fusA 유전자 프로모터를 사용한 것 외에는 상기 poppA 제조방법과 동일하게 제조하였다(도 2 우측 도면 참조).
상기 제조된 pfusA 플라스미드의 염기서열은 서열번호 31의 염기서열을 포함한다.
rmf
유전자 프로모터가 도입된 재조합 벡터(prmf)의 제조
rmf 유전자 프로모터를 사용한 것 외에는 상기 poppA 제조방법과 동일하게 제조하였다. 제조된 prmf 플라스미드의 염기서열은 서열번호 32의 염기서열을 포함한다.
rnpB
유전자 프로모터가 도입된 재조합 벡터(prnpB)의 제조
rnpB 유전자 프로모터를 사용한 것 외에는 상기 poppA 제조방법과 동일하게 제조하였다. 제조된 prnpB 플라스미드의 염기서열은 서열번호 33의 염기서열을 포함한다.
dps
유전자 프로모터가 도입된 재조합 벡터(pdps)의 제조
dps 유전자 프로모터를 사용한 것 외에는 상기 poppA 제조방법과 동일하게 제조하였다. 제조된 pdps 플라스미드의 염기서열은 서열번호 34의 염기서열을 포함한다.
재조합 벡터로 형질전환된 대장균의 제조
상기에서 제조된 poppA, pfusA, prmf, prnpB 및 pdps 플라스미드를 각각 E. coli AB2834 △aroE △tyrR, E. coli AB2834 △aroE △tyrR △ptsG, E. coli AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA, E. coli AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykF 또는 E. coli AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA △pykF에 형질전환시켜, 새로운 프로모터가 도입된 뮤코닉산 생산용 대장균을 제조하였다.
[시험예 1]
상기 제조예에서 제조한 재조합대장균들을 배양 후 HPLC 분석을 하여 각 대장균의 대사산물 생산량을 분석하였다.
구체적으로, LBG agar 배지에서 24시간 동안 고체배양을 진행한 후, 단일 콜로니를 5ml의 LBG 배지에 접종하여 15시간 동안 배양하였다. 그 다음 접종량 1%로 2차 성장배양을 동일하게 20ml의 LBG 배지에서 6시간 동안 배양하였다. 그 후 다시 1%의 접종량으로 5L 발효기에 접종하였다. 작업 용량(working volume)은 2L였고, pH는 10N NaOH와 3N HCl을 이용하여 pH 7로 고정하였다. 그 후 초기 당이 소모되는 모두 소모되는 시점부터 feeding(glucose 600g/L) 배지를 연속적으로 투입시키면서 배양하였다.
그 다음, 채취한 배양액 1㎖을 13000rpm에 10분 원심분리하여 세포를 분리하여 상등액을 0.25㎛ 멤브레인 필터에 여과하여 분석에 사용하였다. 생합성된 전구체들은 HPLC(고속액체크로마토그래피)로 분리-분석되었으며, 사용한 컬럼은 Aminex HPX-87H, 이동상은 5mM H2SO4, 유속은 0.6㎖/L, 분석온도는 30℃에서 수행되었다 (FRC-10A, SHIMADZU). UV 검출은 3-DHS (237㎚)에서 수행하였다. 정량분석을 위해 사용한 표준(standard) (3-DHS: Sigma 사)는 각각 증류수에 녹여 0.25㎛ 멤브레인에 여과하여 사용하였다.
그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3의 결과로부터, 상기 세 외래유전자의 발현을 위하여, lac 프로모터를 포함하는 대장균에 비해 본 발명의 일 실시예에 따른 oppA 유전자 프로모터 또는 fusA 유전자 프로모터를 포함하는 대장균의 시스,시스-뮤코닉산 생산량이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 세 외래유전자의 발현을 위해 oppA 유전자 프로모터 또는 fusA 유전자 프로모터를 포함하는 대장균과 달리, 대장균 내에서 oppA, fusA 유전자와 비슷한 수준으로 높은 발현량을 보이는 유전자인 rmf, rnpB, dps 유전자 프로모터를 포함하는 대장균에서는 시스,시스-뮤코닉산(CCM) 생산량이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 2]
상기 제조예에서 제조한 oppA 유전자 프로모터를 포함하면서 다양한 유전자가 불활성화된 대장균들의 대사산물인 시스,시스-뮤코닉산(CCM)의 생산량을 분석하였다.
상기 시험예 1과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.
균주 | 포도당 소모량 (g) |
OD (600nm) |
DCW (g/L) |
Organic Acid (g/L) |
DHS (g/L) |
PCA (g/L) |
Catechol (g/L) |
Maximum CCM (g/L) |
CCM 생산량 (g/L-hr) |
△ER /poppA |
420 | 39 | 32 | 6.8 | 0 | 0 | 0 | 26 (113 hr) |
0.4 (19~54 hr) |
△ERG /poppA |
420 | 37 | 28 | 0 | 0 | 0 | 0 | 39 (96 hr) |
0.7 (19~54 hr) |
△ERGA /poppA |
420 | 33 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 45 (96 hr) |
0.7 (19~54 hr) |
△ERGAF /poppA |
390 | 29 | 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 44(113 hr) | 0.8 (19~54 hr) |
상기 표 4 및 도 4의 결과로부터, 유전자가 결손될수록 시스,시스-뮤코닉산의 생산성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, E. coli AB2834 △aroE △tyrR △ptsG △pykA를 poppA 플라스미드로 형질전환시킨 균주가 가장 높은 뮤코닉산 생산성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 3]
상기 제조예에서 제조한 fusA 유전자 프로모터 또는 lac 프로모터를 포함하면서 다양한 유전자가 불활성화된 대장균들의 대사산물인 시스,시스-뮤코닉산의 생산량을 분석하였다.
상기 시험예 1과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 5 및 도 5에 나타내었다.
균주 | 포도당 소모량 (g) |
OD (600nm) |
DCW (g/L) |
Organic Acid (g/L) |
DHS (g/L) |
PCA (g/L) |
Catechol (g/L) |
Maximum CCM (g/L) |
CCM 생산량 (g/L-h) |
△ERGA /pfusA |
480 | 32 | 28 | 5.3 | 0 | 0 | 0 | 51 (138 hr) |
0.8 (20~49 hr) |
△ERGA /plac |
480 | 32 | 28 | 0 | 6.8 | 4 | 0 | 46 (120 hr) |
0.7 (20~49 hr) |
△ERGAF /pfusA |
420 | 30 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 42 (138 hr) |
0.65 (20~49 hr) |
△ERGAF /plac |
360 | 30 | 24 | 0 | 0 | 0 | 0 | 41(138 hr) | 0.6 (20~49 hr) |
상기 표 5 및 도 5의 결과로부터, pfusA 플라스미드를 도입한 균주가 기존 lac 프로모터 기반의 MESK1 플라스미드(plac; pM1)를 도입한 균주보다 시스,시스-뮤코닉산 생산성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, pykF 유전자까지 결손하는 것보다 pykA 유전자까지만 결손된 균주가 시스,시스-뮤코닉산의 생산성이 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 4]
상기 제조예에서 제조한 aroE, tyrR, ptsG 및 pykF 유전자가 불활성화된 대장균에 fusA 유전자 프로모터, oppA 유전자 프로모터, 또는 lac 프로모터를 각각 도입한 대장균들의 대사산물인 시스,시스-뮤코닉산의 생산량을 분석하였다.
상기 시험예 1과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 6 및 도 6에 나타내었다.
균주 | 포도당 소모량 (g) |
OD (600nm) |
DCW (g/L) |
Organic Acid (g/L) |
Maximum CCM (g/L) |
CCM 생산량 (g/L) (24~27 hr) |
△ERGF/pfusA | 480 | 32 | 26 | 0 | 46 (102 hr) | 0.8 |
△ERGF/poppA | 480 | 33 | 26 | 0 | 45 (102 hr) | 0.7 |
△ERGF/plac | 480 | 28 | 24 | 0 | 39 (102 hr) | 0.65 |
상기 표 6 및 도 6의 결과로부터, pfusA 또는 poppA 플라스미드를 도입한 균주가 기존 lac 프로모터 기반의 MESK1 플라스미드(plac)를 도입한 균주보다 시스,시스-뮤코닉산 생산성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, pfusA 플라스미드를 도입한 균주의 생산성이 102시간에 46g/L로서 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
상기 시험예들의 결과로부터, 본 발명에 따른 oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 fusA 유전자의 프로모터를 포함하고, 뮤코닉 생산용 외래유전자를 포함하는 재조합 벡터는 뮤코닉 생산용 유전자를 고효율로 발현시키며, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균으로서 aroE 유전자; 및 tyrR 및 ptsG 유전자, tyrR, ptsG 및 pykA 유전자, 또는 tyrR, ptsG, pykA 및 pykF 유전자가 불활성화된 대장균은 우수한 뮤코닉산 생산능을 가짐을 확인할 수 있다.
<110> STR biotech
<120> RECOMBINANT VECTOR FOR PRODUCING MUCONIC ACID, MICROORGANISM
TRANSFORMED WITH THE VECTOR, AND METHOD FOR PRODUCING MUCONIC
ACID USING THE MICROORGANISM
<130> 18p049/ind
<160> 34
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1632
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oppA coding DNA
<400> 1
atgaccaaca tcaccaagag aagtttagta gcagctggcg ttctggctgc gctaatggca 60
gggaatgtcg cgctggcagc tgatgtaccc gcaggcgtca cactggcgga aaaacaaaca 120
ctggtacgta acaatggttc agaagttcag tcattagatc cgcacaaaat tgaaggtgtt 180
ccggagtcta atatcagccg agacctgttt gaaggcttac tggtcagcga tcttgacggt 240
catccagcac ctggcgtcgc tgaatcctgg gataataaag acgcgaaagt ctggaccttc 300
catttgcgta aagatgcgaa atggtctgat ggcacgccag tcacagcaca agactttgtg 360
tatagctggc aacgttctgt tgatccgaac actgcttctc cgtatgccag ttatctgcaa 420
tatgggcata tcgccggtat tgatgaaatt cttgaaggga aaaaaccgat taccgatctc 480
ggcgtgaaag ctattgatga tcacacatta gaagtcacct taagtgaacc cgttccgtac 540
ttctataaat tacttgttca cccatcaact tcaccggtgc caaaagccgc tatcgagaaa 600
ttcggcgaaa aatggaccca gcctggtaat atcgtcacca acggtgccta taccttaaaa 660
gattgggtcg taaacgaacg aatcgttctt gaacgcagcc cgacctactg gaacaacgcg 720
aaaaccgtta ttaaccaggt aacctatttg cctattgctt ctgaagttac cgatgtcaac 780
cgctaccgta gtggtgaaat cgacatgacg aataacagca tgccgatcga attgttccag 840
aagctgaaaa aagagatccc ggacgaagtt cacgttgatc catacctgtg cacttactat 900
tacgaaatta acaaccagaa accgccattc aacgatgtgc gtgtgcgtac cgcactgaaa 960
ctaggtatgg accgcgatat cattgttaat aaagtgaaag cgcagggcaa catgcccgcc 1020
tatggttaca ctccaccgta tactgatggc gcaaaattga ctcagccaga atggtttggc 1080
tggagccagg aaaaacgtaa cgaagaagcg aaaaaactgc tggctgaagc gggttatacc 1140
gcagacaaac cgttgaccat caacctgttg tataacacct ccgatctgca taaaaagctg 1200
gcgattgctg cctcttcatt gtggaagaaa aacattggtg taaacgtcaa actggttaac 1260
caggagtgga aaacgttcct cgacacccgt caccagggta cttttgatgt ggcccgtgca 1320
ggctggtgtg ctgactacaa cgaaccaact tccttcctga acaccatgct ttcgaacagc 1380
tcgatgaata ccgcgcatta taagagcccg gcctttgaca gcattatggc ggaaacgctg 1440
aaagtgactg acgaggcgca gcgcacagct ctgtacacta aagcagaaca acagctggat 1500
aaggattcgg ccattgttcc tgtttattac tacgtgaatg cgcgtctggt gaaaccgtgg 1560
gttggtggct ataccggcaa agatccgctg gataatacct atacccggaa tatgtacatt 1620
gtgaagcact aa 1632
<210> 2
<211> 2115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fusA coding DNA
<400> 2
atggctcgta caacacccat cgcacgctac cgtaacatcg gtatcagtgc gcacatcgac 60
gccggtaaaa ccactactac cgaacgtatt ctgttctaca ccggtgtaaa ccataaaatc 120
ggtgaagttc atgacggcgc tgcaaccatg gactggatgg agcaggagca ggaacgtggt 180
attaccatca cttccgctgc gactactgca ttctggtctg gtatggctaa gcagtatgag 240
ccgcatcgca tcaacatcat cgacaccccg gggcacgttg acttcacaat cgaagtagaa 300
cgttccatgc gtgttctcga tggtgcggta atggtttact gcgcagttgg tggtgttcag 360
ccgcagtctg aaaccgtatg gcgtcaggca aacaaatata aagttccgcg cattgcgttc 420
gttaacaaaa tggaccgcat gggtgcgaac ttcctgaaag ttgttaacca gatcaaaacc 480
cgtctgggcg cgaacccggt tccgctgcag ctggcgattg gtgctgaaga acatttcacc 540
ggtgttgttg acctggtgaa aatgaaagct atcaactgga acgacgctga ccagggcgta 600
accttcgaat acgaagatat cccggcagac atggttgaac tggctaacga atggcaccag 660
aacctgatcg aatccgcagc tgaagcttct gaagagctga tggaaaaata cctgggtggt 720
gaagaactga ctgaagcaga aatcaaaggt gctctgcgtc agcgcgttct gaacaacgaa 780
atcatcctgg taacctgtgg ttctgcgttc aagaacaaag gtgttcaggc gatgctggat 840
gcggtaattg attacctgcc atccccggtt gacgtacctg cgatcaacgg tatcctggac 900
gacggtaaag acactccggc tgaacgtcac gcaagtgatg acgagccgtt ctctgcactg 960
gcgttcaaaa tcgctaccga cccgtttgtt ggtaacctga ccttcttccg tgtttactcc 1020
ggtgtggtta actctggtga taccgtactg aactccgtga aagctgcacg tgagcgtttc 1080
ggtcgtatcg ttcagatgca cgctaacaaa cgtgaagaga tcaaagaagt tcgcgcgggc 1140
gacatcgctg ctgctatcgg tctgaaagac gtaaccactg gtgacaccct gtgtgacccg 1200
gatgcgccga tcattctgga acgtatggaa ttccctgagc cggtaatctc catcgcagtt 1260
gaaccgaaaa ccaaagctga ccaggaaaaa atgggtctgg ctctgggccg tctggctaaa 1320
gaagacccgt ctttccgtgt atggactgac gaagaatcta accagaccat catcgcgggt 1380
atgggcgaac tgcacctcga catcatcgtt gaccgtatga agcgtgaatt caacgttgaa 1440
gcgaacgtag gtaaaccgca ggttgcttac cgtgaaacta tccgccagaa agttaccgat 1500
gttgaaggta aacacgcgaa acagtctggt ggtcgtggtc agtatggtca tgttgttatc 1560
gacatgtacc cgctggagcc gggttcaaac ccgaaaggct acgagttcat caacgacatt 1620
aaaggtggtg taatccctgg cgaatacatc ccggccgttg ataaaggtat ccaggaacag 1680
ctgaaagcag gtccgctggc aggctacccg gtagtagaca tgggtattcg tctgcacttc 1740
ggttcttacc atgacgttga ctcctctgaa ctggcgttta aactggctgc ttctatcgcc 1800
tttaaagaag gctttaagaa agcgaaacca gttctgcttg agccgatcat gaaggttgaa 1860
gtagaaactc cggaagagaa caccggtgac gttatcggtg acttgagccg tcgtcgtggt 1920
atgctcaaag gtcaggaatc tgaagttact ggcgttaaga tccacgctga agtaccgctg 1980
tctgaaatgt tcggatacgc aactcagctg cgttctctga ccaaaggtcg tgcatcatac 2040
actatggaat tcctgaagta tgatgaagcg ccgagtaacg ttgctcaggc cgtaattgaa 2100
gcccgtggta aataa 2115
<210> 3
<211> 843
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimized asbF
<400> 3
atgaaatact ccctgtgcac tattagcttc cgtcatcaac tgatttcttt cactgacatc 60
gttcagttcg cgtacgaaaa cggttttgaa ggcatcgagc tgtggggtac tcatgcccag 120
aacctgtaca tgcaggagcg tgaaaccacc gagcgtgagc tgaacttcct gaaagataag 180
aacctggaaa tcaccatgat ctctgactac ctggatattt ccctgtccgc cgacttcgag 240
aaaaccattg aaaaatccga acagctggtg gtgctggcaa actggttcaa caccaacaag 300
atccgtacct ttgcgggcca gaaaggtagc aaggactttt ctgaacagga acgtaaagag 360
tacgtaaagc gcatccgtaa aatctgcgac gtttttgcac agcataacat gtacgtcctg 420
ctggaaactc atccgaacac cctgaccgac actctgccta gcaccattga actgctggaa 480
gaagtgaacc atccaaacct gaaaatcaac ctggatttcc tgcatatttg ggaaagcggc 540
gcgaatccaa tcgactcttt ccatcgcctg aaaccgtgga ctctgcacta ccatttcaaa 600
aacatctcct ccgcggatta cctgcacgtg ttcgaaccga ataacgtcta cgccgctgca 660
ggctcccgta ttggtatggt tccactgttt gagggcatcg ttaactacga cgaaatcatt 720
caagaagttc gtggcaccga cctgtttgct tctctggaat ggttcggcca caactctaaa 780
gagatcctga aggaagaaat gaaagtgctg atcaaccgta aactggaagt ggtgacgagc 840
tga 843
<210> 4
<211> 1509
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimized aroY
<400> 4
atgactgcac caatccagga cctgcgcgac gcaatcgctc tgctgcaaca gcacgataac 60
cagtatctgg aaaccgatca cccagttgac ccgaatgcgg agctggcagg cgtctaccgt 120
catattggtg ccggtggcac tgttaaacgc ccgacccgca tcggcccagc aatgatgttt 180
aacaacatca aaggctaccc gcacagccgc atcctggtag gcatgcacgc ttctcgtcaa 240
cgtgcggcac tgctgctggg ctgtgaagca tctcagctgg ctctggaggt gggcaaggcc 300
gtcaaaaagc cggtggcgcc ggttgttgtt ccggcatctt ccgctccttg ccaggaacag 360
attttcctgg ccgatgatcc ggacttcgac ctgcgtacgc tgctgccggc tcacacgaac 420
actccgatcg acgcgggtcc gtttttctgc ctgggtctgg ctctggcgtc tgacccggtg 480
gatgcgagcc tgaccgacgt gaccatccac cgcctgtgcg ttcagggtcg tgacgaactg 540
agcatgttcc tggcagcagg tcgtcacatt gaagtattcc gccaaaaagc ggaagccgcc 600
ggtaaaccgc tgcctattac catcaacatg ggtctggacc cggcgatcta catcggcgct 660
tgctttgaag cacctacgac tccgttcggt tacaacgaac tgggtgtagc cggtgctctg 720
cgccagcgtc cggtggaact ggtacagggc gtgagcgtcc cagaaaaagc catcgcacgc 780
gctgaaatcg taatcgaagg cgaactgctg ccgggcgtcc gcgttcgtga agaccagcac 840
accaacagcg gtcacgcaat gcctgaattc ccgggctact gtggcggtgc caacccgtcc 900
ctgccggtta ttaaggttaa agctgttact atgcgtaaca acgcgattct gcagactctg 960
gtcggtccgg gtgaggaaca cacgaccctg gcgggcctgc cgactgaagc ctctatttgg 1020
aatgcggttg aagcagccat cccgggcttc ctgcagaatg tttacgctca taccgcgggt 1080
ggcggtaaat tcctgggtat cctgcaggtt aaaaagcgcc agccggcaga tgaaggtcgc 1140
caaggtcagg ctgccctgct ggcgctggct acctactctg aactgaaaaa catcattctg 1200
gttgacgaag atgtcgatat ctttgattcc gacgacatcc tgtgggctat gacgactcgt 1260
atgcagggcg atgtttctat caccaccatc ccgggcatcc gtggtcacca gctggacccg 1320
tcccagactc cggaatattc cccgagcatc cgcggcaacg gcatctcctg taaaaccatt 1380
ttcgactgca ccgttccgtg ggctctgaaa tcccacttcg agcgtgcgcc gtttgcggac 1440
gttgatccgc gtccgttcgc accggagtat ttcgctcgtc tggagaaaaa tcagggttcc 1500
gcgaaataa 1509
<210> 5
<211> 923
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimized catA
<400> 5
atgaaccgtc agcagatcga cgcgctggtt aaacagatga acgtggatac cgctaagggc 60
gaagttgacg ctcgcgtaca gcagattgta gtacgtctgc tgggtgacct gttccaggca 120
atcgaagatc tggatattca gccgtctgaa gtgtggaaag gtctggagta tttcaccgat 180
gctggtcagg cgaacgaact gggtctgctg gcggccggtc tgggcctgga gcactatctg 240
gacctgcgtg cggatgaagc agatgcaaaa gcaggtgtga ccggtggtac tccgcgtacc 300
attgaaggtc cgctgtatgt tgcaggtgct ccggaaagcg ttggtttcgc gcgtatggat 360
gacggtactg aatctggtaa aatcgatact ctgatcattg aaggcaccgt caccgacacc 420
gacggtaata tcatcgaaaa cgctaaagta gaggtttggc acgcgaactc tctgggcaac 480
tattctttct ttgataaatc ccagtccgac ttcaacctgc gtcgtaccat tctgaccgat 540
gcggacggta aatatgttgc gctgacgacg atgccagtag gctatggctg tccgccggaa 600
ggtaccaccc aagcgctgct gaacaaactg ggtcgccacg gtaaccgtcc ttctcacgta 660
cactatttcg tgtctgctcc gggctaccgt aaactgacga cccaattcaa tatcgagggt 720
gacgaatacc tgtgggatga tttcgctttt gctacccgtg atggtctggt ggcgaccgcg 780
gtagacgtga ccgatccagc tgaaatccag cgtcgcggcc tggatcacgc ttttaaacac 840
atcaccttca acattgaact ggttaaagat gcagccgcgg cacctagcac tgaggtagaa 900
cgccgtcgtg cgtccgctta att 923
<210> 6
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ribosome binding site
<400> 6
gaagga 6
<210> 7
<211> 819
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aroE coding DNA
<400> 7
atggaaacct atgctgtttt tggtaatccg atagcccaca gcaaatcgcc attcattcat 60
cagcaatttg ctcagcaact gaatattgaa catccctatg ggcgcgtgtt ggcacccatc 120
aatgatttca tcaacacact gaacgctttc tttagtgctg gtggtaaagg tgcgaatgtg 180
acggtgcctt ttaaagaaga ggcttttgcc agagcggatg agcttactga acgggcagcg 240
ttggctggtg ctgttaatac cctcatgcgg ttagaagatg gacgcctgct gggtgacaat 300
accgatggtg taggcttgtt aagcgatctg gaacgtctgt cttttatccg ccctggttta 360
cgtattctgc ttatcggcgc tggtggagca tctcgcggcg tactactgcc actcctttcc 420
ctggactgtg cggtgacaat aactaatcgg acggtatccc gcgcggaaga gttggctaaa 480
ttgtttgcgc acactggcag tattcaggcg ttgagtatgg acgaactgga aggtcatgag 540
tttgatctca ttattaatgc aacatccagt ggcatcagtg gtgatattcc ggcgatcccg 600
tcatcgctca ttcatccagg catttattgc tatgacatgt tctatcagaa aggaaaaact 660
ccttttctgg catggtgtga gcagcgaggc tcaaagcgta atgctgatgg tttaggaatg 720
ctggtggcac aggcggctca tgcctttctt ctctggcacg gtgttctgcc tgacgtagaa 780
ccagttataa agcaattgca ggaggaattg tccgcgtga 819
<210> 8
<211> 1542
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tyrR coding DNA
<400> 8
atgcgtctgg aagtcttttg tgaagaccga ctcggtctga cccgcgaatt actcgatcta 60
ctcgtgctaa gaggcattga tttacgcggt attgagattg atcccattgg gcgaatctac 120
ctcaattttg ctgaactgga gtttgagagt ttcagcagtc tgatggccga aatacgccgt 180
attgcgggtg ttaccgatgt gcgtactgtc ccgtggatgc cttccgaacg tgagcatctg 240
gcgttgagcg cgttactgga ggcgttgcct gaacctgtgc tctctgtcga tatgaaaagc 300
aaagtggata tggcgaaccc ggcgagctgt cagctttttg ggcaaaaatt ggatcgcctg 360
cgcaaccata ccgccgcaca attgattaac ggctttaatt ttttacgttg gctggaaagc 420
gaaccgcaag attcgcataa cgagcatgtc gttattaatg ggcagaattt cctgatggag 480
attacgcctg tttatcttca ggatgaaaat gatcaacacg tcctgaccgg tgcggtggtg 540
atgttgcgat caacgattcg tatgggccgc cagttgcaaa atgtcgccgc ccaggacgtc 600
agcgccttca gtcaaattgt cgccgtcagc ccgaaaatga agcatgttgt cgaacaggcg 660
cagaaactgg cgatgctaag cgcgccgctg ctgattacgg gtgacacagg tacaggtaaa 720
gatctctttg cctacgcctg ccatcaggca agccccagag cgggcaaacc ttacctggcg 780
ctgaactgtg cgtctatacc ggaagatgcg gtcgagagtg aactgtttgg tcatgctccg 840
gaagggaaga aaggattctt tgagcaggcg aacggtggtt cggtgctgtt ggatgaaata 900
ggggaaatgt caccacggat gcaggcgaaa ttactgcgtt tccttaatga tggcactttc 960
cgtcgggttg gcgaagacca tgaggtgcat gtcgatgtgc gggtgatttg cgctacgcag 1020
aagaatctgg tcgaactggt gcaaaaaggc atgttccgtg aagatctcta ttatcgtctg 1080
aacgtgttga cgctcaatct gccgccgcta cgtgactgtc cgcaggacat catgccgtta 1140
actgagctgt tcgtcgcccg ctttgccgac gagcagggcg tgccgcgtcc gaaactggcc 1200
gctgacctga atactgtact tacgcgttat gcgtggccgg gaaatgtgcg gcagttaaag 1260
aacgctatct atcgcgcact gacacaactg gacggttatg agctgcgtcc acaggatatt 1320
ttgttgccgg attatgacgc cgcaacggta gccgtgggcg aagatgcgat ggaaggttcg 1380
ctggacgaaa tcaccagccg ttttgaacgc tcggtattaa cccagcttta tcgcaattat 1440
cccagcacgc gcaaactggc aaaacgtctc ggcgtttcac ataccgcgat tgccaataag 1500
ttgcgggaat atggtctgag tcagaagaag aacgaagagt aa 1542
<210> 9
<211> 1434
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ptsG coding DNA
<400> 9
atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60
tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt cagctggctg 120
cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc aaacatgcca 180
ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt atccgcgctg 240
gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc gccactggta 300
ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg cgtactcgga 360
gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg tattaagctg 420
cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc tggcctggct 480
gccatcttta ctggcgttgt gctgtccttc atttggccgc cgattggttc tgcaatccag 540
accttctctc agtgggctgc ttaccagaac ccggtagttg cgtttggcat ttacggtttc 600
atcgaacgtt gcctggtacc gtttggtctg caccacatct ggaacgtacc tttccagatg 660
cagattggtg aatacaccaa cgcagcaggt caggttttcc acggcgacat tccgcgttat 720
atggcgggtg acccgactgc gggtaaactg tctggtggct tcctgttcaa aatgtacggt 780
ctgccagctg ccgcaattgc tatctggcac tctgctaaac cagaaaaccg cgcgaaagtg 840
ggcggtatta tgatctccgc ggcgctgacc tcgttcctga ccggtatcac cgagccgatc 900
gagttctcct tcatgttcgt tgcgccgatc ctgtacatca tccacgcgat tctggcaggc 960
ctggcattcc caatctgtat tcttctgggg atgcgtgacg gtacgtcgtt ctcgcacggt 1020
ctgatcgact tcatcgttct gtctggtaac agcagcaaac tgtggctgtt cccgatcgtc 1080
ggtatcggtt atgcgattgt ttactacacc atcttccgcg tgctgattaa agcactggat 1140
ctgaaaacgc cgggtcgtga agacgcgact gaagatgcaa aagcgacagg taccagcgaa 1200
atggcaccgg ctctggttgc tgcatttggt ggtaaagaaa acattactaa cctcgacgca 1260
tgtattaccc gtctgcgcgt cagcgttgct gatgtgtcta aagtggatca ggccggcctg 1320
aagaaactgg gcgcagcggg cgtagtggtt gctggttctg gtgttcaggc gattttcggt 1380
actaaatccg ataacctgaa aaccgagatg gatgagtaca tccgtaacca ctaa 1434
<210> 10
<211> 1443
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykA coding DNA
<400> 10
atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc gttaccacgt taggcccagc aacagatcgc 60
gataataatc ttgaaaaagt tatcgcggcg ggtgccaacg ttgtacgtat gaacttttct 120
cacggctcgc ctgaagatca caaaatgcgc gcggataaag ttcgtgagat tgccgcaaaa 180
ctggggcgtc atgtggctat tctgggtgac ctccaggggc ccaaaatccg tgtatccacc 240
tttaaagaag gcaaagtttt cctcaatatt ggggataaat tcctgctcga cgccaacctg 300
ggtaaaggtg aaggcgacaa agaaaaagtc ggtatcgact acaaaggcct gcctgctgac 360
gtcgtgcctg gtgacatcct gctgctggac gatggtcgcg tccagttaaa agtactggaa 420
gttcagggca tgaaagtgtt caccgaagtc accgtcggtg gtcccctctc caacaataaa 480
ggtatcaaca aacttggcgg cggtttgtcg gctgaagcgc tgaccgaaaa agacaaagca 540
gacattaaga ctgcggcgtt gattggcgta gattacctgg ctgtctcctt cccacgctgt 600
ggcgaagatc tgaactatgc ccgtcgcctg gcacgcgatg caggatgtga tgcgaaaatt 660
gttgccaagg ttgaacgtgc ggaagccgtt tgcagccagg atgcaatgga tgacatcatc 720
ctcgcctctg acgtggtaat ggttgcacgt ggcgacctcg gtgtggaaat tggcgacccg 780
gaactggtcg gcattcagaa agcgttgatc cgtcgtgcgc gtcagctaaa ccgagcggta 840
atcacggcga cccagatgat ggagtcaatg attactaacc cgatgccgac gcgtgcagaa 900
gtcatggacg tagcaaacgc cgttctggat ggtactgacg ctgtgatgct gtctgcagaa 960
actgccgctg ggcagtatcc gtcagaaacc gttgcagcca tggcgcgcgt ttgcctgggt 1020
gcggaaaaaa tcccgagcat caacgtttct aaacaccgtc tggacgttca gttcgacaat 1080
gtggaagaag ctattgccat gtcagcaatg tacgcagcta accacctgaa aggcgttacg 1140
gcgatcatca ccatgaccga atcgggtcgt accgcgctga tgacctcccg tatcagctct 1200
ggtctgccaa ttttcgccat gtcgcgccat gaacgtacgc tgaacctgac tgctctctat 1260
cgtggcgtta cgccggtgca ctttgatagc gctaatgacg gcgtagcagc tgccagcgaa 1320
gcggttaatc tgctgcgcga taaaggttac ttgatgtctg gtgacctggt gattgtcacc 1380
cagggcgacg tgatgagtac cgtgggttct actaatacca cgcgtatttt aacggtagag 1440
taa 1443
<210> 11
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykF coding DNA
<400> 11
atgaaaaaga ccaaaattgt ttgcaccatc ggaccgaaaa ccgaatctga agagatgtta 60
gctaaaatgc tggacgctgg catgaacgtt atgcgtctga acttctctca tggtgactat 120
gcagaacacg gtcagcgcat tcagaatctg cgcaacgtga tgagcaaaac tggtaaaacc 180
gccgctatcc tgcttgatac caaaggtccg gaaatccgca ccatgaaact ggaaggcggt 240
aacgacgttt ctctgaaagc tggtcagacc tttactttca ccactgataa atctgttatc 300
ggcaacagcg aaatggttgc ggtaacgtat gaaggtttca ctactgacct gtctgttggc 360
aacaccgtac tggttgacga tggtctgatc ggtatggaag ttaccgccat tgaaggtaac 420
aaagttatct gtaaagtgct gaacaacggt gacctgggcg aaaacaaagg tgtgaacctg 480
cctggcgttt ccattgctct gccagcactg gctgaaaaag acaaacagga cctgatcttt 540
ggttgcgaac aaggcgtaga ctttgttgct gcttccttta ttcgtaagcg ttctgacgtt 600
atcgaaatcc gtgagcacct gaaagcgcac ggcggcgaaa acatccacat catctccaaa 660
atcgaaaacc aggaaggcct caacaacttc gacgaaatcc tcgaagcctc tgacggcatc 720
atggttgcgc gtggcgacct gggtgtagaa atcccggtag aagaagttat cttcgcccag 780
aagatgatga tcgaaaaatg tatccgtgca cgtaaagtcg ttatcactgc gacccagatg 840
ctggattcca tgatcaaaaa cccacgcccg actcgcgcag aagccggtga cgttgcaaac 900
gccatcctcg acggtactga cgcagtgatg ctgtctggtg aatccgcaaa aggtaaatac 960
ccgctggaag cggtttctat catggcgacc atctgcgaac gtaccgaccg cgtgatgaac 1020
agccgtctcg agttcaacaa tgacaaccgt aaactgcgca ttaccgaagc ggtatgccgt 1080
ggtgccgttg aaactgctga aaaactggat gctccgctga tcgtggttgc tactcagggc 1140
ggtaaatctg ctcgcgcagt acgtaaatac ttcccggatg ccaccatcct ggcactgacc 1200
accaacgaaa aaacggctca tcagttggta ctgagcaaag gcgttgtgcc gcagcttgtt 1260
aaagagatca cttctactga tgatttctac cgtctgggta aagaactggc tctgcagagc 1320
ggtctggcac acaaaggtga cgttgtagtt atggtttctg gtgcactggt accgagcggc 1380
actactaaca ccgcatctgt tcacgtcctg taa 1413
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ptsG_UP Forward primer
<400> 12
ttacatatgc gggatccggt aggcgaacgt 30
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ptsG_UP Reverse primer
<400> 13
catggtttta accatctaga cataggcaac aactcgagcc agcgcggata 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ptsG_DOWN Forward primer
<400> 14
tccacgcgat tctagaaggc ctggcattcc caagctttat tcttctgggg 50
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ptsG_DOWN Reverse primer
<400> 15
gtcgacctac gccagctata 20
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tyrR_UP Forward primer
<400> 16
caggtgatgg atgtcgacaa accactaccg 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tyrR_UP Reverse primer
<400> 17
tcgacagaga gcaaagcttc aggcaacgcc 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tyrR_DOWN Forward primer
<400> 18
actgacacaa ctcgagggtt ctgagctgcg 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tyrR_DOWN Reverse primer
<400> 19
gcatcgcaac gcctggatcc gccaatagct 30
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykA_UP Forward primer
<400> 20
cgtttctaga caccgtctcg aggttcagtt cgac 34
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykA_UP Reverse primer
<400> 21
ccgccaagga tccgtgatcc cattct 26
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykA_DOWN Forward primer
<400> 22
caaccgcgcc gtcgacttgc tc 22
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykA_DOWN Reverse primer
<400> 23
caaacggctt ctagacgttc aagcttggca acaa 34
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykF_UP Forward primer
<400> 24
gaatatcagg atccagctta ccgcctcatc ct 32
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykF_UP Reverse primer
<400> 25
gcaacaaagt ctagaccttg ttcgcaacca 30
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykF_DOWN Forward primer
<400> 26
gaacagccgt cactagttca acaatgacaa c 31
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pykF_DOWN Reverse primer
<400> 27
acagcgtcga cttgcgcgtc agttca 26
<210> 28
<211> 207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> poppA_promoter sequences
<400> 28
aattcaatgt gtctcgacag gggagacaca gtacgaatcg acataaggtg atcgtctgaa 60
tcaccagaat aaataaagtc ggtgatagta atacgtaacg ataaagtaac ctgacagcag 120
aaagtctccg agcctgtgca gggtcccaat ccgggattac acatgctggt taataccagt 180
aattataatg agggagtcca aaaaaca 207
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pfusA_promoter sequences
<400> 29
gaattcaacg cctaaaagat aaacgaggaa acaa 34
<210> 30
<211> 5809
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> poppA_plasmid sequences
<400> 30
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 60
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 120
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 180
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 240
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 300
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 360
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 420
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 480
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 540
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 600
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 660
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 720
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 780
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 840
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 900
taatgcagct ggcacgacag ggaattcaat gtgtctcgac aggggagaca cagtacgaat 960
cgacataagg tgatcgtctg aatcaccaga ataaataaag tcggtgatag taatacgtaa 1020
cgataaagta acctgacagc agaaagtctc cgagcctgtg cagggtccca atccgggatt 1080
acacatgctg gttaatacca gtaattataa tgagggagtc caaaaaacat ctagaaataa 1140
ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgaaatac tccctgtgca ctattagctt 1200
ccgtcatcaa ctgatttctt tcactgacat cgttcagttc gcgtacgaaa acggttttga 1260
aggcatcgag ctgtggggta ctcatgccca gaacctgtac atgcaggagc gtgaaaccac 1320
cgagcgtgag ctgaacttcc tgaaagataa gaacctggaa atcaccatga tctctgacta 1380
cctggatatt tccctgtccg ccgacttcga gaaaaccatt gaaaaatccg aacagctggt 1440
ggtgctggca aactggttca acaccaacaa gatccgtacc tttgcgggcc agaaaggtag 1500
caaggacttt tctgaacagg aacgtaaaga gtacgtaaag cgcatccgta aaatctgcga 1560
cgtttttgca cagcataaca tgtacgtcct gctggaaact catccgaaca ccctgaccga 1620
cactctgcct agcaccattg aactgctgga agaagtgaac catccaaacc tgaaaatcaa 1680
cctggatttc ctgcatattt gggaaagcgg cgcgaatcca atcgactctt tccatcgcct 1740
gaaaccgtgg actctgcact accatttcaa aaacatctcc tccgcggatt acctgcacgt 1800
gttcgaaccg aataacgtct acgccgctgc aggctcccgt attggtatgg ttccactgtt 1860
tgagggcatc gttaactacg acgaaatcat tcaagaagtt cgtggcaccg acctgtttgc 1920
ttctctggaa tggttcggcc acaactctaa agagatcctg aaggaagaaa tgaaagtgct 1980
gatcaaccgt aaactggaag tggtgacgag ctgaaataat tttgtttaac tttaagaagg 2040
agatatacat atgactgcac caatccagga cctgcgcgac gcaatcgctc tgctgcaaca 2100
gcacgataac cagtatctgg aaaccgatca cccagttgac ccgaatgcgg agctggcagg 2160
cgtctaccgt catattggtg ccggtggcac tgttaaacgc ccgacccgca tcggcccagc 2220
aatgatgttt aacaacatca aaggctaccc gcacagccgc atcctggtag gcatgcacgc 2280
ttctcgtcaa cgtgcggcac tgctgctggg ctgtgaagca tctcagctgg ctctggaggt 2340
gggcaaggcc gtcaaaaagc cggtggcgcc ggttgttgtt ccggcatctt ccgctccttg 2400
ccaggaacag attttcctgg ccgatgatcc ggacttcgac ctgcgtacgc tgctgccggc 2460
tcacacgaac actccgatcg acgcgggtcc gtttttctgc ctgggtctgg ctctggcgtc 2520
tgacccggtg gatgcgagcc tgaccgacgt gaccatccac cgcctgtgcg ttcagggtcg 2580
tgacgaactg agcatgttcc tggcagcagg tcgtcacatt gaagtattcc gccaaaaagc 2640
ggaagccgcc ggtaaaccgc tgcctattac catcaacatg ggtctggacc cggcgatcta 2700
catcggcgct tgctttgaag cacctacgac tccgttcggt tacaacgaac tgggtgtagc 2760
cggtgctctg cgccagcgtc cggtggaact ggtacagggc gtgagcgtcc cagaaaaagc 2820
catcgcacgc gctgaaatcg taatcgaagg cgaactgctg ccgggcgtcc gcgttcgtga 2880
agaccagcac accaacagcg gtcacgcaat gcctgaattc ccgggctact gtggcggtgc 2940
caacccgtcc ctgccggtta ttaaggttaa agctgttact atgcgtaaca acgcgattct 3000
gcagactctg gtcggtccgg gtgaggaaca cacgaccctg gcgggcctgc cgactgaagc 3060
ctctatttgg aatgcggttg aagcagccat cccgggcttc ctgcagaatg tttacgctca 3120
taccgcgggt ggcggtaaat tcctgggtat cctgcaggtt aaaaagcgcc agccggcaga 3180
tgaaggtcgc caaggtcagg ctgccctgct ggcgctggct acctactctg aactgaaaaa 3240
catcattctg gttgacgaag atgtcgatat ctttgattcc gacgacatcc tgtgggctat 3300
gacgactcgt atgcagggcg atgtttctat caccaccatc ccgggcatcc gtggtcacca 3360
gctggacccg tcccagactc cggaatattc cccgagcatc cgcggcaacg gcatctcctg 3420
taaaaccatt ttcgactgca ccgttccgtg ggctctgaaa tcccacttcg agcgtgcgcc 3480
gtttgcggac gttgatccgc gtccgttcgc accggagtat ttcgctcgtc tggagaaaaa 3540
tcagggttcc gcgaaataaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa 3600
ccgtcagcag atcgacgcgc tggttaaaca gatgaacgtg gataccgcta agggcgaagt 3660
tgacgctcgc gtacagcaga ttgtagtacg tctgctgggt gacctgttcc aggcaatcga 3720
agatctggat attcagccgt ctgaagtgtg gaaaggtctg gagtatttca ccgatgctgg 3780
tcaggcgaac gaactgggtc tgctggcggc cggtctgggc ctggagcact atctggacct 3840
gcgtgcggat gaagcagatg caaaagcagg tgtgaccggt ggtactccgc gtaccattga 3900
aggtccgctg tatgttgcag gtgctccgga aagcgttggt ttcgcgcgta tggatgacgg 3960
tactgaatct ggtaaaatcg atactctgat cattgaaggc accgtcaccg acaccgacgg 4020
taatatcatc gaaaacgcta aagtagaggt ttggcacgcg aactctctgg gcaactattc 4080
tttctttgat aaatcccagt ccgacttcaa cctgcgtcgt accattctga ccgatgcgga 4140
cggtaaatat gttgcgctga cgacgatgcc agtaggctat ggctgtccgc cggaaggtac 4200
cacccaagcg ctgctgaaca aactgggtcg ccacggtaac cgtccttctc acgtacacta 4260
tttcgtgtct gctccgggct accgtaaact gacgacccaa ttcaatatcg agggtgacga 4320
atacctgtgg gatgatttcg cttttgctac ccgtgatggt ctggtggcga ccgcggtaga 4380
cgtgaccgat ccagctgaaa tccagcgtcg cggcctggat cacgctttta aacacatcac 4440
cttcaacatt gaactggtta aagatgcagc cgcggcacct agcactgagg tagaacgccg 4500
tcgtgcgtcc gcttaattaa gcttgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg 4560
acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg 4620
catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat 4680
acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 4740
ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 4800
gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 4860
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 4920
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 4980
acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 5040
cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 5100
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 5160
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 5220
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 5280
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 5340
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 5400
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 5460
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 5520
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 5580
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 5640
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 5700
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 5760
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atccttttt 5809
<210> 31
<211> 5635
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pfusA_plasmid sequences
<400> 31
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
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cgtaacaacg cgattctgca gactctggtc ggtccgggtg aggaacacac gaccctggcg 4020
ggcctgccga ctgaagcctc tatttggaat gcggttgaag cagccatccc gggcttcctg 4080
cagaatgttt acgctcatac cgcgggtggc ggtaaattcc tgggtatcct gcaggttaaa 4140
aagcgccagc cggcagatga aggtcgccaa ggtcaggctg ccctgctggc gctggctacc 4200
tactctgaac tgaaaaacat cattctggtt gacgaagatg tcgatatctt tgattccgac 4260
gacatcctgt gggctatgac gactcgtatg cagggcgatg tttctatcac caccatcccg 4320
ggcatccgtg gtcaccagct ggacccgtcc cagactccgg aatattcccc gagcatccgc 4380
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cacttcgagc gtgcgccgtt tgcggacgtt gatccgcgtc cgttcgcacc ggagtatttc 4500
gctcgtctgg agaaaaatca gggttccgcg aaataaaata attttgttta actttaagaa 4560
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ctgttccagg caatcgaaga tctggatatt cagccgtctg aagtgtggaa aggtctggag 4740
tatttcaccg atgctggtca ggcgaacgaa ctgggtctgc tggcggccgg tctgggcctg 4800
gagcactatc tggacctgcg tgcggatgaa gcagatgcaa aagcaggtgt gaccggtggt 4860
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tgtccgccgg aaggtaccac ccaagcgctg ctgaacaaac tgggtcgcca cggtaaccgt 5220
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gtggcgaccg cggtagacgt gaccgatcca gctgaaatcc agcgtcgcgg cctggatcac 5400
gcttttaaac acatcacctt caacattgaa ctggttaaag atgcagccgc ggcacctagc 5460
actgaggtag aacgccgtcg tgcgtccgct taattaagct tgccccgaca cccgccaaca 5520
cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 5580
accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcga 5638
<210> 34
<211> 5796
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pdps_plasmid sequences
<400> 34
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
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gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
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agctttgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
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acccgtccca gactccggaa tattccccga gcatccgcgg caacggcatc tcctgtaaaa 4560
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ctcgcgtaca gcagattgta gtacgtctgc tgggtgacct gttccaggca atcgaagatc 4860
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cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt 5760
gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcga 5796
Claims (8)
- 서열번호 1의 oppA 유전자의 프로모터(promoter) 또는 서열번호 2의 fusA 유전자의 프로모터를 포함하고,
상기 프로모터의 다운스트림(downstream) 영역에 asbF opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, aroY opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 catA opt 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 세 폴리뉴클레오티드의 각 업스트림(upstream)에 대장균 유래의 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, rbs)를 포함하고, 상기 세 폴리뉴클레오티드 중 첫 번째 전사되는 폴리뉴클레오티드의 리보솜 결합부위(rbs)의 업스트림(upstream)에 상기 프로모터를 포함하는, 뮤코닉산 생산용 재조합 벡터. - 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 유전자재조합 대장균.
- 제3항에 있어서, 상기 대장균은,
aroE 유전자; 와 함께
tyrR 및 ptsG 유전자; tyrR, ptsG 및 pykA 유전자; tyrR, ptsG 및 pykF 유전자; 또는 tyrR, ptsG, pykA 및 pykF 유전자;가 불활성화된 것인, 유전자재조합 대장균. - 제4항에 있어서,
상기 유전자의 불활성화는 상기 대장균에서 상기 유전자가 결손(deletion)된 것인, 유전자재조합 대장균. - 제4항에 있어서,
상기 대장균은 시스,시스-뮤코닉산 (cis,cis-muconic acid) 생산용인, 유전자재조합 대장균. - 제4항의 유전자재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하는, 시스,시스-뮤코닉산의 생산방법.
- 제7항에 있어서,
상기 유전자재조합 대장균을 배양하는 단계는 인덕션(induction) 과정을 거치지 않는, 시스,시스-뮤코닉산의 생산방법.
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Citations (1)
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KR20150120236A (ko) | 2014-04-17 | 2015-10-27 | (주)에스티알바이오텍 | 뮤코닉산 생산용 미생물 및 그 제조방법 |
-
2020
- 2020-05-07 KR KR1020200054634A patent/KR20210136417A/ko unknown
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KR20150120236A (ko) | 2014-04-17 | 2015-10-27 | (주)에스티알바이오텍 | 뮤코닉산 생산용 미생물 및 그 제조방법 |
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