KR20210132097A - 개질된 단당류 화합물을 사용하여 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 및 암을 치료 및/또는 진단하기 위한 방법 - Google Patents

개질된 단당류 화합물을 사용하여 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 및 암을 치료 및/또는 진단하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 및/또는 검출하기 위한 방법에서 실행되는 개질된 단당류 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 세포의 식별 또는 단리, 암의 진단 또는 세포 치료를 위한 방법에서 실행되는 그러한 개질된 단당류 화합물에 관한 것이다.

Description

개질된 단당류 화합물을 사용하여 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 및 암을 치료 및/또는 진단하기 위한 방법
본 발명은 의학 분야, 특히 종양학의 의학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 및/또는 검출 및/또는 표적화하기 위한 방법에서 실행되는 개질된 단당류 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 세포의 식별 또는 단리, 암의 진단 또는 세포 치료를 위한 방법에서 실행되는 개질된 단당류 화합물에 관한 것이다.
탄수화물은 신호전달 분자로서 그리고 세포 인지 이벤트에서 중요하다. 실제로, 탄수화물은 탄수화물 인지 단백질 (CRP) 과 다가 상호작용을 할 수 있고, 살아 있는 유기체의 프로브로서 사용될 수 있다. 따라서 탄수화물은 질환 진단 및 요법에 많은 기회를 제시한다. 그 결과, 탄수화물-기반 생물활성 화합물 및 센서의 개발이 활발한 연구 분야가 되고 있다. 기능성 탄수화물 유도체를 제조하기 위한 효과적인 모듈식 합성 접근법은 클릭 화학이다. 치료 및 진단을 위한 CuAAC (Cu-촉매작용되는 아지드-알카인 1,3-2극성 고리화첨가 (cycloaddition)) 클릭 화학에 의해 제조된 일부 탄수화물 유도체가 He et al. (Carbohydrate Research 429 (2016) 1-22) 로부터의 리뷰에서 보고된다. 균주-촉진되는 아지드-알카인 고리화첨가 반응 사용하는 무구리 (copper-free) 클릭 화학이 또한 암 세포에 대해 설명되었다. 클릭가능한 기를 제시하는 특정 당 (예를 들어, 트리아세틸 N-아지도아세틸만노사민 (Ac3ManNAz) 유사체) 은 특이적 과발현 효소-절단가능한 당 유사체로 인해 암세포에 의해 대사된다. 따라서 상기 당은 암 세포 막 내로 특이적으로 대사되고 통합된다.
여러가지 탄수화물/단당류 클릭 화학이 치료 및 진단을 위해 설명되었더라도, 이들 클릭 화학 방법 및 이에 사용되는 화합물은 세포독성이고/이거나 암 세포에 대해 선택적인 것과 같이 특정 세포에 대해 선택적이지 않은 것으로 보인다. 이들 화합물의 세포독성은 낮은 비독성 농도를 사용하는 것을 시사하며, 이는 이들을 덜 효과적이게 한다.
WO2013/1077559 는 살아 있는 미생물을 특이적으로 표지하기 위한 방법에서 특정 화합물 8-아지도-3,8-디데옥시-D-만노-옥툴로손산 (또한 본원에서 "KDO-N3 로 호칭됨) 과 같은 개질된 단당류 화합물을 기재한다. 표지된 살아 있는 미생물은 단세포 원핵생물 미생물 (박테리아) 에 한정되어 왔다.
WO2016/177712 는 또한 살아 있는 미생물을 특이적으로 표지하기 위한 방법에서 특정 화합물 5-아지도-5-데옥시-D-아라비노푸라노스 (또한 본원에서 "Ara-N3 로 호칭됨) 와 같은 개질된 단당류 화합물을 기재한다. 표지된 살아 있는 미생물은 단세포 원핵생물 미생물 (박테리아) 및 단세포 진핵생물 미생물 (효모, 진균 및 아메바) 에 한정되어 왔다.
그러나, 지금까지, 상기 단당류 화합물이 상기 미생물의 세포막에 의해 어떻게 그리고 어디에서 동화되는지에 대한 설명은 제공될 수 없다.
특히 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 및 검출하기 위한 새로운 후보를 검색 및 개발하고, 암 세포를 식별 또는 단리하기 위한 방법을 제공하고, 특히 암 분야에서 진단 또는 세포 치료 방법을 제공할 지속적인 필요가 존재한다.
본 발명은 식 (I) 의 단당류 화합물 또는 그의 전구체에 기초한다:
Figure pct00001
식에서 X 는 추가의 화합물, 예컨대 표지 또는 항암 약물 또는 항암 약물을 포함하는 입자를, 클릭 화학 반응을 통해, 공유적으로 연결시키는 것을 허용하는 반응성 기이다. 형성된 접합체는 따라서 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출하기 위한 방법, 암 세포를 식별 또는 단리하기 위한 방법, 또는 암을 치료하기 위한 방법에서 실행될 수 있다.
더욱 특히, 본 발명자들은 식 (I) 의 단당류 화합물, 특히 Ara-N3 의 동화가 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포에서 일어난다는 것을 발견했다. 본 발명자들은 또한 종양 진핵생물 세포에서의 그러한 동화가 비-종양 진핵생물 세포와 상이하고, 또한 비-종양 세포에 비해 (특히 방광, 혈액, 피부, 췌장, 뇌, 간, 신장, 폐, 근육, 림프구, 전립선, 위, 유방암의 경우에 비-암 세포에 비해) 더욱 중요하다는 것을 발견했다. 그러므로, 식 (I) 의 단당류 화합물 및 그의 전구체는 또한 암 프로브 및 마커로서 사용될 수 있으며, 이는 암 세포를 식별, 단리 또는 표적화하는데, 및/또는 대상체에서 암을 진단하는데 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 양태는 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출 또는 표적화하기 위한 방법, 바람직하게는 시험관내 (in vitro) 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법이다:
a) 진핵생물 세포를 포함하는 샘플을 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체와 접촉시키는 단계;
b) 단계 (a) 의 샘플을 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물과, 임의로 구리의 존재 하에, 접촉시키는 단계; 및
c) 임의로 단계 (a) 의 단당류에 결합된 단계 (b) 의 화합물을 검출하여, 진핵생물 세포를 검출하는 단계;
상기 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물은 하기 식 (I) 을 갖는다:
Figure pct00002
식에서 X 는 제 2 반응성 기이며, 제 1 및 제 2 반응성 기는 클릭 화학 반응으로 함께 반응하여, 상기 단당류에 결합된 단계 (b) 의 화합물이 수득될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 1 반응성 기는 알카인 기이고, 제 2 반응성 기 X 는 아지도 기 (-N3) 이다.
본 발명의 추가의 양태는 본원에서 정의된 바와 같은 진핵생물 세포를 표지, 검출 또는 표적화하기 위한 방법을 실행하기 위한 키트로서, 하기를 포함하는 키트이다:
- 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체, 및
- 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물.
본 발명의 추가의 양태는 암 세포를 식별 또는 단리하기 위한 또는 대상체에서 암을 진단하기 위한 방법으로서, 상기 대상체로부터, 바람직하게는 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 본원에서 정의된 바와 같은 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지, 검출, 또는 표적화하기 위한 방법을 실행하는 것을 포함하는 방법이다.
본 발명의 추가의 양태는 항암 약물에 또는 적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자에 작동가능하게 연결된 또는 연결되지 않은, 본원에서 정의된 바와 같은, 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체를 그것의 표면 상에 제시하는 진핵생물 세포를 포함하는 조성물이다. 또다른 양태는 그러한 세포를 포함하는 약학적 조성물이다. 또다른 양태는, 특히 세포-기반 요법에 의하는, 암 치료에서 사용하기 위한 그러한 약학적 조성물이다. 또다른 양태는 암 진단에서 사용하기 위한 그러한 약학적 조성물이다.
본 발명의 또다른 양태는 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 항암 약물에 또는 적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자에 작동가능하게 연결된, 본원에서 정의된 바와 같은, 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체를 그것의 표면 상에 제시하는 진핵생물 세포를 포함하는, 본원에서 정의된 바와 같은, 조성물의 효율적인 양을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
본 발명의 추가의 양태는, 임의로 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물로, 의학적 영상화 또는 진단을 위한, 바람직하게는 암 진단을 위한 본원에서 정의된 바와 같은 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체의 용도이다.
도 1: Ara-N3 및 형광단을 iv 주입하거나 주입하지 않은 Panc-1 종양 보유 마우스로 얻은 종양과 골격근의 생체외 (ex vivo) 형광 신호 비 (종양/근육 비).
발명의 상세한 설명
정의
본 발명에 따르면, 아래의 용어는 하기 의미를 갖는다:
"다세포 유기체" 는 하나 초과의 세포를 포함하는 임의의 유기체를 포함한다. 다세포 유기체는, 예를 들어, 식물 또는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이거거나 그것으로부터 유래한다.
본원에서 사용되는, 용어 "환자" 및 "대상체" 는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 인간 및 동물 둘 모두, 더욱 구체적으로 인간을 포함한다.
"다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포" 는, 원핵생물과는 달리, 막 내에 핵을 가지고 있고, 다세포 유기체, 예컨대 동물 또는 식물 세포로부터 유래하는 세포이다. 동물 및 식물 세포는 다세포 유기체로부터의 가장 친숙한 진핵생물 세포이다. 본 발명의 맥락에서, "진핵생물 세포" 는 암 세포 또는 정상 세포 (또는 비-종양 및 종양 세포) 를 포함한다.
암 세포는 끈질기게 분열하여 고형 종양을 형성하거나 비정상적인 세포로 혈액을 범람시키는 세포이다. 암 세포는 따라서 고형 암 또는 조혈 암, 예컨대 림프종 또는 백혈병일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "암" 또는 "종양" 은 조절되지 않은 증식, 불멸성, 전이 잠재성, 신속한 성장 및 증식 속도, 및 일정한 특징적 형태학적 특징과 같은 암 유발 세포의 전형적인 특징을 보유하는 세포의 존재를 의미한다. 이 용어는 임의의 유형의 악성 종양 (일차 또는 전이) 을 지칭한다. 전형적인 암은 고형 또는 조혈 암 예컨대 유방, 뇌, 위, 간, 피부, 전립선, 췌장, 식도, 육종, 난소, 자궁내막, 방광, 자궁경부, 직장, 결장, 신장, 폐 또는 ORL 암, 소아 종양 (신경모세포종, 다형성 교모세포종), 림프종, 암종, 교모세포종, 간모세포종, 백혈병, 골수종, 정상피종, 호지킨 또는 악성 혈액질환이다.
본 발명은 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출 또는 표적화하기 위한 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) 진핵생물 세포를 포함하는 샘플을 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체와 접촉시키는 단계;
b) 단계 (a) 의 샘플을 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물과, 임의로 구리의 존재 하에, 접촉시키는 단계; 및
c) 임의로 단계 (a) 의 단당류에 결합된 단계 (b) 의 화합물을 검출하는 단계;
상기 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물은 하기 식 (I) 을 갖는다:
Figure pct00003
식에서 X 는 제 2 반응성 기이며, 제 1 및 제 2 반응성 기는 클릭 화학 반응으로 함께 반응할 수 있다. 제 1 및 제 2 반응성 기 사이의 반응은 단계 (b) 의 화합물이 식 (I) 의 단당류에 결합하는 것을 허용한다.
클릭 화학은 프로브 또는 관심의 기질을 특정 생체분자, 예컨대 본 발명에 따른 개질된 단당류 화합물에 부착하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법이다. 아지드 알카인 고리화첨가는 구리 촉매의 존재 또는 부재 하에서의 잘 알려진 소위 클릭 화학 반응이며, 여기에서 아지드 기는 알카인 기와 반응하여 트리아졸을 제공한다. 알카인 기는 스트레인드 (strained) 또는 그렇지 않을 수 있다.
그러한 아지드 알카인 고리화첨가는 구리 촉매작용되는 조건에서 리간드, 바람직하게는 트리스-트리아졸 리간드 예컨대 TGTA (트리스((1-(-D-글루코피라노실)-1 [1,2,3]-트리아졸-4-일)메틸)아민) 또는 TBTA (트리스-[(1-벤질-1 1,2,3-트리아졸-4-일) 메틸]아민) 의 존재 하에 수행될 수 있다. 빈번히 사용되는 다른 적당한 리간드는 다음과 같다: 트리스(3-히드록시프로필 트리아졸릴메틸)아민 (THPTA), 2-(4-((비스((1-tert-부틸-1 1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)아미노)메틸)-lH-1,2,3-트리아졸-1-일)에탄술폰산 (BTTES), 트리스((1-(((에틸)카르복시메틸)-(1,2,3-트리아졸-4-일))메틸)아민, 바토페난트롤린 디술포네이트, 또는 트리스(2-벤즈이미다졸릴메틸)아민.
대안적으로, 스트레인드 알카인, 예컨대 아자디벤조시클로옥타인 (ADIBO, DIBAC 또는 DBCO) 또는 테트라메톡시디벤조시클로옥타인 (TMDIBO) 이 사용되는 경우에 아지드 알카인 고리화첨가는 구리의 부재 하에 수행될 수 있다. 무구리 반응에 빈번히 사용되는 다른 적당한 스트레인드 알카인은 다음을 포함한다: 시클로옥타인 (OCT), 아릴-레스 (less) 시클로옥타인 (ALO), 모노플루오로시클로옥타인 (MOFO), 디플루오로시클로옥타인 (DIFO), 디벤조시클로옥타인 (DIBO), 디메톡시아자시클로옥타인 (DIMAC), 바이아릴아자시클로옥티논 (BARAC), 바이시클로노닌 (BCN), 테트라메틸티에피니움 (TMTI, TMTH), 디플루오로벤조시클로옥타인 (DIFBO), 옥사-디벤조시클로옥타인 (ODIBO), 카르복시메틸모노벤조시클로옥타인 (COMBO), 또는 벤조시클로노닌.
다른 반응성 기 및 다른 반응이 클릭 화학에서 가능하며, 예컨대 다음과 같다: 스타우딩어 (Staudinger) 결찰 (제 1 반응성 기 = 아지드 및 제 2 반응성 기 = 포스핀), 무구리 클릭-화학 (제 1 반응성 기 = 아지드 및 제 2 반응성 기 = 제약된 (constrained) 알카인 (인트라시클릭 알카인)), 카르보닐 축합 (제 1 반응성 기 = 알데히드 또는 케톤 및 제 2 반응성 기 = 히드라지드 또는 옥시아민), 티올-엔 클릭 화학 (제 1 반응성 기 = 티올 및 제 2 반응성 기 = 알켄), 니트릴-옥시드-엔 클릭 화학 (제 1 반응성 기 = 니트릴 옥시드 또는 알데히드, 옥심, 또는 히드록시모일 클로라이드 또는 클로로록심 및 제 2 반응성 기 = 알켄 또는 알카인), 니트릴 이민-엔 클릭 화학 (제 1 반응성 기 = 니트릴 이민 또는 알데히드, 히드라존, 또는 히드라조노일 클로라이드 또는 클로로히드라존 및 제 2 반응성 기 = 알켄 또는 알카인), 역전자 요구 디엘스 앨더 (Diels-Alder) 결찰 (제 1 반응성 기 = 알켄 및 제 2 반응성 기= 테트라진), 이소니트릴-테트라진 클릭 화학 (제 1 반응성 기 = 이소니트릴 및 제 2 반응성 기 = 테트라진), 스즈키-미야우라 (Suzuki-Miyaura) 커플링 (제 1 반응성 기 = 아릴 할라이드 및 제 2 반응성 기 = 아릴 보로네이트), His-태그 (제 1 반응성 기 = 올리고-히스티딘 및 제 2 반응성 기 = 니켈-착물 또는 니켈 리간드).
단당류 화합물 및 그의 전구체
본 발명에 따르면, 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물은 클릭 화학 반응으로, 바람직하게는 아지드 알카인 고리화첨가로 반응하기에 적합한 반응성 기 X (제 2 반응성 기) 를 포함한다. 따라서, X 는 클릭 화학 반응에 의해 추가의 반응성 기와 반응할 수 있는 임의의 반응성 기 예컨대 위에서 정의된 바와 같은 반응성 기를 포함한다. 특정 구현예에서 X 는 아지도 기 (-N3) 로 이루어지거나 이를 보유하는 임의의 기 및 스트레인드 또는 그렇지 않은 알카인 기 (-C≡C-) 로 이루어지거나 이를 보유하는 기를 포함한다. 바람직한 구현예에서, X 는 아지도 기 (-N3) 이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물은 그의 부분입체이성질체를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물은 하기 식으로 이루어지는 군에서 선택된다:
Figure pct00004
바람직한 구현예에서, 상기 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물은 5-아지도-5-데옥시-D-아라비노푸라노스 (Ara-N3), 특히 하기 식을 갖는 것이다:
Figure pct00005
.
본 발명의 추가의 특정 구현예에서, 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물은 상기 개질된 단당류 화합물의 전구체이다. 더욱 특히, 상기 전구체는 식 (I') 를 갖는 것이다:
Figure pct00006
식에서 X 는 위에서 정의된 바와 같은 제 2 반응성 기, 바람직하게는 아지도 기 (-N3) 이며, 제 1 및 제 2 반응성 기는 클릭 화학 반응으로 함께 반응할 수 있다.
추가의 특정 구현예에서, 상기 식 (I') 의 전구체는 그의 부분입체이성질체를 포함한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 식 (I') 의 전구체는 하기 식으로 이루어지는 군에서 선택된다:
Figure pct00007
바람직한 구현예에서, 상기 식 (I') 의 전구체는 하기 식을 갖는 5-아지도-5-데옥시-2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스이다:
Figure pct00008
.
식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는 그것의 전구체는 세포에 대한 독성을 제시하지 않으므로 본 발명에 따라 임의의 농도에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 식 (I) 의 단당류 화합물 또는 그것의 전구체의 농도는 10μM 내지 100mM, 바람직하게는 1mM 내지 50mM, 더욱 바람직하게는 1mM 내지 20mM 로 다양할 수 있다.
제 1 반응성 기를 보유하는 화합물
제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 직접 검출가능한 모이어티이거나 이를 포함하거나 또는 간접 검출가능한 모이어티이거나 이를 포함한다. 어떠한 이론에도 구속되지 않고, 세포는 단계 (a) 에서 세포 막에 의해 동화되지 않은 단계 (a) 의 단당류의 제 2 반응성 기와의 클릭 반응으로 인해 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물에 커플링된다. 검출가능한 모이어티 (또는 표지), 즉 당업자에게 알려진 기술, 예컨대 형광, 비색법 또는 발광에 의해 검출될 수 있는 모이어티이다. 영상화 기술은 따라서 형광, 자기 공명 또는 컴퓨터 단층촬영이다.
하나의 구현예에 따르면, 상기 화합물은 검출가능한 모이어티, 즉 검출가능한 물질 (또는 표지), 즉 당업자에게 알려진 기술, 예컨대 형광, 비색법 또는 발광에 의해 검출될 수 있는 물질로 이루어지거나 이를 보유하는 모이어티일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
또다른 구현예에 따르면, 상기 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 제 1 리간드 (또는 더욱 구체적으로 상기 제 1 반응성 기를 보유하는 제 1 결합 단백질) 인 간접 검출가능한 모이어티이거나 이를 포함하고, 아래 설명되는 바와 같은, 단계 (c) 의 검출 및/또는 부동화는 상기 제 1 리간드 (또는 더욱 구체적으로 제 1 결합 단백질) 에 커플링된 상기 진핵생물 세포를 상기 제 1 리간드 (또는 더욱 구체적으로 제 1 결합 단백질) 와 특이적으로 반응 또는 결합하는 제 2 리간드 (또는 제 2 결합 단백질) 와 접촉시킴으로써 일어날 수 있다.
더욱 특히, 상기 화합물은 상기 제 1 반응성 기를 보유하는 제 1 리간드, 바람직하게는 비오틴이고, 단계 c) 에서 상기 제 1 리간드에 커플링된 상기 진핵생물 세포는 상기 진핵생물 세포와 상기 제 1 리간드에 특이적인 항체 또는 또다른 단백질의 반응에 의해 검출되며, 상기 항체는 검출가능한 물질 또는 모이어티, 바람직하게는 형광색소 또는 발광 분자 또는 효소를 보유한다.
검출가능한 물질 또는 모이어티는 염료, 방사성 표지 및 친화성 태그 중에서 선택될 수 있다. 특히, 염료는 형광, 발광 또는 인광 염료, 바람직하게는 단실, 플루오레세인, 아크리딘, 로다민, 쿠마린, BODIPY 및 시아닌 염료로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, 형광 염료는 Thermo Fisher 에 의해 시판되는 염료 예컨대 Alexa Fluor 염료, Pacific 염료 또는 Texas Red 또는 다른 제공자에 의해 시판되는 염료 예컨대 시아닌 3, 5 및 7 중에서 선택될 수 있다. 특히, CuAAC 를 위한 아지드를 보유하는 염료는 Alexa Fluor® 488, 55, 594 및 647 로 및 TAMRA (테트라메틸로다민) 로 상업적으로 입수가능하다. 제 2 양태에서, 검출가능한 물질 또는 모이어티 (또는 표지) 는 친화성 태그일 수 있다. 그러한 친화성 태그는 예를 들어 비오틴, His-태그, Flag-태그, strep-태그, 당, 지질, 스테롤, PEG-링커, 및 보조인자로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 검출가능한 물질은 비오티닐화된 표지이다. 아지드에 연결된 비오틴이 상업적으로 입수가능하다 (비오틴 아지드). 바람직한 구현예에서, 표지는 형광 표지이다.
본 발명에 따르면, 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 클릭 화학 반응, 바람직하게는 아지드 알카인 고리화첨가로 함께 반응하기 위한 위에서 정의된 바와 같은 제 2 반응성 기 X 와 상보적인 제 1 반응성 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 화합물의 제 1 반응성 기는 아지도 기 (-N3) 로 이루어지거나 이를 보유하는 임의의 기 및 스트레인드 또는 그렇지 않은 알카인 기 (-C≡C-) 로 이루어지거나 이를 보유하는 기를 포함한다.
위에서 언급된 반응에 관여하는 기의 목록에서, 제 1 반응성 기 및 제 2 반응성 기 X 는 교환될 수 있다. 모든 위에서 언급된 화학 반응은 공유 연결을 초래한다. 예를 들어, X 가 아지도 기 (-N3) 또는 아지도 기를 보유하는 기일 때, 그 때 제 1 반응성 기는 알카인 또는 알카인 기를 보유하는 기이다. X 가 알카인 또는 알카인 기를 보유하는 기일 때, 그 때 제 1 반응성 기는 아지도 기 (-N3) 또는 아지도 기를 보유하는 기이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 제 2 반응성 기 X 는 아지도 기 (-N3) 이고, 제 1 반응성 기는 알카인 기 (-C≡C-) 이다.
표지, 검출 또는 표적화 방법
다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지, 검출 또는 표적화하기 위한 방법에 따른 단계 a) 는 진핵생물 세포를 포함하는 샘플을 반응성 또는 관능성 기 X 를 포함하는 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체와 접촉시키는 것을 포함한다. 그러한 접촉 단계 a) 는 상기 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포의 막 내에, 더욱 구체적으로 상기 세포의 표면 상에 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체의 통합을 허용한다. 그러한 과정은 상기 진핵생물 세포에 의한 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물의 동화에 해당할 수 있다. 따라서, 상기 세포는 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물을 그것의 표면 또는 막 상에서 제시한다.
단계 b) 는 단계 (a) (여기에서 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체가 진핵생물 세포의 막 내에 통합된다) 의 샘플을 위에서 정의된 바와 같은 제 1 반응성 기를 포함하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 그러한 단계 b) 는 상기 화합물의 제 1 반응성 기 및 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그것의 전구체의 제 2 반응성 기 X 사이에 클릭 화학 반응을 생성하는 것을 허용하여, 표지 또는 표적화되거나 또는 그 후 표지 또는 표적화될 수 있는 (아래 상세히 설명된 바와 같음) 다세포 유기체로부터의 커플링된 진핵생물 세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예는 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지, 검출 또는 표적화하기 위한 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법이다:
a) 진핵생물 세포를 포함하는 샘플을 Ara-N3 과 접촉시키는 단계; 및
b)상기 샘플을 제 1 반응성 기를 포함하는 화합물과, 임의로 구리의 존재 하에 접촉시키는 단계.
당업자는 어떻게 단계 (a) 또는 (b) 를 실행하는지를 안다. 특정 구현예에 따르면, 상기 단계 (a) 및/또는 (b) 는, 바람직하게는 상기 진핵생물 세포의 성장에 특이적인, 진핵생물 세포를 포함하는 샘플의 성장을 허용하는 배양물 또는 인큐베이션 배지에서 수행된다.
더욱 구체적으로, 단계 (a) 또는 (b) 의 배양 조건 (시간 및 세포 배양 배지를 포함) 은 표지, 검출 또는 표적화될 진핵생물 세포에 맞춰 적합화된다. 세포 배양 배지는 세포의 배가 (doubling) 및/또는 세포의 표면 또는 막 상에 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물의 동화를 향상 또는 자극하는 임의의 화합물로 보충될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 단계 (a) 의 지속시간은 상기 진핵생물 세포의 막 내에 적어도 하나의 식 (I) 의 단당류 화합물 또는 그의 전구체의 통합을 허용한다. 더욱 구체적으로, 단계 (a) 의 지속시간은 적어도 표지, 검출 또는 표적화될 진핵생물 세포의 배가 시간이다. 더욱 특히, 단계 (a) 의 지속시간은 표지, 검출 또는 표적화될 진핵생물 세포의 배가 시간의 5 배 미만이다. 특정 구현예에 따르면, 단계 (a) 의 지속시간은 표지, 검출 또는 표적화될 진핵생물 세포의 1 배가 시간 또는 2 배가 시간에 해당한다.
특정 구현예에 따르면, 상기 단계 (a) 및/또는 (b) 는 반응물 및/또는 상기 제 1 반응성 기와 상기 제 2 반응성 기의 반응을 생성하기 위한 촉매로 수행된다.
실시예에 의해 예시되는 바와 같이 식 (I) 의 단당류 화합물 또는 그의 전구체가 세포에 대해 제시하는 독성이 낮거나 또는 없어서, 그것의 사용량이 넓은 범위에서 다를 수 있다는 점이 흥미롭다. 그러한 양은 진핵생물 세포를 표지, 식별 또는 검출하기에 충분한 양으로 당업자에 의해 결정될 것이다.
방법은 임의의 샘플, 전형적으로는 대상체의 생물학적 샘플, 예를 들어 유체, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액의 샘플 또는 대상체의 조직 또는 그의 일부로부터의 샘플로 실행될 수 있다. 본 발명은 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 임의의 인간 환자를 포함하는 임의의 대상체로부터의 샘플로 실행될 수 있다. 방법은 전형적으로는 혈액, 혈청 또는 혈장의 샘플, 또는 그로부터 유래된 샘플, 예컨대 전처리된 혈액 샘플에 대해 수행된다. 샘플은 본 발명에서 사용되기 전에 처리될 수 있다 (예를 들어, 희석, 농축, 분리, 부분 정제, 동결 등). 특정 구현예에 따르면, 방법의 단계 (a) 에서 사용되는 각각의 샘플은, 바람직하게는 세포 분류에 의해, 특히 유세포분석법에 의해 수득되는, 세포 집단 또는 바람직하게는 개별 세포를 포함한다. 방법이 생체내에서 (in vivo) 실행될 때, 방법은 대상체의 전신 또는 그의 일부에 대해 실행될 수 있다. 그 상황에서, 식 (I) 의 단당류 화합물 또는 그의 전구체 및 임의로 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 장내 (경구를 포함) 또는 비경구 (정맥내 또는 근육내를 포함) 투여될 수 있다.
검출 다세포 유기체로부터의 커플링된 진핵생물 세포를 검출하기 위해서, 방법은 단계 (a) 의 단당류에 결합된 단계 (b) 의 화합물을 검출하는 것을 포함하는 단계 c) 를 추가로 포함한다.
유리하게는, 본 발명은 상기 진핵생물 세포가 단계 (b) 의 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물과 커플링되어 있는지 여부를 검출하는 것 및/또는 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물과 커플링된 상기 진핵생물 세포를 고형 기재 상에 부동화시키는 것으로 이루어지는 진핵생물 세포를 검출하는 추가의 단계 (c) 를 포함하며, 상기 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 검출가능한 물질을 포함하거나 검출가능한 물질과 반응하거나 검출가능한 물질에 결합될 수 있는 모이어티 또는 분자이거나 또는 바람직하게는 상기 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 제 2 분자 및/또는 고형 기재와 반응하거나 제 2 분자 및/또는 고형 기재에 결합될 수 있는 제 1 분자이거나, 바람직하게는 상기 제 2 분자는 검출가능한 물질을 포함하고/하거나 상기 제 2 분자는 상기 고형 기재에 결합되어 있거나 결합될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 특히 상기 제 1 반응성 기를 보유하는 자기 비드로 구성되는 고형 지지체로, 임의로 고형 지지체 상에 부동화된, 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포의 표지 뿐만 아니라 진핵생물 세포의 넘버링 또는 검출 뿐만 아니라, 진핵생물 세포의 농축 및/또는 단리를 가능하게 한다.
더욱 특히, 상기 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 제 2 분자 및/또는 고형 기재와 반응 또는 결합할 수 있는 제 1 분자이며, 바람직하게는 상기 제 2 분자는 검출가능한 물질을 포함하며, 방법은 상기 진핵생물 세포가 상기 진핵생물 세포에 결합된 상기 검출가능한 분자 또는 모이어티를 포함하는지 여부를 검출하는 것으로 이루어지는 진핵생물 세포를 검출하는 단계 c) 를 포함한다.
본 발명의 방법에 따르면, 표지 또는 검출의 부재시에, 실행된 샘플이 다세포 유기체로부터의 임의의 진핵생물 세포를 포함하지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.
상기 검출 단계 c) 는 액체 배지에서 또는 고형 기재 상에서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출 또는 표적화하기 위한 방법은 시험관내 방법이다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 하나 이상의 세정 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 샘플로 동시에, 예를 들어 마이크로-웰 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 마이크로플레이트는 전형적으로는 6, 12, 24, 48, 96, 384 또는 1536 개 샘플 웰을 갖는다. 상기 특정 구현예에 따르면, 방법의 단계 (a) 에서 사용되는 각각의 샘플 웰은 바람직하게는, 더욱 바람직하게는 세포 분류에 의해, 특히 유세포분석법에 의해 수득되는 세포 집단 또는 바람직하게는 개별 세포를 포함한다.
본 발명의 추가의 과제는 따라서, 바람직하게는 제 1 반응성 기를 포함하는 화합물로, 및 임의로 제 2 분자 및/또는 고형 기재, 바람직하게는 검출가능한 물질을 포함하는 제 2 분자로, 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출하기 위한, 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체의 시험관내 용도이다.
본 발명의 추가의 과제는 본원에서 정의된 바와 같은 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출하기 위한 방법을 실행하기 위한 키트로서, 하기를 포함하는 키트이다:
- 위에서 정의된 바와 같은, 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체, 및
- 위에서 정의된 바와 같은, 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물.
특정 구현예에 따르면, 키트는, 위에서 정의된 바와 같은, 제 2 분자 및/또는 고형 기재를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 제 2 분자 또는 고형 기재는 검출가능한 물질을 포함하며, 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물은 제 2 분자 및/또는 고형 기재와 반응 또는 결합할 수 있는 제 1 분자이다.
추가의 과제는 본원에서 정의된 바와 같은 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출하기 위한 방법을 실행하기 위한 위에서 정의된 바와 같은 키트의 용도이다.
특정 구현예에 따르면, 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포는 암 또는 종양 세포에 감수성 (susceptible) 인 세포이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법 및 키트는 표지의 검출에 의해 암 또는 종양 세포를 식별하는데 유용하다.
암 세포를 식별 또는 단리 또는 암을 진단하기 위한 방법
본 발명은 추가로 본원에서 정의된 바와 같은 상기 대상체 또는 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출하기 위한 방법을 실행하는 것을 포함하는 암 세포를 식별 또는 단리 또는 대상체에서 암을 진단하기 위한 방법, 바람직하게는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 암 세포를 식별 또는 단리 또는 대상체에서 암을 진단하기 위한 방법은 표지를 검출하는 단계 및 임의로 표지를 기준 레벨과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
대상체로부터의 생물학적 샘플은 위에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 샘플은 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 인간 환자로부터의 샘플이다. 특정 구현예에 따르면, 단계 (a) 에서 사용되는 각각의 샘플은, 바람직하게는 세포 분류에 의해, 특히 유세포분석법에 의해 수득되는, 세포 집단 또는 바람직하게는 개별 세포를 포함한다.
샘플은 더욱 구체적으로 암 세포를 포함하는 것으로 의심된다.
그러한 샘플의 예는 유체 예컨대 혈액, 혈장, 타액, 소변 및 정액 샘플, 뿐만 아니라 생검, 기관, 조직 또는 세포 샘플을 포함한다. 샘플은 그것의 사용 전에 처리될 수 있다.
본 발명에 따라 식별 또는 단리되는 암 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 그들은 고형 종양 또는 조혈 암으로부터 유래할 수 있다. 암 세포는 순환 또는 비-순환 종양 세포를 포함한다. 순환 종양 세포 (CTC) 는 일차 종양으로부터 혈관구조 또는 림프계에 분비된 세포이고, 혈액 순환에서 신체 여기저기에 운반된다. CTC 는 대부분의 암 관련 사망의 원인이 되는 메카니즘인, 원거리 기관에서 추가적인 종양 (전이) 의 후속 성장을 위한 시드를 구성한다.
본 발명에 따른 암 세포의 검출 및 분석은 조기 환자 예후를 보조하고 적당한 맞춤 치료를 결정할 수 있다. 시간의 경과에 따른 질환 진행을 모니터링하는 능력은 환자의 요법에 대한 적절한 수정을 용이하게 할 수 있고, 잠재적으로 환자의 예후 및 삶의 질을 개선시킨다. 순환 종양 세포의 검출 및 분석의 경우에, 상기 방법은 암 및 특히 전이의 조기 검출을 가능하게 할 수 있다. 그러한 관점에서, 본 발명에 따른 샘플은 혈액 유체이다. 혈액 검사는 수행하기 용이하고 안전하며 여러 샘플을 시간의 흐름에 따라 채취할 수 있다. 질환의 미래의 진행을 예측하는 능력의 중요한 측면은 반복된 CTC 카운트수가 낮고 증가하지 않을 때 수술에 대한 필요성의 제거 (적어도 일시적으로) 이다; 수술을 피하는 것의 명백한 이점은 암 수술의 선천적인 종양-발생성과 관련된 위험을 피하는 것을 포함한다. 이를 위해, 전이성 질환을 갖는 환자에서 CTC를 검출하기 위해 필요한 민감도 및 재현성을 갖는 본 발명으로서의 기술들이 큰 관심의 대상이다.
본원에서 사용되는 표현 "표지를 검출하는 것" 은 다세포 유기체로부터의 표지된 진핵생물 세포의 존재를 시각화 또는 검출하는 것 또는 또한 그러한 표지를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 표지, 예컨대 형광의 측정은, 임의로 표지를 기준 레벨과 비교함으로써, 암 세포를 검출, 식별 또는 단리하는 것을 허용한다.
암 세포 내에 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체의 동화는 비-암 세포와 상이하고, 더욱 특히 비-암 세포 (예를 들어 기준 레벨 또는 컨트롤 샘플) 에 비해 더 높다는 것이 본원에서 밝혀졌다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 형광 강도는 비-암 세포에 비해 암 세포에서 더 높다 (예를 들어, 1 또는 2 세포 배가 시간 후에).
그러므로, 본 발명은 암 세포를 식별 또는 단리하기 위한 또는 대상체에서 암을 진단하기 위한 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
- 본원에서 기재된 바와 같은 상기 대상체로부터의 샘플의 진핵생물 세포를 표지하는 방법을 실행하는 단계;
- 상기 표지 방법을 실행한 후에, 표지를 검출하고, 임의로 표지를 기준 레벨과 비교하는 단계; 및 그 후
- 표지의 측정에 기반하여 암 세포를 식별 또는 암을 진단하는 단계.
암 세포를 식별 또는 단리 또는 암을 진단하기 위한 방법은 유리하게는 1 세포 주기 시간 내에 수행될 수 있다. 표지의 검출은 바람직하게는 상기 표지 방법을 실행한 후에, 및 더욱 구체적으로 위에서 설명된 바와 같은 단계 (a) 를 실행한 후에 10 시간 내지 40 시간, 더욱 바람직하게는 16 내지 24, 25, 또는 내지 36 시간 후에 수행된다.
방법은 임의로 기준 레벨, 더욱 구체적으로 컨트롤 샘플 또는 기준과의 비교를 포함할 수 있다. 기준 레벨은 정상 세포 (예를 들어 비-암 세포) 및/또는 알려진 암 세포에서 측정되는 표지 (예컨대 형광) 의 강도일 수 있다. 바람직하게는, 기준 세포는 연구될 세포와 가장 가까운 것, 바람직하게는 동일한 세포주, 동일한 기관 및/또는 동일한 유형의 세포이다. 방법은 종양 샘플 및 대상체로부터의 조직학적으로 매치되는 정상 조직을 제공하는 사전 단계를 포함할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 샘플의 표지의 측정값이 비-암 샘플인 컨트롤 샘플의 표지의 측정값보다 더 높을 때 암 세포가 식별되거나 또는 암이 진단된다. "더 높은 측정값" 은, 비-암 샘플에 대한 샘플의 표지 비가 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 또는 3.0 초과임을 의미한다. 더욱 구체적으로, 비-암 샘플에 대한 샘플의 표지 비는 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 또는 3.0 초과이다.
특정 구현예에 따르면, 진단될 암은 직장암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 자궁경부암, 자궁암, 유방암, 난소암, 뇌암, 폐암, 피부암, 방광암, 혈액암, 신장암, 간암, 전립선암, 다발성 골수종, 및 자궁내막암 중에서 선택된다. 더욱 구체적으로, 진단될 암은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 방광, 혈액, 피부, 췌장, 뇌, 간, 신장, 폐, 근육, 림프구, 전립선, 위, 및 유방암. 더욱 특정한 구현예에 따르면, 진단될 암은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 방광, 혈액, 결장, 위, 유방, 폐, 피부, 및 췌장 암.
특정 구현예에 따르면, 식별 또는 단리될 암 세포는 위에 열거된 암에서 유래하는 암 세포이다.
약학적 조성물 및 그의 용도
본 발명은 항암 약물에 또는 적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자에 작동가능하게 연결된 또는 연결되지 않은, 위에서 정의된 바와 같은, 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체를 그것의 표면 상에 제시하는 진핵생물 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
하나의 특정 양태에서, 항암 약물에 또는 적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자에 작동가능하게 연결된 또는 연결되지 않은 위에서 정의된 바와 같은 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체를 그것의 표면 상에 제시하는 세포는 위에서 기재된 바와 같이 본 발명의 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
a) 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 포함하는 조성물을 위에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체와 접촉시키는 단계;
b) 단계 (a) 의 조성물을 제 1 반응성 기를 보유하고 임의로 작동가능하게 연결된 항암 약물 또는 적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자를 포함하는 화합물과, 임의로 구리의 존재 하에, 접촉시키는 단계.
상기 단계는 위에 설명된 것과 유사하다. 단계 a) 는 상기 세포가 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체를 그것의 표면 또는 막 상에 제시하는 것을 허용한다. 단계 b) 는 화합물의 제 1 반응성 기 및 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그것의 전구체의 제 2 반응성 기 X 사이에 클릭 화학 반응을 생성하는 것을 허용한다.
하나의 구현예에 따르면, 제 1 반응성 기를 갖는 화합물은 또한 작동가능하게 연결된 항암 약물 또는 상기 화합물에 부착된 적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자이거나 이를 포함할 수 있으며, 단계 (b) 는 항암 약물 또는 항암 약물을 포함하는 입자와 커플링된 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 제공하는 것을 허용한다.
방법은 따라서, 위에 설명된 바와 같은 클릭 화학 반응에 의해, 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 식 (I') 의 전구체가 항암 약물 또는 항암 약물을 포함하는 입자와 작동가능하게 연결되어 있는 접합체를 제조하는 것을 허용하고, 진핵생물 세포는 그것의 표면 상에 상기 접합체를 제시한다. 특정 구현예에서, 접합체는 알카인 기를 포함하는 항암 약물 또는 그것의 표면 상에 알카인 기를 제시하는 입자 및 아지도 기를 포함하는 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 식 (I') 의 전구체 사이의 클릭 화학 반응에 의해 제조된다.
또다른 구현예에 따르면, 제 1 반응성 기를 갖는 화합물은 항암제인 제 2 리간드 (또는 더욱 구체적으로 제 2 결합 단백질) 와 반응 또는 결합할 수 있는 제 1 리간드 (또는 더욱 구체적으로 제 1 결합 단백질) 이다. 그러한 구현예에 따르면, 방법은, 위에 설명된 바와 같은 클릭 화학 반응에 의해, 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 식 (I') 의 전구체가 항암제인 제 2 리간드와 반응 또는 결합할 수 있는 제 1 리간드에 연결되어 있는 접합체를 제조하는 것을 허용하고, 진핵생물 세포는 그것의 표면 상에 상기 접합체를 제시한다. 특정 구현예에서, 접합체는 위에서 설명된 바와 같은 클릭 화학 반응에 의해 제조된다.
본원에서 사용되는 "항암 약물" 은 암 요법에서 현재 사용되는 임의의 약물, 예컨대 항종양 약물에 해당한다. 바람직한 구현예에서, 항암 약물은 화학요법제, 항암 항체, 호르몬 요법제, 면역요법제, 및 키나제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
용어 "작동가능하게 연결된 항암 약물" 은, 바람직하게는 공유적으로, 연결되어 있는 그것의 치료 효과를 제시할 수 있는 항암 약물을 언급한다.
적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자는 위에서 정의된 바와 같은 제 1 반응성 기를 갖는 항암 약물-함유 입자, 바람직하게는 나노입자이다. 입자는, 예를 들어, 바이시클로[6.1.0]노닌-개질된 글리콜 키토산 나노입자 (BCN-CNP) 일 수 있다. CNP 는 상용성이 높은 불안정한 약물을 캡슐화할 수 있는 것으로 알려져 있으며 약물 전달에 널리 사용되고 있다.
화학요법은 토포이소머라제 I 또는 II 의 저해제, DNA 가교제, DNA 알킬화제, 항대사제 및/또는 유사분열 스핀들의 저해제를 포함할 수 있다.
토포아이소머라제 I 및/또는 II 의 저해제로는 에토포시드, 토포테칸, 캄프토테신, 이리노테칸, 암사크린, 인토플리신, 안트라사이클린 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이단루비신 및 미톡산트론이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 토포이소머라제 I 및 II 의 저해제는 인토플렉신을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 가교제는 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
항대사제는 핵산 합성을 책임지는 효소를 차단하거나 DNA 내에 통합되어, 잘못된 유전 부호를 생성하고 세포자멸사를 유도한다. 이의 비제한적 예는 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 저해제, 및 더욱 특히 메토트렉세이트, 플록수리딘, 시타라빈, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 5-플루오로우라실, 겜시타빈 및 카페시타빈을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
알킬화제는 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 금속염 및 트리아젠을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이의 비제한적인 예로는 우라실 머스타드, 클로르메틴, 시클로포스파미드 (CYTOXAN(R)), 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 포테무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 티오테파, 스트렙토조신, 다카르바진 및 테모졸로미드를 포함한다.
유사분열 스핀들의 저해제는 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 라로타셀 (또한 XRP9881 로 호칭됨; Sanofi-Aventis), XRP6258 (Sanofi-Aventis), BMS-184476 (Bristo1-Meyer-Squibb), BMS-188797 (Bristo1-Meyer-Squibb), BMS-275183 (Bristo1-Meyer-Squibb), 오르타탁셀 (또한 IDN 5109, BAY 59-8862 또는 SB-T-101131 로 호칭됨; Bristo1-Meyer-Squibb), RPR 109881A (Bristo1-Meyer-Squibb), RPR 116258 (Bristo1-Meyer-Squibb), NBT-287 (TAPESTRY), PG-파클리탁셀 (또한 CT-2103, PPX, 파클리탁셀 폴리글루멕스, 파클리탁셀 폴리글루타메이트 또는 Xyotax™ 로 호칭됨), ABRAXANE® (또한 Nab-파클리탁셀로 호칭됨; ABRAXIS BIOSCIENCE), 테세탁셀 (또한 DJ-927 로 호칭됨), IDN 5390 (INDENA), 탁소프렉신 (또한 도코사헥산산-파클리탁셀로 호칭됨; PROTARGA), DHA-파클리탁셀 (또한 탁소프렉신® 로 호칭됨), 및 MAC-321 (WYETH) 을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 Hennenfent & Govindan 의 리뷰 (2006, Annals of Oncology, 17, 735-749) 를 참조한다.
면역 체크포인트 저해제는 항-CTLA-4 (세포독성 T 림프구 연관 단백질 4) 요법 예컨대 이필리무맙, PD-1 (프로그램된 세포사 단백질 1) 저해제 예컨대 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 BGB-A317, PDL1 (프로그램된 세포사 리간드) 저해제 예컨대 아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 두르발루맙, LAG-3 (림프구-활성화 유전자 3) 저해제 예컨대 BMS-986016, TIM-3 (T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3) 저해제, TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체) 저해제, BLTA (B- 및 T-림프구 감쇠자) 저해제, IDO1 저해제 예컨대 에파카도스타트, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
호르몬요법은 예를 들어 타목시펜, 파레스톤, 아리미덱스, 아로마신, 페마라, 졸라덱스/루프론, 메가스, 및 할로테스틴을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물의 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포는 바람직하게는 단리된 비-암 세포이다. 세포는 바람직하게는 단리된 다분화능 줄기세포이다. 세포는 바람직하게는 중간엽 줄기 세포 (MSC) 이다. MSC 는 전신, 바람직하게는 지방 조직, 골수, 기관을 지지하는 조직, 및 또한 골, 연골 및 근육 등에서 발견될 수 있다. 본 발명에 따른 진핵생물 세포는 T-세포일 수 있다.
세포는 동종이형 세포 또는 바람직하게는 자가 세포 (즉, 대상체 또는 환자 본인으로부터의 세포) 이다.
특정 구현예에 따르면, 조성물은 위에서 정의된 바와 같은 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체를 그것의 표면 상에 제시하는 MSC 를 포함한다. 그러한 조성물은 예를 들어 위에서 설명된 바와 같이 직접 또는 간접적으로 제 1 반응성 기를 포함하는 화합물에 의해 검출될 단당류의 특성을 사용함으로써 암 세포 또는 종양을 식별 또는 암을 진단하는데 유용할 수 있다. 그러한 조성물은 또한 조혈 이식물을 모니터링하는 치료법에서 유용할 수 있다.
또다른 특정 구현예에 따르면, 조성물은 항암 약물에 또는 적어도 하나의 항암 약물을 포함하는 입자에 작동가능하게 연결된 및 상기 화합물에 부착된 위에서 정의된 바와 같은 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체를 그것의 표면 상에 제시하는 MSC 를 포함한다. 그러한 조성물은 또한 요법에서, 특히 암 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이다.
본원에서 고려되는 약학적 조성물은 위에서 설명된 바와 같은 항암 약물을 제시하는 세포에 더하여 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 세포의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않고 투여되는 숙주에게 독성이 아닌 임의의 담체 (예를 들어, 지지체, 물질, 용매 등) 를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 비경구 투여의 경우에, 활성 화합물(들)은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민 및 링거액과 같은 비히클에 주입하기 위한 단위 투여 형태로 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 약학적으로 상용성인 용매 중의 용액으로서 또는 적합한 약학적 용매 또는 비히클 중의 에멀젼, 현탁액 또는 분산액으로서, 또는 당업계에 공지된 방식으로 고체 비히클을 함유하는 환제, 정제 또는 캡슐로서 제형화될 수 있다. 경구 투여에 적합한 제제는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 활성 성분의 멸균 유성 또는 수성 제제를 편리하게 포함한다.
담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 그것의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능" 해야 한다. 약학적 조성물은 유리하게는 적합한 멸균 용액의 주사 또는 정맥내 주입에 의해 적용된다. 대부분의 이러한 화학요법제의 안전하고 효과적인 투여 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 이들의 투여는 표준 문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암 요법에서, 및 더욱 구체적으로 암 세포 요법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 위에서 정의된 바와 같은 암 치료에서 사용하기 위한 본원에서 정의된 바와 같은 약학적 조성물이다.
추가의 바람직한 구현예는 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원에서 정의된 바와 같은 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
추가의 바람직한 구현예는 암 치료용 약제의 제조를 위한 본원에서 정의된 바와 같은 약학적 조성물의 용도이다.
영상화 및 진단
위에 설명된 바와 같은, 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는 식 (I') 의 그의 전구체는, 특히 클릭 화학 반응에 의해, 표지, 바람직하게는 형광 표지를 갖는 검출가능한 실체를 형성하기에 적합하다.
본 발명은 따라서 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 검출, 및 더욱 특히 암 세포를 식별 또는 단리하기 위한 연구 도구로서의 본원에서 개시된 바와 같은 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는 식 (I') 의 그의 전구체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 의학적 영상화 또는 진단을 위한, 바람직하게는 암을 진단 하기 위한 본원에서 개시된 바와 같은 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는 식 (I') 의 그의 전구체에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태 및 이점은 하기 실시예에서 설명될 것이며, 하기 실시예는 예시적이며 제한적이 아니라고 여겨질 것이다.
실시예
실시예 1 : 화합물의 합성
물질 및 방법:
박막 크로마토그래피는 Merck 60 F254 상에서 UV 에 의한 검출로, 및/또는 황산 또는 KMnO4 또는 인몰리브덴산 용액으로 탄화하여 수행했다. 실리카 겔 60 40-63 Mm 을 플래시 칼럼 크로마토그래피에 사용했다.
NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 300 또는 500 MHz 분광계 상에서 내부 표준으로서 잔류 양성자화된 용매를 사용하여 취했다. 화학 변위 δ 는 백만분율 (ppm) 로 제시되고, 커플링 상수는 헤르츠 (Hz) 로서 보고된다. 분할 패턴은 단일선 (s), 이중선 (d), 삼중선 (t), 이중선의 이중선 (dd), 이중선의 이중선의 이중선 (ddd) 으로 지정된다. 해석할 수 없거나 쉽게 시각화할 수 없는 분할 패턴은 다중선 (m) 으로 지정된다.
질량 스펙트럼은 Waters LCT Premier XE (ToF) 상에서 전자분무 이온화로 포지티브 (ESI+) 또는 네거티브 (ESI-) 검출 모드에서 취했다.
IR-FT 스펙트럼은 Perkin Elmer Spectrum 100 분광계에서 기록했다. 특징적 흡수는 ㎝-1 로 보고된다.
특정 광학 회전은 20℃ 에서 Anton Paar MCP 300 편광계로 10-㎝ 셀에서 20℃ 및 589 ㎚ 에서 측정했다.
모든 생물학적 및 화학적 시약은 상업적 공급원으로부터 수득한 분석적 또는 세포 배양 등급이었고, 추가의 정제 없이 사용했다.
Ara-N3 및 그의 전구체 VI 는 하기 절차에 따라 합성했다:
Figure pct00009
식에서 R1, R2, 및 R3 은 메틸 기이다.
2:3,4:5-디이소프로필리덴-D-아라비노스 O -메틸옥심 (화합물 II)
건조 피리딘 (90 mL) 중 D-(-)-아라비노스 (4.00 g, 26.6 mmo1, 1.0 eq.) 의 용액에 메톡시아민 하이드로클로라이드 (2.72 g, 32.0 mmo1, 1.2 eq.) 를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 시간 동안 교반했다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 톨루엔으로 3 회 공증발시켰다. 잔류물을 2,2-디메톡시프로판 (100 mL) 에 재현탁시키고, 7-톨루엔술폰산 (1.01 g, 5.33 mmo1, 0.2 eq.) 을 첨가하고, 현탁액을 4 시간 동안 가열 환류시키고, 그에 뒤이어 추가로 15 시간 동안 실온에서 교반했다. 반응 혼합물을 Celite® 로 여과하고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (200 mL) 에 용해시키고, 포화 수성 NaCl 용액 (2 x 150 mL) 으로 세정했다. 실리카 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 (시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1) 에 의해 이성질체 2:3,4:5-디이소프로필리덴-D-아라비노스 O-메틸옥심 (IIE/IIZ) 및 미지의 불순물 (NMR 비 6:1:0.4, 5.83 g) 의 혼합물이 무색 오일로서 산출되었다. 이 혼합물을 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용했다. 순수한 (2E) 의 앨리쿼트를 제 2 플래시 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄/MTBE 98:2) 에 의해 수득하고, 특성분석했다.
이성질체 (IIE):
Figure pct00010
2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 O-메틸옥심 (화합물 III)
80% (v/v) 수성 아세트산 (30 mL) 중 2:3,4:5-디이소프로필리덴-D-아라비노스 O-메틸옥심 (II) (IIE/IIZ) 및 불순물 (1.50 g) 의 용액을 200 mbar 의 압력에서 회전증발기 상에서 40℃ 로 가열했다. 2.5 시간 후에 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 톨루엔으로 공증발시켰다. 이성질체 2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 O-메틸옥심 (IIIE/IIIZ) (NMR 비 4:1, 876 ㎎, 3 단계에 걸쳐 58%) 의 혼합물이 실리카 겔 플래시 칼럼 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 1:1) 후에 무색 오일로서 수득되었다. NMR 에 의해 95% 초과의 순도.
Rf (시클로헥산/에틸 아세테이트 1:1): 0.24.
Figure pct00011
이성질체 (IIIE):
Figure pct00012
이성질체 (IIIZ):
Figure pct00013
2:3-이소프로필리덴-5- O -메탄술포닐-D-아라비노스 O -메틸옥심 (화합물 IV)
-20℃ 에서 건조 피리딘 (2.0 mL) 중 2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 O-메틸옥심 (III) (IIIE/IIIZ) (100 ㎎, 0.46 mmo1, 1.0 eq.) 의 용액에, 메실 클로라이드 (0.10 m1, 1.37 mmo1, 3.0 eq.) 를 첨가하고, 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 -20℃ 에서 교반했다. 반응물을 CH3OH (0.3 mL) 로 켄칭한 후에, 용매를 진공 하에 제거했다. 결과적인 잔류물은 실리카 플래시 칼럼 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 6:4) 에 의해 정제하여 2:3-이소프로필리덴-5-O-메탄술포닐-D-아라비노스 O-메틸옥심 (IVE/IVZ) (NMR 비 4:1, 110 ㎎, 81 %) 의 혼합물을 무색 오일로서 산출했다. 순수한 (IVE) 이성질체의 앨리쿼트가 플래시 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄/디에틸 에테르 9:1) 에 의해 수득되었고, 특성분석되었다. NMR 에 의해 95% 초과의 순도.
Rf (시클로헥산/에틸 아세테이트 6:4): 0.24.
Figure pct00014
이성질체 (IVE):
Rf (시클로헥산/에틸 아세테이트 6:4): 0.20.
Figure pct00015
이성질체 (IVZ):
Figure pct00016
5-아지도-5-데옥시-2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 O -메틸옥심 (화합물 V):
N,N-디메틸포름아미드 (30.0 m1, 0.10 M) 중 (IVE/IVZ) (810 ㎎, 2.72 mmo1, 1.0 eq.) 의 용액에, 소듐 아지드 (531 ㎎, 8.17 mmo1, 3.0 eq.) 를 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃ 에서 15 시간 동안 가열했다. 용매를 그 후 감압 하에 제거하고, 잔류물을 플래시 칼럼 크로마토그래피 (시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1) 에 의해 정제하여 5-아지도-5-데옥시-2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 O-메틸옥심 (VE/VZ) (NMR 비 7:3, 637 ㎎, 96%) 의 혼합물을 황색빛 오일로서 산출했다. (VE) 의 분획을 그것의 특성분석을 위해 플래시 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄/MTBE 97:3) 에 의해 단리했다. NMR 에 의해 95% 초과의 순도.
Rf (시클로헥산/에틸 아세테이트 8:2): 0.30.
Figure pct00017
이성질체 (VE):
Rf (디클로로메탄/MTBE 97:3): 0.23.
Figure pct00018
이성질체 (VZ):
Figure pct00019
5-아지도-5-데옥시-2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 (화합물 VI)
80% (v/v) 수성 아세트산 (120 mL) 중 (VE/VZ) (820 ㎎, 3.36 mmo1, 1.0 eq.) 의 용액에, 포름알데히드 (0.8 mL) 를 첨가하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반했다. 용매를 감압 하에 제거하고, 톨루엔으로 공증발시켜 아세트산의 완전한 제거를 보장했다. 미정제 화합물 5-아지도-5-데옥시-2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 (VI) (682 ㎎) 가 수득되었다.
무색 오일
Rf (시클로헥산/에틸 아세테이트 7:3): 0.56.
Figure pct00020
5-아지도-5-데옥시-D-아라비노푸라노스 (화합물 VII, Ara-N 3 )
CH2Cl2/H2O (20:1, 21 mL) 의 혼합물 중 5-아지도-5-데옥시-2:3-이소프로필리덴-D-아라비노스 (VI) (100 ㎎) 의 용액에, 트리플루오로아세트산 (1 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반했다. 용매를 그 후 증발시키고, 미정제 잔류물을 물에 재현탁시키고 동결건조시켰다. 실리카 플래시 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄/메탄올 92:8) 후에, 화합물 5-아지도-5-데옥시-D-아라비노푸라노스 또는 Ara-N3 (VII) (50 ㎎, 화합물 (V) 로부터 2 단계에 걸쳐 58%) 이 /β 아노머의 혼합물 (NMR 비 55:45) 로서 무색 오일로서 수득되었다. NMR 에 의해 95% 초과의 순도.
Rf (디클로로메탄/메탄올 92:8): 0.28.
Figure pct00021
아노머 알파 (VIIα):
Figure pct00022
아노머 베타 (VIIβ):
Figure pct00023
실시예 2 : 방광 비-종양 및 종양 진핵생물 세포의 표지
물질 및 방법:
세포 배양:
인간 요로상피 세포 (SV-HUC-1) 및 인간 방광암종 (T24) 을 ATCC (Manassas, Van USA) 로부터 구입했다. 이들 세포주를 10% 태아 소 혈청 (FBS) (VWR international S.A.S) 이 보충된 글루타민 1 배지 (Lonza Biowhttaker) 를 포함하는 RPMI 1640 에서 성장시켰다. 배양 배지를 2 일 마다 교환했다. 세포의 계대화를 Tryp-LE express 1x (Gibco) 를 사용하여 수행했다. 세포 생활력을 트리판 블루 배제 시험을 사용하여 추정했다.
Ara-N 3 프로브에 대한 세포 노출:
SV-HUC-1 및 T24 세포를 24-웰 플레이트에, 밀도 5*104 세포/웰로 시딩했다. 그 후, 세포를 37℃, CO2 중 5% 에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, 각각의 웰의 배양 배지를 버리고, 부착된 세포를 포스페이트 버퍼 살린 (PBS) (Lonza Biowhittaker) 으로 2 회 세정하고, 그 후 Ara-N3 프로브 (10 mM) 에 노출시켰다. 프로브를 상이한 FBS 농도 (3% 및 10%) 의 배양 배지에 첨가했다. 그 후, 세포를 37℃, CO2 중 5% 에서 24 시간 동안 다시 인큐베이션했다. 컨트롤 세포를 Ara-N3 의 첨가 없이 5% 또는 10% FBS 로 보충된 배양 배지를 사용하여 배양했다.
항-비오틴 항체로 표지:
Ara-N3 프로브의 형광 동화를 무구리 클릭 화학에 의해 술포-DBCO-비오틴 (1 mM) 을 사용하여 시각화하고, 그에 뒤이어 마우스 항-비오틴 Alexa Fluor 488 항체 접합체 (0.62 ㎎/㎖ 스톡, Jackson ImmunoResearch, 희석 1/10) 로 표지했다. 클릭 반응을 다음과 같이 수행했다: 24h 인큐베이션 시간에, 배양 배지를 제거하고, 부착된 세포를 PBS 로 2 회 세정했다. 세포를 Tryp-LE 로 탈착시키고, PBS 로 2 회 세정하고, 13000 g 에서 2 min 동안 원심분리했다. 세포 펠렛을 10 μL 의 술포-DBCO-비오틴으로 재현탁시키고, 30 min 동안 암흑 속에서, 및 37 ℃ 에서 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 PBS 로 2 회 세정하고, 원심분리하고, 세포 펠렛을 10 μL 의 마우스 항-비오틴 항체 용액으로 재현탁시키고, 그 후 실온에서 암흑 속에서 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 PBS 로 2 회 세정하고, 작은 세포 현탁액 스팟 (spots) (5 μL) 을 polysine® 부착 슬라이드 (VWR international S.A.S) 에, 암실에서, 건조될 때까지 (20 min) 두었다. 스팟을 4% 파라포름알데히드로 20 min 동안, 암흑 및 실온에서 고정시켰다. 슬라이드를 그 후 PBS 로 2 회 세정하고, 그 후 정사각형 커버 글라스 (VWR international S.A.S) 로 글리세롤 봉입제 (Dako) 를 사용하여 회수하고, 4℃ 에서 암실에서 저장했다.
형광 현미경관찰:
60X　/ 1.3 디지털 오프닝 / 1.4 SRI (실리콘 굴절률) 대물렌즈를 구비한 Olympus Microscopy IX83 (Olympus Life Science), 및 109 ㎚/픽셀 보정된 픽셀 크기를 갖는 Hamamatsu 오레카 플래시 4 LT 카메라를 사용하여 형광 획득을 기록했다. 여기 광을 X-CITE 120LED 에 의해 AT180/30X 여기 필터를 사용하여 방사시키고, AT535/40m 방사 필터를 사용하여 신호를 모니터링했다. 녹색광 노출 시간은 600 ms 였고, 백색광 노출 시간은 DIC 방법에 의해 340 ms 에서 확인했다. Cellsens dimension V1.16 소프트웨어에 의해 분석된 획득 면적 크기는 스팟에 함유되어 있는 세포수에 따라 상이했다.
이미지 가공 및 형광 정량화:
Cellsens dimension V1.16 소프트웨어의 카운트 및 측정 유닛을 사용하여 이미지를 가공했다. 배경 노이즈를 다음과 같이 제거했다: ROI 를 먼저 이미지의 배경에서 정의하고, 평균 픽셀 강도를 계산했다. 그에 따라 얻어진 값을 이미지의 모든 픽셀로부터 차감했다. 각각의 세포의 형광 강도를 3030 의 값에서 역치 세트로부터 확인했다. 3030 미만의 강도를 갖는 모든 픽셀을 카운트하지 않았다.
결과:
표 1: 24 h - FBS 농도 3% 에서 표지된 세포 % 의 평가
Figure pct00024
표 2: 24 h - FBS 농도 10% 에서 표지된 세포 % 의 평가
Figure pct00025
표 1 및 2 의 결과는 24 시간 후에 SV-HUC1 세포에 비해 T24 세포의 경우에 더 큰 표지된-세포 % 를 보여주며, 그에 의해 종양 방광 세포의 경우에 Ara-N3 프로브의 더 많은 동화를 입증한다. 더욱 구체적으로, 500,000 초과의 강도/㎛2 에서, FBS 농도 3% 에서 SV-HUC1 % 는 21.76 이고, T24 % 는 66.81 이고, FBS 농도 10% 에서 SV-HUC1 % 는 14.62 이고, T24 % 는 79.42 이며, 낮은 강도에서 수득된 표지된-세포 % 는 반대이다. 강도의 전체적 분포는 정상 세포 및 암 세포 사이에 다르다.
실시예 3 : 비-암 및 암 진핵생물 세포의 표지
물질 및 방법:
실시예 2 와 동일한 실험을 다른 암 및 상응하는 비-암 세포로 수행했다. 배양 배지를 시험되는 세포에 맞춰 적합화시키고, 10% 태아 소 혈청 (FBS) 을 보충했다. Ara-N3 프로브 (10 mM) 를 FBS 농도 (10%) 의 배양 배지에 첨가했다. 인큐베이션 시간은 시험된 세포의 1 배가 시간 또는 2 배가 시간에 해당한다 (아래 표 참조).
암 및 상응하는 비-암 세포에 대해 시험된 Ara-N3 로 수득된 형광 강도에 기초하여 형광 신호 암/비-암 비를 계산했다.
결과:
결과가 아래 제시되어 있고 (표 3), 상응하는 비-암 세포주 (1 초과의 비) 에 비해 시험된 암 세포주의 경우에 더 높은 형광 강도를 보인다.
Figure pct00026
Figure pct00027
동일한 실험을 다른 인간암 세포로, 더욱 구체적으로 하기 세포 (표 4) 를 포함시켜 매치되는 비-암 세포와 비교하여 실행했다:
표 4
Figure pct00028
표 3 과 동일한 결과 즉, 상응하는 비-암 세포주에 비해 시험된 암 세포주의 경우에 더 높은 형광 강도가 수득될 것으로 예상된다 (특히 1 초과의 비).
실시예 4- : Ara-N 3 및 KDO-N 3 의 표지의 비교
KDO-N3 (8-아지도-3,8-디데옥시-D-만노-옥툴로손산) 은 특허 출원 WO2013/107759 에서 박테리아를 표지하는 유용한 도구로서 기재되어 있다.
Ara-N3 및 KDO-N3 을 실시예 2 와 동일한 조건 하에 다른 인간 세포주: HeLa, Raw 및 마크로파지로 어세이했다.
상기 세포주는 KDO-N3 로 표지되지 않았지만 (형광 강도가 관찰되지 않음), 상기 세포주는 Ara-N3 로 표지되었다.
실시예 5: 세포에 대한 Ara-N 3 프로브의 비독성 ( 시험관내 / 생체내 )
A - 시험관내 실험
물질 및 방법
Ara-N3 프로브를 위에서 설명된 바와 같이 제조했다.
세포주 (아래 표에 기재된 바와 같음) 는 Inserm/Aquiderm 전이 세포에 의해 제공되었다. 세포주의 세포 배양 및 세포 세포독성 시험을 또한 Aquiderm 전이 세포에 의해, INSERM U1035 의 실험실에서 수행했다.
말초 혈액 단핵 세포 (단핵구 / 림프구) 의 단리
프랑스 아키텐 혈액 연구소 (Etablissement Francais du Sang d'Aquitaine) 가 확립한 협약에 의해 2 개의 상이한 건강한 공여자로부터의 말초 혈액으로부터 인간 단핵 세포를 단리했다. 사용된 기술은 피콜 (Ficoll) 구배 단리였다. 간략히, 포스페이트 완충 살린 용액 (PBS) 에 희석한 혈액을 수크로스 용액 (피콜, Eurobio) 에 넣고, 원심분리하여 상이한 혈액 성분을 분리했다. 피콜 및 혈장 사이에 단핵구 및 림프구로 구성되는 세포 고리가 확립되었다. 이를 회수하고 말라세즈 (Malassez) 세포로 카운팅하기 위해서 PBS 에서 세정했다.
항-CD14 항체 (Miltenyi Biotech) 에 커플링된 자기 비드에 의해 림프구로부터 인간 CD14 + 단핵구를 단리했다. 단핵 세포를 15 분 동안, PBS 버퍼에서 세포의 수에 따라 결정된 농도의 비드의 존재 하에 인큐베이션했다. 세포를 그 후 PBS 에서 세정하고, 그 후 강한 자석 상에 장착된 칼럼 상에 배치했다. 항-CD14 자성 볼에 부착되어 있는 CD14 + 세포는 칼럼에 부착된 상태로 유지될 수 있다. 세정 후에, 칼럼을 자성 지지체로부터 제거하고, PBS 버퍼에서 칼럼을 세정하여 세포를 언훅 (unhook) 했다.
말라세즈 세포로 카운팅함으로써 단핵구의 수를 확인했다.
세포 배양
세포를 오븐에서 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서, 상이한 배양 배지에서 배양했다:
- 단핵구 / THP1 쌍의 경우에, 10% 의 보체제거된 FCS (태아 송아지 혈청) 및 항생제 페니실린 (100 IU / ㎖) 및 스트렙타비딘 (100 ㎍ / ㎖) 이 보충된 RPMI 1640 배지에서.
- Hacat / A431 커플의 경우에 10% 의 보체제거된 FCS 및 항생제 페니실린 (100 IU / ㎖) 및 스트렙타비딘 (100 ㎍ / ㎖) 이 보충된 DMEM 배지에서.
배양 배지를 연구 동안 2 일 마다 교환했다.
배양물이 70-80% 컨플루언스에 도달했을 때, 부착된 세포를 10% 트립신-EDTA 로 탈착시켰다. 세포 생활력을 트리판 블루 배제 시험에 의해 평가했다.
Ara-N3 프로브와 접촉
모든 세포를 배양물 플레이트에, MTS 증식 시험의 경우에 96 웰에 밀도 1*104 세포 / 웰로, 아넥신 (Annexin) V 시험 / IP 시험의 경우에 24 웰에 밀도 5*104 세포 / 웰로 시딩했다. 그 후 세포를 37℃ 및 5% CO2 에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 24 시간 후에, 모든 웰의 배양 배지를 교환하고 웰 바닥에 부착된 세포를 PBS (Eurobio) 에서 2 회 헹구거나 또는 현탁액 중 세포의 경우에 원심분리하고 PBS 에서 2 회 세정하고, 그 후 Ara-N3 프로브에 상이한 농도로 노출시켰다: 1, 10, 50 및 100mM. 세포를 37℃ 및 5% CO2 에서 48 시간 동안 인큐베이션했다.
컨트롤 세포를 Ara-N3 프로브의 첨가 없이 보충된 배양 배지와 함께 배양했다.
아넥신 V / IP 세포독성 시험
이 시험은 세포자멸사 / 괴사의 검출을 위해 아넥신 V-APC 키트 (Biolegend) 의 사용을 요구한다. 이 시험은 막 포스파티딜세린 (PS) 에 결합하는 아넥신 V 의 능력 및 DNA 상의 프로피디움 요오다이드 (PI) 의 개재 특성을 사용한다.
구체적으로, 생존가능한 세포는 PS 를 그것의 막 이중층의 내층 상에 발현한다. PS 는 그러므로 아넥신 V-APC 에 접근불가능하다. 마찬가지로, 세포는 핵으로부터 떨어진 그것의 DNA 의 온전성을 유지하며, DNA 도 또한 IP 에 접근불가능하게 만든다. 세포가 세포자멸사 (프로그램된 세포사) 에 진입할 때, 일련의 이벤트가 일어난다. 그 중에서, 세포질 막의 층들의 반전이 존재한다. 내부 막 상에서 노출된, PS 는 지질 이중층의 분해에 의해 형성되는 소포의 외막 상에서 발견된다. 그들은 그러므로 아넥신 V-APC 분자를 고정시키고 660 ㎚ 에서 형광을 방사할 수 있으며, 이는 유세포분석법에 의해 검출가능할 것이다.
세포자멸사의 과정 동안, 세포는 그 후 괴사에 들어갈 것이다. 핵 막의 분해 및 배양 배지 내로 DNA 의 방출이 존재한다. PI 는 DNA 의 염기 사이에 삽입될 수 있고, 370-550 ㎚ 에서 제 2 형광을 방사할 수 있으며, 이는 또한 유세포분석법에 의해 검출가능하다.
간략히, 세포를 Ara-N3 프로브와 함께 상이한 농도 및 상이한 시간 (24h 및 48h) 으로 인큐베이션한 후에, 세포를 회수하고, 트립신처리하고 (부착 세포의 경우에), PBS 에서 세정했다. 말라세즈 세포 상에서 트리판 블루로 카운팅한 후에, 세포를 표지 버퍼 (100 μL) 에서 아넥신 V-APC (5 μL) 및 IP (10 μL) 의 존재 하에 15 분 동안 실온에서 및 암흑 속에서 인큐베이션했다. 세포를 그 후 100 μL 의 표지 버퍼를 첨가한 후에 세포분석법에 의해 직접 분석했다.
시험된 세포에 대한 Ara-N3 의 비독성 농도가 하기 표 5 에 나타나 있다.
B- 생체내 실험
물질 및 방법
Ara-N3 프로브를 위에서 설명된 바와 같이 제조했다.
10 마리의 암컷 NMRI 누드 마우스 (6 주령, Janvier, Le Genest-Saint Isle, France) 를 이 어세이에 등록했다. 세 마리의 마우스에게는 8 일 동안 격일로 (4 회 주입) 50 ㎎/마우스/주입의 Ara-N3 를 200 ㎎ 누적 투여량으로 정맥내 주입하고, 세 마리의 다른 마우스는 8 일 동안 8 mL 의 하루에 소비된 물 중 50 ㎎ 의 Ara-N3 로 400 ㎎ 누적 투여량으로 처리했다. 컨트롤 군으로서, 네 마리의 종양-보유 마우스는 처리하지 않았다.
마우스를 안락사시키고, 처리 종료시 해부했다. 심장, 폐, 뇌, 자궁, 난소, 신장, 골격 근육, 비장, 췌장, 복부 지방, 간, 피부, 위, 결장, 맹장, 소장, 장간막 림프절, 겨드랑이 림프절, 상완 림프절 및 전체 혈액을 수확하고, 분석을 위해 동결시켰다.
결과
Ara-N3 를 식수 (6,25 ㎎/mL 이하) 에 도입하는 것은 마우스의 물 소비를 변경시키지 않았다.
식수에서 또는 정맥내 주사에 의한, Ara-N3 를 사용한 처리는 어떠한 체중 감소도 유도하지 않았다.
표 5 ( 시험관내 / 생체내 )
Figure pct00029
실시예 6 : 종양 세포주에 대한 Ara-N 3 프로브의 특이적 표지 ( 생체내 )
물질 및 방법
모든 동물 실험을 실험 동물의 사용에 관한 유럽 경제 공동체의 제도 가이드라인 (EU Directive 2010/63/EU) 에 따라 수행하고, 프랑스 고등 교육 및 연구부에 의해 레퍼런스 APAFIS#8854-2017031314338357 하에 인가되었다.
피하 종양 이종이식
암컷 NMRI 누드 마우스 (6 주령, Janvier, Le Genest-Saint Isle, France) 의 옆구리에 1X PBS 중 8x106 Panc-1 세포를 피하 주입했다.
정맥내 주입에 의한 Ara-N3 처리 : 20 ㎎ Ara-N3 누적 투여량을 평가했다.
종양 세포 이식 후 10 일째에, Panc-1 종양-보유 마우스를 21 일 동안 격일로 (11 회 주입) 1.8 ㎎/마우스/주입의 Ara-N3 으로 20 ㎎ 누적 투여량으로 각각 (투여 당 n=3 마우스) 처리했다.
미처리 : 컨트롤 군으로서, 세포주 당 세 마리의 종양-보유 마우스를 처리하지 않았다 (Ctr).
조영제 투여
ㆍ DBCO-IRDye800CW
> 정맥내 주입에 의해 처리된 마우스
- 처리 조건 당 두 마리의 Panc-1 종양-보유 마우스에게 100 ㎍ 의 DBCO-IRDye800CW 을 마지막 처리 주입 (Ara-N3 + Fluo) 후 24 시간째에 정맥내 주입했다.
> 컨트롤 마우스
- 한 마리의 미처리 Panc-1 종양-보유 마우스에게 100 ㎍ 의 DBCO-IRDye800CW (Ctr + Fluo) 을 정맥내 주입했다.
형광 영상화 데이타 분석 (생체외)
DBCO-IRDye800CW 의 주입 후 48 시간째에 마우스를 안락사시키고 해부했다. 골격 근육 및 종양에 대해 생체외 형광 영상화를 수행했다.
정량화될 종양 부위에 조정된 관심의 영역 (Regions of Interest) (ROI) 을 수동으로 드로잉하여 형광 이미지로부터 반-정량적 데이타를 수득했다. ROI 에서 측정된 전체 형광 신호를 ROI 내 픽셀의 수에 의해 나눗셈했다. 골격 근육 및 종양에 대한 데이타는 따라서 픽셀 당 상대 형광 단위 (RLU) 로서 표현된다. 종양 및 골격 근육의 형광 신호 비가 그 후 계산된다 (종양/근육 비).
결과가 도 1 에 제시되어 있다.

Claims (16)

  1. 다세포 유기체로부터의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출 또는 표적화하기 위한 시험관내 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a) 진핵생물 세포를 포함하는 샘플을 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체와 접촉시키는 단계;
    b) 단계 (a) 의 샘플을 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물과, 임의로 구리의 존재 하에, 접촉시키는 단계; 및
    c) 임의로 단계 (a) 의 단당류에 결합된 단계 (b) 의 화합물을 검출하여, 진핵생물 세포를 검출하는 단계;
    상기 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물은 하기 식 (I) 을 갖는다:
    Figure pct00030

    식에서 X 는 제 2 반응성 기이며, 제 1 및 제 2 반응성 기는 클릭 화학 반응으로 함께 반응할 수 있다.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 2 반응성 기 X 는 아지도 기 (-N3) 이고, 제 1 반응성 기는 알카인 기인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물은 하기 식으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법:
    Figure pct00031
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물은 하기 식을 갖는 5-아지도-5-데옥시-D-아라비노푸라노스인 방법:
    Figure pct00032
    .
  5. 암 세포를 식별 또는 단리하기 위한 시험관내 (in vitro) 또는 생체외 (ex vivo) 방법으로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하는 것을 포함하는 방법.
  6. 대상체에서 암을 진단하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 표지를 검출하고, 임의로 표지를 기준 레벨과 비교하는 단계; 및 그 후 표지의 측정에 기반하여 암 세포를 식별 또는 암을 진단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 의 샘플은 대상체로부터의 생물학적 샘플이며, 상기 대상체는 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 방법.
  9. 하기를 포함하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 진핵생물 세포를 표지 또는 검출 또는 표적화하기 위한 방법을 실행하기 위한 키트:
    - 식 (I) 의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체, 및
    - 제 1 반응성 기를 보유하는 화합물.
  10. 임의로 항암 약물에 또는 항암 약물을 포함하는 입자에 작동가능하게 연결되거나 또는 연결되지 않은, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 식 (I) 의 적어도 하나의 개질된 단당류 화합물 또는, 바람직하게는 식 (I') 의, 그의 전구체를 그것의 표면 상에 제시하는 진핵생물 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 항암 약물은, 바람직하게는 화학요법제, 항암 항체, 호르몬 요법제, 면역요법제, 및 키나제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항종양 약물인 약학적 조성물.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 세포는 단리된 비-암 세포, 바람직하게는 MSC 인 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 암 치료에서 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서, 암 진단에서 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
  15. 암은 직장암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 자궁경부암, 자궁암, 유방암, 난소암, 뇌암, 폐암, 피부암, 방광암, 혈액암, 신장암, 간암, 전립선암, 다발성 골수종, 및 자궁내막암 중에서 선택되는, 제 5 항에 따른 암 진단 방법 또는 제 13 항에 따른 약학적 조성물.
  16. 의학적 영상화 또는 진단을 위한, 바람직하게는 암의 의학적 영상화 또는 진단을 위한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 개질된 단당류 화합물 또는 그의 전구체의 용도.
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