KR20210126008A - 세포 면역 치료의 조합 - Google Patents

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KR20210126008A
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카르스젠 테라퓨틱스 컴퍼니, 리미티드
상하이 캔서 인스티튜트
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Abstract

종양 치료 방법으로서, 종양이 있는 개체에게 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈을 투여하고, 상기 면역 이펙터 세포는 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 것을 특징으로 한다. 종양을 치료하기 위한 키트로서, 상기 키트는 1) 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포; 2) 젬시타빈; 3) 1) 및 2)의 상기 물질을 포함하기 위한 용기; 및 4) 상기 키트를 이용하여 종양을 치료하기 위한 투여 설명서를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

세포 면역 치료의 조합
본 발명은 세포 면역 치료 분야에 관한 것으로, 구체적으로 항종양 치료를 위한 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈의 병용에 관한 것이다.
최근 몇 년간 CAR-T 세포 치료와 같은 세포 면역 치료는 혈종 치료에서 놀라운 치료 효과를 보여주었으며, 현재 혈종 치료를 위한 CAR-T 세포의 임상 실험은 200개를 초과하였다(Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts,Jessica Hartmann et al.,EMBO Molecule Medicine,Published on line,August 1,2017). 그러나 고형 종양의 치료는 혈종 치료의 효과를 얻기 어렵다.
혈종의 경우, CAR-T 세포는 정맥 주입을 통해 종양 세포에 더 쉽게 도달하여 살해할 수 있지만, CAR-T 세포가 고형 종양의 종양 조직에 도달하려면 난이도가 더 크기 때문이다. 또한, 고형 종양은 통상적으로 종양 세포, 양성 세포, 기질 세포, 혈관 세포 등이 상호 작용할 수 있는 복잡하고 동적인 종양 미세 환경을 가지고 있으며, 이 외에 종양 미세 환경에는 시토카인 및 성장 인자에 의해 상호 작용할 수 있는 네트워크가 있기 때문에, 고형 종양 치료에 CAR-T 치료를 사용할 때 통상적으로 치료 효과가 좋지 않다.
본 발명의 목적은 면역 세포 치료, 특히 고형 종양에서 CAR-T 세포 치료의 응용 효과를 향상시키기 위한 종양 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 종양이 있는 개체에게 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈을 투여하고, 상기 면역 이펙터 세포는 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 단계를 포함하는 종양 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 종양이 있는 개체에게 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈을 투여하고, 상기 면역 이펙터 세포는 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 단계를 포함하는 암세포의 성장, 생존 또는 활성 또는 전부를 감소시키는 방법을 더 제공한다.
바람직한 해결수단에서, 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈의 투여 시간은 선후를 가리지 않으며; 먼저 젬시타빈을 투여한 다음 면역 이펙터 세포를 투여할 수 있으며; 동시에 투여할 수도 있고; 또한 먼저 면역 이펙터 세포를 투여한 다음 젬시타빈을 투여할 수도 있다. 즉 종양이 있는 개체에게 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈을 투여하는 방식은 (1) 먼저 젬시타빈을 투여한 다음 면역 이펙터 세포를 투여하는 방식, (2) 면역 이펙터 세포와 젬시타빈을 동시에 투여하는 방식, 및 (3) 먼저 면역 이펙터 세포를 투여한 다음 젬시타빈을 투여하는 방식 중 임의로 선택된다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 수용체는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR), T 세포 수용체(T cell receptor, TCR), T 세포 융합 단백질(T cell fusionprotein, TFP), T 세포 항원 커플러(T cell antigen coupler, TAC) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 종양 항원은 고형 종양 항원이다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 종양 항원은 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(즉 EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII), Claudin18.2, Claudin18.1, Claudin 6, 글리피칸-3(GPC3), 혈관 내피 성장 인자 수용체 중 임의로 선택된다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 종양 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1; C형 렉틴 유사 분자-1; 강글리오시드 GD3; Tn 항원; CD19; CD20; CD 22; CD 30; CD 70; CD 123; CD 138; CD33; CD44; CD44v7/8; CD38; CD44v6; B7H3(CD276), B7H6; KIT(CD117); 인터루킨 13 수용체 서브유닛 α(IL-13Rα); 인터루킨 11 수용체 α(IL-11Rα); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 전립선 특이막 항원(PSMA); 암 태아성 항원(CEA); NY-ESO-1; HIV-1 Gag; MART-1; gp100; 티로시나아제(Tyrosinase); 메소텔린(Mesothelin); EpCAM; 프로테아제 세린 21(PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체; 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β(PDGFR-β); 발생단계 특이적 태아성 항원-4(SSEA-4); 세포 표면 관련 뮤신 1(MUC1), MUC6; 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII); 신경 세포 접촉 분자(NCAM); 탄산 무수화 효소 IX(CAIX); LMP2; A형 에프린 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 접촉 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); O-아세틸 GD2 강글리오시드(OAcGD2); 엽산 수용체; 종양 혈관 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 혈관 내피 마커 7 관련(TEM7R); Claudin 6, Claudin18.2, Claudin18.1; ASGPR1; CDH16; 5T4; 8H9; αvβ6 인테그린; B 세포 성숙 항원(BCMA); CA9; κ 경쇄(kappa light chain); CSPG4; EGP2, EGP40; FAP; FAR; FBP; 태아성 AchR; HLA-A1, HLA-A2; MAGEA1, MAGE3; KDR; MCSP; NKG2D 리간드; PSC1; ROR1; Sp17; SURVIVIN; TAG72; TEM1; 피브로넥틴(Fibronectin); 테나신(Tenascin); 종양 괴사 부위의 암 태아성 변이체; G 단백질 결합 수용체 클래스 C 그룹 5 - 구성원 D(GPRC5D); X 염색체 개방형 판독 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산(Polysialic acid); 태반 특이 1(PLAC1); globoH glycoceramide의 헥소스 부분(GloboH); 유방 분화 항원(NY-BR-1); uroplakin 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 β3(ADRB3); pannexin 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCRγ 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); ETS 전좌 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전좌 중단점; 아포토시스의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V(NA17); Paired box 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; V-myc 조류 골수 세포종 바이러스 암 유전자 신경모 세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자 (아연 집게 단백질) 유사(BORIS); T 세포에 의해 인식되는 편평세포암종 항원 3(SART3); Paired box 단백질 Pax-5(PAX5); proacrosin 결합 단백질 sp32(OYTES1); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제(LCK); A 키나아제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종,, X 중단점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 λ 유사 펩티드 1(IGLL1)로부터 선택된다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 키메라 항원 수용체는,
(i) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD28의 공동자극 신호 도메인 및 CD3δ; 또는
(ii) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD137의 공동자극 신호 도메인 및 CD3δ; 또는
(iii) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD28의 공동자극 신호 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인 및 CD3δ을 구비한다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 종양 항원을 인식하는 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 14-22 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고; 바람직하게 상기 종양 항원을 인식하는 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 14-22 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열이다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23-44 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고; 바람직하게 상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23-44 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열이다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 종양은 유방암, 결장암, 직장암, 신세포암, 간암, 폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 방광암, 요관암, 신우암, 척추 종양, 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병소를 포함한다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 종양은 유방암, 혈액암, 결장암, 직장암, 신세포암, 간암, 비소세포 폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 눈의 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암, 중추신경계(CNS) 종양, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피모양암종, 편평세포암종, T 세포 림프종, 환경적으로 유발된 암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병소를 포함한다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포 또는 골수 유래 식세포 또는 이들의 조합을 포함하고; 바람직하게, 상기 면역 이펙터 세포는 자가 T 세포, 동종이계 T 세포 또는 동종이계 NK 세포로부터 선택되며, 더 바람직하게, 상기 T 세포는 자가 T 세포이다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 젬시타빈은 경구 투여, 복강내 투여 및/또는 주사 투여된다.
다른 바람직한 해결수단에서, 상기 개체에 대해 림프구를 제거하지 않는다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 상기 약물은 인간 환자의 종양을 치료하거나 또는 종양 세포의 성장, 생존, 또는 활성을 감소시키는 상기 세포 및 젬시타빈을 포함하되, 상기 세포와 젬시타빈은 상기 세포 및 젬시타빈을 각각 단독으로 사용했을 때의 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 제공하도록 조제되는 것을 특징으로 하는 약물 제조에서 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포의 응용을 제공한다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 상기 약물은 인간 환자의 종양을 치료하거나 또는 종양 세포의 성장, 생존 또는 활성을 감소시키고, 상기 세포와 젬시타빈은 상기 세포 및 젬시타빈을 각각 단독으로 사용했을 때의 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 제공하도록 조제되는 것을 특징으로 하는 약물 제조에서 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈의 응용을 제공한다.
바람직한 해결수단에서, 상기 면역 이펙터 세포는 CAR T 세포이고, 바람직하게, 상기 CAR T 세포는 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII), Claudin18.2, Claudin18.1, Claudin 6, 글리피칸-3(GPC3), BCMA 및/또는 혈관 내피 성장 인자 수용체를 인식한다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 종양을 치료하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는,
1) 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포;
2) 젬시타빈;
3) 1) 및 2)에 따른 물질을 포함하기 위한 용기; 및
4) 상기 키트를 이용하여 종양을 치료하기 위한 투여 설명서를 포함하되;
상기 면역 이펙터 세포와 젬시타빈은 상기 키트의 각 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 제공하도록 조제되고; 바람직하게, 상기 면역 이펙터 세포는 CAR T 세포이며, 더 바람직하게, 상기 CAR T 세포는 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII), Claudin18.2, Claudin18.1, Claudin 6, 글리피칸-3(GPC3), BCMA 및/또는 혈관 내피 성장 인자 수용체를 인식한다.
본 발명의 범위 내에서 본 발명의 상기 각 기술 특징 및 하기(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술 특징 사이는 서로 결합되어 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있음을 이해해야 한다. 편폭에 한하여 여기서 일일이 설명하지 않는다.
본 발명의 유익한 효과는 아래와 같다.
1. 본 발명에서 제공되는 젬시타빈 및 면역 이펙터 세포의 병용은 종양 세포를 살해하는 능력을 크게 향상시킨다.
2. 본 발명의 치료 방법을 사용하면 암의 미세 환경 중의 면역 억제에 저항할 수 있으므로, 고형 종양에 대한 작용이 크게 증진되고, 난치성 및 진행성 암에 대해 바람직한 효과가 있다.
도 1은 재조합 벡터 MSCV-8E5-2I-mBBZ 플라스미드의 도면이다.
도 2는 마우스의 췌장의 제자리 암종에 대한 젬시타빈과 CART 세포의 병용의 억제 효과에 대한 생체내 실험 관찰을 보여준다.
도 3은 젬시타빈과 CART 세포의 병용으로 치료된 마우스의 생체 이미징 데이터를 보여준다.
도 4는 젬시타빈과 CART 세포의 병용으로 치료된 마우스의 생존 기간 데이터를 보여준다.
본 발명은 종양 치료에 적용되는 면역 이펙터 세포와 젬시타빈의 병용에 관한 것이고, 본 발명은 상기 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는다. 본문에서 달리 정의하지 않는 한, 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 유전자 치료, 생화학, 유전학, 분자 생물학 및 의약 화학 분야 내의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일하다.
본문에서 기재된 것과 유사하거나 등가적인 방법 및 재료는 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본문에서 언급되는 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌의 모든 내용은 참조로 본문에 결합된다. 충돌되는 경우, 본 명세서에 포함되는 정의를 기준으로 한다. 또한, 달리 설명하지 않는 한 재료, 방법 및 실시예는 설명적인 것일 뿐, 이에 한정되지 않는다.
달리 설명하지 않는 한, 본 발명의 실행은 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래 기술을 사용할 것이고, 이는 모두 본 분야의 기술 범위에 속한다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명한다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL, 2000, Wileyand sonInc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Third Edition,(Sambrooketal, 2001, Cold Spring Harbor, NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited., 1984); Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higginseds.1984); Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984); Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney, Alan R.Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson 및 M.Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), 특히 Vols.154, 155(Wuetal.eds.) 및 Vol.185, “Gene Expression Technology”(D.Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller 및 M.P.Caloseds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 및 Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Hand book Of Experimental Immunology, I-IV 장(D.M.Weir 및 C.C.Blackwell, eds., 1986); 및 Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)를 참조 바란다.
본 발명은 적어도 일부분이 하기와 같은 인식에서 유도된다. 연속적으로, 임의의 순서로 또는 기본적으로 동시에 젬시타빈과 면역 이펙터 세포를 투여하는 하나 또는 다수의 주기 및/또는 용량의 조합 치료 방법으로 일부 피험자의 암을 치료할 때 더 효과적으로 면역 세포의 활성 및/또는 개수를 증가, 증진 또는 연장하여, 항종양 효과를 달성할 수 있다.
용어 “젬시타빈(Gemcitabine)”의 화학 명칭은 2’-데옥시-2’,2’-디플루오로시티딘 염산염이고; 분자식은 C9H11F2N3O4.HCl이며, 분자량은 299.66이다. 젬시타빈은 리보뉴클레오티드 환원 효소 및 세포 복제를 억제하여 종양 세포 DNA의 합성 및 복구를 방해할 수 있는 피리미딘 항대사성 종양 약물로, 다양한 고형 종양에 효과적이다. 구체적인 실시예에서 젬시타빈과 종양 항원 표적화 면역 세포 치료의 병용은 항종양 작용을 크게 향상시킬 수 있고, 심지어 완전히 완화하는 치료 효과를 달성할 수 있다.
발명자는 본 발명이 난치성 암의 항암 효과를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, CAR-T 세포를 사용할 때 림프구를 제거하지 않아도 되어, 림프구 제거로 인한 항암 치료 효과의 감소 및 정상 조직 손상으로 인한 독성 및 부작용, 특히 골수에 대한 심한 억제를 크게 줄일 수 있는 것을 발견하였다.
일부 실시형태에서, 종양이 있는 개체는 젬시타빈의 용량이 정맥 주입당 약 1250 mg/m2, 1250, 1150, 1100, 1050, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1 mg/m2이다. 일부 실시형태에서, 종양이 있는 개체는 약 6 주, 5 주, 4 주, 3 주, 2 주 또는 1 주당 한 번씩 젬시타빈을 정맥에 주입한다.
본 발명에서 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈의 투여 시간은 선후를 가리지 않으며; 먼저 젬시타빈을 투여한 다음 면역 이펙터 세포를 투여할 수 있으며; 동시에 투여할 수도 있고; 또한 먼저 면역 이펙터 세포를 투여한 다음 젬시타빈을 투여할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 면역 이펙터 세포 치료는 젬시타빈을 투여하기 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 1 개월 전 또는 이의 임의의 조합으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 면역 이펙터 세포 치료는 젬시타빈을 투여하고 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 1 개월 후 또는 이의 임의의 조합으로 사용된다.
용어 “면역 이펙터 세포”는 면역 반응 기간에 이펙터 기능을 발휘하는 세포를 의미한다. 예를 들어, 시토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 미생물을 살해하며, 항체를 분비하고, 종양 세포를 인식 또는 제거하는 면역 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포(세포 독성 T 세포, 보조 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 살해 세포, 호중구, 대식 세포(또는 골수 유래 식세포) 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게, 상기 T 세포는 자가 T 세포, 이종 T 세포, 동종이계 T 세포를 포함하고, 상기 자연 살해 세포는 동종이계 NK 세포이다.
본문에서 사용되는 바와 같이, 용어 “면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응”은 면역 이펙터 세포가 예를 들어 표적 세포의 면역 공격을 증진 또는 촉진시키는 기능 또는 반응을 의미한다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 살해를 촉진시키거나 성장 또는 증식하는 T 세포 또는 NK 세포의 속성을 억제하는 것을 의미한다.
용어 “면역 이펙터 기능”은 면역계의 조성에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함하고, 종양 확산 및 전이의 억제를 포함하는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 형성의 억제를 초래할 수 있다. 바람직하게, 면역 이펙터 기능은 종양 세포를 살해한다. 바람직하게, 본 발명 중의 면역 이펙터 기능은 항체에 의해 매개된 것이고, 보체 의존 세포 독성 작용(CDC), 항체 의존 세포 매개 세포 독성 작용(ADCC), 항체 의존 세포 매개 포식 작용(ADCP), 종양 관련 항원을 지닌 세포에서의 아포토시스 유도(예를 들어, 항체와 표면 항원의 결합을 통해), CD40L 매개 신호 형질도입의 억제(예를 들어, 항체와 CD40수용체 또는 CD40 리간드(CD40L)의 상호 결합을 통해), 및/또는 종양 관련 항원을 지닌 세포 증식의 억제를 포함하며, 바람직하게 ADCC 및/또는 CDC를 포함한다. 따라서, 하나 또는 여러 가지 면역 이펙터 기능을 매개할 수 있는 항체는 바람직하게 CDC 매개 용해, ADCC 매개 용해, 아포토시스, 동종 접착 및/또는 포식 작용(바람직하게 CDC 매개 용해 및/또는 ADCC 매개 용해의 유도를 통해)을 유도하여 종양 세포의 살해를 매개할 수 있다. 항체는 또한 간단하게 암세포 표면 상의 종양 관련 항원과 결합되어 작용을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 항체는 종양 세포 표면 상의 종양 관련 항원과 결합되어 종양 관련 항원의 기능을 차단시키거나 또는 아포토시스를 유도할 수 있다.
용어 “치료 유효량”, “치료에 유효한”, “유효량”은 본문에서 호환 가능하게 사용될 수 있고, 효과적으로 특정 생물학적 결과를 구현하는 화합물, 제제, 물질 또는 조성물의 양을 의미하며, 예를 들어 T 세포 반응을 촉진하기에 충분한 양 또는 용량을 의미하지만, 이에 한정되지 않는다. “면역학적 유효량”, “항종양 유효량”, “종양 억제 유효량” 또는 “치료 유효량”을 나타낼 때, 본 발명의 면역 이펙터 세포 또는 치료제의 정확한 투여량은 의사가 개체의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도 및 환자(피험자)의 상태를 고려한 전제하에 결정한다. 유효량의 면역 이펙터 세포는 면역 이펙터 세포의 항종양 활성이 증가, 증진, 또는 연장되고; 항종양 면역 이펙터 세포 또는 활성화 면역 이펙터 세포의 개수가 증가되며; IFN-γ, TNFα 분비를 촉진시키고; 종양 퇴행, 종양 축소, 종양 괴사를 이룰 수 있는 면역 이펙터 세포의 개수를 의미하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 “림프구를 제거하지 않는다” 또는 “림프구 제거를 진행하지 않는다”는 피험자 체내의 림프구를 제거하지 않는다는 것이다. 림프구 제거제, 전신 방사선 치료 또는 이들의 조합, 또는 림프구 제거를 유발하는 다른 수단을 제공하지 않는 것을 포함하지만; 림프구 제거제, 전신 방사선 치료 또는 이들의 조합, 또는 림프구 제거를 유발하는 다른 수단을 제공한 후, 피험자 체내의 림프구 제거율이 60%보다 낮으면 본 발명의 “림프구를 제거하지 않는다”는 범위에 해당된다.
용어 “펩티드”, “폴리펩티드” 및 “단백질”은 호환 가능하게 사용될 수 있고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노선 잔기로 구성된 화합물을 의미한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수는 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 또는 다수의 아미노산의 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본문에 사용되는 “키메라 수용체”는 유전자 재조합 기술을 통해 상이한 유래의 DNA 단편 또는 단백질에 상응한 cDNA를 연결하여 형성된 융합 분자이고, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), 변형된 T 세포(항원) 수용체(TCR), T 세포 융합 단백질(TFP), T 세포 항원 커플러(TAC)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본문에 사용되는 “키메라 항원 수용체” 또는 “CAR”은 하나의 폴리펩티드 그룹을 의미하고, 이가 면역 이펙터 세포에 있을 때, 상기 세포에 표적 세포(통상적으로 암세포)에 대한 특이성을 제공하며, 세포내 신호 생성을 가진다. CAR은 통상적으로 하기에 정의된 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도멘일을 포함하는 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 신호 전달 도메인(본문에서 “세포내 신호 전달 도메인”이라고도 함)을 포함한다. 일부 양태에 따르면, 폴리펩티드 그룹은 서로 인접해 있다. 폴리펩티드 그룹은 이합체화 분자가 존재할 때 폴리펩티드를 서로 커플링할 수 있는 이합체화 스위치를 포함하고, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 세포내 신호 전달 도메인에 커플링시킬 수 있다. 하나의 양태에 따르면, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체에 결합되는 δ 사슬이다. 하나의 양태에 따르면, 세포질 신호 전달 도메인은 하기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 또는 다수의 기능적 신호 전달 도메인을 더 포함한다. 하나의 양태에 따르면, 공동자극 분자는 4-1BB(즉 CD137), CD27 및/또는 CD28과 같은 본문에 따른 공동자극 분자로부터 선택된다. 하나의 양태에 따르면, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 양태에 따르면, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인과 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 하나 또는 다수의 공동자극 분자로부터 유래된 2개의 기능적 신호 전달을 포함한다.
본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하는 시작 항체 또는 단편(예를 들어 scFv)의 아미노산 서열의 변형을 구상한다. 예를 들어, CAR에 포함된 scFv와 같은 본문에 따른 암 관련 항원의 항원 결합 도메인의 VH 또는 VL은 변형되어, 본문에 따른 암 관련 항원의 항원 결합 도메인의 시작 VH 또는 VL 프레임 영역(예를 들어scFv)의 적어도 약 70％, 71％, 72％.73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％,81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95 ％, 96％, 97％, 98％, 99％의 동일성을 유지할 수 있다. 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하기 위한 CAR 구축물의 다수의 도메인의 하나 또는 다수의 아미노산 서열의 변형과 같은 전체 CAR 구축물의 변형을 구상한다. CAR 구축물은 변형되어 시작 CAR 구축물의 적어도 약 70％, 71％, 72％.73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％,81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％의 동일성을 유지할 수 있다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 본문의 종양 항원을 인식하는 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시, 또는 SEQ ID NO: 14로 표시, 또는 SEQ ID NO: 15로 표시, 또는 SEQ ID NO: 16으로 표시, 또는 SEQ ID NO: 17로 표시, 또는 SEQ ID NO: 18로 표시, 또는 SEQ ID NO: 19로 표시, 또는 SEQ ID NO: 20으로 표시, 또는 SEQ ID NO: 21로 표시, 또는 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고; 바람직하게 SEQ ID NO: 4로 표시, 또는 SEQ ID NO: 14로 표시, 또는 SEQ ID NO: 15로 표시, 또는 SEQ ID NO: 16으로 표시, 또는 SEQ ID NO: 17로 표시, 또는 SEQ ID NO: 18로 표시, 또는 SEQ ID NO: 19로 표시, 또는 SEQ ID NO: 20으로 표시, 또는 SEQ ID NO: 21로 표시, 또는 SEQ ID NO: 22로 표시되는 아미노산 서열이다.
본문에 사용되는 “막관통 도메인”은 단백질 서열에서 세포막을 관통하는 영역을 의미하고, 막관통 영역에 인접한 하나 또는 다수의 다른 아미노산을 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 또는 다수의 아미노산(예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 15개의 아미노산) 및/또는 상기 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 또는 다수의 다른 아미노산(예를 들어, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 하나의 양태에 따르면, 막관통 도메인은 키메라 수용체의 다른 도메인 중의 하나와 연관된 도메인이고, 예를 들어, 실시형태에서 상기 막관통 도메인은 신호 전달 도메인, 공동자극 도메인 또는 힌지 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부의 경우, 막관통 도메인은 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면막 단백질의 막관통 도메인에 결합되는 것을 방지하기 위해 선택되거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있고, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화한다. 하나의 양태에 따르면, 막관통 도메인은 키메라 수용체의 세포 표면 상의 다른 키메라 수용체와 동종 이합체화될 수 있다. 막관통 도메인은 천연 또는 재조합 유래일 수 있다. 상기 유래가 천연 유래인 경우, 상기 도메인은 임의의 막결합의 단백질 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 하나의 양태에 따르면, 상기 키메라 수용체가 상기 표적 항원에 결합되면 막관통 도메인은 세포내 도메인에 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용되는 막관통 도메인은 적어도 하기와 같은 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, T-세포 수용체의 α, β 또는 δ 사슬, CD28, CD27, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 적어도 하기와 같은 막관통 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD11a, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C이다.
일부의 경우, 막관통 도메인은 힌지(예를 들어, 인간 단백질로부터 유래된 힌지)를 통해 CAR의 항원 결합 도메인과 같은 CAR의 세포외 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, 실시형태에서, 힌지는 인간 Ig(면역글로불린) 힌지(예를 들어, IgG4 힌지, IgD 힌지), GS 링커(예를 들어, 본문에 따른 GS 링커), KIR2DS2 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 하나의 양태에 따르면, 막관통 도메인은 재조합된 것일 수 있고, 이 경우 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 하나의 양태에 따르면, 재조합 막관통 도메인의 각 말단에서 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼합체을 발견할 수 있다. 선택적으로, 길이가 2 내지 10개의 아미노산 사이의 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이에서 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이합체는 특히 적합한 링커를 제공한다.
본문에 사용되는 “세포내 도메인” 또는 “세포질 도메인”은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호 전달 도메인은 통상적으로 키메라 수용체가 도입된 면역 세포의 정상적인 면역 이펙터 서브기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 “이펙터 서브기능”은 세포의 특수 기능을 의미한다. T 세포의 면역 이펙터 서브기능 예를 들어 시토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 보조 활성일 수 있다. 따라서, 용어 “세포내 신호 전달 도메인”은 면역 이펙터 서브기능 신호를 형질도입하고 세포가 특정 기능을 실행하도록 가이드하는 단백질의 일부를 의미한다. 통상적으로 전체 세포내 신호 전달 도메인을 응용할 수 있지만, 많은 경우 전체 사슬을 사용할 필요가 없다. 세포내 신호 전달 도메인의 절단된 부분을 사용하는 경우, 완전한 사슬 대신 이러한 절단된 부분을 사용할 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호 전달 도메인은 면역 이펙터 서브기능 신호를 형질도입하기에 충분한 세포내 신호 전달 도메인의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
알다시피, 별도의 TCR를 통해 생성된 신호만으로 T 세포를 활성화하기에 충분하지 않고, 2차 및/또는 공동자극 신호도 필요하다. 따라서, T 세포 활성화는 2가지 다른 종류의 세포질 신호 전달 서열에 의해 매개된다고 말할 수 있으며, TCR을 통해 항원 의존성 1차 활성화를 촉발하는 것들(1차 세포내 신호 전달 도메인) 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위해 항원 독립적 방식으로 작용하는 것들(2차 세포질 도메인, 예를 들어 공동자극 도메인)이다.
용어 “자극 분자”는 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 세포질 신호 전달 서열을 제공하는 분자를 의미하고, 상기 신호 전달 서열은 자극 방식으로 면역 세포 신호 전달 경로의 적어도 일부 측면에 사용되는 면역 세포의 활성화를 조절한다. 하나의 양태에 따르면, 신호는 예를 들어 TCR/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 MHC-항원 펩티드 복합체의 결합을 통해 개시되는 1차 신호이고, 이는 T 세포 반응의 매개를 유도하며, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 서열(“1차 신호 전달 도메인”이라고도 함)은 면역 수용체 티로신의 활성화 모티프 또는 ITAM 기반 신호 전달 모티프라고 하는 것을 포함할 수 있다. 특히 본 발명에서 사용되는 ITAM을 포함하는 세포질 신호 전달 서열의 구현예는 CD3δ, 일반적인 FcRγ(FCER1G), FcγRIIa, FcRβ(FcEpsilon R1b), CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 임의의 CAR 중의 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-δ의 1차 신호 전달 서열과 같은 세포내 신호 전달 서열을 포함한다. 본 발명의 CAR에서, CD3-δ의 1차 신호 전달 서열은 인간 또는 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등과 같은 비인간종으로부터의 등가 잔기이다.
용어 “공동자극 분자”는 예를 들어 상동 결합 파트너를 의미하고, 이는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합되어 증식과 같은(이에 한정되지 않음) T 세포의 공동자극 반응을 매개한다. 공동자극 분자는 항원 수용체 또는 이의 리간드 외의 세포 표면 분자이고, 이는 효과적인 면역 반응을 촉진한다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 공동자극 분자의 구현예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83에 특이적으로 결합되는 리간드를 더 포함한다.
공동자극 세포내 신호 전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 NK 세포 수용체와 같은 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다. 이러한 분자의 구현예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합되는 리간드 등을 포함한다.
세포내 신호 전달 도메인은 분자의 모든 세포내 부분 또는 모든 천연 세포내 신호 전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
용어 “4-1BB”은 GenBank Accession No.AAA62478.2에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 구비하는 NFR 슈퍼 패밀리의 구성원, 또는 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등과 같은 비인간종으로부터의 등가 잔기를 의미하고; “4-1BB 공동자극 도메인”은 GenBank Accession No.AAA62478.2의 아미노산 잔기 214 ~ 255, 또는 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등과 같은 비인간종으로부터의 등가 잔기로 정의된다. 하나의 양태에 따르면, “4-1BB 공동자극 도메인”은 인간 또는 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등과 같은 비인간종으로부터의 등가 잔기이다.
본문의 키메라 항원 수용체는 (i) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD28의 공동자극 신호 도메인 및 CD3δ; 또는 (ii) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD137의 공동자극 신호 도메인 및 CD3δ; 또는 (iii) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD28의 공동자극 신호 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인 및 CD3δ을 구비한다.
본문의 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고; 바람직하게 상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44로 표시되는 아미노산 서열이다.
용어 “항체”는 항원에 특이적으로 결합되는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 항체는 다클론성 또는 단클론성, 다중 사슬 또는 단일 사슬, 또는 완전한 면역글로불린일 수 있고, 천연 소스 또는 재조합 소스로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사합체일 수 있다.
용어 “항체 단편”은 항원의 에피토프와 특이적으로 상호 작용(예를 들어, 결합, 입체 장해, 안정화/불안정화, 공간 분포를 통해)하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 일부를 의미한다. 항체 단편의 구현예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv, 이황화 결합-연결된 Fvs(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체(예를 들어 sdAb), camelid VHH 도메인, 항체 단편(예를 들어 힌지 영역에서 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편)으로 형성된 다중 특이적 항체 및 항체의 분리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용어 “scFv”는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 의미하며, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 인접(예를 들어, 짧은 가요성 폴리펩티드 링커와 같은 합성 링커를 통해)하고, 단일 사슬 폴리펩티드 형태로 발현될 수 있으며, 여기서 상기 scFv는 그것이 유래된 완전한 항체의 특이성을 유지한다. 달리 지정되지 않는 한, 본문에서 사용되는 바와 같이, scFv는 임의의 순서(예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C 말단)로 상기 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
용어 “항체 중쇄”는 항체 분자에서 천연적으로 존재하는 구성으로 존재하고 통상적으로 항체가 속하는 유형을 결정하는 두 가지 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 의미한다.
용어 “항체 경쇄”는 항제 분자에서 천연적으로 존재하는 구성으로 존재하는 두 가지 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 의미한다. κ(k) 및 λ(l) 경쇄는 두 가지 주요한 항체 경쇄의 동종형이다.
용어 “재조합 항체”는 예를 들어 박테리오파지 또는 효모균 발현 시스템에 의해 발현된 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체의 DNA 분자(여기서 DNA 분자는 항체 단백질을 발현함) 또는 특정 항체의 아미노산 서열을 코딩 및 합성하여 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 이미 재조합 DNA 또는 본 분야에서 획득할 수 있고 잘 알려진 아미노산 서열 기술을 사용하여 획득하였다.
용어 “항원” 또는 “Ag”는 면역 반응을 일으키는 분자를 의미한다. 상기 면역 반응은 항체 생성 또는 특이적 면역 능력을 가진 세포의 활성화 또는 둘 다 포함시킬 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 실제로 모든 단백질 또는 펩티드의 임의의 대분자가 항원으로 작용될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 본문에서 상기 용어를 사용할 때, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 면역 반응을 일으키는 단백질의 뉴클레오티드 서열 또는 일부 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 임의의 DNA를 포함하는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없다는 것을 이해해야 한다.본 발명은 1개 이상의 유전자를 사용한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 이러한 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유발하는 폴리펩티드를 코딩하기 위해 상이한 조합으로 배열된다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 항원이 “유전자”에 의해 코딩될 필요가 전혀 없음을 이해해야 한다. 항원은 합성하여 생성되거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래되거나 또는 폴리펩티드 외의 대분자일 수도 있다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 다른 생물학적 성분이 있는 세포 또는 액체를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 “종양 관련 항원(TAA)” 또는 “종양 항원”은 정상적인 조건 하에 개수가 제한된 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발육 단계에서 특이적으로 발현된 단백질을 의미한다. 일부 실시형태에서, 종양 관련 항원은 정상적인 조건 하에 위 조직에서 특이적으로 발현되고, 바람직하게는 췌장, 위 점막, 생식기관(예를 들어, 고환), 영양층 조직(예를 들어, 태반) 또는 생식계 세포 및 하나 또는 여러 가지 종양 조직 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 종양 관련 항원은 분화 항원을 의미하고, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원을 의미하며, 즉 정상적인 조건 하에 특정 분화 단계의 특정 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 단백질을 의미한다. 일부 실시형태에서, 종양 관련 항원은 종양 세포에 위치하지만, 정상적인 조직에서는 발현되지 않거나 약간만 발현된다. 일부 실시형태에서, 종양 관련 항원 또는 종양 관련 항원의 비정상적 발현은 종양 세포를 동정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체(예를 들어, 종양 환자) 중의 종양 세포에 의해 발현되는 종양 관련 항원은 상기 개체의 자가 단백질이다. 일부 실시형태에서, 종양 관련 항원은 정상적인 조건 하에 개체가 면역계 손상을 입었을 때 치명적이지 않은 조직 또는 기관에서 특이적으로 발현되거나; 또는 신체의 면역계가 접근할 수 없거나 접근하기 어려운 기관 또는 구조에서 특이적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 정상적인 조직에서 발현되는 종양 관련 항원의 아미노산 서열은 종양 조직에서 발현되는 종양 관련 항원의 아미노산 서열과 동일하다.
본 발명의 종양 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1; C형 렉틴 유사 분자-1; 강글리오시드 GD3; Tn 항원; CD19; CD20; CD 22; CD 30; CD70; CD123; CD138; CD33; CD44; CD44v7/8; CD38; CD44v6; B7H3(CD276), B7H6; KIT(CD117); 인터루킨 13 수용체 서브유닛 α(IL-13Rα); 인터루킨 11 수용체 α(IL-11Rα); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 전립선 특이막 항원(PSMA); 암 태아성 항원(CEA); NY-ESO-1; HIV-1 Gag; MART-1; gp100; 티로시나아제; 메소텔린; EpCAM; 프로테아제 세린 21(PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체,혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β(PDGFR-β); 발생단계 특이적 태아성 항원-4(SSEA-4); 세포 표면 관련 뮤신 1(MUC1), MUC6; 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII); 신경 세포 접촉 분자(NCAM); 탄산 무수화 효소 IX(CAIX); LMP2; A형 에프린 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 접촉 분자(sLe); 강글리오시드 GM3; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); O-아세틸 GD2 강글리오시드; 엽산 수용체; 종양 혈관 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 혈관 내피 마커 7 관련(TEM7R); Claudin6, Claudin18.2, Claudin18.1; ASGPR1; CDH16; 5T4; 8H9; αvβ6 인테그린; B 세포 성숙 항원(BCMA); CA9; κ 경쇄(kappa light chain); CSPG4; EGP2, EGP40; FAP; FAR; FBP; 태아성 AchR; HLA-A1, HLA-A2; MAGEA1, MAGE3; KDR; MCSP; NKG2D 리간드; PSC1; ROR1; Sp17; SURVIVIN; TAG72; TEM1; 피브로넥틴; 테나신; 종양 괴사 부위의 암 태아성 변이체; G 단백질 결합 수용체 클래스 C 그룹 5 - 구성원 D(GPRC5D); X 염색체 개방형 판독 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이 1(PLAC1); globoH glycoceramide의 헥소스 부분(GloboH); 유방 분화 항원(NY-BR-1); uroplakin2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 β3(ADRB3); pannexin 3(PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCRγ 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); ETS 전좌 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전좌 중단점; 아포토시스의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V(NA17); Paired box 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; V-myc 조류 골수 세포종 바이러스 암 유전자 신경모 세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자 (아연 집게 단백질) 유사(BORIS); T 세포에 의해 인식되는 편평세포암종 항원 3(SART3); Paired box 단백질 Pax-5(PAX5); proacrosin 결합 단백질 sp32(OYTES1); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나아제(LCK); A 키나아제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 중단점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 λ 유사 펩티드 1(IGLL1)을 포함하지만 이에 한장되지 않는다.
용어 “종양”은 세포의 비정상적 성장으로 인한 팽창 또는 병변(종양성 신생 세포 또는 종양 세포라고 함)을 의미한다. “종양 세포”는 신속하고 통제 불가능하게 증식할 수 있는 세포로, 상기 증식을 일으키는 자극이 정지된 후 계속하여 성장하는 비정상 세포를 의미한다. 종양은 구조적 조직이 부분적으로 또는 완전히 결여되고, 정상적인 조직과의 기능적 조정도 결여되는 것으로 나타나며, 통상적으로 독특한 조직 덩어리를 형성하며, 이는 양성, 악성 전 또는 악성일 수 있다.
용어 “암”(의학 용어: 악성 종양)은 하나의 세포 그룹에서 제어되지 않는 성장(정상 한계를 넘은 분열), 침습(인접 조직의 침입 및 파괴) 및 때때로 전이(림프 또는 혈액을 통해 신체 중의 다른 위치로 확산됨)을 나타내는 질병이다. 암의 이 세 가지 악성 특징은 양성 종양과 구별되고, 양성 종양은 자체 제한적이며, 침습 또는 전이되지 않는다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 일부(예를 들어, 백혈병)는 아니다.
용어 “암” 및 “종양” 또는 “암 질환” 및 “종양 질환”은 호환 가능하게 사용될 수 있고, 세포가 제어되지 않는 성장, 및/또는 침습, 및/또는 전이를 나타내는 질환을 의미한다. 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경모세포, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 이비인후(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 폐암, 및 이들의 전이를 포함한다. 이의 구현예는 폐암, 유암, 전립선암, 결장암, 신세포암, 자궁경부암 또는 상기 각종 암 또는 종양의 전이가 있다.
용어 “형질감염” 또는 “형질도입”은 외인성 핵산을 숙주 세포에 전이하거나 도입하는 과정을 의미한다. “형질감염된” 또는 “형질도입된” 세포는 외인성 핵산으로 형질감염,형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 상기 세포는 원발성 피험자 세포 및 이의 자손을 포함한다.
용어 “특이적으로 결합”, “특이적으로 인식”은 본문에서 동일한 의미를 가지고, 샘풀 중에 존재하는 항원(예를 들어, 종양 항원)의 항체 또는 리간드를 인식 및 결합하는 것을 의미하지만, 상기 항체 또는 리간드는 기본적으로 샘플 중의 다른 분자를 인식하거나 또는 결합하지 않는다.
용어 “난치”는 치료에 반응하지 않는 암 또는 종양과 같은 질환을 의미한다. 실시형태에서, 난치성 종양은 치료 시작 전 또는 시작할 때의 치료에 저항성이 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 난치성 종양은 치료 기간에 저항성이 될 수 있다. 난치성 종양은 저항성 종양이라고도 한다. 본 발명에서, 난치성 종양은 방사선 치료에 민감하지 않은 종양, 방사선 치료 후 재발하는 종양, 화학적 치료에 민감하지 않은 종양, 화학적 치료 후 재발하는 종양, CAR-T 치료에 민감하지 않거나 또는 치료 후 재발하는 종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 난치성 또는 재발성 악성 종양은 본문에서 설명하는 치료 방법을 사용할 수 있다.
본문에 사용된 바와 같은 “재발”은 요법과 같은 개선 기간 후, 예를 들어 암 요법의 이전 치료 후, 질환(예를 들어, 암) 또는 암과 같은 질환의 징후 및 증상의 복귀를 의미한다.
용어 “대상”, “개체”, “유기체” 또는 “환자”는 호환 가능하게 사용할 수 있고, 척추 동물을 포함하며, 바람직하게는 포유 동물을 포함한다. 본 발명에서, 포유 동물은 인간, 비인간 영장류, 가축 동물(예를 들어, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등), 실험 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 등) 및 사육 동물(예를 들어, 동물원 동물)이다. 본문에 사용되는 용어 “동물”은 인간을 더 포함한다. 용어 “대상”, “개체”는 환자, 즉 질환이 있는 동물을 포함하고, 바람직하게는 인간을 포함하며, 상기 질환은 바람직하게 본문에 따른 질환이다.
용어 “증진”은 피험자 또는 종양 세포가 본문에 공개되는 치료에 반응하는 능력을 개선시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 증진된 반응은 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 98％ 또는 더 많은 반응성 증가를 포함할 수 있다. 본문에 사용된 바와 같이, “증진”은 또한 면역 이펙터 세포 요법과 같은 치료에 반응하는 피험자 수를 증가시키는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 증진된 반응은 치료에 반응하는 피험자의 전체 백분율을 의미할 수 있고, 여기서 백분율은 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 98％ 이상일 수 있다.
하나의 양태에 따르면, 치료는 임상 결과를 기반으로 하며; T 세포의 항종양 활성 증가, 증진 또는 연장을 통해; 치료 전의 개수와 비교하면 항종양 T 세포 또는 활성화 T 세포 개수는 증가되고, IFN-γ, TNFa 분비를 촉진시키며 또는 이들의 조합에 의해 결정된다. 다른 양태에 따르면, 임상 결과는 종양 퇴행; 종양 축소; 종양 괴사; 면역계를 통한 항종양 반응; 종양 확대, 재발, 확산 또는 이들의 조합이다. 다른 양태에 따르면, 치료 이펙터는 T 세포의 존재, T 세포 염증을 나타내는 유전자 마커의 존재를 통해, IFN-γ, TNFa 분비를 촉진시키거나 또는 이들의 조합에 의해 예측된다.
본문에 공개된 바와 같은 면역 이펙터 세포는 다양한 경로를 통해 개체에 투여되고, 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 낭내, 복막내, 직장내, 수조내, 종양내, 비강내(intravasally), 피내 또는 각각 피부 패치 또는 경피 이온 삼투법을 사용하여 피부를 통한 수동적 또는 흡수의 촉진과 같은 경구 또는 비경구를 포함한다.
본 발명의 방법을 실행함에 있어서, 투여될 시약의 전체 양은 단일 용량으로 피험자에게 주입 또는 상대적으로 짧은 시간대를 걸쳐 주입, 투여되거나, 또는 분급 치료 방법으로 투여될 수 있으며, 여기서 연장 시간대에는 여러 개의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 피험자의 병리학적 상태를 치료하기 위한 조성물의 양이 피험자의 연령과 일반적인 건강, 및 투여 경로와 투여될 치료 횟수를 비롯한 다양한 요소에 의해 결정된다는 것을 알 것이다. 이러한 요소를 고려하여, 기술자는 필요에 따라 구체적인 용량을 조정한다. 일반적으로, 초기에 1기 및 2기 임상 시험으로 조성물의 조제 및 투여 경로와 빈도를 측정한다.
범위: 전체 발명에서, 본 발명의 각 양태는 범위 형태로 존재할 수 있다. 범위 형태의 설명은 편의 및 간결함을 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위에 대한 불가변적인 제한으로 간주되어서는 아니 됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 별도의 수치를 특별히 공개하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 및 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6과 같은 상기 범위 내의 별도의 수치와 같은 하위 범위를 구체적으로 공개하는 것으로 간주되어야 한다. 다른 구현예로서, 95 ~ 99％의 동일성과 같은 범위는 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 동일성을 가지는 범위를 포함하고, 96 ~ 99％, 96 ~ 98％, 96 ~ 97％, 97 ~ 99％, 97 ~ 98％ 및 98 ~ 99％의 동일성과 같은 하위 범위를 포함한다. 이는 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
본 발명의 내용에 따르면, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 공개된 구체적인 실시형태에서 다양한 변화 또는 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 전제하에 여전히 동일하거나 유사한 결과를 획득할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명은 본문에 설명되는 구체적인 실시형태(본 발명의 각 양태를 예시하기 위한 것일 뿐)로 범위가 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 방법 및 구성 요소는 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명은 다중 용량 또는 중복 용량을 제공하는 세포를 포함하는 고형 종양을 치료하기 위한 입양 세포 또는 면역 이펙터 세포, 및 이의 사용 방법, 조성물 및 제품에 관한 것이다. 세포는 일반적으로 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 다른 형질전환 수용체를 발현한다.
인간 클라우딘 18(Claudin 18, CLD18) 분자(Genbank 수탁 번호: 스플라이스 변이체 1(CLD18A1 또는 Claudin 18.1): NP_057453, NM016369, 및 스플라이스 변이체 2(CLD18A2 또는 Claudin 18.2): NM_001002026, NP_001002026은 분자량이 약 27,9/27,72kD인 내재막 관통 단백질이다. 마우스 클라우딘은 Claudin 18.2(NP_001181850.1)이다.
용어 “CLD18”은 클라우딘 18을 의미하고, 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 또는 CLD18 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현되는 임의의 CLD18의 변이체(CLD18A1 및 CLD18A2를 포함함), 형태, 동종형(isoform) 및 종간 상동체(specieshomologs)를 포함한다. 클라우딘 18은 상피와 내피의 밀착 연결된 위치의 내재막 단백질이다. 인접한 세포 사이에 밀착 연결된 조직막의 입자 상호 연결 사슬의 네트워크이다. 밀착 연결에서, 오클루딘(occludin) 및 클라우딘은 가장 중요한 막관통 단백질 구성 요소이다. 강력한 세포 간의 부착성으로 인해, 용질의 세포간 이동을 방지 및 제어하고 막지질 및 단백질의 측면 확산을 제한하여 세포 극성을 유지하는 1차 장벽을 생성한다. 밀착 연결된 단백질은 조직 상피 조직 구조에 결정적으로 참여한다. 바람직하게, “CLD18”은 인간 CLD18을 의미하고, 특히 CLD18A2(SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열) 및/또는 CLD18A1(SEQ ID NO:3로 표시되는 아미노산 서열)을 의미하며, 더 바람직하게는 CLD18A2을 의미한다.
용어 “CLD18A1”은 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 또는 CLD18A1 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현되는 임의의 인간 CLD18A1의 번역 후 변형 변이체, 동종형 또는 종간 상동체를 포함한다.
용어 “CLD18A2”는 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 또는 CLD18A2 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현되는 임의의 인간 CLD18A2의 번역 후 변형 변이체, 동종형 또는 종간 상동체를 포함한다.
용어 “CLD18 변이체”는 (i) CLD18 스플라이스 변이체, (ii) CLD18 번역 후 변형 변이체, 특히 N 글리코실화 상태가 다른 변이체, (iii) CLD18형태 변이체, 특히 CLD18-형태-1, CLD18-형태-2 및 CLD18-형태-3, (iv) 세포 사이의 밀착 연결된 부분에 위치한 유리 CLD18 및 동종/이종 관련 변이체, (v) CLD18 암 관련 변이체 및 CLD18 비 암 관련 변이체를 포함해야 한다.
일부 실시형태에서, 상기 클라우딘 18A2는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 아미노산 서열 변이체의 단백질/펩티드이다. 용어 “변이체”는 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 형태, 동종형, 대립 유전자 변이체, 종 변이체(species variant) 및 종 상동체(species homolog)를 의미하고, 특히 천연적으로 존재하는 변이체를 의미한다. 용어 “CLDN”, “CLDN18”, “CLDN18A1” 및 “CLDN18A2”는 임의의 번역 후 변형된 변이체 및 형태 변이체를 포함해야 한다.
CLD18A1은 정상적인 폐와 위의 상피에서 선택적으로 발현되는 반면, CLD18A2는 위 세포에서만 발현된다. 또한, CLD18A2는 분화된 위 상피의 단명성 세포에 국한되지만, 위 줄기 세포 영역에는 존재하지 않는다.
일부 실시예에서, 원발성 종양은 위암, 식도암, 췌장암, 비소세포 폐암과 같은 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암 및 담낭암을 의미하고, 상기 전이는 특히 Krukenberg 종양, 복막 전이 및 림프절 전이와 같은 위암 전이를 의미한다. 일부 실시예에서, CLDN18A2를 발현하는 세포는 종양 세포를 의미하고, 특히 종양성 위암 세포, 식도암 세포, 췌장암 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 결장암 세포, 간암 세포, 두경부암 세포 및 담낭암 세포로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 종양은 유방암, 결장암, 직장암, 신세포암, 간암, 폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 방광암, 요관암, 신우암, 척추 종양, 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병소를 포함한다.
본 발명은 CLD18 발현을 갖는 질환(예를 들어, 종양)을 치료하기 위한 치료 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 입양 세포 또는 면역 이펙터 세포의 고형 종양 치료에서 피험자가 유전적으로 조작(재조합)된 면역 이펙터 세포 키메라 수용체를 발현하고, 피험자의 종양을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 이러한 세포의 단일 치료 과정의 재주입 또는 다중 치료 과정의 재주입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이는 치료 과정 내의 용량 증가 또는 치료 과정 내의 반복 용량 주입 또는 치료 과정 내의 용량 감소이다. 일부 실시형태에서, 최초 용량은 낮은 용량 및/또는 조절 또는 감소된 용량 및/또는 후속 용량은 통합 용량 및/또는 조절 또는 감소된 용량이다. 이러한 방법에 사용 가능한 세포, 조성물 및 제품을 더 제공한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 유전적으로 조작된 항원 수용체, 예를 들어 기능적 비-TCR항원 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 형질전환 T 세포 수용체(TCR)와 같은 다른 재조합 항원 수용체이다. 수용체는 다른 재조합 키메라 수용체를 더 포함하고, 예를 들어 리간드 또는 수용체 또는 다른 결합 파트너에 특이적으로 결합되는 세포외 부분 및 세포내 부분을 포함하고, 예를 들어 CAR의 세포내 신호 형질도입 부분의 수용체들이다. 일부 실시형태에서, 용량은 낮은 최초 용량을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 종양이 있는 피험자에게 단일 치료 과정의 키메라 항원 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 피험자에게 다중 치료 과정의 키메라 항원 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 하나 또는 다수의 후속 용량을 제공할 수 있다.
이하 구체적인 실시예에 결합하여 본 발명을 더 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 통상적으로 J.Sambrook et al.에 의해 편집된 《분자 클론 실험 지침서(제3판)》(과학 출판사, 2002)에 따른 조건과 같은 일반적인 조건에 따르거나, 또는 제조사가 권장하는 조건에 따른다.
본 발명의 예시적인 항원 수용체는 CAR, 및 공정 조작 및 수용체를 세포에 도입하는 방법을 포함하고, 예를 들어 중국 특허 출원 공개 번호 CN107058354A, CN107460201A, CN105194661A, CN105315375A, CN105713881A, CN106146666A, CN106519037A, CN106554414A, CN105331585A, CN106397593A, CN106467573A, CN104140974A, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2017186121A1, WO2018006882A1, WO2015172339A8, WO2018/018958A1에 공개된 것들을 참조한다.
실시예 1. Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2, 8E5-2I-mBBZ CAR T 세포의 구축
1. Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2 세포의 구축
분자 생물학의 통상적인 수단을 이용하여 마우스 Claudin 18.2(SEQ ID NO:1)를 과발현하는 Panc02 췌장암 세포 모델(Panc02 췌장암 세포 모델은 BeiNa Biotechnology에서 구입함)을 구축한다. pWPT를 벡터로 마우스 Claudin 18.2(SEQ ID NO:1)를 삽입하여 플라스미드 pWPT-mClaudin 18.2를 구축한다. 이어서, 렌티바이러스 패키징 감염 방법을 사용하여 마우스 Claudin 18.2를 과발현하는 췌장암 세포 Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2를 구축한다.
2. 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포의 구축
(1) 플라스미드의 구축
본 분야의 통상적인 분자 생물학 방법을 사용하고, 본 실시예에 사용되는 scFv는 마우스 claudin18.2를 표적화하는 항체이며, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 5로 표시된다.
MSCV-IRES-GFP(Addgene에서 구입함)를 벡터로, 2세대 키메라 항원 수용체를 발현하는 레트로바이러스 플라스미드 MSCV-8E5-2I-mBBZ(도 1에 도시된 바와 같음)를 구축한다. 여기서, 8E5-2I-mBBZ 서열은 마우스 CD8α 신호 펩티드(이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시됨), claudin 18.2를 표적화하는 scFv(이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5로 표시됨), 마우스 CD8 hinge와 막관통 영역(이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시됨) 및 마우스 4-1BB 세포내 신호 전달 도메인(이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11로 표시됨) 및 마우스 CD3의 세포내 도메인 CD3δ(이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12로 표시되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 13으로 표시됨)으로 구성된다.
상기 구축된 MSCV-8E5-2I-mBBZ를 293T(ATCC에서 유래됨) 패키징 레트로바이러스에 형질감염시켜 레트로바이러스를 획득한다. 감염 방법은 본 분야의 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포 제조 과정에서 일반적인 감염 방법이다.
(2) CAR T 세포의 구축: C57BL/6 마우스(Shanghai Xipuer-Bikai Experimental Animal Co., Ltd.)의 비장 T 림프구를 취하고, 정제된 마우스 CD3+T림프구를 1:1의 부피 비율로 Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28에 첨가하며, PBS로 한 번 세척하고 활성화하며, 인큐베이터에 넣어 배양하고, 배지는 0％ FBS 혈청이 첨가된 RPMI 1640 완전 배지(invitrogen 사에서 구입함)이다.
24h 활성화된 마우스 비장 T 림프구를 재조합 인간 피브린 단편이 코팅된 12 웰 플레이트에 접종하고, 레트로바이러스를 첨가하여 12 시간 동안 감염시킨 후, 필요한 개수만큼 배양 및 증폭시켜, 마우스의 8E5-2I-mBBZ CAR T 세포를 획득한다.
실시예 2. 젬시타빈(Gemcitabine)과 CAR T 세포의 병용이 마우스 췌장암에 대한 억제 효과를 관찰하기 위한 생체내 실험
6 주령의 C57BL/6 마우스 췌장의 제자리에 2×105 Panc02/Luc-GFP-Claudin 18.2 세포를 접종하고, 종양 세포 접종일을 0일(즉 Day0)로 기록하였다.
종양 접종 후 6일차(즉 Day6), 마우스 T 세포를 취하고 실시예 1에 따라 8E5-2I-mBBZ CAR T 세포주를 구축한다. 동시에 마우스에 대해 생체내 이미징을 진행하고, 마우스 종양 부하에 따라 마우스를 랜덤으로 그룹을 나누며, 그룹은 주로 아래와 같다.
제1 그룹: UTD 그룹, 즉 형질감염되지 않은 마우스 T 세포 치료만 제공한 그룹;
제2 그룹: CART 그룹, 즉 8E5-2I-mBBZ CAR T 세포 치료만 제공한 그룹;
제3 그룹: Gemcitabine 그룹(또는, 젬시타빈 그룹이라고도 함), 즉 젬시타빈의 별도 치료만 제공한 그룹; 및
제4 그룹: Gemcitabine + CART 그룹(또는, 젬시타빈 + CART 그룹이라고도 함), 즉 8E5-2I-mBBZ CAR T 세포와 젬시타빈이 병용된 치료를 제공한 그룹이다.
6, 7, 8일차(즉 Day6, 7, 8), Gemcitabine 그룹 및 Gemcitabine + CART 그룹의 마우스에 대해 각각 30 mg/kg의 젬시타빈을 제공하여 치료하고, 복강내 투여로 1일 1회씩 투여한다.
종양 접종 후 9일차(즉 Day9), CART 그룹 및 Gemcitabine + CART 그룹의 마우스에 대해 각각 꼬리 정맥 주사로 용량이 3×106인 8E5-2I-mBBZ CAR-T 세포를 제공하고, UTD 그룹에 주사로 3×106의 형질감염되지 않은 마우스 T 세포를 제공하며, 그후 1주 1회 생체내 이미징으로 치료 효과를 관찰한다.
마우스의 췌장의 제자리 암종에 대한 억제 효과의 결과는 도 2에 도시된 바와 같고, 치료 후 13일차(Day13), UTD 그룹, CART 그룹, Gemcitabine 그룹과 비교하여, Gemcitabine + CART 그룹은 마우스 체내의 종양 부하(백색의 하이라이트 부위)가 크게 감소되고, 상기 Gemcitabine + CART 그룹 중의 두 마리 마우스는 완전히 완화되었다. 21일차(Day21), Gemcitabine + CART 그룹에서, 네 마리 마우스가 완전히 완화되었다. 다른 세 그룹의 경우, 21째에 완전히 완화된 마우스는 나타나지 않았다. 생체내 이미징 데이터에 따르면, UTD 그룹, CART 그룹 및 Gemcitabine 그룹의 마우스의 종양은 지속적으로 성장하고; UTD 그룹과 비교하여, Gemcitabine + CART 그룹 마우스의 종양 성장은 효과적으로 제어(P<0.05, 도 3)되었다. 마우스 생존 데이터에 따르면, Gemcitabine + CART 그룹 마우스의 생존 기간이 가장 길고, UTD 그룹 마우스의 생존 기간(P<0.01, 도 4) 및 Gemcitabine 그룹 마우스의 생존 기간(P<0.05, 도 4)을 크게 초과하였다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 참조로 별도로 인용된 것처럼 본 발명에서 참조로 인용된다. 또한, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있으며, 이러한 등가 형태는 본 발명에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속함을 이해해야 한다.
본 발명은 하기와 같은 서열을 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> CARSGEN THERAPEUTICS CO., LTD. SHANGHAI CANCER INSTITUTE <120> CELLULAR IMMUNOTHERAPY COMBINATION <130> FD00194PCT <141> 2020-01-07 <150> 201910012164.9 <151> 2019-01-07 <160> 44 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 atgtcggtga ccgcctgcca gggcttgggg tttgtggtgt cactgatcgg gtttgcgggc 60 atcattgcag ccacttgtat ggaccagtgg agcacccagg atttatacaa caacccggtg 120 accgctgtat tcaactacca agggctatgg cgttcatgcg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc gaggctactt caccctgttg gggttgccag ccatgctgca agctgtacga 240 gccctgatga tcgtgggcat tgttctgggg gtcatcggta tcctcgtgtc catcttcgcc 300 ctgaagtgca ttcgcattgg tagcatggat gactctgcca aggccaagat gactctgact 360 tctgggatct tgttcatcat ctccggcatc tgtgcaatca ttggtgtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacagcgg catgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacacct ttggtgcagc tctgttcgtg 540 ggctgggttg ctggaggcct caccctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcctgccgt 600 ggcctgacac cagatgacag caacttcaaa gctgtgtctt accatgcctc tggccaaaat 660 gttgcctaca ggcctggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgcccgcaca gaagacgatg aacagtctca tcctaccaag 780 tatgactatg tgtag 821 <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 245 <210> 5 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 caggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctgatcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgcaccg tgagcggcgg cagcatcagc agcggctaca actggcactg gatccggcag 120 ccccccggca agggcctgga gtggatcggc tacatccact acaccggcag caccaactac 180 aaccccgccc tgcggagccg ggtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgac accgccatct actactgcgc ccggatctac 300 aacggcaaca gcttccccta ctggggccag ggcaccaccg tgaccgtgag cagcggtgga 360 ggcggttcag gcggaggtgg ttctggcggt ggcggatcgg acatcgtgat gacccagagc 420 cccgacagcc tggccgtgag cctgggcgag cgggccacca tcaactgcaa gagcagccag 480 agcctgttca acagcggcaa ccagaagaac tacctgacct ggtaccagca gaagcccggc 540 cagcccccca agctgctgat ctactgggcc agcacccggg agagcggcgt gcccgaccgg 600 ttcagcggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct gcaggccgag 660 gacgtggccg tgtactactg ccagaacgcc tacagcttcc cctacacctt cggcggcggc 720 accaagctgg agatcaagcg g 765 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala 20 25 <210> 7 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60 atcctgggga gtggagaagc t 83 <210> 8 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr 1 5 10 15 Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser 20 25 30 Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 35 40 45 Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr 50 55 60 Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg 65 70 <210> 9 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60 ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120 gcctgtgata tttacatctg ggcacccttg gccggaatct gcgtggccct tctgctgtcc 180 ttgatcatca ctctcatctg ctaccacagg agccga 222 <210> 10 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys 1 5 10 15 Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys 20 25 30 Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu 35 40 45 <210> 11 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 aaatggatca ggaaaaaatt cccccacata ttcaagcaac catttaagaa gaccactgga 60 gcagctcaag aggaagatgc ttgtagctgc cgatgtccac aggaagaaga aggaggagga 120 ggaggctatg agctg 139 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu 1 5 10 15 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu 20 25 30 Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg 35 40 45 Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met 50 55 60 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 65 70 75 80 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 85 90 95 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala 100 105 <210> 13 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 agcaggagtg cagagactgc tgccaacctg caggacccca accagctcta caatgagctc 60 aatctagggc gaagagagga atatgacgtc ttggagaaga agcgggctcg ggatccagag 120 atgggaggca aacagcagag gaggaggaac ccccaggaag gcgtatacaa tgcactgcag 180 aaagacaaga tggcagaagc ctacagtgag atcggcacaa aaggcgagag gcggagaggc 240 aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agcactgcca ccaaggacac ctatgatgcc 300 ctgcatatgc agaccctggc c 331 <210> 14 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 245 <210> 15 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala 145 150 155 160 Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr 165 170 175 Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val 180 185 190 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln 210 215 220 Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys Arg <210> 16 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly 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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 290 295 300 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 305 310 315 320 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 325 330 335 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 340 345 350 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 355 360 365 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 370 375 380 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 385 390 395 400 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 405 410 415 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 420 425 430 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 435 440 445 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 450 455 460 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 40 <211> 515 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 290 295 300 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg 305 310 315 320 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 325 330 335 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 340 345 350 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 355 360 365 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 370 375 380 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 385 390 395 400 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 405 410 415 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 420 425 430 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 435 440 445 Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 450 455 460 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 465 470 475 480 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 485 490 495 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 500 505 510 Pro Pro Arg 515 <210> 41 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 41 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 290 295 300 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg 305 310 315 320 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 325 330 335 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 340 345 350 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 355 360 365 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 370 375 380 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 385 390 395 400 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln 405 410 415 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 420 425 430 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 435 440 445 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 450 455 460 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 42 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 42 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 290 295 300 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 305 310 315 320 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 325 330 335 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 340 345 350 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 355 360 365 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 370 375 380 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 385 390 395 400 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 405 410 415 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 420 425 430 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 435 440 445 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 450 455 460 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 43 <211> 515 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 290 295 300 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg 305 310 315 320 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 325 330 335 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 340 345 350 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 355 360 365 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 370 375 380 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 385 390 395 400 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 405 410 415 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 420 425 430 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 435 440 445 Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 450 455 460 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 465 470 475 480 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 485 490 495 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 500 505 510 Pro Pro Arg 515 <210> 44 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr 245 250 255 Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu 260 265 270 Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala 275 280 285 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu 290 295 300 Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Lys 305 310 315 320 Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys 325 330 335 Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro 340 345 350 Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu Ser Arg Ser Ala 355 360 365 Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 370 375 380 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala 385 390 395 400 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln 405 410 415 Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 420 425 430 Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 435 440 445 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 450 455 460 Leu His Met Gln Thr Leu Ala 465 470

Claims (19)

  1. 종양 치료 방법으로서,
    종양이 있는 개체에게 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈을 투여하고, 상기 면역 이펙터 세포는 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 암세포의 성장, 생존 또는 활성 또는 전부를 감소시키는 방법으로서,
    종양이 있는 개체에게 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈을 투여하고, 상기 면역 이펙터 세포는 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    종양이 있는 개체에게 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈을 투여하는 방식은,
    (1) 먼저 젬시타빈을 투여한 다음 면역 이펙터 세포를 투여하는 방식,
    (2) 면역 이펙터 세포와 젬시타빈을 동시에 투여하는 방식, 및
    (3) 먼저 면역 이펙터 세포를 투여한 다음 젬시타빈을 투여하는 방식 중 임의로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용체는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR), T 세포 수용체(T cell receptor, TCR), T 세포 융합 단백질(T cell fusionprotein, TFP), T 세포 항원 커플러(T cell antigen coupler, TAC) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 항원은 고형 종양 항원이고; 바람직하게 상기 종양 항원은 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(즉 EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII), Claudin18.2, Claudin18.1, Claudin 6, 글리피칸-3(GPC3) 및/또는 혈관 내피 성장 인자 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는,
    (i) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD28의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ; 또는
    (ii) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD137의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ; 또는
    (iii) 종양 항원을 인식하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 영역, CD28의 공동자극 신호 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ을 구비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 종양 항원을 인식하는 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 14-22 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고;
    바람직하게 상기 종양 항원을 인식하는 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 14-22 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23-44 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고;
    바람직하게 상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23-44 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 유방암, 결장암, 직장암, 신세포암, 간암, 폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 방광암, 요관암, 신우암, 척추 종양, 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 이펙터 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 호중구, 수지상 세포 또는 골수 유래 식세포 또는 이들의 조합을 포함하고; 바람직하게, 상기 면역 이펙터 세포는 자가 T 세포, 동종이계 T 세포 또는 동종이계 NK 세포로부터 선택되며, 더 바람직하게, 상기 T 세포는 자가 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 젬시타빈은 경구 투여, 복강내 투여 및/또는 주사 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 대해 림프구를 제거하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 약물 제조에서 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포의 응용으로서,
    상기 약물은 인간 환자의 종양을 치료하거나 또는 종양 세포의 성장, 생존, 또는 활성을 감소시키는 상기 세포 및 젬시타빈을 포함하되, 상기 세포와 젬시타빈은 상기 세포 및 젬시타빈을 각각 단독으로 사용했을 때의 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 제공하도록 조제되는 것을 특징으로 하는 응용.
  14. 약물 제조에서 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포 및 젬시타빈의 응용으로서,
    상기 약물은 인간 환자의 종양을 치료하거나 또는 종양 세포의 성장, 생존 또는 활성을 감소시키고, 상기 세포와 젬시타빈은 상기 세포 및 젬시타빈을 각각 단독으로 사용했을 때의 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 제공하도록 조제되는 것을 특징으로 하는 응용.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 면역 이펙터 세포는 CAR T 세포이고, 바람직하게, 상기 CAR T 세포는 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII), Claudin18.2, Claudin18.1, Claudin 6, 글리피칸-3(GPC3), BCMA 및/또는 혈관 내피 성장 인자 수용체를 인식하는 것을 특징으로 하는 응용.
  16. 종양을 치료하기 위한 키트로서,
    상기 키트는,
    1) 종양 항원을 인식하는 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포;
    2) 젬시타빈;
    3) 1) 및 2)에 따른 물질을 포함하기 위한 용기; 및
    4) 상기 키트를 이용하여 종양을 치료하기 위한 투여 설명서를 포함하되;
    상기 면역 이펙터 세포와 젬시타빈은 상기 키트의 각 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 제공하도록 조제되고; 바람직하게, 상기 면역 이펙터 세포는 CAR T 세포이며, 더 바람직하게, 상기 CAR T 세포는 표피 성장 인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII), Claudin18.2, Claudin18.1, Claudin 6, 글리피칸-3(GPC3), BCMA 및/또는 혈관 내피 성장 인자 수용체를 인식하는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항 또는 제 16항에 있어서,
    상기 종양 항원을 인식하는 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 14-22 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고; 바람직하게 상기 종양 항원을 인식하는 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 14-22 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열이며;
    상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23-44 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 가지고;
    바람직하게 상기 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 23-44 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 응용 또는 키트.
  18. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항 또는 제 16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 종양은 유방암, 결장암, 직장암, 신세포암, 간암, 폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 방광암, 요관암, 신우암, 척추 종양, 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 상기 종양의 조합 및 상기 종양의 전이성 병소를 포함하는 것을 특징으로 하는 응용 또는 키트.
  19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 이펙터 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 호중구, 수지상 세포 또는 골수 유래 식세포 또는 이들의 조합을 포함하고; 바람직하게, 상기 면역 이펙터 세포는 자가 T 세포, 동종이계 T 세포 또는 동종이계 NK 세포로부터 선택되며, 더 바람직하게, 상기 T 세포는 자가 T 세포인 것을 특징으로 하는 응용 또는 키트.
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