KR20210122396A - 오리오바시디움 균주 및 이의 배양물로부터 분리한 생물학적 계면활성제 - Google Patents

오리오바시디움 균주 및 이의 배양물로부터 분리한 생물학적 계면활성제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP) 균주로부터 생산되는 생물학적 계면활성제의 활성을 가지는 화합물에 관한 것이다. 생물학적 계면활성제의 활성성분을 가지는 화합물의 구조를 분광법을 이용하여 확인하였다. 본 발명의 생물학적 계면활성제의 활성성분은 다양한 용도로 이용이 가능하며, 예컨대 세정 및 정화용 조성물 등으로 이용할 수 있으며, 그 이외에도 의약품, 식품, 화장품, 육상과 해상의 유류 오염 정화, 처리조의 유지방 분해 등 화학합성 계면활성제가 사용되는 대부분의 다양한 산업분야에서 사용할 수 있다.

Description

오리오바시디움 균주 및 이의 배양물로부터 분리한 생물학적 계면활성제{AN AUREOBASIDIUM SP. STRAIN AND A BIOSURFACTANT ISOLATED FROM THE SAME}
본 발명은 오리오바시디움 균주 및 이의 배양물로부터 분리된 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도에 관한 것이다.
계면활성제는 의약학, 농업, 향장산업 등의 다양한 산업에서 폭넓게 활용되고 있다.
현재 상업적으로 이용되는 계면활성제는 대부분 석유로 만든 화학합성 계면활성제로서 그 생산량은 세계적으로 매년 약 1천만톤에 이른다. 이와 같은 계면활성제는 화학합성으로 제조하기 때문에 그 과정에서 오염원이 배출되는 등의 문제점이 있었다.
따라서 최근 환경오염에 대한 인식의 확대와 친환경소재에 대한 선호도의 증가에 따라 이를 대체할 수 있는 환경친화적인 계면활성제의 개발이 시급한 실정이다.
최근 생물공학의 발달은 미생물의 biosurfactant(생물학적 계면활성제)를 그 대안으로 급부상시켰다.
생물학적 계면활성제는 미생물이 생산하는 양친매성 물질로서 생분해성 계면활성제를 의미한다.
생물학적 계면활성제는 화학합성 계면활성제와 비교하여 생분해가 가능하고, 극한의 온도나 pH에서 활성을 유지하며, 독성이 낮고, 발효에 의한 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.
이에 생물학적 계면활성제는 원유 회수, 의약품 및 식품산업, 화장품, 비누, 경피용 DDS(drug delivery system) 등 다양한 산업에서의 활용 가능성이 대두되어 그에 따른 연구가 활발히 진행되고 있다.
최근까지 미생물로부터 수종의 계면활성제가 분리되어 이용되고 있으나 더 강한 효과를 나타내는 다양한 종의 미생물 확보 및 이로부터 강력한 생물학적 계면활성제의 발굴이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자는 한국등록번호 10-1446219호, 한국등록번호 10-1365711호, 한국등록번호 10-1278272호 등 균주로부터 분리한 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도를 여럿 밝혀온 바 있다.
본 발명은 위의 연구에서 더 나아가 강력한 생물학적 계면 활성을 지닌 새로운 미생물소재를 탐색 및 발견하고, 이로부터 활성성분을 분리, 정제한 뒤, 분광분석방법으로 화학구조를 규명한 것이다.
본 명세서는 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌을 참조하고, 그 인용을 표시하였다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용을 명확하게 설명하는데 활용될 수 있다.
한국등록번호 10-1446219호 한국등록번호 10-1365711호 한국등록번호 10-1278272호
본 발명자들은 천연물 기반 계면활성제로서 인체에 안전하고, 강력한 계면활성 효과를 나타내는 화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 효모로부터 분리된 화합물이 뛰어난 계면활성 효과를 보유한다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 효모로부터 분리된 화합물 및 이들의 생물학적 계면활성제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 생물학적 계면활성제는 강력한 계면활성 효과를 보유하며, 생분해가 가능하고 독성이 낮아 인체에 안전하다. 또한, 본 발명의 생물학적 계면활성제는 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하여 환경 친화적이다.
따라서, 본 발명의 목적은 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 계면활성제로서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 효모로부터 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
본 발명의 일측면은 하기 화학식 1로 표기되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 일측면은 하기 화학식 2로 표기되는 화합물을 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00002
본 발명의 일측면은 하기 화학식 3으로 표기되는 화합물을 제공한다.
[화학식 3]
Figure pat00003
본 발명의 일측면은 하기 화학식 4로 표기되는 화합물을 제공한다.
[화학식 4]
Figure pat00004
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 화합물 중 어느 하나는 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 분리된 것인 화합물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 화합물을 포함하는 생물학적 계면활성제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 1의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00005
본 발명의 또 다른 측면은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 2의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00006
본 발명의 또 다른 측면은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 3의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공한다.
[화학식 3]
Figure pat00007
본 발명의 또 다른 측면은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 4의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공한다.
[화학식 4]
Figure pat00008
본 발명의 또 하나의 다른 측면은 하기 화학식 1 내지 4의 화합물 중 어느 하나 이상을 생산하는 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP) 균주를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00009
[화학식 2]
Figure pat00010
[화학식 3]
Figure pat00011
[화학식 4]
Figure pat00012
본 발명의 또 다른 측면은 상기 화합물을 생물학적 계면활성제로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 화합물을 생물학적 계면활성제로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 화합물을 생물학적 계면활성제로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 균주로부터 분리된 화합물을 제공한다.
(2) 또한, 본 발명은 상기 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도를 제공한다.
(3) 본 발명의 생물학적 계면활성제는 강력한 계면활성 효과를 보유하며, 생분해가 가능하고 독성이 낮아 인체에 안전하다. 또한, 본 발명의 생물학적 계면활성제는 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하여 환경 친화적이다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본원발명 균주의 계통도이다.
도 2는 본원발명 계면활성물질의 분리 및 정제과정이다.
도 3은 본원발명 실시예 2에서 용출용매 chloroform:methanol=50:1(Fr. I), 20:1(Fr. II), 10:1(Fr. III), 5:1(Fr. IV), 1:1(Fr. V)을 순차적으로 이용하여 다섯 개의 분획으로 나눈 silica gel column chromatography 분획물의 계면활성 결과이다.
도 4은 본원발명 실시예 2에서 chloroform:methanol=5:1 분획(Fr. IV)을 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행한 결과이다.
도 5는 본원발명 실시예 2에서 Sephadex LH-20 column chromatography 분획물의 HPLC chromatogram 결과이다.
도 6은 본원발명 실시예 2에서 화합물 A-58-1의 HPLC chromatogram (ELSD detector)이다.
도 7은 본원발명 실시예 2에서 분획 IV-1의 ODS MPLC column chromatography 후, 분획물의 계면활성이다.
도 8은 본원발명 실시예 2에서 화합물 A-58-3의 ELSD를 이용한 HPLC chromatography이다.
도 9는 본원발명 실시예 2에서 ODS MPLC chromatogram 이다.
도 10는 본원발명 실시예 2에서 ODS MPLC column chromatography 분획물의 계면활성이다.
도 11은 본원발명 실시예 2에서 분획 I-1, I-2, I-3의 HPLC chromatogram (ELSD detector)이다.
도 12은 본원발명 실시예 2에서 화합물 A-58-9의 HPLC chromatogram (ELSD detector)이다.
도 13은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 ESI-mass spectrum (Negative mode)이다.
도 14은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 1H NMR spectrum이다.
도 15은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 13C NMR spectrum이다.
도 16은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 1H-1H COSY spectrum이다.
도 17은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 1H-1H COSY spectrum에 의해 해석된 부분구조이다.
도 18은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 HMQC spectrum 이다.
도 19은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 HMBC spectrum 이다.
도 20은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 2차원 NMR spectrum의 해석에 의하여 규명된 화학구조이다.
도 21은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-1의 화학구조 및 proton, carbon peak의 귀속(assignment)이다.
도 22는 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 ESI-mass spectrum (Negative mode)이다.
도 23는 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 1H NMR spectrum 이다.
도 24은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 13C NMR spectrum이다.
도 25은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 1H-1H COSY spectrum이다.
도 26은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 1H-1H COSY spectrum에 의해 해석된 부분구조이다.
도 27은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 HMQC spectrum 이다.
도 28은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 HMBC spectrum 이다.
도 29은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 2차원 NMR spectrum의 해석에 의하여 규명된 화학구조이다.
도 30은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-3의 화학구조 및 proton, carbon peak의 귀속(assignment)이다.
도 31은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 ESI-mass spectrum (Positive mode)이다.
도 32은 본원발명 실시예 4에서 화합물 A-58-4의 1H NMR spectrum이다.
도 33은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 13C NMR spectrum이다.
도 34은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 1H-1H COSY spectrum이다.
도 35은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 1H-1H COSY spectrum에 의해 해석된 부분구조이다.
도 36은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 HMQC spectrum 이다.
도 37은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 HMBC spectrum 이다.
도 38은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 2차원 NMR spectrum의 해석에 의하여 규명된 화학구조이다.
도 39은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-4의 화학구조 및 proton, carbon peak의 귀속(assignment)이다.
도 40는 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 ESI-mass spectrum (Positive mode)이다.
도 41는 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 1H NMR spectrum 이다.
도 42은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 13C NMR spectrum이다.
도 43은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 1H-1H COSY spectrum이다.
도 44은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 1H-1H COSY spectrum에 의해 해석된 부분구조이다.
도 45은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 HMQC spectrum 이다.
도 46은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 HMBC spectrum 이다.
도 47은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 2차원 NMR spectrum의 해석에 의하여 규명된 화학구조이다.
도 48은 본원발명 실시예 3에서 화합물 A-58-9의 화학구조 및 proton, carbon peak의 귀속(assignment)이다.
도 49는 본원발명 실험예 1에서 표면장력 실험결과이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "하부에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 폴리머 조성물 및 배합물의 양을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일측면은 하기 화학식 1 내지 4의 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물 및 이의 제조 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00013
[화학식 2]
Figure pat00014
[화학식 3]
Figure pat00015
[화학식 4]
Figure pat00016
본 발명의 일측면에 따른 상기 화학식 1 내지 4의 화합물 중 어느 하나 이상은 생물학적 계면 활성제로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 세정 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 생물학적 계면활성제로서 사용될 수 있는 화합물은 강력한 계면활성 효과를 보유하고 있으며, 특히 직물의 세척 및 세정 적용을 위해 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 계면활성제는 경질 표면의 세정 및 광택을 위해 사용될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 생물학적 계면활성제로서 사용될 수 있는 화합물은 비누, 샴푸, 크림 또는 로션에서 유화제로서 유리하게 사용될 수 있다.
상기 용도 외에도 본 발명의 화합물은 의약품, 식품, 원유의 2차 회수, 펄프와 제지 산업, 육상과 해상의 유류 오염 정화, 처리조의 유지방 분해 등 화학합성 계면활성제가 사용되는 대부분의 다양한 산업분야에서 사용될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 산국화꽃에서 분리된 균주로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 Aureobasidium pullulans A11231-1-58 균주로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 기탁번호가 KCTC 13895BP인 Aureobasidium pullulans A11231-1-58 균주로부터 분리될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주 배양, 특성 및 분리
- 균주 분리원 : 산국화꽃(울진군 부구면 두산아파트 뒷길 주변)
- 균주명 : Aureobasidium pullulans A11231-1-58
- Putative fatty acid elongase(ELO) 유전자(미국 국립생물공학정보센터 (NCBI, National Center for Biotechnology Information) 유전체 서열 데이터베이스 GenBank 등록번호 AB746306)
- ELO 유전자를 표준균주의 ELO 유전자와 분자계통해석을 통한 분자계통 도에서 기존의 그룹1~4에 속하지 않는 신규의 그룹임을 보인다. (여기서 그룹은 subspecies 또는 genotype을 일컫는다)
계통도는 도 1과 같았다.
- 균주기탁번호 : KCTC 13895BP (기탁일 2019년 7월 25일)
- 배양조건 : 300 L 배양, 배양기간 4일간, 최종 산물의 pH 7.35
- 배지 : KH2PO4(0.15g/L), MgSO4·7H2O(0.15g), NaNO3(1.5g), Yeast extract(0.5g), Glucose(20g),
- 전처리 : 원심분리, 농축(약 30L)
산국화꽃 으로부터 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 균주를 분리하였다. 상기 오리오바시디움 플루란스 A11231-1-58 균주는 2019년 07월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(기탁번호 KCTC 13895BP).
상기 오리오바시디움 플루란스 A11231-1-58를 발효조를 사용하여 상기 배지 조건에서 4일간 배양하였다.
배양액을 원심분리하여 얻은 상등액에 15ℓ의 에탄올을 첨가하고 교반한 뒤 하루 동안 방치하였다. 이 후 다당류로 보이는 부유물 및 침전물을 체로 걸러 제거하였다. 다시 한 번 원심분리하여 상등액을 취하였다. 이를 농축 및 동결건조하였다.
실시예 2. 계면활성물질의 분리 및 정제
계면활성물질의 분리 및 정제과정은 하기 도 2와 같았다. 구체적으로 하기와 같은 과정으로 계면활성물질을 분리 및 정제하였다.
배양농축액 약 10 L에 Diaion HP-20 resin (2 L)을 넣고 3시간 동안 교반하여 흡착시켰다. 흡착시킨 resin을 column에 충진한 후, 증류수로 세척하고 50% aq. methanol, 100% methanol, acetone으로 각각 2 L씩 순차적으로 용출시켰다. 활성을 검정한 결과 100% methanol 분획에서 활성을 나타내어 이를 농축하고 ethyl acetate로 분배 추출하였다.
Ethyl acetate 층을 농축한 후 silica gel column chromatography를 수행하였다. 용출용매는 chloroform:methanol=50:1(Fr. I), 20:1(Fr. II), 10:1(Fr. III), 5:1(Fr. IV), 1:1(Fr. V)을 순차적으로 이용하여 다섯 개의 분획으로 나누었다. 각 분획의 활성 결과는 도 3과 같았다.
도 3에서와 같이 우선, 활성이 제일 강한 chloroform:methanol=5:1 분획(Fr. IV)을 농축하고 Sephadex LH-20 column chromatography (용출용매: Methanol)를 수행하였다. 분획 수행 결과는 도 4와 같았다.
분획물의 활성을 측정하여 2개의 분획 IV-1(17-33), IV-2(34-47)으로 grouping하였다.
분획물은 ELSD detector를 이용하여 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 시스템 및 조건은 하기와 같았다.
HPLC system
-HITACHI Chromaster, HITACHI , Japan
-Pump 5110, Autosampler 5210,
-Column Oven 5310, ELSD Detector
HPLC 조건
- Detecter: ELSD
- Column: TSK-gel 100V (4.6 mm×250 mm, 5 ㎛), TOSOH, Japan
- Injection vol.: 10 μL
- Mobile phase: 상은 하기 표 1과 같다
Min 5% aq. MeOH/0.04% TFA MeOH Flow rate(ml/min)
0 50 50 1
2 50 50 1
17 0 100 1
26 0 100 1
29 50 50 1
30 50 50 1
상기 Sephadex LH-20 column chromatography 분획물의 HPLC chromatogram 결과는 도 5와 같았다.
분획 IV-2를 농축한 후 ODS MPLC(용출용매: 10→100% aq. methanol)를 수행하여 A-58-1을 분리하였다.
ODS MPLC 장비:
- Combiflash RF+ (Teledyne ISCO)
- Column C18 (86 g, Teledyne ISCO)
- Mobile phase: 증류수-acetonitrile
화합물 A-58-1의 HPLC chromatogram (ELSD detector)는 도 6과 같았다.
분획 IV-1은 농축하여, ODS MPLC(용출용매: 10~100% methanol)를 수행하였고 도 7과 같은 활성을 나타내었다.
활성을 나타낸 97-110번 분획은 농축하여 다시 ODS MPLC(용출용매: 30~100% acetonitrile)를 수행하여 A-58-3을 분리하였다. 화합물 A-58-3의 ELSD를 이용한 HPLC chromatography는 도 8과 같았다.
또한, chloroform:methanol=50:1 분획을 농축하고, ODS MPLC를 수행하였다(용출용매: 10→100% aq. MeOH). 각 분획물은 활성을 측정하여 3개의 분획(I-1, I-2, I-3)으로 grouping하였다. 결과는 도 9 및 도 10과 같았다.
3개의 분획을 ELSD detector를 이용하여 HPLC로 분석한 결과는 다음과 같다. 그 결과 분획 I-2 및 I-3은 순도가 높아 각각 화합물 A-58-4, 화합물 A-58-5로 명명하였다. 도 11과 같았다.
분획 I-1은 Sephadex LH-20 column chromatography (용출용매: Methanol)를 수행한 후, 활성분획은 ODS MPLC로 분취하여 화합물 A-58-9를 분리하였다. 도 12는 화합물 A-58-9의 HPLC chromatogram (ELSD detector)이다.
실시예 3. 계면활성물질의 화학구조 규명
가. 화합물 A-58-1의 화학구조
계면활성물질로 분리한 화합물 A-58-1의 화학구조를 규명하기 위하여 ESI-mass 및 1차원, 2차원 NMR spectrum을 측정, 해석하였다.
1) Mass spectrum의 측정 및 해석
본 화합물의 분자량을 밝히기 위하여 ESI-mass spectrum을 측정하였다. (도 13)Positive mode에서 측정한 결과 피크가 검출되지 않았으나 negative mode에서 측정한 결과 [M-H]-가 m/z 477.2, [2M-H]-가 m/z 955.1에서 관찰되어 분자량이 478로 확인되었다.
2) NMR spectrum의 측정 및 해석
화합물 A-58-1의 화학구조를 규명하기 위하여 CD3OD에 녹여 1H NMR, 13C NMR 등 1차원 NMR, 1H-1H COSY, HMQC, HMBC 등 2차원 NMR spectrum을 측정하여 해석하였다.
1 H NMR spectrum의 측정 및 해석: 1H NMR spectrum을 측정한 결과(도 14), 6.30, 6.01, 5.34, 5.31 ppm에서 네 개의 olefinic methine, 4.01, 3.63 ppm에서 두 개의 oxygenated methine, 3.53/3.47 ppm에서 한 개의 oxygenated methylene, 2.30/1.33, 1.98/1.75, 1.97/1.84, 1.87/1.58, 1.83/1.74, 1.74/1.63 ppm에서 6개의 methylene, 2.57, 1.92, 1.82, 1,82, 1,50 ppm에서 5개의 methine, 1.07, 0.97, 0.88, 0.86, 0.72 ppm에서 5개의 methyl proton 피크가 관찰되었다.
13 C NMR spectrum의 측정 및 해석: 13C NMR spectrum을 측정한 결과(도 15), 총 28개의 피크가 관찰되었다. 즉 141.3, 137.2, 133.7, 131.3 ppm에서 네 개의 sp2 methine carbon, 79.7, 75.2, 73.7 ppm에서 3개의 oxygenated quaternary carbon, 77.5, 67.1 ppm에서 2개의 oxygenated methine carbon, 67.7 ppm에서 한 개의 oxygenated methylene carbon, 48.2, 48.1 ppm에서 2개의 quaternary carbon, 54.8, 52.2, 47.2, 44.6, 34.3 ppm에서 5개의 methine carbon, 43.2, 41.6, 31.3, 28.3, 25.9, 22.0 ppm에서 6개의 methylene, 24.9, 20.5, 20.2, 17.9, 8.6 ppm에서 5개의 methyl carbon이 관찰되었다. 이상의 13C NMR spectrum은 본 화합물이 두 개의 이중결합을 지닌 terpene 계 화합물임을 나타내었다. 본 화합물의 화학구조는 2차원 NMR spectrum의 측정 및 해석에 의하여 규명되었다.(도 20)
H- 1 H COSY spectrum의 측정 및 해석: 화합물의 부분구조를 규명하기 위하여 1H-1H COSY spectrum을 측정하였으며, 그 결과 도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이 다섯 개의 부분구조를 규명하였다.
HMQC spectrum 및 HMBC spectrum의 측정 및 해석: HMQC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 도 18과 같이 관찰된 모든 proton-bearing carbon (1 J C-H)을 규명할 수 있었다. 또한 HMBC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 도 19에 도시한 long-range correlation이 관찰되었다. 즉 6.30 ppm의 methine proton으로부터 79.7, 73.7, 54.8 ppm의 carbon에, 6.01 ppm의 methine proton으로부터 75.2, 48.1, 43.2 ppm의 carbon에, 1.97/1.84 ppm의 methylene proton으로부터 141.3, 75.2 ppm의 carbon에, 1.07 ppm의 methyl proton으로부터 79.7, 75.2, 48.1, 28.3 ppm의 carbon에 long-range correlation이 관찰되어 A, B ring의 구조가 결정되었다. 또한, 1.82 ppm의 methine proton으로부터 133.7 ppm의 carbon에, 0.72 ppm의 methyl proton으로부터 77.5, 54.8, 52.2, 48.2 ppm의 carbon에 long-range correlation이 관찰되었다.
이상의 결과로부터 화합물 A-58-1의 화학구조를 도 20과 같이 결정하였으며, 화학구조를 바탕으로 SciFinder database를 검색한 결과 신규 화합물로 유추되었다. 도 21에 화합물 A-58-1의 proton, carbon peak의 귀속을 나타내었다.
나. 화합물 A-58-3의 화학구조
계면활성물질로 분리한 화합물 A-58-3의 화학구조를 규명하기 위하여 ESI-mass 및 1차원, 2차원 NMR spectrum을 측정, 해석하였다.
1) Mass spectrum의 측정 및 해석
본 화합물의 분자량을 밝히기 위하여 ESI-mass spectrum을 측정하였다. Negative mode에서 측정한 결과 [M-H]-가 m/z 487.2, [2M-H]-가 m/z 975.1에서 관찰되어 분자량이 488로 확인되었다.(도 22) 그러나 positive mode에서는 피크가 검출되지 않았다.
2) NMR spectrum의 측정 및 해석
화합물 A-58-3의 화학구조를 규명하기 위하여 CD3OD에 녹여 1H NMR, 13C NMR 등 1차원 NMR, 1H-1H COSY, HMQC, HMBC 등 2차원 NMR spectrum을 측정하여 해석하였다.
1 H NMR spectrum의 측정 및 해석: 1H NMR spectrum을 측정한 결과, 도 23과 같이 5.06, 4.07 ppm에서 각각 2개씩 4개의 oxygenated methine proton, 2.53/2.42, 2.49/2.40, 2.30, 1.80/1.73 (×2), 1.62, 1.61 (×2), 1.25-1.40 (×8) ppm에서 16개의 methylene 및 0.92 ppm에서 3개의 methyl기에 유래하는 proton들이 관찰되었다.
13 C NMR spectrum의 측정 및 해석: 13C NMR spectrum을 측정한 결과, 도 24와 같이 총 26개의 탄소가 관찰되었다. 즉 176.0, 175.4, 173.1 ppm에서 3개의 carbonyl carbon, 73.5, 73.0, 66.9, 66.9 ppm에서 4개의 oxygenated methine carbon, 43.5, 43.2, 42.3 (×2), 35.6, 35.2 (×2), 32.9 (×2), 32.6, 26.0 (×3), 23.8 (×2), 23.5 ppm에서 16개의 methylene carbon 및 14.5 ppm에서 3개의 methyl carbon이 관찰되었다.
1 H- 1 H COSY spectrum의 측정 및 해석: 화합물 A-58-3의 부분구조를 규명하기 위하여 3 J H-H의 상관관계를 규명할 수 있는 1H-1H COSY spectrum을 측정하여 해석하였다. 그 결과 도 25 및 26에 나타낸 6개의 부분구조 -CH2-CH(-O)-CH2-CH(-O)-CH2-CH2-, -CH2-CH(-O)-CH2-CH(-O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, CH3-CH2-, CH3-CH2-, CH3-CH2-를 규명하였다.
HMQC spectrum의 측정 및 해석: HMQC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 많은 시그널들이 중첩되어 cross-peak가 검출되었으나 proton integral을 바탕으로 모든 proton-bearing carbon (1 J C-H)을 규명할 수 있었다.(도 27)
HMBC spectrum의 측정 및 해석: HMBC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 도 28과 같이 5.06 ppm의 methine proton과 2.53/2.42 ppm의 methylene proton으로부터 173.1 ppm의 ester carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었고, 5.06 ppm의 oxygenated methine proton, 2.30, 1.62 ppm의 methylene proton으로부터 175.4 ppm의 ester carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었다. 또한, 2.49/2.40 ppm의 methylene proton으로부터 176.0 ppm의 carboxyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었다. 남은 3개의 ethyl group은 1.61 ppm의 methylene proton으로부터 32.9, 26.0 ppm의 methylene carbon에, 0.92 ppm의 methyl proton으로부터 32.9 ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되어 두 개의 3,5-dihydroxydecanoyl moiety가 규명되었다. 또한 2.30, 1.62 ppm의 methylene proton으로부터 각각 32.6, 23.5 ppm의 methylene carbon에, 0.92 ppm의 methyl proton으로부터 32.6, 23.5 ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되어 hexanoyl moiety가 확인되었다.
이상의 결과로부터 본 화합물 A-58-3의 화학구조를 도 29와 같이 결정하였다. 화학구조를 바탕으로 SciFinder database를 검색한 결과 동일한 화합물이 검색되지 않아 신규 화합물로 유추되었다. 도 30에 proton, carbon peak의 귀속(assignment)을 나타내었다.
다. 화합물 A-58-4의 화학구조
계면활성물질로 분리한 화합물 A-58-4의 화학구조를 규명하기 위하여 ESI-mass 및 1차원, 2차원 NMR spectrum을 측정, 해석하였다.
1) Mass spectrum의 측정 및 해석
본 화합물의 분자량을 밝히기 위하여 ESI-mass spectrum을 측정하였다. Positive mode에서 측정한 결과 [M+H]+가 m/z 503.3에서 관찰되어 분자량이 502로 확인되었다. 그러나 negative mode에서는 피크가 검출되지 않았다.(도 31)
2) NMR spectrum의 측정 및 해석
화합물 A-58-4의 화학구조를 규명하기 위하여 CD3OD에 녹여 1H NMR, 13C NMR 등 1차원 NMR, 1H-1H COSY, HMQC, HMBC 등 2차원 NMR spectrum을 측정하여 해석하였다.
1 H NMR spectrum의 측정 및 해석: 1H NMR spectrum을 측정한 결과, 도 32와 같이 5.03, 4.04 ppm에서 각각 2개씩 4개의 oxygenated methine proton, 3.65 ppm에서 한 개의 methoxy proton, 2.50/2.39, 2.50/2.37, 2.28, 1.77/1.70 (×2), 1.60, 1.58 (×2), 1.23-1.36 (×8) ppm에서 16개의 methylene 및 0.89 ppm에서 3개의 methyl기에 유래하는 proton들이 관찰되었다.
13 C NMR spectrum의 측정 및 해석: 13C NMR spectrum을 측정한 결과, 도 33과 같이 총 27개의 탄소가 관찰되었다. 즉 175.2, 173.7, 173.0 ppm에서 3개의 ester carbonyl carbon, 73.2, 72.8, 66.7, 66.7 ppm에서 4개의 oxygenated methine carbon, 52.1 ppm에서 methoxy carbon, 43.4, 43.0, 42.3 (×2), 35.5, 35.1 (×2), 32.8 (×2), 32.5, 25.9 (×3), 23.6 (×2), 23.4 ppm에서 16개의 methylene carbon 및 14.3 ppm에서 3개의 methyl carbon이 관찰되었다.
1 H- 1 H COSY spectrum의 측정 및 해석: 화합물 A-58-4의 부분구조를 규명하기 위하여 3 J H-H의 상관관계를 규명할 수 있는 1H-1H COSY spectrum을 측정하여 해석하였다. 그 결과 도 34 및 도 35에 나타낸 6개의 부분구조 -CH2-CH(-O)-CH2-CH(-O)-CH2-CH2-, -CH2-CH(-O)-CH2-CH(-O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, CH3-CH2-, CH3-CH2-, CH3-CH2-를 규명하였다.
HMQC spectrum 및 HMBC spectrum의 측정 및 해석: HMQC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 도 36과 같이 모든 proton-bearing carbon (1 J C-H)을 규명할 수 있었다.
또한 HMBC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 도 37과 같이 3.65 ppm의 methoxy proton과 2.51/2.39 ppm의 methylene proton으로부터 173.7 ppm의 ester carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었고, 5.03 ppm의 oxygenated methine proton, 2.50/2.37 ppm의 methylene proton, 4.04 ppm의 oxygenatedㅌ methine proton으로부터 173.0 ppm의 ester carbonyl carbon에, 또한 5.03 ppm의 oxygenated methine proton, 2.28, 1.60 ppm의 methylene proton으로부터 175.2 ppm의 ester carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었다.
남은 3개의 ethyl group은 1.58 ppm의 methylene proton으로부터 32.8, 25.9 ppm의 methylene carbon에, 0.89 ppm의 methyl proton으로부터 32.8 ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되어 3,5-dihydroxydecanoyl methyl ester moiety와 3,5-dihydroxydecanoyl moiety가 규명되었다. 그리고 2.28, 1.60 ppm의 methylene proton으로부터 각각 32.5, 23.4 ppm의 methylene carbon에, 0.89 ppm의 methyl proton으로부터 32.5, 23.4 ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되어 hexanoyl moiety가 확인되었다.
이상의 결과로부터 화합물 A-58-4의 화학구조를 아래의 도 38과 같이 결정하였다. 화학구조를 바탕으로 SciFinder database를 검색한 결과 동일한 화합물이 검색되지 않아 신규 화합물로 유추되었다. 도 39에 화합물 A-58-4의 proton, carbon peak의 귀속을 나타내었다.
라. 화합물 A-58-9의 화학구조
계면활성물질로 분리한 화합물 A-58-9의 화학구조를 규명하기 위하여 ESI-mass 및 1차원, 2차원 NMR spectrum을 측정, 해석하였다.
1) Mass spectrum의 측정 및 해석
본 화합물의 분자량을 밝히기 위하여 ESI-mass spectrum을 측정하였다. Positive mode에서 측정한 결과 [M+H]+가 m/z 317.2에서 관찰되어 분자량이 316으로 확인되었다. Negative mode에서는 피크가 검출되지 않았다.(도 40)
2) NMR spectrum의 측정 및 해석
화합물 A-58-9의 화학구조를 규명하기 위하여 CD3OD에 녹여 1H NMR, 13C NMR 등 1차원 NMR, 1H-1H COSY, HMQC, HMBC 등 2차원 NMR spectrum을 측정하여 해석하였다.
1 H NMR spectrum의 측정 및 해석: 1H NMR spectrum을 측정한 결과, 도 41과 같이 5.04, 4.07 ppm에서 2개의 oxygenated methine proton, 3.67 ppm에서 한 개의 methoxy proton, 2.54/2.41, 2.30, 1.80/1.71, 1.62, 1.60, 1.25-1.37 (×5) ppm에서 10개의 methylene 및 0.90 ppm에서 2개의 methyl기에 유래하는 proton들이 관찰되었다.
13 C NMR spectrum의 측정 및 해석: 13C NMR spectrum을 측정한 결과, 도 42와 같이 총 17개의 탄소가 관찰되었다. 즉 175.3, 173.6 ppm에서 2개의 ester carbonyl carbon, 72.7, 66.6 ppm에서 2개의 oxygenated methine carbon, 52.1 ppm에서 methoxy carbon, 42.9, 42.3, 35.4, 35.1, 32.7, 32.4, 25.9 (×2), 23.6, 23.4 ppm에서 10개의 methylene carbon 및 14.3 ppm에서 2개의 methyl carbon이 관찰되었다.
1 H- 1 H COSY spectrum의 측정 및 해석: 화합물 A-58-9의 부분구조를 규명하기 위하여 3 J H-H의 상관관계를 규명할 수 있는 1H-1H COSY spectrum을 측정하여 해석하였다. 그 결과 도 43 및 도 44에 나타낸 4개의 부분구조 -CH2-CH(-O)-CH2-CH(-O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, CH3-CH2-, CH3-CH2-를 규명하였다.
HMQC spectrum 및 HMBC spectrum의 측정 및 해석: HMQC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 도 45와 같이 모든 proton-bearing carbon (1 J C-H)을 규명할 수 있었다.
또한 HMBC spectrum을 측정하여 해석한 결과, 도 46과 같이 3.67 ppm의 methoxy proton과 2.54/2.41 ppm의 methylene proton으로부터 173.6 ppm의 ester carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었고, 5.04 ppm의 oxygenated methine proton과 2.30, 1.62 ppm의 methylene proton으로부터 175.3 ppm의 ester carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었다. 또한 1.60 ppm의 methylene proton으로부터 32.7, 25.9 ppm의 methylene carbon에, 0.90 ppm의 methyl proton으로부터 32.7 ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되어 3,5-dihydroxydecanoyl methyl ester moiety가 규명되었다. 2.30, 1.62 ppm의 methylene proton으로부터 각각 32.4, 23.4 ppm의 methylene carbon에, 0.90 ppm의 methyl proton으로부터 32.4, 23.4 ppm의 methylene carbon에 long-range correlation이 관찰되어 hexanoyl moiety가 확인되었다.
이상의 결과로부터 화합물 A-58-9의 화학구조를 도 47과 같이 결정하였다. 화학구조를 바탕으로 SciFinder database를 검색한 결과 동일한 화합물이 검색되지 않아 신규 화합물로 유추되었다. 도 48에 화합물 A-58-9의 proton, carbon peak의 귀속을 나타내었다.
실험예 1. 표면 장력 시험
표면장력은 A-58-1, A58-3, A58-4, A58-9의 5,000 ppm에서 각각 30.31 dyne/cm, 31.15 dyne/cm, 33.72 dyne/cm, 33.83 dyne/cm (표면장력계, Sigma 700 Tensiometer, KSV Instruments Ltd., Finland)로 측정되었으며 매우 낮은 표면장력을 보였다.
또한 Drop collapse test 결과는 도 49와 같이, 물과 비교했을 때 생물학적 계면활성제는 그 효과가 뛰어남을 알 수 있다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
한국생명공학연구원 KCTC13895BP 20190725

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표기되는 화합물.
    [화학식 1]
    Figure pat00017

  2. 하기 화학식 2로 표기되는 화합물.
    [화학식 2]
    Figure pat00018

  3. 하기 화학식 3으로 표기되는 화합물.
    [화학식 3]
    Figure pat00019

  4. 하기 화학식 4로 표기되는 화합물.
    [화학식 4]
    Figure pat00020

  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 분리된 것인 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 생물학적 계면활성제용 조성물.
  7. 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 1의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00021

  8. 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 2의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure pat00022

  9. 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 3의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법.
    [화학식 3]
    Figure pat00023

  10. 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP)로부터 하기 화학식 4의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법.
    [화학식 4]
    Figure pat00024

  11. 하기 화학식 1 내지 4의 화합물 중 어느 하나 이상을 생산하는 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A11231-1-58 (기탁번호 KCTC 13895BP) 균주.
    [화학식 1]
    Figure pat00025

    [화학식 2]
    Figure pat00026


    [화학식 3]
    Figure pat00027


    [화학식 4]
    Figure pat00028

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Putative fatty acid elongase (ELO) gene (National Center for Biotechnology Information (NCBI) genome sequence database GenBank, 2015.09.11., [online]. *

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