KR101627351B1

KR101627351B1 - 오리오바시디움 균주로부터 분리된 신규한 생물학적 계면활성제

Info

Publication number: KR101627351B1
Application number: KR1020150124643A
Authority: KR
Inventors: 김종식
Original assignee: 재단법인 경북해양바이오산업연구원
Priority date: 2015-09-03
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2016-06-07

Abstract

본 발명은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A08174-1-37 KCCM11648P 균주로부터 생산되는 생물학적 계면활성제의 활성을 가지는 신규 화합물에 관한 것이다.
생물학적 계면활성제의 활성성분을 가지는 화합물의 구조를 분광법을 이용하여 확인하였다.
본 발명의 생물학적 계면활성제의 활성성분은 다양한 용도로 이용이 가능하며, 예컨대 세정 및 정화용 조성물 등으로 이용할 수 있으며, 그 이외에도 의약품, 식품, 화장품, 육상과 해상의 유류 오염 정화, 처리조의 유지방 분해 등 화학합성 계면활성제가 사용되는 대부분의 다양한 산업분야에서 사용할 수 있다.

Description

오리오바시디움 균주로부터 분리된 신규한 생물학적 계면활성제{A NEW BIOSURFACTANT ISOLATED FROM AUREOBASIDIUM PULLULANS}

본 발명은 오리오바시디움에서 분리된 신규한 화합물 및 이들의 계면활성제로서의 용도에 관한 것이다.

계면활성제는 의약학, 농업, 향장산업 등의 다양한 산업에서 폭넓게 활용되고 있다.

현재 상업적으로 이용되는 계면활성제는 대부분 석유로 만든 화학합성 계면활성제로서 그 생산량은 세계적으로 매년 약 1천만톤에 이른다. 이와 같은 계면활성제는 화학합성으로 제조하기 때문에 그 과정에서 오염원이 배출되는 등의 문제점이 있었다.

따라서 최근 환경오염에 대한 인식의 확대와 친환경소재에 대한 선호도의 증가에 따라 이를 대체할 수 있는 환경친화적인 계면활성제의 개발이 시급한 실정이다.

최근 생물공학의 발달은 미생물의 biosurfactant(생물학적 계면활성제)를 그 대안으로 급부상시켰다.

생물학적 계면활성제는 미생물이 생산하는 양친매성 물질로서 생분해성 계면활성제를 의미한다.

생물학적 계면활성제는 화학합성 계면활성제와 비교하여 생분해가 가능하고, 극한의 온도나 pH에서 활성을 유지하며, 독성이 낮고, 발효에 의한 대량생산이 가능하다는 장점이 있다.

이에 생물학적 계면활성제는 원유 회수, 의약품 및 식품산업, 화장품, 비누, 경피용 DDS(drug delivery system) 등 다양한 산업에서의 활용 가능성이 대두되어 그에 따른 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근까지 미생물로부터 수종의 계면활성제가 분리되어 이용되고 있으나 더 강한 효과를 나타내는 다양한 종의 미생물 확보 및 이로부터 강력한 생물학적 계면활성제의 발굴이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자는 한국등록번호 10-1446219호, 한국등록번호 10-1365711호, 한국등록번호 10-1278272호 등 균주로부터 분리한 신규한 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도를 여럿 밝혀온 바 있다.

본 발명은 위의 연구에서 더 나아가 강력한 생물학적 계면 활성을 지닌 새로운 미생물소재를 탐색 및 발견하고, 이로부터 활성성분을 분리, 정제한 뒤, 분광분석방법으로 화학구조를 규명한 것이다.

본 명세서는 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌을 참조하고, 그 인용을 표시하였다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용을 명확하게 설명하는데 활용될 수 있다.

한국등록번호 10-1446219호 한국등록번호 10-1365711호 한국등록번호 10-1278272호

본 발명자들은 천연물 기반 계면활성제로서 인체에 안전하고, 강력한 계면활성 효과를 나타내는 화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 효모로부터 분리된 신규한 화합물이 뛰어난 계면활성 효과를 보유한다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 효모로부터 분리된 신규한 화합물 및 이들의 생물학적 계면활성제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 생물학적 계면활성제는 강력한 계면활성 효과를 보유하며, 생분해가 가능하고 독성이 낮아 인체에 안전하다. 또한, 본 발명의 생물학적 계면활성제는 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하여 환경 친화적이다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 계면활성제로서의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 효모로부터 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다.

화학식 1

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화합물은 균주로부터 분리된 것이다.

본 발명에서 이용할 수 있는 균주는 당업계에 알려진 다양한 균주를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 오리오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 균주, 보다 바람직하게는 기탁번호 KCCM11648P의 오리오바시디움 속 균주이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화합물은 생물학적 계면활성제로서 특징을 갖는다.

생물학적 계면활성제는 종래의 화학합성 계면활성제와 비교하여 낮은 독성 및 높은 생분해 효과에 의해 종래의 환경오염 문제를 극복할 수 있다. 또한, 생물학적 계면활성제는 기존의 방법으로는 합성하기 어려운 복잡한 화학구조를 갖고 있어 특수한 목적으로 사용될 수 있고, 표면장력 저하능력, 온도, pH에 대한 안정성 등 계면활성제의 물리·화학적 면에서 기존의 화학합성 계면활성제와 거의 대등한 효과를 갖고 있어 사용가치가 매우 높다(Ishigami et al., 1987. Chem . Lett ., 763).

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 세정 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 생물학적 계면활성제로서 사용될 수 있는 화합물은 강력한 계면활성 효과를 보유하고 있으며, 특히 직물의 세척 및 세정 적용을 위해 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 계면활성제는 경질 표면의 세정 및 광택을 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 생물학적 계면활성제로서 사용될 수 있는 화합물은 비누, 샴푸, 크림 또는 로션에서 유화제로서 유리하게 사용될 수 있다.

상기 용도 외에도 본 발명의 화합물은 의약품, 식품, 원유의 2차 회수, 펄프와 제지 산업, 육상과 해상의 유류 오염 정화, 처리조의 유지방 분해 등 화학합성 계면활성제가 사용되는 대부분의 다양한 산업분야에서 사용될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A08174-1-37 KCCM11648P 균주로부터 상기 화학식 1의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 생산하는 오리오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 균주 (기탁번호: KCCM11648P)를 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 효모로부터 분리된 신규한 화합물을 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 화합물의 생물학적 계면활성제로서의 용도를 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 생물학적 계면활성제는 강력한 계면활성 효과를 보유하며, 생분해가 가능하고 독성이 낮아 인체에 안전하다. 또한, 본 발명의 생물학적 계면활성제는 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하여 환경 친화적이다.

도 1은 활성성분의 분리 및 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 활성성분 A37-1의 ESI-mass spectrum을 나타낸 도면이다.
도 3은 활성성분 A37-1의 ¹H NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 4는 활성성분 A37-1의 ¹³C NMR spectrum을 나타낸 도면이다.
도 5는 활성성분 A37-1의 ¹H-¹H COSY spectrum을 나타낸 도면이다.
도 6은 ¹H-¹H COSY spectrum에 의하여 규명된 화합물 A37-1의 부분구조를 나타낸 도면이다.
도 7은 활성성분 A37-1의 HMQC spectrum을 나타낸 도면이다.
도 8은 활성성분 A37-1의 HMBC spectrum을 나타낸 도면이다.
도 9는 2-Dimensional NMR spectrum에 의하여 규명된 화합물 A37-1의 화학구조를 나타낸 도면이다.
도 10은 활성성분 A37-1의 proton 및 carbon peak assignment을 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 발명의 요지가 변경되지 않는 한 다양한 형태로 변형될 수 있다. 그러나 본 발명의 권리범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되면 공지 구성 및 기능에 대한 설명은 생략한다. 본 명세서에서 "포함"한다는 것은 특별한 기재가 없는 한 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명에서 사용한 분석기기는 다음과 같다.

질량분석 스펙트럼(mass spectrum)의 측정

FAB-mass는 Jeol(Japan)사의 JMS-700 MSTATION mass spectrometer를 사용하였으며, mass 측정 시 matrix로는 glycerol 혹은 m-nitrobenzyl alcohol을 사용하였다. High-resolution FAB-mass 측정 시 internal standard로서 polyethylene glycol을 사용하였다.

핵자기공명 스펙트럼(NMR spectrum)의 측정

핵자기공명 스펙트럼은 JEOL사(Japan)의 JNM-ECA600 600MHz FT-NMR spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 TMS(tetramethylsilane)를 사용하였다. 용매로는 CDCl₃를 사용하였으며, chemical shift는 ppm(δ)으로 나타내었다. NMR spectrum은 ¹H NMR, ¹³C NMR 등의 1차원 NMR(one-dimensional NMR)을 비롯하여 ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC 등의 2차원 NMR(two-dimensional NMR)을 측정하였다.

시약

각 정제과정 및 column chromatography에서 사용한 hexane, ethyl acetate, chloroform, methanol, acetone 등의 용매는 SK케미칼(Korea), 대정화금(Korea) 제품을, HPLC 용매는 Merck(Germany), Baxter(Burdick & Jackson, USA) 제품을 사용하였고, NMR 용매인 CDCl₃ 등은 Aldrich(USA) 제품을 사용하였다. 물질의 분리 및 정제를 위하여 순상 TLC(Merck, Kieselgel 60F, 70-230 mesh, USA) 및 역상 TLC (Merck, RP-18, F₂₅₄, USA), Sephadex LH-20(Pharmacia, bead size 25-100 ㎛, Sweden), ODS sep-pak cartridge(Alltech, RP-18, USA) 등을 사용하였다.

본 발명에 있어서 균주의 선별, 활성성분의 분리 시 계면활성제로서의 활성은 물에 녹인 시료 또는 화합물 20 μL를 파라필름에 loading하여 퍼지는 정도로 측정하였다. 이때 동량의 증류수를 비교구로 사용하였다.

실시예1 :균주의 선별

계면활성제의 활성성분을 생산할 수 있는 균주를 분리하기 위하여 제주도 해안에서 순비기나무(학명:Vitex rotundifolia)를 채취하였다. 상기 순비기나무에서 꽃을 회수하여 균주 분리를 위한 시료로 준비하였다.

상기 시료를 10 mM 인산완충액(potassium phosphate buffer)을 사용하여 3회 세정한 뒤 멸균된 용기에 담았다.

균주 분리용 배지로 GPY agar (glucose 4%, peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, agar 1.5%)를 사용하였다. 이 때 세균의 억제를 위해 상기 배지에 클로람페니콜(chloramphenicol) 100 mg/L, 스트렙토마이신(streptomycin) mg/L를 첨가하였다. 또한 곰팡이의 생육을 억제하기 위해 트리톤(Triton) X-10 0 0.1% 및 소르보스(L-sorbose) 0.4%를 첨가하였다.

상기 시료 1 mL를 상기 배지에 도말한 후 25℃에서 2 ~ 5 일간 배양하였다. 상기 배지에 형성된 콜로니를 분리하여 활성을 측정함으로써 높은 수치를 나타낸 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A08174-1-37 KCCM11648P(이하, '오리오바시디움 플루란스 A-37'이라 함)를 선별하였다. 상기 오리오바시디움 플루란스 A-37은 2014년 12월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁되었다(기탁번호: KCCM11648P).

실시예2 :균주의 배양

상기 오리오바시디움 플루란스 A-37의 활성을 비교한 결과 M2배지(glucose 4%, KH₂PO₄ 0.03%, MgSO₄·7H₂O 0.03%, NaNO₃ 0.3%, Yeast extract 0.1%)에서 더 높은 수치를 보였다. 이에 상기 오리오바시디움 플루란스 A-37을 대량으로 생산하기 위해서 M2배지로 25℃에서 호기 조건으로 6일간 배양하였다.

배양액을 원심분리하여 얻은 상등액에 같은 양의 에탄올을 첨가하고 교반한 뒤 하루 동안 방치하였다. 이 후 다당류로 보이는 부유물 및 침전물을 체로 걸러 제거하였다. 다시 한 번 원심분리하여 상등액을 취하였다. 이를 농축 및 동결건조하였다.

실시예3 :활성성분의 분리 및 정제

상기 오리오바시디움 플루란스 A-37의 배양상등액에서 활성성분을 분리, 정제하는 과정을 도 1에 도시하였다. 구체적인 내용은 아래와 같다.

상기 오리오바시디움 플루란스 A-37의 배양상등액을 동결건조한 시료를 물에 녹인 후 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 부가하여 추출하였다. 에틸아세테이트 층을 감압 농축한 후 chloroform : methanol(50:1 → 1:1, v/v)을 용출용매로 하여 flash normal phase(silica gel) column chromatography를 수행하였다. 각 분획물에 대하여 활성을 평가한 결과 chloroform : methanol (20:1, v/v) 용출분획에서 활성을 나타내었다.

활성분획을 농축한 후 메탄올 수용액(10% → 90%)을 용출용매로 하여 ODS column chromatography를 수행하였다. 각 분획물에 대하여 활성을 평가한 결과 메탄올 수용액(80%) 용출분획에서 활성을 나타내었다.

활성분획을 메탄올을 용출용매로 하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행하였다. 이어 10% 메탄올 수용액으로 시작하여 90% 메탄올 수용액에 이를 때까지 점진적으로 메탄올의 함량을 증가시키며 ODS medium pressure liquid chromatography를 수행하였다. 마지막으로 50% 아세토니트를(Acetonitrile) 수용액을 용출용매로 하여 preparative HPLC를 수행하여 활성이 가장 높은 화합물 A37-1(이하, '활성성분 A37-1'이라 함)을 분리, 정제하였다.

실시예4 :활성성분 A37-1의 화학구조 해석

활성성분 A37-1의 분자량을 밝히기 위해 ESI-mass spectrum을 측정하였고, 화학구조를 규명하기 위해 ¹H NMR, ¹³C NMR 등의 1차원 NMR과 ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC 등의 2차원 NMR spectrum을 측정하였다.

1) ESI -mass spectrum의 측정 및 해석

상기 활성성분 A37-1의 ESI-mass spectrum의 결과는 도 2와 같다. [M+H]⁺가 m/z 805.3에서 관찰되었다. 이에 따라 상기 활성성분 A37-1의 분자량은 782임을 알 수 있었다.

2) NMR(Nuclear Magnetic Resonance) 스펙트럼의 측정 및 해석

활성성분 A37-1을 CD₃OD에 녹인 후 ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC spectrum을 측정하였다.

¹ H NMR spectrum의 측정 및 해석 : ¹H NMR spectrum을 측정한 결과를 도 3에 도시하였다.

- 5.05(×3), 4.05(×3), 3.88, 3.78, 3.77, 3.68 ppm에서 열 개의 oxygenated methine,

- 3.81/3.64, 4.40/4.20 ppm에서 두 개의 oxygenated methylene,

- 1.2 - 2.6 ppm 사이에서 18 개의 methylene, 2.01, 0.90(×3) ppm에서 네 개의 methyl 기에 유래하는 proton이 관찰되었다.

¹³ C NMR spectrum의 측정 및 해석 : ¹³C NMR spectrum을 측정한 결과를 도 4에 도시하였다.

총 38개의 피크가 관찰되었으나, 매우 겹쳐진 상태임을 알 수 있다. 이에 탄소수의 예측은 HMQC spectrum과 병행하여 해석한 결과로부터 유추할 수 있었다.

- 173.5, 173.0(×2), 172.7 ppm에서 네 개의 ester carbonyl carbon,

- 73.3(×2), 73.1, 72.9, 71.0(×2), 70.3, 66.8(×3) ppm에서 열 개의 oxygenated methine carbon,

- 67.9, 65.1 ppm에서 두 개의 oxygenated methylene carbon,

- 23-44 ppm 사이에서 18개의 methylene carbon,

- 21.2, 14.4(×3) ppm에서 네 개의 methyl carbon이 관찰되었다.

¹ H- ¹ H COSY spectrum의 측정 및 해석 : 활성성분 A37-1의 화학구조를 규명하기 위해 상호 이웃한 수소간의 상관관계(³ J _H _-H)를 규명할 수 있는¹H-¹H COSY spectrum을 측정하였다. 그 결과를 도 5에 도시하였다.

3.81/3.64 ppm의 oxygenated methylene proton과 3.68 ppm의 methine proton, 3.68 ppm의 methine proton과 3.78 ppm의 methine proton, 3.78 ppm의 methine proton과 3.77 ppm의 methine proton, 3.77 ppm의 methine proton과 3.88 ppm의 methine proton, 3.88 ppm의 methine proton과 4.40/4.20 ppm의 methylene proton 사이에서 correlation 관찰되어 mannitol moiety가 밝혀졌다. 또한 세 개의 3,5-dihydroxydecanoyl moiety의 존재가 규명되었다.

도 6은 최종적으로 구조가 규명된 상기 활성성분 A37-1의 화학구조에서 본 ¹H-¹H COSY spectrum을 통해 해석된 mannitol moiety과 3,5-dihydroxydecanoyl moiety를 표시한 것이다. 각각 A 및 B에서 굵게 표시된 부분에 해당한다.

HMQC spectrum의 측정 및 해석 : 활성성분 A37-1의 화학구조를 규명하기 위하여 수소-탄소간의 상관관계(¹ J _C _-H)를 규명할 수 있는HMQC spectrum을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 도시하였다.

전술한 바와 같이 ¹³C NMR spectrum의 결과와 병행하여 상기 활성성분 A37-1을 구성하는 모든 수소와 탄소 간의 상관관계를 규명할 수 있었다.

HMBC spectrum의 측정 및 해석 : 활성성분 A37-1의 화학구조를 규명하기 위하여 수소-탄소간의 2-bond 혹은 3-bond 결합 관계(² J _C _-H, ³ J _C _-H)를 규명할 수 있는HMBC spectrum을 측정하였다. 그 결과를 도 8에 도시하였다.

- mannitol moiety를 구성하는 4.40/4.20 ppm의 methylene proton으로부터 173.5 ppm의 carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었고, 5.05 ppm의 oxygenated methine proton으로부터 이웃한 3,5-dihydroxydecanoyl moiety의 carbonyl carbon에 long-range correlation이 관찰되었다. 이들 결과로부터 본 화합물은 mannitol 구조에 세 개의 3,5-dihydroxydecanoyl moiety가 연속적으로 결합한 화합물임을 알 수 있었다.

- acetyl moiety는 세 번째 3,5-dihydroxydecanoyl moiety의 5번 위치에 결합되어 있음을 알 수 있었다. 즉, 5번 위치에 acetyl moiety가 결합되지 않은 경우 수소는 3.7 ppm, 탄소는 69 ppm 부근의 고자장 영역에서 관찰되어야 한다. 그러나 본 결과에 따르면 수소는 5.05 ppm, 탄소는 73 ppm 부근에서 관찰되어 acetyl moiety가 결합된 경우의 수소 및 탄소의 chemical shift와 완벽하게 일치하였다.

이상의 결과로부터 활성성분 A37-1의 화학구조를 도 9와 같이 결정하였다. 또한 각각의 proton 및 carbon peak의 귀속을 그림 10에 나타내었다.

전술한 ESI-mass spectrum 결과에 따르면 상기 활성성분 A37-1의 분자량은 782로 측정되었다. 이는 NMR 분광분석에 의해 결정된 도 9의 화학구조와 잘 일치함을 알 수 있다.

이상으로 본 발명에 대해 상세히 설명하였다. 다만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않고, 이하의 특허청구범위에 의해 정해진다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11648P

20141217

Claims

하기 화학식 1로 표기되는 화합물.
[화학식 1]
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 효모로부터 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A08174-1-37 KCCM11648P 균주로부터 분리되는 화합물.
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 생물학적 계면활성제인 화합물.
오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A08174-1-37 KCCM11648P 균주로부터 하기 화학식 1의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 계면활성제의 제조방법;
[화학식 1]
하기 화학식 1의 화합물을 생산하는 오리오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) A08174-1-37 KCCM11648P 균주.
[화학식 1]