KR20210115528A - 분지형 dna 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체로 구성된 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 면역 증진용 조성물 - Google Patents

분지형 dna 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체로 구성된 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 면역 증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분지형 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물, 이로 구성된 복합체 및 이의 면역 증진 용도에 관한 것으로, DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체의 조합이 수지상 세포를 활성화하여 면역 반응을 증진할 뿐만 아니라, 이로 인해 활성화된 수지상 세포가 T 세포의 활성화를 증진하여 면역 반응이 향상되는 것을 확인하였고, 동물 모델에서 면역 반응이 증진되고 항암 효과가 향상되는 것을 확인함으로써, 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물을 면역 증진용, 또는 면역결핍 질환의 예방 또는 치료용 제제로 제공한다.

Description

분지형 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체로 구성된 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 면역 증진용 조성물{A complex consisting of branched DNA dendrimer and reducible polycations, and a composition comprising the complex for enhancing immunity}
본 발명은 분지형 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물, 이로 구성된 복합체 및 이의 면역 증진 용도에 관한 것이다.
면역은 체내에서 외래성 및 내인성 이물질을 생리적으로 인식하고, 이를 제거 및 대사시키는 자기 방어 반응이다. 면역 반응은 초기 면역반응인 선천성 면역반응(innate immunity)과 후기 면역반응인 후천성 면역반응(acquired immunity)으로 구분될 수 있다. .
선천성 면역반응은 자연 면역이라고도 하며, 일반적으로 모든 감염원에 비특이적으로 반응하여 제거하기 위해 나타나는 염증과 같은반응을 일컫는다. 후천성 면역반응은 감염원에 의한 선천성 면역반응 후에 면역 세포들에 의해 유도되는 세포 분열로 나타나는 면역 형태이다. 그러나 일부 환자들은 면역 세포들이 분화되지 않거나, 감염원을 인식하지 못하는 등의 면역 결핍으로 감염원을 제거하지 못하여 질병이 유발되고 있다.
일반적으로, 면역 결핍(immunodeficiency) 현상이 지속되면, 감염에 대한 저항력이 저하되고, 항체가 생성되지 않아 세균에 의한 감염을 방어할 수 없으며, 호중구의 탐식작용 능력도 저하되어 다양한 면역결핍 질환이 발병한다 이 경우에는 보체계(complement system) 활성화 반응도 저하되기 때문에 백혈구 유주인자 등이 생성되지 않아, 염증발생율이 높아지고, 바이러스 혈증이 일어나 중추신경이나 다른 곳으로 확산되기도 한다. 암 환자의 경우, 화학요법이나 방사선치료 과정에서 암 세포뿐만 아니라 정상세포까지 영향을 줌으로써 환자의 면역력이 급격히 저하되는 부작용이 발생하기도 한다. 따라서 이러한 면역결핍 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위해서는 다양한 형태의 면역 증진제가 개발되고 있다.
한편, 독특한 형태의 DNA는 보호 면역, 알레르기 반응 감소, 백신 반응 보조제 및 암 면역 요법 등의 제제로 연구되어 왔다. 최근 임상 연구에서는 DNA의 몇몇 모형은 흑색종, 유방암, 난소암 및 림프종을 포함하는 암, 말라리아 감염, 및 폐염의 치료를 위한 제제로 연구되고 있다.
본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 특정 형태의 DNA 덴드리머가 면역 세포의 사이토카인 분비를 증진하는 활성이 있는 것을 확인하고, 이의 효과를 증진하기 위해 DNA 덴드리머와 환원성 양성자 중합체를 조합하였을 때에 면역 세포가 활성화되고, 면역 반응이 증진되며, 동물 모델에서 치료 효과가 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 분지형 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물, 이로 구성된 복합체 및 이의 면역 증진 용도에 관한 것으로, DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체의 조합이 수지상 세포를 활성화하여 면역 반응을 증진할 뿐만 아니라, 이로 인해 활성화된 수지상 세포가 T 세포의 활성화를 증진하여 면역 반응이 향상되는 것을 확인하였고, 동물 모델에서 면역 반응이 증진되고 항암 효과가 향상되는 것을 확인함으로써, 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물을 면역 증진용 조성물로 제공하는 것이다.
본 발명은 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체의 조합이 수지상 세포를 활성화하여 면역 반응을 증진할 뿐만 아니라, 이로 인해 활성화된 수지상 세포가 T 세포의 활성화를 증진하여 면역 반응이 향상되는 것을 확인하였고, 동물 모델에서 면역 반응이 증진되고 항암 효과가 향상되는 것을 확인함으로써, 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물을 면역 증진용, 또는 면역결핍 질환의 예방 또는 치료용 제제로 제공할 수 있다.
도 1은 환원성 양이온 중합체인 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, bPEI)이 형성되는 과정을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 복합체가 수지상 세포에서 INF-β의 분비에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다. RPC는 환원성 양이온 중합체인 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, RPC-bPEI)이고, XbDNA는 CpG 모티프가 없는 X-분지형 DNA이고, YbDNA는 CpG 모티프가 없는 Y-분지형 DNA이고, CXbDNA는 CpG 모티프가 있는 X-분지형 DNA이고, CYbDNA는 CpG 모티프가 있는 Y-분지형 DNA이다.
도 3은 본 발명에 따른 복합체의 입자 크기, 다분산지수(polydispersity index, PI), 및 제타(ζ) 전위를 측정한 그래프 및 표이다.
도 4는 본 발명에 따른 복합체가 수지상 세포 내로 도입되는 정도를 평가한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
도 5는 본 발명에 따른 복합체가 수지상 세포에서 면역 활성화 지표의 발현에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
도 6은 본 발명에 따른 복합체가 수지상 세포에서 표면 단백질 CD80 발현에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
도 7은 본 발명에 따른 복합체가 수지상 세포에서 IRF3 전사인자의 인산화에 미치는 영향을 평가한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 복합체를 처리한 수지상 세포가 CD8 T 세포의 IFN-γ 분비에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
도 9는 본 발명에 따른 복합체가 T 세포에서 TLR9 경로에 미치는 영향을 면역 블로팅(immunoblotting)으로 확인한 사진이다.
도 10은 본 발명에 따른 복합체가 야생형 또는 TLR9 녹아웃 마우스로부터 분리된 수지상 세포에 미치는 영향을 확인한 면역 블로팅(immunoblotting) 사진 및 면역 사이토카인 분비량을 측정한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
도 11은 본 발명에 따른 복합체가 흑색종 동물 모델에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험 설계도이다.
도 12는 본 발명에 따른 복합체가 흑색종 동물 모델의 종양 부피에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
도 13은 본 발명에 따른 복합체가 흑색종 동물 모델의 종양 무게에 미치는 영향을 평가한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
도 14는 본 발명에 따른 복합체가 흑색종 동물 모델에서 면역 세포의 활성을 평가하기 위한 마커를 측정한 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내며, *은 비히클(vehicle) 대비 P<0.05 유의하게 다른 것을 표시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 분지형 구조의 DNA는 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머이며, 구체적으로 상기 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 나타내는 뉴클레오타이드들의 상보적 결합에 의해 형성된다. 서열번호 1, 3, 및 5는 36개의 염기서열로 구성되고, 서열번호 2, 4, 및 6은 108개의 염기서열로 구성되며, 서로 상보적인 결합에 의해 도 1로 표현되는 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머를 형성한다.
구체적으로 상기 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머는 (1) 서열번호 1의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열과 서열번호 6의 91번부터 108번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (2) 서열번호 1의 19번부터 36번까지 18개의 염기서열과 서열번호 2의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (3) 서열번호 2의 19번째부터 54번까지 36개의 염기서열과 서열번호 6의 55번부터 90번까지 36개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (4) 서열번호 2의 55번부터 90번까지 36개의 염기서열과 서열번호 4의 19번부터 54번까지 36개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (5) 서열번호 2의 91번부터 108번까지 18개의 염기서열과 서열번호 3의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (6) 서열번호 3의 19번부터 36번까지 18개의 염기서열과 서열번호 4의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (7) 서열번호 4의 55번부터 90번까지 36개의 염기서열과 서열번호 6의 19번부터 54번까지 36개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (8) 서열번호 4의 91번부터 108번까지 18개의 염기서열과 서열번호 5의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고, (9) 서열번호 5의 19번부터 36번까지 18개의 염기서열과 서열번호 6의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1 내지 6의 염기서열은 5’부터 3’으로 순서가 매겨지며, 서로 상보적인 결합을 통해 도 1로 표현되는 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머가 형성될 수 있다.
상기 DNA 덴드리머는 규칙적인 가지 구조를 가지는 DNA 분자로, 중심의 Y형 또는 X형 구조를 가지며, 각 구조의 끝에 중심 구조와 동일한 형태로 가지를 형성한 형태를 의미한다.
상기 분지형 구조의 DNA 덴드리머는 면역 세포의 면역성 사이토카인의 분비를 증가시켜 면역 반응을 유도할 수 있으며, 구체적으로 수지상 세포의 사이토카인 IFN-β, IL-12 및 케모카인 CXCL10 분비를 증가시키고, CD80의 발현이 증가하여 면역 반응을 유도한다. 또한, 상기 DNA 덴드리머는 TLR9와 직접적으로 결합하여 면역 반응을 유도할 수 있으며, 이로 인해 활성화된 수지상 세포는 T 세포의 면역 반응을 활성화할 수 있다.
상기 환원성 양이온 중합체(RPC)는 형질 감염의 효율을 향상시키고, 세포 독성을 감소하기 위해 세포질에서 글루타티온에 의해 분해되도록 설계된 형질전환 중합체 시약(polymeric transfection reagent)이다. 구체적으로 환원성 양이온 중합체는 환원성 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, bPEI)일 수 있으며, 보다 구체적으로 환원성 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, bPEI)은 0.8 kDa의 크기를 가질 수 있다.
상기 조성물은 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 1 : 0.5 내지 1 : 5의 중량비로 포함할 수 있으며, 상기 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체가 결합되어 복합체를 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
상기 분지형 구조의 DNA 덴드리머는 TLR9에 결합하여 면역 반응을 유도할 수 있다.
상기 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체는 결합하여 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 복합체는 수지상 세포에서 IFN-β, IL-12, 또는 CXCL10의 분비를 증가시켜 면역 반응을 유도할 수 있고, 상기 복합체는 수지상 세포에서 CD80의 발현을 증가시켜 면역 반응을 유도할 수 있으며, 상기 수지상 세포는 상기 복합체를 인지하면, T 세포의 IFN-γ 분비를 유도 및 증가시키는 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 면역결핍 질환은 선천성 면역결핍증, 암, 만성바이러스 감염, 골수이식 후 면역결핍증, 박테리아 패혈증 또는 항암 치료 후 면역결핍증일 수 있으며, 상기 암은 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 갑상선암, 위 암종, 난소암, 간종양, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 자궁경부암, 백혈병 또는 림프종일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 면역력을 향상시켜서 치료해야 하는 질환들을 모두 포함한다.
상기 약학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 대상체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 병용 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 조성물으 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
이하, 실시예 등에서 사용한 시약은 시중에서 구할 수 있는 것으로, 최상품을 사용하였으며, 별도의 언급이 없는 한, Sigma-aldrich사에서 구입한 것을 사용하였다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험 동물 샘플
모든 동물은 국립 과학 아카데미(National Academy of Sciences)가 준비하고, 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 출판된 “실험실 동물의 치료 및 사용을 위한 가이드 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)”에 설명된 기준에 따라 인도적 치료를 받았다. 모든 실험 절차는 가톨릭대학교의 동물실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)가 승인한 의정서에 따라 수행되었다 (허가 번호 2016-004-02).
2. 입자 크기 및 제타 전위 측정
본 발명에 따른 복합체의 표면 전하 및 입자 크기를 실험실 온도 조건의 pH 7.4, 20 mM HEPES 완충액에서 제타 전위 및 크기 분석기(ELS-Z; Photal Otsuka Electronic Co., Osaka, Japan)를 사용하여 677 nm 파장 및 90°일정한 각도에서 측정하였다. 복합 용액에서 복합체의 농도는 1.5 μg/mL로 설정하였다.
3. 동물 및 세포 배양
동물 관리 및 연구 방법은 가톨릭대학교의 동물실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 지침에 따라 수행되었다(허가 번호 2012-5-001).
C57BL/6 마우스는 오리엔트바이오(서울, 한국)에서 구입하였으며, 실험 전 최소 1주일 동안 동물 시설에서 특정 병원균이 없는 조건하에서 적응하였다. 마우스는 23±3℃, 상대 습도 40% 내지 60% 조건으로 사육되었다. Balb/C TLR9 녹아웃(KO) 마우스는 강원도 한림대학교로부터 수득하였다.
수지상 세포(dendritic cells, cDCs)를 준비하기 위해, 골수 세포를 마우스로부터 분리하고, 10%(v/v) 열 불활성 태아 소 혈청(Life Technologies; Grand Island, NY, USA), 50 μM 2- mercaptoethanol, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민 및 3% J558L 하이브리도마 세포 배양 상급제 과립(과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GMCSF) 함유)을 포함하는 RPMI1640 배지에 6 일 동안 배양하였다. 비부착 세포는 수지상 세포 (DC)로 사용하였다.
HEK293T 세포(인간 배아 신장 세포) 및 B16/F10 세포(마우스 피부 흑색종 세포)는 10% 태아 소 혈청, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco’s 변형된 eagle 배지에 37℃, 5% CO2 공기 조건에서 배양되었다.
4. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
IL-1β의 농도는 제조사(R&D Systems)의 지시에 따라 ELISA로 측정하였다. 각 플레이트는 아이크로 플레이트 리더(Molecular Devices, San Francisco, CA, USA)로 450 nm 파장에서 판독되었다. 표준 곡선의 농도 범위는 46.875 pg/mL 내지 3000 pg/mL이고, 샘플은 표준 곡선 범위 내에서 측정하기 위해 적절하게 희석되었습니다.
5. 역전사(Reverse transcription, RT) 및 정량적 PCR 분석
총 RNA는 트리졸 시약(invitrogen)으로 분리하였다. RNA는 ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)로 역전사 되고, 정량적 리얼타임 PCT용 IQ™5 (Bio-Rad)를 사용하여 IQ™ SYBR® Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 증폭되었다. 프라이머는 다음 표와 같다.
구분 염기서열 (5'-3') 서열번호
Ifn-β forward TCCAAGAAAGGACGAACATTCG 7
reverse TGAGGACATCTCCCACGTCAA 8
IL-12 forward GAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAG 9
reverse AGGGAGAAGTAGGAATGGGG 10
CXCL9 forward TGTGGAGTTCGAGGAACCCT 11
reverse TGCCTTGGCTGGTGCTG 12
CXCL10 forward AGAACGGTGCGCTGCAC 13
reverse CCTATGGCCCTGGGTCTCA 14
CD86 forward TGTTTCCGTGGAGACGCAAG 15
reverse TTGAGCCTTTGTAAATGGGCA 16
CD80 forward ACCCCCAACATAACTGAGTCT 17
reverse TTCCAACCAAGAGAAGCGAGG 18
CD40 forward GCTATGGGGCTGCTTGTTGA 19
reverse ATGGGTGGCATTGGGTCTTC 20
MHC class1 forward GCGGCTCTCACACTATTCAGGT 21
reverse TTCCCGTTCTTCAGGTATCTGC 22
β-actin forward TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT 23
reverse TTGCGGTGCACGATGGAGGGGCCGGA 24
증폭된 PCR의 특이성은 용융 곡선 분석에 의해 평가되었다. 유전자 발현 정도는 β-액틴의 발현 수준 대비 각 표적 유전자의 mRNA 수준으로 계산하였다.
6. 유세포 분석
본 발명에 따른 복합체(CYbDNA)에 FITC로 표시하고, 수지상 세포에 4 시간 동안 처리하고, 염색 완충액(BD Pharmingen)으로 세척한 후, FACSCanto 유량 세포계(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석하였다. 수지상 세포를 Y-DNA로 24 시간 동안 처리한 후, CD80 및 CD86에 대한 FITC-컨쥬게이트 항-마우스 항체(BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)로 4℃에서 3 시간 동안 CD80 및 CD86 표면 분자를 염색하였다. 염색 완충액(BD Pharmingen)으로 세척한 후, FACSCanto 유동 세포계(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 세포를 분석하였다.
7. 본 발명의 복합체에 대한 TLR9에 결합 분석
HEK293 T 세포에 TLR9 침전을 위한 pcDNA3.1-mTLR9-Myc/His 발현 플라스미드 또는 cGAS 침전을 위한 puno1-cGAS-3xHA 플라스미드를 각각 처리하여 형질감염하였다. 세포 용해물을 비오틴이 부착된 복합체(CYbDNA)와 2 시간 동안 배양하고 NeutrAvidin (NA) 비드(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)로 4℃ 로커에서 4 시간 동안 침전시켰다. 침전된 복합체는 3번 세척 후 Laemmli 샘플 버퍼로 용해하였다. 용해성 단백질은 SDS-PAGE에 의해 해결하고, 면역 블로팅(immunoblotting)을 수행하였다. 항-Myc 항체는 Cell Signaling Technology로부터 구입하고, 항-HA 항체는 Roche로부터 구입하였다.
8. 면역 블로팅(immunoblotting)
면역 블로팅은 SDS-PAGE를 사용하여 수행하였다. 포스포-IRF3, IRF3 및 액틴에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)에서 구입하였고, TLR9에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.
9. T 세포와 수지상 세포의 공동 배양
T 세포는 제조사의 프로토콜(Miltenyi Biotec, Auburn, WA, USA)에 따라 항 마우스 CD8a 마이크로 비드 및 MACS LS 컬럼을 사용하여 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 분리하였다. 수지상 세포를 10 μg/ml ovalbumin으로 자극한 후 18 시간 동안 복합체 존재 또는 부재 하에서 3일 동안 CD8a+ T 세포와 공동 배양(수지상 세포 : T 세포 = 1 : 10)하였다. 배양 상층액에서 사이토카인의 농도는 ELISA로 측정하였다.
10. 마우스 흑색종 종양 모델
B16F10 세포 1 X 105 세포/마우스를 트립신화 후 DMEM에서 재현탁하고, 8 주령의 C57BL/6 마우스의 왼쪽 옆구리에 주입하였다. 부피가 10 mm3 정도의 종양을 가진 마우스를 치료군으로 무작위하게 선별하여 치료하였다. CYbDNA가 10 μg 로드된 복합체를 9일 째부터 3일 마다 100 μl PBS로 종양 내로 주입하였다. 동일 양의 PBS만 주입한 군을 대조군으로 사용하였다. 종양의 크기는 디지털 캘리퍼스로 3일마다 측정하였다. 종양의 부피는 (길이 X 폭2) X 0.5의 수학식에 따라 계산하였다. 19일 째에 마우스를 안락사 하고, 종양의 무게를 측정하였다. 사이토카인 및 케모카인의 검출을 위해 혈청 샘플을 수집하였다. 종양 조직은 조직학적 연구를 위해 수집되었다. 독성을 모니터링하기 위해 마우스의 동작 및 체중 변화를 면밀하게 관찰하였으며, 치료 후 몇 시간 이내에 사멸되는 마우스는 관측되지 않았다.
11. 통계 분석
통계 분석은 소프트웨어 그래프 패드 프리즘7 (GraphPad Software, San Diego, CA)을 사용하여 수행되었으며, 모든 데이터는 파라메터 통계 검정을 적용하기 전에 Kolmogorov-Smirnov 시험에 의해 평균± SEM으로 표시하였다. 데이터 집합은 단방향 ANOVA로 분석되었으며, Brown-Forsythe 테스트에서 분산 차이를 테스트한 후 동일한 표본 크기의 데이터 그룹이 비슷한 분산을 갖도록 했습니다. P-값이 <0.05 인 경우는 유의한 것으로 간주하였다.
<제조예>
본 발명에 따른 복합체를 제조하기 위해 분비형 DNA 덴드리머를 제조하였다. 10 mM Tris-HCl, [0084] pH 8.0, 1mM EDTA, 50mM NaCl을 혼합하여 어닐링 버퍼를 준비하고, 하기 표 1에 기재된 각각의 DNA구조를 구성하는 올리고뉴클레오타이드들의 조합을 각각 동일한 양으로 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 50mM NaCl으로 제조된 어닐링 버퍼에 용해하고, 멸균된 Milli-Q 워터를 첨가하여 최종 농도가 0.5mM이 되도록 준비하였다. 혼합물을 95℃에서 5분, 65℃에서 2분, 62℃에서 1분간 반응시키고, 서서히 4℃까지 온도를 낮추어 주었다. 제조된 각각의 구조의 DNA들은 21% PAGE를 이용하여 200V에서 1.5-2 시간동안 전기영동하여 확인하였다.
Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머
구분 염기서열 (5'-3') 서열번호
Yb1 GTCGCTGACACTGTGATGGGATTGTAGGTGAACGCT 1
Yb2 AGCGTTCACCTACAATCCAGGAGTCACGCTTACAGA ATCTATGTCCGGTAGTGAAATGAGAACGATCTCTGA GGTGGATCTCGGACATGAGTTCAGAGCGTAAAGGTT 2
Yb3 AACCTTTACGCTCTGAACCATACCTGTCGACTTGAA 3
Yb4 TTCAAGTCGACAGGTATGTCATGTCCGAGATCCACC TCAGAGATCGTTCTCATTGGAGTAACGGTCTGTGTC TGACCTATAGCTTGTCTGGTCCAGTGCTGTGTCCTT 4
Yb5 AAGGACACAGCACTGGACATTTGTTCGTGGAGACTT 5
Yb6 AAGTCTCCACGAACAAATCAGACAAGCTATAGGTCA GACACAGACCGTTACTCCTCACTACCGGACATAGAT TCTGTAAGCGTGACTCCT CATCACAGTGTCAGCGAC 6
상기 표 1를 참고하면, 분지형 DNA 덴드리머의 경우 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 올리고뉴클레오타이드들이 서로 상보적으로 결합하여 Y-분지형 구조의 DNA(YbDNA)를 형성한다.
상기 제조된 YbDNA는 pH 7.4, 20 mM HEPES 완충액에서 0.8 kDa 크기의 환원성 양이온 중합체인 분지형 폴리에틸렌이민(RPC-bPEI)과 결합하였다. DNA 1 μg 당 10 μL로 실험실 온도에서 30 분 동안 반응 후 형성된 복합체를 실험에 사용하였다.
RPC-bPEI 0.8 kDa과 결합된 YbDNA는 EtBr이 첨가된 0.8 wt/val% 아가로오즈 겔에서 전기 영동하여 감지하였다. 0.5X TAE 버퍼에서 100 V의 일정한 전압으로 10 분 동안 폴리플렉스-로딩 겔을 적용하였다. 결합되지 않은 YbDNA 또는 노출된 YbDNA는 UV 일루미네이터로 검출되었다.
실시예 1: 면역 사이토카인 생성 효과 분석
본 발명에 따른 복합체에 면역 증진 활성이 있는지를 확인하기 위해 이를 수지상 세포에 처리하고 사이토카인 분비의 변화를 평가하였다.
수지상 세포에 분지형 DNA 덴드리머(CXbDNA, CYbDNA), RPC-bPEI(RPC) 또는 이들의 조합(CXbDNA:RPC, CYbDNA:RPC, XbDNA:RPC, YbDNA:RPC)을 처리하고, 사이토카인 IFN-β 분비량을 측정하였다. 대조군에는 비히클만 처리하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 분지형 DNA 덴드리머 또는 환원성 양이온 중합체만 처리한 경우 보다 다양한 농도에서 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체을 모두 처리한 경우에 수지상 세포에서 사이토카인 IFN-β 분비가 증가하였다.
상기 결과는 DNA 덴드리머 또는 환원성 양이온 중합체을 단일 처리하는 경우보다 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체을 모두 처리하는 경우가 수지상 세포의 면역성 사이토카인의 분비를 촉진하는 효과가 우수하며, 면역 반응을 유도하는 활성이 우수한 것을 입증하였다.
실시예 2: DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체로 구성되는 복합체의 특성
DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체가 결합되어 형성된 복합체가 수지상 세포에서 면역 반응을 유도하는지 확인하기 위해, CYbDNA와 RPC-bPEI의 중량비를 1 : 1, 1 : 2 또는 1 : 4로 다양하게 하여 복합체(CYR 1, CYR 2, CYR 4)를 제조하였다. 복합체의 형성 여부는 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동 하여 DNA 덴드리머가 검출되는지 여부를 통해 확인하였다. DNA 덴드리머가 검출되지 않으면 복합체가 형성된 것으로 판단하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 비율을 1 : 2 또는 1 : 4로 혼합한 경우, DNA 덴드리머가 검출되지 않았으며, DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체가 결합된 복합체가 형성되었고, 특히, DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 중량비가 1 : 2 비율일 때에 96.8 nm의 가장 작은 입자 크기의 복합체가 형성되는 것으로 나타났다.
실시예 3: DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체로 구성되는 복합체의 수지상 세포 내 도입율 평가
DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체가 결합되어 형성된 복합체가 세포 내로 도입되는 정도의 변화가 있는지 평가하였다. CYbDNA에 FITC로 표지하하여, FITC-CYbDNA를 제조하고, 일부는 RPC-bPEI와 결합하여 복합체(FITC-CYR2)를 형성하였다. 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에 처리한 후 유세포 분석으로 세포를 분석하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, FITC-CYbDNA 단도 처리에 비해 FITC-CYR2를 처리한 경우가 CYbDNA을 함입한 세포수가 6 내지 7 배 증가하였다. 상기 결과는 DNA 덴드리머에 환원성 양이온 중합체가 결합되어 복합체를 수지상 세포에 처리하는 경우 수지상 세포 내로 DNA 덴드리머의 도입율이 증가하는 것을 입증하였다.
이는 본 발명에 본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합은 세포 내로 DNA 덴드리머의 도입율을 증가시켜 면역 반응을 증진하는 효과가 우수하다는 것을 시사한다.
실시예 4: DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체로 구성되는 복합체의 수지상 세포의 면역 반응 유도 평가
DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체가 결합되어 형성된 복합체가 수지상 세포에 면역 반응을 유도하는지 평가하기 위해, 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에 CYbDNA, RPC-bPEI 또는 CYbDNA와 RPC-bPEI가 결합된 복합체(CYR2)를 18 시간 동안 처리한 후, 면역 반응의 마커들의 변화를 확인하였다.
도 5 내지 7에 나타난 바와 같이, 상기 복합체(CYR2)를 처리한 경우, CYbDNA 또는 RPC-bPEI를 단독으로 처리하는 경우에 비해 면역 반응의 활성화를 지표하는 사이토카인 IFN-β 및 IL-12의 분비가 현저히 증가하였으며, 케모카인 CXCL10의 분비도 증가하였고, 수지상 세포의 활성화를 나타내는 표지 분자인 CD80의 발현이 현저히 증가하였으며, 전사인자인 IRF3가 인산화되어 활성화되어 있는 것으로 나타났다.
상기 결과는 DNA 덴드리머에 환원성 양이온 중합체가 결합되어 복합체를 수지상 세포에 처리하면 각 단독으로 처리하는 경우에 비해 사이토카인 IFN-β, IL-12 및 케모카인 CXCL10의 분비가 증가하고, CD80의 발현이 증가하며, 전사인자인 IRF3가 활성화되는 등의 면역 반응이 유도되는 것을 입증하였다. 이는 본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합은 수지상 세포의 면역 반응을 증진하는 활성이 우수하며, 면역 증진 효과가 있음을 시사한다.
실시예 5: 본 발명에 따른 복합체로 활성화된 수지상 세포의 면역 활성 평가
본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합으로 활성화된 수지상 세포가 면역 반응을 증진하는 활성이 있는지를 확인하기 위해, CYR 2로 활성화된 수지상세포가 CD8+ T 세포의 활성화에 미치는 영향을 확인하였다.
골수 유래 수지상 세포(BMDC)에 ovalbumin으로 전처리하고 CYbDNA, RPC-bPEI 또는 이들의 복합체(CYR 2)를 처리한 후, 3일 동안 CD8+ T 세포와 공동 배양하였다. CD8+ T 세포의 활성화 마커인 IFN-γ의 분비 수준을 측정함으로써, CD8+ T 세포의 활성화를 확인하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 상기 복합체(CYR 2)를 수지상 세포에 처리한 경우, CYbDNA 또는 RPC-bPEI를 단독 수지상 세포에 처리하는 경우에 비해 공동 배양된 CD8+ T 세포의 IFN-γ의 분비가 현저히 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합은 수지상 세포의 활성화를 증진할 뿐만 아니라, 수지상 세포가 T 세포를 자극하여 면역 반응을 유도하는 활성도 현저히 향상된다는 것을 입증하였다.
실시예 6: 본 발명에 따른 복합체와 TLR9의 결합 여부 확인
본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합이 면역 반응을 유도하는 기작을 연구하기 위해, 상기 복합체가 TLR9에 미치는 변화를 확인하였다. TLR9는 박테리아나 바이러스가 가지고 있는 메틸화되지 않은 DNA(CpG DNA)에 직접적으로 결합하여 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.
HEK293T 세포에 mTLR9-Myc/His 발현용 플라스미드를 SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 제조자 방식에 따라 형질전환하고, 24시간 배양 후 용해시켰다. 그 용해물을 바이오티닐화된 CYbDNA(biotynylated CYbDNA)와 4 시간 동안 반응시키고, NeutrAvidin (NA) 비드로 회수하였다. 풀다운 분석에 의해 수득된 단백질을 면역 블로팅으로 TLR9와 CYbDNA의 공동 침전을 분석하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, TLR9는 바이오티닐화된 CYbDNA에 의해 용량 의존적으로 공동 침전되었고, CYbDNA가 TLR9에 직접적으로 결합하는 것을 확인하였다.
CYbDNA가 TLR9를 인식하여 결합하는 기작이 본 발명에 따른 복합체(CYR 2)를 처리한 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서도 나타나는지 확인하였다. 야생형 마우스와 TLR9 녹아웃 마우스로부터 유래한 수지상 세포에 본 발명에 따른 복합체(CYR 2)를 처리하고, 상기와 동일한 방법으로 공동 침전된 TLR9를 면역 블로팅으로 분석하였다. 또한, ELISA를 이용하여 야생형 및 TLR9 녹아웃 마우스에서 수집한 수지상 세포의 사이토카인 IFN-β 및 IL12의 분비 수준 변화를 측정하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 야생형에서는 복합체(CYR 2)를 처리하자 사이토카인 IFN-β 및 IL12의 분비 수준이 현저히 향상되었으나, TLR9 녹아웃 마우스에서는 사이토카인 IFN-β 및 IL12의 분비 수준이 감소하였다.
이는 본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합으로 수지상 세포에 처리하면, DNA 덴드리머가 TLR9와 직접적으로 결합하여 반응하며, 수지상 세포의 사이토카인 분비를 향상하는 등의 면역 반응을 활성화하는 효과가 있다는 것을 입증한다.
실시예 7: 동물 모델에서 본 발명에 따른 복합체의 면역 증진 효과 확인
본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합이 동물 모델에서 면역 반응을 증진하는 지를 확인하기 위해, 종양 동물 모델을 준비하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, B16F10 흑색종 1 X 105 세포를 마우스 왼쪽 옆구리에 주입하여 흑색종 동물 모델을 제작하였다.
항-PD-L1은 면역 체크포인트 봉쇄제(immune checkpoint blockades, ICBs)로, ICB는 종양 세포가 T 세포를 비활성화 하여 자신을 보호하기 위해 표현하는 PD-1, PD-L1, 및 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트를 봉쇄하는 항암제이다. ICB가 암 치료로 사용되고 있지만, 종양 조직으로 T 세포와 같은 면역 세포가 침윤하는 것이 억제되는 경우에는 ICB의 항암 활성이 나타나지 않는 것으로 보고된 바 있다.
도 11에 따라 제조된 흑색종 동물 모델에서 종양의 부피가 10 mm3 정도 되었을 때에 3일 마다 종양 부위에 비히클(Vehicle) 또는 상기 복합체(CYR 2)를 주입하고, 항-PD-L1는 복강 내로 주입하였다. 18일 간의 실험 기간 동안 종양의 부피 변화를 디지털 캘리커스로 관찰하였고, 실험 종료 후에 종양을 분리하여 무게 및 종양 부위의 면역 반응의 변화를 확인하였다.
도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 종양의 부피 및 무게가 복합체(CYR 2)를 투여한 경우 크게 감소하였고, 항-PD-L1와 복합체(CYR 2)를 병용 투여한 경우에 더 큰폭으로 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합은 동물 모델에서 면역 반응의 증진을 촉진하여 항암 효과가 나타난다는 것을 입증할 뿐만 아니라, ICB와 같은 항암제와 병용 투여시 항암 효과가 현저하게 향상된다는 것을 입증한다.
또한, 종양 조직의 mRNA의 수준을 분석하여 면역 반응의 변화를 확인하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, 복합체(CYR 2)와 항-PD-L1를 병용 투여한 경우, CD8 T 세포의 표면 마커로 알려진 CD8a의 발현 수준이 증가하였으며, 활성화 CD8 T 세포에서 발현되는 사이토카인 IFN-γ, 및 IFN-β의 발현 수준이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 본 발명에 따른 DNA 덴드리머와 환원성 양이온 중합체의 조합은 종양 조직의 부피를 감소하는 등의 항암 효과가 나타나며, 면역 반응을 증진하여 T 세포와 같은 면역 세포의 도입을 촉진하기 때문에 항암 효과 또한 우수하다는 것을 입증하며, 항암제와 함께 병용 투여시에 암에 대한 치료 효과가 현저하게 향상된다는 것을 보여준다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
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Claims (20)

  1. 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분지형 구조의 DNA는 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 나타내는 뉴클레오타이드들로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Y-분지형 구조의 DNA 덴드리머는,
    (1) 서열번호 1의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열과 서열번호 6의 91번부터 108번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (2) 서열번호 1의 19번부터 36번까지 18개의 염기서열과 서열번호 2의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (3) 서열번호 2의 19번째부터 54번까지 36개의 염기서열과 서열번호 6의 55번부터 90번까지 36개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (4) 서열번호 2의 55번부터 90번까지 36개의 염기서열과 서열번호 4의 19번부터 54번까지 36개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (5) 서열번호 2의 91번부터 108번까지 18개의 염기서열과 서열번호 3의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (6) 서열번호 3의 19번부터 36번까지 18개의 염기서열과 서열번호 4의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (7) 서열번호 4의 55번부터 90번까지 36개의 염기서열과 서열번호 6의 19번부터 54번까지 36개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (8) 서열번호 4의 91번부터 108번까지 18개의 염기서열과 서열번호 5의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하고;
    (9) 서열번호 5의 19번부터 36번까지 18개의 염기서열과 서열번호 6의 1번부터 18번까지 18개의 염기서열이 서로 상보적인 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 1 : 0.5 내지 1 : 5의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 환원성 양이온 중합체는 환원성 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, bPEI)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 분지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, bPEI)의 크기는 0.8 kDa인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체가 결합되어 복합체를 형성한 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 분지형 구조의 DNA 덴드리머는 TLR9에 결합하여 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 분지형 구조의 DNA 덴드리머 및 환원성 양이온 중합체는 결합하여 복합체를 형성한 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 복합체는 수지상 세포에서 IFN-β, IL-12, 또는 CXCL10의 분비를 증가시켜 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 복합체는 수지상 세포에서 CD80의 발현을 증가시켜 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 수지상 세포는 상기 복합체를 인지하면, T 세포의 IFN-γ 분비를 유도 및 증가시키는 활성을 갖게 되는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역결핍 질환은 선천성 면역결핍증, 암, 만성바이러스 감염, 골수이식 후 면역결핍증, 박테리아 패혈증 및 항암 치료 후 면역결핍증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암은 폐암, 육종, 악성 흑색종, 전립선암, 췌장 암종, 갑상선암, 위 암종, 난소암, 간종양, 유방암, 결장직장암, 신장암, 뇌암, 자궁경부암, 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역결핍 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  20. 제19항에 있어서, 상기 개선용 건강기능 식품은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 개선용 건강기능 식품.
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