KR20210114702A

KR20210114702A - 뼈 재생을 위한 말뼈 분말을 함유한 수산화인회석 시멘트 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20210114702A
Application number: KR1020200030141A
Authority: KR
Inventors: 김복희; 장경제; 김재은
Original assignee: 엘바이오 주식회사
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2021-09-24

Abstract

본 발명은 종래 제조되는 인산칼슘시멘트(CPC)의 주요 성분인 수산화인회석(Hydroxyapatite, HA)을 대신 열처리한 동물뼈 분말로 대체하는 CPC 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 열처리를 통하여 동물뼈 분말을 얻는 단계; 및 동물뼈 분말과 인회석 분말들을 혼합하여 CPC 분말상을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 분말상과 경화용액을 혼합하여 반죽하는 단계를 포함하는, CPC의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 CPC는 뼈 결손 회복에 효과적으로 사용될 수 있으며, 특히 치과용 골 이식재 및 3D 골조직 재생용 지지체로 사용될 수 있다. 또한 개발된 CPC는 치조골 뿐 아니라 다양한 뼈 결손 부위에 사용될 수 있으며, 골절된 뼈의 접합 등에 사용될 가능성이 높다.

Description

뼈 재생을 위한 말뼈 분말을 함유한 수산화인회석 시멘트 및 그 제조방법 {Equine bone powder incorporated calcium phosphate cement for bone regeneration and preparing method thereof}

본 발명은 말뼈 분말을 함유한 Calcium phosphate cement (이하 ‘CPC’)및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CPC의 시멘트화 과정에서 결정핵으로 사용되는 Hydroxyapatite을 사용하는 대신 말뼈 분말을 사용하는 시멘트 및 그 제조방법에 관한 것이다.

칼슘계 골시멘트는 치과, 정형외과, 성형외과 적용에서 골접합, 골충전재, 골조직 성장촉진으로 사용하는 삽입형 의료소재의 일종으로 주사기를 사용하여 환부에 직접 주입할 수 있고 성형성이 우수하여 최소 절개술이 가능한 물질로 최근 많은 적용이 보고되고 있다. 임상적으로는 다양한 부위 즉, 손목 및 무릎 등의 관절부, 두개골, 요추 등의 골절이나 결손이 일어났을 때 결손 부위의 충진 및 골절부위의 접합을 유도할 수 있는 재료이다. 환부에 주입된 골시멘트는 시간이 경과함에 따라 서서히 생분해되는 특성이 있으며, 분해가 일어남과 동시에 주변 뼈 조직에서 새로운 뼈 조직의 생성을 유도하는 역할도 수행하고 있다. 이러한 역할을 수행하기 위하여 칼슘계 골시멘트는 페이스트 상태에서 주입성이 우수하고 체내에서 유실되지 않아야 한다.

칼슘계 골시멘트는 경화되었을 때, 수산화인회석 (hydroxyapatite)의 결정질을 갖고 있으며, 이를 형성하기 위하여 인산칼슘 화합물이나 석고 등을 포함하는 분말상과 이를 경화시키기 위한 경화촉진제 등이 혼합된 액상으로 구성되어 있다. 상기 칼슘계 골시멘트는 임상 적용시 먼저 분말상과 액상을 서로 잘 혼합하여 페이스트 형태로 만든 뒤 주사기에 넣고 환부에 주입하면 상온에서 경화되어 골접합이나 골 충전 작용을 한다.

상기 칼슘계 골시멘트는 1983년 Brown 및 Chow에 의해 TTCP, DCP 등과 인산염 수용액을 혼합한 형태가 처음으로 보고되었다. 상기 인산칸슘 시멘트는 인산칼슘 분말과 경화촉진제를 포함하는 수용액이 혼합되었을 때, 부분적으로 인산칼슘이 물에 녹아 이온화되었다가 수산화인회석(HA)를 결정핵으로 침전되게 되어 최종적으로 수산화인회석의 결정구조를 갖는 시멘트가 된다. 이후 개발된 칼슘계 시멘트들의 경화 과정은 Brown과 Chow가 개발한 방법과 유사한 침전 과정을 갖도록 개발되었다. 추가적으로 칼슘계 시멘트의 강도를 개선하기 위하여 반수석고(calcium sulphate hemihydrate)나 피로인산칼슘(Calcium pyrophosphate)를 첨가하거나 구연산 나트륨을 경화촉진제에 추가하여 주입 특성과 강도를 개선한 사례가 보고 되었다. 또한 생분해성 섬유를 CPC에 주입하여 기계적 특성을 향상한 사례도 있다.

칼슘계 골시멘트의 분말상은 일반적으로 1 내지 20 ㎛의 입경을 갖도록 제조되어야 하는 것으로 알려져 있다. 골시멘트의 분말 입경이 작을수록 압축 강도가 증가하나 주입성이 줄어드는 문제점을 가진다.

인산칼슘게 골시멘트는 강도가 약하고 부서지기 쉬운 단점을 갖고 있다. 이를 극복하기 위하여 인산칼슘계 골시멘트에 다양한 물질을 도입시켜왔고, 특히 천연고분자성 물질(키토산, 젤라틴, 콜라겐)을 포함하거나 합성고분자(PLGA)를 포함하는 등의 다양한 시도들이 보고되었다.

본 발명의 목적은 인산칼슘계 시멘트의 분말상을 구성하는 수산화인회석 (HA)를 900℃ 이상으로 열처리하여 얻은 동물 뼈(특히 말의 뼈)의 분말으로 대체하여 기존의 인산칼슘계 시멘트보다 골 재생 능력이 뛰어난 인산칼슘을 제조하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동물뼈의 무기상만을 얻기 위하여 잔류 유기물을 제거하는 단계; 상기 동물뼈에서 무기상만을 얻기 위하여 고온의 여러리를 거치는 단계; 및 DCPD와 탄산칼슘과 동물뼈의 무기상을 혼합하여 인산칼슘계 시멘트의 무기상을 준비하는 단계, 경화제가 포함된 액상과 혼합하여 인산칼슘계 시멘트를 만드는 단계를 제공한다.

본 발명에 따른 동물뼈 분말을 포함하는 CPC 재료는 다양한 골결손 및 골절 부위의 최소 침습법 치료에 이용될 수 있으며, 특히 복잡한 부위의 골 충진 및 골절 부위의 접합에 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 동물뼈에 포함되어 있는 미량 금속원소들은 인간의 뼈에도 포함되어 있으며 이러한 원소들이 뼈의 재생을 촉진시킬 수 있어, 새로운 뼈의 재생에 효과적인 치료재로 사용될 수 있다.

도 1은, 본 발명에 따라 제조된 CPC의 제조방법을 도식화한 그림이다.
도 2는, 본 발명에 따라 제조된 CPC 시편의 결정학적 특성을 분석하기 위해 X-선 분말 회절 분석(XRD) 결과 그래프이다.
도 3은, 본 발명에 따라 제조된 CPC의 화학 조성을 분석하기 위해 에너지분산형 분광분석 법을 이용하여 말뼈를 함유하지 않은 CPC와 비교 분석한 그래프이다.
도 4는, 본 발명에 따라 제조된 CPC의 생체 내 주입되는 특성을 고려하여 수중불분리 현상을 관찰한 사진과 CPC의 응집도(Degree of Cohesion)를 측정한 그래프이다.
도 5는, 본 발명에 따라 제조된 CPC가 말뼈 분말의 특성에 따라 합선된 분말의 입자 형상 및 기공 형태를 관찰하기 위해 주사전자현미경(SEM)으로 100, 10000, 그리고 50,000 배율에서 관찰한 사진이다.
도 6은, 본 발명에 따라 제조된 CPC의 바이오미네랄화 능력을 확인하기 위해 유사 체액(SBF)에 침지시킨 후 CPC의 표면변화를 SEM으로 관찰한 사진이다.
도 7은, 본 발명에 따라 제조된 CPC와 말뼈를 함유하지 않은 CPC의 압축강도결과를 비교 분석한 그래프이다.
도 8은, 본 발명에 따라 제조된 CPC를 유사 체액에 침지시킨 후 압축강도를 측정한 그래프이다.
도 9는, 본 발명에 따라 제조된 CPC에서의 줄기세포의 증식 능력을 평가한 그래프이다.
도 10은, 본 발명에 따라 제조된 CPC에서의 세포 부착능을 확인하기 위해 시행된 면역형광염색(ICC)사진이다.
도 11은, 본 발명에 따라 제조된 CPC에서의 줄기세포의 분화특성를 확인하기위해 Western Blot 방법을 이용한 골 분화인자 발현 확인 결과 그래프이다.
도 12는, 본 발명에 따라 제조된 3D 프린팅용 CPC의 프린팅 조건과, 프린팅된 3D 메시 형태의 조직재생용 지지체 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들을 기존에 이종골 이식용 재료로 사용하는 동물 뼈를 하소하여 얻은 뼈를 미세 분말화하여 인산칼슘계 골 시멘트(CPC)에 재료로 활용될 수 있음을 발견하였고, 특히 말뼈 분말을 함유하는 CPC가 기존 수산화인회석으로 제작된 CPC보다 더 나은 골 분화능력을 가짐을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 처리되지 않은 가축의 뼈(특히 말뼈)에서 피와 잔존 유기물을 제거하여 순수한 미네랄 상을 얻는 단계; 얻어진 말뼈를 2 um 이하의 분말로 분쇄하는 단계; 상기 분말과 CPC를 구성하는 다른 분말 TCP, DCPD, CaCO3와 비율에 맞게 혼합하는 단계; 분말에 경화용 Na₂HPO4 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 CPC의 제조방법을 제공한다.

일반적으로 알려진 CPC 분말의 조성은 다음과 같다. alpha tricalcium phosphate 60%, dicalcium phosphate dehydrate 26%, calcium carbonate 10%, hydroxyapaite 4%로 구성되어 있으며 여러 연구팀들에 의해 다양한 조성의 CPC 분말상이 보고되어 있다.

상기 말뼈 분말은 말의 뼈로부터 추출되는 골 이식재의 일종이다. 동물유래 골이식재는 높은 생체적합성과 골 유착능력으로 오랜 기간 골 결손용 충진재로 사용되어져 왔으며, 이를 이용한 다양한 의료용 응용 연구에 활용될 수 있다.

<실시예 1>

상기 분말을 준비하는 단계는 처리되지 않은 말뼈를 채집하여 물(증류수, 수돗물)에 30분씩 5~6회 침지시켜 핏기를 제거한 후, 잔류하는 부피가 큰 살점을 제거하며 완전히 제거할 필요는 없다. 이 후, 처리된 뼈 조각을 과산화 수소수에 부피비로 1:2~1:3 정도로 48시간 동안 침지시켜 표백 과정을 거친 후, 남은 살점을 제거하며 완전히 제거할 필요는 없다. 살점을 제거한 동물뼈를 증류수로 간단히 세척한 뒤, 그늘에서 48시간 이상 건조한다. 건조 후 전기 소결로를 이용하여 600℃ 에서 2시간 동안 소결한다. 소결된 동물뼈를 막자와 막자사발로 조분쇄 한뒤, 충격식 분쇄기에 넣어 다시 분쇄한다. 분말은 채를 이용하여 50 um 이하의 분말이 될때까지 계속 분쇄를 거치며 분쇄된 분말을 전기소결로에 넣고 900℃에서 4시간 동안 소결한다. 소결된 뼈 분말을 볼밀로 분쇄하여 최종적으로 5um 이하의 분말을 얻는다.

<실시예 2>

말뼈를 포함하는 CPC 분말상의 제조

일반적인 CPC 분말의 구성성분에 맞추어 a-TCP 60%, DCPD 26%, CaCO3 10%, 말뼈분말 4%를 질량비로 섞은 뒤, 볼밀에 넣고 1시간 동안 교반하였다

<실시예 3>

경화용 용액(Na₂PO4)의 제작

증류수에 4 wt% 인산이나트륨(Na₂HPO4)를 용해시킨 경화용액을 제조하였다.

<실시예 4>

CPC 제작

실시예 2에서 준비된 CPC 분말상과, 실시예 3에서 준비된 경화용 용액(Na₂PO4)를 1g:0.4ml의 비율로 혼합하여 spatula등을 이용하여 잘 반죽한다. 준비된 CPC 반죽은 목적에 따라 mold에 넣고 경화시키거나, 주사기에 담지하여 주입형으로 사용할 수 있다.

<실시예 5>

CPC 경화 확인

(1) 방법

혼합된 분말상과 경화 이후의 CPC의 결정구조를 관찰하기 위하여 X-ray 회절 패턴 분석기(XRD)를 이용하였다. CPC의 경화가 이루어 졌는지 확인하기 위하여 경화 이후의 CPC에 대한 Cohesion Test를 진행하였다. Cohesion Test는 경화시킨 CPC 디스크를 생리식염수(PBS)에 넣은 뒤의 질량 변화를 측정하는 방법으로 수행되었다.

(2) 결과 도2은 경화 전 후의 XRD 회절 패턴을 나타낸 결과이다. 경화제와 혼합된 CPC 분말상은 경화 이후에 수산화인회석을 결정 구조를 갖도록 설계 되었다. 따라서 경화 이후의 CPC에서는 수산화인회석의 특성 peak가 관찰되어야 한다. 도3의 결과 CPC 분말상에서는 HA의 특성 peak가 약하게 관찰되지만, 경화 이후에는 강한 HA peak을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이로 미루어 CPC의 형성이 성공적으로 수행되었음을 알 수 있었다.

도4는 Cohesion 실험 결과를 나타낸 것이며, 1 시간과 24시간 모두에서 질량 손실이 5% 미만이었으며 디스크의 모양을 그대로 유지하는 것으로 미루어 1시간 이내에 경화가 이루어지며 경화 이후에 식염수에 분해되지 않음을 알 수 있었다.

<실시예 6>

CPC의 바이오미네랄화측정

시멘트의 바이오미네랄화 능력을 확인하기 위해 유사체액(Simulated Body Fluid, SBF)에 CPC를 14일 동안 침지시킨 후 CPC의 표면변화를 도5에서 확인할 수 있었다. SEM결과를 통해 유사체액에서 시간이 지남에 따라 침상형의 HA 결정이 성장하고 증가함을 알 수 있었다.

<실시예 7>

시멘트의 압축강도를 평가하기 위해, 실린더 모양의 시멘트 시편을 제작하여 파괴 실험을 진행하였다. 도7에서 보여주는 바와 같이, 시멘트의 강도는 각각의 조성에 따라 다른 결과를 나타낸 것을 확인하였다. 말뼈의 분말이 총량대비 32% 혼합된 시멘트가 가장 높은 강도를 갖는 것을 나타냈다.

32%까지의 비율에서 말뼈의 혼합비율이 증가함에 따라 강도가 증가하는 이유는 말뼈 유래 골 분말이 반응할 때 표면의 미네랄 침전을 증가시키기 때문으로 예측된다.

<실시예 8>

시멘트 표본의 세포독성 효과를 평가하기 위해, WST-1 분석을 수행하였다. 도 9에서 보여주는 바와 같이, 말뼈가 혼합된 시멘트 표본은 대조군인 HA가 혼합된 시멘트와 비교하여 세포독성이 없음을 알 수 있었다.

치조골 조직의 성공적인 재생을 위해 시멘트의 표면의 특성은 매우 중요하며, 이를 평가하기 위하여 인간유래 치수 줄기세포를 배양하여 골아세포로의 분화 정도를 측정하였다. 도 11에 결과가 도시되어 있으며, 단백질 정량평가 결과 말의 뼈를 혼합하여 제작한 CPC에서 더 높은 수준의 OPN, OCN (골분화 마커 단백질)이 발현되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 9>

시멘트를 3D 프린팅용 지지체 제작을 위한 재료로 사용하기 위하여, 경화용액에 20%의 Pluronic(R)F-127을 혼합하였다. 프린팅을 위하여 분말과 경화제를 0.4 ml/g 의 비율로 혼합하여, 프린팅 재료 주입구에 넣어주고 프린팅 재료 통을 6 ~ 12 ℃의 온도로 유지하게 시켜주었다.

도 12는 시멘트를 출력하는 조건을 정리한 결과이다. 재료 압출형 3D 프린터의 프린팅 조건을 결정하는 가장 중요한 요소는 사용하는 재료의 점도를 포함 강도등의 물성이다. 일반적인 CPC는 반죽 상태에서 압출되는 성질이 뛰어나지 못하며, 상분리가 일어나거나, 토출량이 불균일해 3D 프린팅에 사용되기 어려운 특성이 있다. 본 발명에서 사용한 Pluronic(R)F-127 용액은 15℃ 이하에서 CPC에 적당한 점도를 부여하여, 도 12에 도시한 것과 같이 3차원 메시 형태의 지지체를 제작할 수 있었다.

Claims

칼슘포스페이트 분말상 제조시 말뼈를 800 내지 1300 ℃로 열처리한 세라믹 분말을 150 ㎛이하로 분쇄한 뒤 수산화인회석을 대체하여 혼합하는 단계; 및
상기 분말에 2 내지 6 % Na₂HPO₄용액을 혼합하여 반죽을 제작하는 단계를 포함하는, 인산칼슘시멘트의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 동물뼈의 분말을 준비하는 단계는,
동물의 뼈를 800 내지 1300 ℃의 온도로 열처리 하는 것을 특징으로 하는, 인산칼슘시멘트 제조방법.
청구항 2에 있어서,
상기 동물뼈 분말의 입도 크기는,
600 ㎚ 내지 150 ㎛인 것을 특징으로 하는, 인산칼슘시멘트의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 분말상은,
알파삼인산화칼슘(α-Tricalcium Phosphate, α-TCP), 제이인산칼슘 2수화물(Dicalcium phosphate dihydrate, DCPD), 탄산칼슘(Calcium carbonate, CaCO₃), 및 동물뼈 분말로 이루어진 것으로, 혼합비율은 α-TCP:DCPC:CaCO₃:동물뼈= 60:26:10:4 내지 23.8:55:9.2:12를 갖는 인산칼슘시멘트의 제조방법.
청구항 1에 있어서,
분말상과 경화용액(Na₂HPO₄ 용액)의 혼합비는,
분말상과 용액의 혼합비를 0.4 내지 0.8 ㎖/g 으로하는 인산칼슘시멘트의 제조방법.
청구항 1에 있어,
Na₂HPO₄용액 제조시에 Pluronic(R)F-127 분말을 15 내지 30 wt% 혼합하여 제조하는 것을 포함하여, 칼슘포스페이트 분말상과 용액의 혼합비를 0.4 내지 0.8 ㎖/g 으로 하는 인산칼슘시멘트의 제조방법.
청구항 6에 있어,
혼합된 반죽을 5 내지 15 ℃의 온도에서 3D 프린터를 이용하여 골조직 재생용 3차원 지지체를 제작하는 방법을 포함하는 3차원 인산칼슘시멘트의 제조방법.