KR20210113932A - High sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification primer set for detection of novel coronavirus-19 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 2019 신종 코로나바이러스(coronavirus disease-19: COVID-19)에 감염된 환자를 신속하고 정확하게 진단하기 위한 방법으로 인후도말 RNA 샘플로부터 코로나19 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있는 루프매개등온증폭 프라이머와 프로브에 관한 것이다.The present invention is a method for rapidly and accurately diagnosing a patient infected with the 2019 novel coronavirus (COVID-19). Loop-mediated isothermal amplification capable of detecting the nucleotide sequence of the Corona 19 virus from a throat smear RNA sample. It relates to primers and probes.
2019 년 12 월, 무한의 도매 시장과 역학적으로 연결된 비정형 폐렴 환자 집단이 발견되었고, 이들 중에서 2019-novel coronavirus (2019-nCoV)로 명명된 새로운 베타-코로나 바이러스의 감염이 일부 확인되었다. 이 바이러스는 Sarbecovirus 속의 박쥐 바이러스와 유전적으로 유사하며 2020년 2월 13일 전세계적으로 46997명이 감염환자로 확인되었고, 중국에서는 46550명 감염환자중에서 1368명이 사망한 것으로 보고되었다. 중국 이외에 한국, 일본, 싱가폴, 스페인, 미국, 독일, 배트남, 프랑스 말레이시아 등의 나라에서도 감염이 확인되어 사람간 감염 및 다중 감염이 발생하고 있는 상황이지만 인간 사이에서 이 질병의 스펙트럼은 아직 완전히 결정되지 않았다. 2019-nCoV의 감염 징후는 비특이적이며 호흡기 증상, 열, 기침, 호흡 곤란 및 바이러스 성 폐렴 증상을 나타낸다. 2019-novel coronavirus의 감염 확산을 막고, 환자를 치료하려면 빠른 2019-novel coronavirus 진단 검사가 절실히 필요하다. 신종 코로나바이러스현재 바이러스의 진단은 WHO 분자진단 검사법으로서 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 2019-nCoV를 진단하는 방법이 제공되고 있는 상황이나 실시간 PCR법은 숙련된 검사자 및 고급 실험실 기반을 필요로하며 검사결과 확인까지 2시간 정도의 시간이 소요되어 현장에서 빠르게 진단까지 어려움이 있다. In December 2019, a group of patients with atypical pneumonia epidemiologically linked to the wholesale market in Wuhan was discovered, and among them, infection with a new beta-coronavirus named 2019-novel coronavirus (2019-nCoV) was confirmed. This virus is genetically similar to the bat virus of the genus Sarbecovirus, and on February 13, 2020, 46997 cases were confirmed worldwide, and 1368 of 46550 infected cases were reported in China. In addition to China, infections have been confirmed in countries such as Korea, Japan, Singapore, Spain, the United States, Germany, Vietnam, France, and Malaysia, and human-to-human transmission and multiple infections are occurring. didn't Signs of infection with 2019-nCoV are non-specific and include respiratory symptoms, fever, cough, shortness of breath, and viral pneumonia. A rapid 2019-novel coronavirus diagnostic test is desperately needed to prevent the spread of 2019-novel coronavirus and treat patients. The current virus diagnosis is a WHO molecular diagnostic test, and a method for diagnosing 2019-nCoV using polymerase chain reaction (PCR) is being provided. It requires a foundation, and it takes about 2 hours to confirm the test result, making it difficult to quickly diagnose on the spot.
최근, 온도 변화 없이 일정한 온도에서 유전자를 증폭하는 등온 증폭 반응법(loop-mediated isothermal amplification reaction, LAMP)이 개발되었다. LAMP법은 주형에 상보적인 프라이머 6개를 사용하여 각기 다른 8개의 부위를 인식하여 유전자 증폭을 진행한다. 기존의 PCR법과 비교하였을 때, 온도의 변화 없이 증폭할 수 있다는 점에서 검사 시간을 단축할 수 있고, 온도 변화를 위한 값비싼 장비 없이 검사를 진행할 수 있다Recently, a loop-mediated isothermal amplification reaction (LAMP) that amplifies a gene at a constant temperature without temperature change has been developed. The LAMP method uses six primers complementary to the template to recognize eight different sites and proceed with gene amplification. Compared with the existing PCR method, the test time can be shortened in that it can be amplified without a change in temperature, and the test can be performed without expensive equipment for temperature change.
이에, 본 발명자들은 LAMP법을 이용하여 숙련된 검사자 및 값비싼 장비 없이도 2019-nCoV의 빠른 진단을 위하여 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors completed the present invention by intensively researching for rapid diagnosis of 2019-nCoV using the LAMP method without an experienced tester and expensive equipment.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 신종 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 키트를 제공하고, 이를 이용하여 신종 코로나바이러스를 빠르고 정확하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is to provide a primer set and kit for detecting a novel coronavirus, and to provide a method for rapidly and accurately detecting a novel coronavirus using the same.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) primer set for detecting novel coronavirus comprising the primers of SEQ ID NOs: 1 to 6.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 RdRP 유전자를 타겟으로 하며, 프로브(probe)와 퀀쳐(quencher)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 7의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 8의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the LAMP primer set for detecting the novel coronavirus targets the RdRP gene of the novel coronavirus, and may further include a probe and a quencher, wherein the probe is a sequence It may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, a fluorescent material may be attached, and the quencher may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
또한, 본 발명은 서열번호 9 내지 13의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a LAMP primer set for detecting novel coronavirus, comprising the primers of SEQ ID NOs: 9 to 13.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 E 유전자를 타겟으로 하며, 프로브와 퀀쳐를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 14의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 15의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the LAMP primer set for detecting novel coronavirus targets the E gene of novel coronavirus, and may further include a probe and a quencher, wherein the probe contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14. It may include or consist of, a fluorescent material may be attached, and the quencher may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
또한, 본 발명은 서열번호 16 내지 21의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a LAMP primer set for detecting novel coronavirus, comprising the primers of SEQ ID NOs: 16 to 21.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 N 유전자를 타겟으로 하며, 프로브와 퀀쳐를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 22의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 23의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the LAMP primer set for detecting novel coronavirus targets the N gene of novel coronavirus, and may further include a probe and a quencher, wherein the probe contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 It may include or consist of, a fluorescent material may be attached thereto, and the quencher may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23.
또한, 본 발명은 서열번호 24 내지 29의 프라이머를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a LAMP primer set for detecting novel coronavirus comprising the primers of SEQ ID NOs: 24 to 29.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 Spike (S) 유전자를 타겟으로 하며, 프로브와 퀀쳐를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 30의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 31의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. As an embodiment of the present invention, the LAMP primer set for detecting the novel coronavirus targets the Spike (S) gene of the novel coronavirus, and may further include a probe and a quencher, wherein the probe is of SEQ ID NO: 30 It may include or consist of a nucleotide sequence, and may have a fluorescent material attached thereto, and the quencher may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 각 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 허위음성 결과를 배재하기 위하여 actin beta 유전자를 타겟하는 내부대조군(internal control) 서열번호 32 -37의 염기서열을 포함할 수 있다.As another embodiment of the present invention, each LAMP primer set for detecting novel coronavirus includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32-37 as an internal control targeting the actin beta gene in order to exclude false negative results. can
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트, 서열번호 9 내지 13의 프라이머 세트, 서열번호 16 내지 21, 및 서열번호 24 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention includes a primer set of SEQ ID NOs: 1 to 6, a primer set of SEQ ID NOs: 9 to 13, SEQ ID NOs: 16 to 21, and two or more primer sets selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24 to 29, We provide a set of multiple LAMP primers for detecting novel coronavirus.
또한, 본 발명은 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트 중 1종의 프라이머 세트 또는 상기 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a LAMP kit for detecting a novel coronavirus comprising one of the LAMP primer sets for detecting the novel coronavirus or the multiple LAMP primer sets for detecting the novel coronavirus.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 키트에 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트가 포함된 경우, 상기 프라이머 세트는 상기 서열번호 7; 서열번호 14; 서열번호 22; 및/또는 서열번호 30의 프로브를 포함할 수 있고, 상기 프로브는 형광물질로 표지된 것일 수 있으며, 상기 프로브는 서로 다른 파장을 발하는 형광물질로 표지된 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, when the kit includes a multi-LAMP primer set for detecting novel coronavirus, the primer set is SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 22; and/or a probe of SEQ ID NO: 30, wherein the probe may be labeled with a fluorescent material, and the probe may be labeled with a fluorescent material emitting different wavelengths.
본 발명의 다른 구현예로서 상기 프로브는 각각 독립적으로 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the probes are each independently FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein, HEX (2',4',5',7'-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, FITC (fluorescein) isothiocyanate), oregon green, alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine-based dyes and thiadicarbocyanine Any one or more fluorescent materials selected from the group consisting of may be attached thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약에는 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다. In another embodiment of the present invention, the kit may further include a reagent for performing an amplification reaction, and the reagent may include one or more selected from the group consisting of DNA polymerase, dNTPs, and a buffer.
또한, 본 발명은 (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 상술한 LAMP 프라이머 세트 또는 다중 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출 방법을 제공한다. In addition, the present invention comprises the steps of (1) isolating genomic DNA (gDNA) from a biological sample; (2) amplifying the target sequence by using the isolated gDNA as a template and performing an isothermal amplification reaction using the above-described LAMP primer set or multiple LAMP primer sets; and (3) detecting the amplified product.
또한, 본 발명은 (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 상술한 LAMP 프라이머 세트 또는 다중 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 신종 코로나바이러스 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (1) isolating genomic DNA (gDNA) from a biological sample; (2) amplifying the target sequence by using the isolated gDNA as a template and performing an isothermal amplification reaction using the above-described LAMP primer set or multiple LAMP primer sets; and (3) detecting the amplified product; provides an information providing method for diagnosing novel coronavirus, including.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 인후 도말(throat swab)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the biological sample may be at least one selected from the group consisting of sputum, bronchial aspiration and bronchial washing, and throat swab.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (3) 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 바람직하게는 형광 측정 방법에 의할 수 있다. As another embodiment of the present invention, step (3) may be performed by one or more methods selected from the group consisting of DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement, but preferably fluorescence measurement can depend on the method.
본 발명의 프라이머 세트는 실시간 다중 등온증폭반응(real-time multiplex LAMP)을 기반으로 하여 종래에 PCR, real time PCR 기반의 검출과 달리 고가의 장비와 숙련된 기술자 없이도 신종 코로나바이러스의 검출이 가능하고, 1시간 이내에 바이러스의 검출이 가능하여 현장에서 빠른 진단을 통환 조기 치료를 실시할 수 있다. 또한, 본 발명은 형광프로브와 내부대조군을 이용하여 위양성/위음성 결과를 배제할 수 있고, 아울러 복수 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트를 제공하여 검사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는바 현장에서 기존의 검출법을 대체하는 분자진단검사법으로 즉시 적용가능하다.The primer set of the present invention is based on real-time multiplex LAMP, and unlike conventional PCR and real-time PCR-based detection, it is possible to detect novel coronavirus without expensive equipment and skilled technicians. , it is possible to detect the virus within 1 hour, so it is possible to carry out early treatment through rapid diagnosis on the spot. In addition, the present invention can exclude false-positive/false-negative results by using a fluorescent probe and an internal control group, and also provides a primer set targeting multiple genes to increase the reliability of the test results. It can be applied immediately as an alternative molecular diagnostic test.
도 1은 신종 코로나바이러스 RdRP gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2는 신종 코로나바이러스 E gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 3은 신종 코로나바이러스 N gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 4는 신종 코로나바이러스 S gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 5는 RdRP gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 6는 E gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 7는 N gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 8는 S gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 9은 상기 2종 프라이머 세트의 혼합인 다중 LAMP 프라이머 세트(COVID19 RdRP/N gene multiplex LAMP primer set)의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 10은 임상샘플에서 다중 LAMP 프라이머 세트(COVID19 RdRP/E gene multiplex LAMP primer set)를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
도 11은 COVID19 RdRP/N 유전자와 인터널컨트롤(actin ß) 조합의 다중 LAMP 테스트 결과 도면이다.1 is a diagram showing the position of the LAMP primer set in the novel coronavirus RdRP gene sequence.
Figure 2 is a diagram showing the position of the LAMP primer set in the novel coronavirus E gene sequence.
3 is a diagram showing the position of the LAMP primer set in the novel coronavirus N gene sequence.
4 is a diagram showing the position of the LAMP primer set in the novel coronavirus S gene sequence.
5 is a diagram of the specificity test result for the cross-reaction of the LAMP primer set targeting the RdRP gene.
6 is a diagram of the specificity test result for the cross-reaction of the LAMP primer set targeting the E gene.
7 is a diagram of the specificity test result for the cross-reaction of the LAMP primer set targeting the N gene.
8 is a view of the specificity test result for the cross-reaction of the LAMP primer set targeting the S gene.
9 is a view showing the specificity test results for the cross-reaction of the multiplex LAMP primer set (COVID19 RdRP/N gene multiplex LAMP primer set), which is a mixture of the two primer sets.
10 is a result of detecting an amplification product using a multiplex LAMP primer set (COVID19 RdRP/E gene multiplex LAMP primer set) in a clinical sample.
11 is a diagram of multiple LAMP test results of a combination of COVID19 RdRP/N gene and internal control (actin ß).
본 발명자들은 현장에서 숙련된 기술자 없이 빠르고 정확하게 신종 코로나바이러스 검출방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors completed the present invention by earnestly researching a novel coronavirus detection method quickly and accurately without skilled technicians in the field.
구체적으로, 본 발명자들은 신종 코로나바이러스(2019 novel coronavirus: 2019-nCoV)의 RdRP, E, N, 및/또는 S 유전자를 기반으로 LAMP 프라이머를 제작하였고, BLP 프라이머에 형광이 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브를 표지하여 기존의 형광 dye를 사용하는 LAMP 방법보다 정확도와 특이도를 향상시키고, real time LAMP가 가능하게 하였다. 또한, 본 발명은 Real-time RT-LAMP 방법을 이용함으로써 종래에 qRT-PCR에 비해 시간을 검사에 소요되는 시간을 40분 이상 단축시킬 수 있으며, actin beta 유전자를 internal control로 이용하여 위음성 결과를 배제할 수 있다.Specifically, the present inventors prepared LAMP primers based on the RdRP, E, N, and/or S genes of the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV), and oligonucleotide probes fluorescence-coupled to the BLP primers. By labeling, the accuracy and specificity were improved compared to the conventional LAMP method using fluorescent dyes, and real-time LAMP was enabled. In addition, the present invention can reduce the time required for testing by more than 40 minutes compared to conventional qRT-PCR by using the real-time RT-LAMP method, and by using the actin beta gene as an internal control, false-negative results are obtained. can be excluded.
본 발명의 RdRP 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 1의 F3 프라이머, 서열번호 2의 B3 프라이머, 서열번호 3의 FIP 프라이머, 서열번호 4의 BIP 프라이머, 서열번호 5의 FL 프라이머, 서열번호 6의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머의 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 7), 또한, 상기 프로브와 상보적인 서열번호 8번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀처 프로브를 제작하였다. The LAMP primer set for novel coronavirus detection targeting the RdRP gene of the present invention is the F3 primer of SEQ ID NO: 1, the B3 primer of SEQ ID NO: 2, the FIP primer of SEQ ID NO: 3, the BIP primer of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 The probe was designed by linking the FL primer and the BLP primer of SEQ ID NO: 6, and linking a fluorescence-coupled 32-mer oligonucleotide to 5' of the BLP primer (SEQ ID NO: 7), and a sequence complementary to the probe BHQ1 was bound to 3' of the oligonucleotide (30mer) of No. 8 to prepare a quencher probe.
또한, 본 발명의 E 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 9의 F3 프라이머, 서열번호 10의 B3 프라이머, 서열번호 11의 FIP 프라이머, 서열번호 12의 BIP 프라이머, 서열번호 13의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머의 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 14), 또한, 상기 프로브 서열과 상보적인 서열번호 15번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀쳐 프로브를 제작하였다.In addition, the LAMP primer set for novel coronavirus detection targeting the E gene of the present invention is the F3 primer of SEQ ID NO: 9, the B3 primer of SEQ ID NO: 10, the FIP primer of SEQ ID NO: 11, the BIP primer of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: A probe was designed by including the BLP primer of 13 and linking a fluorescence-coupled 32 mer oligonucleotide to 5' of the BLP primer (SEQ ID NO: 14), and also the oligo of SEQ ID NO: 15 complementary to the probe sequence BHQ1 was bound to 3' of the nucleotide (30mer) to prepare a quencher probe.
또한, 본 발명의 N 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 16의 F3 프라이머, 서열번호 17의 B3 프라이머, 서열번호 18의 FIP 프라이머, 서열번호 19의 BIP 프라이머, 서열번호 20의 FL 프라이머, 서열번호 21의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 22). 또한, 상기 프로브 서열과 상보적인 서열번호 23번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀처 프로브로 사용하였다.In addition, the LAMP primer set for novel coronavirus detection targeting the N gene of the present invention is the F3 primer of SEQ ID NO: 16, B3 primer of SEQ ID NO: 17, FIP primer of SEQ ID NO: 18, BIP primer of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: A probe was designed by including the FL primer of 20 and the BLP primer of SEQ ID NO: 21, and linking the fluorescence-coupled 32 mer oligonucleotide to the BLP primer 5' (SEQ ID NO: 22). In addition, BHQ1 was bound to 3' of the oligonucleotide (30mer) of SEQ ID NO: 23 complementary to the probe sequence and used as a quencher probe.
또한, 본 발명의 Spike (S) 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 24의 F3 프라이머, 서열번호 25의 B3 프라이머, 서열번호 26의 FIP 프라이머, 서열번호 27의 BIP 프라이머, 서열번호 28의 FL 프라이머, 서열번호 29의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 30). 또한, 상기 프로브 서열과 상보적인 서열번호 31번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀처 프로브로 사용하였다.In addition, the LAMP primer set for novel coronavirus detection targeting the Spike (S) gene of the present invention is the F3 primer of SEQ ID NO: 24, the B3 primer of SEQ ID NO: 25, the FIP primer of SEQ ID NO: 26, and the BIP primer of SEQ ID NO: 27 , the FL primer of SEQ ID NO: 28, and the BLP primer of SEQ ID NO: 29, and the fluorescence-coupled 32 mer oligonucleotide was linked to the BLP primer 5' to design a probe (SEQ ID NO: 30). In addition, BHQ1 was bound to 3' of the oligonucleotide (30mer) of SEQ ID NO: 31 complementary to the probe sequence and used as a quencher probe.
인터널 컨트롤로 사용된 Actin beta 유전자를 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 32의 F3 프라이머, 서열번호 33의 B3 프라이머, 서열번호 34의 FIP 프라이머, 서열번호 35의 BIP 프라이머, 서열번호 36의 FL 프라이머, 서열번호 37의 BL 프라이머를 포함한다.The LAMP primer set targeting the Actin beta gene used as an internal control is F3 primer of SEQ ID NO: 32, B3 primer of SEQ ID NO: 33, FIP primer of SEQ ID NO: 34, BIP primer of SEQ ID NO: 35, FL of SEQ ID NO: 36 a primer, and a BL primer of SEQ ID NO: 37.
한편, 본 발명자들은 신종 코로나바이러스의 2개 이상의 유전자를 동시에 증폭시켜 보다 신뢰도 높은 검사 결과를 확보하기 위하여 상기 각각의 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트를 혼합하여 '신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트'를 제작하였다. 상기 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트는 RdRP, E, N, 및 S 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 검출을 하나의 튜브에서 수행할 수 있는 multiplex LAMP에 제공될 수 있고, 상기 다중 LAMP 프라이머 세트는 높은 민감도와 특이도를 가지고 보다 정확한 진단 결과를 제공할 수 있다. On the other hand, the present inventors mixed primer sets targeting each gene in order to simultaneously amplify two or more genes of the novel coronavirus to secure a more reliable test result, and 'multiple LAMP primer set for detection of novel coronavirus' was produced. The multiple LAMP primer set for detecting novel coronavirus may be provided in a multiplex LAMP capable of detecting two or more genes selected from the group consisting of RdRP, E, N, and S genes in one tube, Multiple LAMP primer sets can provide more accurate diagnostic results with high sensitivity and specificity.
본 발명의 LAMP 기반의 프라이머 세트는 전통적인 PCR과 달리 온도변화를 요구하지 아니하여 단순하고 가벼운 증폭 기기를 이용할 수 있고 분석에 소요되는 시간을 획기적으로 감소시킬 수 있다. Unlike conventional PCR, the LAMP-based primer set of the present invention does not require a temperature change, so a simple and light amplification device can be used, and the time required for analysis can be dramatically reduced.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다. 하기 표 1의 서열번호 1-6은 신종 코로나바이러스의 RdRP 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 세트이며 (RdRP primer), 서열번호 9-13은 E 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 (E primer) 이며, 서열번호 16-21은 N 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 (N primer) 세트이며, 서열번호 24-29은 S 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 (S primer) 세트이다. 표 1의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물은 Multiplex LAMP 법을 이용한 신종 코로나바이러스 검출법에 사용될 수 있다. In addition, the present invention provides a composition for detecting novel coronavirus comprising the primer set. SEQ ID NO: 1-6 in Table 1 is a set of six primers capable of amplifying the RdRP gene of the novel coronavirus (RdRP primer), and SEQ ID NO: 9-13 is a primer set capable of amplifying the E gene (E primer) and SEQ ID NOs: 16-21 are a set of six primers capable of amplifying the N gene, and SEQ ID NOs: 24-29 are a set of six primers (S primer) capable of amplifying the S gene. The primer set of Table 1 and the composition including the same can be used for novel coronavirus detection method using the Multiplex LAMP method.
본 발명의 신종 코로나바이러스 검출을 위한 multiplex LAMP 프라이머 세트의 구성은 하기 표 2 및 3과 같으며, 반응 시간 및 온도는 하기 표 5과 같다. The composition of the multiplex LAMP primer set for detecting novel coronavirus of the present invention is shown in Tables 2 and 3 below, and the reaction time and temperature are shown in Table 5 below.
본 발명은 RdRP 프라이머 세트, E 프라이머 세트, 및 N 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 신종 코로나바이러스 진단용 LAPM 키트를 제공할 수 있으며, 상기 LAMP 키트는 multiplex LAMP 수행에 이용되어 한 번의 검사로 신종 코로나바이러스 감염 여부를 알 수 있다. The present invention can provide a LAPM kit for diagnosing novel coronavirus comprising two or more primer sets selected from the group consisting of RdRP primer set, E primer set, and N primer set, and the LAMP kit is used for performing multiplex LAMP With a single test, you can find out if you are infected with the new coronavirus.
한편, 본 발명의 상기 세개의 프라이머 세트는 각각 독립적으로 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 각 프로브는 발하는 파장범위가 상이한 형광물질이 부착된 것일 수 있다. Meanwhile, the three primer sets of the present invention may each independently include a probe, and each probe may have a fluorescent material having a different emission wavelength range attached thereto.
본 발명은 서로 다른 형광을 발하는 각각의 프로브를 포함하는 상기 3개 프라이머 세트를 이용하여 multiplex real-time LAMP를 수행함으로써 한 번의 검사로 빠르게 감염 여부 결과를 얻을 수 있다.In the present invention, by performing multiplex real-time LAMP using the three primer sets including each of the probes emitting different fluorescence, it is possible to quickly obtain an infection result with a single test.
상기 각 프로브에 부착되는 형광물질은 형광을 발하는 것이라면 제한되지 아니하나, 그 비제한적인 예로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등이 있다.The fluorescent material attached to each probe is not limited as long as it emits fluorescence, but non-limiting examples thereof include FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein, HEX (2', 4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetra methyl rhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein) ), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl)ethylenediamine), cyanine series dyes and thiadicarbocyanine.
또한, 본 발명은 신종 코로나바이러스 감염 여부의 진단이 필요한 개체의 생물학적 시료에서 게놈 DNA(gDNA)를 분리하고, 상기 gDNA를 주형으로 하여 상기 키트를 이용하여 LAMP를 수행함으로써 표적 서열을 증폭하고, 그 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 신종 코로나바이러스 감염 진단 방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention isolates genomic DNA (gDNA) from a biological sample of an individual requiring diagnosis of novel coronavirus infection, and amplifies the target sequence by performing LAMP using the kit using the gDNA as a template, and the It is possible to provide a method for diagnosing a novel coronavirus infection comprising detecting an amplification product.
본 발명에서 “개체”는 신종 코로나바이러스 감염의 진단이 필요한 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 본 발명에서 “생물학적 시료”는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 인후도말 등을 포함하는 신체의 다양한 부분의 세포 또는 조직을 포함할 수 있다. In the present invention, the "individual" is not limited as long as it is a mammal requiring diagnosis of novel coronavirus infection, but may preferably be a human. In addition, the "biological sample" in the present invention may include cells or tissues of various parts of the body, including sputum, bronchial aspiration and bronchial washing, throat smear, and the like.
본 발명에 있어서, “등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)”은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요 없는 Bst, Gsp 등의 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법으로, 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 고리(loop) 구조로 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭 유무를 확인하는 방법으로서, 바람직하게는 형광 검출용 시약을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, "LAMP; Loop-mediated isothermal amplification" is a method of performing a reaction under isothermal conditions using a polymerase such as Bst, Gsp, etc. that does not require a PCR cycle unlike the existing PCR method, Basically, by using four primers, both ends are synthesized in a loop structure to infinitely amplify a specific region of a gene, and the amplified DNA product is subjected to a fluorescence detection reagent or a precipitation reaction to confirm the presence or absence of amplification. As such, a reagent for detecting fluorescence may be preferably used, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 있어서, “다중 등온증폭반응(multiplex LAMP)”은 다양한 유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 바람직하게는 시료에서 신종 코로나바이러스의 RdRP, N, 및 E 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 유전자의 증폭 산물 확인을 통해 신종 코로나바이러스 감염 유무를 판별할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, in the present invention, "multiplex LAMP" can detect various genes simultaneously, preferably two types selected from the group consisting of RdRP, N, and E genes of novel coronavirus in a sample The presence or absence of novel coronavirus infection can be determined by checking the amplification products of the above genes, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 있어서 “실시간 다중 등온증폭반응(multiplex real-time LAMP)”는 상기 다양한 유전자의 증폭 유무를 실시간으로 확인하는 방법으로서 상기 3종의 프라이머 세트는 각각 형광 표지된 프라이머를 포함하여 시료에서 신종 코로나바이러스 감염 여부를 실시간으로 판별할 수 있다.In addition, in the present invention, “multiplex real-time LAMP” is a method for checking in real time whether or not the various genes are amplified. You can determine whether or not you have been infected with the novel coronavirus in real time.
본 발명의 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트는 신종 코로나바이러스 감염의 진단을 위한 등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)에 사용되는 것이 바람직하며, 등온증폭반응은 표적 DNA를 LAMP에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) LAMP일 수 있고, 실시간 LAMP (real-time LAMP)일 수 있으며, 또는 이들의 조합일 수 있다. The kit including the primer set of the present invention is preferably used for isothermal amplification (LAMP) for the diagnosis of novel coronavirus infection, and the isothermal amplification reaction amplifies the target DNA by LAMP It may be a one-step LAMP, a real-time LAMP, or a combination thereof.
본 발명에 있어서, "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. In the present invention, the term "primer" means a template under suitable conditions (for example, four different nucleoside triphosphates and a polymerization agent such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and at an appropriate temperature. - refers to a single-stranded oligonucleotide that can serve as a starting point for directing DNA synthesis. The appropriate length of the primer may vary depending on the intended use, but is usually 15 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form stable hybrids with the template. The primer sequence need not be completely complementary to the template, but must be sufficiently complementary to hybridize to the template.
본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.The primer of the present invention can be chemically synthesized using methods known in the art, such as, for example, phosphoramidite solid support method. In addition, it can be modified by methylation, encapsulation, etc. by a known method. In addition, if necessary, the primer of the present invention may include a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioactive isotopes (eg, 32P), fluorescent molecules, chemical groups (eg, biotin), and the like. have.
본 발명에 있어서, “내부 프라이머(inner primer)”는 주형 DNA에 결합하여 새로운 DNA 사슬 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.In the present invention, "inner primer" refers to a single-stranded oligonucleotide capable of binding to a template DNA and serving as a starting point for synthesis of a new DNA chain.
본 발명에 있어서, “외부 프라이머(outer primer)”는 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합한 위치보다 더 바깥쪽에서 주형 DNA에 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 DNA 사슬이 신장된 이후, 외부 프라이머와 주형 DNA의 결합으로 사슬 변위(strand displacement)가 발생하여 먼저 형성된 사슬이 떨어져 나오게 된다.In the present invention, the term "outer primer" refers to a single-stranded oligonucleotide that binds to the template DNA outside the position where the inner primer binds to the template DNA, and the inner primer binds to the template DNA to form a DNA chain. After this elongation, a strand displacement occurs due to the binding of the external primer and the template DNA, and the previously formed chain is separated.
본 발명에 있어서, “고리 프라이머(loop primer)”는 상기 내부 프라이머 및 외부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 형성된 초기 줄기 고리(stem loop) 구조 사슬이 고리(loop) 구조 생성 횟수를 증가시켜 결과적으로 전체 반응을 가속화시킬 수 있도록 하는, 뉴클레오티드 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.In the present invention, the “loop primer” refers to an initial stem loop structure formed by binding the inner primer and the outer primer to the template DNA by increasing the number of loop structures as a result. It refers to a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for nucleotide synthesis, allowing the reaction to be accelerated.
한편, 본 발명에서 고리 프라이머에서 형광물질이 부착된 염기를 특정하기 위한 염기의 번호매김은 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 염기 순서를 확인하는 방법과 동일하게 3'에서 5' 순서로 이루어진다. On the other hand, in the present invention, the numbering of the bases for specifying the base to which the fluorescent substance is attached in the ring primer is generally performed in the order of 3' to 5' in the same manner as in the method of confirming the order of the bases of the oligonucleotide.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.The present invention can apply various transformations and can have various embodiments. Hereinafter, specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and it should be understood to include all modifications, equivalents and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
[실시예][Example]
실시예 1. 2019-nCoV 검출용 프라이머 세트 설계Example 1. Design of a primer set for detection of 2019-nCoV
신종 코로나바이러스19의 정확한 검출을 위한 타겟 유전자 선별을 위하여 10개의 신종 코로나바이러스 19의 subtype을 조사하였고, 그 결과 변이에 영향을 받지 않고 확실한 바이러스 검출 결과를 제공할 수 있는 유전자로서 RdRP, E, N 및 S 유전자를 선정하였다. 각 유전자의 염기서열을 바탕으로 설계된 프라이머 세트는 형광프로브가 부착된 올리고펩타이드를 포함하고 있다. 각 타겟 유전자에 따른 프라이머 세트의 구체적인 정보는 하기 표 1과 같다. In order to select target genes for accurate detection of
실시예 2. 2019-nCoV 검출용 primer mix 및 LAMP 조성물의 조성과 반응 조건Example 2. Composition and reaction conditions of primer mix and LAMP composition for 2019-nCoV detection
real-time LAMP primer mix 조성은 하기 표 2에 나타내었으며, real-time LAMP를 위한 반응 혼합물의 시약(M-monitor LAMP kit 사용) 조성은 하기 표 3에 나타내었고, real-time LAMP는 하기 표 4의 반응 조건하에서 수행되었다.The composition of the real-time LAMP primer mix is shown in Table 2 below, the composition of the reagent (using M-monitor LAMP kit) of the reaction mixture for real-time LAMP is shown in Table 3 below, and the real-time LAMP is shown in Table 4 below. was carried out under the reaction conditions of
실시예 3. 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트의 검출 민감도 확인 Example 3. Confirmation of detection sensitivity of LAMP primer set for detection of 2019-nCoV
본 발명의 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트의 검출 한계를 확인하기 위하여 코로나19 바이러스의 RdRP, N, 또는 E 유전자를 삽입한 plasmid DNA(양성 대조군)를 3차 증류수로 1X107 ~ 1X100까지 희석하여 농도별 분석능을 확인하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. In order to confirm the detection limit of the LAMP primer set for detecting 2019-nCoV of the present invention, plasmid DNA (positive control) into which the RdRP, N, or E gene of
상기 표로 확인되는 바와 같이, RdRP 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트는 100 copy에서 증폭이 확인되었고, N 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트는 10 copy에서 증폭이 확인되었고, E 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트는 100 copy에서 증폭이 확인되었는바, 각 프라이머 세트는 높은 민감도로 타겟 유전자를 검출할 수 있음을 알 수 있다. As confirmed in the table above, the primer set targeting the RdRP gene was confirmed to be amplified in 100 copies, the primer set targeting the N gene was confirmed to be amplified in 10 copies, and the primer set targeting the E gene was Amplification was confirmed in 100 copies, it can be seen that each primer set can detect the target gene with high sensitivity.
실시예 4. 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트의 특이도 확인Example 4. Confirmation of specificity of LAMP primer set for detection of 2019-nCoV
신종 코로나바이러스-19에 대한 특이반응을 확인하기 위하여, 임상으로 확인된 코로나바이러스 3종(NL63, 229E, OC43/HKU1)과의 교차반응을 실시하였다. In order to confirm the specific response to novel coronavirus-19, cross-reaction with three clinically confirmed coronaviruses (NL63, 229E, OC43/HKU1) was performed.
그 결과, 4개의 2019-nCoV 검출용 프라이머 세트 모두 상호 교차 반응 및 비특이 반응에 대한 결과가 없음을 확인할 수 있었다(도 5 내지 도 8). As a result, it was confirmed that all of the four 2019-nCoV detection primer sets had no results for mutual cross-reaction and non-specific reaction ( FIGS. 5 to 8 ).
실시예 5. 임상샘플에서 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트와 WHO의 RT-qPCR 프라이머의 검출 민감도 비교 확인Example 5. Comparison of detection sensitivity of LAMP primer set for detection of 2019-nCoV in clinical samples and RT-qPCR primer of WHO
고려대학교 구로 병원에서 신종 코로나바이러스 감염으로 확진된 2개 검체로 WHO 기준의 RT-qPCR 프라이머와 상기 실시예 1에서 설계한 2종 프라이머 세트의 혼합 프라이머 세트(COVID19 RdRP/E gene multiplex CoV19 LAMP primer set, 도 9)의 신종 코로나바이러스 검출 민감도의 비교 테스트를 진행하였다. 각 샘플은 인후도말 샘플이며, 고려대학교 구로 병원에서 제공받아 사용하였다. A mixed primer set (COVID19 RdRP/E gene multiplex CoV19 LAMP primer set of the WHO standard RT-qPCR primer and the two primer sets designed in Example 1 above with two samples confirmed with novel coronavirus infection at Korea University Guro Hospital , a comparative test of the novel coronavirus detection sensitivity of FIG. 9) was performed. Each sample was a throat smear sample, and was provided and used by Korea University Guro Hospital.
각 샘플의 10분의 1희석배수를 이용하여 농도별 분석능을 검증한 결과는 하기 표 6 및 7에 나타내었으며, 하기 표로 확인되는 바와 같이, 본원의 혼합 프라이머 세트는 WHO의 RT-qPCR 프라이머와 비교하여 더 낮은 농도에서 신종 코로나바이러스 19를 검출할 수 있음을 알 수 있다. 도 10는 두개의 2019-nCoV 감염 Nasopharyngeal swab 원 검체에 대한 멀티플렉스 실험 결과를 나타낸다(도 10). The results of verifying the analytical ability for each concentration using 1/10 dilution of each sample are shown in Tables 6 and 7 below, and as confirmed in the table below, the mixed primer set of the present application is WHO's RT-qPCR primer and By comparison, it can be seen that the
시예 6. COVID19 RdRP/N 유전자와 인터널컨트롤(actin ß) 조합의 멀티플렉스 LAMP 프라이머의 검출 민감도 확인Example 6. Confirmation of detection sensitivity of multiplex LAMP primer of COVID19 RdRP/N gene and internal control (actin ß) combination
RdRp 및 N plasmid와 음성 검체로 상기 실시예 1에서 설계한 2종 프라이머 세트(COVID19 RdRP/N gene multiplex CoV19 LAMP primer set)와 인터널컨트롤 프라이머 세트의 혼합을 이용하여 다중 등온증폭반응을 수행하였다. RdRP 프라이머 세트와 N 프라이머 세트에 포함된 각 프로브는 Cy5로 형광표지되었으며, 인터널 컨트롤 actin ß를 포함한 증폭산물은 Evagreen을 이용하여 형광염색하였다. 그 결과, 코로나 19 바이러스의 RdRP 및 N 유전자는 Cy5 형광으로 검출할 수 있고, RdRP 및 N 증폭산물을 포함하는 actin ß 증폭산물은 evagreen으로 검출이 가능함을 확인하였다(도 11).Multiple isothermal amplification was performed using a mixture of RdRp and N plasmid and a negative sample with the two primer sets (COVID19 RdRP/N gene multiplex CoV19 LAMP primer set) designed in Example 1 and an internal control primer set. Each probe included in the RdRP primer set and the N primer set was fluorescently labeled with Cy5, and the amplification product including the internal control actin ß was fluorescently stained using Evagreen. As a result, it was confirmed that the RdRP and N genes of the
상기 결과를 기반으로, 고려대학교 구로 병원에서 신종 코로나바이러스 감염으로 확진된 10개 임상샘플과 음성샘플 10개를 RdRP/N/actin ß 멀티플렉스 LAMP assay를 통해 검출 민감도 및 특이도를 확인하였다. 신종 코로나바이러스 감염으로 확진된 샘플에 대한 결과는 하기 표 8에 나타내었고, 음성샘플을 대상으로 한 실험 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 하기 표로 확인되는 바와 같이, 본원의 혼합 프라이머 세트는 비특이적 반응없이 실험된 모든 COVID19 양성검체 모두를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.Based on the above results, the detection sensitivity and specificity of 10 clinical samples and 10 negative samples confirmed with novel coronavirus infection at Korea University Guro Hospital were confirmed by RdRP/N/actin ß multiplex LAMP assay. The results for the samples confirmed by the novel coronavirus infection are shown in Table 8 below, and the experimental results for the negative samples are shown in Table 9 below. As confirmed in the table below, it was confirmed that the mixed primer set of the present application can detect all of the tested COVID19 positive samples without a non-specific reaction.
양성 검체 수COVID-19
number of positive samples
음성 검체 수COVID-19
number of negative samples
상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As a specific part of the present invention has been described in detail above, for those of ordinary skill in the art, it is clear that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Korea University Research and Buisness Foundation <120> High sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification primer set for detection of novel coronavirus-19 <130> DHP20-194 <150> KR 1020200029268 <151> 2020-03-09 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_F3-1 <400> 1 ccgataagta tgtccgcaat 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_B3 <400> 2 gcttcagaca taaaaacatt gt 22 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_FIP <400> 3 atgcgtaaaa ctcattcaca aagtccaaca cagactttat gagtgtc 47 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_BIP <400> 4 tgatactctc tgacgatgct gtttaaagtt ctttatgcta gccac 45 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_FLP <400> 5 tgtgtcaaca tctctatttc tatag 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_BLP <400> 6 tcaatagcac ttatgcatct caagg 25 <210> 7 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Wu_LAMP_N_BLP_PROBE4_TEX <400> 22 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cgggtttacc caataatact gcgtctt 57 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_QUANCHER <400> 23 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_F3 <400> 24 cagaagtccc tgttgctat 19 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_B3 <400> 25 cgaggagaat tagtctgagt c 21 <210> 26 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_FIP <400> 26 tgcacgtgtt tgaaaaacat tagaatcatg cagatcaact tactcc 46 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_BIP <400> 27 ggctgtttaa taggggctga acatgataac tagcgcatat acctg 45 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_FLP <400> 28 cctgtagaat aaacacgcca agta 24 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_BLP <400> 29 tgtcaacaac tcatatgagt gtgac 25 <210> 30 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_BLP_PROBE4_HEX <400> 30 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cgcctgtaga ataaacacgc caagta 56 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_QUANCHER <400> 31 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_F3 <400> 32 agtaccccat cgagcacg 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_B3 <400> 33 agcctggata gcaacgtaca 20 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_FIP <400> 34 gagccacacg cagctcattg tatcaccaac tgggacgaca 40 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_BIP <400> 35 ctgaacccca aggccaaccg gctggggtgt tgaaggtc 38 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_LF <400> 36 tgtggtgcca gattttctcc a 21 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_LB <400> 37 cgagaagatg acccagatca tgt 23 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> High sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification primer set for detection of novel coronavirus-19 <130> DHP20-194 <150> KR 1020200029268 <151> 2020-03-09 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_F3-1 <400> 1 ccgataagta tgtccgcaat 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_B3 <400> 2 gcttcagaca taaaaacatt gt 22 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_FIP <400> 3 atgcgtaaaa ctcattcaca aagtccaaca cagactttat gagtgtc 47 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_BIP <400> 4 tgatactctc tgacgatgct gtttaaagtt ctttatgcta gccac 45 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_FLP <400> 5 tgtgtcaaca tctctatttc tatag 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_BLP <400> 6 tcaatagcac ttatgcatct caagg 25 <210> 7 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_F3-1 <400> 7 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cgtcaatagc acttatgcat ctcaagg 57 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_B3 <400> 8 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_F3 <400> 9 tcattcgttt cggaagaga 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_B3 <400> 10 aggaactcta gaagaattca gat 23 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_FIP <400> 11 tgtaactagc aagaatacca cgaaacaggt acgttaatag ttaatagcg 49 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_BIP <400> 12 gcttcgattg tgtgcgtact cgagagtaaa cgtaaaaaga agg 43 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_BLP <400> 13 gctgcaatat tgttaacgtg agtc 24 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_LB_P4_HEX <400> 14 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_BLP_PROBE4_HEX <400> 30 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cgcctgtaga ataaacacgc caagta 56 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_QUANCHER <400> 31 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_F3 <400> 32 agtaccccat cgagcacg 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_B3 <400> 33 agcctggata gcaacgtaca 20 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_FIP <400> 34 gagccacacg cagctcattg tatcaccaac tgggacgaca 40 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_BIP <400> 35 ctgaacccca aggccaaccg gctggggtgt tgaaggtc 38 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_LF <400> 36 tgtggtgcca gattttctcc a 21 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_LB <400> 37 cgagaagatg acccagatca tgt 23
Claims (20)
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) primer set for detecting novel coronavirus, comprising the primers of SEQ ID NOs: 1 to 6.
상기 프라이머 세트는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 8의염기서열로 이루어진 퀀처(quancher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
According to claim 1,
The primer set LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a quencher consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
3. The method of claim 2,
The probe is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein (fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) , fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, Alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine) isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine-based dyes, and any one or more fluorescent substances selected from the group consisting of thiadicarbocyanine LAMP primer set for novel coronavirus detection, characterized in that it is attached.
상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
According to claim 1,
The primer set is a LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises the primers of SEQ ID NOs: 32 to 37.
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) primer set for novel coronavirus detection, comprising the primers of SEQ ID NOs: 9 to 13.
상기 프라이머 세트는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 퀀처(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
6. The method of claim 5,
The primer set LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 and a quencher consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
7. The method of claim 6,
The probe is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein (fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) , fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, Alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine) isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine-based dyes, and any one or more fluorescent substances selected from the group consisting of thiadicarbocyanine LAMP primer set for novel coronavirus detection, characterized in that it is attached.
상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
6. The method of claim 5,
The primer set is a LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises the primers of SEQ ID NOs: 32 to 37.
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) primer set for detecting novel coronavirus, including primers of SEQ ID NOs: 16 to 21.
상기 프라이머 세트는 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 퀀쳐(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
10. The method of claim 9,
The primer set LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and a quencher consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.
상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
11. The method of claim 10,
The probe is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein (fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) , fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, Alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine) isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine-based dyes, and any one or more fluorescent substances selected from the group consisting of thiadicarbocyanine LAMP primer set for novel coronavirus detection, characterized in that it is attached.
상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
10. The method of claim 9,
The primer set is a LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises the primers of SEQ ID NOs: 32 to 37.
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) primer set for novel coronavirus detection, comprising the primers of SEQ ID NOs: 24 to 29.
상기 프라이머 세트는 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 퀀쳐(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
14. The method of claim 13,
The primer set LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 and a quencher consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31.
상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
14. The method of claim 13,
The probe is FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein (fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) , fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, Alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-XRhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine) isothiocyanate), TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), cyanine-based dyes, and any one or more fluorescent substances selected from the group consisting of thiadicarbocyanine LAMP primer set for novel coronavirus detection, characterized in that it is attached.
상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
14. The method of claim 13,
The primer set is a LAMP primer set for detecting novel coronavirus, characterized in that it further comprises the primers of SEQ ID NOs: 32 to 37.
The primer set of any one of claims 1 to 4; The primer set of any one of claims 5 to 8; The primer set of any one of claims 9 to 12; and the primer set of any one of claims 13 to 16; comprising two or more primer sets selected from the group consisting of, multiple LAMP primer sets for detecting novel coronavirus.
(2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 제14항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 신종 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.
(1) isolating the genomic DNA (gDNA) of the biological sample;
(2) amplifying the target sequence by performing an isothermal amplification reaction using the isolated gDNA as a template and the primer set of claim 14; and
(3) detecting the amplified product; information providing method for diagnosing novel coronavirus infection, including.
상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 인후 도말(throat swab)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.
19. The method of claim 18,
The biological sample of step (1) is a novel coronavirus, characterized in that at least one selected from the group consisting of sputum, bronchial aspiration and bronchial washing, and throat swab Method of providing information for diagnosis of infection.
상기 (3) 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.
19. The method of claim 18,
Step (3) is an information providing method for diagnosing novel coronavirus infection, characterized in that it is performed by one or more methods selected from the group consisting of DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement.
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| Yu GY, Lou Z, Zhang W. [Several suggestion of operation for colorectal cancer under the outbreak of Corona Virus Disease 19 in China]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi. 2020 Feb 19;23(3):9-11 |
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