KR20210112846A

KR20210112846A - 디스트럭신(Destruxin)을 포함하는 재선충 방제용 조성물

Info

Publication number: KR20210112846A
Application number: KR1020200028397A
Authority: KR
Inventors: 조병관; 신종오; 성재민; 김선창
Original assignee: 한국과학기술원; 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2021-09-15
Also published as: WO2021177795A1

Abstract

본 발명은 디스트럭신(Destruxin)을 포함하는 재선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 재선충 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명의 디스트럭신 A는 소나무 재선충에 대해 강력하고 빠른 마비 및 살충 효과를 나타내는 것으로, 이를 소나무 재선충 방제에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

디스트럭신(Destruxin)을 포함하는 재선충 방제용 조성물{A composition for prevent bursaphelenchus xylophilus comprising Destruxin}

본 발명은 디스트럭신(Destruxin)을 포함하는 재선충 방제용 조성물 및 이를 이용한 재선충 방제 방법에 관한 것이다.

　소나무　재선충(Bursaphelenchusxylophilus)은 선충(nematode)에 속하며, 소나무, 해송, 잣나무, 전나무에서 기생하면서, 기주 식물의 고사를 일으킨다. 소나무　재선충은 매개체의 체내로 들어가, 매개체를 따라 나무들 간에 전파된다.　재선충은 수체 내에 곰팡이를 먹으면서 증식하며, 식물의 가도관 (tracheid)을 막아 수분이동을 차단함으로써 고사를 야기한다.

소나무의　재선충에 의한 고사는 전 세계적이며, 특히 서유럽과 한국을 포함한 동북아시아에서 급격히 확산되어 막대한 삼림 피해를 유발하고 있다. 소나무　재선충병 방제는 솔수염 하늘소를 대상으로 한 방제, 감염목을 벌채한 후 약물처리 하는 방법, 그리고 살선충제를 소나무에 주입하는 방법이 있다.

살선충제인 에버멕틴 (avermectin) 계열의 약물 (emamectin, abamectin, ivermectin 등)은 무척추동물에만 존재하는 특이한 형태의 glutamate-gated chloride channel을 표적으로 하며, 염소 이온에 대한 세포질막의 투과도를 높임으로써 살충 효과를 나타내는 것으로 알려져 있고, 대한민국 공개특허 제10-2009-0037158호에서는 셀러리 (Celery, Apium graveloens). 레몬 그라스 (Lemongrass, Cymbopogon flexuosus), 시트로넬라 그라스(Citronella grass Cymbopogon witerianus), 카라웨이 (trachyspermum ammi), 파인 (Pinus rexburghii), 및 바실 (Basil, Ocium Basilicum)로 이루어지는 군에서 1종 이상 선택된 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 소나무 재선충 방제제에 대해 개시하고 있다.

그러나, 상기 물질들은 소나무 재선충을 선택적으로 살상하는 효과가 충분하지 않아 새로운 재선충 방제용 조성물에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 소나무 재선충 방제제를 개발하고자 예의 노력한 끝에, 디스트럭신(Destruxin)이 재선충을 살상하는 살충 효과가 기존 물질보다 매우 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 디스트럭신 A(Destruxin A)를 포함하는. 재선충 방제용 조성물, 재선충 방제제, 및 소나무재선충병 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 디스트럭신 A를 곤충, 식물, 식물의 종자, 및 식물 재배지 중 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는, 소나무 재선충 방제방법, 및 소나무재선충병 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 하나의 양태는 디스트럭신 A(Destruxin A)를 포함하는 재선충 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "디스트럭신 A(Destruxin A)"는 알파-하이드록시산과 5개의 아미노산이 아미드 또는 에스터 결합을 이루어 고리구조를 이룬 화합물을 의미한다. 디스트럭신 A는 Metarhizium anisopliae (Oospora destructor) 등의 진균류(fungi)로부터 분비되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 디스트럭신 A는 고리형 헥사 뎁시-펩타이드(cyclohexadepsipeptide)로 C₂₉H₄₇N₅O₇의 화학식을 가지는 화합물 일 수 있다.

본 발명의 디스트럭신 A는 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 디스트럭신 A는 (3S,6S,9S,16R,21aS)-16-allyl-3-sec-butyl-6-isopropyl-5,8,9-trimethyldodecahydropyrrolo[1,2-d][1,4,7,10,13,16]oxapentaazacyclononadecine-1,4,7,10,14,17(11H,16H)-hexaone로 명명되는 화합물 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 상기 디스트럭신 A를 재선충에 처리하여, 마비 및 살충 효과를 확인하였는 바, 디스트럭신 A를 재선충 방제에 이용할 수 있음을 확인하였다 (도 1 내지 도 3).

본 발명에서, 용어 "재선충"은 "소나무재선충"과 상호 교환적으로 사용되며, 본 발명의 재선충은 소나무, 잣나무, 해송, 전나무 등에 기생해 나무를 갉아먹는 선충을 의미한다. 소나무재선충은 크기 1mm 내외의 실 같은 선충으로 매개충의 몸 안에 서식하다가 새순을 갉아 먹을 때 상처부위를 통하여 나무에 감염되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 상기 재선충은, 소나무재선충병의 원인균인 Bursaphelenchus xylophilus (B. Xylophilus)일 수 있으나 제한되지 않는다. 상기 재선충은 균식성일 수 있으며, 예를 들어 Pestalotia sp. Botrytis cinerea 등 다양한 사상균을 먹이로 하는 것일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않고 소나무 유조직 등을 섭식할 수도 있다.

본 발명에서 "소나무재선충병(Pine tree wilt disease)"은 소나무재선충에감염되어 솔잎이 시들어 고사하는 식물병을 의미한다.

가도관 폐쇄에 의한 수분이동차단, 과민반응에 의한 소나무 세포사멸, 소나무재선충의 세균/진균 독소에 의한 스트레스 등에 의해 소나무재선충병이 발생할 수 있다.

일 예로 소나무재선충이 소나무 내에서 단기간에 급속하게 증식하면서 가도관을 막아 발생하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않고 기주수목인 소나무, 매개충인 솔수염하늘소, 병원체인 재선충, 그리고 미생물 등과 같은 제3 요인 간의 밀접한 상관관계의 결과로 발생하는 것일 수 있다.

소나무재선충병은 감염 후 시간 경과에 따라 솔잎이 연두색 또는 갈색으로 변하는 등의 증상이 있거나, 소나무 잎이 우산살 모양으로 처지면서 수세가 약화되거나, 매개충이 탈출한 흔적(탈출공)이 있거나, 소나무 표피가 건조하거나, 톱으로 절단시 송진이 전혀 없는 등의 증상을 나타낼 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, "방제"란 작물 등의 식물을 병해충의 피해로부터의 예방, 발생한 병원체의 제거 또는 병원체의 파급을 저지시키는 것을 의미한다. 병해충에 독성이 있는 살균제 또는 살충제를 사용하는 화학적 방제뿐 아니라 저항성 식물의 재배, 돌려짓기 등을 이용하여 병원체에 대해 부적절한 환경을 조성하는 방법, 식물체를 열처리하거나 토양을 증기처리하여 병원체를 제거하는 방법, 유인물질이나 성페로몬을 이용하여 해충을 유인하여 포살하는 방법 등이 포함된다.

본 발명의 목적 상, 상기 방제는 본 발명의 디스트럭신 A를 사용하여 병원체인 재선충의 살충, 마비, 제거 또는 그의 파급을 저지시키는 것일 수 있고, 구체적으로는 재선충의 살상을 의미할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 디스트럭신을 20 내지 400 uM 농도로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 디스트럭신을 20 내지 200uM, 20 내지 150uM, 20 내지 100uM, 20 내지 80 uM, 또는 20 내지 60 uM의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 통상적으로 이용되는 살충제 또는 살균제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 일 예로, 재선충 방제에 사용되는 물질을 포함할 수 있고, 구체적으로 기존 재선충 방제 효과를 나타내는 것으로 확인된 화합물인 아바멕틴(Abamectin) 및 이버멕틴(Ivermectin) 등도 함께 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은, 상기 활성성분 이외에 부형제로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제 또는 기타 보조제 예를 들어 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 방제용 조성물은 활성성분과 상기 부형제를 혼합하여 농업용 조성물로 제제화시켜 사용할 수 있고, 농업용 조성물로 제제화하는 방법으로 당분야에서 통상적으로 사용되는 방법은 모두 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 방제용 조성물은 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제공될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 디스트럭신 A(Destruxin A)를 유효성분으로 포함하는 재선충 방제제를 제공한다.

디스트럭신 A, 재선충 및 방제에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 디스트럭신 A(Destruxin A)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 소나무재선충병 치료는 소나무 재선충의 "방제"와 동일한 의미 혹은 방제에 의해 발생하는 상태를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "예방" 이란 본 발명의 디스트럭신에 의해 소나무재선충병 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 디스트럭신 투여 및/또는 처리에 의해 소나무재선충병 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 디스트럭신 A를 곤충, 식물, 식물의 종자, 및 식물 재배지 중 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는, 소나무 재선충 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 디스트럭신 A를 곤충, 식물, 식물의 종자, 및 식물 재배지 중 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는, 소나무 재선충병(Pine wilt disease) 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 방제 또는 치료방법은, 곤충, 식물, 식물의 종자, 및 식물 재배지 중 하나 이상에 처리하여 본 발명의 디스트럭신 A를 포함하는 조성물 또는 제제를 소나무재선충병의 원인균인 Bursaphelenchus xylophilus와 직접 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 디스트럭신 A를 포함하는 조성물 또는 제제를 작물이나 작물의 종자에 침지하거나 관주, 즉, 분무할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 조성물 또는 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 담가둘 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 디스트럭신 A를 포함하는 조성물 또는 제제를 나무 줄기에 주입할 수 있다. 본 발명의 조성물을 나무줄기에 주입하는 방법으로는 앰플(ampoule) 주입법, 스폿(spot) 주입법, 보링(boring) 주입법, 들판체 주입기법, 낙차 주입법등을 포함하며, 주입량으로서는 목적, 시기, 수령, 수목의 크기 및 피해상황에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 디스트럭신 A는 소나무 재선충에 대해 강력하고 빠른 마비 및 살충 효과를 나타내는 것으로, 이를 소나무 재선충 방제에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 소나무 재선충에 다양한 농도의 디스트럭신 A와, 기존 알려진 재선충 방제용 화합물인 아바멕틴, 이버멕틴을 처리하고 시간 경과에 따른 마비율을 확인한 것이다.
도 2는 소나무 재선충에 40uM 디스트럭신 A, 아바멕틴, 이버멕틴을 처리하고 시간 경과에 따른 생존율을 측정하여 살충 효과를 확인한 것이다. (그래프 아래 사진 설명 필요)
도 3은 40uM 디스트럭신 A, 아바멕틴, 이버멕틴을 처리한 재선충의 생존율과 LT50값을 확인한 것이다.
도 4는 아트로바스타틴(atrovastatin), 스테리그마토시스틴(Sterigmatocystin) 및 디스트럭신 A(Destruxin A)를 각 농도별로 처리하여 시간 경과에 따른 재선충의 생존율(Survival rate)을 측정한 것이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험 재료 및 방법

보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) KACC 40573 을 KACC에서 분양받아 26℃에서 PDA 플레이트에 배양한 배지에 재선충(Bursaphelenchus xylophilus; pine wood nematode)을 배양한 후, Baermann funnel technique을 이용하여 재선충을 분리하여 실험에 사용하였다.

증류수 10 ul당 20-40 마리 소나무 재선충의 농도로 희석하여 소나무 재선충 현탁액을 제조하였다. 96 웰 플레이트에 제조된 현탁액 10ul, 각 실시예에서의 화합물을 90ul 씩 가하였다. 각 처리는 3회 반복하였으며 12시간 마다 재선충의 마비율 및 치사율을 측정하였다.

실시예 2: 디스트럭신 A의 재선충 마비 및 살상 효과 확인

실시예 2-1: 디스트럭신 A의 재선충 마비 효과 확인

디스트럭신 A(Destruxin A), 아바메시틴(Avermectin) 및 이버멕틴(Ivermectin)을 이용하여 재선충의 마비율(Paralysis rate) 을 측정하였다. 디스트럭신 A는 증류수를 이용하여, 아바메시틴 및 이버멕틴은 메탄올을 이용하여 0 내지 200 uM 농도로 희석하여 사용하였다.

Nikon Eclipse Ti-U microscope을 이용하여 움직임을 확인하여, 15초 간 움직임이 없으면 재선충이 마비된 상태로 간주하였다. 마비율(paralysis rate) 측정 결과를 도 1에 표시하였다.

실험 결과, 디스트럭신 A는 기존 재선충 방제 효과를 나타내는 것으로 확인된 화합물인 아바멕틴(Abamectin) 및 이버멕틴(Ivermectin)과 유사한 정도의 마비율을 나타내었으나, 시간 경과 및 농도에 따라 양상이 달라짐을 확인하였다. 이를 토대로, 디스트럭신 A에 의한 재선충 마비 효과는 재선충 살상에 의해 나타나는 것이라고 가정하고 추가적인 실험을 수행하였다.

실시예 2-2: 디스트럭신 A의 재선충 살상 효과 확인

실시예 2-1의 결과로부터 디스트럭신 A가 재선충 살상능을 가질 것으로 예측하고, 디스트럭신 A, 아바멕틴 또는 이버멕틴을 재선충에 처리하여 살상능을 비교하였다.

재선충의 사멸은 propidium iodiode 염색을 통해 확인하였다. 구체적으로 Propodium iodide를 각 웰 당 최종 2.5μM농도가 되도록 마이크로플레이트에 첨가하고, 15분간 horizontal shaker에 120rpm속도로 상온에서 15분간 인큐베이팅하고 Nikon Eclipse Ti microscope으로 측정함으로써 재선충 사멸을 확인하였다. 총 72시간 동안, 12시간마다 죽은 재선충의 수를 총 6회 측정하여, LT50 값을 계산하여 도 2 및 도 3에 관찰 결과를 나타내었다.재선충의 치사율을 확인한 결과, 아바멕틴(Abamectin) 및 이버멕틴(Ivermectin)과 동일한 농도로 처리하였을 때, 본 발명의 디스트럭신 A가 매우 유의한 수준으로 재선충의 생존율을 감소시키는 것을 확인하였으며(도 2), LT50값 역시 다른 2개의 물질에 비해 약 50%-40% 수준으로(도 3) 매우 짧은 시간 동안 많은 재선충을 방제할 수 있음을 확인하였다.

추가적으로 아트로바스타틴 및 스테리그마토시스틴에 대해서도 재선충 살상능 비교실험을 수행하여 결과를 도 4에 나타내었다.

아트로바스타틴은 0.1-1mM 범위에서, 스테리그마토시스텐은 1-20uM에서 효과가 있다고 보고된 바 있는 물질이다. (Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Oct 27;106(43):18285-90, Pest Manag Sci 64:119-125(2008)) 이에, 상기 2종의 물질은 기존에 효과가 있다고 보고된 농도로 효과를 실험하였으며, 디스트럭신 A는 전술한 실시예에서 효과를 확인한 농도로 처리하였다.

실험 결과, 디스트럭신 A는 아트로바스타틴 및 스테리그마토시스틴에 비해 재선충 생존율을 크게 감소시키는 것을 확인하엿는바, 본 발명의 디스트럭신 A가 재선충 방제에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 디스트럭신 A가 재선충을 직접 살상하는 데 있어서 기존 물질보다 매우 효과적임을 확인하였는 바, 상기 화합물을 재선충 방제에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

디스트럭신 A(Destruxin A)를 포함하는 재선충 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 디스트럭신 A는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 재선충 방제용 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]
제1항에 있어서, 상기 조성물에서 디스트럭신 A의 농도는 20 내지 400 uM인, 재선충 방제용 조성물.
디스트럭신 A(Destruxin A)를 유효성분으로 포함하는 재선충 방제제.
디스트럭신 A(Destruxin A)를 유효성분으로 포함하는 소나무재선충병 예방 또는 치료용 조성물.
디스트럭신 A를 곤충, 식물, 식물의 종자, 및 식물 재배지 중 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는, 재선충 방제 방법.
제6항에 있어서, 상기 디스트럭신 A는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 재선충 방제 방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제6항에 있어서, 상기 방법은 상기 디스트럭신 A를 20 내지 400 uM의 농도로 처리하는 것인, 재선충 방제 방법.
디스트럭신 A를 곤충, 식물, 식물의 종자, 및 식물 재배지 중 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는, 소나무 재선충병(Pine wilt disease) 예방 또는 치료 방법.
제9항에 있어서, 상기 디스트럭신 A는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 소나무 재선충병(Pine wilt disease) 예방 또는 치료 방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

.
제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 디스트럭신 A를 20 내지 400 uM의 농도로 처리하는 것인, 소나무 재선충병(Pine wilt disease) 예방 또는 치료 방법.