KR20210112346A

KR20210112346A - 눈에서 혈관신생을 촉진하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20210112346A
Application number: KR1020217024590A
Authority: KR
Inventors: 나폴레옹 페라라; 퀸 리; 핀 리
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-09-14
Also published as: AU2019419468A1; EP3905885A4; CN113301915A; EP3905885A1; US20220105157A1; WO2020142349A1; CA3125605A1; JP2022516917A

Abstract

백혈병 저해 인자(LIF: leukemia inhibitory factor) 또는 카디오트로핀-1(CT-1: cardiotrophin-1)을 포함한 IL-6 패밀리(family) 단백질을 이용하여 눈에서 혈관신생(angiogenesis)을 촉진하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

눈에서 혈관신생을 촉진하기 위한 조성물 및 방법

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2019년 1월 4일자로 출원된 미국 임시출원 62/788,174호의 우선권의 이익을 주장하며, 이 출원은 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

본 발명은 눈의 병태를 경감시키기 위한 혈관신생(angiogenesis)의 촉진에 관한 것이다.

혈관신생은 배아 발달, 성인 혈관 항상성, 및 조직 수선에 필요한 생리학적 과정이다(1). 또한, 혈관신생은 여러 가지 병리학적 병태, 예컨대 종양 및 습식 노화-관련 황반 변성(AMD: age-related macular degeneration)을 포함하여 몇몇 안구내 장애(intraocular disorder)에 기여한다(1). 종양 진행 동안, 새로운 혈관은 신생물 조직(neoplastic tissue)에 영양분 및 산소를 제공하므로, 필수적인 역할을 하고; 안구내 장애에서, 비정상적인 누출 혈관(leaky blood vessel)의 성장은 망막을 파괴하고 실명을 유발할 수 있다(1, 2). 혈관신생의 분자적 기초를 정밀분석(dissect)하고 신생물 및 다른 질환에 대한 치료 표적을 식별하기 위한 광범위한 노력은 혈관 발달 및 분화에 관여하는 주된 신호전달 경로의 발견을 초래하였다(1, 3). 특히, 수많은 연구는 생리학적 혈관신생에서 VEGF 경로의 중추적인 역할을 확립하였고, 이러한 경로를 표적화하는 치료법은 암 및 안구내 장애, 예컨대 습식 AMD의 치료에서 성공을 달성하였다(4, 5). 역으로, 혈관신생을 자극하는 것은, 여러 가지 허혈 장애를 갖는 환자의 성과를 향상된 관류(perfusion)를 통해 향상시키는 장래성을 보유한다(6). 이러한 가설은 지난 수십년 이내에, 관상동맥(coronary) 또는 사지(limb) 허혈증(ischemia) 환자에서 유전자 치료법에 의해 또는 재조합 단백질로서 전달되는 혈관신생 인자, 예컨대 VEGF 또는 bFGF를 시험하는 일련의 임상 시험을 유발하였다. 안타깝게도, 이들 연구 중 어느 것도, 유망한 전임상 연구에도 불구하고 성공적이지 않았다(7). 따라서, 혈관신생 치료법(angiogenic therapy)를 향상시키기 위한 신규 전략을 식별하는 필요성이 존재한다.

교모세포종(glioblastoma) 세포는 여러 가지 혈관신생 인자를 분비하며, 이들 인자는 이러한 종양의 고도로 혈관성(vascular) 표현형에 기여한다(8). LN-229 교모세포종 세포주로부터 유래된 이종이식(xenograft) 종양은 매우 낮은 VEGF 발현에도 불구하고 적절하게 혈관화된다(9, 10). 따라서, LN-229 세크레톰(secretome)은 추정 내피 미토겐(putative endothelial mitogen)을 특징화하는 데 관심 있다.

사이토카인의 IL-6 슈퍼패밀리(superfamily)는 백혈병 저해 인자(LIF: leukemia inhibitory factor)를 포함한다. 이는 배아 줄기세포의 전분화능(pluripotency)을 유지시키는 이의 능력으로 인해 실험 줄기세포 생물학에서 광범위하게 사용된다. 상이한 유형의 세포 및 조직에서, 배아 이식, 조혈 세포 발달, 염증 반응, 종양 진행 등을 포함하여 LIF의 여러 가지 역할이 또한 관찰되었다(67).

혈관신생에서 LIF의 역할은 아직까지 논쟁의 소지가 있다. 이는 초기에 소(bovine) 대동맥 내피 세포에 대한 항혈관신생 인자로서 특징화되었고, 소 부신피질 모세혈관 내피 세포에는 아무런 효과를 나타내지 않았으며(35), 이는 LIF가 상이한 유형의 내피 세포에 대해 구별하여(distinctively) 작용함을 시사한다. 후속 연구는 상당한 복잡성을 보여주었다. LIF를 과발현하는 유전자이식(transgenic) 마우스는 눈에서 감소된 혈관구조(vasculature)를 보여주었으며(14); 한편, 동형접합성 LIF 넉아웃(knockout) 대립유전자를 보유하는 마우스는 망막에서 증가된 혈관 밀도를 가졌다(16). 초기 생후(early postnatal) 기간에서 래트 새끼(pup) 내로의 재조합 LIF의 주사 또한, 발달 중인 망막에서 약간 증가된 무혈관(avascular) 영역을 초래하였다(22).

본 발명은 IL-6 슈퍼패밀리의 구성원(member), 및 이의 기능성 단편이 예컨대 노화-관련 황반 변성 및 미숙아 망막병증(ROP)으로 제한되지 않는 병태를 치료적으로 치료하는 것을 필요로 하는 대상체의 눈에서 혈관신생을 증가시키는 데 사용될 수 있음을 제공한다. 구현예에서, 대상체는 인간이다.

구현예에서, 본 발명은 대상체의 눈에서 부적절한 혈관화(vascularization)와 관련된 병태의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 IL-6 패밀리 단백질, 또는 이의 기능성 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 혈관신생을 촉진하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 본 발명은 IL-6 패밀리 단백질이 백혈병 저해 인자(LIF) 또는 카디오트로핀-1(CT-1: cardiotrophin-1)임을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 투여가 망막 미세혈관 밀도(retinal microvessel density)를 증가시킴을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 투여가 맥락막 내피 세포(choroidal endothelial cell)의 증식을 증가시킴을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 병태가 노화-관련 황반 변성임을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 병태가 미숙아 망막병증(ROP)임을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 투여가 유리체내 주사(intravitreal injection)를 통한 것임을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 유효량이 혈관 누출(vascular leakage)을 유도하지 않음을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 유효량이 부종(edema)을 유도하지 않음을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 대상체의 눈에서 혈관 형성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 IL-6 패밀리 단백질, 또는 이의 기능성 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

구현예에서, 본 발명은 투여가 망막 혈관신생(retinal angiogenesis)을 증가시킴을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 투여가 맥락막 내피 세포의 증식을 증가시킴을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 대상체가 노화-관련 황반 변성을 가짐을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 대상체가 미숙아 망막병증(ROP)을 가짐을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 투여가 유리체내 주사를 통한 것임을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 유효량이 혈관 누출을 유도하지 않음을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 유효량이 부종을 유도하지 않음을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 IL-6 패밀리 단백질이 백혈병 저해 인자(LIF)임을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 IL-6 패밀리 단백질이 카디오트로핀-1(CT-1)임을 제공한다.

도 1a 내지 도 1f는, LIF가 LN-229 조건화된 배지로부터의 내피 세포 미토겐임을 도시한다. LN-229 조건화된 배지는 소 맥락막 내피 세포의 성장을 자극한다, n=3(도 1a). VEGF 중화 항체는 LN-229 CM에 의해 유도되는 BCE 세포 성장을 억제시키는 데 실패한다, n=3(도 1b). LN-229 CM의 역상 크로마토그래피 분획은 BCE 세포 성장을 유도한다. BCE 세포는 도면에서 지시된 바와 같이 분획(2 μl/웰)과 함께 인큐베이션되었다, n=3(도 1c). 항-LIF 중화 항체는 역상 분획(reverse-phase fraction)에 의해 유도된 BCE 세포 성장을 무효화한다, n=3(도 1d). 재조합 인간 LIF 단백질은 BCE 세포의 성장을 용량-의존적 방식으로 자극한다. BCE 세포는 비히클, VEGF(10 ng/ml) 및 지시된 농도의 재조합 인간 LIF(rhLIF)의 존재 하에 배양되었다, n=3(도 1e). LIF 및 VEGF는 BCE 세포 성장을 상승작용적으로 자극한다. 세포 증식은 6일 후 알라마 블루(alamar blue)를 사용하여 분석되었다, n=3. 막대 및 오차 막대는 평균±SD를 나타낸다. *, p<0.05; **, p<0.01; #, p≤0.0001; ns, 통계적으로 유의하지 않음(도 1f).
도 2a 내지 도 2e는 LIF가 JAK-STAT3 경로를 통해 BCE 세포 성장을 촉진함을 도시한다. JAK 저해제 바리시티닙(Ba: baricitinib)은 LIF에 의한 STAT3의 활성화를 차단한다. BCE 세포는 DMSO, 바리시티닙(2 μM), 코비메티닙(Co: cobimetinib)(150 nM) 또는 BEZ235(BE)(5 nM)와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션된 다음, 비히클 또는 LIF(10 ng/ml)로 15분 동안 처리되었다. Ctrl, 저해제와의 예비-인큐베이션이 없음(도 2a). 바리시티닙은 LIF-유도 BCE 세포 성장을 억제시킨다. BCE 세포는 DMSO, 바리시티닙, 코비메티닙 또는 BEZ235와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션된 다음, 비히클, LIF(10 ng/ml) 또는 VEGF(10 ng/ml)로 처리되었다. 세포 증식은 6일 후에 분석되었다, n=3(도 2b). 도 2c 및 도 2d는 BCE 세포에서 STAT3 넉다운(knockdown)을 도시한다. BCE 세포는 si음성(siNegative) 및 STAT3를 표적화하는 siRNA로 형질주입(transfect)되었다. qRT-PCR을 수행하여, STAT3 mRNA 수준을 검사하였다. Si음성에서의 STAT3 수준은 1로 설정되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 데이터는 평균화되었으며, 도 2c에 제시된다. 도 2d에서, siRNA로 형질주입된 세포는 LIF(10 ng/ml) 또는 비히클로 15분 동안 처리되었다. 전체-세포 용해물은 지시된 항체를 이용하는 웨스턴 블로팅을 받았다. LIF-유도 BCE 세포 성장은 STAT3 넉다운에 의해 무효화(abolish)되었다. STAT3 넉다운된 BCE 세포는 LIF(10 ng/ml) 또는 비히클과 함께 배양되었다. 세포 증식은 3일 후에 분석되었다. 각각의 비히클 군에 대한 590 nm에서의 형광 판독은 1로 설정되었다, n=3. si음성, 임의의 기지의 유전자를 표적화하지 않는 음성 대조군 siRNA. **, p<0.01; *** p<0.001; #, p≤0.0001; ns, 통계적으로 유의하지 않음(도 2e).
도 3a 내지 도 3j는, LIF가 생체외 및 생체내 모델에서 혈관신생을 촉진함을 도시한다. 도 3a 및 도 3b는 LIF에 의한 마우스 맥락막 발아(choroidal sprouting)의 유도를 도시한다. 접종-후(post-seeding) 6일째에 1차 맥락막 외식편으로부터의 혈관 증식은 도 3a의 대표적인 사진에 도시되어 있다. 보충제는 지시된 바와 같이 각각의 시료에 첨가되었다. 혈관싹(vascular sprout)의 성장의 정량화는 Axiovision 소프트웨어를 사용하여 수행되었다, n=5. 도 3c 및 도 3d는 LIF의 유리체내 주사가 마우스 눈에서 혈관 밀도를 증가시킴을 도시한다. 성체(adult) 마우스에게 지시된 양의 VEGF 및 LIF가 유리체내로 주사되었다. 주사 후 7일째에, PFA-고정 맥락막-공막 복합체(choroid-sclera complex) 및 망막이 CD31 IF를 받았다. CD31-양성 혈관의 대표적인 이미지는 도 3c에 도시되어 있다. ImageJ 소프트웨어로 결정된 혈관 밀도는 도 3d에 제시되어 있다, n=5-8. 도 3e 및 도 3f는 LIF-치료 마우스 망막의 OCTA 이미지화(imaging)를 도시한다. 성체 마우스에게 1 μl의 LIF(50 ng) 또는 비히클 용액(PBS)이 유리체내로 주사되었다. 망막 OCTA 이미지는 주사 후 7일째에 수득되었으며, 대표도는 도 3e에 도시되어 있다. 혈관 밀도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 혈관-피복(covered) 영역/총 영역 표면의 백분율로 결정되었으며, 도 3f에 도시되어 있다, n=7-8. 도 3g 및 도 3h는 LIF 치료가 마우스 망막에서 혈관 밀도를 증가시킴을 도시한다. 성체 마우스에게 LIF(10 ng) 또는 비히클 용액이 유리체내로 주사되었다. 주사 후 7일째에, 마우스 눈의 냉동된 절편(section)은 H&E 염색 및 CD31 IF 염색을 받았다. 대표적인 이미지는 도 3g에 도시되어 있다. ImageJ 소프트웨어를 사용한 CD31-양성의 정량화는 도 3h에 도시되어 있다, n=4. 도 3i 및 도 3j에서, 5일령 신생(neonatal) 마우스에게 LIF(50 ng) 또는 비히클 용액(PBS)이 유리체내로 주사되었다. 3일 동안 치료 후, 마우스 망막은 Dylight-488-표지 렉틴(lectin)을 이용한 IF 염색을 받았다. 유사한 안구 장소(ocular loci)에 대한 대표적인 이미지는 도 3i에 도시되어 있다. ImageJ 소프트웨어를 사용한 렉틴-표지 영역의 정량화는 도 3j에 도시되어 있다, n=4. *, p<0.05; **, p<0.01.
도 4a 내지 도 4f는 LIF가 JAK-STAT3 경로를 통한 BAE 세포 성장을 저해함을 도시한다. 재조합 인간 LIF는 BAE 세포의 성장을 용량-의존적 방식으로 저해한다. BAE 세포는 비히클 및 지시된 농도의 재조합 인간 LIF(rhLIF)의 존재 하에 배양되었다. 세포 증식은 6일 후에 분석되었다, n=3(도 4a). JAK 저해제 바리시티닙은 LIF에 의한 STAT3의 활성화를 차단한다. DMSO 및 저해제와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션된 BAE 세포는 비히클 및 LIF(10 ng/ml)로 15분 동안 처리되었다. 전체-세포 용해물은 지시된 항체를 이용하는 웨스턴 블로팅을 받았다. Ctrl, 저해제와의 예비-인큐베이션이 없음; Ba, 바리시티닙(2 μM); Co, 코비메티닙(150 nM); BE, BEZ235(5 nM)(도 4b). JAK 저해제 바리시티닙은 LIF-유도 BAE 성장 저해를 역전시킨다. 저해제와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션된 BAE 세포는 비히클, LIF(10 ng/ml) 및 VEGF(10 ng/ml)로 처리되었다. 세포 증식은 6일 후 알라마 블루(alamar blue)를 사용하여 분석되었다, n=3(도 4c). 도 4d 및 도 4e는 BAE 세포에서의 STAT3의 넉다운을 도시한다. BAE 세포는 STAT3를 표적화하는 siRNA로 형질주입되었다. qRT-PCR을 수행하여, STAT3 mRNA 수준을 검사하였다. Si음성에서의 STAT3 수준은 1로 설정되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 데이터는 평균화되었으며, 도 4d에 도시되어 있다. 도 4e에서, siRNA로 형질주입된 세포는 LIF(10 ng/ml) 및 비히클로 15분 동안 처리되었다. 전체-세포 용해물은 지시된 항체를 이용하는 웨스턴 블로팅을 받았다. 도 4f는 STAT3의 넉다운이 LIF-유도 BAE 세포 성장 저해를 무효화함을 도시한다. STAT3 넉다운된 BAE 세포는 LIF(10 ng/ml) 및 비히클과 함께 배양되었다. 세포 증식은 3일 후에 분석되었다. 각각의 비히클 군에 대한 형광 판독은 1로 설정되었다, n=3. 막대 및 오차 막대는 평균±SD를 나타낸다. si음성, 임의의 기지의 유전자를 표적화하지 않는 음성 대조군 siRNA. **, p<0.01; *** p<0.001; #, p≤0.0001; ns, 통계적으로 유의하지 않음.
도 5a 내지 도 5b는 LIF가 기니피그 피부 및 마우스 망막에서 혈관 투과성을 유도하지 않음을 도시한다. 도 5a에서, 무모(hairless) 수컷 기니피그(Crl: HA-Hrhr/IAF, 450-500 g, Charles River Laboratories)는 자일라진(5 mg/kg) 및 케타민(75 mg/kg)의 복강내(i.p.) 투여에 의해 마취되었다. 그 후에, 동물은 1 ml의 1% Evans 청색 염료의 정맥내 주사(음경 정맥(penile vein))를 받았다. 15분 후, 상이한 용량(1, 5, 25, 100, 200 ng/주사 부위(site))의, PBS 중 rhLIF의 피내 주사(0.05 ml/부위)가 어깨보다 뒤의 몸통 영역 내로 투여되었다. 0.05 ml의 PBS, 및 0.05 ml의 PBS 중 25 ng의 VEGF는 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 주사되었다. 피내 주사 후 30분째에, 동물은 펜토바르비탈(200 mg/kg)의 i.p. 주사에 의해 안락사되었다. 피부 조직은 결합 조직으로부터 절제되고 사진 촬영되었다, n=2. 도 5b에서, 혈관 누출이 마우스 망막에서 도시된다. LIF(10 ng) 또는 VEGF(100 ng)는 유리체강(vitreous cavity)(대조군으로서 0.1% BSA/PBS)에 주사되었다. TRITC-덱스트란은 혈관 누출을 지시하는 데 사용되었다. 망막 혈관구조는 FITC-렉틴에 의해 표지되었다, n=5.
도 6a 내지 도 6f는 LIF가 카텝신 L(cathepsin L)의 상향조절을 통해 세포 사멸을 유도함을 도시한다. 도 6a 및 도 6b는 LIF 치료가 BAE 세포에서 세포 사멸을 유도함을 도시한다. LIF(10 ng/ml) 또는 비히클로 24시간 동안 처리 시, BAE 세포는 Annexin V-Cy5로 염색되었다. 대표적인 이미지는 도 6a에 도시되어 있다. Annexin V-양성 영역 대(versus) 총 세포-피복 영역의 백분율이 계산되었고 도 6b에 제시되었다, n=3. 도 6c 및 도 6d는 LIF가 BAE 세포에서 카텝신 L 발현을 유도하였음을 도시한다. LIF(10 ng/ml) 또는 비히클로 24시간 동안 처리 시, qRT-PCR이 수행되어 BAE 세포에서 카텝신 L(CTSL) mRNA 수준이 검사되었다. 비히클 군에서의 CTSL 수준은 1로 설정되었다. 각각의 시료에서 CTSL mRNA 수준은 비히클 군과 비교되었으며, 도 6c에서 배수 변화(fold change)로서 제시된다, n=3. LIF 처리된 BAE 세포로부터의 총 단백질은 소 카텝신 L ELISA에 사용되었다. 비히클-처리 군에서의 카텝신 L 단백질 수준은 1로 설정되었다. 카텝신 L 단백질에 대한 배수 변화(LIF-처리된 시료 군 대 비히클 군)의 유도가 계산되었으며, 3개의 독립적인 실험으로부터의 배수 변화는 도 6d에 도시된다. 도 6e 및 도 6f는 카텝신 L 저해제 CA074me 및 CAA0225가 LIF-유도 BAE 세포 성장 저해를 경감시킴을 도시한다. 지시된 농도의 CA074me 및 CAA0225와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션된 BAE 세포는 비히클, LIF(10 ng/ml) 및 VEGF(10 ng/ml)로 처리되었다. 세포 성장은 6일 후에 분석되었다, n=3. 막대 및 오차 막대는 평균±SD를 나타낸다. *, p<0.05; **, p<0.01; *** p<0.001; #, p≤0.0001; ns, 통계적으로 유의하지 않음.
도 7a 내지 도 7c는 LIF가 BAE 세포에서 세포 주기 억제를 유도함을 도시한다. 도 7a 및 도 7b는 LIF 처리가 BAE 세포에서 BrdU 혼입을 감소시킴을 도시한다. LIF(10 ng/ml) 및 비히클로 48시간 동안 처리 시, BAE 세포는 10 μM의 BrdU와 함께 4시간 동안 인큐베이션되었다. Alexa Fluor-488 접합(conjugated) BrdU 항체로 검출된 BrdU 혼입의 대표적인 이미지는 도 7a에 도시되어 있다. BrdU 양성 핵 대 DAPI-염색 총 핵의 백분율이 계산되었으며, 도 7b에 도시되어 있다, n=3. 도 7c는 BAE에서 LIF에 의한 사이클린 A 및 B 발현의 억제를 도시한다. BAE 세포 및 BCE 세포는 LIF(10 ng/ml) 및 비히클로 24시간 동안 처리되었다. qRT-PCR을 수행하여, CTSL1, CCNA2, CCNB1 및 MYC mRNA 수준을 검사하였다. 각각의 유전자 프로브에 대해, 비히클-처리 군 수준은 1로 설정되었다. LIF-처리 시료에서의 mRNA 수준은 비히클 군으로 정규화되었다, n=3. 막대 및 오차 막대는 평균±SD를 나타낸다. *, p<0.05; *** p<0.001; #, p≤0.0001; ns, 통계적으로 유의하지 않음.
도 8a 내지 도 8d는 마우스 눈 모델에서의 다른 IL-6 패밀리 단백질의 효과를 도시한다. 재조합 LIF(50 ng) 및 1 μl 중 상이한 용량의 CT-1 및 PBS 비히클 대조군은 마우스의 눈 내로 유리체내 주사되었다(도 8a). 망막 혈관구조는 살아 있는(live) 마우스 OCT-A 이미지화와 CD31 면역형광 염색 둘 다로 지시되었다, n=5 (도 8a). 망막 플랫 마운트 염색은 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다(도 8b). 혈관의 정량화는 Image J를 사용하여 수행되었다. 도 8c 및 도 8d는 소듐 요오데이트가 마우스에서 맥락막 모세혈관 손상을 유도하는 데 사용되었음을 도시한다. 소듐 요오데이트 주사 후, 지시된 양의 LIF, CT-1 또는 OSM이 눈에 주사되었다. 맥락막 모세혈관이 OCT-A 시스템 하에 이미지화되었다, n=5. 맥락막 내 무혈관 영역이 결정되었으며, Image J를 사용하여 정량화되었다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조문헌으로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조문헌으로서 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어 및 임의의 두문자어는 본 발명 분야의 당업자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 관행에 사용될 수 있긴 하지만, 예시적인 방법, 장치 및 물질이 본원에 기재된다.

본 발명의 관행은 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판(Sambrook 등, 1989)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed., 1984)]; 문헌[Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed., 1987)]; 문헌[Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel 등, eds., 1987, 및 정기적인 업데이트)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullis 등, eds., 1994)]; 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제20판(Lippincott, Williams & Wilkins 2003)], 및 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제22판(Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy at University of the Sciences 2012)]에 잘 설명되어 있다.

본 발명은 IL6 슈퍼패밀리의 구성원, 및 이의 기능성 단편이 예컨대 노화-관련 황반 변성 및 미숙아 망막병증(ROP)으로 제한되지 않는 병태를 치료적으로 치료하는 것을 필요로 하는 대상체의 눈에서 혈관신생을 증가시키는 데 사용될 수 있음을 제공한다. 구현예에서, 대상체는 인간이다.

구현예에서, 본 발명은 대상체의 눈에서 부적절한 혈관화와 관련된 병태의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 IL-6 패밀리 단백질, 또는 이의 기능성 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 혈관신생을 촉진하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 본 발명은 IL-6 패밀리 단백질이 백혈병 저해 인자(LIF) 또는 카디오트로핀-1(CT-1)임을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 투여가 망막 미세혈관 밀도를 증가시킴을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 투여가 맥락막 내피 세포의 증식을 증가시킴을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 투여가 혈관신생을 자극함을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 투여가 망막 혈관신생을 증가시킴을 제공한다. 구현예에서, 본 발명은 투여가 맥락막 내피 세포의 증식을 증가시킴을 제공한다.

정의

본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 본원에 사용된 바와 같은 다수의 용어 및 약어는 하기와 같이 아래에서 정의된다:

본 발명 또는 이의 바람직한 구현예(들)의 요소를 소개할 때, 관사("a", "an", "the") 및 "상기(said)"는 하나 이상의 요소가 존재하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되며, 나열된 요소 이외의 추가 요소가 있을 수 있음을 의미한다.

2개 이상의 항목의 목록에 사용될 때, 용어 "및/또는"은, 자체로 또는 나열된 항목 중 임의의 하나와 조합하여 이용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 표현 "A 및/또는 B"는 A 및 B 중 어느 하나 또는 둘 다, 즉 A 단독, B 단독 또는 A와 B의 조합을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 표현 "A, B 및/또는 C"는 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B의 조합, A와 C의 조합, B와 C의 조합 또는 A, B 및 C의 조합을 의미하는 것으로 의도된다.

본원에 기재된 본 발명의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예로 "구성되는(consisting)" 및/또는 "본질적으로 구성되는"을 포함하는 것으로 이해된다.

범위 형식의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로서 간주되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 이에, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 이는 범위의 폭에 상관없이 적용된다. 값 또는 범위는 또한 본원에서, "약", "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지 표현될 수 있다. 이러한 값 또는 범위가 표현될 때, 개시된 다른 구현예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지 언급된 구체적인 값을 포함한다. 유사하게는, 선행하는 "약"을 사용하여 값이 근사치로 표현될 때, 특정 값은 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 나아가, 본원에 개시된 다수의 값이 존재하고, 각각의 값 또한 그 값 자체 외에도 해당되는 특정 값에 대해 "약"으로서 본원에서 개시되는 것으로 이해될 것이다. 구현예에서, "약"은 예를 들어, 언급된 값의 10% 이내, 언급된 값의 5% 이내, 또는 언급된 값의 2% 이내를 의미하는 데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "환자" 또는 "대상체"는 치료될 인간 또는 동물 대상체를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적 조성물"은 약학적으로 허용 가능한 조성물을 지칭하며, 상기 조성물은 약학적 활성제를 포함하고, 일부 구현예에서는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적 활성제와 담체의 조합일 수 있다.

용어 "조합"은 하나의 투약 단위 형태의 고정된 조합, 또는 조합 투여를 위한 부품 키트(kit of part)를 지칭하며, 여기서, 하나 이상의 활성 화합물 및 조합 파트너(예를 들어, "치료제" 또는 "보조제(co-agent)"로도 지칭되는 하기에 설명된 바와 같은 또 다른 약물)는 동시에 독립적으로 또는 시간 간격 내에서 별도로 투여될 수 있다. 일부 상황에서, 조합 파트너는 협력적, 예로 상승작용 효과를 나타낸다. 본원에 이용된 바와 같이, 용어 "공동-투여" 또는 "조합 투여" 등은 이를 필요로 하는 단일 대상체(예를 들어, 환자)에게 선택된 조합 파트너의 투여를 포괄하는 것으로 의미되고, 제제가 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되는 것은 아닌 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적 조합"은 하나 초과의 활성 구성분의 혼합 또는 조합으로부터 기인한 생성물을 의미하고, 활성 구성분의 고정된 조합과 비-고정된 조합 둘 다 포함한다. 용어 "고정된 조합"은 활성 구성분, 예를 들어, 화합물과 조합 파트너 둘 다 단일 실체(entity) 또는 투약 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정된 조합"은 활성 구성분, 예를 들어, 화합물과 조합 파트너 둘 다 특정한 시간 제한 없이 동시에, 수반하여(concurrently) 또는 순차적으로 별개의 실체로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서, 이러한 투여는 환자의 신체에서 치료적 유효 수준의 2개 화합물을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예를 들어 3개 이상의 활성 구성분의 투여에도 적용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "효과적인" 또는 "치료적으로 유효한"은, 질환 및 의학적 병태와 관련된 증상을 치료 또는 호전시키거나, 일부 방식에서는 감소시키기에 충분한 약학적 활성 화합물(들)의 양을 지칭한다. 방법과 관련하여 사용되는 경우, 방법은 질환 또는 병태와 관련된 증상을 치료 또는 호전시키거나, 또는 일부 방식에서는 감소시키기에 충분히 효과적이다. 예를 들어, 노화-관련 눈 질환(eye disease)과 관련된 유효량은, 발병을 차단하거나 예방하거나; 질환 병리(pathology)가 시작된 경우라면, 질환의 완화하거나, 호전시키거나, 안정화시키거나, 역전시키거나, 진행을 지연하거나, 다르게는 질환의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 임의의 경우, 유효량은 단일 용량 또는 분할된 용량으로 주어질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은, 환자에서 질환과 관련된 증상의 적어도 호전을 포괄하며, 여기서, 개선은 광범위한 의미에서 매개변수, 예를 들어, 치료중인 질환 또는 병태와 관련된 증상의 규모의 적어도 감소를 지칭하는 데 사용된다. 이와 같이, "치료"는 또한 질환, 장애, 또는 병리학적 병태, 또는 이와 관련된 적어도 증상이 완전히 저해(예를 들어, 발생으로부터 예방)되거나 정지(예를 들어, 종료)되어, 환자가 병태 또는 병태를 특징화하는 적어도 증상을 더 이상 앓지 않게 되는 상황을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환 또는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 발병, 재발 또는 확산의 예방을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 상기 용어는 특히 본원에 제공된 질환 또는 장애의 위험이 있는 대상체에게 증상의 발병 전에 하나 이상의 다른 추가 활성제(들)와 함께 또는 없이 본원에 제공된 화합물 또는 투약 형태에 의한 치료 또는 이의 투여를 지칭한다. 상기 용어는 특정 질환의 증상의 저해 또는 감소를 포괄한다. 소정의 구현예에서, 질환의 가족력이 있는 대상체는 예방 요법에 대한 잠재적인 후보이다. 소정의 구현예에서, 증상 재발의 병력이 있는 대상체 또한 예방을 위한 잠재적인 후보이다. 이와 관련하여, 용어 "예방"은 용어 "예방적 치료"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 화합물의 "예방적 유효량"은 질환 또는 장애를 예방하거나, 이의 재발을 예방하기에 충분한 양이다. 화합물의 예방적 유효량은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 제제(들)와 조합되어 질환의 예방에 예방적 이점을 제공하는 치료제의 양을 의미한다. 용어 "예방적 유효량"은 전반적인 예방을 향상시키거나, 또 다른 예방제의 예방적 효능을 증강시키는 양을 포괄할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 활성"은 살아 있는 물질, 특히 인체의 세포 및 조직에 대한 성분의 유익한 생물학적 활성을 지칭한다. "약학적 활성제" 또는 "약물"은 약학적으로 활성인 성분이고, "약학적 활성 구성분"(API)은 약물 내 약학적 활성 성분이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 동물에서, 더욱 특히 인간 및/또는 비-인간 포유류에서 사용하기에 안전한 다른 제형 외에도 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전, 다른 일반적으로 인정되는 약전에 의해 승인됨을 의미한다. 본 발명은 유리체내 주사를 포함하여 안과(ophthalmic) 전달을 위해 제형화된, 눈 치료를 위한 조성물을 고려한다.

본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 탈메틸화 화합물(들)과 함께 투여되는 부형제, 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 아쥬반트 및/또는 비히클을 지칭한다. 이러한 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유(mineral oil), 참기름 등을 포함하여 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매일 수 있다. 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 비설파이트(sodium bisulfite)와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 및 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 장성(tonicity) 조정용 제제도 담체일 수 있다. 담체와 조합하여 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 일부 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학적 투여와 융화성인(compatible) 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 성분에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 제20판 (Lippincott, Williams & Wilkins 2003)]을 참조한다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 함께 비융화성인 경우를 제외하고는, 조성물에서의 이러한 사용이 고려된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 개시내용에서 다중-약물 접합체와 같이 화합물의 산 부가염 또는 염기 부가염을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 염은, 모(parent) 제제 또는 화합물의 활성을 보유하고 이것이 투여되는 대상체에게 그리고 이것이 투여되는 환경(context)에서 임의의 유해한 또는 바람직하지 못한 효과를 부여하지 않는 임의의 염이다. 약학적으로 허용 가능한 염은 시스테인을 포함하지만 이로 제한되지 않는 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 화합물을 염으로서 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있다(문헌[Stahl 등, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH]; 문헌[Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002]; 문헌[Berge 등, J Pharm. Sci. 66: 1, 1977] 참조). 일부 구현예에서, "약학적으로 허용 가능한 염"은 무독성이며, 생물학적으로 내약성(tolerable)이거나 다르게는 대상체에게 투여하기에 생물학적으로 적합한, 본원에서 표시된 제제 또는 화합물의 자유(free) 산 또는 염기의 염을 의미하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 문헌[Berge, 등, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19]를 참조한다. 바람직한 약학적으로 허용 가능한 염은, 과도한 독성, 과민증(irritation), 또는 알레르기 반응 없이 대상체의 조직과 접촉되기에 약리학적으로 효과적이고 적합한 염이다. 본원에 기재된 제제 또는 화합물은 충분히 산성인 기, 충분히 염기성인 기, 유형 둘 다의 작용기, 또는 각각의 유형의 1개 초과를 소유하고, 이에 많은 무기 또는 유기 염기, 및 무기 및 유기 산과 반응하여 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염의 예는 설페이트, 피로설페이트(pyrosulfate), 비설페이트(bisulfate), 설파이트, 비설파이트, 포스페이트, 모노하이드로겐-포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스포네이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 설포네이트, 메틸설포네이트, 프로필설포네이트, 베실레이트, 자일렌설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, [감마]-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트 및 만델레이트를 포함한다.

용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 미메틱(mimetics)을 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩되는 아미노산, 뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, α-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본(basic) 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합된 α 탄소, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 미메틱은 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.

본 발명에 사용하기 위한 IL-6 패밀리 단백질은 백혈병 저해 인자(LIF) 또는 카디오트로핀-1(CT-1)을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 IL-6 패밀리 단백질은 또한, 혈관신생을 촉진하기 위해 다른 IL-6 사이토카인, 예컨대 인터루킨 11(IL-11), 섬모 신경친화성 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 카디오트로핀-유사 사이토카인(CLC), 및 인터루킨 27(IL-27), 또한 IL-12 패밀리에서 그룹화될 수 있는 헤테로이량체성 사이토카인을 포함할 수 있다. 그러나, 온코스타틴 M(OSM: oncostatin M)은 반대 효과를 갖는다. 당업자는, 본원에 기재된 본 발명의 지식으로, 본 발명에 사용하기 위한 혈관신생 촉진 활성을 위해 추가의 IL-6 패밀리 구성원을 일상적으로 스크리닝할 수 있다. IL-6 패밀리 단백질은 단리된 또는 부분적으로 정제된 천연 발생 단백질 또는 재조합적으로 생성된 단백질일 수 있다.

이러한 천연 발생 IL-6 패밀리 구성원의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 아미노산 서열에 관하여 당업자는, 인코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산을 변경시키거나, 첨가하거나 결실시키는, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에의 개별 치환, 결실 또는 첨가가, 상기 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형체성 변이체, 종간 동족체(interspecies homolog), 및 대립유전자 이외의 것이며 이를 배제하지 않는다.

구현예에서, 본 발명은 부적절한 또는 불충분한 혈관화를 특징으로 하는 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위한 혈관신생의 촉진에 관한 것이다. 이러한 질환 또는 병태는 미숙아 망막병증(ROP), 노화-관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 녹내장(glaucoma), 당뇨병성 족부 궤양(diabetic foot ulcer), 폐 고혈압(pulmonary hypertension), 허혈증(ischemia), 만성 궤양(chronic ulcer), 대머리(baldness) 또는 모발 회색화(hair graying), 피부판의 재생(regeneration of skin flap), 상처 및 화상 치유, 인공 피부 이식, 배아 발달, 및 이식용 혈관의 제조를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명은 LIF를 1차 맥락막 내피 세포에 대한 미토겐으로서 식별한다. 본 발명 전에, LIF는 내피 세포 성장/혈관신생의 음성 조절제로서 특징화되었지만, 정확한 기전은 대체로 알려져 있지 않았다. 1992년에, LIF는 처음에 BAE 세포 성장의 저해제인 것으로 보고되었다(35). 후속 연구는 LIF를 또한 bFGF-유도 및 VEGF-유도 내피 세포 증식의 저해제로서 기재하였다(15, 41). 유일한 예외는, SV40 라지(large) T 항원을 통해 발생된 불멸(immortalized) 내피 세포주에서 LIF의 일부 유사분열촉진 효과(mitogenic effect)를 보여주는 연구였다(42).

본 발명은 LIF가 시험관내에서 1차 내피 세포 성장을 자극할 수 있음을 처음으로 실증한다. 게다가, 본 발명은 LIF-JAK-STAT3 신호전달 축(axis)이 내피 세포에서 유사분열촉진 효과를 담당함을 개시한다. 재조합 LIF의 유리체내 주사는 성체 마우스 망막에서 혈관 밀도를 유의하게 증가시키며, 이는 LIF의 전혈관신생성(proangiogenic) 역할을 확인시켜 준다. 흥미롭게는, CT-1 또한 망막 혈관신생을 유도하고 또한 NaIO₃ 모델에서 보호적이다.

유전적으로 조작된 마우스 모델(GEMM)에서, LIF 발현 수준은 망막 혈관구조 발달과 음의 상관관계가 있다(14, 16). 아직, LIF는 다수의 세포 유형에 영향을 미치며(16, 43) 심지어 GEMM에서 망막 발달을 완전히 방해하는(44) 것으로 이전에 보고되었다. 특히, LIF는 망막 성상세포 성숙(maturation)에 부정적인 영향을 미쳤으며, 다시 말해 미성숙 성상세포에 의한 VEGF 발현을 촉진하였고, 이는 혈관 밀도의 증가에 기여할 수 있다(16, 31, 32, 45). 따라서, GEMM에서 망막 혈관구조의 변경은 내피 세포에 미치는 LIF의 직접적인 효과가 아닐 것이다. 또 다른 연구에서, 복강내 LIF 주사와 유리체내 LIF 주사 둘 다, 신생 래트 눈에서 혈관 구조의 중등(moderate) 저하를 유발하였으며(22); LIF의 이러한 저해 역할은 또한 망막 발달에 미치는 이의 효과에 의해 설명될 수 있었다. 더욱이, 유리체내 주사되는 LIF의 용량은 해당 연구에서 명확하게 지시되지 않았다(22). 본 연구에서 개시된 타이트하고(tight), 벨-형상인(bell-shaped) 용량-반응을 고려하면, 본 발명을 임의의 이전의 연구와 비교하는 것은 어렵다. 사실상, 문헌에서의 불일치(discrepancy) 중 적어도 일부는 수 나노그램 내지 수백 나노그램 범위의, 상이한 연구에서 이용된 LIF의 광범위하게 상이한 용량에 의해 설명될 것이다(16, 22).

미숙아 망막병증(ROP)은 미숙아 사이에서 보편적인 실명-유발 질환으로서, 혈관구조의 지연된 발달 및 기존 혈관의 퇴화(regression), 뒤이어 저산소증-유도 망막 신혈관형성(neovascularization)을 특징으로 한다(46). 눈에서 VEGF 발현의 급격한 하향조절은 ROP의 발병 및 진행과 관련이 있으며(47), 외인성(exogenous) VEGF의 투여는 마우스에서 ROP의 중증도를 경감시킨다(47). 그러나, VEGF를 치료제로서 사용하는 염려는 지속되는데, VEGF가 증가된 혈관 투과성과 함께 병리학적 신혈관형성에 기여하기 때문이다(48). 본 발명에서, VEGF와 달리 LIF는 기니피그 피부에서 혈관 투과성을 유도하지 않는다(도 5a). 게다가, TRITC-표지 덱스트란은 마우스에서 망막 미세혈관 누출을 결정하는 데 사용되었다. LIF(10 ng) 또는 VEGF(100 ng)는 TRITC-덱스트란 주사 전 15분째에 유리체내 주사되었다. 그 결과는, VEGF와 달리 LIF는 망막 미세혈관 누출을 유도하지 않음을 보여준다(도 5b). 따라서, LIF는 ROP의 일부 병기(stage)에서 혈관 퇴화를 예방하기 위해 사용될 수 있다.

이전의 보고와 일관되게(35), 본 발명은 LIF가 BAE 세포 성장 저해를 초래함을 나타낸다. 본 발명은, 이것이 적어도 부분적으로는, LIF 처리 시 Annexin V 염색의 증가에 의해 입증된 바와 같이 세포 사멸에 기인함을 보여준다. 흥미롭게는, 카스파제 저해제가 아니라 리소좀 시스테인 프로테아제 카텝신 L의 2개의 저해제(즉, CA-074me 및 CAA0225)가 LIF-유도 세포 사멸을 역전시키며, 이는 카스파제-독립적 세포 사멸의 관여(involvement)를 시사한다. 더욱이, 카텝신 B-특이적 저해제 CA074는 BAE 세포 사멸을 구제(rescue)하는 데 실패하며, 카텝신 B가 아니라 카텝신 L이 LIF-처리 BAE 세포에서 상향조절되고, 이는 카텝신 L이 LIF-유도 리소좀 세포 사멸의 실행제(executer)임을 나타낸다.

카텝신 B 및 카텝신 L의 유도는 자가포식(autophagy) 및 세포 사멸과 연관지워 왔다(49, 50). 본 발명은 내피 세포 사멸의 유도에 있어서 LIF-카텝신 L 경로를 연관시킨 최초의 발명이다. 이는, 이러한 신호전달 경로가 특정 생리학적 또는 병리학적 과정에 참여하는지의 여부에 대한 의문을 제기한다. 흥미롭게는, LIF와 카텝신 L 둘 다 혈관 질환, 예컨대 복부 대동맥류(abdominal aortic aneurysm) 및 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)의 발증(development) 및 진행에 연관되어 왔다(51-53). 이들 데이터는 종합하여, 병리학적 설정에서 혈관구조를 조절하는 데 있어서의 LIF-카텝신 L 경로의 역할을 시사한다.

본 발명에서, LIF는 또한 BAE 세포에서 사이클린 A/B 발현의 저하에 의해 수반되는 감소된 BrdU 혼입을 유발하며, 이는 LIF-유도 세포 주기 억제가 BAE 세포 성장에서 역할을 함을 시사한다. 사이클린 A1 및 사이클린 B1이 직접적인 STAT3 표적이라는 것이 이전에 보고되었다(54). 또한, STAT3는 특정 설정에 따라 사이클린 A/B의 상향조절과 하향조절 둘 다에 연관되어 왔으며(55-58), STAT3에 의한 사이클린 A 발현의 억제는 이의 직접적인 표적 PIM1에 의해 매개되었다(58). 이는, LIF에 의한 PIM1의 유도가 BAE 세포에서만 존재하기 때문에, LIF가 BCE 세포가 아니라 BAE 세포에서 사이클린 A/B의 발현을 억제시키는 이유를 설명한다.

본 발명은 2개 유형의 내피 세포에서 동일한 신호전달 경로에 의해 유도되는 반대되는(opposite) 반응(증식 대 성장 저해)을 개시한다. 활성화된 STAT3는 이들 2개 세포 유형에서 별도 세트의 유전자를 트랜스활성화(transactivate)시킨다. 사실상, BCE 세포에서 증식 유전자 MYC 단독의 상향조절이 아니라 S 기(phase) 및 G2/M 사이클린 유전자 CCNA2 및 CCNB1의 하향조절, 뿐만 아니라 BAE 세포에서 리소좀 시스테인 프로테아제 CTSL의 상향조절을 포함하여 BCE 세포 및 BAE 세포에서 LIF 처리 시 일부 유전자의 차별적인 발현이 존재한다. 상이한 유형의 내피 세포는 동일한 자극에 대한 이들 세포의 차별적인 반응을 결정하는 이들의 독특한 유전자 발현 패턴/후성유전학적(epigenetic) 프로파일링을 갖는다(59-61). 상이한 내피 세포에서 LIF의 반대 효과의 본 발명의 개시내용은 이러한 다양성의 신규 양태를 예시하며: 동일한 신호전달 경로는 내피 세포-유형-특이적 전사 프로그램에 따라 발산 효과(divergent effect)를 매개한다. 본 발명은 처음으로, LIF에 의해 유도되는 리소좀 프로테아제 카텝신 L이 내피 세포에서 세포 사멸을 유발함을 보고한다.

본 발명은 구현예에서, 맥락막 및 망막 내피 세포에서 LIF의 예상치 못한 유사분열촉진 역할을 개시하며, LIF와 CT-1 둘 다 생체내에서 망막 미세혈관 밀도를 증가시킴을 보여준다. 사실상, 습식 또는 건성 AMD를 갖는 환자에서 안구 혈관, 예컨대 맥락막모세혈관 층(choriocapillaris layer)을 보호하는 것은 이것이 위축증(atrophy)을 예방할 수 있기 때문에 유익하다(62). LIF와 CT-1 둘 다 NaIO₃ 모델에서 보호 효과를 갖는다는 것은, 이들 제제가 망막 색소 상피 및 맥락막모세혈관층을 보호하므로 AMD에서 위축증을 예방하는 데 있어서 치료 효과를 가짐을 시사한다. LIF의, 그리고 아마도 또한 CT-1의 직접적인 투과 효과의 결여는 이러한 측면에서 특히 유용할 것이다. 두드러지게는, OSM은 반대되는 효과를 가지며, 이는 LIF 및 CT-1의 효과에서 특이성을 나타낸다.

실시예

재료 및 방법

시약

항체: 인간 PDGF-AA 항체(R&D Systems, CAT# AF-221-NA), 인간 CCL2/MCP-1(R&D Systems, CAT# AF-279-NA), 인간 LIF 항체(Sigma, CAT# L9277), 정상적인 염소 IgG 이소타입(isotype) 대조군(R&D Systems, CAT# AB-108-C), 및 Alexa Fluor-488 접합된 BrdU 항체 3D4(Biolegend, CAT# 364106)

저분자 저해제: 바리시티닙(baricitinib)(Apexbio Technology, CAT# A414150), 코비메티닙(cobimetinib)(MedChemExpress, CAT# HY-13064), BEZ235(Selleckchem, CAT# S1409), Z-VAD-FMK(R&D Systems, CAT# FMK001), Z-DEVD-FMK(R&D Systems, CAT# FMK004), Q-VD(OMe)-OPh(Apexbio Technology, CAT# A8165), 5-AIQ 하이드로클로라이드(Sigma, CAT# A7479), CA-074 me(Calbiochem, CAT # 205531), CA-074(Tocris, CAT # 4863), 및 CAA0225(Calbiochem, CAT# 219502)

재조합 단백질: 인간 LIF(Sigma, CAT# SRP9001), 인간 LIF(Biolegend, CAT# 593902), 인간 PDGF-AA(Peprotech, CAT# 100-13A), 인간 퍼옥시레독신(Peroxiredoxin) 1(Abcam, CAT# ab74172), 인간 IL-8(Biolegend, CAT# 574202), 및 인간 VEGF 165(R&D Systems, CAT# 293-VE)

세포 배양

LN-229 인간 교모세포종 세포를 5% FBS가 보충된 고(high)-글루코스 DMEM에서 유지시켰다. 소 맥락막 내피(BCE)(P5-P9) 및 소 망막 내피(BRE)(P5-P9) 세포를 피브로넥틴-코팅된 배양 플레이트 상에서 10% 우아 혈청(BCS: bovine calf serum), 2 mM 글루타민, 5 ng/ml bFGF 및 10 ng/ml VEGF가 보충된 DMEM-저 글루코스에서 유지시켰다. 소 대동맥 내피(BAE) 세포(P5-P10)를 10% BCS가 보충된 DMEM-저 글루코스에서 유지시켰다. 인간 망막 미세혈관 내피(HRME) 세포(P4-P9)를 젤라틴-코팅된 배양 플레이트 상에서 항체와 함께 EGM2 배지에서 유지시켰다. 모든 세포를 5% CO2와 함께 습윤화된 분위기에서 37℃에서 유지시켰다.

내피 세포 증식 검정

소 내피 증식 검정은 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(63, 64). BCE(1×10³ 세포/웰) 또는 BRE(5×10² 세포/웰) 세포를 배양 배지(10% BCS, 2 mM 글루타민 및 항생제가 보충된 DMEM-저 글루코스) + 시험 물질에서 96-웰 플레이트에 웰당 200 μl의 총 부피로 접종하였다. BAE 세포를 배양 배지(1% BCS 및 항생제가 보충된 DMEM-저 글루코스) + 시험 물질에서 96-웰 플레이트에 웰당 200 μl의 총 부피로 2×10³ 세포의 밀도로 평판배양하였다. HRME 세포를 검정(assay) 배지(20% FBS 및 항생제가 보충된 DMEM-저 글루코스) + 시험 물질에서 젤라틴-코팅된 96-웰 플레이트에 1×10³ 세포/웰의 밀도로 접종하여, 웰당 200 μl의 총 부피를 만들었다. 항체 또는 저분자 저해제를 수반하는 검정을 위해, 저해제 또는 비히클 대조군을 우선 첨가한 다음, 시험 물질을 1시간 후에 첨가하였다. 6일 후(달리 명시되지 않는 한), 세포는 알라마 블루와 함께 4시간 동안 인큐베이션되었다. 형광은 530 nm 여기 파장 및 590 nm 방출 파장에서 측정되었다. 각각의 실험을 2벌/3벌로 수행하고 적어도 3회 반복하였다.

LN-229 세포 조건화된 배지

5×10⁶ LN-229 세포를 35 ml의 배양 배지(0.5% FBS 및 1% 항생제와 함께 DMEM-고 글루코스)와 함께 15-cm 배양 디쉬(dish)에 접종하고, 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. LN-229 CM을 원심분리에 의해 수집하며, 0.22 μm 필터로 여과하고, 이후의 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.

LN-229 CM에서 내피 미토겐의 크로마토그래피 강화

대략 400 ml의 LN-229 CM을 크로마토그래피 정제의 순차(sequential)에 의해 내피 미토겐의 강화를 받게 하였다. CM을 20 mM Tris, pH 8.0으로 완충액-교환하며, 여과하고(0.2 μm), GE AKTA Explorer System(GE Healthcare)을 사용하여 5-ml HiTrap Q^TM HP 컬럼(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)에 로딩(load)하였다. Tris 완충액 중 0.2 M, 0.5 M, 1 M 및 2 M NaCl을 이용한 계단식 용출(stepwise elution) 후, 용출된 분획의 분취물(aliquot)을 상기 기재된 바와 같이 BCE 세포 성장 검정에서 시험하였다. 그 후에, 유사분열촉진 분획을 풀링(pool)하며, 0.1 % 트리플루오로아세트산/H2O(TFA, ThermoFisher)에 희석시키고, SynChropak RP C4 역상 컬럼(4.6 x 100 mm, Eichrom Technologies, Darien, IL)에 적용하였다. 분획을 아세토니트릴/0.1% TFA의 선형 구배(linear gradient)로 용출시켰다. 용출된 분획을 MiVac DUO 농축기(Concentrator)(Genevac, Ipswich, UK)를 사용하여 증발시키며, 세척하고, PBS에 재현탁시키며, 상기와 같이 시험하였다. 유사분열촉진 분획 및 인접 음성물(adjacent negative)을 질량 분광법 분석을 받게 하였다.

ELISA

LN-229 CM 시료에서 VEGF 및 LIF 수준을 인간 VEGF ELISA 키트(R&D Systems, CAT# DVE00) 및 인간 LIF ELISA 키트(Biolegend, CAT# 443507)에 의해 각각 제조업체의 설명서에 따라 결정하였다. BAE 세포에서의 카텝신 L 수준을 소 카텝신 L ELISA 키트(MyBioSource, Inc, CAT # MBS2887609)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 측정하였다.

siRNA에 의한 STAT3 넉다운

BCE 세포 및 BAE 세포를 6-웰 배양 플레이트 상에 1.5×10⁵ 세포/웰의 밀도로 평판배양하였다. BCE 세포를 10% BCS, 2 mM, 5 ng/ml bFGF, 10 ng/ml VEGF 및 항생제가 보충된 2 ml의 DMEM-저 글루코스에서 밤새 인큐베이션하는 한편, BAE 세포를 10% BCS 및 항생제가 보충된 2 ml의 DMEM-저 글루코스에서 밤새 배양하였다. 2 ml의 무항생제(antibiotics-free) 배양 배지를 사용하여 오래된 배지를 대체하였다. si음성(Ambion, CAT# AM4611), siSTAT3-915(Invitrogen, CAT# 361146C04), siSTAT3-1492(Invitrogen, CAT# 361146C05) 및 siSTAT3-454(Invitrogen, CAT# 384235A10)를 포함하여 siRNA를 Opti-MEM™ I 환원 혈청 배지(Gibco, CAT# 31985062) 중 리포펙타민 RNAiMAX 시약(ThermoFisher Scientific, CAT# 13778150)과 함께 제조업체의 설명서에 따라 혼합하였다. 간략하게는, 25 pmol의 siRNA, 7.5 ul의 RNAiMAX 시약 및 125 ul의 Opti-MEM 배지를 사용하여, 각각의 웰에서 세포를 형질주입(transfect)시키며, 이는 12.5 nM의 최종 siRNA 농도를 만든다. RNAiMAX와 Opti-MEM의 믹스(mix)를 siRNA-무함유(no siRNA) 대조군으로서 사용하였다. 세포를 siRNA와 함께 8시간 동안 인큐베이션한 다음, 신선한 정상 배양 배지를 사용하여 siRNA-함유 배지를 대체하였다. siRNA에 의한 형질주입 후 24시간째에, 세포를 내피 증식 검정 및 RNA/단백질 추출에 사용하였다.

웨스턴 블로팅

BCE 세포 및 BAE 세포는 성장 배지에서 밤새 배양되었다. 성장 배지는 제거되었으며, 그 후에 세포는 PBS로 2회 세척되었다. 재조합 인간 LIF를 하기 배지에서 3-시간 인큐베이션 후 세포에 15분 동안 첨가하였다: BCE 세포에 대해 10% BCS, 2 mM 글루타민 및 항생제가 보충된 DMEM-저 글루코스, 및 BAE 세포에 대해 1% BCS 및 항생제가 보충된 DMEM-저 글루코스. 적용 가능하다면, 저분자 저해제(즉, 바리시티닙, 코비메티닙, BEZ235 및 비히클 대조군 DMSO)를 LIF 처리 전 1시간째에 세포에 첨가하였다. 그 후에, 세포를 RIPA 용해 완충액(Life Technologies, CAT# 89901) + 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(ThermoFisher Scientific CAT# 78440)로 용해시켰다. 세포 용해물 내 단백질 농도를 BCA 검정(ThermoFisher Scientific CAT# 23227)으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질을 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔(ThermoFisher Scientific, CAT # NW04125BOX)에서 전기영동시킨 다음, PVDF 막 상으로 이전(transfer)시켰다. 막을 TBST 중 5% 탈지유(non-fat milk)로 실온에서 1시간 동안 차단시키며(block), 0.5% 탈지유를 함유하는 TBST에서 하기 지시된 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 2차 HRP-접합 항체(1:2000, GE Healthcare)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 신호를 SuperSignal™ West Pico PLUS 화학발광 기질(ThermoFisher Scientific)을 이용하여 발색시켰다. 사용된 1차 항체: 항-포스포-STAT3(Cell Signaling, CAT# 9131, 1:3000), 항-STAT3(Cell Signaling, CAT# 4904, 1:3000), 항-포스포-ERK(Cell Signaling, CAT# 4376, 1:5000), 항-ERK(Cell Signaling, CAT# 4695, 1:5000), 항-포스포-AKT Ser473(Cell Signaling, CAT# 4060, 1:2000), 항-AKT(Cell Signaling, CAT# 4691, 1:2000) 및 HRP-접합 항-베타-액틴(Sigma, CAT# AC-15, 1;10000 ).

RNA 추출 및 qRT-PCR

지시된 처리 후, BCE 및 BAE 세포를 트리졸 시약(Invitrogen, CAT# 15596026)으로 용해시키고, RNA 추출을 제조업체의 설명서에 따라 받게 하였다. RNA 농도를 Nanodrop 2000(ThermoFisher Scientific)으로 결정하고, 1 μg의 총 RNA를 High-Capacity cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, CAT# 4368814)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 동일한 양(일반적으로 10 ng/반응)의 cDNA를, TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems, CAT# 4444557) 및 ViiA7 실시간 PCR 시스템을 사용하여 qRT-PCR 분석을 받게 하였다. 검사된 유전자의 상대 mRNA 수준을 내부 대조군 RPLP0(리보솜 단백질 측지 서브단위 P0: Ribosomal Protein Lateral Stalk Subunit P0)으로 정규화시키며, 대조군 시료군과 비교함으로써 결정하고, 배수 변화(fold change)로서 보고하였다. TaqMan 유전자 발현 검정 프로브를 사용하였다: 소 RPLP0(Bt03218086_m1), 소 STAT3(Bt03259865_m1), 소 CTSL1(Bt03257307_m1 및 Bt03257309_m1), 소 CTSB(Bt03259161_m1), 소 MYC(Bt03260377_m1), 소 JunB(Bt03246919_s1), 소 CCNA2(Bt03240503_g1), 소 CCNB1(Bt03237853_g1), 및 소 PIM1(Bt03212957_m1). 실험을 3벌로 수행하고 3회 반복하였다.

세포 사멸에 대한 아넥신 V 염색

BAE 세포를 12-웰 플레이트에 1 ml의 배양 배지(DMEM-저 글루코스 + 10% BCS)와 함께 2×10⁴ 세포/웰의 밀도로 평판배양한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 배양 배지의 제거 후, 세포는 0.5 ml의 DMEM-저(low) 글루코스 + 1% BCS에서 인큐베이션되었다. LIF(10 ng/ml) 및 비히클 대조군(PBS 중 0.1% BSA)이 세포에 첨가되었다. 24시간 동안 LIF 처리 후, Annexin V-Cy5 세포자멸사 염색 검출 키트(Abcam, CAT# ab14150)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 세포 사멸 마커 Annexin V에 대해 검사하였다. 간략하게는, 세포 배양 배지를 제거하고, 0.5 ml의 Annexin V 결합 용액을 세포 상으로 덮었다. 5 μl의 Annexin V-Cy5의 첨가 후 세포를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 염색 용액을 폐기하고, 0.5 ml의 Annexin V 결합 용액으로 대체하였다. Annexin V 염색의 이미지화를 Keyence Microscope BZ-X710(Keyence Corporation, Osaka, Japan)을 사용하여 수행하였다. 4개의 무작위 필드(field)를 선택하고, 세포 사멸에 대한 지표(indicative)로서 총 세포-피복된(covered) 영역 내 Annexin V-염색 영역의 백분율을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. Annexin V 염색의 이미지화를 Keyence Microscope BZ-X710(Keyence Corporation, Osaka, Japan)을 사용하여 수행하였다. 실험을 3벌로 수행하고 3회 반복하였다.

BrdU 혼입 검정

BAE 세포를 각각의 웰에서 18-mm 폴리-D-라이신-처리 커버슬립과 함께 12-웰 플레이트에 1 ml의 배양 배지(DMEM-저 글루코스 + 10% BCS)와 함께 2×10⁴ 세포/웰의 밀도로 평판배양한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 배양 배지의 제거 후, 세포는 0.5 ml의 DMEM-저 글루코스 + 1% BCS에서 인큐베이션되었다. LIF(10 ng/ml) 및 비히클 대조군(PBS 중 0.1% BSA)이 세포에 첨가되었다. 48시간 동안 LIF 처리 시, 2.5 μl의, DMSO 중 2 mM BrdU를 각각의 웰에 10 μM의 최종 농도로 첨가하고 4시간 동안 인큐베이션함으로써 세포를 BrdU 혼입을 받게 하였다. 그 후에, 세포를, Fluor alexa-488과 접합된 BrdU에 대한 항체(Biolegend, CAT# 364106, 1:400)를 사용하여 BrdU 면역형광 염색을 받게 하였다. 간략하게는, BrdU 표지 배지를 배양 플레이트로부터 제거하고, 세포를 PBS 중 3.7% 포름알데하이드로 실온에서 15분 동안 고정시켰다. 세포 DNA를, PBS 중 0.1% Triton X-100(PBST)에 의한 세포 투과 후 얼음 상에서 1 N HCl로 10분 동안 그리고 실온에서 2 N HCl로 10분 동안 변성시켰다. 세포 커버슬립을 5% 염소 혈청-PBST 중 fluor alexa-488 접합된 BrdU 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후에, 커버슬립을 DAPI와 함께 Fluoroshield 마운팅 배지(Abcam, CAT# ab104139)로 유리 슬라이드에 마운팅하였다. BrdU 염색의 이미지화를 Keyence Microscope BZ-X710(Keyence Corporation, Osaka, Japan)을 사용하여 수행하였다. 각각의 시료에 대해 4개 필드를 무작위로 선택하고, BrdU-양성 핵뿐만 아니라 총 핵(DAPI-양성)을 수동으로 카운팅하였으며; BrdU-양성 핵의 수를 총 핵의 수로 나누어서 BrdU-양성 세포의 백분율을 결정하였다. 실험을 2벌/3벌로 수행하고 3회 반복하였다.

마우스 맥락막 외식편 검정

48-웰 플레이트에서, 60 μL의 성장 인자-감소 기저막 추출물(GFR-BME: growth factor-reduced basement membrane extract)(Corning, CAT # 354230)을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 고형화시켰다. 수컷 C57BL/6J 마우스(연령 P20)로부터 절제된 말초 맥락막-공막 복합체(대략 1 mm × 1 mm)를 이전에 기재된 바와 같이 각각의 웰의 중심부에 첨가하였다(23). 60 μL GFR-BME의 상부(top) 층을 각각의 웰에 첨가한 다음, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 2% FBS 및 항생제가 보충된 500 μL의 내피 세포 성장 기본 배지 EBM-2(Lonza, CAT # CC3156)의 첨가 시, 맥락막 외식편의 내인성 VEGF 활성을 5 μg/ml의 항-VEGF Mab B20-4.1.1에 의해 블런트(blunt)시켰다. 항체와 함께 90분 인큐베이션 후, 10 ng/ml의 LIF 또는 PBS 대조군을 시험 웰에 첨가하였다. 조직을 5% CO2와 함께 표준 세포 배양 조건에서 인큐베이션하고, 신선한 배지를 48시간마다 교환하였다. 각각의 외식편(explant)의 위상차 Z-스택 이미지(phase contrast Z-stack image)를 Keyence 현미경을 사용하여 제5일에 촬영하였다. 혈관 발아 영역을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 실험을 3회 반복하고, 매번 각각의 조건당 5개 복제물(replicate)을 분석함으로써 데이터를 수득하였다.

마우스 눈에서 재조합 단백질의 유리체내 주사

수컷 C57BL/6J 마우스(6 내지 8주 및 P5)를 케타민/자일라진 칵테일로 마취시켰다. 1 μl의 PBS 중 지시된 양의 재조합 LIF(Sigma, CAT# SRP9001) 및 PBS 대조군을 33-게이지 해밀턴(Hamilton) 주사기를 이용하여 유리체내 주사하였다. 주사 후 7일째(성체 마우스에 대해) 또는 3일째(신생 마우스에 대해)에, 동물을 안락사시킨 다음, 눈을 적출하고 4% 포름알데하이드(PFA)에서 15분 동안 고정시켰다. 맥락막-공막 복합체 및 망막을 분리하고, 항-CD31 면역형광(IF) 또는 렉틴 표지화를 수행하여, 망막 조직과 맥락막 조직 둘 다의 전체 마운트 염색 또는 망막의 플랫 마운트에 의해 혈관구조를 입증하였다. CD31 IF의 경우, 래트 항-마우스 항체(BD Biosciences, CAT# 550274)를 1:100으로 희석시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. Alexa Fluor-488-접합 항-래트 항체(Life Technologies, CAT# A11006)와 함께 4-시간 인큐베이션 후, 전체 마운트를 Keyence 현미경 BZ-X710(Keyence Corporation, Osaka, Japan) 또는 A1R 공초점 STORM 슈퍼-해상 시스템(Nikon)을 사용하여 488 nm 채널을 통해 이미지화하였다. 렉틴 염색을 위해, Dylight-488-표지 렉틴(Vector Laboratories, CAT# DL-1174)을 1:200으로 희석시키고, A1R 공초점 STORM 슈퍼-해상 시스템(Nikon)을 사용하여 이미지를 수득하였다. 맥락막 및 망막에서의 혈관 밀도의 정량화의 경우 Image J에 의해 수행하였다. 스튜던츠 t 검정을 통계학적 분석에 사용하였다. 각각의 실험을 3회 반복하였으며 매번 유사한 결과가 얻어졌고, 각각의 치료군은 모든 실험에서 4 또는 5개의 개별 시료로 구성된다. 모든 동물 절차를 미국 샌디에이고 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인을 받았고 동물 관리 프로그램(ACP)의 지침에 따라 시행하였다.

소듐 요오데이트 모델

8주령 C57BL/6J 마우스를 케타민/자일라진 칵테일로 마취시켰다. 멸균된 NaIO₃를 단일 정맥내 주사(20 mg/kg 체중)로서 투여하였다(28)(29). 대조군 마우스에게 PBS를 주사하였다. PBS, LIF(50 ng), CT-1(상이한 용량) 또는 OSM(10 ng)을 5-마우스 군에서 유리체내 주사하였다. 주사 후 5일, 7일 및 9일째에, 맥락막 모세혈관을 OCT-A 시스템에 의해 모니터링하였다. 주사 후 9일째에, 마우스를 죽이고, H&E 및 면역-형광 염색을 위해 눈을 수합하였다. 맥락막 모세혈관 내 무혈관 영역(avascular area)을 ImageJ를 사용하여 분석하였다.

망막 내 혈관 누출의 측정

재조합 인간 VEGF(100 ng) 또는 LIF(10 ng)를 유리체 내로 주사하였다(비히클 대조군으로서 0.1% BSA PBS 용액). 그 후에, TRITC-덱스트란(50 mg/ml, 100 ul)을 꼬리 정맥 내에 주사하였다. 10분 후, 동물을 희생시키고, 눈을 적출하였다. 망막 플랫 마운트(retina flat mount)를 현미경 하에 이미지화하였다(65).

광간섭 단층촬영 혈관조영술(OCTA: optical coherence tomography angiography) 이미지화

이전에 기재된 방법과 일관되게 워싱턴 시애틀 대학교에서 Dr. R.K. Wang 그룹에 의해 개발된 1300 nm 광간섭 단층촬영(OCT) 시스템을 사용하여 LIF 주사 후 7일째에 성체 마우스의 망막의 혈관조영술(OCTA) 이미지화를 수행하였다(66). 간략하게는, 1300 nm 및 200 kHz A-라인 속도에서 중심화된 90 nm 밴드폭(bandwidth)과 함께 단일 경도(longitude) 모드에서 작동되는 가변 레이저(swept laser)를 사용하여, 마우스 망막을 스캔하고 1.5 × 1.5 mm²의 시야 필드에서 혈관구조의 이미지를 발생시켰다. 2500개의 B-프레임을 500개의 단면에서 캡처하였으며, 각각의 단면에서 5개의 반복된 B-프레임을 가졌다. 망막 혈관 밀도를 정량화하기 위해, 3D 구조 OCT 스캔에서 망막 및 맥락막 층을 하이퍼-반사성(hyper-reflecting) 망막 색소 상피(RPE)에 의해 분리하였다. 그 후에, 엔 페이스 최대 강도 투영(en face maximum intensity)을 발생시켰다. 그 후에, 시야(view)의 총 영역 내 혈관-피복 영역의 백분율을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산함으로써 혈관 밀도를 결정하였다.

통계학적 분석

실험을 적어도 3회 반복하였으며, 질량 분광법 분석을 제외하고는 유사한 결과가 얻어졌다. 막대 차트는 평균 ± 표준 편차(sd)를 나타낸다. 연구에서 단지 2개 군 사이의 비교를 위해, 양측 스튜던츠 t-검정(two-tailed Student's t test)을 수행하였다. 데이터의 2개 초과의 군을 갖는 연구에서 군(group)간의 비교를 위해, 다중-비교와 함께 일원 ANOVA(one-way ANOVA)를 수행하였다. 2개 이상의 변수를 갖는 연구에서 군간의 비교를 위해, 다중-비교와 함께 이원 ANOVA(two-way ANOVA)를 수행하였다. p<0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 여겨졌다. 모든 통계학적 분석을 Graphpad Prism 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행하였다.

결과

맥락막 내피 세포에 대한 미토겐으로서의 LIF의 식별

LN-229 세포 조건화된 배지(LN-229 CM)는 소 맥락막 내피(BCE) 세포의 성장을 자극할 수 있다(도 1a). 그러나, 이전의 연구와 일관되게(9, 10), LN-229 세포는 배지에서 매우 적은 VEGF를 분비한다. 항-VEGF 항체 B20-4.1(11)은 LN-229 CM의 유사분열촉진 효과를 억제하지 않으며(도 1b), 이는 VEGF-독립적 경로의 관여를 시사한다. LN-229 CM의 혈관신생 인자 프로파일을 특이적 항체 어레이를 사용하여 검사하였다. 이러한 분석은, CM에서 풍부하였던 PDGF-AA, CCL2(MCP-1로도 알려져 있음) 및 인터루킨 8(IL-8)을 제외하고는 대부분의 기지의 혈관신생 인자가 검출 불가능함을 드러낸다. 그러나, PDGF-AA 또는 CCL2를 중화시키는 항체는 LN-229 CM에 의해 유도되는 BCE 세포 성장을 억제시키는 데 실패하였다. 더욱이, 재조합 PDGF-AA 및 IL-8은 BCE 세포 성장을 자극하는 데 실패한다(표 1).

LN-229 CM에서 유사분열촉진 인자(들)를 식별하기 위해, 프로테오믹(proteomic) 접근법을 취하였다. BCE 유사분열촉진 활성을 2개의 순차적인 크로마토그래피 단계인 음이온-교환 및 역상 크로마토그래피를 통해 강화시켰다. 각각의 단계에서, 4 내지 5개의 인접 분획으로 이루어진 단지 하나의 흡광도 피크만 유사분열촉진 활성을 보여주었다. 역상 컬럼 단계 후, 피크 유사분열촉진 분획(R26 및 R27), 최소 유사분열촉진 분획(R25 및 R28), 및 인접 음성 분획(R24 및 R29)(도 1c)을 질량 분광법 분석을 받게 하였다. 세포내 단백질을 스크리닝함으로써 5개의 후보 단백질의 짧은 목록을 발생시켰다(표 2).

나열된 5개의 단백질 중 4개는 혈청 구성요소였으며 퍼옥시레독신(PRDX: peroxiredoxin)-1, 퍼옥시레독신-2 및 퍼옥시레독신-6, 뿐만 아니라 알파-2-마크로글로불린을 포함하여 산화환원 효소로서 작용한 한편, LIF는 사이토카인으로서 드러났다. 인터루킨 6(IL-6) 패밀리 단백질의 구성원인 LIF는 다수의 세포 유형 및 조직에서 광범위하게 발현되며 효과를 발휘하고, 배아 줄기세포 자가-재생, 배반포 이식, 성상세포 분화를 포함하여 다양한 결정적인 생리학적 과정에 연관되어 왔다(12, 13). 본원에서 LIF의 존재는 예상치 못하였는데, 이 사이토카인은 내피 세포 성장 저해제 및 항-혈관신생제로서 이전에 특징화되었기 때문이다(14-16). 그러나, LIF에 대한 항체는 역상 분획에 의해 유도된 BCE 세포의 성장을 완전히 억제시켰다(도 1d). 각각의 분획에서 LIF 수준은 유사분열촉진 활성과 강하게 상관관계가 있었으며: 가장 생물활성 분획인 R26 및 R27은 최고 LIF 농도를 보여주었고, R25 및 R28은 미량의 LIF를 가진 한편, 불활성 분획 R24 및 R29는 LIF가 없었다(표 3).

이들 관찰은, LIF가 유사분열촉진 효과를 담당할 것임을 시사하였다. 사실상, 재조합 LIF는 BCE 세포의 성장을 자극한 한편(도 1e), 다른 후보인 PRDX1은 아무런 효과를 갖지 않았으며(표 1), 이는 LIF를 유사분열촉진 인자로서 추가로 확인시켜 주었다. 소 망막 내피(BRE) 세포 상에서 시험 시, LIF 또한 유사분열촉진 활성을 발휘하였다. 흥미롭게는, VEGF 및 LIF는 함께, BCE 세포(도 1f)와 BRE 세포 둘 다에서 상가(additive) 유사분열촉진 효과보다 더 크게 초래하였으며, 이는 LIF와 VEGF 사이의 상승작용적 관계를 시사하였다. 사실상, LIF가 인간 망막 미세혈관 내피 세포에서 강한 유사분열촉진 반응을 이끌어 내지 않긴 하였지만, 이의 첨가는 VEGF-자극 성장을 유의하게 증강시켰다.

내피 세포 성장에 미치는 LIF의 효과는 JAK-STAT3 경로에 의해 매개된다

IL-6 패밀리의 모든 구성원이 수용체 구성요소인 gp130을 공유한다고 하더라도, LIF 신호전달은 gp130:LIFR 수용체 이량체를 통해 전달되는 한편, IL-6는 IL6Rα:gp130:gp130:IL6Rα 사량체를 통해 이의 다운스트림 신호를 활성화시킨다(12). gp130과 관련된 4개의 Janus 키나제(JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2) 중에서, LIF 신호전달은 트랜스인산화를 통해 JAK1을 선택적으로 활성화시킨다(12, 17, 18). LIF에 의한 활성화 시, JAK는 3개의 별개의 신호전달 캐스케이드: JAK-STAT, PI3K-AKT-mTOR 및 RAS-MAPK를 이끌어내며, 이는 상이한 기능에 세포 유형 특이적 방식으로 기여한다(12, 19). JAK-STAT 경로에 관하여, LIF 신호전달은 STAT3를 우선적으로 활성화시키긴 하지만, STAT1 및 STAT5 또한 JAK1에 의해 인산화될 수 있다(19, 20). 어떤 경로가 BCE 세포에서 LIF-유도 성장 자극을 담당하는지 검사하기 위해, 각각 특이적으로 JAK1/2, MEK1/2(MAPK 경로) 및 PI3K/mTOR에 대한 것인 저분자 저해제 바리시티닙, 코비메티닙 및 BEZ235 세트를 이용하였다. BCE 세포에서, 15분 동안의 LIF 처리는 STAT3 및 ERK의 인산화를 이끌어내었으나, AKT 인산화에는 거의 효과를 보여주지 않았다(도 2a). JAK1/2 저해제 바리시티닙과의 예비-인큐베이션은 STAT3 및 ERK MAPK의 LIF-유도 인산화를 거의 완전히 억제시켰으며(도 2a), 한편, 코비메티닙 전처리는 ERK 인산화를 차단하였으나 STAT3 및 AKT 인산화에 아무런 효과를 보여주지 않았다(도 2a). BEZ235는 LIF 처리와 상관없이 AKT 인산화에 단지 중등 효과를 가졌다(도 2a). 더욱이, 바리시티닙은 LIF-유도 세포 성장을 완전히 차단한 한편, 코비메티닙은 미미한 효과를 보여주었고 PI3K/mTOR 저해제 BEZ235는 LIF-유도 세포 성장에 아무런 효과를 갖지 않았다(도 2b). 이들 관찰은, MAPK 및 PI3K 경로가 BCE 세포에서 LIF 자극에 대한 주요 기여인자(contributor)가 아닐 것이므로, JAK-STAT이 관여함을 시사한다. STAT3가 LIF-유도 JAK-STAT 신호전달 캐스케이드에서 우선적인 매개인자이고(19, 20) 광범위하게 다양한 세포 유형에서 증식 및 생존율에 연관되어 왔기 때문에(21), siRNA 넉다운에 의한 BCE에서의 STAT3의 역할을 추가로 검사하였다. siRNA는 BCE 세포에서 RNA 수준과 단백질 수준 둘 다에서 STAT3 수준을 성공적으로 약화시켰다(도 2c 및 도 2d). STAT3의 하향조절은 시험관내에서 LIF-유도 BCE 세포 성장을 차단하였다(도 2e). 이들 관찰은, JAK-STAT3 신호전달 축이 BCE 세포에서 LIF의 유사분열촉진 효과를 매개하였음을 나타내었다.

LIF는 생체외에서 그리고 생체내에서 내피 세포 성장을 촉진하였다

LIF는 시험관내에서 맥락막 및 망막 내피 세포의 증식을 유도할 수 있다. 그러나, 이전의 보고서는, LIF가 발달중인 눈에서 혈관 기능에 악영향을 미칠 수 있을 것임을 시사하였다(14, 16, 22). 이들 명백한 불일치를 해결(resolve)하기 위해, LIF가 생체외에서 그리고 생체내에서, 특히 눈에서의 내피 세포에서 차별적으로 작용하는지의 여부를 검사하였다. 맥락막 내피 세포에 미치는 LIF의 효과를 우선, 이전의 보고로부터 변형된 생체외 맥락막 외식편 모델에서 검사하였다(23). LIF에 반응하여, 외식편으로부터 마트리겔(matrigel) 내로의 미세혈관 아웃성장(outgrowth)은 대조군과 비교하여 유의하게 증강되었다(도 3a 및 도 3b). 다음, 생체내에서의 LIF 효과는 6 내지 8주령 마우스에서 유리체내 주사에 의해 검사하였다. 눈(eye)당 10 ng 용량의 LIF의 투여는 내피 세포 표면 마커 CD31에 대한 항체를 이용한 면역조직화학(IHC)에 의해 평가된 바와 같이 망막 미세혈관 밀도를 유의하게 증가시켰으며, 한편, 100 ng의 용량은 많은 사이토카인에 대해 관찰된 벨-형상의 반응과 일관되게 덜 효과적이었다(도 3c 및 도 3d)(24). 광간섭 단층촬영 혈관조영술(OCTA)은 또한, LIF 주사 후 망막 혈관 밀도에서 유의한 증가를 입증하였다(도 3e 및 도 3f). 마우스 눈의 단면에서 CD31에 대한 면역형광 염색 또한, LIF 주사가 성체 마우스 망막에서 혈관 밀도를 증가시켰음을 실증하였다(도 3g 및 도 3h).

이러한 전혈관신생성 효과가 미량의 오염물질, 예컨대 내독소에 의해서라기 보다는 또는 주사와 관련된 비특이적인 사건(event)에 의해서라기 보다는 LIF에 의해 참으로 유도되었음을 입증하기 위해, 재조합 LIF를 95℃까지 2시간 동안 노출시키기 전에 열-불활성화시켰으며, 이는 내독소 안정성에 영향을 미치지 않는다(30). 이러한 치료는 시험관내에서 유사분열 유도(mitogenesis) 및 생체내에서 혈관신생을 촉진하는 LIF 능력을 무효화시켰다. 그러나, LIF 넉아웃(knockout) 마우스를 사용하는 이전의 연구는, LIF 발현이 망막 혈관 밀도와 음성적으로(negatively) 관련되었음을 시사하였다(16). 이러한 관찰과 본 발명의 데이터 사이의 차이는, LIF가 상이한 발달 스테이지(stage)에서 망막 혈관신생을 조절하는 데 있어서 별개의 역할을 수행하는 가능성을 제기한다. 중요하게는, LIF는 또한, 망막 혈관구조의 발달에 부차적으로 영향을 미칠 수 있는 망막 성상세포 성숙에 결정적인 역할을 한다(31, 32). 발달중인 망막 혈관구조에 미치는 LIF의 효과를 검사하기 위해 그리고 성상세포 발달에 미치는 이의 영향을 최소화하기 위해, LIF를, 망막 혈관구조가 발달중이지만 성상세포 네트워크는 이미 확립되었고 성숙을 거치고 있는 생후 5일째의(P5) 마우스에게 유리체내 주사하였다(33, 34). 이러한 신생 마우스에서 LIF 처리는 또한, 주사 후 3일째에 평가된 바와 같이 혈관 밀도에서 유의한 증가를 초래하였으며(도 3i 및 도 3j), 이는 망막 혈관구조에서 LIF의 전혈관신생 효과를 확인시켜 주었다.

LIF가 인터루킨-6(IL-6) 패밀리의 구성원이기 때문에(25), 망막 혈관구조에 미치는 2개의 다른 패밀리 구성원인 카디오트로핀-1(CT-1)(26) 및 온코스타틴 M(OSM)(27)의 효과를 시험하였다. 50 ng LIF와 필적할 만하게, 20 ng 및 100 ng CT-1은 각각 망막 밀도에서 대략 30% 및 50% 증가를 초래하였다. 그러나, 촉진 대신에, 혈관 밀도가 OSM-치료 마우스의 망막에서 저하되었다. 망막 혈관구조에 미치는 LIF 및 CT-1의 효과로부터 OSM에 의해 유도되는 상이한 효과는, OSM이 gp130::LIFR 수용체 복합체와 gp130::OSMR 수용체 복합체 둘 다에 결합할 수 있는 한편 LIF 및 CT-1은 gp130::LIFR 복합체만 이용하기 때문에 OSM은 LIF 및 CT-1과 동일한 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없음을 시사한다.

NaIO₃ 마우스 모델은 위축성 AMD의 전임상 모델로서 광범위하게 사용되어 왔다(28). 이 모델에서, RPE 층과 맥락막 모세혈관 둘 다 심각하게 손상된다(29). 따라서, LIF, CT-1 및 OSM을 이 모델에서 맥락막 모세혈관 회복을 촉진하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. NaIO₃의 정맥내 주사 후, LIF, CT-1 또는 OSM을 유리체내 주사하였다. 망막 혈관구조에 미치는 효과와 일관되게, LIF 및 CT-1은 PBS 군과 비교하여 무혈관 영역을 감소시켰다. 대조적으로, OSM-치료 맥락막에서 무혈관 영역은 PBS 군보다 더 컸다(도 8c 및 도 8d). NaIO₃ 처리에 대한 망막 혈관구조에 미치는 LIF 및 CT-1의 보호 효과는 망막 내피 세포에서 이들의 직접적인 유사분열촉진 활성과 잠재적으로는 또한 산화적 스트레스-유도 손상으로부터 망막 RPE 세포를 보호하는 이들의 능력 둘 다에 기인할 수 있으며, 이는 다시 말해 전혈관신생 인자, 예를 들어, VEGF의 분비를 통한 망막 혈관구조의 유지를 뒷받침한다.

LIF는 JAK-STAT3 경로를 통해 성장 저해를 부여하였다

이전의 연구와 일관되게(35), LIF는 BAE 세포의 성장 저해를 초래하였으며(도 4a), 이는 내피 기능을 조절하는 데 있어서 LIF의 복합적인 역할을 시사하였다. BAE 세포에서 LIF-유도 신호전달 캐스케이드를 알아보기 위해, 바리시티닙, 코비메티닙 및 BEZ235를 사용하여 LIF-gp130:LIFR 다운스트림 구성요소 JAK1/2, MEK1/2 및 PI3K/mTOR을 저해하였다. BAE 세포에서, 15분 동안의 LIF 처리는 STAT3, ERK(MAPK) 및 AKT의 인산화를 유발하였다(도 4b). 바리시티닙 전처리는 STAT3, ERK 및 AKT의 LIF-유도 인산화를 유의하게 억제시킨 한편, 코비메티닙 및 BEZ235 전처리는 또한 ERK 및 AKT의 인산화를 각각 효과적으로 억제시켰다(도 4b). 흥미롭게는, 바리시티닙은 BAE 세포에서 LIF에 의해 유도되는 성장 억제를 역전시킨 유일한 저해제였으며(도 4c), 이는 JAK-STAT 경로가 BAE 세포에서 LIF의 효과를 매개하였음을 시사하였다. LIF에 의한 BAE 세포의 저해가 JAK-STAT3 캐스케이드에 기인하는지의 여부를 추가로 검사하기 위해, STAT3를 BAE 세포에서 3개의 상이한 siRNA에 의해 대략 80%만큼 넉다운시켰다(도 4d 및 도 4e). 흥미롭게는, BAE 세포에서 STAT3의 넉다운은 LIF에 의한 성장 저해를 개선하였다(도 4f). 이들 관찰은, LIF-JAK-STAT3 신호전달 경로가 내피 세포 성장의 조절에서 반대되는 역할을 할 수 있을 것이며, 이는 내피 세포의 유형에 의존적이었음을 실증한다.

LIF는 카텝신 L-의존적 세포 사멸 및 세포 주기 억제를 통해 BAE 세포 성장을 저해하였다

다음으로, 어떤 성장 저해 효과(예를 들어, 세포 주기 억제, 세포 노화 또는 프로그래밍된 세포 사멸)가 BAE 세포에서 LIF에 의해 유도되었는지 검사하였다. IL-6-STAT3 신호전달이 세포 노화와 밀접하게 관련이 있기 때문에(36-38), 우선 LIF-STAT3 축 또한 BAE 세포에서 노화를 유도하였다고 가정하였다. 그러나, 노화-관련-β-갈락토시다제 검정에서, LIF로 48시간 동안 처리된 BAE 세포에서 노화 세포의 증가된 수는 관찰되지 않았으며, 이는 노화가 BAE 세포에서 LIF에 의해 이끌어지는 주요 효과가 아니었음을 시사하였다. 흥미롭게는, 세포 사멸 마커 Annexin V에 대한 염색은 증가된 비율의 세포를 보여주었으며, LIF로 24시간 동안 처리된 BAE 세포에서 Annexin V 양성이었고(도 6a 및 도 6b), 이는 LIF 처리가 세포 사멸을 유도하였음을 나타내었다. 놀랍게도, 카스파제 저해제(Q-VD-OPH, Z-VAD-fmk 및 Z-DEVD-fmk) 또는 폴리(아데노신 5'-디포스페이트 리보스) 폴리머라제(PARP) 저해제(5-AIQ)와의 공동인큐베이션은 LIF에 의해 유도되는 세포 사멸 표현형을 구제할 수 없었다. 이들 데이터는, 카스파제-독립적 경로가 BAE 세포에서 LIF-매개 세포 사멸에 관여할 수 있음을 시사한다. BAE 세포 및 BCE 세포에서 LIF의 차별화된 역할에 대한 분자 기본을 조사하기 위해, LIF에 의해 유도되는/억제되는 유전자를, LIF와 함께 6시간 동안 인큐베이션된 BAE 세포 및 BCE 세포에서 RNA-seq에 의해 분석하였다. 두드러지게는, LIF 처리는 이들 2개 세포 유형에서 별개의 유전자 발현 패턴을 유발하였다. 특히, 적어도 일부 상황에서 혈관신생 저해제인 것으로 이전에 나타난 분비된 단백질인 IGFBP3(39)은 BCE 세포가 아니라 BAE 세포에서 대략 8배만큼 상향조절되었으며, 이는 qRT-PCR에 의해 후속적으로 확인된 발견이었다. 그러나, 재조합 IGFBP3은 BAE 세포 성장에 아무런 효과를 갖지 않았다. 더욱이, LIF로 72시간 동안 처리된 BAE 세포의 조건화된 배지는 LIF 중화 항체의 존재 하에 BAE 세포 성장을 저해하지 않았으며, 이는 LIF 유도 BAE 성장 저해가 분비된 인자에 의해 매개되었다는 가설에 대해 반대 의견을 내었다. STAT3가 리소좀 프로테아제 카텝신 B 및 L의 상향조절을 통해 카스파제-독립적 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것은 이전에 보고되었다(40). 따라서, LIF가 BAE 세포에서 이러한 신호전달 캐스케이드를 이끌어낼 것인지의 여부를 검사하였다. 흥미롭게는, CTSB가 아니라 CTSL이 BAE 세포에서 24시간의 처리에 의해 mRNA 수준과 단백질 수준 둘 다에서 LIF에 의해 급격하게 상향조절되었다(도 6c 및 도 6d). 카텝신 B와 카텝신 L 둘 다를 길항시키는 저해제인 CA074me와의 공동인큐베이션은 BAE 세포에서의 LIF-유도 성장 저해를 CA074me의 용량-의존적 방식으로 경감시켰다(도 6e). 더욱이, 또 다른 카텝신 L-특이적 저해제인 CAA0225 또한, BAE 세포에서 LIF-유도 성장 저해를 그렇지만 더 적은 규모(extent)만큼 억제시켰다(도 6f). 대조적으로, 카텝신 B-선택적 저해제 CA074는 시험된 최고 용량인 50 μM에서도 BAE 세포에서 LIF-유도 효과를 억제시킬 수 없었다. 흥미롭게는, BCE 세포에서 카텝신 L mRNA(CTSL) 수준은, 상기 세포가 비히클 또는 LIF와 함께 인큐베이션되었을 때에도 상관없이 qRT-PCR에 의해 검출 불가능하였다. 이들 데이터는 종합해서, LIF가 BAE 세포에서 카텝신 L의 상향조절을 유도하였으며 다시 말해 카스파제-독립적 세포 사멸을 유발하였음을 나타내었다. 더욱이, LIF와 함께 48시간 동안 인큐베이션 후, BAE 세포는 비히클 대조군과 비교하여 BrdU 혼입을 유의하게 감소시켰으며(도 7a 및 도 7b), 이는 세포 주기 억제가 LIF에 의해 이끌어졌음을 시사하였다. 이러한 개념은 BCE 세포가 아니라 LIF-처리 BAE 세포에서 사이클린 A/B의 하향조절에 의해 뒷받침되었다(도 7c).

구현예에서, 본 발명은 혈관 성장, 즉, 혈관신생을 유도하기 위해, IL-6 사이토카인, 예컨대 LIF 및 CT-1의 신규하며 예상치 못한 활성을 제공한다.

예를 들어, 본 발명은, 이전에 내피 세포 성장의 저해제로서 특징화되어 온 분자인 LIF가 시험관내, 생체외 및 생체내 연구에 의해 평가된 바와 같이 눈에서 예상치 못한 전혈관신생(pro-angiogenic) 특성을 가짐을 제공한다.

본 발명은, LIF가 맥락막 내피 세포의 증식을 직접적으로 자극할 수 있는 한편, LIF는 대동맥 내피 세포의 성장을 저해하며, 이는 내피 세포에 미치는 이의 효과의 특이성 및 독특성(uniqueness)을 강조함을 제공한다. LIF는 또한, 마우스 유리체 내에 주사되었을 때 맥락막 외식편으로부터의 내피 발아 및 혈관신생을 촉진하였다.

LIF는 IL6 패밀리의 구성원인 잘-특징화된 사이토카인이다. LIF는 LIF 수용체와 상호작용하며, 이는 다시 말해 GP130과 헤테로이량체를 형성하여 다른 효과 중에서 Stat3 활성화를 초래한다.

본 발명은, LIF가 내피 세포의 서브세트의 성장을 촉진할 수 있음을 제공하며, 망막/맥락막, 관상동맥 및 심근 질환에서의 낮은 관류를 포함하여 여러 가지 병태에서 치료적 개입을 위한 기회를 제공한다(Reboucas 등, 2016; Simon-Yarza 등, 2012; Wang 등, 2013). LIF가 혈관 투과성을 유도하지 않는다는 관찰은, 이러한 인자의 투여가 VEGF와 관련된 바람직하지 못한 혈관 누출을 피할 것임을 시사한다(Niu 등, 2016).

본 발명은, IL-6 패밀리 구성원, 예컨대 LIF 및 CT-1이 산화적 스트레스로 인한 손상을 포함한 손상으로부터 RPE를 보호할 수 있음을 시사한다. 이는 RPE 손상 또는 변성(degeneration)과 관련된 망막 병태의 치료를 위한 신규 치료적 전략을 나타내어야 한다.

참조문헌

1. A. S. Chung, N. Ferrara, Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology 27, 563-584 (2011).

2. M. Potente, H. Gerhardt, P. Carmeliet, Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell 146, 873-887 (2011).

3. G. D. Yancopoulos et al., Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407, 242-248 (2000).

4. N. Ferrara, A. P. Adamis, Ten years of anti-vascular endothelial growth factor therapy. Nat Rev Drug Discov 15, 385-403 (2016).

5. R. S. Apte, D. S. Chen, N. Ferrara, VEGF in Signaling and Disease: Beyond Discovery and Development. Cell 176, 1248-1264 (2019).

6. J. M. Isner, Vascular endothelial growth factor: gene therapy and therapeutic angiogenesis. Am J Cardiol 82, 63S-64S (1998).

7. M. Simons, Angiogenesis: where do we stand now? Circulation 111, 1556-1566 (2005).

8. S. Das, P. A. Marsden, Angiogenesis in glioblastoma. The New England journal of medicine 369, 1561-1563 (2013).

9. C. Depner et al., EphrinB2 repression through ZEB2 mediates tumour invasion and anti-angiogenic resistance. Nature communications 7, 12329 (2016).

10. R. Ferla, M. Bonomi, L. Otvos, Jr., E. Surmacz, Glioblastoma-derived leptin induces tube formation and growth of endothelial cells: comparison with VEGF effects. BMC cancer 11, 303 (2011).

11. A. Holm, T. Heumann, H. G. Augustin, Microvascular Mural Cell Organotypic Heterogeneity and Functional Plasticity. Trends Cell Biol 28, 302-316 (2018).

12. N. A. Nicola, J. J. Babon, Leukemia inhibitory factor (LIF). Cytokine Growth Factor Rev 26, 533-544 (2015).

13. G. X. Rosario, C. L. Stewart, The Multifaceted Actions of Leukaemia Inhibitory Factor in Mediating Uterine Receptivity and Embryo Implantation. Am J Reprod Immunol 75, 246-255 (2016).

14. J. Ash, D. S. McLeod, G. A. Lutty, Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular vision 11, 298-308 (2005).

15. M. S. Pepper, N. Ferrara, L. Orci, R. Montesano, Leukemia inhibitory factor (LIF) inhibits angiogenesis in vitro. J Cell Sci 108 ( Pt 1), 73-83 (1995).

16. Y. Kubota, M. Hirashima, K. Kishi, C. L. Stewart, T. Suda, Leukemia inhibitory factor regulates microvessel density by modulating oxygen-dependent VEGF expression in mice. The Journal of clinical investigation 118, 2393-2403 (2008).

17. Y. Takahashi et al., Leukemia inhibitory factor regulates trophoblast giant cell differentiation via Janus kinase 1-signal transducer and activator of transcription 3-suppressor of cytokine signaling 3 pathway. Mol Endocrinol 22, 1673-1681 (2008).

18. S. J. Rodig et al., Disruption of the Jak1 gene demonstrates obligatory and nonredundant roles of the Jaks in cytokine-induced biologic responses. Cell 93, 373-383 (1998).

19. S. G. Rane, E. P. Reddy, Janus kinases: components of multiple signaling pathways. Oncogene 19, 5662-5679 (2000).

20. H. Kiu, S. E. Nicholson, Biology and significance of the JAK/STAT signalling pathways. Growth Factors 30, 88-106 (2012).

21. H. Yu, D. Pardoll, R. Jove, STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3. Nature reviews. Cancer 9, 798-809 (2009).

22. J. R. McColm, P. Geisen, L. J. Peterson, M. E. Hartnett, Exogenous leukemia inhibitory factor (LIF) attenuates retinal vascularization reducing cell proliferation not apoptosis. Experimental eye research 83, 438-446 (2006).

23. Z. Shao et al., Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PloS one 8, e69552 (2013).

24. M. Atanasova, A. Whitty, Understanding cytokine and growth factor receptor activation mechanisms. Critical reviews in biochemistry and molecular biology 47, 502-530 (2012).

25. D. Pennica et al., Cardiotrophin-1. Biological activities and binding to the leukemia inhibitory factor receptor/gp130 signaling complex. The Journal of biological chemistry 270, 10915-10922 (1995).

26. D. Pennica et al., Expression cloning of cardiotrophin 1, a cytokine that induces cardiac myocyte hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 1142-1146 (1995).

27. D. P. Gearing, A. G. Bruce, Oncostatin M binds the high-affinity leukemia inhibitory factor receptor. New Biol 4, 61-65 (1992).

28. J. Hanus, C. Anderson, D. Sarraf, J. Ma, S. Wang, Retinal pigment epithelial cell necroptosis in response to sodium iodate. Cell Death Discov 2, 16054 (2016).

29. A. Mizota, E. Adachi-Usami, Functional recovery of retina after sodium iodate injection in mice. Vision Res 37, 1859-1865 (1997).

30. P. O. Magalhaes et al., Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of pharmacy & pharmaceutical sciences : a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutiques 10, 388-404 (2007).

31. S. Sakimoto et al., A role for endothelial cells in promoting the maturation of astrocytes through the apelin/APJ system in mice. Development 139, 1327-1335 (2012).

32. H. West, W. D. Richardson, M. Fruttiger, Stabilization of the retinal vascular network by reciprocal feedback between blood vessels and astrocytes. Development 132, 1855-1862 (2005).

33. C. Tao, X. Zhang, Development of astrocytes in the vertebrate eye. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 243, 1501-1510 (2014).

34. L. J. Duan, S. J. Pan, T. N. Sato, G. H. Fong, Retinal Angiogenesis Regulates Astrocytic Differentiation in Neonatal Mouse Retinas by Oxygen Dependent Mechanisms. Scientific reports 7, 17608 (2017).

35. N. Ferrara, J. Winer, W. J. Henzel, Pituitary follicular cells secrete an inhibitor of aortic endothelial cell growth: identification as leukemia inhibitory factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 698-702 (1992).

36. H. Kojima, T. Inoue, H. Kunimoto, K. Nakajima, IL-6-STAT3 signaling and premature senescence. Jak-Stat 2, e25763 (2013).

37. M. Sapochnik, M. Fuertes, E. Arzt, Programmed cell senescence: role of IL-6 in the pituitary. Journal of molecular endocrinology 58, R241-R253 (2017).

38. R. Salama, M. Sadaie, M. Hoare, M. Narita, Cellular senescence and its effector programs. Genes & development 28, 99-114 (2014).

39. B. Liu et al., Insulin-like growth factor-binding protein-3 inhibition of prostate cancer growth involves suppression of angiogenesis. Oncogene 26, 1811-1819 (2007).

40. P. A. Kreuzaler et al., Stat3 controls lysosomal-mediated cell death in vivo. Nature cell biology 13, 303-309 (2011).

41. S. Takashima, M. Klagsbrun, Inhibition of endothelial cell growth by macrophage-like U-937 cell-derived oncostatin M, leukemia inhibitory factor, and transforming growth factor beta1. The Journal of biological chemistry 271, 24901-24906 (1996).

42. M. Vasse et al., Oncostatin M induces angiogenesis in vitro and in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol 19, 1835-1842 (1999).

43. T. Pannicke, L. Wagner, A. Reichenbach, A. Grosche, Electrophysiological characterization of Muller cells from the ischemic retina of mice deficient in the leukemia inhibitory factor. Neuroscience letters 670, 69-74 (2018).

44. D. M. Sherry, R. Mitchell, H. Li, D. R. Graham, J. D. Ash, Leukemia inhibitory factor inhibits neuronal development and disrupts synaptic organization in the mouse retina. J Neurosci Res 82, 316-332 (2005).

45. L. Bozoyan, J. Khlghatyan, A. Saghatelyan, Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 32, 1687-1704 (2012).

46. J. Chen, L. E. Smith, Retinopathy of prematurity. Angiogenesis 10, 133-140 (2007).

47. T. Alon et al., Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nature medicine 1, 1024-1028 (1995).

48. J. S. Penn et al., Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in retinal and eye research 27, 331-371 (2008).

49. S. Pensa et al., Signal transducer and activator of transcription 3 and the phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunits p55α and p50α regulate autophagy in vivo. The FEBS journal 281, 4557-4567 (2014).

50. A. Kaasik, T. Rikk, A. Piirsoo, T. Zharkovsky, A. Zharkovsky, Up-regulation of lysosomal cathepsin L and autophagy during neuronal death induced by reduced serum and potassium. The European journal of neuroscience 22, 1023-1031 (2005).

51. J. Liu et al., Cathepsin L expression and regulation in human abdominal aortic aneurysm, atherosclerosis, and vascular cells. Atherosclerosis 184, 302-311 (2006).

52. W. Li, L. Kornmark, L. Jonasson, C. Forssell, X. M. Yuan, Cathepsin L is significantly associated with apoptosis and plaque destabilization in human atherosclerosis. Atherosclerosis 202, 92-102 (2009).

53. N. A. Gillett, D. Lowe, L. Lu, C. Chan, N. Ferrara, Leukemia inhibitory factor expression in human carotid plaques: possible mechanism for inhibition of large vessel endothelial regrowth. Growth Factors 9, 301-305 (1993).

54. M. Snyder, X. Y. Huang, J. J. Zhang, Identification of novel direct Stat3 target genes for control of growth and differentiation. The Journal of biological chemistry 283, 3791-3798 (2008).

55. M. Zhou, H. Yang, R. M. Learned, H. Tian, L. Ling, Non-cell-autonomous activation of IL-6/STAT3 signaling mediates FGF19-driven hepatocarcinogenesis. Nature communications 8, 15433 (2017).

56. R. L. Robinson et al., Comparative STAT3-Regulated Gene Expression Profile in Renal Cell Carcinoma Subtypes. Frontiers in oncology 9, 72 (2019).

57. C. Gong et al., Abnormally expressed JunB transactivated by IL-6/STAT3 signaling promotes uveal melanoma aggressiveness via epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports 38 (2018).

58. B. Jin et al., PIM-1 modulates cellular senescence and links IL-6 signaling to heterochromatin formation. Aging cell 13, 879-889 (2014).

59. J. LeCouter et al., Angiogenesis-independent endothelial protection of liver: role of VEGFR-1. Science 299, 890-893 (2003).

60. H. G. Augustin, G. Y. Koh, Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science 357 (2017).

61. D. J. Nolan et al., Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Developmental cell 26, 204-219 (2013).

62. J. Kim et al., Tie2 activation promotes choriocapillary regeneration for alleviating neovascular age-related macular degeneration. Science advances 5, eaau6732 (2019).

63. L. Yu et al., Interaction between Bevacizumab and Murine VEGF-A: A Reassessment. Invest Ophthalmol Vis Sci 49, 522-527 (2008).

64. H. Xin, C. Zhong, E. Nudleman, N. Ferrara, Evidence for Pro-angiogenic Functions of VEGF-Ax. Cell 167, 275-284 e276 (2016).

65. L. Scheppke et al., Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of clinical investigation 118, 2337-2346 (2008).

66. J. Xu et al., Evaluating changes of blood flow in retina, choroid, and outer choroid in rats in response to elevated intraocular pressure by 1300nm swept-source OCT. Microvascular research 121, 37-45 (2019).

67. Yue, X., Wu, L., and Hu, W. (2015). The regulation of leukemia inhibitory factor. Cancer cell & microenvironment 2.

Claims

대상체의 눈에서 부적절한 혈관화(vascularization)와 관련된 병태의 치료 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 IL-6 패밀리(family) 단백질, 또는 이의 기능성 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 혈관신생(angiogenesis)을 촉진하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여는 망막 미세혈관 밀도(retinal microvessel density)를 증가시키는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여는 맥락막 내피 세포(choroidal endothelial cell)의 증식을 증가시키는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 병태는 노화-관련 황반 변성(age-related macular degeneration)인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 병태는 미숙아 망막병증(ROP: retinopathy of prematurity)인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여는 유리체내 주사(intravitreal injection)를 통한 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 유효량은 혈관 누출(vascular leakage)을 유도하지 않는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 유효량은 부종(edema)을 유도하지 않는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 IL-6 패밀리 단백질은 백혈병 저해 인자(LIF: leukemia inhibitory factor)인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 IL-6 패밀리 단백질은 카디오트로핀-1(CT-1: cardiotrophin-1)인, 방법.
대상체의 눈에서 혈관 형성을 유도하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 IL-6 패밀리 단백질, 또는 이의 기능성 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 투여는 망막 혈관신생을 증가시키는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 투여는 맥락막 내피 세포의 증식을 증가시키는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 대상체는 노화-관련 황반 변성을 갖는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 대상체는 미숙아 망막병증(ROP)을 갖는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 투여는 유리체내 주사를 통한 것인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 유효량은 혈관 누출을 유도하지 않는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 유효량은 부종을 유도하지 않는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 IL-6 패밀리 단백질은 백혈병 저해 인자(LIF)인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 IL-6 패밀리 단백질은 카디오트로핀-1(CT-1)인, 방법.