KR20210110985A

KR20210110985A - 율피 추출물 또는 이의 분리화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20210110985A
Application number: KR1020200025930A
Authority: KR
Inventors: 김태양; 황성진; 이춘몽; 이광식; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2021-09-10
Also published as: KR102311382B1

Abstract

본 발명은 율피 추출물(Castanea crenata) 또는 이의 분리화합물을 유효성분으로 함유하여, 자외선에 의한 피부 노화를 방지하는 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 율피 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론은 악틴 또는 악티게닌과 함께 조합되어, 콜라겐 생합성 촉진, MMP 활성억제, 엘라스타아제 효소활성 저해, 티로시나아제 효소 활성 저해, 멜라닌 합성 억제, 세포 증식 촉진 효과를 갖는 항노화용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

율피 추출물 또는 이의 분리화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR PREVENTING SKIN PHOTO-AGING COMPRISING EXTRACT OF CASTANEA CRENATA OR FRACTIONS FROM THEREOF AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 율피 추출물(Castanea crenata) 또는 이의 분리화합물인 스코파론(scoparone)을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

인체를 이루고 있는 가장 큰 기관인 피부는 외부로부터 피부 안쪽의 다양한 기관을 보호하는 기능과 내부의 수분 및 유용성분이 밖으로 유출되는 것을 막아주는 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡 기능 등 다양한 생리적 기능을 담당하고 있는 아주 중요한 기관이다. 그러나, 나이가 들면서 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아져 피부 장벽 기능이 저하되고 피부의 수분함량의 급격한 감소로 피부가 건조해지는 등 피부의 생리적 기능이 저하되고, 이로 인한 다양한 변화가 오면서 노화된다.

또한, 대부분의 사람들이 성장기에는 일광에 대하여 피부가 쉽게 대응을 하지만, 연령이 높아지면서 피부 조직이 점차 변화함에 따라 일광으로 인한 거칠어짐, 주름, 착색 반점, 혈색이 나쁨, 설사, 모세혈관확장, 흑점, 자반 및 쉬운 타박상, 위축, 섬유증 탈색 부위 및 극심하게는 전암성 종양 및 악성 종양 등의 현상이 발생하게 된다.

자외선은 UVA, UVB, UVC 영역으로 나누어지며 지구상에는 UVA, UVB만 이 작용을 하고, UVC영역은 오존층에 의해 차단된다. UVB는 피부에 가장 많은 영향을 주며 주로 표피에 까지 침투하여 피부세포에 영향을 준다. UVA는 피부속 진피까지 침투하여 주로 콜라겐 합성 관련 피부 세포에 영향을 준다. 이들 자외선은 직접적으로 영향을 주거나 간접적으로는 활성 산소를 발생시켜 피부에 영향을 준다. 자외선에 의한 피부 세포의 영향을 살펴보면 다음과 같다. 먼저, 피부세포 중 케라티노사이트 (keratinocyte)는 자외선이 조사되면 염증성 사이토카인(cytokine)들을 분비하고 또한 산화적 스트레스가 유발되어 세포내에서 여러 종류의 단백질 키나제 및 포스포리파제가 활성화된다. 활성화된 이들 효소는 세포막 지질을 가수분해시켜 아라키돈산을 분비되게 한다. 상기의 분비된 아라키돈산은 시클로옥시게나제의 작용으로 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 변화된다. 이렇게 형성된 아라키돈산 및 PGE2는 사이토카인들과 협동하여 피부에서 발적을 비롯한 여러 가지의 염증 반응을 일으키며, 궁극적으로는 피부의 노화를 촉진한다.

노화에 따른 피부의 생리적 변화로는 크게 세가지로 구분할 수 있는데, 첫째로 피부의 구성성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지는 현상, 두번째로 피부장벽의 기능을 맡고 있는 지질막(lipid barrier)의 지질 조성과 함량이 변화하면서 그 기능이 급격하게 저하됨으로써 피부의 수분함량이 떨어지고 피부가 건조해지는 현상, 마지막으로는 기미, 주근깨, 색소 침착 및 다 양한 피부 병변이 유발되는 현상 등이 있다. 최근 환경오염으로 인하여 피부에 도달하는 자외선의 양이 점차 증가하고 있는데 이로 인하여 자유 라디칼의 생성, 피부탄력감소, 색소침착, 기미, 주근깨와 같은 피부 노화 현상과 관련된 다양한 원인이 되고 있다.

피부에서 엘라스틴 섬유는 콜라겐 섬유와 더불어 진피(epidermis) 안쪽에서 가교 결합을 형성한다. 나이가 들어감에 따라 엘라스틴 분해 효소인 엘라스타제의 작용으로 피부의 탄력이 급격히 저하되고, 함몰(sagging)이 생긴다. 또한, 조직학적으로는 나이가 들어감에 따라 염증 세포의 활성이 증가하며, 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 콜라겐 섬유의 감소를 보여주며, 생화학적으로는 엘라스타제의 활성도가 현격히 감소한다. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해할 수 있는 지금까지 알려진 유일한 효소이며, 이러한 활성 또는 생성의 저해는 피부 노화를 근본적으로 줄여 줄 수 있는 방법이 된다.

사람의 피부색은 크게 멜라닌의 양, 헤모글로빈, 카로틴 등에 의해 결정되는데, 이중에서 멜라닌이 가장 중요한 역할을 한다. 멜라닌은 사람의 피부색을 결정할 뿐 아니라 자외선 흡수 작용 및 자유 라디칼 스캐빈져(scavenger)의 역할을 하지만, 외부의 환경변화(예, 자외선의 과량 노출, 대기오염, 정신적 스트레스 등)에 의 해 과다하게 피부내 생성되면 피부 내에서 색소침착현상이 일어나게 되어 피부색이 검게되거나 기미, 주근깨 등의 원인이 된다

멜라닌 합성 과정을 살펴보면 다음과 같다: 먼저, 멜라노사이트에서, 티로신을 기질로 하여 티로시나아제라는 효소가 도파퀴논 (DOPA quinone)을 생성시키며, 도파퀴논으로부터 자동산화 반응과 효소 반응을 거쳐 공중합체 인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀을 통해 각질형성세포로 옮겨지게 되고 각질형성세포 에서 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부표면으로 나오게 된다. 그러나 이 과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 요인에 의해서 멜라닌이 과량 생성되고, 각화에 의해 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소침착(Pigmentation) 현상이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 색소 침착 현상을 막아주기 위해서는 멜라닌 생성 과정에서의 일부 과정을 조절해 줌으로써 가능하다.

한국등록특허 제10-1040507호에서는 천녀목란 추출물을 함유하여 광노화 방지 효과를 갖는 화장료 조성물을 개시한다.

또한, 한국등록특허 제10-0308178호는 피추출물을 함유하여 피부 주름 개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 개시한다.

본 발명자는 피부 광노화 현상을 효과적으로 개선하기 위해 천연 식물 및 이의 분리 화합물에 대한 다양한 피부 생리활성을 검색한 결과, 천연 식물 추출물 중에서 율피(Castanea crenata) 추출물 및 이의 분리화합물인 스코파론이 피부 광노화를 효과적으로 방지함을 피부 노화를 효과적으로 방지함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기한 과제는, 율피(Castanea crenata) 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론(scoparone)과, 악틴(arctiin) 또는 악티게닌(arctigenin)을 유효성분으로 포함하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 피부 광노화 방지는 UV에 의한 피부 손상에 따른 주름 생성 억제 또는 멜라닌 생합성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 율피 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론과, 악틴 또는 악티게닌은 100:1 내지 10:1의 중량비로 혼합될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 율피 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론과, 악틴 또는 악티게닌을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 30 중량%를 함유할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 율피 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명은 율피 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론(scoparone)을 포함하는 화장료 조성물에 의해, 콜라겐 생합성 촉진 및 MMP 활성억제, 엘라스타아제 효소활성 저해, 티로시나아제 효소 활성 저해, 멜라닌 합성 억제, 세포 증식 촉진 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 율피(Castanea crenata) 추출물 또는 이의 분리화?d물인 스코파론(scoparone)을 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 율피(Castanea crenata)는 참나무과의 밤나무 열매로부터 얻어지는 속껍질로써, 예로부터 율부라는 이명으로 구감, 나창, 비뉵과 같은 병증의 치료제로 사용되어 왔다.

본 발명의 율피 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다. 본 발명에서는 바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용 하였다. 본 발명에서 율피 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다.

한편, 본 발명의 율피 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 본 발명의 율피 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명에 따른 율피 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함하는 데 율피(Castanea crenata)의 발효추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 율피를 100~500메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모 균주 또는 유산균등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 율피 추출물로부터 분리된 분리화합물인 스코파론(scoparone)을 포함할 수 있다.

스코파론은 하기의 화학식 1로 나타낼 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 악틴 또는 악티게닌을 추가로 포함할 수 있다.

악티게닌은 4-[(3,4-디메톡시페닐)메틸]디하이드로-3-[(4-하이드록시-3-메톡시페닐)메틸]-2(3H)-퓨라논(4-[(3,4-Dimethoxyphenyl)methyl]dihydro-3-[(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)methyl]-2(3H)-furanone)으로 표기되는 하기 화학식 2의 구조를 가지는 분자량이 372인 리간드 화합물이다.

악틴은 악티게닌의 배당체로 글루코스가 붙어있는 화합물이며(화학식 2 참조), 4-[(3,4-디메톡시페닐)메틸]디하이드로-3-[(4-글루코스-3-메톡시페닐)메틸]-2(3H)-퓨라논(4-[(3,4-Dimethoxyphenyl)methyl]dihydro-3-[(4-Glucose-3-metoxyphenyl)methyl]-2(3H)-furanone)으로 표기되는 분자량이 535인 리간드 화합물이다.

[화학식 2]

상기 악틴과 악티게닌은 모두 리간드 화합물로서, 우엉, 우방자(Arctium lappa), 홍화(Carthamus tinctorius), 연교(Forsythia suspensa) 등에서 추출할 수 있으며, 상업적으로 판매하기도 한다.

본 발명에 따르면, 상기 율피 추출물 또는 스코파론과, 악틴 또는 악티게닌은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 율피 추출물 또는 스코파론과, 악틴 또는 악티게닌은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 주름 개선 또는 미백 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 율피 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론과, 악틴 또는 악티게닌은 100:1 내지 10:1의 중량비로 혼합되어, 우수한 광노화 방지 효과를 갖는다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다

본 발명에 있어서 “추출물”은 율피(Castanea crenata)를 용매를 이용하여 얻어지는 추출액으로써, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 이를 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물 등, 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 의미한다.

제조예 1 - 율피( Castanea crenata ) 추출물 제조

율피 10.0 kg을 깨끗한 물로 씻어 건조시킨 다음 일정한(100mesh) 크기로 분쇄하여 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하여 농축기를 이용하여 율피 추출물 1.15kg을 제조하였다.

제조예 2 - 스코파론 (scoparone) 제조

상기 제조예 1에서 획득한, 율피 추출물 1.0kg에 10L의 물을 넣어 분산시킨 후 n-헥산(hexane) 1L를 이용하여 비극성 성분을 제거하였으며(3회 반복), 이후 물층에 메틸렌클로라이드 10L를 넣어 분획한 층을 감압 농축하여 451g의 분획물을 얻었다. 이를 실리카겔(60 ~ 120mesh) 컬럼을 이용하여 유효성분 분리를 진행하였으며, 이동상으로는 메탄올메틸렌클로라이드 혼합액(1:20 -> 1:5)을 이용하여 분리 정제 하였다. 전체 12개의 분획물(fraction)을 회수하였으며, 콜라겐 생합성 효과와 멜라닌 합성 저해효과를 가지는 1개의 분획물로부터 9.1g을 회수 하였으며 NMR을 이용하여 분리 동정하여 스코파론임을 확인하였다

Scoparone : recrystallized from acetone, m.p. = 144-145℃, UV(methanol) 294 and 345nm, (1H, d, J=9.5, H-3), 3.95 and 3.92 (6H, 2s, 2 * OCH₃). ¹³C-NMR(CDCl3) 161.54 (C-2), 15.0 (C-5), 150.18 (C-7), 146.50 (C-8a), 143.41 (C-4), 113.65 (C-3), 111.54 (C-4a), 108.10 (C-6 or C-8), 100.10 (C-6 or C-8), 56.40 (2 * -OCH₃), Mass M/Z 207(M+), 206 (100), 191(38)

제조예 3 -악틴 및 악티게닌 제조

우방자 10.0 kg을 깨끗한 물로 씻어 건조시킨 다음 일정한(100mesh) 크기로 분쇄하여 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하여 농축기를 이용하여 우방자 추출물 1.50kg을 제조하였다. 우방자 추출물 1.0kg에 10L의 10% 에탄올을 넣어 분산시킨 후 n-헥산(hexane) 1L를 이용하여 비극성 성분을 제거하였으며(3회 반복), 이후 물층에 메틸렌클로라이드 10L를 넣어 분획한 층을 감압 농축하여 50g의 분획물을 얻었다. 이를 실리카겔(60 ~ 120mesh) 컬럼을 이용하여 유효성분 분리를 진행하였으며, 이동상으로는 메탄올/메틸렌 클로라이드 혼합액(1:20 -> 1:5)을 이용하여 분리 정제하여(전체 9개의 분획물을 회수하였으며, 모유두세포 증식효과를 가지는 2개의 분획물로부터) 2.14g, 1.84g을 회수하였으며 NMR을 이용하여 분리 동정하였다. 분획물 9개 중 콜라겐 생합성과 멜라닌 합성 저해효과를 가지는 분획 2종을 분리하여 악틴 및 악티게닌을 선정하였으며, NMR 결과를 문헌자료와 비교하여 분리 동정된 성분이 악틴(arctiin)과 악티게닌(arctigenin)임을 확인하였다. (Lu, H., Sun, Z., Shan, H., & Song, J. (2015). Microwave-assisted extraction and purification of arctiin and arctigenin from fructus arctii by high-speed countercurrent chromatography.　Journal of chromatographic science,　54(3), 472-478.)

실험예 1: 엘라스타제(Elastase) 저해활성 측정

기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(S4760, Sigma)를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 500μL씩 시험관에 취하고, 2mM tris-HCl buffer(pH8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(E1250, Sigma)2.5U/mL) 용액 500μL을 가한 후, 기질로 50mM tris-HCl buffer(pH8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(500μg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타제 저해활성은 시료 용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 하기 수학식 1에 따라 계산하여 나타내었다.

[수학식 1]

시료명	농도(ppm)	엘라스타제 저해율(%)
율피 추출물	100	21.11 % ± 1.35
	10	10.45 % ± 2.14
	1	5.08 % ± 1.82
스코파론	100	75.21 % ± 1.05
	10	50.48 % ± 1.87
	1	28.15 % ± 1.29
악틴	100	30.44 % ± 0.92
악틴	10	9.72 % ± 1.54
악티게닌	100	15.37 % ± 2.50
악티게닌	10	5.24 % ± 1.37

실험예 2: 티로시나아제 활성 저해 실험

기질로는 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)에 용해한 1.5 mmol/ℓ의 티로신 (sigma) 40 ㎕를 사용하였다. 제조예 1,2에서 제조한 추출물을 각각 0.05 M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)으로 희석하여 일정 농도로 시료액을 제조하였다. 티로신 40 ㎕에 상기 농도별 시료액 240 ㎕을 각각 첨가하고, 상기 용액에 티로시나아제(시그마사, 1500 U/㎖) 20 ㎕을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 반응시킨 다음, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나제 활성 저해율(%)은 시료 용액 첨가군인 실험군과 무첨가군인 대조군의 흡광도 감소율로 하기 수학식 2에 의하여 계산하여 표 2와 같이 나타내었다.

[수학식 2]

시료명	처리농도(ppm)	티로시나아제 저해율(%)
율피 추출물	100	23.12 % ± 1.35
	10	15.57 % ± 2.04
	1	-
스코파론	100	67.84 % ± 2.13
	10	45.90 % ± 1.95
	1	17.69 % ± 0.97
악틴	100	12.94 % ± 1.23
악틴	10	-
악티게닌	100	14.59 % ± 1.51
악티게닌	10	-

실험예 3: UV에 의해 증가된 멜라닌 생성 저해 효과

UV에 의해 촉진된 멜라닌의 생성 저해 실험에 사용한 α-MSH는 10% DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 1mM 용액으로 사용하였다. 마우스 유래 B-16 멜라노마(ATCC CRL 6323) 세포주는 포도당 4.5 g/L, 10% 혈청 및 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 75㎠ T-플라스크에 5%CO2 및 37℃ 조건하에서 계대 배양하였다. 계대 배양한 멜라노마 세포주는 75㎠ T-플라스크에서 24시간 배양한 후, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신(Trypsin)을 처리하여 세포를 분리한 후 75㎠ T-플라스크에 접종하여 6시간 동안 더 배양하였으며, 이때 세포 수는 1 × 10⁷세포/플라스크이다. 여기에 멜라노사이트 자극 호르몬을 DMEM 배지에 희석시켜 최종 100㎍/㎖의 농도로 희석하여 첨가하고 240~360 nm의 파장영역의 형광 태양광을 1분간 조사하였으며, 제조예 1, 2, 3의 화합물을 DMEM 배지에 희석시켜 최종 각각 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 멜라노마 세포에 처리하고 37℃에서 5일간 더 배양하였다. 배양한 후 배지를 수득하여 475nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 정도를 비교하였으며, 멜라닌 생성 억제율(%)은 멜라노사이트 자극 호르몬과 UV 파장영역을 처리한 세포배양액의 흡광도 값을 대조값으로 하여 하기 수학식 3에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.

[수학식 3]

시료명	처리농도(ppm)	멜라닌 생성 억제율(%)(UV처리 대비)
율피 추출물	100	25.18 % ± 1.07
	10	13.27 % ± 1.64
	1	-
스코파론	100	27.84 % ± 2.13
	10	25.90 % ± 1.95
	1	-
악틴	100	7.46 % ± 1.01
악틴	10	-
악티게닌	100	8.61 % ± 1.20
악티게닌	10

시료명	농도(ppm)	시료명	농도(ppm)	멜라닌 생성 저해율(%)(UV처리 대비)
스코파론	100	악틴	10	68.09 % ± 1.10
			1	50.17 % ± 2.27
	10	악틴	10	45.41 % ± 1.78
			1	40.91 % ± 0.94
	100	악티게닌	10	55.24 % ± 1.73
			1	36.07 % ± 1.50
	10	악티게닌	10	45.76 % ± 0.96
			1	38.12 % ± 1.37

실험예 4: UV에 의한 세포 독성 회복 효과(cell proliferation)

24 웰 플레이트에 각질형성세포를 2× 10⁵ cells/well의 밀도로 10% FBS가 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco)으로 접종하여 가습화된 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청(Serum-free) DMEM으로 교환 후 240 ~ 360nm의 파장영역의 형광 태양광을 1분간 조사하였으며 제조예의 시료를 일정농도(v/v) 처리하여 3일 배양하였다. 이때, 대조군(음성)으로는 제조예의 추출물 대신 식염수를 사용하여 실시하였다. 배양 후 세포생성 효과를 보기 위해 MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며 UV처리군을 무처리군으로 하여 처리군과의 세포증식 효과를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	세포 증식 효과(%) (UV처리 대비)
율피 추출물	100	101.82 % ± 3.51
	10	-
	1	-
스코파론	100	113.10 % ± 1.27
	10	105.18 % ± 2.01
	1	-
악틴	100	104.17 % ± 1.79
	10	101.11 % ± 3.33
	1	-
악티게닌	100	120.04 % ± 2.09
	10	113.76 % ± 2.68
	1	-

시료명	농도(ppm)	시료명	농도(ppm)	세포 증식 효과(%)(UV처리 대비)
스코파론	100	악틴	10	141.84 % ± 2.75
			1	125.10 % ± 1.17
	10	악틴	10	123.41 % ± 2.10
			1	108.73 % ± 1.33
	100	악티게닌	10	126.79 % ± 1.91
			1	120.00 % ± 1.05
	10	악티게닌	10	121.11 % ± 2.18
			1	112.77 % ± 1.06

실험예 5: 콜라겐 생합성

24 well plate에 섬유아세포를 2× 10 ⁵ cells/well의 밀도로 10% FBS, 페니실린(Penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco)으로 접종하여 가습화된 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청(Serum-free) DMEM으로 교환 후 240 ~ 360nm의 파장영역의 형광 태양광을 1분간 조사하였으며 제조예의 시료를 일정농도(v/v) 처리하고, 1× 10⁵개/ml로 24 well plate에 500㎕씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 섬유아세포에서 콜라겐 타입 I(collagen type I) 의 정량은 'Procollagen Type I c-peptide EIAkit(TaKaRa, japan)'를 이용하여 효소면역분석법(immunosorbent assay, ELISA)으로 실시하였는데, 분석을 위해 48시간 동안 배양한 상기의 세포 배양 상등액을 조심스럽게 수집하였다. 먼저 'Procollagen Type I cpeptide와 결합하는 항체 (antibody)가 코팅된 스트립(strip)에 48시간 배양된 배양 상등액을 각각 100 ul씩 첨가하고 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거한 다음, 여기에 블라킹 버퍼(Blocking buffer) 100 ul씩 넣고, 다시 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거하고, 'Procollagen Type I c-peptide'와 결합하는 또 다른 항체에 POD가 콘쥬게이트(conjugate)된 용액(Antiobody-POD conjugate solution) 100 ul씩 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱 버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거하고, 동량의 기질 (substrate) 용액 넣고, 30분간 반응시킨 다음 정지용액(stop solution, 1N H2SO4)을 넣고 실험을 종료하였다. 실험이 종료된 스트립(strip)을 450 nm에서 흡광도를 측정하여 콜라겐 표준품과 비교하여 새로 합성된 콜라겐 양을 PICP 양으로 측정하였으며 PICP 양은 ng/2x10⁴세포로 환산하여 콜라겐의 합성효과를 표 7 및 표 8에 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	콜라겐 합성량 (ng/2x10⁴) (UV처리 대비)
율피 추출물	100	24.9
	10	20.1
	1	13.5
스코파론	100	33.7
	10	20.9
	1	10.5
악틴	100	20.9
	10	15.3
	1	9.8
악티게닌	100	16.2
	10	11.9
	1	5.2

시료명	농도(ppm)	시료명	농도(ppm)	콜라겐 합성량 (ng/2x10⁴) (UV처리 대비)
스코파론	100	악틴	10	59.1
			1	43.3
	10	악틴	10	40.9
			1	29.0
	100	악티게닌	10	45.6
			1	36.3
	10	악티게닌	10	41.7
			1	27.4

실험예 6: MMP-1 생성 억제 효과

24 well plate에 섬유아세포를 2× 10 ⁵ cells/well의 밀도로 10% FBS, Penicillin이 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco)으로 접종하여 가습화 된 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청(Serum-free) DMEM으로 교환 후 240~360nm의 파장영역의 형광 태양광을 1분간 조사하였으며 제조예의 시료를 일정농도(v/v) 처리하고, 1× 10⁵개/ml로 24 well plate에 500㎕씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MM P-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 4에 따라 UV처리군 대비 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 9 및 표 10에 나타내었다.

[수학식 4]

시료명	농도(ppm)	MMP-1 생성 저해율(%) (UV처리 대비)
율피 추출물	100	31.21 %
	10	18.18 %
	1	-
스코파론	100	33.25 %
	10	26.11 %
	1	-
악틴	100	30.37 %
	10	12.69 %
	1	-
악티게닌	100	16.81 %
	10	9.08 %
	1	-

시료명	농도(ppm)	시료명	농도(ppm)	MMP-1 생성 저해율(%)
스코파론	100	악틴	10	67.92 %
			1	55.04 %
	10	악틴	10	39.52 %
			1	30.75 %
	100	악티게닌	10	62.35 %
			1	42.15 %
	10	악티게닌	10	45.29 %
			1	30.87 %

처방예 1 - 크림

상기의 제조예를 통하여 만들어진 율피 추출물 및 이의 유효성분을 함유하는 제조예를 함유한 화장료 중 크림의 처방예는 다음 표 11와 같으며 본 처방예에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 샴푸, 트리트먼트, 두피 앰플, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

성분				함량 (중량%)
제형예 1	제형예 2	제형예 3	제형예 4	함량 (중량%)
제조예 1 (1000ppm)	제조예 2 (1000ppm)	제조예 3 (악틴1000ppm)	제조예 2 및 3 (스코파론 100ppm 및 악틴 100ppm)
글리세린	글리세린	글리세린	글리세린	3.0
베타인	베타인	베타인	베타인	10.0
피이지 1500	피이지 1500	피이지 1500	피이지 1500	5.0
알란토인	알란토인	알란토인	알란토인	2.0
DL-판테놀	DL-판테놀	DL-판테놀	DL-판테놀	0.1
이.디.티.에이-2Na	이.디.티.에이-2Na	이.디.티.에이-2Na	이.디.티.에이-2Na	0.3
벤조페논 - 9 히드록시에칠	벤조페논 - 9 히드록시에칠	벤조페논 - 9 히드록시에칠	벤조페논 - 9 히드록시에칠	0.02
셀룰로오스	셀룰로오스	셀룰로오스	셀룰로오스	0.04
소듐히아루로네이트	소듐히아루로네이트	소듐히아루로네이트	소듐히아루로네이트	0.1
카르복시비닐폴리머	카르복시비닐폴리머	카르복시비닐폴리머	카르복시비닐폴리머	8.0
트리에탄올아민	트리에탄올아민	트리에탄올아민	트리에탄올아민	0.2
옥틸도데칸올	옥틸도데칸올	옥틸도데칸올	옥틸도데칸올	0.18
옥틸도데세스 -16	옥틸도데세스 -16	옥틸도데세스 -16	옥틸도데세스 -16	6.0
방부제, 향, 색소	방부제, 향, 색소	방부제, 향, 색소	방부제, 향, 색소	미량
증류수	증류수	증류수	증류수	잔량
합계				100

실시예 1: 율피 추출물 또는 이의 분리화합물(스코파론)을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과

제형예 1 내지 4의 유효성분인 제조예 1 내지 3을 정제수로 대체하여 비교제형예 1로 사용해 평가하였다. 100명의 30-40세 여성을 무작위로 5개군으로 나누어 제형예 1 ~ 4, 비교예의 크림을 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 크림 적당량을 양볼을 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 피부 탄력 개선 효과를 Cutometer(C+K, 독일)를 이용하여 탄력 증진 유무를 평가하였다. 실험 결과는 하기의 표 12에 나타낸 바와 같다.

구분	사용 전	사용 2주	사용 4주 후
제형예 1	24.10	30.24	31.23
제형예 2	26.21	31.13	33.57
제형예 3	21.47	29.95	31.18
제형예 4	23.78	35.9	45.5
비교 제형예 1	25.31	28.15	30.10

실시예 2: 율피 추출물 또는 이의 분리화합물(스코파론)을 함유하는 화장료의 미백 개선 효과

피부색이 어두운 25 ~ 45세의 여성 10명을 대상으로, 제형예 1 내지 4의 유효성분인 제조예 1 내지 3을 정제수로 대체하여 비교제형예 1로 사용해 평가하였다. 피험자의 팔의 12군데를 가로 세로 1 cm씩 표시하고, 자외선 B를 0.7MED의 광량으로 1일 간격으로 3회 조사한 후 7일간 색소 침착을 유발 한 후 제형예 1~4의 각 화장료를 각각 도포한 다음, 나머지 1 곳은 활성성분을 정제수로 대체한 대조군으로 사용하였다. 화장료는 2달 동안 하루에 2회 적용하였다. 측정 장비인 Minolta CR 300을 사용하여 2개월 경과 후 피부색을 측정하였으며, 피부색의 변화도를 계산하여 그 결과를 표 13에 나타내었다.

구분	ΔL value
제형예 1	1.98
제형예 2	2.42
제형예 3	2.64
제형예 4	3.35
비교 제형예 1	1.47

Claims

율피(Castanea crenata) 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론(scoparone)과, 악틴(arctiin) 또는 악티게닌(arctigenin)을 유효성분으로 포함하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피부 광노화 방지는 UV에 의한 피부 손상에 따른 주름 생성 억제 또는 멜라닌 생합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 율피 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론과, 악틴 또는 악티게닌은 100:1 내지 10:1의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 피부 광노화 방지용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 율피 추출물 또는 이의 분리화합물인 스코파론과, 악틴 또는 악티게닌을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 율피 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 광노화 방지용 화장료 조성물.