KR20210108830A - 나노구조체, 나노구조체를 포함하는 바이오센서, 및 스크리닝 방법 - Google Patents

나노구조체, 나노구조체를 포함하는 바이오센서, 및 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

나노입자,
탐지자(probe)를 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제1 화합물, 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제2 화합물, 및 선택적으로 상기 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하는 나노구조체로서, 상기 나노구조체가 상기 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우, 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)는 평균 1.2 nmol/g 내지 85 μmol/g인 나노구조체, 상기 나노구조체를 포함하는 바이오센서, 및 상기 나노구조체 또는 상기 바이오센서를 이용하여 생물학적 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

나노구조체, 나노구조체를 포함하는 바이오센서, 및 스크리닝 방법{A NANOSTRUCTURE, A BIOSENSOR INCLUDING THE NANOSTRUCTURE, AND A SCREENING METHOD}
나노구조체, 상기 나노구조체를 포함하는 바이오센서, 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인간의 질병과 관련된 유전자는 약 10,000개에 이르는 것으로 추정되나, 현재 FDA의 승인을 받아 임상에서 사용되는 약물의 표적단백질은 수백개에 불과하다. 그러나, 전통적인 약물 개발으로는 한 개의 신약을 개발하는데 평균 12-17억 달러의 비용과 10-15년의 개발기간이 소요된다. 이에, 표적 물질에 작용하는 신약 후보 물질을 전통적인 약물 개발 과정보다 빠르게, 저비용으로 발굴할 수 있는 기술이 필요하다.
표적 물질에 대해 특이적으로 반응하는 모이어티, 및/또는 화합물을 확인하는 것은 신약 후보 물질 발굴에서 중요한 단계이다. 최근 DNA-암호화 라이브러리 (DNA-encoded chemical library, DECL)를 이용해 신약 후보물질을 발굴하는 기술이 주목받고 있다.
DNA-암호화 라이브러리는 표적물질과 반응할 가능성이 있는 탐지자, 및 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 결합시킨 다양한 종류의 구조체를 포함한다. 상기 DNA-암호화 라이브러리에 표적 물질을 처리하여, 표적 물질과 반응한 구조체(Hit-구조체)를 선별한다. 이후, Hit-구조체에 결합된 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 분석하여, 표적 물질과 반응한 탐지자, 즉, Hit-화합물의 구조를 확인함으로써 신약 후보 물질을 발굴할 수 있다.
그러나, 라이브러리 구축 시, DNA는 수용액, 및 유기 용매 모두에서 용해도가 낮으며, 특히 대부분의 유기 용매에서는 서로 응집된다. 따라서, 가능한 반응이 제한적이고, 반응의 속도가 매우 느린 바, 라이브러리를 구축할 수 있는 탐지자의 종류가 상당히 제한적이다. 또한, 각 라이브러리를 구축하기 위한 각각의 반응 단계마다 과량의 시약, 용매 등을 제거하기 위한 분리, 및/또는 정제 과정이 필수적이나, 여기에 상당한 시간과 비용이 요구된다.
한편, Hit-구조체를 선별한 후, Hit-구조체 내 탐지자를 암호화 하는 DNA 서열을 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하고, next generation sequencing (NGS)으로 분석한다. 그러나, 일반적으로 Hit-구조체 내 탐지자, 즉, Hit-화합물의 수가 수만 개에서 수십만 개에 이르는 바, 이렇게 많은 Hit-화합물들 중 재합성, 및 활성을 검증할 화합물을 선택하는 것은 매우 어렵고 중요한 문제이다.
따라서, 라이브러리 구축이 용이하고, 스크리닝 시 Hit-화합물의 분석, 및 선택이 용이한 DNA 암호화 라이브러리가 필요하다.
일 구현예에서는 저비용 고효율로 초 거대 DNA 암호화 라이브러리를 구축하고, 신약 후보물질을 검출할 수 있는 나노구조체를 제공하고자 한다.
다른 구현예에서는 상기 나노구조체를 포함하는 바이오센서를 제공하고자 한다.
또 다른 구현예에서는 상기 바이오센서를 사용하여 생물학적 물질과 결합하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구현예는,
나노입자,
탐지자(probe)를 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제1 화합물,
상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제2 화합물, 및
선택적으로 상기 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하는 나노구조체로서,
상기 나노구조체가 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우, 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)는 평균 1.2 nmol/g 내지 85 μmol/g인 나노구조체를 제공한다.
상기 나노입자는 유기 중합체 나노입자, 무기 나노입자, 유무기 복합 나노입자, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 나노입자는 코어-쉘 형태이고, 상기 코어는 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌, 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트, 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌-폴리글리시딜메타크릴레이트 공중합체, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 쉘은 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트를 포함할 수 있다.
상기 나노입자의 크기는 10 nm 내지 1,000 nm 일 수 있다.
상기 제1 화합물, 및 제2 화합물은 각각 독립적으로 적어도 2 개의 말단을 가지고, 그 중 한 말단은 상기 나노입자에 결합될 수 있다.
상기 탐지자는 펩타이드, 펩타이드 유사체(peptide mimetics), 저분자 화합물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 탐지자는 D-펩타이드, L-펩타이드, 고리형 펩타이드, 스테이플 된 펩타이드(stapled peptide), 펩토이드, 고리형 펩토이드, 폴다머, 트리아진 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 피롤로피리미딘 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 벤즈이미다졸 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 제2 화합물은 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열의 양 말단에 프라이머(primer)를 포함할 수 있다.
상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 중량 평균 분자량은 약 1,000 내지 10,000 Da 일 수 있다.
상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜은 치환 또는 비치환된 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.
상기 제1 화합물의 몰수(n1)와 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 비(n1:n2)는 3:1 내지 1,000:1일 수 있다.
상기 나노구조체가 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함할 경우,
상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 몰수(n3)의 비(n3/w)는 평균 100 μmol/g 이상일 수 있다.
상기 나노구조체가 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우,
상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1)의 비(n1/w)는 60 μmol/g 이하 일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서는 상기 나노구조체를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 바이오센서에 생물학적 물질을 처리하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 생물학적 물질은 표지 물질(label)로 표지되고,
상기 표지 물질은 바이오틴, 아비딘(avidin),　히스태그(histag), Ni-NTA, N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinmide), 아민(amine), 티올(thiol), 히스티딘(histidine), 포스핀(phosphine), 알데히드 태그(aldehyde tag), 히드라지드 태그(hydrazide tag), 할라이드(halide), 알카인(alkyne), 아자이드(azide),　할로태그(Halotag), 벤질구아닌(benzylguanin),　스냅태그(sanp tag), 벤질시토신(benzylcytosine),　클립 태그(CLIP-tag),　플래그 태그(Flag-tag),　말레이미드(maleiimide), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 상기 생물학적 물질과 반응한 상기 바이오센서 내 나노구조체를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체를 선별하는 단계는
상기 생물학적 물질과 결합하는 물질로 코팅된 용기를 준비하는 단계, 및
상기 용기에 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체를 부착시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체로부터 상기 생물학적 물질과 반응한 화합물을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체로부터 상기 생물학적 물질과 반응한 화합물을 확인하는 단계는
상기 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체의 상기 제2 화합물의 DNA 서열을 증폭하는 단계, 및
상기 증폭된 DNA 서열을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 구현예에 따른 나노구조체 또는 바이오센서는 생물학적 물질과 결합하는 화합물을 저비용 및 고효율로 확인하여 신약 후보 물질을 발굴할 수 있고, 이에 따라 신약 개발 기간, 및 개발 비용을 줄일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노구조체를 포함하는 바이오센서를 이용하여 생물학적 물질을 스크리닝하는 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 제조예 1에서 제조된 나노구조체 1을 대표적으로 도시한 것이다.
도 3 내지 6은, 각각 제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1에서 제조된 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 3 회 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7 내지 9는, 각각 제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1에서 제조된 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1의 0 시간, 6 시간, 및 16 시간 후 응집 여부를 보여주는 사진이다.
도 10은 실시예 1에 따른 Stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 1에 따른 Stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 제2 화합물을 개략적으로 도시한 것이다.
도 12는 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 13의 (a), 및 (b)는 메탄올/물 1:1 용액에 분산된 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체를 TEM으로 관찰한 사진이다.
도 14는 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체들의 0.05% Tween-20용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF)에서의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 2회씩 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 16는 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 17의 (a), 및 (b)는 메탄올/물 1:1 용액에 분산된 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체를 TEM으로 관찰한 사진이다.
도 18은 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체들의 Tris-HCl 버퍼 식염수에서의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 3회씩 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 19는 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 제2 화합물을 개략적으로 도시한 것이다.
도 21은 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 22의 (a), 및 (b)는 메탄올/물 1:1 용액에 분산된 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체를 TEM으로 촬영한 사진이다.
도 23은 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체들의 0.05% Tween-20용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF)에서의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 3회씩 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 24(a), 및 (b)는 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리에 LRH-1을 스크리닝하여 선별된 상위 30 개의 DNA 서열을 기재한 것이고,
도 24(c), 및 (d)는 도 24(a), 및 (b)에서 선별된 DNA 서열로부터 LRH-1 단백질과 결합한 펩타이드(Hit-stapled 펩타이드)의 서열을 해독한 것이다.
도 25는 stapled 펩타이드의 농도에 따른 LRH-1과 stapled 펩타이드가 결합한 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 26은 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리에 PTP1B를 스크리닝하여 선별된 상위 10개의 DNA 서열을 기재한 것이다.
도 27(a)는 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리에 Bcl-xL을 스크리닝하여 선별된 상위 10개의 DNA 서열을 기재한 것이고,
도 27(b)는 상기 선별된 DNA 서열로부터 Bcl-xL 단백질과 결합한 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체(Hit-트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체)의 서열을 해독한 것이다.
도 28은 Bcl-xL의 농도에 따른 Hit 1 내지 3의 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체에 표지된 fluorescein의 형광 편광값 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 구현예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소, 또는 단계는 하나 이상의 다른 구성요소, 또는 단계의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 특별한 정의가 없는 한, '치환된'이란, 화합물 중의 수소 원자가 중수소, 할로겐 원자(F, Br, Cl, 또는 I), 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아지도기, 아미디노기, 히드라지노기, 히드라조노기, 카르보닐기, 카르바밀기, 티올기, 에스테르기, 카르복실기나 그의 염, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염, C1 내지 C30 알킬기, C2 내지 C30 알케닐기, C2 내지 C30 알키닐기, C6 내지 C30 아릴기, C7 내지 C30 아릴알킬기, C1 내지 C30 알콕시기, C1 내지 C20 헤테로알킬기, C3 내지 C20 헤테로아릴알킬기, C3 내지 C30 사이클로알킬기, C3 내지 C15의 사이클로알케닐기, C6 내지 C15 사이클로알키닐기, C2 내지 C30 헤테로고리기 및 이들의 조합에서 선택된 치환기로 치환된 것을 의미한다.
또한 상기 치환된 할로겐 원자(F, Br, Cl, 또는 I), 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아지도기, 아미디노기, 히드라지노기, 히드라조노기, 카르보닐기, 카르바밀기, 티올기, 에스테르기, 카르복실기나 그의 염, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염, C1 내지 C30 알킬기, C2 내지 C30 알케닐기, C2 내지 C30 알키닐기, C6 내지 C30 아릴기, C7 내지 C30 아릴알킬기, C1 내지 C30 알콕시기, C1 내지 C20 헤테로알킬기, C3 내지 C20 헤테로아릴알킬기, C3 내지 C30 사이클로알킬기, C3 내지 C15의 사이클로알케닐기, C6 내지 C15 사이클로알키닐기, C2 내지 C30 헤테로고리기 중 인접한 두 개의 치환기가 융합되어 고리를 형성할 수도 있다. 예를 들어, 상기 치환된 C6 내지 C30 아릴기는 인접한 또 다른 치환된 C6 내지 C30 아릴기와 융합되어 치환 또는 비치환된 플루오렌 고리를 형성할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 별도의 정의가 없는 한, '헤테로'란, N, O, S, Se 및 P에서 선택된 헤테로 원자를 1개 내지 3개 함유한 것을 의미한다.
본 명세서에서, 평균(average)은 평균값(mean), 최빈값(mode) 또는 중앙값(median) 일 수 있다.
본 명세서에서, 입자의 크기는 동적 광산란 방법, 및/또는 전자 현미경 분석(예컨대, TEM 또는 SEM)으로부터 얻어지는 2차원 이미지를 상용화된 이미지 분석 프로그램(예컨대, image J)으로 분석하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 중합체는 올리고머(oligomer), 중합체(polymer), 또는 이 둘을 모두 포함하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 화합물은 화학적 모이어티를 포함하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 저분자 화합물(small molecule)은 900 Da 이하의 유기 화합물로서, 단백질이나 핵산과 같은　생체고분자에 결합하여 생체 고분자의 기능을 조절하는　화합물을 의미할 수 있다. 예를 들어, 저분자 화합물은 세포 신호 물질일 수 있다.
본 명세서에서 “빌딩블록”은 조합 화학적 방법으로 합성될 수 있는 화합물의 화학적 구조단위로서, 다른 화학적 구조단위에 연결될 수 있거나, 연결되어 있다. 예컨대, 조합 화학적 방법으로 합성된 중합체 또는 올리고머의 빌딩블록은 그 중합체 또는 올리고머를 합성하는데 사용한 모노머로부터 유래한 구조 단위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서, “개시 올리고뉴클레오티드”는 올리고뉴클레오티드의 라이브러리 합성을 위한 출발 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 개시 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 천연 염기, 비천연 염기, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, “링커”는 나노입자에 제1 화합물, 제2 화합물, 또는 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 연결시키는 분자를 의미한다.
본 명세서에서, “탐지자”는 표적물질과 반응할 가능성이 있는 화합물을 의미한다.
본 명세서에서, “탐지자를 암호화하는 DNA 서열”은, 탐지자를 구성하는 빌딩 블록의 종류, 개수, 및 순서를 코딩하는 DNA 태그를 의미한다.
본 명세서에서, “라이브러리”는 각기 다른 화합물, 또는 그의 단편의 조합을 의미한다.
본 명세서에서, “Hit”는 표적 물질과 반응한 것, 예를 들어, 표적물질과 결합한 것일 수 있다. 예를 들어, “Hit-나노구조체”는 표적물질과 결합한 나노구조체를 의미할 수 있다. 또한, “Hit-화합물”은 표적물질과 결합한 화합물, 또는 표적물질과 결합한 화합물 내 표적물질과 반응하는 탐지자를 의미할 수 있다.
본 명세서에서, “스크리닝”은 라이브러리　내 표적 물질과 반응하는 구조체(Hit-나노구조체)를 선별하여, 표적물질과 반응한 탐지자(Hit-화합물)를 확인하는 작업을 의미한다.
액상(Liquid phase)에서 DNA-암호화 라이브러리를 구축할 경우, 합성 가능한 탐지자의 종류가 매우 제한적이다. DNA는 유기용매상에 대한 용해도가 매우 낮기 때문에 라이브러리 합성시 반드시 물이 들어간 조건에서 합성해야 하는 반면, 대부분의 유기반응은 유기용매상에서 일어난다. 따라서 사용 가능한 반응의 종류가 매우 제한적이고, 구축 가능한 탐지자의 구조적 다양성도 낮아진다. 또한 각 반응 단계마다 과량의 DNA 태그나 반응물을 제거하기 위해서는 반복적인 정제 과정이 필수적이다. 주로 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)와 동결 건조의 복잡한 분리 및/또는 정제 과정이 요구되기 때문에 비용 및 시간이 많이 소요된다.
이에, 다양한 종류의 탐지자를 갖는 라이브러리를 구축하고, 분리, 및/또는 정제 과정을 단순화하기 위해서는, 고체 상(Solid Phase)에서 DNA-암호화 라이브러리를 구축하는 것이 유리하다.
본 발명의 일구현예에 따른 나노구조체는,
나노입자,
탐지자(probe)를 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제1 화합물,
상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제2 화합물, 및
선택적으로 상기 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함할 수 있다.
상기 나노구조체는, 용매의 제한 없이, 종래 방법으로는 불가능한 다양한 종류의 탐지자를 갖는 고체 상(Solid Phase) DNA-암호화 라이브러리를 구축할 수 있다. 또한, 과량의 반응물, 용매, 및 효소 등으로부터 원심분리, 또는 자석을 활용하는 등의 단순한 방법으로 상기 나노구조체를 분리, 및/또는 정제할 수 있는 바, split-and-pool 방법으로 용이하게 거대한 DNA-암호화 라이브러리를 구축할 수 있다.
상기 나노입자는 나노 수준의 입자 크기를 갖는 2차원 또는 3차원 형태의 입자일 수 있으며, 유기 중합체 나노입자, 무기 나노입자, 유무기 복합 나노입자, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 유기 중합체 나노입자는 유기 중합체로 이루어지거나, 유기 중합체를 주성분으로 포함할 수 있고, 상기 유기 중합체는 단일중합체 및/또는 공중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 유기 중합체는 단일 중합체, 블록공중합체, 랜덤공중합체, 교호 공중합체, 가교 공중합체 가지 공중합체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
예를 들어, 상기 유기 중합체는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌, 치환 또는 비치환된 폴리에틸렌글리콜, 치환 또는 비치환된 폴리아마이드, 치환 또는 비치환된 폴리아크릴아마이드, 치환 또는 비치환된 폴리에스테르, 치환 또는 비치환된 폴리우레탄, 치환 또는 비치환된 폴리카보네이트, 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌, 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
구체적으로, 상기 유기 중합체는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌, 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트(poly-glycidyl methacrylate), 치환 또는 비치환된 폴리에틸렌글리콜-폴리스티렌 공중합체, 치환 또는 비치환된 폴리에틸렌글리콜-폴리아크릴아마이드 공중합체, 치환 또는 비치환된 폴리스티렌-폴리글리시딜메타크릴레이트 공중합체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 유기 중합체 나노입자는 Tentagel (Rapp-Polymere 社), Dynabead (Invitrogen 社), AccuNanoBead (Bionner 社), FG-beads (Tamagawa Seiki 社), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 무기 나노입자는 무기물로 이루어지거나, 무기물을 주성분으로 포함할 수 있다. 상기 무기 나노입자는 하나의 원소로 이루어진 화합물이거나, 이원소 화합물, 삼원소 화합물, 또는 사원소 화합물로 이루어질 수도 있으며, 2 원소 이상의 화합물로 이루어지는 경우, 이들은 각각 균일한 농도로 나노입자 내에 존재하거나, 또는 농도 분포가 부분적으로 다른 상태로 나누어져 동일 나노입자 내에 존재하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 무기 나노입자는 코어-쉘 구조를 가질 수도 있으며, 코어와 쉘의 계면은 쉘에 존재하는 원소의 농도가 중심으로 갈수록 낮아지는 농도 구배(gradient)를 가질 수 있다.
상기 무기물은 금속, 비금속, 준금속, 반도체, 이들의 산화물, 이들의 합금, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 무기물은 금, 은, 구리, 백금, 철, 코발트, 망간, 아연, 바륨, 니켈, 알루미늄, 인듐, 티타늄, 텔루륨, 셀레늄, 규소, 인, 황, 이들의 산화물, 이들의 합금, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 무기물은 자성체일 수 있고, 상기 자성체는 철(Fe), 코발트(Co), 철 산화물, 코발트 산화물, 망간 산화물, 아연 산화물, 또는 이들의 합금, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 상기 자성체는 철, 및/또는 아연의 산화물일 수 있다. 이에 따라, 자기장을 이용하여, 상기 나노입자를 포함하는 나노구조체, 및 상기 나노구조체와 결합하고 있는 화합물들을 용이하게 정제, 및/또는 분리할 수 있다.
예를 들어, 상기 무기물은 페라이트를 포함할 수 있고, 예를 들어, 실리카로 코팅된 페라이트일 수 있다. 여기서, 페라이트는 소량의 바륨, 망간, 니켈 및/또는 아연과 혼합된 다량의 철(III) 산화물을 포함하는 세라믹 물질일 수 있으며, soft 페라이트와 hard 페라이트를 포함한다.
상기 유무기 나노입자는 유기물과 무기물을 모두 포함하는 것일 수 있고, 예컨대, 상기 유기물, 및 무기물이 나노입자 내에 균일하게 혼합되어 존재하거나, 또는 농도 분포가 부분적으로 다른 상태로 나누어져 동일 나노입자 내에 불균일하게 존재하는 것일 수 있다. 또한, 상기 유무기 나노입자는, 예컨대, 코어-쉘 형태일 수 있으며, 코어와 쉘의 계면은 쉘에 존재하는 원소의 농도가 중심으로 갈수록 낮아지는 농도 구배(gradient)를 가질 수 있다. 여기서, 유기물은 유기 중합체를 포함할 수 있고, 상기 유기 중합체, 및 상기 무기물은 각각 전술한 바와 같다.
일 예로, 상기 나노입자는 코어-쉘 형태일 수 있다. 상기 코어는 페라이트를 선택적으로 포함하는 유기중합체일 수 있고, 상기 쉘은 유기 중합체, 또는 무기물일 수 있다. 여기서, 페라이트, 유무기 나노입자, 유기 중합체, 및 무기물은 상술한 바와 같다.
예를 들어, 상기 코어는 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌, 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트, 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌-폴리글리시딜메타크릴레이트 공중합체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고,
예를 들어, 상기 쉘은 실리카, 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트, 치환 또는 비치환된 폴리에틸렌글리콜, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
수 마이크로 수준의 입자 크기를 갖는 유기 중합체 비드 상에서 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 합성할 경우, 유기 중합체 비드 내부에도 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열이 합성될 가능성이 있다. 그러나, DNA 서열을 합성하는 데 사용되는 연결효소(ligase)가 상기 유기 중합체 비드 내부로는 접근하기 어려우므로 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열이 불균일하고 부정확하다. 일 실시예에 따라 상기 나노입자가 코어-쉘 형태를 가질 경우, 나노입자의 표면에서만 반응이 일어날 수 있다. 이에 따라, 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열이 균일할 수 있고, 스크리닝 시 DNA 서열 분석의 정확성도 향상될 수 있다. 또한, 생물학적 물질과 강하게 결합하는 Hit-화합물을 선별할 수 있다. 상기 생물학적 물질은 표적 물질(target)일 수 있으며, 상기 생물학적 물질과 관련된 설명은 후술하기로 한다.
상기 나노입자의 크기는 10 nm 내지 1000 nm, 예를 들어, 20nm 내지 800nn, 예를 들어, 40nm 내지 700nm, 예를 들어, 60nm 내지 600nm, 예를 들어, 80nm 내지 500nm, 예를 들어, 90nm 내지 400nm, 100 nm 내지 300 nm, 예를 들어, 150nm 내지 250nm, 예를 들어, 170nm 내지 230nm, 예를 들어, 190nm 내지 210nm 일 수 있다. 나노입자가 구형의 나노입자인 경우, 나노입자의 크기는 구형 나노 입자의 입경을 의미한다. 여기서, 구형은 완전한 구형이 아니어도 되며, 이 때 나노입자의 크기는 입경 중 가장 큰 입경을 의미할 수 있다. 나노입자가 코어-쉘 형태의 나노입자일 경우, 나노입자의 크기는 코어와 쉘을 포함한 전체 나노입자의 입경을 의미한다.
나노입자가 상술한 범위의 크기를 가짐으로써, 마이크로미터 수준의 크기를 갖는 폴리머 비드를 사용하는 경우에 비해 부피가 감소하므로, 수조 개 이상의 초거대 라이브러리를 구축할 수 있다. 또한, 마이크로미터 수준의 유기 중합체 비드를 사용하는 경우에 비해, 생물학적 물질이 유기 중합체 비드 내부에 물리적으로 갇힌 것에 불과한 나노구조체를 Hit-나노구조체로 선별하는 거짓 양성(false positive) 반응도 줄일 수 있다.
상술한 바와 같이, 일 실시예에 따른 나노구조체에서 제1 화합물 및 제2 화합물은 나노입자의 표면에만 존재할 수 있다. 이에 따라, DNA의 낮은 용해도와 상관없이 대부분의 용매와 양립 가능하여 고농도로 합성할 수 있으므로, 라이브러리 구축에 소요되는 시간을 단축할 수 있으며, 현재 기술로는 불가능한 유기용매에서의 반응이 가능해져 매우 다양한 종류의 라이브러리 구축이 가능할 수 있다. 또한, 표면에서만 반응이 일어나므로, 제2 화합물을 합성하기 위한 연결효소(ligase)가 균일하게 접근할 수 있어, DNA 서열이 균일하게 합성될 수 있고, 스크리닝 후 Hit-화합물의 구조 분석의 정확성을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에 따른 나노구조체는 하나의 나노입자 당 1 종의 상기 탐지자를 포함하는 제1 화합물과, 1 종의 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 화합물을 포함할 수 있다. 1 종의 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열은 1 종의 탐지자만을 암호화한다. 이에 따라, 생물학적 물질에 대한 결합력-기반 스크리닝 시, 생물학적 물질과 결합한 Hit-나노구조체의 DNA 서열을 분석함으로써 Hit-화합물의 구조를 확인할 수 있다.
상기 제1 화합물은 적어도 두 개의 말단을 가지고, 그 중 한 말단은 상기 나노입자의 표면에 결합될 수 있다. 이에 따라, 나노입자의 표면에서만 제1 화합물과 생물학적 물질이 서로 반응하여 결합할 수 있고, 예를 들어, 제1 화합물의 탐지자와 생물학적 물질이 반응하여 결합할 수 있다. 이에, 상술한 나노구조체를 사용하여 결합력-기반 스크리닝 시, 나노입자 내부에 생물학적 물질이 갇혀 나타나는 거짓 양성(false positive) 반응을 억제할 수 있다.
상기 탐지자는 임의의 유기 분자, 또는 무기분자일 수 있으며, 예를 들어, 수소 결합 가능성, 용해도, 결합의 회전 자유도, 양전하, 음전하 등 특성을 기반으로 하여 생물학적 물질과 결합 가능하도록 디자인될 수 있다.
상기 탐지자는 1종 이상의 제1 빌딩 블록(building block)이 중합되어 형성될 수 있고, 예를 들어, 고체상에서 중합되어 형성될 수 있다.
상기 제1 빌딩블록은, 예컨대, 아미노산, 또는 이들의 유사체; N-알킬화된 글리신(N-alkylated glycine); 치환 또는 비치환된 아민, 치환 또는 비치환된 트리아진, 및 치환 또는 비치환된 트리아진의 조합; 또는 이들의 조합일 수 있다. 여기서, 상기 아미노산은 천연 아미노산, 및 비천연 아미노산을 포함하는 의미이며, L-형태, 및/또는 D-형태일 수 있다.
일 예로, 상기 아미노산은 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 아스파라진(Asn), 아스파르트산(Asp), 시스테인(Cys), 글루탐산(Glu), 글루타민(Gln), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 히드록시프롤린(Hyp), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 라이신(Lys), 메티오닌(Met) 페닐알라닌(Phe), 프롤린(Pro), 피로글루탐산(Glp), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 발린(Val), 또는
노르류신(Nle), 사이클로헥실알라닌(Cha), 1-나프틸알라닌(Nap), 4-클로로페닐알라닌(PheCl), 4-플루오로페닐알라닌(PheF), 4-니트로페닐알라닌(PheNO2), 호모페닐알라닌(hPhe), 호모아르기닌(hArg), 2-아미노 이소 부티르산(Aib) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 아미노산의 유사체는 상술한 각각의 아미노산이 고체상에서 중합될 수 있도록 보호기로 캐핑된 것일 수 있고, 예컨대, Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl) 보호기, Nosyl(Nitrobenzensulfonyl), Trt (Trityl), Dde(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxacyclohexylidene)ethyl), Alloc(allyloxycarbonyl), Mmt(Monomethoxytrityl), azide, 또는 이들의 조합으로 보호된 것일 수 있다. 상기 보호기는 상기 아미노산의 N-말단에 치환 또는 캐핑될 수 있다.
구체적으로, 상기 아미노산의 유사체는 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Hyp-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Glp-OH, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Val-OH, 또는
Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Nap-OH, Fmoc-PheCl-OH, Fmoc-PheF-OH, Fmoc-PheNO2-OH, Fmoc-hPhe-OH, Fmoc-hArg-OH, Fmoc-Aib-OH 등일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일 예로, 상기 N-알킬화된 글리신은 1차 아민 화합물과 할로카복시산의 반응에 의해 형성될 수 있다.
상기 1차 아민 화합물은 하기 화학식 1로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
R1-(CH2)n-NH2
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, 중수소, 할로겐, 알콕시기, 하이드록시기, 카르복시기, 아미노기, 니트로기, 아자이드기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C20 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20 헤테로사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C20 아릴기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합이고,
n은 1 이상의 정수이다.
예를 들어, 상기 R1은 수소, 알콕시기, 하이드록시기, 카르복시기, 아미노기, 니트로기, 아자이드기, 선형 또는 분지형의 C1 내지 C10 알킬기, C1 내지 C10 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C10 아릴기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C10 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C10 헤테로사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C10 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합일 수 있고, 이에 한정되지는 않는다.
일 예로, 상기 치환 또는 비치환된 C6 내지 C10 아릴기는 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는 치환 또는 비치환된 나프틸기일 수 있고, 상기 치환 또는 비치환된 C3 내지 C10 사이클로알킬기는 치환 또는 비치환된 사이클로헥실기일 수 있고, 상기 치환 또는 비치환된 C3 내지 C10 헤테로사이클로알킬기는 치환 또는 비치환된 락탐기일 수 있고, 상기 C1 내지 C10 알콕시기는 치환 또는 비치환된 메톡시기, 치환 또는 비치환된 에톡시기, 치환 또는 비치환된 프로폭시기, 또는 이들의 조합일 수 있고, 상기 치환 또는 비치환된 C2 내지 C10 헤테로아릴기는 치환 또는 비치환된 퓨라닐기, 또는 치환 또는 비치환된 피리디닐기일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일 예로, 상기 1차 아민 화합물은 하기 그룹 1-1, 및/또는 그룹 1-2에서 선택될 수 있다.
[그룹 1-1]
Figure pat00001
[그룹 1-2]
Figure pat00002
일 예로, 상기 N-알킬화된 글리신은 하기 화학식 2로 표현될 수 있고, 하기 화학식 2에서, R1은 상기 1차 아민 화합물에서 유래된 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00003
상기 화학식 2에서, R1, 및 n은 각각 상기 화학식 1의 R1, 및 n과 동일하다.
일 예로, 상기 할로카복시산은 할로아세트산(haloactic acid), 할로프로피온산(halopropionic acid), 할로부티르산(halobutyric acid), 할로발레르산(halovaleric acid), 또는 이들의 조합일 수 있다. 구체적으로, 상기 할로카복시산은 클로로아세트산, 브로모아세트산, 클로로프로피온산, 브로모프로피온산, 클로로부티르산, 브로모부티르산, 클로로발레르산, 브로모발레르산, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 치환 또는 비치환된 아민은 치환된 아민일 수 있고, 상기 치환기는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30 사이클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30 아릴기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C30 헤테로고리기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 여기서, 상기 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬기는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 선형 알킬기, 및 치환 또는 비치환된 C3 내지 C20 분지형 알킬기일 수 있고, 상기 치환 또는 비치환된 C3 내지 C20 분지형 알킬기는 치환 또는 비치환된 C3 내지 C20 iso-알킬기, 치환 또는 비치환된 C4 내지 C20 sec-알킬기, 치환 또는 비치환된 C4 내지 C20 tert-알킬기, 및 치환 또는 비치환된 C5 내지 C20 neo-알킬기일 수 있다.
구체적으로, 상기 치환 또는 비치환된 아민은 치환 또는 비치환된 메틸기, 치환 또는 비치환된 에틸기. 치환 또는 비치환된 n-프로필기, 치환 또는 비치환된 iso-프로필기, 치환 또는 비치환된 n-부틸기, 치환 또는 비치환된 iso-부틸기, 치환 또는 비치환된 sec-부틸기, 치환 또는 비치환된 tert-부틸기, 치환 또는 비치환된 n-펜틸기, 치환 또는 비치환된 iso-펜틸기, 치환 또는 비치환된 sec-펜틸기, 치환 또는 비치환된 tert-펜틸기, 치환 또는 비치환된 neo-펜틸기, 치환 또는 비치환된 사이클로프로필기, 치환 또는 비치환된 사이클로부틸기, 치환 또는 비치환된 사이클로펜틸기, 치환 또는 비치환된 사이클로헥실기, 치환 또는 비치환된 사이클로헵틸기,
치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 나프틸기, 치환 또는 비치환된 바이페닐기, 치환 또는 비치환된 페난트레닐기, 치환 또는 비치환된 안트라세닐기, 치환 또는 비치환된 파이레닐기,
치환 또는 비치환된 피롤로기, 치환 또는 비치환된 피롤리디닐기, 치환 또는 비치환된 이미다졸릴기, 치환 또는 비치환된 피라졸릴기, 치환 또는 비치환된 트리아졸릴기, 치환 또는 비치환된 피페리디닐기, 치환 또는 비치환된 피페라지닐기, 치환 또는 비치환된 피리딜기, 치환 또는 비치환된 피리미딜기, 치환 또는 비치환된 피리다지닐기, 치환 또는 비치환된 피라지닐기, 치환 또는 비치환된 모폴리닐기, 치환 또는 비치환된 베타락탐기, 치환 또는 비치환된 감마락탐기, 치환 또는 비치환된 델타락탐기, 치환 또는 비치환된 퓨라닐기, 치환 또는 비치환된 피라닐기, 치환 또는 비치환된 싸이오페닐기, 치환 또는 비치환된 테트라하이드로싸이오페닐기, 치환 또는 비치환된 인돌로기, 치환 또는 비치환된 벤조퓨라닐기, 치환 또는 비치환된 벤조싸이오페닐기, 또는 이들의 조합으로 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 치환 또는 비치환된 아민은 하기 그룹 2 또는 하기 그룹 3에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[그룹 2]
Figure pat00004
[그룹 3]
Figure pat00005
일 예로, 상기 치환 또는 비치환된 트리아진은 적어도 하나의 할로겐기, 치환 또는 비치환된 아미노기, 또는 이들의 조합으로 치환될 수 있다.
일 예로, 상기 치환 또는 비치환된 트리아진은 적어도 두 개의 할로겐기로 치환될 수 있고, 적어도 하나의 치환 또는 비치환된 아미노기로 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 치환 또는 비치환된 아미노기는 치환된 아미노기일 수 있고, 여기서 치환기는 치환 또는 비치환된 아민에서 설명한 치환기의 정의와 같을 수 있다.
구체적으로, 상기 치환 또는 비치환된 트리아진은 하기 그룹 4에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[그룹 4]
Figure pat00006
일 예로, 상기 치환 또는 비치환된 피페라진은 적어도 하나의 치환 또는 비치환된 알킬기로 치환될 수 있다. 여기서, 상기 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬기는 치환된 알킬기일 수 있고, 여기서 치환기는 치환 또는 비치환된 아민에서 설명한 치환기의 정의와 같을 수 있다.
구체적으로, 상기 치환 또는 비치환된 피페라진은 하기 그룹 5에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[그룹 5]
Figure pat00007
상기 탐지자는 생물학적 물질, 예를 들어, 표적 물질과 반응할 가능성이 있는 화합물이면 한정되지는 않으며, 바람직하게는 생물학적 물질과 결합할 가능성이 있는 화합물이면 한정되지는 않는다.
일 예로, 상기 탐지자는 펩타이드, 펩타이드 유사체(peptide mimetics), 저분자 화합물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
여기서, 상기 저분자 화합물은 적어도 하나의 질소원자를 포함하는 헤테로 방향족 고리 모이어티를 포함할 수 있고, 예컨대, 치환 또는 비치환된 피롤 모이어티, 치환 또는 비치환된 이미다졸 모이어티, 치환 또는 비치환된 피라졸 모이어티, 치환 또는 비치환된 트리아졸 모이어티, 치환 또는 비치환된 피리딘 모이어티, 치환 또는 비치환된 피리미딘 모이어티, 치환 또는 비치환된 피리다진 모이어티, 치환 또는 비치환된 피라진 모이어티, 치환 또는 비치환된 인돌 모이어티, 치환 또는 비치환된 퀴놀린 모이어티, 치환 또는 비치환된 이소퀴놀린 모이어티, 치환 또는 비치환된 카바졸 모이어티, 치환 또는 비치환된 인다졸 모이어티, 치환 또는 비치환된 벤즈이미다졸 모이어티, 치환 또는 비치환된 퓨린 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 저분자 화합물은 알파-헬릭스 유사체일 수 있다.
일 예로, 상기 탐지자는 D-펩타이드, L-펩타이드, 고리형 펩타이드, 스테이플 된 펩타이드(stapled peptide), 펩토이드, 고리형 펩토이드, 폴다머, 트리아진 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 피롤로피리미딘 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 벤즈이미다졸 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 트리아진 모이어티를 포함하는 저분자 화합물은 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체일 수 있다. 예를 들어, 상기 Stapled 펩타이드는 펩타이드 유사체로서, 같은 위상의 아미노산(ex, I, 및 i+4; 또는 I, 및 i+7)이 공유결합으로 연결되어 안정된 알파-헬릭스 구조를 이룰 수 있다.
상기 D-펩타이드, L-펩타이드, 및 스테이플드 펩타이드(stapled peptide)는 1종 이상의 상술한 아미노산, 또는 이들의 유사체가 중합되어 형성된 것일 수 있다. 상기 stapled 펩타이드는 천연 펩타이드에 비해 우수한 결합력, 세포 투과성, 및 단백질분해 안정성 등을 가질 수 있다.
상기 펩토이드는 펩타이드 유사체로서, 구체적으로, 선형 펩토이드, 고리형 펩토이드(cyclic peptoids), 또는 이중고리형 펩토이드(bicyclic peptoids)일 수 있다. 상기 펩토이드는 1종 이상의 상술한 N-알킬화된 글리신이 중합되어 형성된 것일 수 있다. 상기 펩토이드는 천연 펩타이드에 비해, 우수한 세포투과성, 및 단백질 분해 효소에 대한 안정성 등을 가질 수 있다.
상기 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체는 저분자량의 알파-헬릭스 모방체로서, 알파-헬릭스 상의 i, i+3(또는 4), i+7 아미노산 잔기의 위치를 모방할 수 있다. 상기 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체는 상술한 치환 또는 비치환된 아민, 치환 또는 비치환된 트리아진, 및 치환 또는 비치환된 피페라진의 반응에 의해 형성된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체는 하기 화학식 3으로 표현될 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00008
상기 화학식 3에서, R2는 상술한 그룹 2에서 유래된 1가의 기일 수 있고, R3, 및 R5는 각각 독립적으로 상기 그룹 4에서 유래된 1가의 기일 수 있고, R4는 상기 그룹 5에서 유래된 1가의 기일 수 있고, R6는 상기 그룹 3에서 유래된 1가의 기일 수 있다.
일 예로, 하나의 나노입자 표면에 복수 개의 제2 화합물이 결합되어 있을 수 있다. 하나의 탐지자와 하나의 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열이 결합된 구조체를 포함하는 라이브러리로 스크리닝하는 종래의 방법에서는, 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열이 쉽게 분리되어 Hit-화합물이 정확하게 분석되지 않는다. 예컨대, 종래의 하나의 탐지자와 하나의 상기 탐지자를 암호화하는 서열이 결합된 구조체를 포함하는 DNA-암호화 라이브러리로 스크리닝 시, 수만-수십만 개의 Hit-구조체가 얻어지더라도, 최종적으로 분석된 DNA 암호화 서열의 개수는 수 개에서 수백 개 정도에 불과하다. 반면, 일 구현예에 따른 나노구조체는 하나의 나노입자 표면에 복수 개의 제2 화합물이 결합되어 있으므로, 그 중 일부의 제2 화합물이 분리되더라도, Hit-화합물의 구조를 분석할 수 있다.
또한, 나노입자 하나 당 복수 개의 제2 화합물을 가짐에 따라, 증폭된 DNA 서열의 개수가 매우 많으므로, 복잡한 분석작업 없이 DNA 서열 중 가장 많은 수를 갖는 최상위의 서열을 선택하여, 스크리닝 후 재합성 및 활성을 확인할 Hit-화합물들을 용이하게 골라낼 수가 있다. 이에 따라, 스크리닝으로 선별된 Hit-화합물의 검증에 들어가는 비용과 시간을 크게 절약할 수 있고, 분석의 정확성을 극대화할 수 있다.
일 예로, 상기 제2 화합물은 적어도 2 개의 말단을 가지고, 그 중 한 말단은 상기 나노입자에 결합될 수 있다. 이에 따라, 후술하는 Hit-나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 증폭하는 단계에서, 중합효소가 용이하게 접근할 수 있으므로, 균일하게 DNA 서열이 증폭될 수 있고, Hit-화합물의 구조를 더욱 정확하게 분석할 수 있다.
상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열은 제2 빌딩블럭이 중합되어 형성될 수 있고, 바람직하게는 고체상에서 중합되어 형성될 수 있다. 상기 제2 빌딩블럭은 dsDNA(double strand DNA) 절편일 수 있으며, 1종의 상기 제2 빌딩블럭은 1종의 상술한 제1 빌딩블럭만을 암호화할 수 있다. 이에 따라, 생물학적 물질에 대한 스크리닝 시, 생물학적 물질과 반응한 Hit-나노구조체의 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 구성하는 제2 빌딩블럭의 종류, 개수, 및 순서를 분석함으로써, Hit-화합물을 구성하는 제1 빌딩블럭의 종류, 개수, 및 순서를 확인하여, Hit-화합물의 구조를 도출할 수 있다.
상기 제2 빌딩블럭은 효소에 의해 중합되어 상술한 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 합성할 수 있다. 상기 제2 빌딩블럭은 양 말단에 점착 말단을 갖는 dsDNA 절편일 수 있다. 상기 dsDNA 절편은 3 내지 15개, 예를 들어, 4 내지 13개, 예를 들어, 5 내지 11개, 또는 예를 들어, 6개 내지 10개 의 염기쌍을 가질 수 있고. 상기 점착 말단의 길이는 2 내지 5개일 수 있고, 예를 들어, 3개, 또는 4개일 수 있다. 종래, 유기합성적인 방법으로 뉴클레오타이드를 하나씩 합성하여 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 형성하는 방법에 비해, 효소를 이용하여 상기 범위의 dsDNA 절편을 합성하여 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 형성할 경우, 반복되는 반응, 정제, 및 분리 단계가 감소하므로, 수율, 및 순도가 증가할 수 있고, 거대한 라이브러리를 구축할 수 있다.
상기 dsDNA 절편은 복수의 데옥시뉴클레오사이드 삼인산(deoxynucleoside triphosphate, dNTP)을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 데옥시아데닌 삼인산 (ATP), 데옥시구아닌 삼인산 (GTP), 데옥시시토신 삼인산 (CTP), 또는 데옥시티미딘 삼인산 (TTP, deoxythymidine triphosphate)을 포함할 수 있다.
상기 제2 화합물은 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열의 양 말단에 각각 프라이머(primer)를 포함하는 것일 수 있다. 이들 양 말단에 있는 프라이머 중 제2 화합물이 나노입자와 연결되는 쪽 말단에 위치하는 프라이머의 말단에는 헤드피스를 더 포함할 수 있다. 상기 헤드피스는 나노입자와 결합할 수 있는 반응성 작용기를 포함할 수 있고, 상기 헤드피스는 개시 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
이에 따라, 제2 화합물의 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 증폭할 수 있고, 증폭된 DNA 서열을 분석하여 제2 화합물을 구성하는 제2 빌딩블록의 종류, 개수, 및 순서를 분석할 수 있다. 즉, 각각의 제2 빌딩 블록이 암호화하는 제1 빌딩블록의 종류, 개수, 및 순서를 바탕으로 제1 화합물의 구조를 확인하여 신약 후보물질을 선별할 수 있다.
상기 제1 화합물의 몰수(n1)는 상기 제 2 화합물의 몰수(n2)보다 많을 수 있고, 이에 따라, 후술하는 생물학적 물질이 제2 화합물(예를 들어, 상기 탐지자를 암호화 하는 DNA 서열)과 결합하여 나타나는 거짓 양성 반응을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 화합물의 몰수(n1)와 상기 제 2 화합물의 몰수(n2)의 비(n1:n2)는 1.5:1 내지 1,000:1일 수 있고, 예를 들어, 1.6:1 내지 500:1일 수 있고, 예를 들어, 1.6:1 내지 300:1일 수 있고, 예를 들어, 1.7:1 내지 200:1일 수 있고, 예를 들어, 1.7:1 내지 150:1일 수 있고, 예를 들어, 1.8:1 내지 100:1일 수 있고, 예를 들어, 1.8:1 내지 70:1일 수 있고, 예를 들어, 1.9:1 내지 50:1일 수 있고, 예를 들어, 1.9:1 내지 30:1일 수 있고, 예를 들어, 2:1 내지 20:1일 수 있고, 예를 들어, 2:1 내지 10:1일 수 있고, 예를 들어, 2:1 내지 5:1일 수 있고, 예를 들어, 2:1 내지 4:1일 수 있다.
상기 나노구조체가 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하거나, 또는 상기 나노구조체가 상기 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우, 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)는 평균 85 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 70 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 60 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 50 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 45 μmol/g 이하일 수 있다.
상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)의 하한은 한정되지는 않으나, 예를 들어, 평균 1.2 nmol/g 이상, 예를 들어, 10 nmol/g 이상, 예를 들어, 50 nmol/g 이상, 예를 들어, 100 nmol/g 이상, 예를 들어, 500 nmol/g 이상, 예를 들어, 1 μmol/g 이상, 예를 들어, 5 μmol/g 이상, 예를 들어, 10 μmol/g 이상, 예를 들어, 15 μmol/g 이상일 수 있다.
상기 나노구조체가 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함할 경우, 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜은 나노구조체 사이의 물리적인 거리를 증가시켜 줌으로써, 나노구조체의 안정성이 증가될 수 있다. 반면, 상기 나노구조체가 상기 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우, 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)를 상기 범위로 가짐으로써, 나노구조체 간의 인력이 감소하여 나노구조체의 안정성이 증가될 수 있다. 이에 따라, 나노 수준의 크기를 가지면서도, 비가역적이고 영구적인 응집 현상 없이, 상술한 나노구조체가 용매에 잘 분산될 수 있고, 스크리닝 시 거짓 양성 반응을 감소시켜 분석 결과의 신뢰성을 높일 수 있다.
상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 중량 평균 분자량은 예를 들어, 1,000 내지 10,000 Da, 예를 들어, 3,000 내지 7,000 Da, 예를 들어, 4,000 내지 6,000 Da, 또는 예를 들어, 4,500 내지 5,500 Da 일 수 있다. 상기 범위로 중량평균 분자량을 가짐에 따라, 나노구조체 간의 응집이 억제되면서도 제1 화합물과 제2 화합물의 합성, 및 나노구조체를 이용한 신약 후보물질 선별이 원활할 수 있다.
일 예로, 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜은 적어도 2개의 말단을 가지고, 그 중 한 말단은 상기 나노입자의 표면에 결합될 수 있고, 예를 들어, 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜은 하기 화학식 4로 표현될 수 있다.
[화학식 4]
Figure pat00009
상기 화학식 4에서, X' 및 Y'는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1 내지 C15 알킬렌기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30 아릴렌기 또는 이들의 조합이고,
Z'는 수소, C1 내지 C15 알킬기, C6 내지 C30 아릴기 또는 이들의 조합이고,
m' 및 n'은 각각 독립적으로 0 내지 5의 정수이며, m'+n'은 2=m'+n'=8의 범위를 만족하는 정수이고,
*는 나노입자와 연결되는 지점이다.
일 예로, X', 및 Y'은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기, 치환 또는 비치환된 에틸렌기, 치환 또는 비치환된 프로필렌기, 치환 또는 비치환된 부틸렌기, 치환 또는 비치환된 펜틸렌기, 치환 또는 비치환된 헥실렌기 또는 이들의 조합일 수 있고, 보다 구체적으로, X', 및 Y'는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기, 치환 또는 비치환된 에틸렌기, 치환 또는 비치환된 n-프로필렌기, 치환 또는 비치환된 n-부틸렌기, 치환 또는 비치환된 n-펜틸렌기 또는 치환 또는 비치환된 n-헥실렌기일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일 예로, Z'은 치환 또는 비치환된 메틸기, 치환 또는 비치환된 에틸기, 치환 또는 비치환된 프로필기, 치환 또는 비치환된 부틸기, 치환 또는 비치환된 펜틸기, 치환 또는 비치환된 헥실기 또는 이들의 조합일 수 있고, 보다 구체적으로, Z'은 치환 또는 비치환된 메틸기, 치환 또는 비치환된 에틸기, 치환 또는 비치환된 n-프로필기, 치환 또는 비치환된 n-부틸기, 치환 또는 비치환된 n-펜틸기 또는 치환 또는 비치환된 n-헥실기일 수 있다.
일 예로, X'과 Y'는 서로 같거나 다를 수 있고, m'과 n'는 서로 같거나 다를 수 있다.
일 예로, m' 및 n'은 각각 독립적으로 0 내지 3의 정수이며, 예를 들어, 0 내지 2의 정수일 수 있고, 예를 들어, m'는 2이고, n'는 0일 수 있다.
일 예로, m'및 n' 중 적어도 하나는 0일 수 있다.
일 예로, X', Y'는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 에틸렌기일 수 있고, Z'은 치환 또는 비치환된 메틸기일 수 있다.
일 예로, 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜은 치환 또는 비치환된 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 나노구조체가 상기 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함할 경우, 상기 나노입자 표면의 제1 화합물, 제2 화합물, 및 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 몰수의 합(n1+n2+n3)에 대한 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 몰수(n3)의 비(n3/(n1+n2+n3))가 0.3 이상일 수 있고, 예를 들어, 0.4 이상일 수 있고, 예를 들어, 0.5 이상일 수 있다.
일 예로, 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 몰수(n3)의 비(n3/w)는 평균 100 μmol/g 이상일 수 있고, 예를 들어, 평균 150 μmol/g 이상일 수 있고, 예를 들어, 평균 200 μmol/g 이상일 수 있고, 예를 들어, 평균 250 μmol/g 이상일 수 있고, 예를 들어, 평균 300 μmol/g 이상일 수 있고, 예를 들어, 평균 350 μmol/g 이상일 수 있다.
상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 몰수(n3)의 비(n3/w)의 상한은 한정되지는 않으나, 예를 들어, 평균 1,000 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 평균 900 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 평균 800 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 평균 700 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 평균 600 μmol/g 이하일 수 있다.
일 예로, 상기 나노구조체가 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우, 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1)의 비(n1/w)는 60 μmol/g 이하, 예를 들어, 55 μmol/g 이하, 예를 들어, 50 μmol/g 이하일 수 있고, 예를 들어, 1 내지 60 μmol/g, 예를 들어, 5 내지 55 μmol/g, 예를 들어, 10 내지 50 μmol/g 일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서는 상기 나노구조체를 포함하는 바이오센서를 제공한다. 상기 바이오센서는 생물학적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 사용한 결합력 기반의 장치일 수 있으며, 예컨대, 결합력-기반의 스크리닝용 라이브러리, 생물학적 물질의 존재를 분석할 수 있는 바이오 칩, 또는 이를 포함하는 키트일 수 있다.
이에 더하여, 상기 바이오센서는 상기 바이오센서를 지지하는 기판을 더 포함할 수 있다. 상기 기판은 투명하거나 또는 불투명할 수도 있고, 무기물질 또는 유기물질로 이루어질 수 있다. 상기 투명 기판으로는 유리, ITO(Indium Tin Oxide), 석영(quartz), 알루미나, 실리콘, 또는 탄소물질과 같은 무기물 기판, 또는 투명 폴리머로 이루어진 유기물 기판을 사용할 수 있다. 불투명 기판으로는 종이, 또는 불투명한 유리 또는 폴리머로 이루어진 기판을 사용할 수 있다. 상기 기판은 그 위에 지지되는 나노구조체를 구성하는 물질들과 특별한 화학반응을 일으키지 않으면서 상기 바이오센서를 잘 지지할 수 있는 형태라면 어떤 것이라도 사용할 수 있고, 상기에 예시한 것들로 제한되지 않는다.
또한, 상기 기판은 자성을 띠는 소재로 이루어지거나, 또는 그 내부 또는 하부에 자성을 띠는 물질을 포함하여도 좋다. 상기 기판이 자성을 띄는 물질을 포함하는 경우, 상기 기판과 상기 나노구조체는 자성을 통해 결합할 수 있다.
상기 바이오센서가 상기 나노구조체로만 이루어지는 경우, 상기 바이오센서는 상기 나노구조체를 포함하는 분말, 또는 용액 형태로 존재할 수 있다. 상기 바이오센서가 상기 기판을 더 포함하는 경우에는, 상기 바이오센서는 기판 상에 상기 나노구조체가 다양한 방법으로 지지된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 바이오센서를 이용하여, 생물학적 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 생물학적 물질은 효소, 항원, 항체, 단백질, 펩타이드, 탄화수소물질(carbohydrates), DNA, RNA, 및/또는 이들의 일부일 수 있다. 상기 생물학적 물질은, 예를 들어, 질병의 바이오마커일 수 있고, 상기 열거된 물질들로 제한되지 않는다. 상기 생물학적 물질은 특정 화합물과 결합되어 생물학적 활성이 변할 수 있으므로, 상기 생물학적 물질과 결합하는 화합물은 신약 후보물질이 될 수 있는 바, 상기 생물학적 물질과 결합하는 화합물을 발굴하는 것은 신약 개발에 있어 중요하다.
상기 생물학적 물질은 표지 물질(label)로 표지될 수 있고, 상기 표지 물질은 접착성 표지 물질일 수 있다. 상기 생물학적 물질이 표지 물질로 표지됨에 따라, 생물학적 물질에 대한 결합력-기반 스크리닝 시, 표지물질을 통해 Hit-나노구조체를 선별할 수 있다. 예컨대, 상기 표지물질로 표지된 생물학적 물질과 결합된 Hit-나노구조체는 용기에 접착될 수 있으므로, 이로부터 Hit-나노구조체를 선별할 수 있다. 여기서, 상기 용기 등은 상기 표지물질과 접착할 수 있는 물질이 코팅된 것일 수 있고, 용기의 형태는 기판, 튜브, 챔버 등 상기 나노구조체가 도포 및/또는 담지될 수 있는 것이면 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 표지 물질은 바이오틴, 아비딘(avidin),　히스태그(histag), Ni-NTA, N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinmide), 아민(amine), 티올(thiol), 히스티딘(histidine), 포스핀(phosphine), 알데히드 태그(aldehyde tag), 히드라지드 태그(hydrazide tag), 할라이드(halide), 알카인(alkyne), 아자이드(azide),　할로태그(Halotag), 벤질구아닌(benzylguanin),　스냅태그(sanp tag), 벤질시토신(benzylcytosine),　클립 태그(CLIP-tag),　플래그 태그(Flag-tag),　말레이미드(maleiimide), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 나노구조체를 포함하는 바이오센서를 이용하여 생물학적 물질을 스크리닝하는 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 1을 참조하면, 일 구현예에 따른 스크리닝 방법은 상기 바이오센서에 생물학적 물질을 처리하는 단계를 포함한다. 상기 바이오센서 내 나노구조체는 상기 생물학적 물질과 반응하거나 반응하지 않을 수 있고, 상기 나노구조체와 상기 생물학적 물질이 반응할 경우, 상기 나노구조체와 상기 생물학적 물질이 결합될 수 있다. 상기 나노구조체에서 상기 생물학적 물질과 반응한 반응 자리(reaction site)는 탐지자일 수 있다.
이후, 상기 스크리닝 방법은 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체(Hit-나노구조체)를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체(Hit-나노구조체)를 선별하는 단계는 상기 생물학적 물질에 표지된 표지 물질을 검지하여, Hit-나노구조체를 선별하는 단계일 수 있다.
상기 표지 물질이 접착성 표지 물질일 경우, 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체를 선별하는 단계는
상기 생물학적 물질과 결합하는 물질로 코팅된 용기를 준비하는 단계, 및
상기 생물학적 물질과 결합하는 물질로 코팅된 용기에 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체를 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표지물질이 바이오틴일 경우, 상기 용기는 스트렙타비딘으로 코팅된 것일 수 있다.
이에 따라, 나노구조체 중 Hit-나노구조체만 상기 용기의 면에 고정되는 바, 고효율로 신속하게 Hit-나노구조체를 선별할 수 있다. 이에, 대량 분석이 가능하므로, 누적된 결과를 통해 최적의 Hit-화합물을 선별할 수 있어 신약 후보 물질 스크리닝의 정확도와 성공 확률도 높일 수 있다.
도 1을 참조하면, 상기 스크리닝 방법은 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체로(Hit-나노구조체)부터 상기 생물학적 물질과 반응한 화합물(Hit-화합물)을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체로(Hit-나노구조체)부터 상기 생물학적 물질과 반응한 화합물을 확인하는 단계는 제2 화합물의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 이에 따라, 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 구성하는 제2 빌딩블록의 종류, 개수, 및 순서를 분석하여, 각각의 제2 빌딩 블록이 암호화하는 제1 빌딩블록의 종류, 개수, 및 순서를 확인함으로써, 상기 생물학적 물질과 반응한 화합물(Hit-화합물)의 구조를 확인할 수 있다.
예를 들어, 상기 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체로부터 상기 생물학적 물질과 반응한 화합물을 확인하는 단계는
상기 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체의 상기 제2 화합물의 DNA 서열을 증폭하는 단계, 및
상기 증폭된 DNA 서열을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체의 상기 제2 화합물의 DNA 서열을 증폭하는 단계는 일반적인 중합효소연쇄반응에 의해 이루어질 수 있다. 예컨대, 약 95℃에서 DNA 암호화 서열의 이중가닥을 단일가닥으로 분리(Denaturation)하고, 온도를 낮추어 상기 DNA 단일가닥, 또는 상기 DNA 단일가닥 말단의 상술한 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머(primer)가 결합(Annealing)하고, 다시 온도를 높여 DNA 중합효소(DNA polymerase)가 상기 DNA 단일가닥에 결합된 상기 프라이머의 3'-OH 말단에서부터 DNA 단일가닥과 상보적인 dNTP를 중합(Polymerization)하여 DNA 이중나선을 합성한다. 상기 DNA는 분리-결합-중합의 순환 주기(Cycle)를 일정 횟수 반복하고, 상기 합성된 DNA 이중나선은 다음 사이클의 기질로 이용하여 DNA를 증폭할 수 있다.
상기 증폭된 DNA 서열을 분석하는 단계는 Sanger 서열 분석법(Sanger Sequencing), 차세대 염기서열 분석법(NGS, Next Generation Sequencing) 등에 의해 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 차세대 염기서열 분석법(NGS, Next Generation Sequencing)에 의해 이루어질 수 있다. 이에 따라, 증폭된 DNA를 구성하는 제2 빌딩블록의 종류, 개수, 및 순서를 분석하고, 각각의 제2 빌딩 블록이 암호화하는 제1 빌딩블록의 종류, 개수, 및 순서를 확인함으로써, Hit-화합물의 구조를 도출할 수 있다. 즉, 생물학적 물질과 결합하는 탐지자의 구조를 확인하여, 상기 생물학적 물질과 결합한 탐지자를 신약 후보물질로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 　다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로써 본 발명이 제한되어서는 안된다.
나노구조체의 제조
제조예 1: 나노구조체 1의　제조
나노구조체 1은 하기 반응식 1로부터 제조될 수 있다.
하기 반응식 1을 참조하면, 표면에 아미노기가 도입된 나노입자 전구체(Tamagawa Seiki 社), FG beads, 크기: 200nm) 0.3mg 에 링커로 Fmoc-AEEP-OH, Boc-γAbu-OH, 및 MeO-PEG(5,000Da)-OH를 3:1:6의 몰비로 각각 0.60 mg, 0.10 mg, 15 mg씩 첨가하여 반응시킨다. 1:1 부피비의 TFA/DCM 혼합 용액을 넣은 후(Boc 탈보호 단계), 여기에 아미노기가 붙은 headpiece DNA를 연결한다(제2 화합물 연결 단계). 이후, 디메틸포름아마이드에 20 부피%로 녹인 피페리딘을 넣은 후(Fmoc 탈보호 단계), 여기에 류신-페닐알라닌-트립토판-Ac을 첨가하여 연결하여(제1 화합물 연결 단계), 나노구조체 1을 제조한다.
(여기서, Fmoc: Fluorenylmethyloxycarbony, AEEP: [(Amino)ethoxy]ethoxy propionic Acid, γAbu: 4-amino butyric acid, Boc: t-Butyloxycarbonyl, Abu: aminooxyacetic acid, NHS: N-hydroxysuccinimide ester, Ac: acetyl, TFA: trifluoroacetic acid, DCM: dichloromethane)
도 2는 제조예 1에서 제조된 나노구조체 1을 대표적으로 도시한 것이다.
[반응식 1]
Figure pat00010
제조예 2: 나노구조체 2의　제조
링커로 Fmoc-AEEP-OH, Boc-γAbu-OH, 및 MeO-PEG(5,000Da)-OH를 3:1:6의 몰비로 각각 0.60 mg, 0.10 mg, 15 mg씩 첨가하는 대신, 링커로 Fmoc-Abu-OH, Boc-Abu-OH, 및 MeO-PEG(5,000Da)-OH를 7.5:2.5:90의 몰비로 각각 0.15 mg, 0.025 mg, 22.5 mg씩 첨가하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로, 나노구조체 2를 제조한다.
제조예 3: 나노구조체 3의　제조
링커로 Fmoc-AEEP-OH, Boc-γAbu-OH, 및 MeO-PEG(5,000Da)-OH를 3:1:6의 몰비로 각각 0.60 mg, 0.10 mg, 15 mg씩 첨가하는 대신, Fmoc-Abu-OH, 및 Boc-Abu-OH를 75:25의 몰비로 각각 0.30 mg, 0.051 mg 씩 첨가하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로, 나노구조체 3을 제조한다.
비교 제조예 1: 비교 나노구조체 1의　제조
링커로 Fmoc-AEEP-OH, Boc-γAbu-OH, 및 MeO-PEG(5,000Da)-OH를 3:1:6의 몰비로 각각 0.60 mg, 0.10 mg, 15 mg씩 첨가하는 대신, Fmoc-Abu-OH, 및 Boc-Abu-OH를 75:25의 몰비로 각각 1.5 mg, 0.25 mg씩 첨가하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로, 비교 나노구조체 1을 제조한다.
평가 1: 나노구조체의 분산성 평가
나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 유무, 및 나노입자 표면에 결합된 제1 화합물과 제2 화합물의 표면 밀도에 따른 나노구조체의 분산성을 평가한다.
평가 1-1: 나노입자 표면의 제1 화합물 밀도
상기 제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1에 따른 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1의 제조 방법에서, 상기 Fmoc 탈보호 단계 이후 생성된 다이벤조풀벤피페리딘을 273nm에서 분광광도계로 정량화하였다. 상기 다이벤조풀벤피페리딘의 몰수는 상기 나노구조체 표면의 제1 화합물의 몰수와 동일하며, 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1 각각의 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1)의 비(n1/w), 이로부터 계산한 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1)와 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비, 및 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌의 몰수(n3)의 비 (n3/w) 값은 하기 표 1과 같다.
나노 구조체 1 나노 구조체 2 나노 구조체 3 비교 나노 구조체 1
링커 몰비 3:1:6 7.5:2.5:90 75:25:0 75:25:0
n1/w 50.2 μmol/g 30.3 μmol/g 14.5 μmol/g 64.2 μmol/g
(n1+n2)/w 66.9 μmol/g 40.4 μmol/g 19.3 μmol/g 85.6 μmol/g
n3/w 100.6 μmol/g 363.6 μmol/g - -
상기 표 1을 참조하면, 나노구조체 1, 및 2는 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌을 포함하고, 나노구조체 3은 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌을 포함하지 않고, 나노구조체의 중량에 대한 제1 화합물과 제2 화합물의 몰수의 합이 낮다. 그러나, 비교 나노구조체 1은 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌을 포함하지 않고, 나노구조체의 중량에 대한 제1 화합물과 제2 화합물의 몰수의 합이 큰 것을 확인할 수 있다.
평가 1-2: 나노구조체의 크기 분포
상기 제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1에 따른 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1를 각각 0.15 mg씩 600 μL의 TBST 버퍼 식염수에 넣어 분산시키고, 동적 광산란 측정기 (Malvern Panalytical 社, Malvern zetasizer Z)를 이용해 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1의 크기를 각각 측정하여, 크기 분포를 도 3 내지 도 6, 및 하기 표 2 에 나타내었다.
도 3 내지 도 6는 각각 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 3 회씩 측정하여 나타낸 그래프이다.
나노 구조체 1 나노 구조체 2 나노 구조체 3 비교 나노 구조체 1 대조군
DLS (nm) 235.5±4.4 229.1±3.0 246.7±2.6 508.2±23.1 239.4±1.6
(여기서, 대조군은 나노구조체 1 내지 3 및 비교나노구조체 1 합성 시 사용한 나노입자 전구체(Tamagawa Seiki 社), FG beads)이다.)표 2를 참조하면, 비교 나노 구조체 1에 비해, 나노구조체 1 내지 3이 더 작은 크기를 가지고, 크기 분포가 균일한 것을 확인할 수 있다.
평가 1-3: 나노구조체의 분산성
상기 제조예 1 내지 3, 및 비교 제조예 1에 따른 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1를 Tris-HCl 버퍼 식염수에 넣어 분산시키고, 0 시간, 6 시간, 16 시간 후 나노구조체의 크기 분포 변화, 및 나노구조체의 응집 여부를 확인하였다.
도 7 내지 도 9은 각각 나노구조체 1 내지 3, 및 비교 나노구조체 1의 0 시간, 6 시간, 및 16 시간 후 응집여부를 보여주는 사진이다. 도 7 내지 도 9에서, 1은 각각 비교 나노구조체 1의 응집 여부를 보여주는 사진이고, 2는 각각 나노구조체 1의 응집 여부를 보여주는 사진이고, 3은 각각 나노구조체 2의 응집 여부를 보여주는 사진이고, 4는 각각 나노구조체 3의 응집 여부를 보여주는 사진이다.
도 7 내지 도 9을 참조하면 나노구조체 1 내지 3은 시간이 흐른 후에도 응집되지 않으나, 비교 나노구조체 1은 6시간, 및 16 시간 후에는 나노구조체가 응집되어 침전됨을 확인할 수 있다.
정리하면, 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하는 제조예 1에 따른 나노구조체 1과 2, 및 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지는 않으나, 나노구조체 중량에 대한 나노입자 표면에 결합된 제1 화합물과 제2 화합물의 함량이 낮은 나노구조체 3은 나노구조체의 평균 크기가 작고, 크기 분포가 균일하며, 시간이 경과하여도 응집되지 않음을 확인할 수 있다.
반면, 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않고, 나노입자 표면에 결합된 제1 화합물과 제2 화합물의 함량이 높은 나노구조체 3은 나노구조체의 평균 크기가 크고, 크기 분포가 불균일하며, 시간이 경과 시 서로 응집되어 침전됨을 확인할 수 있다.
실시예 1: Stapled 펩타이드 라이브러리의 구축
하기 반응식 2의 방법으로, LXXLL 모티프를 가지는 알파-헬릭스 구조를 기반으로 한 stapled 펩타이드 라이브러리를 구축하였다.
[반응식 2]
Figure pat00011
상기 반응식 2를 참조하면, 표면에 아미노기가 도입된 나노입자 전구체(Tamagawa Seiki 社, FG beads, 크기: 200nm) 5 mg 에 아마이드 결합 반응을 통해 Fmoc-AEEP-OH, Boc-γAbu-OH 링커를 각각 3.0 mg, 0.51 mg씩 첨가하여 반응시킨다(Fmoc-AEEP-OH, 및 Boc-γAbu-OH의 몰비: 3:1). 이후, 나노입자 표면에 아미노산과 상기 아미노산을 암호화하는 DNA 서열을 split-and-pool 방법으로 교대로 합성하면서, 탐지자(즉, 펩타이드)를 포함하는 제1 화합물, 및 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 화합물을 포함하는 나노구조체들을 합성하였다. 마지막으로 구리(I) 촉매화 알킨-아자이드 고리화 첨가반응(copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition, CuAAC)을 통해 stapled 펩타이드 라이브러리를 합성하였다. 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)는 42.7 μmol/g이다.
구체적으로, 상기 탐지자는 디메틸포름아마이드에 20 중량%로 녹인 피페리딘을 넣은 후(Fmoc 탈보호 단계), 5-에티닐-2′-데옥시시티딘(Ethynyl-2′-deoxycytidine, EDC)과 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAT)을 넣고, 각 차수 마다 하기 표 3에서 그 차수에 해당하는 어느 하나의 아미노산을 선택하여 1차부터 7차까지 순서대로 도입하여 합성한다.
차수 아미노산
1 Ala, Leu, Ile,Phe, Ser, Thr, Gln, Tyr, Trp, Arg, Nle, Cha, Nap, hArg, PheCl, Aib
2 Val, Leu, Ile, Phe, Nle, Cha, PheF, PheCl, NaP, Tyr, Trp, hPhe
3 Phe, Tyr, Trp, PheF, PheCl, PheNO2, hPhe, Arg, hArg, NaP
4 Val, Leu, Ile, Phe, Nle, Cha, PheF, PheCl, NaP, Tyr, Trp, hPhe
5 Gly, Ala, Leu, Ile, Phe, Ser, Thr, Gln, Tyr, Trp, Arg, Nle, Cha, Nap, hArg, Aib
6 Ala, Leu, Ile,Phe, Ser, Thr, Gln, Tyr, Trp, Arg, Nle, Cha, Nap, hArg, PheCl, Aib
7 stapling 위치를 암호화 하는 8ds의 DNA 서열
(상기 표 3에서, stapling 위치를 암호화 하는 8ds의 DNA 서열은 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, 구체적으로 한정되지 않는다.)
상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열은 1:1 부피비의 TFA/DCM 혼합 용액을 넣어, Boc를 탈보호하고, 카복시기를 도입한 후, 아미노기가 도입된 dsDNA(즉, 헤드피스)를 도입하고, 순방향 프라이머(forward primer), 상기 아미노산을 암호화하는 DNA 서열, 및 역 프라이머(reverse primer)을 T4 연결효소로 도입하여 합성한다. 여기서, 상기 아미노산을 암호화하는 DNA 서열은 이중나선 구조로써, 3'과 5' 말단에 각각 3개의 염기로 이루어진 점착 말단(stick end)를 포함하며, 7 개의 염기쌍(base pare)이 각각의 아미노산을 암호화한다.
도 10은 Stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고, 도 10에서, Rn은 각각 표 3의 차수 n에 기재된 아미노산들 중 어느 하나로부터 유래된 1가의 기이다.
도 11은 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 화합물을 개략적으로 도시한 것이다.
이에 따라, 실시예 1에 따라 제조된 Stapled 펩타이드 라이브러리는 16×12×10×12×16×16×2=11,796,480 개(약 1,200 만 개)의 서로 다른 stapled 펩타이드를 포함한다.
평가 2-1: stapled 펩타이드 라이브러리의 겔 전기영동
실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 중합효소연쇄반응으로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여, 그 결과를 확인한다.
구체적으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 25, 2.5 및 0.25 μg/mL의 농도로 0.05% Tween-20 (Georgiachem) 수용액에 분산되어 있는 나노구조체 1 μL, 0.4 μM forward 프라이머 (TAGAAGGCACAGTCGAGGCATCTC), 및 0.4 μM reverse 프라이머 (GGTCAGCATAGCTGTCTCCTGATCAG)를 50 μL의 premixed PCR 용액 (HelixAmp?? Ready-2x-Go, Nanohelix)에 섞어 진행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응의 사이클은 [95oC 10 s, 60oC 10 s, 72oC 10 s]Х35, 72oC 5 min으로 진행하였다.
구체적으로, 상기 전기영동은 8% 아크릴아마이드 젤에서 진행하였으며, TBE (Tris-borate-EDTA) 버퍼 식염수 상에서 Size marker (Tech & Innovation 社, 50 bp ladder)와 함께 130 V로 전개하였다.
도 12는 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 12를 참조하면, 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체 들에서 탐지자를 암호화하는 DNA 서열의 크기가 균일한 것을 확인할 수 있다.
평가 2-2: stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 분산성
stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체의 분산성은 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope, TEM, JEOL JEM-2100 Electron Microscope)으로 사진을 촬영하고, 동적 광산란 방법으로 그 크기, 및 크기 분포를 측정하여 평가한다.
먼저, 상기 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체들을 메탄올/물 1:1 용액에 넣어 분산시키고, TEM으로 그 결과를 확인한다.
도 13의 (a), 및 (b)는 메탄올/물 1:1에 분산된 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체를 TEM으로 관찰한 사진이다.
또한, 상기 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체 0.5 mg을 0.05% Tween-20(Georgiachem 社, Tween-20)용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF)에 각각 넣어 분산시키고, 동적 광산란 측정기 (Malvern Panalytical 社, Malvern zetasizer Z)를 이용해 크기를 측정하여, 그 크기 분포를 하기 표 4, 및 도 14에 나타내었다.
용매 0.05% Tween-20 DMF
DLS (nm) 404.8±4.4 310.2±0.9
도 14는 상기 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체 들의 0.05% Tween-20용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF) 에서의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 2회씩 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 13, 도 14, 및 표 4를 참조하면, 상기 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체들은 메탄올/물 1:1, 0.05% Tween-20(Georgiachem 社)용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF)에서 모두 응집되지 않으며, 크기 분포가 균일한 것을 확인할 수 있다.
정리하면, 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체는 균일한 크기의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체들은 균일한 크기를 가지며, 서로 응집되지 않는 것을 확인할 수 있다. 한편, LXXLL 모티프를 가지는 알파-헬릭스 구조는 유방암, 췌장암 등의 다양한 암에서 과발현 되어 종양 발현과 암세포 증식에 관여한다고 알려진 간 수용체 상 동체(liver receptor homolog-1, LRH-1)과 결합하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, LXXLL 모티프를 가지는 알파-헬릭스 구조를 기반으로 한 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리를 이용하여, LRH-1에 결합하는 신약 후보 물질을 높은 정확성으로 발굴할 수 있다.
실시예 2: 펩토이드 라이브러리의 제조
하기 반응식 3의 방법으로, 펩토이드 라이브러리를 구축하였다.
[반응식 3]
Figure pat00012
상기 반응식 3를 참조하면, 표면에 아미노기가 도입된 나노입자 전구체(Tamagawa Seiki 社, FG beads, 크기: 200nm) 3 mg에 아마이드 결합반응을 통해 Fmoc-γAbu-OH, Boc-γAbu-OH, 및 폴리에틸렌글리콜(PEG, 5,000Da)을 각각 0.59 mg, 0.12 mg, 및 18 mg씩 첨가하여 반응시킨다(Fmoc-γAbu-OH, Boc-γAbu-OH, 및 PEG의 몰비= 3:1:6). 이후, 나노입자 표면에 N-알킬화된 글리신과 상기 N-알킬화된 글리신을 암호화하는 DNA 서열을 split-and-pool 방법으로 교대로 합성하면서, 탐지자(즉, 펩토이드)를 포함하는 제1 화합물, 및 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 화합물, 및 PEG를 포함하는 나노구조체들을 합성하였다. 마지막으로 구리(I) 촉매화 알킨-아자이드 고리화 첨가반응(copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition, CuAAC)로, 하기 화학식 5로 표현되는 화합물(core 1)을 아자이드기가 존재하는 4 번째 N-알킬화된 글리신에 도입하여, 펩토이드 라이브러리를 합성하였다
[화학식 5]
Figure pat00013
구체적으로, 상기 탐지자는 Fmoc 보호기를 제거한 후, 클로로아세트산나트륨, 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMT-MM)을 넣어 아미노기를 클로로아세틸화 시킨 후, 각 차수마다 하기 표 5에서 그 차수에 해당하는 어느 하나의 1차 아민 화합물을 넣어 N-알킬화된 글리신을 합성하는 Sub-monomer synthesis 단계를 1차부터 7차까지 반복하여 합성한다.
차수 1차 아민 화합물
1 내지 3, 및 5 내지 7 하기 그룹 1-1
4 하기 그룹 1-2
[그룹 1-1]
Figure pat00014
[그룹 1-2]
Figure pat00015
상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열의 구체적인 합성 과정, 및 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 화합물의 구조는 실시예 1과 동일하다.
도 15는 합성된 펩토이드 라이브러리의 나노구조체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고, 도 15에서, Rn은 각각 표 5의 차수 n에 기재된 1차 아민 화합물들 중 어느 하나로부터 유래된 1가의 기이다.
이에 따라, 실시예 2에 따라 제조된 펩토이드 라이브러리는 3×166=50,331,648 개의 서로 다른 펩토이드를 포함한다.
평가 3-1: 펩토이드 라이브러리의 겔 전기영동
실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 중합효소연쇄반응으로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여, 그 결과를 확인한다.
구체적으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 20, 2.0 및 0.20 μg/mL의 농도로 0.05% Tween-20 (Georgiachem 社) 수용액에 분산되어 있는 나노구조체 1 μL, 0.4 μM forward 프라이머 (TAGAAGGCACAGTCGAGGCATCTC), 및 0.4 μM reverse 프라이머 (GGTCAGCATAGCTGTCTCCTGATCAG)를 50 μL의 premixed PCR 용액 (HelixAmp?? Ready-2x-Go, Nanohelix)에 섞어 진행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응의 사이클은 [95oC 10 s, 60oC 10 s, 72oC 10 s]Х35, 72oC 5 min으로 진행하였다.
구체적으로, 상기 전기영동은 8% 아크릴아마이드 젤에서 진행하였으며, TBE (Tris-borate-EDTA) 버퍼 식염수 상에서 Size marker (Thermo Fisher Scientific 社, GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder)와 함께 130 V로 전개하였다.
도 16는 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 16를 참조하면, 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체 들에서 탐지자를 암호화하는 DNA 서열의 크기가 균일한 것을 확인할 수 있다.
평가 3-2: 펩토이드 라이브러리의 나노구조체의 분산성
펩토이드 라이브러리의 나노구조체의 분산성은 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope, TEM, JEOL JEM-2100 Electron Microscope)으로 사진을 촬영하고, 동적 광산란 방법으로 그 크기, 및 크기 분포를 측정하여 평가한다.
먼저, 상기 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체들을 메탄올/물 1:1 용액에 넣어 분산시키고, TEM으로 그 결과를 확인한다.
도 17의 (a), 및 (b)는 메탄올/물 1:1 용액에 분산된 펩토이드 라이브러리의 나노구조체를 TEM으로 관찰한 사진이다.
또한, 상기 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체 0.15 mg 을 700 μL의 TBST 버퍼 식염수에에 넣어 분산시키고, 동적 광산란 측정기 (Malvern Panalytical 社, Malvern zetasizer Z)를 이용해 크기를 측정하여, 그 크기 분포를 하기 표 6, 및 도 18에 나타내었다.
용매 TBST
DLS (nm) 315.9±6.1
도 18은 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체들의 Tris-HCl 버퍼 식염수에서의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 3회씩 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 17, 도 18, 및 표 6를 참조하면, 상기 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체들은 Tris-HCl 버퍼 식염수에서 응집되지 않으며, 크기 분포가 균일한 것을 확인할 수 있다.
정리하면, 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체는 균일한 크기의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리의 나노구조체들은 균일한 크기를 가지며, 서로 응집되지 않는 것을 확인할 수 있다.
한편, 상기 화학식 5로 표현되는 화합물(core 1)은 단백질 티로신 인산가수분해효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)의 활성 부위에 약하게 붙는다고 알려져 있다. 또한, 펩토이드는 펩타이드보다 높은 세포투과성, 단백질 분해 효소에 대한 높은 안정성 등을 가진다.
이에 따라, core 1으로부터 유래된 모이어티를 가지는 펩토이드를 기반으로 한 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리를 이용하여, PTP에 결합하면서도 높은 세포투과성, 단백질 분해 효소에 대한 높은 안정성 등을 갖는 신약 후보 물질을 높은 정확성으로 발굴할 수 있다.
실시예 3: 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 구축
하기 반응식 4의 방법으로, 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리를 구축하였다.
[반응식 4]
Figure pat00016
상기 반응식 4를 참조하면, 표면에 아미노기가 도입된 나노입자 전구체(Tamagawa Seiki 社, FG beads, 크기: 200nm) 2.1 mg에 아마이드 결합 반응을 통해 Fmoc-Abu-NHS, 및 Boc-Abu-NHS 링커를 각각 0.090 mg, 및 0.015 mg씩 첨가하여 반응시킨다(Fmoc-Abu-NHS, 및 Boc-Abu-NHS의 몰비: 3:1). 이후, 치환 또는 비치환된 아민, 치환 또는 비치환된 트리아진, 및 치환 또는 비치환된 피페라진; 및 이들을 암호화하는 DNA 서열을 split-and-pool 방법으로 교대로 합성하면서, 탐지자(즉, 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체)를 포함하는 제1 화합물, 및 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 화합물을 포함하는 나노구조체들을 합성하였다. 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)는 31.9 μmol/g이다.
먼저, 상기 탐지자를 암호화하는 서열은 Boc를 탈보호하고, 카복시기를 도입한 후, 아미노기가 도입된 dsDNA(헤드피스)를 도입하고, 순방향 프라이머(forward primer); 상기 치환 또는 비치환된 아민, 치환 또는 비치환된 트리아진, 및 치환 또는 비치환된 피페라진을 암호화하는 DNA 서열; 및 역 프라이머(reverse primer)을 T4 ligase로 도입하여 합성한다. 여기서, 상기 치환 또는 비치환된 아민, 치환 또는 비치환된 트리아진, 및 치환 또는 비치환된 피페라진을 암호화하는 DNA 서열은 이중나선 구조로써, 3'과 5' 말단에 각각 3개의 염기로 이루어진 점착 말단(stick end)를 포함하며, 7 개의 염기쌍(base pare)이 각각의 치환 또는 비치환된 아민, 치환 또는 비치환된 트리아진, 및 치환 또는 비치환된 피페라진을 암호화한다.
상기 탐지자는 Fmoc을 탈보호한 후, 각 차수 마다 하기 표 7에서 그 차수에 해당하는 어느 하나를 선택하여 1차부터 5차까지 순서대로 도입하여 합성한다.
차수 치환 또는 비치환된 아민/치환 또는 비치환된 트리아진/ 치환 또는 비치환된 피페라진
1 하기 그룹 2
2 하기 그룹 4
3 하기 그룹 5
4 하기 그룹 4
5 하기 그룹 3
[그룹 2]
Figure pat00017
[그룹 3]
Figure pat00018
[그룹 4]
Figure pat00019
[그룹 5]
Figure pat00020
도 19는 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고, 도 19에서, Rn은 각각 표 3의 차수 n에 기재된 제1 빌딩블록들 중 어느 하나로부터 유래된 1가의 기이다.
도 20은 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 제2 화합물을 대표적으로 도시한 것이다.
이에 따라, 실시예 3에 따라 제조된 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리는 17×17×12×17×17=1,002,252 개(약 백만 개)의 서로 다른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체를 포함한다.
평가 4-1: 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 겔 전기영동
실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 중합효소연쇄반응으로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여, 그 결과를 확인한다.
구체적으로, 상기 중합효소 연쇄반응은 63, 6.3 및 0.63 ng/mL의 농도로 0.05% Tween-20 (Georgiachem 社) 수용액에 분산되어 있는 나노구조체 1 μL, 0.4 μM forward 프라이머 (TAGAAGGCACAGTCGAGGCATCTC), 및 0.4 μM reverse 프라이머 (CAGGCAGTCACGTCCAGTTACACTATGAGG)를 50 μL의 premixed PCR 용액 (HelixAmp?? Ready-2x-Go, Nanohelix)에 섞어 중합효소연쇄반응을 진행하였다. 상기 중합효소 연쇄반응의 사이클은 [95oC 10 s, 60oC 10 s, 72oC 10 s]Х35, 72oC 5 min으로 진행하였다.
구체적으로, 상기 전기영동은 8% 아크릴아마이드 젤에서 진행하였으며, TBE (Tris-borate-EDTA) 버퍼 식염수 상에서 Size marker (50 bp ladder, Tech & Innovation)와 함께 130 V로 전개하였다.
도 21은 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 PCR로 증폭하고, 아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과를 촬영한 사진이다.
도 21을 참조하면, 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체 들에서 탐지자를 암호화하는 DNA 서열의 크기가 균일한 것을 확인할 수 있다.
평가 4-2: 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 분산성
트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체의 분산성은 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope, TEM, JEOL JEM-2100 Electron Microscope)으로 사진을 촬영하고, 동적 광산란 방법으로 그 크기, 및 크기 분포를 측정하여 평가한다.
먼저, 상기 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체들을 메탄올/물 1:1 용액에 넣어 분산시키고, TEM으로 그 결과를 확인한다.
도 22의 (a), 및 (b)는 메탄올/물 1:1에 분산된 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체를 TEM으로 촬영한 사진이다.
또한, 상기 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체 0.11 mg을 550 μL의 0.05% Tween-20 수용액 (Georgiachem 社)용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF)에 각각 넣어 분산시키고, 동적 광산란 측정기 (Malvern Panalytical 社. Malvern zetasizer Z)를 이용해 크기를 측정하여, 그 크기 분포를 하기 표 8, 및 도 23에 나타내었다.
용매 0.05% Tween-20 DMF
DLS (nm) 269.4±7.1 220.4±0.3
도 23은 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체들의 0.05% Tween-20용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF) 에서의 크기 분포를 동적 광산란 방법으로 3회씩 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 22, 도 23, 및 표 8을 참조하면, 상기 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체들은 메탄올/물 1:1, 0.05% Tween-20 용액, 및 디메틸포름아마이드(DMF) 에서 모두 응집되지 않으며, 크기 분포가 균일한 것을 확인할 수 있다.
정리하면, 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체는 균일한 크기의 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체들은 균일한 크기를 가지며, 서로 응집되지 않는 것을 확인할 수 있다.
한편, 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체는 저분자량 물질로서, 알파-헬릭스 상의 i, i+3(4), i+7 아미노산 잔기의 위치를 모방할 수 있다. 이에 따라, 펩타이드, 및/또는 펩토이드 뿐만 아니라, 이와 같은 유망한 저분자 화합물도 라이브러리 구축에 적용될 수 있고, 신약 후보 물질을 높은 정확성으로 발굴할 수 있다.
결합력 기반 단백질 스크리닝
평가 5-1: 간 수용체 상 동체 1(LRH-1) 스크리닝
(1) 상기 실시예 1에서 얻은 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체들을 스트렙타비딘을 코팅한 튜브에 넣고, 인큐베이션 한다. 이후, 스트렙타비딘과 결합하여 튜브 벽에 붙은 거짓 양성을 보이는 나노구조체들은 제거하고, 튜브 벽에 붙지 않은 나노구조체들만 사용한다 (사전-스크리닝 단계).
사전-스크리닝된 나노구조체들 중 절반에 바이오틴으로 표지된 LRH-1을 200 nM로 포함하는 스크리닝 버퍼 용액(TBS Start Block (Thermo Scientific 社), 0.05% Tween-20, 1 mg/mL sheared salmon sperm DNA (Invitrogen 社))을 넣어 혼합액 1을 만들고, 나머지 절반에는 바이오틴으로 표지된 LRH-1이 없는 스크리닝 버퍼 용액을 넣어 혼합액 2를 만든 후, 각각 4oC에서 3 시간 동안 인큐베이션 한다. 이후, 혼합액 1, 및 2를 각각 두 개씩의 스트렙타비딘을 코팅한 튜브 (총 4 개)에 넣고, 4oC에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였으며, 각각의 튜브에서, 튜브 벽에 붙은 나노구조체는 남겨두고, 나머지 붙지 않은 나노구조체를 sheared salmon sperm DNA를 제외한 스크리닝 버퍼 용액으로 5 번 씻어줌으로써 제거한다.
혼합액 1, 및 2를 넣은 각각의 튜브에서, 튜브 벽에 붙은 나노구조체를 PCR하여, 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 증폭하고 정제하였다. 이후, NGS 분석 (Illumina platform)을 통해 Duplicate로 합성한 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 분석한다.
혼합액 1을 넣은 튜브에서 분석된 DNA 서열 중, 혼합액 2를 넣은 튜브에서도 분석된 DNA 서열은 제외하고, 개수가 많은 순으로 상위 30개(총 60개)의 DNA 서열만 선별하였다. 선별된 DNA 서열로부터 LRH-1 단백질과 결합한 펩타이드(Hit-stapled 펩타이드)의 서열을 해독한다.
도 24(a), 및 (b)는 상기 선별된 상위 30개의 DNA 서열을 기재한 것이고,
도 24(c), 및 (d)는 상기 선별된 DNA 서열로부터 LRH-1 단백질과 결합한 펩타이드(Hit-stapled 펩타이드)의 서열을 해독한 것이다.
(2) 도 24(c), 및 (d) 중 개수가 가장 많은 서열을 포함하여 임의로 8개의 서열을 선택하고, 이들로부터 각각 Hit 1 내지 8의 stapled 펩타이드를 합성한 후, 경쟁 형광 편광 분석(competitive fluorescence polarization assay, FP)를 통해 합성된 Hit 1 내지 8의 stapled 펩타이드가 LRH-1 의 상호작용을 저해하는지 확인한다.
구체적으로, 상기 경쟁 형광 편광 분석은 20 nM의 fluorescein으로 표지된 DAX-1 box 3 peptide (FL-PRQGSILYSLLTSSK)와 500 nM의 LRH-1-LBD (ligand binding domain)을 binding 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.01% Tween-20)에 넣은 후, Hit 1 내지 8의 stapled 펩타이드를 각각 다양한 농도로 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 형광 편광값은 Tecan F200 Microplate Reader (Tecan 社)을 사용해서 excitation wavelength: 485 nm, emission wavelength: 535 nm의 조건으로 측정하였다.
도 25는 Hit 1 내지 8의 stapled 펩타이드의 농도에 따른 LRH-1과 stapled 펩타이드가 결합한 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 25를 참조하면, 실시예 1에 따른 stapled 펩타이드 라이브러리를 통해 발굴된 Hit 1 내지 8의 stapled 펩타이드는 LRH-1에 대해 25 nM 이상의 Ki 값을 가지며, 항체 수준의 결합력을 가짐을 확인할 수 있다. 이에 따라, Hit 1 내지 8의 stapled 펩타이드는 LRH-1과 결합하여, LRH-1의 과발현을 억제하는 저해제로 사용될 수 있다.
평가 5-2: 단백질 티로신 인산가수분해효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B) 스크리닝
상기 실시예 1에서 얻은 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체들 대신 상기 실시예 2에서 얻은 펩토이드 라이브러리의 나노구조체들을 사용하고, LRH-1 대신 PTP1B를 사용한 것을 제외하고는 평가 5-1과 동일한 방법으로 PTP1B를 스크리닝 하여, 개수가 많은 순으로 상위 10개(총 20개)의 DNA 서열만 선별한다.
도 26은 상기 선별된 상위 10개의 DNA 서열을 기재한 것이다.
PTP1B는 PTP family의 일종으로 제 2형 당뇨병과 비만에 밀접한 관련이 있다고 알려진 단백질 중 하나인 바, 실시예 2에 따른 펩토이드 라이브러리를 이용하여 PTP1B를 스크리닝 해 얻은 상기 DNA 서열을 해독하여, PTP1B와 결합하는 펩토이드를 발굴해 신약 후보물질로 사용할 수 있다.
평가 5-3: B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL)단백질 스크리닝
상기 실시예 1에서 얻은 stapled 펩타이드 라이브러리의 나노구조체들 대신 상기 실시예 3에서 얻은 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리의 나노구조체들을 사용하고, LRH-1 대신 Bcl-xL를 사용한 것을 제외하고는 평가 5-1과 동일한 방법으로 Bcl-xL를 스크리닝 하여, 개수가 많은 순으로 상위 10개의 DNA 서열만 선별한다.
도 27(a)는 상기 선별된 상위 10개의 DNA 서열을 기재한 것이고,
도 27(b)는 상기 선별된 DNA 서열로부터 Bcl-xL 단백질과 결합한 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체(Hit-트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체)의 서열을 해독한 것이다.
도 27 (b)중 개수가 가장 많은 서열을 포함하여 임의로 3개의 서열을 선택하고, 이들로부터 각각 Hit 1 내지 3의 트리아진-피페라지-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체를 형광 (fluorescenin)이 표지된 형태로 합성하고, 형광 편광 분석(fluorescence polarization assay, FP)를 통해 합성된 Hit 1 내지 3의 저분자 화합물이 Bcl-xL에 결합하는지 확인한다.
구체적으로, 100 nM의 fluorescein으로 표지된 Hit 1 내지 3의 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체를 각각 binding 버퍼 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.01% Tween-20)에 넣은 후, 다양한 농도의 Bcl-xL 단백질을 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션한다. 형광 편광값은 Tecan F200 Microplate Reader (Tecan)을 사용해서 excitation wavelength: 485 nm, emission wavelength: 535 nm의 조건으로 측정한다.
도 28은 Bcl-xL의 농도에 따른 Hit 1 내지 3의 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체에 표지된 fluorescein의 형광 편광값 변화를 나타낸 그래프이다.
Bcl-xL는 세포사멸을 저해하는 단백질로써 다양한 암세포에서 과발현 되어 있다고 알려진 단백질 중 하나인 바, 실시예 3에 따른 트리아진-피페라진-트리아진 골격을 갖는 알파-헬릭스 유사체 라이브러리를 이용하여 Bcl-xL를 스크리닝 해 얻은 상기 DNA 서열을 해독하여, Bcl-xL과 결합하는 저분자 화합물을 발굴해 신약 후보물질로 사용할 수 있다.
이상 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고, 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리 범위에 속하는 것이다.

Claims (20)

  1. 나노입자,
    탐지자(probe)를 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제1 화합물,
    상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 상기 나노입자 표면에 결합된 제2 화합물, 및
    선택적으로 상기 나노입자 표면에 결합된 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하는 나노구조체로서,
    상기 나노구조체가 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우, 상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1) 및 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 합의 비((n1+n2)/w)는 평균 1.2 nmol/g 내지 85 μmol/g인 나노구조체.
  2. 제1항에서,
    상기 나노입자는 유기 중합체 나노입자, 무기 나노입자, 유무기 복합 나노입자, 또는 이들의 조합을 포함하는 나노구조체.
  3. 제1항에서,
    상기 나노입자는 코어-쉘 형태이고,
    상기 코어는 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌, 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트, 페라이트를 선택적으로 포함하는 치환 또는 비치환된 폴리스티렌-폴리글리시딜메타크릴레이트 공중합체, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 쉘은 치환 또는 비치환된 폴리글리시딜메타크릴레이트를 포함하는 나노구조체.
  4. 제1항에서,
    상기 나노입자의 크기는 10 nm 내지 1,000 nm 인 나노구조체.
  5. 제1항에서,
    상기 제1 화합물, 및 제2 화합물은 각각 독립적으로 적어도 2 개의 말단을 가지고, 그 중 한 말단은 상기 나노입자에 결합되는 나노구조체.
  6. 제1항에서,
    상기 탐지자는 펩타이드, 펩타이드 유사체(peptide mimetics), 저분자 화합물, 또는 이들의 조합을 포함하는 나노구조체.
  7. 제1항에서
    상기 탐지자는 D-펩타이드, L-펩타이드, 고리형 펩타이드, 스테이플 된 펩타이드(stapled peptide), 펩토이드, 고리형 펩토이드, 폴다머, 트리아진 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 피롤로피리미딘 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 벤즈이미다졸 모이어티를 포함하는 저분자 화합물, 또는 이들의 조합을 포함하는 나노구조체.
  8. 제1항에서,
    상기 제2 화합물은 상기 탐지자를 암호화하는 DNA 서열의 양 말단에 프라이머(primer)를 포함하는 나노구조체.
  9. 제1항에서,
    상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 중량 평균 분자량은 1,000 내지 10,000 Da 인 나노구조체.
  10. 제1항에서,
    상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜은 치환 또는 비치환된 폴리에틸렌글리콜인 나노구조체.
  11. 제1항에서,
    상기 제1 화합물의 몰수(n1)와 상기 제2 화합물의 몰수(n2)의 비(n1:n2)는 1.5:1 내지 1,000:1인 나노구조체.
  12. 제1항에서,
    상기 나노구조체가 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함할 경우,
    상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜의 몰수(n3)의 비(n3/w)는 평균 100 μmol/g 이상인 나노구조체.
  13. 제1항에서,
    상기 나노구조체가 상기 치환 또는 비치환된 폴리알킬렌글리콜을 포함하지 않을 경우,
    상기 나노구조체의 중량(w)에 대한 상기 제1 화합물의 몰수(n1)의 비(n1/w)는 60 μmol/g 이하인 나노구조체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 나노구조체를 포함하는 바이오센서.
  15. 제14항에 따른 바이오센서와 생물학적 물질을 접촉시키는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
  16. 제15항에서,
    상기 생물학적 물질은 표지 물질(label)로 표지되고,
    상기 표지 물질은 바이오틴, 아비딘(avidin),　히스태그(histag), Ni-NTA, N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinmide), 아민(amine), 티올(thiol), 히스티딘(histidine), 포스핀(phosphine), 알데히드 태그(aldehyde tag), 히드라지드 태그(hydrazide tag), 할라이드(halide), 알카인(alkyne), 아자이드(azide),　할로태그(Halotag), 벤질구아닌(benzylguanin),　스냅태그(sanp tag), 벤질시토신(benzylcytosine),　클립 태그(CLIP-tag),　플래그 태그(Flag-tag),　말레이미드(maleiimide), 또는 이들의 조합인 스크리닝 방법.
  17. 제15항에서,
    상기 바이오센서 내 생물학적 물질과 반응한 나노구조체를 선별하는 단계를 더 포함하는 스크리닝 방법.
  18. 제17항에서,
    상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체를 선별하는 단계는
    상기 생물학적 물질과 결합하는 물질로 코팅된 용기를 준비하는 단계, 및
    상기 용기에 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체를 부착시키는 단계를 포함하는 스크리닝 방법.
  19. 제17항에서,
    선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체로부터 상기 생물학적 물질과 반응한 화합물을 확인하는 단계를 더 포함하는 스크리닝 방법.
  20. 제19항에서,
    상기 화합물을 확인하는 단계는
    상기 선별된 상기 생물학적 물질과 반응한 나노구조체의 상기 제2 화합물의 DNA 서열을 증폭하는 단계, 및
    상기 증폭된 DNA 서열을 분석하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법.
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