KR20210107166A - 항-ｎｍｅ 항체 - Google Patents

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KR20210107166A
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신시아 밤다드
벤와 스마그
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미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션
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Abstract

본 출원은 항-NME 항체, 및 질환을 치료하거나 예방하는 데 있어서의 이의 용도를 개시하고 있다.

Description

항-ＮＭＥ 항체{ANTI-NME ANTIBODY}
본 출원은 NME 단백질, NME 단백질 유래의 펩타이드, 및 이의 펩타이드로부터 생성되는 항체, 또는 상기 펩타이드에 결합하는 능력에 의해 선택되는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 본 출원은 또한, 환자에서 NME의 발현과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 것에 관한 것이다.
NDPK(뉴클레오사이드 다이포스페이트 단백질 키나제) 단백질들은, 이들이 모두 NDPK 도메인을 함유하기 때문에 함께 그룹으로 엮인 단백질 패밀리이다. 발견된 첫 번째 NME 단백질은 이전에는 NM23 단백질로 지칭되었으며, NM23-H1 및 NM23-H2이었다. 수십 년 동안, 이들이 조혈 세포의 분화를 유도하는지 또는 분화를 방지하였는지 불분명하였다. 본 발명자들은 이전에, NM23-H1이 이량체일 때 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하여 분화를 방지하지만, 보다 고농도에서 NM23-H1은 육량체로 되며, MUC1*에 결합하지 않아 분화를 유도함을 발견하였다. NM23은 이것이 일부 매우 공격적인 암에서 하향-발현되는 것이 발견되었을 때, 전이 억제자로 지칭되기도 하였다. 본 발명자들은 이전에, NM23-H1 이량체가 대부분의 암에서 과발현되는 MUC1* 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 결합하여 이량체화하고, 이러한 결합이 암세포의 성장을 촉진함을 발견하였다. 역으로, 보다 고농도에서, NM23은 MUC1*에 결합하지 않는 사량체 및 육량체를 형성하고, 종양 형성을 촉진하지 않는다. 매우 최근에 보다 많은 NME 패밀리 단백질들(NME 1 내지 NME 10)이 발견되긴 하였지만, 현재까지 이들의 기능은 설명되지 않고 있다. NME7은 새로 발견된 NME 패밀리 단백질이지만, 이의 NDPK 도메인은 다른 NME 패밀리 구성원들과는 달리 효소 활성을 갖지 않는다. NME7은 성인 조직에서 전혀 발현되지 않거나 극도로 낮은 수준으로 발현된다.
본 출원은 NME 패밀리의 구성원에 대항하여 제조된 항체를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. NME 패밀리는 NME7 패밀리일 수 있다. 항체는 NME7에 결합할 수 있다. 항체는 NME7-AB 또는 NME-AB-유사 단백질에 결합할 수 있다. 항체는 NME7-X1에 결합할 수 있다. 항체는 NME7과 이의 동족 결합 파트너(cognate binding partner) 사이의 결합을 저해할 수 있다. 동족 결합 파트너는 MUC1*일 수 있다. 동족 결합 파트너는 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분일 수 있다. 일 양태에서, 도 16 내지 도 19에 열거된 것들(서열 번호:88 내지 145)로부터 선택되는 펩타이드에 결합하는 항체가 생성되거나, 이러한 능력에 대해 선택될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드는 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택될 수 있다.
펩타이드는, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드일 수 있다. 일 양태에서, 항체는 NME1이 아닌 NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 이가 항체, 일가 항체, 이중특이적 항체, 가변 영역을 함유하는 항체 단편, 또는 항체 모방체일 수 있다. 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 항체는 단쇄 scFv일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 NME7-AB의 영역에 고도로 상동성이거나 일치하는 펩타이드를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자의 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 펩타이드는 도 16에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 17에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 18에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 19에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 펩타이드는 도 19에 열거된 것들(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 또는, 펩타이드는, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드일 수 있다. 펩타이드는 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩타이드에 연결될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것으로서, CAR의 표적화 세포외 부분이 NME 패밀리의 구성원의 적어도 하나의 펩타이드 단편을 포함한다. NME 패밀리는 NME7 패밀리일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7일 수 있다. 또는, NME7 패밀리의 구성원은 NME7-AB 또는 NME-AB-유사 단백질일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 또한, NME7-X1일 수 있다. CAR의 표적화 세포외 부분은 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드들(서열 번호:88 내지 145) 중의 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드는 도 19에 열거된 것들(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 펩타이드는, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드는 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩타이드에 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 청구항 제3항에 따른 키메라 항원 수용체를 면역계 세포 내로 조작하고, 상기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 암 전이를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것으로서, 키메라 항원 수용체의 표적화 세포외 부분은 NME7-AB, NME-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1에 결합하는 항체의 부분을 포함한다. 항체의 부분은 단쇄 scFv일 수 있거나, 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 NME 패밀리 구성원의 펩타이드 단편으로 인간을 면역화시키는 단계를 포함하는, 암 또는 전이성 암에 대해 인간을 백신화시키는 방법에 관한 것이다. NME 패밀리는 NME7 패밀리일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7 또는 NME7b일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7-AB 또는 NME7-AB-유사 단백질일 수 있다. NME7 패밀리는 NME7-X1일 수 있다. 면역화 펩타이드는 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145) 중의 펩타이드일 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드는 도 19에 열거된 것들(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 면역화 펩타이드는, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성일 수 있는 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함할 수 있다. 면역화 펩타이드는 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩타이드에 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 핵산을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 핵산은 NME7, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 억제하는 안티-센스 핵산일 수 있다. 핵산은 NME7, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 억제하는 저해성 RNA, siRNA, RNAi 또는 shRNA일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전적으로 편집된 핵산을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전적으로 편집된 핵산은 세포 내로 삽입될 수 있으며, 그런 다음, 환자에게 투여될 수 있다. NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전적으로 편집된 핵산은 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 삽입될 수 있다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 시스템일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 암세포를 NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1, 2i 또는 5i와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포를 성장시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1, 2i 또는 5i를 함유하는 배지 내에서 세포를 배양하는 단계, 또는 인간 NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1을 발현하는 동물, 또는 NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1이 투여된 동물에서 세포를 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 암세포는 유방암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종 또는 뇌암 세포일 수 있다. 후보 약물은 세포 상에서 시험될 수 있다. 약물의 효능은, 암 성장을 무-약물(no drug) 대조군과 비교하거나, 전이 마커 또는 줄기세포 마커의 발현 수준을 무-약물 대조군과 비교하거나, 무-약물 대조군과 비교하여 낮은 세포 복사 수(copy number)로부터 동물에서 종양을 형성하는 생성된 세포의 능력을 비교하고, 암 또는 전이 치료용 후보 약물의 효능을 확인함으로써 평가될 수 있다. 세포는 암 치료를 위해 평가되는 환자로부터 수득될 수 있고, 해당 환자에게 효과적일 약물은 전술한 방법을 사용하여 수득된 결과를 토대로 선택된다. 세포는 암 치료를 위해 평가되는 환자로부터 수득되지 않을 수 있으나, 해당 환자에게 효과적일 약물은 전술한 방법을 사용하여 수득된 결과를 토대로 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 NME의 서열로부터 유래되는 서열을 갖는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체로부터 항체 또는 항체-유사 분자를 생성하는 방법에 관한 것이다. NME는 NME7일 수 있다. 펩타이드는 항체 또는 항체-유사 분자를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 펩타이드는 항-NME7 항체를 생성하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 펩타이드는 항-NME7 항체를 생성하기 위해 인간에게 투여될 수 있다. 펩타이드는 도 16 내지 도 19에 열거된 서열(서열 번호:88 내지 145)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드는 도 19에 열거된 것들(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 펩타이드는, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 암의 존재 또는 암의 진행을 검출하는 방법에 관한 것이다:
1) 암 환자 또는 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 검체를 수득하는 단계;
2) 해당 검체를, NME7 패밀리의 구성원의 수준, 또는 NME7 패밀리의 구성원을 인코딩하는 핵산의 수준을 검출하거나 측정할 수 있는 분석법으로 처리하는 단계;
3) 시험 검체에서 측정된 NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원-인코딩 핵산의 수준을 대조군 환자 또는 대조군 세포에서의 수준과 비교하는 단계;
4) NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원을 인코딩하는 핵산의 수준이 대조군과 비교하여 상승되는지 확인하는 단계; 및
5) 시험이 비교되는 대조군이 이전에 암을 진단받은 공여자로부터 유래된 것이라면, 시험 검체의 공여자가 암을 가지고 있거나, 암이 진행되었다고 결론 내리는 단계.
이러한 방법에서, 순환계 또는 조직 내에서 NME7 패밀리의 구성원의 검출은 환자에서 암의 지표(indicator)일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7-AB-유사 단백질일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
환자에서 NME7 패밀리의 구성원 또는 MUC1*의 존재를 검출하는 단계; 및
항-NME7 항체 또는 항-MUC1* 항체 또는 항체들을 NME7 패밀리의 구성원 또는 MUC1* 발현을 나타내는 환자에게 투여하는 단계.
NME7 패밀리의 구성원은 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7-AB-유사 단백질일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다:
1) 암이 의심되는 환자, 암이 발병할 위험이 있는 환자 또는 전이성 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 검체를 수득하는 단계;
2) NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원을 인코딩하는 핵산의 양을 측정하는 단계로서, 측정된 수준이 대조군 검체에서 측정된 것보다 상당히 더 높은, 단계;
3) 환자가 암을 가지고 있거나 환자에서 보다 공격적인 암 또는 전이성 암이 발병되었음을 확인하는 단계;
4) NME7 패밀리의 구성원의 발현을 억제하거나, NME7의 절단을 저해하거나, NME7의 표적으로의 이의 결합을 저해하는 치료제를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계.
NME7 패밀리의 구성원의 표적은 MUC1*일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원의 표적은 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7-AB-유사 단백질일 수 있다.
암에 관한 상기 방법들 중 임의의 방법에서, 암은 유방암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종 또는 뇌암을 포함할 수 있다.
본 발명은 본원의 하기에 제공되는 상세한 설명, 및 단지 예시로써 제공되므로 본 발명을 제한하고자 하는 것 아닌 첨부된 도면을 통해 보다 완전히 이해될 것이며, 여기서;
도 1의 A 내지 D. 세포 파쇄물에서 NME1 또는 NME7의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 겔의 사진: 1) MUC1* 항체 표면(MN-C3 mab)으로 코팅된 표면 상의, NM23-H1 이량체에서 배양된 BGO1V 인간 배아 줄기세포; 2) 마우스 피더 세포(mouse feeder cell)(MEF) 층 상의, bFGF에서 표준 프로토콜에 따라 배양된 BGO1V 인간 배아 줄기세포; 3) RPMI 배지에서 표준 방법에 따라 배양된 T47D 유방암 세포; 및 4) 재조합 인간 NM23-H1 야생형, "wt"(A, B). 하부 열(C, D)은 "풀-다운(pull-down)", 또는 세포 파쇄물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 "Ab-5"를 첨가한 비드와 함께 개별적으로 인큐베이션한 면역-침전 분석법의 결과를 보여준다. MUC1* 펩타이드로의 결합에 의해 포착된(captured) 종을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 각각 제각기의 NM23 단백질에 대한 항체를 사용하여 블로팅하였다. 동일한 실험을 NME6를 사용하여서 수행하였으나, 데이터는 도시되지 않는다.
도 2의 A 내지 E는, NME1, NME6 또는 NME7의 존재 여부를 알아보기 위해, T47D 유방암 세포, BGO1V 및 HES-3 인간 ES 세포 및 인간 SC101-A1 iPS 세포로부터의 세포 파쇄물을 탐침한, 웨스턴 블롯의 사진을 도시한 것이다. 모든 세포주에서 NME1은 약 17 kDa의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)으로 진행되었다(A). 모든 세포주에서, NME7 약 33 kDa 종 및 42 kDa 종(C, E)은 HES-3 세포주(FGF에서 배양됨)를 제외한 모든 세포주에서 검출될 수 있었다. NME6-특이적인 항체와 반응한 종은, 시각화를 슈퍼 시그널을 이용해 증강시킨 경우, HES-3 세포주를 제외한 모든 세포주에서 검출되었다.
도 3a 내지 3c는, NME7의 존재 여부를 알아보기 위해, 탐침한 인간 배아 줄기(ES) 세포(a) 및 유도 만능 줄기(iPS) 세포(b, c)의 웨스턴 블롯 사진의 패널을 도시한 것이다. 웨스턴 블롯은 세포 파쇄물에 3가지 형태의 NME7이 존재함을 보여준다. 하나는 겉보기 분자량이 약 42kDa(전장), 약 33 kDa(N-말단 DH 영역을 포함하지 않는 NME7-AB 영역) 및 작은 약 25 kDa의 종이다. 그러나, 저분자량 종만이 조건화된 배지(b)에 존재한다.
도 4의 A 내지 C. (A)는 NME7-AB의 크기 배제 크로마토그래피 정제의 용출 프로파일이며; (B)는 NME7-AB 피크 분획으로부터의 비-환원성 SDS-PAGE 겔이며; (C)는 정제된 NME7-AB의 크기 배제 크로마토그래피의 용출 프로파일이다.
도 5는, NME7-AB가 MUC1* 세포외 영역 펩타이드를 이량체화하는 것을 보여주는, ELISA 샌드위치 분석법으로부터의 HRP 신호에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 6의 A 내지 G는, 비처리(A열), 택솔(B열) 또는 항-NME7 항체(C열 내지 E열)로 처리한 MUC1*-양성 암세포의 사진을 도시한 것으로서; 그래프는 48시간째에 치료에 반응한 세포의 계수를 보여주며(F), 암세포 저해 실험에 사용된 항체의 농도를 추정하기 위해 도트-블롯을 이용하였다(G).
도 7의 A 내지 K는, 암세포 성장을 저해하기 위해 항-NME7 항체를 사용한 실험을 수행한 지 48시간째의 결과를 도시한 것이다. 배지 단독(A), 택솔(B), 또는 지시된 농도에서 항-NME7(C 내지 J)에서 배양한 세포의 사진; 칼세인 암(calcein AM) 분석법을 이용해 수득한 세포 수의 그래프가 도시되어 있다(K).
도 8의 A 내지 K는, 암세포 성장을 저해하기 위해 항-NME7 항체를 사용한 실험을 수행한 지 96시간째의 결과를 도시한 것이다. 배지 단독(A), 택솔(B, 또는 지시된 농도에서 항-NME7(C 내지 J)에서 배양한 세포의 사진; 칼세인 AM 분석법을 이용해 수득한 세포 수의 그래프가 도시되어 있다(K). 그래프 및 사진은, 항-NME7 항체가 나노몰 범위로 낮은 농도에서 암세포 성장을 저해한다는 것을 보여준다.
도 9는 NME7의 존재 여부를 알아보기 위해, 줄기세포 파쇄물(홀수 레인) 또는 세포 조건화된 배지(짝수 레인)를 탐침한 웨스턴 블롯 사진이다. iPS(유도 만능 줄기) 세포를, FGF에서 MEF 상에서 배양하거나(레인 1, 2), NM23-H1 이량체에서 항-MUC1* 항체(C3) 표면 상에서 배양하거나(레인 3, 4) 또는 NME7에서 항-MUC1* 항체(C3) 표면 상에서 배양하였다(레인 5 내지 8). HES-3(인간 배아 줄기) 세포를, FGF에서 MEF 상에서 배양하거나(레인 9, 10), NM23-H1 이량체에서 항-MUC1* 항체(C3) 표면 상에서 배양하거나(레인 11, 12) 또는 NME7에서 항-MUC1* 항체(C3) 표면 상에서 배양하였다(레인 13, 14). 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포를 또한 탐침하였다(레인 15, 16). 웨스턴 블롯은, 세포 파쇄물이, 전장 단백질에 상응하는 분자량 약 42 kDa의 NME7 종을 포함하는 것을 보여준다. 그러나, 분비된 종은 약 33 kDa의 겉보기 MW로 진행되며, 이는 N-말단 리더 서열을 포함하지 않는 NME7 종에 상응한다.
도 10a 내지 10b는, NME7의 존재 여부를 알아보기 위해, 마우스 모노클로날 항체(a) 또는 N-말단 DM10 서열만 인지하는 또 다른 모노클로날 항체(b)를 사용하여 탐침된 다양한 세포 파쇄물 및 상응하는 조건화된 배지의 웨스턴 블롯 사진을 도시한 것이다. 세포의 조건화된 배지 유래의 검체에서 약 33 kDa의 NME7 종에 DM10 특이적인 항체가 결합하지 않는 것은, NME7의 분비된 형태가 N-말단 DM10 리더 서열 모두는 아니라도 대부분을 포함하지 않는다는 것을 의미한다.
도 11은 과도기(traditional) 배지 또는 NME7을 포함하는 배지에서 배양한 후, T47D 암세포에 대한 줄기세포 마커 및 암 줄기세포 마커에 대한 유전자 발현을 RT-PCR로 측정한 그래프로서, 여기서, 비-부착성으로 되었던 세포(부유 세포(floater))는 부착된 상태로 존재하는 세포와 별도로 분석되었다.
도 12는 T47D 암세포에 대한 줄기세포 마커 SOX2 및 암 줄기세포 마커 CXCR4에 대한 유전자 발현을 RT-PCR로 측정한 그래프이다. 세포는 과도기 배지, 또는 NME1 이량체 또는 NME7(NME7-AB)을 포함하는 배지에서 배양하였다. 개별적으로 분석된 세포 유형은 부유 세포, Rho 키나제 저해제가 더해진 세포(+Ri)(모든 세포를 부착성으로 만들었음), 또는 rho 키나제 저해제의 부재하에(-Ri) 존재했던 부유 세포를 제거한 후 부착된 채로 존재하는 세포였다.
도 13은 DU145 전립선암 세포에 대한 다양한 줄기세포 및 추정상 암 줄기세포 마커에 대한 유전자 발현을 RT-PCR로 측정한 그래프이다. 세포는 과도기 배지, 또는 NME1 이량체("NM23") 또는 NME7(NME7-AB)을 포함하는 배지에서 배양하였다. 계대배양 2회째에, 세포는 부착된 채로 존재하였기 때문에, Rho 키나제 저해제는 사용되지 않았다.
도 14a 내지 도 14b는 전이 마커 및 전분화능 줄기세포 마커의 RT-PCR 측정 그래프이며, 이는, (a) 줄기세포를 보다 네이브(naive)한 상태로 역전시키는 것으로 이전에 나타난 2i 저해제(GSK3-베타 및 MEK 저해제), 또는 (b) 인간 NME1 또는 인간 NME7에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 박테리아 NME가 또한, 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킴을 보여준다.
도 15는 인간 NME1과 인간 NME7-A 또는 인간 NME7-B 영역 간의 서열 정렬이다.
도 16은 NME1과 서열 동일성이 낮으며 암의 치료 또는 예방을 위해 치료용 항-NME7 항체를 생성하는 능력에 대해 선택된, 인간 NME7의 면역원성 펩타이드들의 목록이다.
도 17은 암의 치료 또는 예방을 위해 치료용 항-NME7 항체를 생성하는 능력에 대해 선택된, 구조적 온전성(structural integrity) 또는 MUC1*에의 결합에 중요할 수 있는 인간 NME7의 면역원성 펩타이드의 목록이다.
도 18은 암의 치료 또는 예방을 위해 치료용 항-NME7 항체를 생성하는 능력에 대해 선택되고, 구조적 온전성 또는 MUC1*에의 결합에 중요할 수 있는 인간 NME1의 면역원성 펩타이드의 목록이다.
도 19는 NME1에 대한 낮은 서열 일치성, 및 암에 관여하는 박테리아 NME1 단백질에 대한 상동성에 대해 선택된 인간 NME7 유래의 면역원성 펩타이드를 열거하고 있다. 이들 펩타이드는 암의 치료 또는 예방을 위한 치료용 항-NME7 항체를 생성하는 능력 면에서 바람직하다. 이 도면에서 도시된 펩타이드는 C-말단에 공유 결합된 시스테인을 포함하고 첨가한다.
도 20은, 처음에 NME7-AB에서 7일 동안 성장되었던 오로지 50개의 인간 유방암 세포를 이종 이식받았으며, CXCR4, CHD1 및 줄기세포 마커의 크게 증가된 발현을 보인 24마리 중 2마리의 암컷 무흉선 nu/nu 마우스의 사진을 보여준다. 또한, 마우스의 절반에게 인간 재조합 NME7-AB를 매일 주사하였다. NME7-AB를 매일 주사받은 마우스 중 82%에서, 주사 위치에서 종양이 발병되었을 뿐만 아니라 원거리 전이가 발병되었다.
도 21은 인간 NME7-AB를 함유하는 배지에서 예비-배양에 의해 보다 전이성 상태로 변환된 암세포를 마우스에게 이종 이식한 실험 결과를 표로 보여준다.
도 22a는 50개, 100개, 1,000개 또는 10,000개 세포를 옆구리에 피하 이식한 면역-약화된 nu/nu 암컷 마우스의 4개 그룹에 대한 종양 부피 측정 그래프를 보여주며, 이식된 세포는 재조합 인간 NME7-AB에서 7일 동안 배양된 인간 MUC1-양성 유방암 세포였으며, '부유 세포'를 수집하고, 전이 수용체 CXCR4를 100배 넘게 과발현하는지 입증하였다. 각각의 그룹의 마우스 중 절반에게 인간 재조합 NME7-AB를 매일 주사하였다. 그래프 내의 숫자는 마우스 추적 번호를 지칭한다. 'M'은 다중 종양(multiple tumor)을 가진 마우스를 나타낸다.
도 22b는 50개, 100개, 1,000개 또는 10,000개 세포를 옆구리에 피하 이식한 면역-약화된 nu/nu 암컷 마우스의 4개 그룹에 대한 종양 부피 측정 그래프를 보여주며, 이식된 세포는 재조합 인간 NME7-AB에서 7일 동안 배양된 인간 MUC1-양성 유방암 세포였으며, '부유 세포'를 수집하고, 전이 수용체 CXCR4를 100배 넘게 과발현하는지 입증하였다. 각각의 그룹의 마우스 중 절반에게 인간 재조합 NME7-AB를 매일 주사하였다. NME7-AB를 매일 주사받은 마우스 중에서, 80%에서 다중 종양이 발병되었다. 이 그래프는 동일한 마우스에서 다중 종양의 조합된 부피를 보여준다. 그래프 내의 숫자는 마우스 추적 번호를 지칭한다. 'M'은 다중 종양을 가진 마우스를 나타낸다.
도 23은 인간 NME7-AB를 함유하는 배지에서 예비-배양에 의해 보다 전이성 상태로 변환된 인간 유방암 세포를 이종 이식한 마우스에서 원발성 종양뿐만 아니라 원거리 혹(bump)의 웨스턴 블롯을 보여준다. 웨스턴 블롯은, VU4H5 항체가 뮤린(murine)이 아닌 인간 MUC1만 염색시키기 때문에, 원거리 혹이 인간 유방 종양이었음을 보여준다.
도 24는 인간 NME7-AB를 함유하는 배지에서 예비-배양에 의해 보다 전이성 상태로 변환된 인간 유방암 세포를 이종 이식한 마우스에서 원발성 종양의 웨스턴 블롯을 보여준다. 웨스턴 블롯은, VU4H5 항체가 뮤린이 아닌 인간 MUC1만 염색시키기 때문에, 가시적인 혹이 인간 유방 종양임을 보여준다.
도 25는 인간 NME7-AB를 함유하는 배지에서 예비-배양에 의해 보다 전이성 상태로 변환된 인간 유방암 세포를 이종 이식한 마우스에서 수집된 기관의 웨스턴 블롯을 보여준다. 웨스턴 블롯은, 원거리 종양을 가지는 것으로 보이지 않은 일부 마우스가 이들의 기관들 중 일부에 인간 MUC1-양성 암을 가짐을 보여준다.
도 26의 A 내지 K는, NME7-AB(A) 또는 NME1(B)이 플레이트에 흡착되고, NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3에 의해 생성된 항-NME7 항체가 NME1이 아닌 NME7에의 결합 능력에 대해 시험되는 ELISA 분석법의 그래프를 보여준다. C20은 항-NME1 항체이다.
도 27은, 생성된 항-NME7 항체가 NME1의 결합을 저해하는 것이 아닌, MUC1* 펩타이드가 고정된 표면로의 NME7-AB의 결합을 저해하는 능력에 대해 시험되는 ELISA 분석법의 그래프를 보여준다.
도 28은, 유방암 세포를 NME7 항체, 또는 항체를 생성하거나 선택하는 데 사용된 NME7 유래의 짧은 펩타이드의 존재 또는 부재 하에 성장시킨 암세포 성장 실험의 그래프를 보여준다. 또한, 아미노산 100-376의 거의 전체 NME7-AB 펩타이드를 사용한 고정화에 의해 생성된 항체는 암세포 성장을 저해하는 것으로 나타났다.
도 29는 유방암 세포를 NME7 항체들의 조합, 또는 항체를 생성하거나 선택하는 데 사용된 NME7 유래의 짧은 펩타이드들의 조합의 존재 또는 부재 하에 성장시킨 암세포 성장 실험의 그래프를 보여준다. 두 항체들뿐만 아니라 이들의 면역화 NME7-AB 펩타이드들은 암세포의 성장을 저해하였다.
도 30은 암세포를 NME7-AB 또는 2i 저해제에서 성장시켰을 때, 과학자들의 관찰 결과의 표를 보여주며, 이 둘 모두는 NME7 유래의 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3의 존재 또는 부재 하에 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킬 수 있다. NME7-AB 펩타이드는 부착성 암세포가 부유 세포로 변이되는 것을 저해하였으며, RT-PCR 측정은 전이 마커, 특히 CXCR4의 발현 증가를 보여준다.
도 31a 내지 도 31c는 NME7-AB 또는 2i 저해제에서 성장시켰으며 각각 암세포를 보다 전이성 상태로 변환한 T47D 유방암 세포에서의 CXCR4 발현에 대한 RT-PCR 측정, 및 전이성 변환에 미치는 항-NME7 항체의 저해 효과의 그래프를 보여준다(a). 2i 저해제에서 72시간 또는 144시간 동안 성장시킨 T47D 유방암 세포에서 CXCR4, CHD1 및 SOX2 발현에 대한 RT-PCR 측정 그래프는, NME7-AB 면역화 펩타이드 자체가 전이성 변환에 대해 저해성임을 보여준다. 파트 (a)에서 저해성 콤보 2 및 3에 사용된 펩타이드 A1, A2 및 B1 또한, 펩타이드로서 저해성이다. 펩타이드 B3는 가장 저해성이며, 파트 (a)에서 시험된 가장 저해성인 항체였던 항체 61에 대한 면역화 펩타이드이다. 파트 (c)에서, 파트 (b)의 그래프의 Y-축의 규모는 감소된다.
도 32는 도 31에서 CXCR4의 RT-PCR 측정에 사용된 검체에서의 RNA 수준뿐만 아니라 CXCR4 발현 및 대조군 하우스키핑 유전자에 대한 역치 사이클 수를 기록한 표를 보여준다.
도 33은 인간 줄기세포 및 암세포의 패널에서 NME7-X1의 발현에 대한 RT-PCR 측정의 그래프를 보여준다.
도 34는 인간 줄기세포 및 암세포의 패널에서 NME7, NME7a, NME7b 및 NME7-X1의 발현에 대한 RT-PCR 측정의 그래프를 보여준다. NME7a는 전장 NME7이며, NME7b는 DM10 도메인의 작은 부분을 포함하지 않으며, NME7-X1은 DM10 도메인의 모든 부분 및 처음 NDPK A 도메인의 N-말단의 작은 부분을 포함하지 않고 있다. NME7으로 표지된 막대는, 프라이머가 NME7a 및 NME7b 둘 모두를 검출하는 데 사용되었음을 의미한다.
도 35의 A 내지 C는 다양한 암세포주들이 NME7 유래의 짧은 펩타이드로 면역화시킴으로써 생성된 항체를 사용하여 NME7 종의 발현에 대해 탐침되는 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다.
도 36의 A 내지 B는 다양한 암세포주들이 상업적으로 입수가능한 항체를 사용하여 NME7 종의 발현에 대해 탐침되는 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다.
도 37a 내지 도 37c는 표준 배지와 비교하여, NME7-AB를 함유하는 무혈청 배지에서 배양된 후, 암세포에서 전이 마커의 RT-PCR 측정 그래프를 보여준다. a) MUC1-양성 난소 암세포주인 SK-OV3는 전이 마커 CXCR4, CDH1, 즉, E-캐드헤린, SOX2 및 NME7-X1의 발현을 증가시켰으며; b) MUC1-음성 난소 암세포주인 OV-90은 전이 마커 CXCR4 및 NME7-X1의 발현을 증가시켰고; c) MUC1을 최소의 수준으로 발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB는 전이 마커 CDH1, 즉, E-캐드헤린 및 SOX2의 발현을 증가시켰다.
도 38a 내지 도 38b는 웨스턴 블롯 사진 및 암 성장 그래프를 보여준다. A) 다양한 암세포주들을 항-탠덤 반복 항체 VU4H5를 사용하여 전장 MUC1의 발현에 대해 탐침한다. B) 다양한 암세포주들을 항-PSMGFR 항체를 사용하여 절단된 형태의 MUC1*의 발현에 대해 탐침한다. C) 다양한 암세포주들을 상업적으로 입수가능한 항-NME7 항체 B9를 사용하여 NME7 종의 발현에 대해 탐침하며, 이는, 전장 NME7뿐만 아니라, 33 kDa 종 및 30 kDa 종이 자연 발생 NME7-AB-유사 종뿐만 아니라 NME7-X1과 일치함을 보여준다. D) HER2 양성 BT-474 유방암 세포는, 화학치료 약물에 대한 내성을 획득하고 전이될 때까지, MUC1 또는 MUC1*을 거의 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않는다. 부모 세포는, 이 세포를 아치사(sub-lethal) 수준의 약물에서 세포를 배양함으로써, 허셉틴, 택솔, 독소루비신 및 사이클로포스파미드에 내성이 되게 만들었다. 파트 (D)는, HER2의 발현 수준은 변하지 않았으나, MUC1*의 발현은 급격하게 증가되었음을 보여준다. E)는 항-MUC1* Fab의 존재 또는 부재 하에 허셉틴을 이용한 치료에 반응하여 부모 BT-474 세포의 성장을 약물 내성 전이성 세포와 비교한 그래프를 보여준다. F)는 항-MUC1* Fab의 존재 또는 부재 하에 택솔을 이용한 치료에 반응하여 부모 BT-474 세포의 성장을 약물 내성 전이성 세포와 비교한 그래프를 보여준다.
도 39의 A 내지 E는 공동-면역침전 실험의 웨스턴 블롯 사진을 보여준다. T47D 유방암 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동-면역침전시켰다. 겔을 2개의 상이한 상업적으로 입수가능한 항-NME7 항체 B9(A) 및 CF7(B)으로 블로팅하였다. 두 겔 모두는 약 33 kDa 및 약 30 kDa에서 독특한 NME7 밴드를 보여준다. 겔을 스트리핑(stripping)하고, MUC1*의 세포외 도메인에 대한 항체인 항-PSMGFR(C) 및 (D)로 재탐침하였으며, 이는, NME7 종과 MUC1*이 상호작용함을 보여준다. 재조합 NME7-AB 및 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔 상에서 러닝시킨 다음, 항-NME7 항체로 탐침하였으며, 이는, 유방암 세포에서 자연 발생하며 MUC1*과 상호작용하는 2개의 독특한 NME7 종이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 보여준다(E).
도 40의 A 내지 C는 공동-면역침전 실험의 웨스턴 블롯 사진을 보여준다. 인간 유도 전분화능 줄기세포, iPS7 또는 배아 줄기세포 HES3 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동-면역침전시켰다. 겔을 상업적으로 입수가능한 항-NME7 항체 B9(A)로 블로팅하였다. 두 세포 유형 모두는 약 33 kDa 및 약 30 kDa에서 독특한 NME7 밴드를 보여준다. 겔을 스트리핑하고, MUC1*의 세포외 도메인에 대한 항체인 항-PSMGFR(B)로 재탐침하였으며, 이는, NME7 종과 MUC1*이 상호작용함을 보여준다. 재조합 NME7-AB 및 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔 상에서 러닝시킨 다음, 항-NME7 항체로 탐침하였으며, 이는, 유방암 세포에서 자연 발생하며 MUC1*과 상호작용하는 2개의 독특한 NME7 종이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 보여준다(C).
정의
본 출원에서, 단수형("a" 및 "an")은 단일 물체 및 복수의 물체 둘 모두를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약" 또는 "실질적으로"는 일반적으로, 정확한 수로 한정되지 않는 재량을 제공한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 서열의 길이에 대한 맥락에서 사용된 바와 같이, "약" 또는 "실질적으로"는, 폴리펩타이드가 언급된 수의 아미노산으로 제한되지 않아야 함을 가리킨다. N-말단 또는 C-말단에 첨가되거나 제거된 몇몇 아미노산은, 이의 결합 활성과 같은 기능적 활성이 존재하는 한, 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상 추가적인 치료제"와 조합한" 투여는 동시(수반되는) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연 발생적인 L-α-아미노산을 지칭한다. 이러한 정의는 노르루신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로, 용어 "아미노산 서열 변이체"는 참조(예, 본래의(native) 서열) 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 서열이 약간 차이나는 분자를 지칭한다. 아미노산 변경은 본래의 아미노산 서열에서의 치환, 삽입, 결실 또는 이러한 변화들의 임의의 바람직한 조합일 수 있다.
치환 변이체는, 본래의 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 동일한 위치에서 이의 자리에 상이한 아미노산이 삽입된 것이다. 치환은 분자에서 오로지 하나의 아미노산만 치환된 단일 치환일 수 있거나, 동일한 분자에서 2개 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수 있다.
서열 내에서의 아미노산에 대한 치환기는, 아미노산이 속한 부류의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 극성 중성 아미노산으로는, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양전하성(염기성) 아미노산으로는, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 있다. 음전하성(산성) 아미노산으로는, 아스파트르산 및 글루탐산이 있다. 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질, 단편 또는 이들의 유도체, 및 번역 동안이나 번역 후에 예를 들어 글리코실화, 단백질용해성 절단, 항체 분자 또는 다른 세포성 리간드에의 연결 등에 의해 상이하게 변형되는 유도체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
삽입 변이체는, 본래의 아미노산 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산에 바로 인접하여 하나 이상의 아미노산이 삽입된 것이다. 아미노산에 바로 인접해 있다는 것은, 아미노산의 α-카르복시 또는 α-아미노 관능기에 연결됨을 의미한다.
결실 변이체는, 본래의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 본래, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "단편" 또는 "기능적 유도체"는 본 발명의 폴리펩타이드의 생물학적 활성 아미노산 서열 변이체 및 단편, 뿐만 아니라 유기 유도체화제와의 반응, 번역-후 변형, 비-단백질성 중합체를 가진 유도체, 및 면역어드헤신(immunoadhesin)을 포함하여 공유 변형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "담체"는, 이용되는 용량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유류에 무독성인 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 약제학적으로 허용가능한 담체는 pH 완충 수용액이다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예로는 비제한적으로, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량(잔기가 약 10개 미만인) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN®, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS® 등이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"로는, 임의의 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등이 있다. 약제학적 활성 성분에 대한 이러한 배지 및 작용제의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 작용제가 활성 성분과 비융화성인 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보조적인 활성 성분 또한, 조성물 내로 혼입될 수 있다.
특히, 투여의 용이성 및 투약의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이, 투약 단위 형태는 치료받아야 할 포유류 피험자를 위한 일원화된 용량으로서 적합화된 물리적 개별 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 연관된 요망되는 치료 효과를 발휘하도록 계산된 활성 물질을 예정된 양으로 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 설명은 (a) 활성 물질의 독특한 특징 및 달성되어야 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 신체적 건강이 손상된 질환 병태를 가진 살아 있는 피험자에서 질환의 치료를 위한 활성 물질과 같은 컴파운딩(compounding) 분야에 내재하는 한계에 의해 나타나며 이들에 따라 직접 달라진다.
기본적인 활성 성분은 편리하고 효과적인 투여를 위해 유효량으로, 투약 단위 형태에서 약제학적으로 허용가능한 적합한 담체와 함께 컴파운딩된다. 단위 투약 형태는 예를 들어, 기본적인 활성 화합물을 0.5 ㎍ 내지 약 2000 mg 범위의 양으로 함유할 수 있다. 비율로서 표현하자면, 활성 화합물은 일반적으로 담체의 약 0.5 ㎍/ml로 존재한다. 보조 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투약량은 상기 성분의 통상적인 용량 및 투여 방식을 참조로 하여 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터", "폴리뉴클레오타이드 벡터", "구축물" 및 "폴리뉴클레오타이드 구축물"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 벡터는 RNA, DNA, 레트로바이러스 코트에 캡슐화된 RNA, 아데노바이러스 코트에 캡슐화된 DNA, 또 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 형태(예, 헤르페스 심플렉스, 및 아데노-구조물, 예컨대 폴리아미드)에 패킹된 DNA를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 몇몇 형태들 중 임의의 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 본 발명의 벡터의 수여자일 수 있거나 수여자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 본질적으로는, 자연적, 우연적 또는 고의적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 오리지널 부모 세포와 (형태 또는 총 DNA 보체의 면에서) 완전히 일치하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "피험자"는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료를 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장용 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등을 비롯하여 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 유익하거나 요망되는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적에 있어서, 유익하거나 요망되는 임상 결과로는, 검출 가능하거나 검출 불가능하든 간에, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 (부분적이거나 전체적이든지 간에) 차도 등이 있다. "치료"는 또한, 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존율과 비교하여, 생존율을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 개체로는, 이미 장애를 앓고 있는 개체뿐만 아니라 장애가 방지되어야 하는 개체가 있다. 질환의 "경감"은, 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상 징후가 줄어들고/거나 진행 시간이 치료를 받지 않는 상황과 비교하여 서행되거나 길어지는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "A1" 펩타이드, "A2" 펩타이드, "B1" 펩타이드, "B2" 펩타이드 및 "B3" 펩타이드는 인간 NME1에 결합하지 않으나(또는 상당히 적게 결합하나) 인간 NME7-AB에 결합하는 펩타이드를 지칭한다. 이들 항체를 생성하는 데 사용되는 펩타이드는 NME7-AB 및 NME7-X1 둘 모두에 보편적이며, 하기에 나타나 있다.
A1은 NME7A 펩타이드 1(A 도메인): MLSRKEALDFHVDHQS(서열 번호:141)이다.
A2는 NME7A 펩타이드 2(A 도메인): SGVARTDASES(서열 번호:142)이다.
B1은 NME7B 펩타이드 1(B 도메인): DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(서열 번호:143)이다.
B2는 NME7B 펩타이드 2(B 도메인): EVYKGVVTEYHDMVTE(서열 번호:144)이다.
B3는 NME7B 펩타이드 3(B 도메인): AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(서열 번호:145)이다.
나아가, 명료히 하기 위해, NME7A(대문자 "A")는 NME7의 하위단위 A 부분을 지칭한다. NME7a(소문자 "a")는 본 출원 어디에서든지 기술되는 전장 NME7을 지칭한다. 또한, NME7B(대문자 "B")는 NME7의 하위단위 B 부분을 지칭한다. NME7b(소문자 "b")는 본 출원 어디에서든지 기술되며, DM10 영역을 부분적으로 포함하지 않는 NME7의 화학종을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-유사"는, 항체의 일부를 포함하지만 자연상에서 자연적으로 존재하는 항체는 아닌 방식으로 조작될 수 있는 분자를 의미한다. 예로는, CAR(키메라 항원 수용체) T 세포 기술 및 Ylanthia® 기술 등이 있지만, 이들로 한정되지 않는다. CAR 기술은 T 세포의 일부에 융합된 항체 에피토프를 사용하여, 신체의 면역계가 특이적인 표적 단백질 또는 세포를 공격하도록 한다. Ylanthia® 기술은, 이후에, 표적 단백질 유래의 펩타이드 에피토프에 결합하는지 스크리닝되는 합성 인간 fab의 컬렉션인 "항체-유사" 라이브러리로 구성된다. 그런 다음, 선별된 Fab 영역은 스캐폴드 또는 골격 내로 조작되어, 항체를 닮게 될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "NME 패밀리 구성원 단백질을 저해하기 위한 작용제의 유효량"은, 예를 들어, NME 패밀리 구성원 단백질과 이의 동족 수용체 사이의 활성화 상호작용을 방해하는 데 있어서의 작용제의 유효량을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "NME 유래 단편"은, NME의 단편이거나, NME 단편인 펩타이드 서열에 고도로 상동성인 펩타이드 서열을 지칭한다.
본원에서, "MUC1*" 세포외 영역은 주로 PSMGFR 서열 (GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호:6))에 의해 정의된다. MUC1 절단의 정확한 부위는 이를 집는(clip) 효소에 따라 다르고, 절단 효소는 세포 유형, 조직 유형 또는 세포의 진화 시간에 따라 다양하기 때문에, MUC1* 세포외 영역의 정확한 서열은 N-말단에서 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PSMGFR"은 GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호:6)로 표시되는 MUC1 성장 인자 수용체의 일차 서열에 대한 두문자어이다. 이러한 면에서, "N-10 PSMGFR", "N-15 PSMGFR" 또는 "N-20 PSMGFR"에서와 같이 "N-수"는 PSMGFR의 N-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다. 마찬가지로 "C-10 PSMGFR", "C-15 PSMGFR" 또는 "C-20 PSMGFR"에서와 같이 "C-수"는 PSMGFR의 C-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다.
본원에서, "MUC1*의 세포외 영역"은 탠덤 반복 영역을 포함하지 않는 MUC1 단백질의 세포외 부분을 지칭한다. 대부분의 경우, MUC1*은 절단 생성물로서, 여기서, MUC1* 부분은 탠덤 반복부를 포함하지 않는 짧은 세포외 영역, 막관통 영역 및 세포질 꼬리로 구성된다. MUC1이 절단되는 정확한 위치는, MUC1이 하나 초과의 효소에 의해 절단될 수 있는 것으로 보이기 때문에, 아마도 알려져 있지 않다. MUC1*의 세포외 영역은 PSMGFR 서열 대부분을 포함할 것이지만, 부가적인 N-말단 아미노산을 10개 내지 20개로 가질 수 있다.
본원에서, "높은 상동성"은, 임의의 2개의 폴리펩타이드 간의 지정된 중복 영역에서 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 97% 이상의 동일성인 것으로 간주된다.
본원에서, 수가 1 내지 10인 "NME 패밀리 단백질" 또는 "NME 패밀리 멤버 단백질"은, 이들 모두가 적어도 하나의 NDPK(뉴클레오타이드 다이포스페이트 키나제) 영역을 가지기 때문에, 함께 단백질로 분류된다(grouped). 일부 경우, NDPK 영역은, ATP가 ADP로 전환되는 것을 촉매할 수 있다는 점에서, 기능적이지 않다. NME 단백질은 형식상 H1 및 H2로 넘버링되는 NM23 단백질로서 알려져 있었다. 최근, NME 패밀리 구성원 10개가 동정된 바 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 NM23 및 NME는 상호호환가능하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 NME1, NME2, NME5, NME6, NME7, NME8 및 NME9은 본래의 단백질뿐만 아니라 NME 변이체를 지칭하는 데 사용된다. 일부 경우, 이들 변이체는 본래의 서열 단백질보다 용해성이며, E. coli에서 더 잘 발현되거나 또는 더 용해성이다. 예를 들어, 명세서에서 사용되는 바와 같은 NME7은, 본래의 단백질 또는 변이체, 예컨대 변이는 E. coli에서 용해성의 적절하게 접혀진 단백질이 고 수율로 발현되게 할 수 있기 때문에 우수한 상업적인 이용가능성을 가진 NME7-AB를 의미할 수 있다. NME7-AB는 주로 NME7 A 및 NME7 B 도메인으로 이루어지지만, 본래 단백질의 N-말단에 존재하는 DM10 도메인(서열 번호:39)을 대부분 포함하지 않는다. 본원에서 지칭되는 바와 같은 "NME1"은 "NM23-H1"과 상호호환가능하다. 본 발명은 또한, NME 단백질의 정확한 서열에 의해 제한되지 않는 것으로 의도된다. NM23-S120G로도 일컬어지는 돌연변이체 NME1-S120G는 출원 전체에서 상호호환적으로 사용된다. S120G 돌연변이체 및 P96S 돌연변이체는 이들의 이량체 형성 선호도 때문에 바람직하지만, 본원에서 NM23 이량체, NME1 이량체, 이량체성 NME1 또는 이량체성 NM23으로 지칭될 수 있다.
본원에서 지칭되는 바와 같은 NME7은 분자량이 약 42 kDa인 본래의 NME7을 의미하고자 한다.
"NME7 패밀리"는 전장 NME7뿐만 아니라, 분자량이 30 kDa, 33 kDa인 자연 발생적인 절단된 형태 또는 인공적으로 만들어진 절단된 형태, 또는 분자량이 약 25 kDa인 절단된 형태, DM10 리더 서열을 포함하지 않거나 부분적으로 포함하지 않는 변이체, 예컨대 NME7b, NME7-X1, NME7-AB 또는 재조합 NME7 단백질, 또는 효율적인 발현을 허용하도록 변경될 수 있거나 또는 NME7을 보다 효과적이거나 또는 상업적으로 보다 활력이 있도록 만드는 다른 특징, 용해성 또는 수율을 증가시키도록 변경될 수 있는 이의 변이체를 의미하고자 하며, DM10 리더 서열은 서열 번호:82 또는 147로 표시되는 NME7의 NME7 아미노산 1-91이다. "NME7 패밀리"는 또한, 암세포에서 발현되며 30 kDa 내지 33 kDa 범위의 단백질인 "NME7-AB-유사" 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "줄기세포를 네이브 상태로 유지시키거나 프라이밍된(primed) 줄기세포를 네이브 상태로 역전시키는 작용제"는, 단독으로 또는 조합하여, 줄기세포를 네이브 상태로 유지시켜, 세포가 배아의 내부 세포 덩어리를 닮게 만드는 단백질, 작은 분자 또는 핵산을 지칭한다. 예로는, 인간 NME 단백질, 특히 NME1, NME7, NME7-X1, NME7-AB, NME6, 2i(Silva J et al, 2008; Hanna et al, 2010), 5i(Theunissen TW et al, 2014), 핵산, 예컨대 MBD3, CHD4(Rais Y1 et al, 2013), BRD4 또는 JMJD6(Liu W et al 2013)의 발현을 억제시키는 siRNA에 높은 서열 일치성을 가진 인간 NME1 이량체, 박테리아, 균류, 효모, 바이러스 또는 기생충 NME 단백질 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "전분화능을 촉진하는 작용제" 또는 "체세포를 줄기-유사 또는 암-유사 상태로 역전시키는 작용제"는, 단독으로 또는 조합하여, 유전적 시그니처가 줄기세포 또는 암세포를 보다 근접하게 닮은 시그니처로 시프트되도록 소정의 유전자의 발현을 유도하거나 발현을 억제하는 단백질, 작은 분자 또는 핵산을 지칭한다. 예로는, NME1 이량체, NME7, NME7-X1, NME7-AB, 2i, 5i, 핵산, 예컨대 MBD3, CHD4, BRD4 또는 JMJD6의 발현을 억제하는 siRNA, 인간 NME1, NME2, NME5, NME6, NME7, NME8 또는 NME9, 바람직하게는 NDPK 도메인을 가진(house) 영역에 대해 높은 서열 상동성을 가진 미생물 NME 단백질 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, "작은 분자"로 지칭되는 제제에 관하여, 이는 분자량이 50 Da 내지 2000 Da, 보다 바람직하게는 150 Da 내지 1000 Da, 보다 더 바람직하게는 200 Da 내지 750 Da인 합성 화학적 또는 화학적으로 기재된(based) 분자일 수 있다.
본원에서, "천연 생성물"로 지칭되는 제제에 관하여, 이는 분자가 자연상에 존재하는 한, 화학적 분자 또는 생물학적 분자일 수 있다.
본원에서, FGF, FGF-2 또는 bFGF는 섬유아세포 성장 인자를 지칭한다(Xu RH et al, 2005; Xu C et al, 2005).
본원에서, "Rho 연관 키나제 저해제"는 작은 분자, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다(Rath N, et al, 2012). Rho 키나제 저해제는 본원 및 다른 어디에서도 ROCi 또는 ROCKi 또는 Ri로 약칭된다. 특이적인 rho 키나제 저해제의 사용은 예시적인 것으로 의미되며, 임의의 다른 rho 키나제 저해제를 대체할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암 줄기세포" 또는 "종양 개시 세포"는, 보다 전이적인 상태 또는 보다 공격적인 암과 관련된 유전자의 수준을 발현하는 암세포를 지칭한다. 용어 "암 줄기세포" 또는 "종양 개시 세포"는 또한, 동물에게 이식되는 경우 종양을 발생시키는 데 있어서 훨씬 더 적은 수의 세포가 필요한 암세포를 지칭할 수 있다. 암 줄기세포 및 종양 개시 세포는 종종 화학치료 약물에 내성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기/암", "암-유사", "줄기-유사"는, 세포가 줄기세포 또는 암세포의 특징을 획득하며, 줄기세포, 암세포 또는 암 줄기세포의 유전자 발현 프로파일의 중요한 요소들을 공유하는 상태를 지칭한다. 줄기-유사 세포는, 덜 성숙한 상태로의 유도를 수행하고 있는, 예컨대 전분화능 유전자의 발현을 증가시키는 체세포일 수 있다. 줄기-유사 세포는 또한, 일부 탈분화를 수행하였거나, 또는 이들이 이들의 말기 분화를 변경할 수 있는 준-안정 상태에 있는 세포를 지칭한다. 암-유사 세포는 아직까지는 완전히 특징화되지 않았지만 암세포의 형태 및 특징을 나타내는, 예컨대 부착-비의존적으로 성장할 수 있거나 또는 동물에서 종양을 발생시킬 수 있는 암세포일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 길이가 서로 다른 "스페이서" 또는 "링커"는 펩타이드 내 어디에서든지 혼입될 수 있다. 스페이서 부착은 통상 아미드 연결을 통해 이루어지지만, 다른 관능기들도 가능하다.
NME, NME7 및 단백질 NME7 패밀리
본 발명자들은, NME7이 초기 인간 줄기세포 및 또한 대부분의 암세포에서 고도로 발현됨을 발견하였다(도 1, 2, 3, 35, 36, 38, 39 및 40 및 실시예 2, 3 및 4). 나아가, 본 발명자들은, NM23-H1과 유사하게, NME7이 줄기세포 및 암세포 둘 모두 상에 존재하는 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하여 수용체를 이량체화한다고 언급하였다. 도 15는 NME1과 NME7 A 및 NME7 B 도메인의 서열 정렬을 보여준다.
본 발명자들은 최근, NME7이 매우 초기의 배아 줄기세포에서 발현되는 원시 형태의 NME1(NM23-H1)임을 발견하였다. NME7은 성인 조직에서는 전혀 발현되지 않거나, 극도로 낮은 수준을 발현된다. 그러나, 본 발명자들은, NME7이 암성 세포 및 조직에서 높은 수준으로 발현되고, 전이성 암세포 및 조직에서는 심지어 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 발견하였다. 절단된 형태의 NME7은 세포외 수용체에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 분비 형태일 수 있다. 본 발명자들은 전장 NME7, MW 42kDa, 뿐만 아니라 약 33 kDa 및 30 kDa인 NME7 화학종을 검출한다. 33 kDa 화학종 및 30 kDa 화학종은 암세포로부터 분비된다. 웨스턴 블롯은 세포 파쇄물에서 전장 NME7을 검출하지만, 이들의 조건화된 배지에서는 더 작은 30 kDa 내지 33 kDa NME7 화학종을 검출한다(도 9 및 도 10). NME7을 인지하는 항체 또는 오로지 DM10 도메인만 인지하는 항체를 사용하여 탐침된 웨스턴 블롯은, 조건화된 배지 내로 분비되는 보다 낮은 분자량의 NME7 화학종이 DM10 도메인을 포함하지 않음을 보여준다(도 10). 이들 데이터는, 자연 발생 NME7 화학종이 본 발명자들이 생성한 재조합 NME7-AB와 거의 동일한 분자량을 가지며, 둘 모두가 분비되고, 둘 모두가 단백질을 세포 내에서 보유시킬 수 있는 DM10 도메인의 91개 아미노산을 포함하지 않기 때문에, 자연 발생 NME7 화학종과 재조합 NME7-AB가 유사하다는 생각과 일치한다.
본 발명자들은 새로운 NME7 아이소폼, NME7-X1을 발견하였고, 또한, 이는 암에서 과발현되며 특히 전립선암에서 과발현됨을 발견하였다(도 33, 34). 분자량이 약 30 kDa인 NME7-X1은 NME7 아미노산 125-376을 포함하는 반면, 본 발명자들이 생성한 분자량이 약 33 kDa인 재조합 NME7-AB는 아미노산 92-376을 스패닝(spanning)하고, 따라서, 33개보다 많은 N-말단 아미노산을 포함한다. NME7b는 아미노산 37-376을 스패닝하고, DM10 도메인의 오로지 37개 아미노산을 포함하지 않으며, 또한 전립선암에서 과발현된다(도 34). 본 발명자들은 인간 재조합 NME7-X1을 생성하였으며, 이는 자연 발생적인 약 33 kDa NME7 화학종보다 바로 아래에서 러닝되며, 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼인 자연 발생 "NME7-AB-유사" 단백질인 것으로 보이는, 암세포에서 분비되는 30 kDa NME7 화학종임을 보여준다.
본 발명자들은 암세포주 패널을 시험하였으며, 암세포주가 NME7, 및 NME7-AB, 예컨대 NME7-AB-유사 단백질 또는 대안적인 아이소폼, 예컨대 NME7-X1과 유사한 절단물(truncation)일 수 있는 보다 낮은 분자량의 화학종을 높은 수준으로 발현함을 확인하였다.
NM23-H1(즉, NME1)은 이량체이어야 하는 반면, NME7은 MUC1* 세포외 도메인에 대해 2개의 결합 부위를 가진 단량체이다. 본 발명자들은 DM10 도메인을 포함하지 않는 재조합 인간 NME7을 생성하였으며, 본 발명자들은 이를 NME7-AB로 칭한다. 도 4의 A 내지 C는 NME7-AB의 크기 배제 크로마토그래피 정제의 용출 프로파일, NME7-AB 피크 분획으로부터의 비-환원성 SDS-PAGE 겔, 및 정제된 NME7-AB의 크기 배제 크로마토그래피의 용출 프로파일을 보여준다. 샌드위치 ELISA 결합 분석법은, 재조합 NME7, NME7-AB가 2개의 PSMGFR 펩타이드에 동시에 결합하며, 여기서, MUC1*의 세포외 도메인이 PSMGFR 서열을 대부분 또는 모두 포함함을 보여준다(도 5, 실시예 6). 나노입자 결합 분석법에서, NME7은 또한, MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분에 결합하여 이를 이량체화할 수 있는 것으로 나타났다.
NME7을 불능화시키거나, NME7과 이의 결합 파트너와의 상호작용을 차단하거나 이의 발현을 억제하는 작용제는 강력한 항암 치료제이다. 이러한 작용제는 항체, 작은 분자 또는 핵산일 수 있다. 이들은 NME7에 직접 작용하거나, NME7 발현을 조절하는 분자, 또는 NME7을 암-촉진 형태로 절단하는 효소에 작용할 수 있다.
본 발명자들은, NM23-H1 이량체와 유사하게, 재조합 NME7-AB 단량체가 임의의 다른 성장 인자, 사이토카인 또는 혈청의 부재 하에 전분화능 인간 줄기세포 성장을 완전히 지지할 수 있었음을 발견하였다. 본질적으로 PSMGFR 서열을 포함하며 줄기세포의 분화를 유도하는 NME7과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 경쟁적으로 저해하는 것은, NME7과 MUC1*의 상호작용이 줄기세포 성장을 촉진하고, 분화를 저해함을 보여준다.
다음, 본 발명자들은, NME7-AB 또한 단독으로 인간 암세포 성장을 완전히 지지할 수 있음을 보여주었다. NME7-AB가 보통의 암세포 성장 배지에 첨가되었을 때, 이는 암세포 성장, 특히 MUC1-양성 및 MUC1*-양성 암세포의 성장을 자극하였다. NME7과 MUC1*의 상호작용을 저해하면, 암세포 성장을 저해하였다. MUC1* 성장 인자 수용체를 항-MUC1* Fab로 차단하면, 암세포 성장을 강력하게 저해하였다. 유사하게는, NME7에 결합하는 항체는 암세포 성장을 저해한다. 항-NME7 항체에 의한 암 성장 저해의 일례는 도 6 내지 도 8 및 실시예 10에 나타나 있다. 이러한 경우, 폴리클로날 항체는 아미노산 100-376을 스패닝하는 NME7의 부분을 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 생성되었다. 그러나, 본 발명자들은, NME7-AB 또는 NME7-X1 유래의 보다 짧은 펩타이드를 면역화함으로써 생성되는 항체 또한, 암 성장을 저해함을 확인하였다. 특히, 이들 항체는 MUC1 및 MUC1*-양성 암의 성장을 저해한다.
NME7은 암 전이를 유발한다
나아가, 본 발명자들은, NME7-AB를 함유하는 최소 배지에서 암세포를 배양하는 것은 광범위하게 다양한 암세포들이 보다 전이성 상태로 변환되도록 유도하였음을 발견하였다. 이러한 유도된 전이성 상태에 대한 증거는 부착성 세포 성장으로부터 비-부착성 세포 성장, 즉, "부유" 세포로의 변화, 및 부유 세포에서 특히 상향조절된 특이적인 전이 마커의 수반되는 상향조절을 포함한다. NME7-AB에서 배양된 후 상향조절되는 이들 전이 마커로는, CXCR4, CHD1, 즉, E-캐드헤린, CD44, 및 전분화능 줄기세포 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF2/4 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. NME7-AB에서 배양된 암세포는 시험 동물 내로 이종 이식되었을 때 급격하게 더 높은 이식률을 가졌으며, 이러한 이식률은 90%를 초과하였다. 또한, 매우 적은 수의 이식된 암세포로도 시험 동물에서 종양이 형성되었으며, 이는, NME7-AB가 이러한 암세포를 전이성 암세포로도 알려진 암 줄기세포로 변환시켰다는 증거이다. 암세포가, 본질적으로 NME7-AB와 동등한 NME7 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼을 만들기 때문에, 본원에 기술된 방법은 NME7-AB를 사용하는 것으로 한정되지 않으며; 다른 NME7 화학종들도 마찬가지로 작용할 수 있었다. 예를 들어, 본 발명자들은 또 다른 NME7 아이소폼, NME7-X1이 암세포에 의해 발현됨을 발견하였다. 이는, X1 아이소폼이 N-말단에 33개의 아미노산을 포함하지 않는다는 점을 제외하고는, 본 발명자들의 재조합 NME7-AB와 일치한다. NME7-X1은 NME7-AB와 유사하게 작용하는 것으로 예상된다. "NME7-AB-유사" 단백질 또한, 암세포에서 검출되었으며, 이는 약 33 Da 화학종이다.
본 발명자들은, 발명자들의 이전 연구가, NME7-AB가 단독으로도 인간 줄기세포를 보다 조기의 네이브 상태로 역전시킬 수 있음을 보여준 것을 주지한다. 본 발명자들은, 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 다른 시약의 존재 하에 암세포를 배양하면, 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킴을 발견하였다. 본 발명자들은, NME7-AB(도 11 및 도 12), "2i" 저해제(도 14a), 인간 NME1 이량체, 또는 인간 NME1 또는 인간 NME7과 높은 서열 상동성을 가진 박테리아 NME1 이량체(도 14b)는 각각 보통의 암세포를 전이성 암세포로 변환시킬 수 있으며, 이들 또한, 암 줄기세포 "CSC" 또는 종양 개시 세포 "TIC"로 칭해진다(도 11 내지 도 14).
2i는, 연구자들이 확인하기에 인간 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 2개의 생화학적 저해제에 주어진 명칭이다. 2i는 MEK 및 GSK3-베타 저해제 PD0325901 및 CHIR99021이며, 이들은 배양 배지에 각각 약 1 mM 및 3 mM의 최종 농도로 첨가된다. NME7-AB 및 NME7-X1은 암세포를 전이성 세포로 변환시키기 위해 최소 배지의 별개의 배치들에 첨가되었을 때, 약 4 nM의 최종 농도로 존재하긴 하지만, 보다 낮은 농도 및 보다 높은 농도들도 약 1 nM 내지 16 nM 의 범위에서 양호하게 작용한다. 인간 NME1 이량체 또는 박테리아 NME1 이량체는 4 nM 내지 32 nM의 최종 농도로 사용되며, 16 nM이 이들 실험에 전형적으로 사용되고, 여기서, 인간 NME는 S120G 돌연변이를 가진다. 야생형을 사용하는 경우, 보다 낮은 농도가 필요할 수 있다. 이들 정확한 농도가 중요한 것은 아니다. NME1 단백질이 이량체이고, 이것이 발생하는 농도 범위는 낮은 나노몰 범위에 존재하며, 그렇더라도, 소정의 돌연변이는 보다 높은 농도에서 이량체로서 유지될 수 있게 하는 것이 중요하다. 유사하게는, NME7 단백질의 농도는 다양할 수 있다. NME7-AB 및 NME7-X1은 단량체이고, 암세포를 전이성 세포로 변환시키는 데 사용된 농도는 단백질을 단량체로 유지시킬 수 있어야 한다.
NME7, NME7-AB, NME7-X1, 및 2i 저해제 MEKi 및 GSK3i 외에도, 다른 시약 및 저해제들이 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 것으로 나타났다. 이들 저해제, "i들"로는, JNKi, p38i, PKCi, ROCKi, BMPi, BRAFi, SRCi 뿐만 아니라 성장 활성화 인자 LIF(Gafni et al 2013, Chan et al 2013, Valamehr et al 2014, Ware et al 2014, Theunissen et al 2014) 등이 있다. 이들 시약은 또한, 암세포를 보다 전이성 상태로 진행시키는 데 사용될 수 있다. 그런 다음, 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 임의의 단일 인자, 또는 저해제 또는 성장 인자들의 조합을 사용하여 보다 전이성 상태로 변환시키도록 유도되었던 세포는 암 전이를 치료하거나 예방하기 위한 약물을 확인하거나 시험하는 디스커버리 툴로서 사용될 수 있다.
다양한 분자 마커는 전이성 암세포의 지표로서 제안되었다. 서로 다른 유형의 암들은, 상향조절되는 서로 다른 분자들을 가질 수 있다. 예를 들어, 수용체 CXCR4는 전이성 유방암에서 상향조절되며, 한편, CHD1으로도 알려져 있는 E-캐드헤린은 전이성 전립선암에서 더 상향조절된다. 이들 특이적인 전이 마커 외에도, 전분화능에 대한 전형적인 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF4는 암이 전이성으로 됨에 따라 상향조절된다. 출발 암세포 및 이후의 전이성 암세포는 이들 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 PCR에 의해 분석된다. 본 발명자들은, 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시키는 시약, 예컨대 NME7-AB에 배양된 이들 암세포가 전이 마커 및 전분화능 줄기세포 마커의 발현 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 전이성 암세포로서 작용한다고 언급하였다.
암세포 집단이 전이성인지 아닌지에 대한 기능 시험은, 매우 적은 수, 예를 들어 200개의 세포를 면역-약화된 마우스에 이식하고, 이들 세포가 종양으로 발병되는지 알아보는 것이다. 전형적으로, 면역-약화된 마우스에서 종양을 형성하기 위해서는 5x106 내지 6x106개의 암세포가 필요하다. 본 발명자들은, 50개만큼 적은 수의 NME-유도 전이성 암세포가 마우스에서 종양을 형성하였음을 보여주었다. 또한, 시험 기간 전체 동안에 인간 NME7-AB, NME1 또는 NME7-X1이 주사된 마우스에서 원거리 전이가 발병되었다.
하나의 특정 시험에서, T47D 인간 유방암 세포를 표준 RPMI 배지에서 14일 동안 배양하였으며, 이때, 배지를 48시간마다 교환하였고, 약 75% 포화되었을 때, 트립신처리에 의해 계대배양하였다. 그런 다음, 세포를 6-웰 플레이트 내로 평판배양하고, 4 nM NME7-AB가 보충된 최소 줄기세포 배지(실시예 1 참조)에서 배양하였다. 배지를 48시간마다 교환하였다. 약 제4일까지, 일부 세포는 표면으로부터 탈착되어, 부유 상태로 되었다. "부유 세포"가 전이 마커의 RT-PCR 측정에 의해 입증되는 바와 같이 가장 높은 전이 잠재력을 가진 세포이기 때문에, "부유 세포"를 보유하기 위해 배지를 조심스럽게 교환한다. 제7일 또는 제8일에, 부유 세포를 수집하고, 계수한다. RT-PCR 측정을 위해 검체를 보유시킨다. 측정된 키 마커는 CXCR4이며, 이는 NME7-AB에서 간단히 배양된 후 40배 내지 200배 상향조절된다.
방금 수집된 부유하는 전이성 세포를, 90-일 서방성 에스트로겐 펠렛이 이식되었던 암컷 nu/nu 무흉선 마우스의 옆구리에 이종 이식하였다. 부유 세포를 각각 10,000개, 1,000개, 100개 또는 50개 세포로 이종 이식하였다. 또한, 6마리로 이루어진 각각의 그룹 내의 마우스 중 절반에는 32 nM NME7-AB를 오리지널 이식 부위 근처에서 매일 주사하였다. NME7-AB를 포함하지 않는 RPMI 배지에서 배양된 부모 T47D 세포를 또한, 대조군으로서 6x106개, 10,000개 또는 100개로 마우스에게 이식하였다. NME7-유도 부유 세포를 이식한 마우스는 50개만큼 적은 수의 세포가 이식되었을 때에도 종양이 발병되었다. 부유 세포를 이식하고, NME7-AB를 매일 주사한 마우스에서는 또한, 원거리 종양이 발병되거나 다양한 기관들에서 원거리 전이가 발병되었다(도 20 내지 도 25). NME7-AB에서 배양된 암세포를 이식한 후, 인간 NME7-AB를 주사한 12마리의 마우스 중 11마리, 또는 92%의 마우스에서는 주사 부위에서 종양이 발병되었다. 이식 후 인간 NME7-AB를 주사하지 않은 12마리의 마우스 중 오로지 7마리 또는 58%의 마우스에서만 종양이 발병되었다. 종양을 나타내고, 인간 NME7-AB가 주사된 11마리의 마우스 중 9마리 또는 82%의 마우스에서는, 주사 부위로부터 원거리에서 다중 종양들이 발병되었다. NME7-AB를 주사하지 않은 마우스 중 어떤 마우스에서도 가시적인 다중 종양이 발병되지 않았다.
안락사 후, RT-PCR 및 웨스턴 블롯은, NME7-AB를 주사한 마우스 상의 원거리 혹이 사실상 인간 유방 종양이었음을 보여주었다. 이들 기관에 대한 유사한 분석은, 원거리 혹 외에도, 마우스에서, 이식된 인간 유방암 세포의 인간 유방암 특징이 간 및 폐로 무작위로 전이되었음을 보여주었다. 예상된 바와 같이, 6x106개 세포를 이식한 마우스만 종양을 성장시켰다.
본 발명자들은, 인간 재조합 NME7-AB가 NME7-X1 및 30 kDa 내지 33 kDa NME7 절단 생성물과 크기 및 서열 면에서 유사함을 언급하였다. 본 발명자들은, NME7-AB이 암성 성장을 촉진하고, 암세포로 하여금 종양 개시 세포(TIC)로도 칭해지는 고도로 전이성인 암 줄기세포(CSC) 상태로 가속화되도록 유발함을 보여주었다. 따라서, 본 발명자들은, NME7-X1, 및 DM10 도메인을 제거한 NME7 절단 생성물 또한, 암성 성장을 촉진하고, 암세포로 하여금 종양 개시 세포(TIC)로도 칭해지는 고도로 전이성인 암 줄기세포(CSC) 상태로 가속화되도록 유발한다고 결론 내린다. 일례에서, NME7-AB를 임의의 다른 성장 인자 또는 사이토카인의 부재 하에 혈청-무함유 배지 내의 암세포에 첨가하였다. 7일 내지 10일 이내에, 암세포는 전이성 암세포의 지표인 분자 마커, 예컨대 CXCR4의 발현의 100배 초과의 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 고도로 전이성인 CSC/TIC로 역전되었다. 일례에서, T47D 유방암 세포를 표준 RPMI 배지 또는 최소 줄기세포 배지(실시예 1)에서 배양하였으며, 이 배지에 재조합 NME7-AB를 16 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 10일 후, 세포를 수집하고, CSC의 분자 마커의 발현에 대해 RT-PCR로 분석하였으며, 이러한 발현은 10배 내지 200배만큼 상승되었다(도 11, 도 12). 이는, 본 발명자들이 하나의 유형의 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킨 방법을 보여주는 구체적이며 상세한 예이다. 이러한 방식으로 변환되는 암세포는 광범위하게 존재하며, 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키며 또한 암세포를 보다 전이성 상태로 진행시키는 시약이 광범위하게 존재하며, 첨가되는 시약이 암세포를 변환시키는 농도도 광범위하기 때문에, 본 발명은 이들 상세한 사항에 의해 제한되지 않아야 한다. 다른 유형의 암세포는, 전이 마커의 급격한 상향조절 및 이식된 매우 적은 수의 암세포로부터 종양을 형성하는 능력을 위해서는 NME7-AB에서 보다 장기간 동안 배양될 필요가 있었다. 예를 들어, NME7-AB, 2i, 인간 NME1, 또는 인간 NME1 또는 인간 NME7에 대해 높은 상동성을 가진 박테리아 NME1에서 배양된 전립선암 세포는 2회 내지 3회의 계대배양 후, 전이 마커의 급격한 증가를 보여주었다.
전이 마커 CXCR4는 특히 전이성 유방암 세포에서 상승되는 한편, CHD1은 특히 전이성 전립선암에서 상승된다. 본원에서, 본 발명자들은, 전분화능 줄기세포 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG, KLF2/4 및 TBX3 또한, 암세포가 보다 전이성 세포로 변환될 때 상향조절됨을 보여준다.
DU145 전립선암 세포를 유사하게 배양하였으며, NME7-AB에서 배양된 세포 또한, CSC 마커의 발현의 급격한 증가를 보여주었다(도 13). 전립선암 세포에서, CHD1(즉, E-캐드헤린) 및 CXCR4는 다른 전분화능 줄기세포 마커와 더불어, NME7-AB에서 성장되지 않은 대조군 암세포와 비교하여 상향조절되었다. 난소 암세포, 췌장 암세포 및 흑색종 세포 또한, NME7-AB에서 배양되었으며, 배양 3일 후에 보다 전이성 상태로 변환되었다. 도 37a 내지 도 37b는, 난소 암세포주 SK-OV3, OV-90 및 유방암 세포주 MDA-MB가 모두 부착성 세포를 비-부착성 부유 세포로 변이시켰으며, NME7-AB와 배양한 지 72시간 또는 144시간 후, 전이 마커의 발현을 증가시켰음을 보여준다.
본원에서, 본 발명자들은, NME7-AB가 광범위한 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킴을 보여주었다. 본 발명자들은 또한, 암세포가 재조합 NME7-AB 33 kDa과 대략 동일한 분자량을 가진 자연 발생 화학종을 발현하고(도 33 내지 도 36 및 도 38), 또한 NME7-AB와 유사하게 DM10 도메인을 포함하지 않으며(도 10), 또한 N-말단에 33개의 아미노산이 제거된 점을 제외하고는 NME7-AB와 동일한 서열을 가진 대안적인 아이소폼 NME7-X1 30 kDa을 발현한다고 보여주었다. 공동-면역침전 실험을 T47D 유방암 세포 상에서 수행하였으며, 여기서, 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션하고, 공동-면역침전시켰다. 면역침전된 화학종을 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔을 2개의 서로 다른 상업적으로 입수가능한 항-NME7 항체를 사용하여 블로팅하였다. 2개의 겔 모두 약 33 kDa 및 약 30 kDa에서 독특한 NME7 밴드를 보여준다(도 39A, 도 39B). 겔을 스트리핑하고, MUC1*의 세포외 도메인에 대한 항체인 항-PSMGFR 항체를 사용하여 재프로브하였으며(도 39C, 도 39D), 이는, NME7 화학종 및 MUC1*가 상호작용함을 보여준다. 본 발명자들이 제조한 재조합 NME7-AB 및 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔 상에서 러닝시켰으며, 그런 다음 항-NME7 항체를 사용하여 프로브하였으며, 이는, 유방암 세포에서 자연 발생적이며 MUC1*와 상호작용하는 2개의 독특한 NME7 화학종들이 NME7-AB-유사 화학종 및 NME7-X1임을 보여준다(도 39e). 유사한 실험을 인간 줄기세포에서 수행하였다. 도 40의 A 내지 C는 공동-면역침전 실험의 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다. 인간 유도성 전분화능 줄기세포, iPS7, 배아 줄기세포, HES3, 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션하고, 공동-면역침전시켰다. 겔을 상업적으로 입수가능한 항-NME7 항체 B9를 사용하여 블로팅하였다(a). 2개의 세포 유형은 약 33 kDa 및 약 30 kDa에서 독특한 NME7 밴드를 보여준다. 겔을 스트리핑하고, MUC1*의 세포외 도메인에 대한 항체인 항-PSMGFR 항체를 사용하여 재프로브하였으며(b), 이는 NME7 화학종 및 MUC1*가 상호작용함을 보여준다. 본 발명자들이 제조한 재조합 NME7-AB 및 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔 상에서 러닝시켰으며, 그런 다음 항-NME7 항체를 사용하여 프로브하였으며, 이는, 유방암 세포에서 자연 발생적이며 MUC1*와 상호작용하는 2개의 독특한 NME7 화학종들이 NME7-AB-유사 화학종 및 NME7-X1임을 보여준다(c). NME7-AB가 재조합 단백질이기 때문에, 본 발명자들은 자연 발생 화학종이 1개 내지 15개의 부가적인 엑스트라 아미노산을 함유하거나, 아직까지 동일한 겉보기 분자량으로 러닝되긴 하지만 재조합 NME7-AB보다 1개 내지 15개의 부가적인 아미노산을 포함하지 않을 수 있는지 알지 못한다. "NME7-AB-유사"란, 본 발명자들은, 대략 33 kDa의 겉보기 분자량으로 러닝되는 NME7 화학종이 암세포 성장을 자극할 수 있고, 보다 전이성 상태로의 암세포의 변이를 유도하고, 인간 줄기세포의 전분화능 성장을 전적으로 지지할 수 있다는 점에서, 재조합 NME7-AB가 수행하는 방식으로 작용할 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은, NME7 및 보다 낮은 분자량의 NME7 화학종을 발현하는 암세포주 및 암세포 집단이, CSC 또는 전이성 암세포인 일부 암세포를 함유한다고 결론 내린다. 이들 암은 보다 전이성으로 될 수 있거나, NME7-AB, NME7-X1 또는 보다 낮은 분자량의 NME7 화학종에서 세포를 배양함으로써 전이성 세포 집단을 증가시킬 수 있다. 도 35는 모두가 NME7뿐만 아니라 33 kDa에서 보다 낮은 분자량을 가진 화학종인 NME7-AB-유사 및 30 kDa에서 NME7-X1을 발현하는 암세포 패널의 웨스턴 블롯을 보여준다. 도 38은, 유방암 세포주 T47D, 전립선암 세포주 PC3 및 DU145, 유방암 세포주 BT-474, 둘 모두가 흑색종 세포주인 CHL-1 및 A2058, 및 둘 모두가 췌장 세포주인 CAPAN-2 및 PANC-1이 모두 MUC1, MUC1*, NME7-AB-유사 화학종 및 NME7-X1을 발현함을 보여준다. 도 38a의 A에서, BT0474 세포가 MUC1 또는 MUC1*를 발현하지 않는 것으로 보이지만, 본 발명자들은 이전에(Fessler et al 2009), 이들 HER2 양성 유방암 세포가 화학치료 약물에 대해 내성으로 될 때, 즉, 전이성으로 될 때, 이들 세포는 MUC1*의 발현을 증가시킴으로써 그렇게 수행한다는 것을 보여주었다(도 38b의 D). 항-MUC1* Fab를 사용하여 MUC1* 수용체를 차단하는 것은 허셉틴(도 38의 E), 택솔(도 38b의 F)뿐만 아니라 다른 화학치료제에 대한 이들의 내성을 역전시켰다. NME7 및 보다 낮은 분자량, 예컨대 33 kDa, 30 kDa의 NME7 화학종을 발현하는 이들 유형의 암 및 다른 유형의 암들은 보다 전이성으로 될 수 있거나, NME7-AB, NME7-X1 또는 보다 낮은 분자량의 NME7 화학종에서 세포를 배양함으로써 전이성 세포 집단을 증가시킬 수 있다.
역으로, 이들 암, 및 NME7과 보다 저분자량의 NME7 화학종, 예컨대 33 kDa 또는 30 kDa NME7 화학종을 발현하는 다른 암 유형의 전이 잠재력은 세포를 항-NME7 항체로 치료함으로써 역전될 수 있다. 항-NME7 항체, 또는 NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하는 항체는 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 및 간암을 비롯한 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 본 발명자들이, NME7-AB가 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하고 이를 활성화시킴으로써 NME7-AB의 종양원성 효과를 발휘함을 보여주었기 때문에, 항-NME7 항체는 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 결장직장암, 전립선암, 뇌암, 흑색종, 신장암 및 다른 암 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아닌 임의의 MUC1*-양성 암에 대해 효과적일 것이다. 항-NME7 항체, 항-NME7-AB 항체 또는 항-NME7-X1 항체는, NME7-AB, NME7-AB-유사, NME7-X1 양성 또는 MUC1* 양성인 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다.
효과적인 치료법을 위한 환자 암세포의 시험
NME7-AB, NME7-X1뿐만 아니라 2i, 및 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 다른 시약들 또한, 암세포가 보다 전이성 상태로 변환되도록 유도한다. 이들 시약 중 임의의 하나 또는 조합을 사용한 치료 후, 암세포는 보다 높은 이식률을 가지며, 시험 동물에서 종양을 형성하는 데 있어서 100,000배까지 더 적은 수의 세포를 필요로 한다. 따라서, 본 개시내용에서 언급되는 방법은 환자의 원발성 종양 세포를 시험 동물 내로 이종 이식시킬 수 있는 데 사용될 수 있다.
그런 다음, 후보물질 치료제를 수여자 동물에서 시험할 수 있다. 이러한 방식으로 확인된 효과적인 치료제는 공여자 환자 또는 유사한 암을 가진 다른 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 특정 환자 또는 특정 유형의 암에 효과적인 치료제를 확인하는 방법은, 1) 세포주, 환자, 또는 시험되는 치료제를 투여할 환자로부터 암세포를 수득하는 단계; 2) 암세포를, NME7-AB, NME7-X1, 인간 NME1, 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 상동성을 가진 박테리아 NME1, 2i, 또는 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 것으로 알려진 다른 시약 내에서 배양하는 단계; 3) 생성되는 암세포를, 인간 NME7-AB, NME7-X, 인간 NME1, 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 상동성을 가진 박테리아 NME1, 2i, 또는 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 것으로 알려진 다른 시약 또한 투여될 수 있는 시험 동물에게 이식하거나, 동물은 인간 NME7-AB 또는 NME7-X1에 대한 유전자로 이식되는 단계; 4) 후보물질 항암 치료제를 동물에게 투여하는 단계; 5) 치료제의 효능을 평가하는 단계; 및 6) 효과적인 치료제를 공여자 환자 또는 유사한 암을 가진 또 다른 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
항-NME7 항체
항-NME7 항체는 강력한 항암제이다. NME7은 암세포의 성장을 촉진하며, 암세포가 보다 전이성 상태 또는 보다 공격적인 상태로 진행되는 것을 촉진하는 성장 인자이다. NME7 및 절단된 형태의 NME7은 약 33 kDa 또는 30 kDa이며, 임의의 다른 성장 인자 또는 사이토카인을 포함하지 않는 혈청-무함유 배지에서조차 암 성장을 전적으로 지지하는 것으로 나타났다. 풀-다운 분석법, ELISA 및 나노입자 결합 실험에서, 본 발명자들은, 성장 인자 수용체 MUC1*이 NME7 및 NME7-AB의 결합 파트너임을 보여주었다. 모든 다른 성장 인자 또는 사이토카인을 제거함으로써 이러한 상호작용을 촉진하는 것은 암 줄기세포 마커의 발현을 증가시켰다. 혈청의 존재 하에서조차 NME7에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 사용하여 이러한 상호작용을 차단하는 것은 암세포를 능동적으로 살해하였다. 따라서, 항-NME7 항체 또는 항-NME7-AB 항체는 암 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있는 강력한 항암제이다. 모든 암들 중 75% 초과는 MUC1* 양성이다. MUC1*는 MUC1의 막투과 절단 생성물이며, 여기서, 대부분의 세포외 도메인은 탈락(shed)되었으며, 따라서, 대부분의 PS정의
본 출원에서, 단수형("a" 및 "an")은 단일 물체 및 복수의 물체 둘 모두를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약" 또는 "실질적으로"는 일반적으로, 정확한 수로 한정되지 않는 재량을 제공한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 서열의 길이에 대한 맥락에서 사용된 바와 같이, "약" 또는 "실질적으로"는, 폴리펩타이드가 언급된 수의 아미노산으로 제한되지 않아야 함을 가리킨다. N-말단 또는 C-말단에 첨가되거나 제거된 몇몇 아미노산은, 이의 결합 활성과 같은 기능적 활성이 존재하는 한, 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상 추가적인 치료제"와 조합한" 투여는 동시(수반되는) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연 발생적인 L-α-아미노산을 지칭한다. 이러한 정의는 노르루신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로, 용어 "아미노산 서열 변이체"는 참조(예, 본래의(native) 서열) 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 서열이 약간 차이나는 분자를 지칭한다. 아미노산 변경은 본래의 아미노산 서열에서의 치환, 삽입, 결실 또는 이러한 변화들의 임의의 바람직한 조합일 수 있다.
치환 변이체는, 본래의 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 동일한 위치에서 이의 자리에 상이한 아미노산이 삽입된 것이다. 치환은 분자에서 오로지 하나의 아미노산만 치환된 단일 치환일 수 있거나, 동일한 분자에서 2개 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수 있다.
서열 내에서의 아미노산에 대한 치환기는, 아미노산이 속한 부류의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 극성 중성 아미노산으로는, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양전하성(염기성) 아미노산으로는, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 있다. 음전하성(산성) 아미노산으로는, 아스파트르산 및 글루탐산이 있다. 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질, 단편 또는 이들의 유도체, 및 번역 동안이나 번역 후에 예를 들어 글리코실화, 단백질용해성 절단, 항체 분자 또는 다른 세포성 리간드에의 연결 등에 의해 상이하게 변형되는 유도체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
삽입 변이체는, 본래의 아미노산 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산에 바로 인접하여 하나 이상의 아미노산이 삽입된 것이다. 아미노산에 바로 인접해 있다는 것은, 아미노산의 α-카르복시 또는 α-아미노 관능기에 연결됨을 의미한다.
결실 변이체는, 본래의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 대개, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "단편" 또는 "기능적 유도체"는 본 발명의 폴리펩타이드의 생물학적 활성 아미노산 서열 변이체 및 단편, 뿐만 아니라 유기 유도체화제와의 반응, 번역-후 변형, 비-단백질성 중합체를 가진 유도체, 및 면역어드헤신(immunoadhesin)을 포함하여 공유 변형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "담체"는, 이용되는 용량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유류에 무독성인 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 약제학적으로 허용가능한 담체는 pH 완충 수용액이다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예로는 비제한적으로, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량(잔기가 약 10개 미만인) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN®, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS® 등이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"로는, 임의의 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등이 있다. 약제학적 활성 성분에 대한 이러한 배지 및 작용제의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 작용제가 활성 성분과 비융화성인 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보조적인 활성 성분 또한, 조성물 내로 혼입될 수 있다.
특히, 투여의 용이성 및 투약의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이, 투약 단위 형태는 치료받아야 할 포유류 피험자를 위한 일원화된 용량으로서 적합화된 물리적 개별 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 연관된 요망되는 치료 효과를 발휘하도록 계산된 활성 물질을 예정된 양으로 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 설명은 (a) 활성 물질의 독특한 특징 및 달성되어야 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 신체적 건강이 손상된 질환 병태를 가진 살아 있는 피험자에서 질환의 치료를 위한 활성 물질과 같은 컴파운딩(compounding) 분야에 내재하는 한계에 의해 나타나며 이들에 따라 직접 달라진다.
기본적인 활성 성분은 편리하고 효과적인 투여를 위해 유효량으로, 투약 단위 형태에서 약제학적으로 허용가능한 적합한 담체와 함께 컴파운딩된다. 단위 투약 형태는 예를 들어, 기본적인 활성 화합물을 0.5 ㎍ 내지 약 2000 mg 범위의 양으로 함유할 수 있다. 비율로서 표현하자면, 활성 화합물은 일반적으로 담체의 약 0.5 ㎍/ml로 존재한다. 보조 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투약량은 상기 성분의 통상적인 용량 및 투여 방식을 참조로 하여 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터", "폴리뉴클레오타이드 벡터", "구축물" 및 "폴리뉴클레오타이드 구축물"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 벡터는 RNA, DNA, 레트로바이러스 코트에 캡슐화된 RNA, 아데노바이러스 코트에 캡슐화된 DNA, 또 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 형태(예, 헤르페스 심플렉스, 및 아데노-구조물, 예컨대 폴리아미드)에 패킹된 DNA를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 몇몇 형태들 중 임의의 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 본 발명의 벡터의 수여자일 수 있거나 수여자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 본질적으로는, 자연적, 우연적 또는 고의적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 오리지널 부모 세포와 (형태 또는 총 DNA 보체의 면에서) 완전히 일치하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "피험자"는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료를 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장용 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등을 비롯하여 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 유익하거나 요망되는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적에 있어서, 유익하거나 요망되는 임상 결과로는, 검출 가능하거나 검출 불가능하든 간에, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 (부분적이거나 전체적이든지 간에) 차도 등이 있다. "치료"는 또한, 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존율과 비교하여, 생존율을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 개체로는, 이미 장애를 앓고 있는 개체뿐만 아니라 장애가 방지되어야 하는 개체가 있다. 질환의 "경감"은, 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상 징후가 줄어들고/줄어들거나 진행 시간이 치료를 받지 않는 상황과 비교하여 서행되거나 길어지는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "A1" 펩타이드, "A2" 펩타이드, "B1" 펩타이드, "B2" 펩타이드 및 "B3" 펩타이드는 인간 NME1에 결합하지 않으나(또는 상당히 적게 결합하나) 인간 NME7-AB에 결합하는 펩타이드를 지칭한다. 이들 항체를 생성하는 데 사용되는 펩타이드는 NME7-AB 및 NME7-X1 둘 모두에 보편적이며, 하기에 나타나 있다.
A1은 NME7A 펩타이드 1(A 도메인): MLSRKEALDFHVDHQS(서열 번호:141)이다.
A2는 NME7A 펩타이드 2(A 도메인): SGVARTDASES(서열 번호:142)이다.
B1은 NME7B 펩타이드 1(B 도메인): DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(서열 번호:143)이다.
B2는 NME7B 펩타이드 2(B 도메인): EVYKGVVTEYHDMVTE(서열 번호:144)이다.
B3는 NME7B 펩타이드 3(B 도메인): AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(서열 번호:145)이다.
나아가, 명료히 하기 위해, NME7A(대문자 "A")는 NME7의 서브유닛 A 부분을 지칭한다. NME7a(소문자 "a")는 본 출원 어디에서든지 기술되는 전장 NME7을 지칭한다. 또한, NME7B(대문자 "B")는 NME7의 서브유닛 B 부분을 지칭한다. NME7b(소문자 "b")는 본 출원 어디에서든지 기술되며, DM10 영역을 부분적으로 포함하지 않는 NME7의 종을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-유사"는, 항체의 일부를 포함하지만 자연상에서 자연적으로 존재하는 항체는 아닌 방식으로 조작될 수 있는 분자를 의미한다. 예로는, CAR(키메라 항원 수용체) T 세포 기술 및 Ylanthia® 기술 등이 있지만, 이들로 한정되지 않는다. CAR 기술은 T 세포의 일부에 융합된 항체 에피토프를 사용하여, 신체의 면역계가 특이적인 표적 단백질 또는 세포를 공격하도록 한다. Ylanthia® 기술은, 이후에, 표적 단백질 유래의 펩타이드 에피토프에 결합하는지 스크리닝되는 합성 인간 fab의 컬렉션인 "항체-유사" 라이브러리로 구성된다. 그런 다음, 선별된 Fab 영역은 스캐폴드 또는 골격 내로 조작되어, 항체를 닮게 될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "NME 패밀리 구성원 단백질을 저해하기 위한 작용제의 유효량"은, 예를 들어, NME 패밀리 구성원 단백질과 이의 동족 수용체 사이의 활성화 상호작용을 방해하는 데 있어서의 작용제의 유효량을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "NME 유래 단편"은, NME의 단편이거나, NME 단편인 펩타이드 서열에 고도로 상동성인 펩타이드 서열을 지칭한다.
본원에서, "MUC1*" 세포외 영역은 주로 PSMGFR 서열 (GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호:6))에 의해 정의된다. MUC1 절단의 정확한 부위는 이를 집는(clip) 효소에 따라 다르고, 절단 효소는 세포 유형, 조직 유형 또는 세포의 진화 시간에 따라 다양하기 때문에, MUC1* 세포외 영역의 정확한 서열은 N-말단에서 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PSMGFR"은 GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호:6)로 표시되는 MUC1 성장 인자 수용체의 일차 서열에 대한 두문자어이다. 이러한 면에서, "N-10 PSMGFR", "N-15 PSMGFR" 또는 "N-20 PSMGFR"에서와 같이 "N-수"는 PSMGFR의 N-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다. 마찬가지로 "C-10 PSMGFR", "C-15 PSMGFR" 또는 "C-20 PSMGFR"에서와 같이 "C-수"는 PSMGFR의 C-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다.
본원에서, "MUC1*의 세포외 영역"은 탠덤 반복 영역을 포함하지 않는 MUC1 단백질의 세포외 부분을 지칭한다. 대부분의 경우, MUC1*은 절단 생성물로서, 여기서, MUC1* 부분은 탠덤 반복부를 포함하지 않는 짧은 세포외 영역, 막관통 영역 및 세포질 꼬리로 구성된다. MUC1이 절단되는 정확한 위치는, MUC1이 하나 초과의 효소에 의해 절단될 수 있는 것으로 보이기 때문에, 아마도 알려져 있지 않다. MUC1*의 세포외 영역은 PSMGFR 서열 대부분을 포함할 것이지만, 부가적인 N-말단 아미노산을 10개 내지 20개로 가질 수 있다.
본원에서, "높은 상동성"은, 임의의 2개의 폴리펩타이드 간의 지정된 중복 영역에서 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 97% 이상의 동일성인 것으로 간주된다.
본원에서, 1 내지 10으로 번호가 매겨진 "NME 패밀리 단백질" 또는 "NME 패밀리 멤버 단백질"은, 이들 모두가 적어도 하나의 NDPK(뉴클레오타이드 다이포스페이트 키나제) 영역을 가지기 때문에, 함께 단백질로 분류된다(grouped). 일부 경우, NDPK 영역은, ATP가 ADP로 전환되는 것을 촉매할 수 있다는 점에서, 기능적이지 않다. NME 단백질은 형식상 H1 및 H2로 넘버링되는 NM23 단백질로서 알려져 있었다. 최근, NME 패밀리 구성원 10개가 동정된 바 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 NM23 및 NME는 상호호환가능하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 NME1, NME2, NME5, NME6, NME7, NME8 및 NME9은 본래의 단백질뿐만 아니라 NME 변이체를 지칭하는 데 사용된다. 일부 경우, 이들 변이체는 본래의 서열 단백질보다 용해성이며, E. coli에서 더 잘 발현되거나 또는 더 용해성이다. 예를 들어, 명세서에서 사용되는 바와 같은 NME7은, 본래의 단백질 또는 변이체, 예컨대 변이는 E. coli에서 용해성의 적절하게 접혀진 단백질이 고 수율로 발현되게 할 수 있기 때문에 우수한 상업적인 이용가능성을 가진 NME7-AB를 의미할 수 있다. NME7-AB는 주로 NME7 A 및 NME7 B 도메인으로 이루어지지만, 본래 단백질의 N-말단에 존재하는 DM10 도메인(서열 번호:39)을 대부분 포함하지 않는다. 본원에서 지칭되는 바와 같은 "NME1"은 "NM23-H1"과 상호호환가능하다. 본 발명은 또한, NME 단백질의 정확한 서열에 의해 제한되지 않는 것으로 의도된다. NM23-S120G로도 일컬어지는 돌연변이체 NME1-S120G는 출원 전체에서 상호호환적으로 사용된다. S120G 돌연변이체 및 P96S 돌연변이체는 이들의 이량체 형성 선호도 때문에 바람직하지만, 본원에서 NM23 이량체, NME1 이량체, 이량체성 NME1 또는 이량체성 NM23으로 지칭될 수 있다.
본원에서 지칭되는 바와 같은 NME7은 분자량이 약 42 kDa인 본래의 NME7을 의미하고자 한다.
"NME7 패밀리"는 전장 NME7뿐만 아니라, 분자량이 30 kDa, 33 kDa인 자연 발생적인 절단된 형태 또는 인공적으로 만들어진 절단된 형태, 또는 분자량이 약 25 kDa인 절단된 형태, DM10 리더 서열을 포함하지 않거나 부분적으로 포함하지 않는 변이체, 예컨대 NME7b, NME7-X1, NME7-AB 또는 재조합 NME7 단백질, 또는 효율적인 발현을 허용하도록 변경될 수 있거나 또는 NME7을 보다 효과적이거나 또는 상업적으로 보다 활력이 있도록 만드는 다른 특징, 용해성 또는 수율을 증가시키도록 변경될 수 있는 이의 변이체를 의미하고자 하며, DM10 리더 서열은 서열 번호:82 또는 147로 표시되는 NME7의 NME7 아미노산 1-91이다. "NME7 패밀리"는 또한, 암세포에서 발현되며 30 kDa 내지 33 kDa 범위의 단백질인 "NME7-AB-유사" 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "줄기세포를 네이브 상태로 유지시키거나 프라이밍된(primed) 줄기세포를 네이브 상태로 역전시키는 작용제"는, 단독으로 또는 조합하여, 줄기세포를 네이브 상태로 유지시켜, 세포가 배아의 내부 세포 덩어리를 닮게 만드는 단백질, 소분자 또는 핵산을 지칭한다. 예로는, 인간 NME 단백질, 특히 NME1, NME7, NME7-X1, NME7-AB, NME6, 2i(Silva J et al, 2008; Hanna et al, 2010), 5i(Theunissen TW et al, 2014), 핵산, 예컨대 MBD3, CHD4(Rais Y1 et al, 2013), BRD4 또는 JMJD6(Liu W et al 2013)의 발현을 억제시키는 siRNA에 높은 서열 일치성을 가진 인간 NME1 이량체, 박테리아, 균류, 효모, 바이러스 또는 기생충 NME 단백질 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "전분화능을 촉진하는 작용제" 또는 "체세포를 줄기-유사 또는 암-유사 상태로 역전시키는 작용제"는, 단독으로 또는 조합하여, 유전적 시그니처가 줄기세포 또는 암세포를 보다 근접하게 닮은 시그니처로 시프트되도록 소정의 유전자의 발현을 유도하거나 발현을 억제하는 단백질, 소분자 또는 핵산을 지칭한다. 예로는, NME1 이량체, NME7, NME7-X1, NME7-AB, 2i, 5i, 핵산, 예컨대 MBD3, CHD4, BRD4 또는 JMJD6의 발현을 억제하는 siRNA, 인간 NME1, NME2, NME5, NME6, NME7, NME8 또는 NME9, 바람직하게는 NDPK 도메인을 가진(house) 영역에 대해 높은 서열 상동성을 가진 미생물 NME 단백질 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, "소분자"로 지칭되는 제제에 관하여, 이는 분자량이 50 Da 내지 2000 Da, 보다 바람직하게는 150 Da 내지 1000 Da, 보다 더 바람직하게는 200 Da 내지 750 Da인 합성 화학적 또는 화학적으로 근거하는(based) 분자일 수 있다.
본원에서, "천연 생성물"로 지칭되는 제제에 관하여, 이는 분자가 자연상에 존재하는 한, 화학적 분자 또는 생물학적 분자일 수 있다.
본원에서, FGF, FGF-2 또는 bFGF는 섬유아세포 성장 인자를 지칭한다(Xu RH et al, 2005; Xu C et al, 2005).
본원에서, "Rho 연관 키나제 저해제"는 소분자, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다(Rath N, et al, 2012). Rho 키나제 저해제는 본원 및 다른 어디에서도 ROCi 또는 ROCKi 또는 Ri로 약칭된다. 특이적인 rho 키나제 저해제의 사용은 예시적인 것으로 의미되며, 임의의 다른 rho 키나제 저해제를 대체할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암 줄기세포" 또는 "종양 개시 세포"는, 보다 전이적인 상태 또는 보다 공격적인 암과 관련된 유전자의 수준을 발현하는 암세포를 지칭한다. 용어 "암 줄기세포" 또는 "종양 개시 세포"는 또한, 동물에게 이식되는 경우 종양을 발생시키는 데 있어서 훨씬 더 적은 수의 세포가 필요한 암세포를 지칭할 수 있다. 암 줄기세포 및 종양 개시 세포는 종종 화학치료 약물에 내성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기/암", "암-유사", "줄기-유사"는, 세포가 줄기세포 또는 암세포의 특징을 획득하며, 줄기세포, 암세포 또는 암 줄기세포의 유전자 발현 프로파일의 중요한 요소들을 공유하는 상태를 지칭한다. 줄기-유사 세포는, 덜 성숙한 상태로의 유도를 수행하고 있는, 예컨대 전분화능 유전자의 발현을 증가시키는 체세포일 수 있다. 줄기-유사 세포는 또한, 일부 탈분화를 수행하였거나, 또는 이들이 이들의 말기 분화를 변경할 수 있는 준-안정 상태에 있는 세포를 지칭한다. 암-유사 세포는 아직까지는 완전히 특징화되지 않았지만 암세포의 형태 및 특징을 나타내는, 예컨대 부착-비의존적으로 성장할 수 있거나 또는 동물에서 종양을 발생시킬 수 있는 암세포일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 길이가 서로 다른 "스페이서" 또는 "링커"는 펩타이드 내 어디에서든지 혼입될 수 있다. 스페이서 부착은 통상 아미드 연결을 통해 이루어지지만, 다른 관능기들도 가능하다.
NME, NME7 및 단백질 NME7 패밀리
본 발명자들은, NME7이 초기 인간 줄기세포 및 또한 대부분의 암세포에서 고도로 발현됨을 발견하였다(도 1, 2, 3, 35, 36, 38, 39 및 40 및 실시예 2, 3 및 4). 나아가, 본 발명자들은, NM23-H1과 유사하게, NME7이 줄기세포 및 암세포 둘 모두에 존재하는 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하여 수용체를 이량체화한다고 언급하였다. 도 15는 NME1과 NME7 A 및 NME7 B 도메인의 서열 정렬을 보여준다.
본 발명자들은 최근, NME7이 매우 초기의 배아 줄기세포에서 발현되는 원시 형태의 NME1(NM23-H1)임을 발견하였다. NME7은 성인 조직에서는 전혀 발현되지 않거나, 극도로 낮은 수준을 발현된다. 그러나, 본 발명자들은, NME7이 암성 세포 및 조직에서 높은 수준으로 발현되고, 전이성 암세포 및 조직에서는 심지어 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 발견하였다. 절단된 형태의 NME7은 세포외 수용체에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 분비 형태일 수 있다. 본 발명자들은 전장 NME7, MW 42kDa, 뿐만 아니라 약 33 kDa 및 30 kDa인 NME7 종을 검출한다. 33 kDa 종 및 30 kDa 종은 암세포로부터 분비된다. 웨스턴 블롯은 세포 파쇄물에서 전장 NME7을 검출하지만, 이들의 조건화된 배지에서는 더 작은 30 kDa 내지 33 kDa NME7 종을 검출한다(도 9 및 도 10). NME7을 인지하는 항체 또는 오로지 DM10 도메인만 인지하는 항체를 사용하여 탐침된 웨스턴 블롯은, 조건화된 배지 내로 분비되는 보다 낮은 분자량의 NME7 종이 DM10 도메인을 포함하지 않음을 보여준다(도 10). 이들 데이터는, 자연 발생 NME7 종이 본 발명자들이 생성한 재조합 NME7-AB와 거의 동일한 분자량을 가지며, 둘 모두가 분비되고, 둘 모두가 단백질을 세포 내에서 보유시킬 수 있는 DM10 도메인의 91개 아미노산을 포함하지 않기 때문에, 자연 발생 NME7 종과 재조합 NME7-AB가 유사하다는 생각과 일치한다.
본 발명자들은 새로운 NME7 아이소폼인 NME7-X1을 발견하였고, 또한, 이는 암에서 과발현되며 특히 전립선암에서 과발현됨을 발견하였다(도 33, 34). 분자량이 약 30 kDa인 NME7-X1은 NME7 아미노산 125-376을 포함하는 반면, 본 발명자들이 생성한 분자량이 약 33 kDa인 재조합 NME7-AB는 아미노산 92-376을 포괄(spanning)하고, 따라서, 33개보다 많은 N-말단 아미노산을 포함한다. NME7b는 아미노산 37-376을 포괄하고, DM10 도메인의 오로지 37개 아미노산을 포함하지 않으며, 또한 전립선암에서 과발현된다(도 34). 본 발명자들은 인간 재조합 NME7-X1을 생성하였으며, 이는 자연 발생적인 약 33 kDa NME7 종보다 바로 아래에서 러닝되며, 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼인 자연 발생 "NME7-AB-유사" 단백질인 것으로 보이는, 암세포에서 분비되는 30 kDa NME7 종임을 보여준다.
본 발명자들은 암세포주 패널을 시험하였으며, 암세포주가 NME7, 및 NME7-AB, 예컨대 NME7-AB-유사 단백질 또는 대안적인 아이소폼, 예컨대 NME7-X1과 유사한 절단물(truncation)일 수 있는 보다 낮은 분자량의 종을 높은 수준으로 발현함을 확인하였다.
NM23-H1(즉, NME1)은 이량체이어야 하는 반면, NME7은 MUC1* 세포외 도메인에 대해 2개의 결합 부위를 가진 단량체이다. 본 발명자들은 DM10 도메인을 포함하지 않는 재조합 인간 NME7을 생성하였으며, 본 발명자들은 이를 NME7-AB로 칭한다. 도 4의 A 내지 C는 NME7-AB의 크기 배제 크로마토그래피 정제의 용출 프로파일, NME7-AB 피크 분획으로부터의 비-환원성 SDS-PAGE 겔, 및 정제된 NME7-AB의 크기 배제 크로마토그래피의 용출 프로파일을 보여준다. 샌드위치 ELISA 결합 분석법은, 재조합 NME7인 NME7-AB가 2개의 PSMGFR 펩타이드에 동시에 결합하며, 여기서, MUC1*의 세포외 도메인이 PSMGFR 서열을 대부분 또는 모두 포함함을 보여준다(도 5, 실시예 6). 나노입자 결합 분석법에서, NME7은 또한, MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분에 결합하여 이를 이량체화할 수 있는 것으로 나타났다.
NME7을 불능화시키거나, NME7과 이의 결합 파트너와의 상호작용을 차단하거나 이의 발현을 억제하는 작용제는 강력한 항암 치료제이다. 이러한 작용제는 항체, 소분자 또는 핵산일 수 있다. 이들은 NME7에 직접 작용하거나, NME7 발현을 조절하는 분자, 또는 NME7을 암-촉진 형태로 절단하는 효소에 작용할 수 있다.
본 발명자들은, NM23-H1 이량체와 유사하게, 재조합 NME7-AB 단량체가 임의의 다른 성장 인자, 사이토카인 또는 혈청의 부재 하에 전분화능 인간 줄기세포 성장을 완전히 지지할 수 있었음을 발견하였다. 본질적으로 PSMGFR 서열을 포함하며 줄기세포의 분화를 유도하는 NME7과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 경쟁적으로 저해하는 것은, NME7과 MUC1*의 상호작용이 줄기세포 성장을 촉진하고, 분화를 저해함을 보여준다.
그런 다음, 본 발명자들은, NME7-AB 또한 단독으로 인간 암세포 성장을 완전히 지지할 수 있음을 보여주었다. NME7-AB가 보통의 암세포 성장 배지에 첨가되었을 때, 이는 암세포 성장, 특히 MUC1-양성 및 MUC1*-양성 암세포의 성장을 자극하였다. NME7과 MUC1*의 상호작용을 저해하면, 암세포 성장을 저해하였다. MUC1* 성장 인자 수용체를 항-MUC1* Fab로 차단하면, 암세포 성장을 강력하게 저해하였다. 유사하게는, NME7에 결합하는 항체는 암세포 성장을 저해한다. 항-NME7 항체에 의한 암 성장 저해의 일례는 도 6 내지 도 8 및 실시예 10에 나타나 있다. 이러한 경우, 폴리클로날 항체는 아미노산 100-376을 포괄하는 NME7의 부분을 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 생성되었다. 그러나, 본 발명자들은, NME7-AB 또는 NME7-X1 유래의 보다 짧은 펩타이드로 면역화함으로써 생성되는 항체 또한, 암 성장을 저해함을 확인하였다. 특히, 이들 항체는 MUC1 및 MUC1*-양성 암의 성장을 저해한다.
NME7은 암 전이를 유발한다
나아가, 본 발명자들은, NME7-AB를 함유하는 최소 배지에서 암세포를 배양하는 것은 광범위하게 다양한 암세포들이 보다 전이성 상태로 변환되도록 유도하였음을 발견하였다. 이러한 유도된 전이성 상태에 대한 증거는 부착성 세포 성장으로부터 비-부착성 세포 성장, 즉, "부유" 세포로의 변화, 및 부유 세포에서 특히 상향조절된 특이적인 전이 마커의 수반되는 상향조절을 포함한다. NME7-AB에서 배양된 후 상향조절되는 이들 전이 마커로는, CXCR4, CHD1, 즉, E-캐드헤린, CD44, 및 전분화능 줄기세포 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF2/4 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. NME7-AB에서 배양된 암세포는 시험 동물 내로 이종 이식되었을 때 급격하게 더 높은 이식률을 가졌으며, 이러한 이식률은 90%를 초과하였다. 또한, 매우 적은 수의 이식된 암세포로도 시험 동물에서 종양이 형성되었으며, 이는, NME7-AB가 이러한 암세포를 전이성 암세포로도 알려진 암 줄기세포로 변환시켰다는 증거이다. 암세포가, 본질적으로 NME7-AB와 동등한 NME7 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼을 만들기 때문에, 본원에 기술된 방법은 NME7-AB를 사용하는 것으로 한정되지 않으며; 다른 NME7 종들도 마찬가지로 작용할 수 있었다. 예를 들어, 본 발명자들은 다른 NME7 아이소폼인 NME7-X1이 암세포에 의해 발현됨을 발견하였다. 이는, X1 아이소폼이 N-말단에 33개의 아미노산을 포함하지 않는다는 점을 제외하고는, 본 발명자들의 재조합 NME7-AB와 일치한다. NME7-X1은 NME7-AB와 유사하게 작용하는 것으로 예상된다. "NME7-AB-유사" 단백질 또한, 암세포에서 검출되었으며, 이는 약 33 Da 종이다.
본 발명자들은, 발명자들의 이전 연구가, NME7-AB가 단독으로도 인간 줄기세포를 보다 조기의 네이브 상태로 역전시킬 수 있음을 보여준 것을 주지한다. 본 발명자들은, 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 다른 시약의 존재 하에 암세포를 배양하면, 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킴을 발견하였다. 본 발명자들은, NME7-AB(도 11 및 도 12), "2i" 저해제(도 14a), 인간 NME1 이량체, 또는 인간 NME1 또는 인간 NME7과 높은 서열 상동성을 가진 박테리아 NME1 이량체(도 14b)는 각각 보통의 암세포를 전이성 암세포로 변환시킬 수 있으며, 전이성 암세포는 또한, 암 줄기세포 "CSC" 또는 종양 개시 세포 "TIC"로 칭해진다(도 11 내지 도 14).
2i는, 연구자들이 인간 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시킴을 발견한 2개의 생화학적 저해제에 주어진 명칭이다. 2i는 MEK 및 GSK3-베타 저해제 PD0325901 및 CHIR99021이며, 이들은 배양 배지에 각각 약 1 mM 및 3 mM의 최종 농도로 첨가된다. NME7-AB 및 NME7-X1은 암세포를 전이성 세포로 변환시키기 위해 최소 배지의 별개의 배치들에 첨가되었을 때, 약 4 nM의 최종 농도로 존재하긴 하지만, 약 1 nM 내지 16 nM 의 범위의 보다 낮은 농도 및 보다 높은 농도들도 양호하게 작용한다. 인간 NME1 이량체 또는 박테리아 NME1 이량체는 4 nM 내지 32 nM의 최종 농도로 사용되며, 16 nM이 이들 실험에 전형적으로 사용되고, 여기서, 인간 NME는 S120G 돌연변이를 가진다. 야생형을 사용하는 경우, 보다 낮은 농도가 필요할 수 있다. 이들 정확한 농도가 중요한 것은 아니다. NME1 단백질이 이량체이고, 이것이 발생하는 농도 범위는 낮은 나노몰 범위에 존재하며, 그렇더라도, 소정의 돌연변이는 보다 높은 농도에서 이량체로서 유지될 수 있게 하는 것이 중요하다. 유사하게는, NME7 단백질의 농도는 다양할 수 있다. NME7-AB 및 NME7-X1은 단량체이고, 암세포를 전이성 세포로 변환시키는 데 사용된 농도는 단백질을 단량체로 유지시킬 수 있어야 한다.
NME7, NME7-AB, NME7-X1, 및 2i 저해제 MEKi 및 GSK3i 외에도, 다른 시약 및 저해제들이 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 것으로 나타났다. 이들 저해제, "i들"로는, JNKi, p38i, PKCi, ROCKi, BMPi, BRAFi, SRCi 뿐만 아니라 성장 활성화 인자 LIF(Gafni et al 2013, Chan et al 2013, Valamehr et al 2014, Ware et al 2014, Theunissen et al 2014) 등이 있다. 이들 시약은 또한, 암세포를 보다 전이성 상태로 진행시키는 데 사용될 수 있다. 그런 다음, 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 임의의 단일 인자, 또는 저해제 또는 성장 인자들의 조합을 사용하여 보다 전이성 상태로 변환시키도록 유도되었던 세포는 암 전이를 치료하거나 예방하기 위한 약물을 확인하거나 시험하는 디스커버리 툴로서 사용될 수 있다.
다양한 분자 마커는 전이성 암세포의 지표로서 제안되었다. 서로 다른 유형의 암들은, 상향조절되는 상이한 분자들을 가질 수 있다. 예를 들어, 수용체 CXCR4는 전이성 유방암에서 상향조절되며, 한편, CHD1으로도 알려져 있는 E-캐드헤린은 전이성 전립선암에서 더 상향조절된다. 이들 특이적인 전이 마커 외에도, 전분화능에 대한 전형적인 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF4는 암이 전이성으로 됨에 따라 상향조절된다. 출발 암세포 및 이후의 전이성 암세포는 이들 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 PCR에 의해 분석된다. 본 발명자들은, 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시키는 시약, 예컨대 NME7-AB에 배양된 이들 암세포가 전이 마커 및 전분화능 줄기세포 마커의 발현 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 전이성 암세포로서 작용한다고 언급하였다.
암세포 집단이 전이성인지 아닌지에 대한 기능 시험은, 매우 적은 수, 예를 들어 200개의 세포를 면역-약화된 마우스에 이식하고, 이들 세포가 종양으로 발병되는지 알아보는 것이다. 전형적으로, 면역-약화된 마우스에서 종양을 형성하기 위해서는 5백만 내지 6백만개의 암세포가 필요하다. 본 발명자들은, 50개만큼 적은 수의 NME-유도 전이성 암세포가 마우스에서 종양을 형성하였음을 보여주었다. 또한, 시험 기간 전체 동안에 인간 NME7-AB, NME1 또는 NME7-X1이 주사된 마우스에서 원거리 전이가 발병되었다.
하나의 특정 시험에서, T47D 인간 유방암 세포를 표준 RPMI 배지에서 14일 동안 배양하였으며, 이때, 배지를 48시간마다 교환하였고, 약 75% 포화되었을 때, 트립신처리에 의해 계대배양하였다. 그런 다음, 세포를 6-웰 플레이트 내로 평판배양하고, 4 nM NME7-AB가 보충된 최소 줄기세포 배지(실시예 1 참조)에서 배양하였다. 배지를 48시간마다 교환하였다. 약 4일까지, 일부 세포는 표면으로부터 탈착되어, 부유 상태로 되었다. "부유 세포"가 전이 마커의 RT-PCR 측정에 의해 입증되는 바와 같이 가장 높은 전이 잠재력을 가진 세포이기 때문에, "부유 세포"를 보유하기 위해 배지를 조심스럽게 교환한다. 7일 또는 8일에, 부유 세포를 수집하고, 계수한다. RT-PCR 측정을 위해 검체를 보유시킨다. 측정된 키 마커는 CXCR4이며, 이는 NME7-AB에서 간단히 배양된 후 40배 내지 200배 상향조절된다.
방금 수집된 부유하는 전이성 세포를, 90-일 서방성 에스트로겐 펠렛이 이식되었던 암컷 nu/nu 무흉선 마우스의 옆구리에 이종 이식하였다. 부유 세포를 각각 10,000개, 1,000개, 100개 또는 50개 세포로 이종 이식하였다. 또한, 6마리로 이루어진 각각의 그룹 내의 마우스 중 절반에는 32 nM NME7-AB를 원래의 이식 부위 근처에 매일 주사하였다. NME7-AB를 포함하지 않는 RPMI 배지에서 배양된 부모 T47D 세포를 또한, 대조군으로서 6백만개, 10,000개 또는 100개로 마우스에게 이식하였다. NME7-유도 부유 세포를 이식한 마우스는 50개만큼 적은 수의 세포가 이식되었을 때에도 종양이 발병되었다. 부유 세포를 이식하고, NME7-AB를 매일 주사한 마우스에서는 또한, 원거리 종양이 발병되거나 다양한 기관들에서 원거리 전이가 발병되었다(도 20 내지 도 25). NME7-AB에서 배양된 암세포를 이식한 후, 인간 NME7-AB를 주사한 12마리의 마우스 중 11마리, 또는 92%의 마우스에서는 주사 부위에서 종양이 발병되었다. 이식 후 인간 NME7-AB를 주사하지 않은 12마리의 마우스 중 오로지 7마리 또는 58%의 마우스에서만 종양이 발병되었다. 종양을 나타내고, 인간 NME7-AB가 주사된 11마리의 마우스 중 9마리 또는 82%의 마우스에서는, 주사 부위로부터 원거리에서 다중 종양들이 발병되었다. NME7-AB를 주사하지 않은 마우스 중 어떤 마우스에서도 가시적인 다중 종양이 발병되지 않았다.
안락사 후, RT-PCR 및 웨스턴 블롯은, NME7-AB를 주사한 마우스 상의 원거리 혹이 사실상 인간 유방 종양이었음을 보여주었다. 이들 기관에 대한 유사한 분석은, 원거리 혹 외에도, 마우스에서, 이식된 인간 유방암 세포의 인간 유방암 특징이 간 및 폐로 무작위로 전이되었음을 보여주었다. 예상된 바와 같이, 6백만개 세포를 이식한 마우스만 종양을 성장시켰다.
본 발명자들은, 인간 재조합 NME7-AB가 NME7-X1 및 30 kDa 내지 33 kDa NME7 절단 생성물과 크기 및 서열 면에서 유사함을 입증하였다. 본 발명자들은, NME7-AB이 암성 성장을 촉진하고, 암세포로 하여금 종양 개시 세포(TIC)로도 칭해지는 고도로 전이성인 암 줄기세포(CSC) 상태로 가속화되도록 유발함을 보여주었다. 따라서, 본 발명자들은, NME7-X1, 및 DM10 도메인을 제거한 NME7 절단 생성물 또한, 암성 성장을 촉진하고, 암세포로 하여금 종양 개시 세포(TIC)로도 칭해지는 고도로 전이성인 암 줄기세포(CSC) 상태로 가속화되도록 유발한다고 결론 내린다. 일례에서, NME7-AB를 임의의 다른 성장 인자 또는 사이토카인의 부재 하에 무혈청 배지 내의 암세포에 첨가하였다. 7일 내지 10일 이내에, 암세포는 전이성 암세포의 지표인 분자 마커, 예컨대 CXCR4의 발현의 100배 초과의 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 고도로 전이성인 CSC/TIC로 역전되었다. 일례에서, T47D 유방암 세포를 표준 RPMI 배지 또는 최소 줄기세포 배지(실시예 1)에서 배양하였으며, 이 배지에 재조합 NME7-AB를 16 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 10일 후, 세포를 수집하고, CSC의 분자 마커의 발현에 대해 RT-PCR로 분석하였으며, 이러한 발현은 10배 내지 200배만큼 상승되었다(도 11, 도 12). 이는, 본 발명자들이 하나의 유형의 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킨 방법을 보여주는 구체적이며 상세한 예이다. 이러한 방식으로 변환되는 암세포는 광범위하게 존재하며, 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키며 또한 암세포를 보다 전이성 상태로 진행시키는 시약이 광범위하게 존재하며, 첨가되는 시약이 암세포를 변환시키는 농도도 광범위하기 때문에, 본 발명은 이들 상세한 사항에 의해 제한되지 않아야 한다. 다른 유형의 암세포는, 전이 마커의 급격한 상향조절 및 이식된 매우 적은 수의 암세포로부터 종양을 형성하는 능력을 위해서는 NME7-AB에서 보다 장기간 동안 배양될 필요가 있었다. 예를 들어, NME7-AB, 2i, 인간 NME1, 또는 인간 NME1 또는 인간 NME7에 대해 높은 상동성을 가진 박테리아 NME1에서 배양된 전립선암 세포는 2회 내지 3회의 계대배양 후, 전이 마커의 급격한 증가를 보여주었다.
전이 마커 CXCR4는 특히 전이성 유방암 세포에서 상승되는 한편, CHD1은 특히 전이성 전립선암에서 상승된다. 본원에서, 본 발명자들은, 전분화능 줄기세포 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG, KLF2/4 및 TBX3 또한, 암세포가 보다 전이성 세포로 변환될 때 상향조절됨을 보여준다.
DU145 전립선암 세포를 유사하게 배양하였으며, NME7-AB에서 배양된 세포 또한, CSC 마커의 발현의 급격한 증가를 보여주었다(도 13). 전립선암 세포에서, CHD1(즉, E-캐드헤린) 및 CXCR4는 다른 전분화능 줄기세포 마커와 더불어, NME7-AB에서 성장되지 않은 대조군 암세포와 비교하여 상향조절되었다. 난소 암세포, 췌장 암세포 및 흑색종 세포 또한, NME7-AB에서 배양되었으며, 배양 3일 후에 보다 전이성 상태로 변환되었다. 도 37a 내지 도 37c는, 난소 암세포주 SK-OV3, OV-90 및 유방암 세포주 MDA-MB가 모두 부착성 세포를 비-부착성 부유 세포로 변이시켰으며, NME7-AB와 배양한 지 72시간 또는 144시간 후, 전이 마커의 발현을 증가시켰음을 보여준다.
본원에서, 본 발명자들은, NME7-AB가 광범위한 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킴을 보여주었다. 본 발명자들은 또한, 암세포가 재조합 NME7-AB 33 kDa과 대략 동일한 분자량을 가진 자연 발생 종을 발현하고(도 33 내지 도 36 및 도 38), 또한 NME7-AB와 유사하게 DM10 도메인을 포함하지 않으며(도 10), 또한 N-말단에 33개의 아미노산이 제거된 점을 제외하고는 NME7-AB와 동일한 서열을 가진 대안적인 아이소폼 NME7-X1 30 kDa을 발현한다고 보여주었다. 공동-면역침전 실험을 T47D 유방암 세포 상에서 수행하였으며, 여기서, 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션하고, 공동-면역침전시켰다. 면역침전된 종을 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔을 2개의 서로 다른 상업적으로 입수가능한 항-NME7 항체를 사용하여 블로팅하였다. 2개의 겔 모두 약 33 kDa 및 약 30 kDa에서 독특한 NME7 밴드를 보여준다(도 39A, 도 39B). 겔을 스트리핑하고, MUC1*의 세포외 도메인에 대한 항체인 항-PSMGFR 항체를 사용하여 재탐침하였으며(도 39C, 도 39D), 이는, NME7 종 및 MUC1*가 상호작용함을 보여준다. 본 발명자들이 제조한 재조합 NME7-AB 및 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔 상에서 러닝시켰으며, 그런 다음 항-NME7 항체를 사용하여 탐침하였으며, 이는, 유방암 세포에서 자연 발생적이며 MUC1*와 상호작용하는 2개의 독특한 NME7 종들이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 보여준다(도 39E). 유사한 실험을 인간 줄기세포에서 수행하였다. 도 40의 A 내지 C는 공동-면역침전 실험의 웨스턴 블롯의 사진을 보여준다. 인간 유도성 전분화능 줄기세포인 iPS7 또는 배아 줄기세포인 HES3의 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션하고, 공동-면역침전시켰다. 겔을 상업적으로 입수가능한 항-NME7 항체 B9를 사용하여 블로팅하였다(A). 2개의 세포 유형은 약 33 kDa 및 약 30 kDa에서 독특한 NME7 밴드를 보여준다. 겔을 스트리핑하고, MUC1*의 세포외 도메인에 대한 항체인 항-PSMGFR 항체를 사용하여 재탐침하였으며(B), 이는 NME7 종 및 MUC1*가 상호작용함을 보여준다. 본 발명자들이 제조한 재조합 NME7-AB 및 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔 상에서 러닝시켰으며, 그런 다음 항-NME7 항체를 사용하여 탐침하였으며, 이는, 유방암 세포에서 자연 발생적이며 MUC1*와 상호작용하는 2개의 독특한 NME7 종들이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 보여준다(C). NME7-AB가 재조합 단백질이기 때문에, 본 발명자들은 자연 발생 종이 1개 내지 15개의 부가적인 엑스트라 아미노산을 함유하거나, 동일한 겉보기 분자량으로 러닝되긴 하지만 재조합 NME7-AB보다 1개 내지 15개의 부가적인 아미노산을 포함하지 않을 수 있는지 알지 못한다. "NME7-AB-유사"란, 본 발명자들은, 대략 33 kDa의 겉보기 분자량으로 러닝되는 NME7 종이 암세포 성장을 자극할 수 있고, 보다 전이성 상태로의 암세포의 변이를 유도하고, 인간 줄기세포의 전분화능 성장을 전적으로 지지할 수 있다는 점에서, 재조합 NME7-AB가 수행하는 방식으로 작용할 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은, NME7 및 보다 낮은 분자량의 NME7 종을 발현하는 암세포주 및 암세포 집단이, CSC 또는 전이성 암세포인 일부 암세포를 함유한다고 결론 내린다. 이들 암은 보다 전이성으로 될 수 있거나, NME7-AB, NME7-X1 또는 보다 낮은 분자량의 NME7 종에서 세포를 배양함으로써 전이성 세포 집단을 증가시킬 수 있다. 도 35는 NME7뿐만 아니라 33 kDa에서 보다 낮은 분자량을 가진 종인 NME7-AB-유사 및 30 kDa에서 NME7-X1을 모두 발현하는 암세포 패널의 웨스턴 블롯을 보여준다. 도 38은, 유방암 세포주 T47D, 전립선암 세포주 PC3 및 DU145, 유방암 세포주 BT-474, 둘 모두가 흑색종 세포주인 CHL-1 및 A2058, 및 둘 모두가 췌장 세포주인 CAPAN-2 및 PANC-1이 모두 MUC1, MUC1*, NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1을 발현함을 보여준다. 도 38a에서, BT0474 세포가 MUC1 또는 MUC1*를 발현하지 않는 것으로 보이지만, 본 발명자들은 이전에(Fessler et al 2009), 이들 HER2 양성 유방암 세포가 화학치료 약물에 대해 내성으로 될 때, 즉, 전이성으로 될 때, 이들 세포는 MUC1*의 발현을 증가시킴으로써 그렇게 수행한다는 것을 보여주었다(도 38d). 항-MUC1* Fab를 사용하여 MUC1* 수용체를 차단하는 것은 허셉틴(도 38e), 택솔(도 38f)뿐만 아니라 다른 화학치료제에 대한 이들의 내성을 역전시켰다. 이들 유형의 암 및 NME7 및 보다 낮은 분자량, 예컨대 33 kDa, 30 kDa의 NME7 종을 발현하는 다른 유형의 암들은 보다 전이성으로 될 수 있거나, NME7-AB, NME7-X1 또는 보다 낮은 분자량의 NME7 종에서 세포를 배양함으로써 전이성 세포 집단을 증가시킬 수 있다.
역으로, 이들 암, 및 NME7과 보다 저분자량의 NME7 종, 예컨대 33 kDa 또는 30 kDa NME7 종을 발현하는 다른 암 유형의 전이 잠재력은 세포를 항-NME7 항체로 치료함으로써 역전될 수 있다. 항-NME7 항체, 또는 NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하는 항체는 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 및 간암을 비롯한 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 본 발명자들이, NME7-AB가 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하고 이를 활성화시킴으로써 NME7-AB의 종양원성 효과를 발휘함을 보여주었기 때문에, 항-NME7 항체는 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 결장직장암, 전립선암, 뇌암, 흑색종, 신장암 및 다른 암 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아닌 임의의 MUC1*-양성 암에 대해 효과적일 것이다. 항-NME7 항체, 항-NME7-AB 항체 또는 항-NME7-X1 항체는, NME7-AB, NME7-AB-유사, NME7-X1 양성 또는 MUC1* 양성인 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다.
효과적인 치료법을 위한 환자 암세포의 시험
NME7-AB, NME7-X1뿐만 아니라 2i, 및 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 다른 시약들 또한, 암세포가 보다 전이성 상태로 변환되도록 유도한다. 이들 시약 중 임의의 하나 또는 조합을 사용한 치료 후, 암세포는 보다 높은 이식률을 가지며, 시험 동물에서 종양을 형성하는 데 있어서 100,000배까지 더 적은 수의 세포를 필요로 한다. 따라서, 본 개시내용에서 언급되는 방법은 환자의 원발성 종양 세포를 시험 동물 내로 이종 이식시킬 수 있는 데 사용될 수 있다.
그런 다음, 후보물질 치료제를 수여자 동물에서 시험할 수 있다. 이러한 방식으로 확인된 효과적인 치료제는 공여자 환자 또는 유사한 암을 가진 다른 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 특정 환자 또는 특정 유형의 암에 효과적인 치료제를 확인하는 방법은, 1) 세포주, 환자, 또는 시험되는 치료제를 투여할 환자로부터 암세포를 수득하는 단계; 2) 암세포를, NME7-AB, NME7-X1, 인간 NME1, 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 상동성을 가진 박테리아 NME1, 2i, 또는 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 것으로 알려진 다른 시약 내에서 배양하는 단계; 3) 생성되는 암세포를, 인간 NME7-AB, NME7-X, 인간 NME1, 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 상동성을 가진 박테리아 NME1, 2i, 또는 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 것으로 알려진 다른 시약이 또한 투여될 수 있는 시험 동물에게 이식하거나, 동물은 인간 NME7-AB 또는 NME7-X1에 대한 유전자로 트랜스제닉되는 단계; 4) 후보물질 항암 치료제를 동물에게 투여하는 단계; 5) 치료제의 효능을 평가하는 단계; 및 6) 효과적인 치료제를 공여자 환자 또는 유사한 암을 가진 또 다른 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
항-NME7 항체
항-NME7 항체는 강력한 항암제이다. NME7은 암세포의 성장을 촉진하며, 암세포가 보다 전이성 상태 또는 보다 공격적인 상태로 진행되는 것을 촉진하는 성장 인자이다. NME7 및 절단된 형태의 NME7은 약 33 kDa 또는 30 kDa이며, 임의의 다른 성장 인자 또는 사이토카인을 포함하지 않는 무혈청 배지에서조차 암 성장을 전적으로 지지하는 것으로 나타났다. 풀-다운 분석법, ELISA 및 나노입자 결합 실험에서, 본 발명자들은, 성장 인자 수용체 MUC1*이 NME7 및 NME7-AB의 결합 파트너임을 보여주었다. 모든 다른 성장 인자 또는 사이토카인을 제거함으로써 이러한 상호작용을 촉진하는 것은 암 줄기세포 마커의 발현을 증가시켰다. 혈청의 존재 하에서조차 NME7에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 사용하여 이러한 상호작용을 차단하는 것은 암세포를 능동적으로 살해하였다. 따라서, 항-NME7 항체 또는 항-NME7-AB 항체는 암 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있는 강력한 항암제이다. 모든 암들 중 75% 초과는 MUC1* 양성이다. MUC1*는 MUC1의 막투과 절단 생성물이며, 여기서, 대부분의 세포외 도메인은 탈락(shed)되었으며, 따라서, 대부분의 PSMGFR 서열을 함유하며, PSMGFR 서열의 경계에 9개 내지 20개의 부가적인 아미노산 N-말단을 함유할 수 있는 세포외 도메인의 일부가 남겨진다.
본 발명의 일 양태는 항-NME7 항체를 유효량으로 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이다. 일 예에서, 항-NME7 항체는 NME7-AB에 결합할 수 있다. 다른 경우에서, 항-NME7 항체는 NME7-X1에 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 환자에게 투여되는 항-NME7 항체는 암의 촉진 시 NME7과 이의 표적 사이의 결합을 저해하거나 방지한다. 일 경우에서, 표적은 절단된 MUC1의 세포외 도메인이다. 보다 구체적으로는, 암을 촉진하는 NME7 표적은 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 영역이다. 일 양태에서, 효과적인 치료제는 NME7 종과, 주로 MUC1*의 PSMGFR 부분 또는 PSMGFR 펩타이드로 이루어진 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 방해하거나 저해하는 것이다. 암 치료 또는 예방용 작용제는, NME7, NME7-AB-유사 절단 생성물, 또는 NME7-X1을 비롯한 대안적인 아이소폼의 발현 또는 기능을 직접 또는 간접적으로 저해하는 작용제이다. 일 경우에서, 효과적인 항암 치료제는, NME7 종에 결합하거나 이의 종양원성 활성을 불능화시키는 것이다. 암 치료 또는 예방에 효과적인 치료제는, NME7, NME7-AB-유사 절단 생성물, 또는 대안적인 아이소폼 또는 NME7-X1에 결합하거나 이들을 불능화시키는 작용제이다. 일 양태에서, NME7 종에 결합하는 치료제는 항체이다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 이가 항체, 일가 항체, 단쇄 항체, scFv, 기원이 동물일 수 있는 항체 모방체, 인간-동물 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 항체는 NME7 종 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션되거나 이를 사용하여 면역화됨으로써 생성될 수 있거나, NME7, NME7-AB-유사 절단 생성물, 또는 NME7-X1을 비롯한 대안적인 아이소폼을 비롯한 NME7 종에 결합하는 능력에 대해 예를 들어, 항체 라이브러리 또는 항체 풀로부터 선택될 수 있다.
항-NME7 항체의 생성
항-NME7 항체는 숙주 동물에서와 같이 환자의 외부에서 생성되거나 환자 내에서 생성될 수 있다. 항체는 NME7 또는 NME7 단편의 면역화에 의해 생성되거나, 요망되는 NME7 종, 예컨대 NME7-AB 또는 NME7-X1로의 결합 능력에 근거하여 천연 항체, 합성 항체, 전체 항체 또는 항체 단편일 수 있는 항체 라이브러리 또는 항체 풀로부터 선택될 수 있다. 일 양태에서, 항체는 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이들로부터 선택되는 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 생성되거나, 이러한 펩타이드로의 결합 능력에 대해 선택된다. 또 다른 양태에서, 항체는 인간 NME1의 서열과 일치하지 않는 서열을 가진 펩타이드로부터 생성되거나, 항체는 NME7 종으로의 결합 능력 및 인간 NME1에의 결합 불능에 대해 선택된다.
암 성장을 저해하고 전이로의 변이를 저해하는 항체를 유발하는 NME7 또는 NME7-X1 유래의 펩타이드, 또는 그 자체가 저해성인 펩타이드를 확인하는 데 사용되는 일 방법은 하기와 같다: 1) 인간 NME1, 인간 NME7, 인간 NME7-X1, 및 인간 NME1 또는 인간 NME7 중 하나에 대해 높은 서열 상동성을 가진 몇몇 박테리아 또는 진균류 NME 단백질의 단백질 서열을 정렬하는 단계; 2) 모든 NME 중에서 높은 서열 상동성을 가진 영역을 동정하는 단계; 3) NME7 또는 NME7-X1에는 독특하지만, 높은 서열 상동성을 가진 영역의 측방에 존재하는(flanking) 펩타이드 서열을 동정하는 단계. 그런 다음, 펩타이드를 합성하고 인간 또는 숙주 동물에서 항체를 생성하는 데 사용한다. 생성되는 항체를 암 성장을 저해하거나 전이성 암세포로의 변이를 저해하는 능력에 대해 시험한다.
암 치료를 위한 항-NME7 항체의 용도
암 성장 또는 보다 전이성 상태로의 변이를 저해하는 항체는 항암 치료제로서 사용되도록 선택되며, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 선택된 항체는 예를 들어, 인간 키메라 항체 또는 전체 인간 항체를 조작하거나 제조함으로써 추가로 최적화될 수 있다. 이러한 접근법의 효능을 언급하기 위해, 본 발명자들은 암성 기능에 중요한 것으로 의심되는 NME7 영역으로부터 NME7 펩타이드를 선택하였다. 그런 다음, 본 발명자들은 이들 펩타이드를 사용하여 항체를 생성한 다음, 생성되는 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드 둘 모두를 하기 능력에 대해 시험하였다: a) 암성 성장을 저해하는 능력; 및 b) 암세포로부터 전이성 암세포로의 유도 변이를 저해하는 능력. NME7 펩타이드를 항체 생성을 위한 면역화 작용제로서, 그리고 그 자체를 저해제로서 선택하였다(도 19 및 실시예 11). 펩타이드 A1(서열 번호:141), A2(서열 번호:142), B1(서열 번호:143), B2(서열 번호:144) 및 B3(서열 번호:145), 여기서, A는 펩타이드가 유래되는 도메인, 즉, NDPK A 도메인을 지칭하고, B는 펩타이드가 NDPK B 도메인으로부터 유래됨을 나타낸다(도 15). 각각의 펩타이드는 면역원으로서 사용되었으며, 폴리클로날 항체의 제조를 위해 2마리의 토끼에게 각각 주사되었다. 면역화된 토끼의 혈액으로부터 수집한 항체를 면역화 펩타이드를 사용하여 유도체화된 컬럼에서 정제하였다. 그런 다음, 정제된 항체를 인간 NME7로의 결합 능력에 대해 시험하였다. 요망한 바와 같이 생성된 모든 항체는 인간 NME1이 아니라 인간 NME7에 결합했다(도 26의 A 내지 B, 실시예 12). 이들 결과는, 서열이 NME1에서 정확하게 일치하지는 않으나 NME7에서 발견되는 펩타이드를 선택함으로써, NME1이 아니라 NME7에 특이적으로 결합하는 항체가 생성된다는 것을 보여준다. NME1이 건강한 기능을 가지기 때문에, 대부분의 경우, NME1을 방해하지 않는 항체를 생성하는 것이 바람직하다. 항체를 또한, MUC1* 세포외 도메인 펩타이드로의 NME7의 결합을 저해하는 능력에 대해 시험하였다. 도 27에 도시된 ELISA 실험은, 항체가, NME1의 결합을 저해했던 것보다 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드로의 NME7-AB의 결합을 훨씬 더 크게 저해하였음을 보여준다.
그러나, 이는 NME7 및 NME7 종의 암성 기능을 저해하는 항체를 생성하는 펩타이드를 선택하는 일례이다. 인간 NME1, 인간 NME7, 인간 NME7-X1, 및 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 서열 상동성을 가진 박테리아 NME 단백질 사이에서의 서열 정렬을 통해, 5개의 상동성 영역이 동정되었다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3가 모두 암 성장 또는 전이성 상태로의 변이를 저해한 항체를 생성하였다는 사실은, 이들 펩타이드가 유래되는 5개의 영역이 암의 촉진에 있어서 이의 기능에 중요한 NME7의 영역임을 의미한다. 이들 영역 유래의 다른 펩타이드들 또한, 암 성장 및 전이를 저해할 항-NME7 항체를 생성할 것이며, 따라서, 강력한 항암 치료제이다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3로부터 생성된 항체는 암 성장을 저해하는 것으로 나타났으며, 보다 전이성 상태로의 변이를 저해하였다. 동일하거나 유사한 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 생성된 모노클로날 항체 및 이러한 모노클로날 항체의 후속적인 시험은, 당업계에 알려진 인간화 또는 다른 조작 후, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 항체를 동정할 것이다.
특정 실험에서, 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드 자체를 배양중인 암세포에 첨가하여, 항체 또는 면역화 펩타이드의 첨가가 암세포 성장을 저해할 것인지 알아보았다. 낮은 농도에서 개별적으로 첨가되어도, 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드는 암세포 성장을 저해하였다(예, 도 28 참조). 그러나, 보다 고농도에서 첨가되거나 조합하여 첨가되었을 때, 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드는 암세포 성장을 강력하게 저해하였다(도 29). 면역화 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3의 상응하는 인간 NME7 아미노산 수는 서열 번호:82 또는 147을 가진 인간 전장 NME7으로부터 각각 127-142, 181-191, 263-282, 287-301, 343-371이다.
명확하게 하기 위해, NME7이 잔기 수가 논의될 때, 이들 수는 서열 번호:82 또는 147에 표시된 바와 같이 NME7의 잔기 수를 지칭한다.
도 6 내지 도 8에 도시된 암 성장 저해 실험에서 사용된 항체, 및 도 28에 도시된 항체들 중 하나의 항체는 NME7의 아미노산 100-376(서열 번호:82 또는 147)에 상응하는 NME7 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 생성되었다. 보다 높은 친화성을 가지며 특이적인 항-NME7 항체를 생성하기 위해, 하기 단계들이 후속된다: 인간 NME7 아미노산 100-376을 함유하는 펩타이드로 동물을 면역화한 후: 1) 인간 NME1에 결합하는 항체를 탈락시키는 단계; 2) NME7-AB, 2i 또는 보다 전이성 상태로의 암세포의 변이를 유도하는 다른 NME를 저해하는 항체를 선택하는 단계; 3) 암세포의 성장을 저해하는 항체를 선택하는 단계; 4) MUC1* 양성 암세포의 성장을 저해하는 항체를 선택하는 단계; 5) MUC1* 세포외 도메인으로의 NME7-AB 또는 NME7-X1의 결합을 저해하는, 본질적으로 PSMGFR 펩타이드로의 결합을 저해하는 항체를 선택하는 단계; 및/또는 6) 도 19에 열거된 펩타이드들 - A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드 중 하나 이상에 결합하는 항체를 선택하는 단계.
보다 높은 친화성을 가진 모노클로날 항체, 또는 더 긴 펩타이드로부터 생성되는 모노클로날 항체는 보다 효과적인 항체 치료제일 수 있다. 대안적으로, 효능을 증가시키기 위해, 항-NME7, 항-NME7-AB 또는 항-NME7-X1 항체의 조합이 환자에게 투여된다.
항-NME7 항체는 전이성 암세포로의 암세포의 변이를 저해한다.
항-NME7 항체는 암 줄기세포(CSC) 또는 종양 개시 세포(TIC)로도 칭해지는 전이성 암세포로의 암세포의 변이를 저해한다. 본 발명자들이, NME7-AB의 존재 하에 광범위하게 다양한 암세포를 배양하면, NME7-AB가 보통의 암세포로부터 전이성 CSC 또는 TIC로의 변이를 유발함을 언급하였음을 상기한다. 따라서, NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하는 항체는 보다 전이성 상태로의 암세포의 진행을 저해할 것이다.
암세포는 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 작용제의 존재 하에 배양되었을 때, 보다 전이성 상태로 변환된다. 본 발명자들은, NME7-AB, 인간 NME1 이량체, 박테리아 NME1 이량체, 또는 "2i"로 칭해지는 MEK 및 GSK3-베타 저해제에서 암세포를 배양하면, 세포가 보다 전이성 상태로 된다고 언급하였다. 세포가 보다 전이성 상태로 변이됨에 따라, 세포는 비-부착성 또는 덜 부착성인 상태로 되고, 배양 플레이트로부터 떨어져 나와 부유한다. 이들 부유하는 세포인 "부유 세포"를 부착성인 세포들로부터 개별적으로 수집하였으며, 이들은, a) 전이성 유전자를 훨씬 더 높은 수준으로 발현하고; b) 매우 낮은 복사 수로 마우스 내로 이종 이식되었을 때, 종양을 형성하는 것으로 나타났다. RT-PCR 측정값에서, 특이적인 전이 마커, 예컨대 유방암의 경우 CXCR4, 전립선암의 경우 CHD1, 및 다른 전분화능 줄기세포 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4 및 다른 마커들은 NME7-AB에서 배양된 암세포에서 급격하게 과발현되었으며, 본원 및 도면에서 "부유 세포"로 칭해지는 비-부착성으로 된 세포에서 가장 과발현되었다.
일례에서, NME7-유래의 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 NME7-AB 특이적인 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드 그 자체를 NME7-AB 또는 2i와 함께 배지에 첨가하여, 이들이 보통의 암세포에서 전이성 암 줄기세포로의 변환을 저해하였는지 확인하였다. 항체 및 펩타이드를 전이성 변환을 유발하는 작용제와 함께 개별적으로 첨가하였으며; 이 경우, NME7-AB 또는 2i 저해제 PD0325901 및 CHIR99021였다. NME7-AB 및 2i를 개별적으로 사용하여, 변환되는 암세포를 보다 공격적인 전이성 상태로 유도하였다. 2i를 사용하여, 배지에 첨가된 항체가 단순히 NME7-AB를 모두 흡수하였는지에 대해 논쟁이 없도록 할 수 있었으며, 따라서, 원인 작용제(causative agent)는 배지에 효과적으로 존재하지 않았다(실시예 14).
실험이 진행됨에 따라, 2명의 과학자들이 시각적인 관찰을 독립적으로 기록하였다(도 30). 가장 놀라운 관찰은, 항체 및 펩타이드가 부유 세포의 수를 급격하게 감소시킨 것이며, 이는, 항체 및 펩타이드가 전이성 암세포로의 변환을 저해한다는 제1 지표였다. 특히, B3 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 항체가 생성된 세포는 임의의 부유 세포를 거의 생성하지 않았다. mRNA를 부유 세포, 부착성 세포 및 대조군 암세포 모두로부터 추출하였다. 세포의 생존력 및 성장을 가리키는 mRNA의 양을 측정하였다. 항체로 처리한 세포는 훨씬 더 적은 양의 mRNA를 가졌으며, 이는 살아 있는 분화성 세포가 더 적음을 가리키며(도 32), 이는, 항-NME7-AB 항체가 암세포 성장뿐만 아니라 보다 전이성 상태로의 암세포의 변이를 저해함을 확인시켜 준다. RT-PCR을 사용하여, CXCR4를 비롯한 전이 마커의 발현 수준을 측정하였다. 항-NME7 항체를 사용한 치료는 전이 마커, 예컨대 CXCR4의 양을 크게 감소시켰으며, 이는, 항-NME7 항체 또는 펩타이드가 전이성 암으로의 변이를 저해함을 가리킨다(도 31a 내지 도 31c). 이들 결과는, NME7-AB에 결합하는 항체가 전이성 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있음을 보여준다.
NME7-AB 또는 NME7-X1 유래의 펩타이드는 온전한 NME7-AB 및 NME7-X1의 결합을 경쟁적으로 저해하고, 항암제이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 암의 치료 또는 예방을 위한 치료제는 NME7 서열 유래의 펩타이드이며, 이는 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 일 양태에서, 전체 NME7보다 더 짧고, NME7의 발암 활성을 부여할 수 없으며, NME7의 표적에 결합하고, 암을 촉진하는 온전한 NME7과 이의 표적과의 상호작용을 경쟁적으로 저해해야 하는 NME7-유래의 펩타이드가 환자에게 투여된다. NME7-AB가 전적으로 발암 활성을 부여할 수 있기 때문에, NME7-AB의 서열은 보다 짧은 펩타이드(들)에 대한 공급원으로서 바람직하며, 여기서, 펩타이드 자체는 암성 성장 또는 다른 종양원성 활성 또는 발암 활성을 촉진할 수 없는 것이 확인되어야 한다. 바람직한 실시형태에서, NME7-AB의 일부의 서열을 가지며 바람직하게는 길이가 약 12개 내지 56개 아미노산인 하나 이상의 펩타이드가 환자에게 투여된다. 반감기를 증가시키기 위해, 펩타이드는 펩타이드 모방체, 예컨대 비-자연적인 백본을 가진 펩타이드 또는 L에 대한 D-형태 아미노산을 가진 펩타이드일 수 있다. 또 다른 경우에서, 항암 치료제는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체이며, 여기서, 펩타이드는 NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1, 또는 이의 표적이며 본원에서 일부 경우에 "FLR"로도 칭해지는 PSMGFR 펩타이드를 포함하는 MUC1* 세포외 도메인의 적어도 하나의 부분과 고도로 상동성인 서열을 가진다.
도 16 내지 도 19는 NME7과 이의 동족 표적 사이의 결합을 저해하는 것으로 예측되는 바람직한 아미노산 서열의 목록을 제공한다. 보다 더 바람직한 실시형태에서, 암 환자 또는 암이 발병할 위험이 있는 환자에게 투여하기 위해 선택된 펩타이드는 이들이 NME7 결합 파트너에 결합하고, 그 자체는 종양원성 활성을 부여하지 않기 때문에 선택된다. 좀 더 바람직한 실시형태에서, NME7 결합 파트너는 MUC1*의 세포외 도메인이다. 보다 더 바람직한 실시형태에서, NME7 결합 파트너는 PSMGFR 펩타이드이다.
용어 "종양원성 활성 또는 발암 활성을 부여한다"라는 것은, 펩타이드 그 자체는 암의 성장을 지지하거나 촉진할 수 없음을 의미한다. NME7 유래의 펩타이드 또는 펩타이드들이 종양 형성을 촉진할 수 있는지의 여부를 시험하는 또 다른 방식은, 펩타이드가 인간 줄기세포의 전분화능 성장을 지지할 수 있는지를 시험하는 것이다. 전분화능 인간 줄기세포 성장을 지지하는 NME 단백질 및 펩타이드는 또한, 암 성장을 지지한다. 또 다른 방법에서, 펩타이드가 체세포를 덜 성숙한 상태로 역전시킬 수 있다면 이러한 펩타이드는 탈락된다.
NME7-AB의 단편은 암세포 성장 및 보다 전이성 상태로의 암세포의 변이를 저해한다. 언급하자면, 개별적으로(도 28) 또는 조합하여(도 29) 첨가된 NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3는 암세포의 성장을 저해한다. 또한, NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3는 보다 전이성 상태로의 암세포의 변이를 저해하였다(도 31b 내지 도 31c).
따라서, NME7에 특이적인 펩타이드, 및 NME7-AB 또는 NME7-X1에 특이적인 펩타이드를 사용하여 면역화함으로써 생성되는 항체는 NME7 종의 암성 작용을 차단할 것이며, 강력한 항암제일 것이다. 유사하게는, 이들 결과는, NME7에 특이적이고 NME7-AB 또는 NME7-X1에 특이적인 펩타이드가 NME7 종의 암성 작용을 차단할 것임을 보여준다. 본 발명의 일 양태에서, 펩타이드는 도 16에 도시된 목록으로부터 선택된다. 본 발명의 일 양태에서, 펩타이드는 도 17에 도시된 목록으로부터 선택된다. 본 발명의 일 양태에서, 펩타이드는 도 18에 도시된 목록으로부터 선택된다. 본 발명의 보다 다른 양태에서, 펩타이드는 도 19에 도시된 목록으로부터 선택된다.
암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-NME7 항체는 당업계에 알려진 표준 방법에 의해 생성될 수 있으며, 여기서, 이들 방법은 NME7, NME7-AB 또는 보다 짧은 형태의 NME7-AB를 인지하는 항체 또는 항체-유사 분자를 생성하는 데 사용되며, 여기서, N-말단을 형성하는 부가적인 10개 내지 25개의 아미노산은 존재하지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 소분자는, NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1의 종양원성 효과를 저해하는 능력에 대해 선택된 항암제이다. 예를 들어, 고속 대량 스크린은 암을 치료할 소분자를 동정한다. 다중-웰 플레이트에서, 소분자는, NME7-AB를 함유하는 배지에서 암세포가 배양되는 웰에 개별적으로 첨가된다. 소분자가, 부유 세포로 되는 세포의 양을 감소시키고/감소시키거나 전이 마커, 예컨대 CXCR4, CHD1 또는 전분화능 줄기세포 마커의 발현을 저하시키면, 소분자는 항암 약물 후보물질이다. 항암제인 소분자를 동정하는 또 다른 방법은, NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하거나 NME7 종의 발현을 억제하는 소분자를 선택하는 것이다. 또 다른 고속 대량 스크린은, MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 펩타이드로의 NME7-AB의 결합을 저해하는 소분자를 선택하는 것이며, 이들 소분자는 항암제일 것이다.
NME7-AB 및 NME7-X1의 서열은, NME7-AB가 가지고 있는 N-말단 서열의 일부를 NME7-X1은 갖지 않는다는 점에서만 차이가 난다. 실험은, NME7-AB에 거의 일치하는 자연 발생 NME7 종이 존재함을 보여주며, 본 발명자들은 이를 NME-AB-유사 종이라 칭한다. NME7-X1에 결합하는 항체는 또한, 항체가 차별화될 수 있는 구조적 차이가 존재하지 않는다면, NME7-AB를 모방하는 자연 발생 종에도 결합할 수 있다. 따라서, NME7-AB-유사 종이 아닌 NME7-X1을 저해하는 것이 바람직하거나 그 반대가 바람직하다면, siRNA, 안티-센스 핵산, 또는 유전자 편집 기술이 사용되어, 둘 중 하나의 발현을 저해할 수 있다.
일 경우에서, 항암 치료제는 NME7, NME7-X1 또는 NME7-AB-유사 종의 특이적인 발현을 직접 또는 간접적으로 억제하는 핵산이다. 이러한 핵산은 NME7 종을 직접 억제하는 siRNA, RNAi, 안티-센스 핵산 등일 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 핵산은, 예를 들어 NME7 종을 조절하는 분자의 발현을 변경시킴으로써 NME7 종을 간접적으로 억제할 수 있다. 예를 들어, 슈퍼 인핸서 BRD4는 NME7의 발현을 억제한다. 따라서, 암의 치료 또는 예방을 위한 효과적인 치료제는 BRD4의 발현을 증가시키는 작용제이다. 효과적인 치료제는 BRD4의 발현의 공동인자인 JMJD6를 증가시키는 작용제이다.
NME7-AB 또는 NME7-X1 유래의 펩타이드 또는 전체 단백질은, 본 발명자들이 암 성장을 저해하고 전이성 암세포로의 암세포의 변이를 저해함을 입증한 항-NME7 항체 또는 항-NME7-X1 항체를 동물에서 생성하는 데 사용된다. 유사하게는, NME7-유래의 펩타이드는, 이러한 펩타이드가 암을 치료 또는 방지하거나 전이성 암세포로의 암세포의 변이를 저해하는 항체를 생성하도록, 인간에게 투여될 수 있다. NME7 펩타이드 또는 단백질은, 수여자에서 항-NME7 항체, 항-NME7-AB 항체 또는 항-NME7-X1 항체의 생성을 자극하기 위해 하나의 백신 유형으로서 사람에게 투여된다. 도 28 및 도 29에 도시된 결과는, NME7, 특히 NME7-X1 또는 NME7-AB 서열 유래의 펩타이드의 컬렉션을 사용하여 사람을 면역화시키는 것은 단일 펩타이드를 사용한 면역화보다 더 효과적인 백신일 수 있음을 가리킨다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 추가로, 면역 반응의 자극에 일조하기 위해 당업자에게 알려진 담체 단백질 또는 다른 아쥬반트에 공액될 수 있다.
암의 치료 또는 예방을 위한 항체를 생성하기 위해서는, DM10 도메인의 외부에 존재하는 NME7 펩타이드가 바람직하다. 암 또는 전이의 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있는 펩타이드는 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드의 서열을 함유한다. A1, A2, B1, B2 및 B3는, NME7-AB 및 NME7-X1에 결합하고 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여되는 항체를 생성하는 펩타이드의 예들이다. 본 발명은, 이러한 펩타이드가 NME7 또는 NME7-X1에서 자연 발생적이기 때문에, 정확한 서열을 가진 펩타이드로 한정되지 않는다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 펩타이드 서열의 몇몇 아미노산의 치환은 천연 단백질 서열을 특이적으로 인지하는 항체를 여전히 발생시킬 수 있다. 본 발명은, 암 성장을 저해하거나 전이성 암세포로의 보통의 암세포의 변이를 저해하는 것으로 본원에서 언급된 펩타이드로 한정되는 것이 아니다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 동정하기 위해 본원에 사용되는 방법은 또한, 본원에서 언급된 펩타이드와 동등하게 효과적이거나 더 효과적일 수 있었던 다른 펩타이드 서열을 동정하는 데 사용될 수 있다.
인간 NME7-AB 또는 NME7-X1의 일부를 포함하는 키메라 항원 수용체 분자, 또는 NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하는 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 분자는 항암 치료제이고, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다.
일 예에서, 항-NME7 항체의 인지 단위 또는 가변 영역은 CAR(키메라 항원 수용체) 기술 또는 CAR T 기술로서 알려진 기술을 사용하여 T 세포의 분자에 융합된다. 암을 치료하거나 예방하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있는 항체 또는 이의 단편의 가장 중요한 특징은, NME7을 인지하고, 암을 촉진하는 표적과 NME7과의 상호작용을 방지하는 항체-유사 가변 영역의 동정이다. 일 경우에서, 표적은 MUC1*의 PSMGFR 영역이다.
항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체는 CAR로도 알려져 있는 키메라 항원 수용체를 비롯한 키메라 분자 내로 조작될 수 있으며, 그런 다음 이러한 분자는 T 세포와 같은 면역계 세포 내로 형질감염되거나 형질도입된 다음, 환자에게 투여된다. 인간화된 항체 또는 항체 단편, 전형적으로 scFv는 CAR의 세포외 도메인의 대부분을 포함한다. 항체 단편은, 막관통 도메인으로서 CD8과 같은 면역계 신호전달 분자 및 세포질 신호전달 모티프, 예컨대 활성화 도메인으로도 칭해지는 T 세포 수용체 신호전달 분자, 또는 비제한적으로 CD3-제타, CD28, 41bb, OX40을 포함하는 공동-자극 도메인에 생화학적으로 융합된다. CAR은 T 세포 또는 다른 세포, 바람직하게는 면역계 세포 내로 형질감염된 다음, 환자에게 투여될 수 있다. 본원에서, 본 발명자들은, 세포외 부분이 항-NME7, 항-NME7-AB 또는 항-NME7-X1 항체, 항체 단편 또는 단쇄, scFv 항체 단편을 함유하는 CAR을 기술하고 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 항체 또는 인간화된 항체이다.
효과적인 항-NME7 항체 또는 항-NME7-X1 항체 또는 이들의 단편은 본래의 NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하는 능력을 가질 것이다. 사실상, CAR의 세포외 도메인이 조작되는 부모 항체는 NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1 유래의 펩타이드를 동물에게 면역화함으로써 생성된다. 본 발명의 일 양태에서, 면역화 펩타이드는 NME7 아미노산 1-376으로 이루어진다. 본 발명의 일 양태에서, 면역화 펩타이드는 NME7 아미노산 92-376으로 이루어진다. 본 발명의 다른 양태에서, 면역화 펩타이드는 NME7 아미노산 125-376으로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 면역화 펩타이드는 도 16 내지 도 18에 열거된 서열로 제조된다. 본 발명의 다른 양태에서, 면역화 펩타이드는 도 19에 열거된 서열로 제조된다. 대안적으로, 부모 항체 또는 항체 단편은 항체 라이브러리 또는 항체 풀로부터 선택되며, 이러한 항체는 천연 항체, 합성 항체 또는 이들의 단편일 수 있으며, 여기서, 이들 항체는 NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1, 도 16 내지 도 18에 열거된 펩타이드 또는 도 19에 열거된 펩타이드로의 결합 능력에 대해 선택된다.
CAR의 표적화 부분은 항체 또는 항체 단편일 필요가 없다. 본원에서, 본 발명자들은, 세포외 도메인이 NME7 단편을 함유하는 CAR을 기술하고 있다. NME7-유래의 펩타이드(들)는 상이한 종류의 CAR 내로 조작되며, 여기서, 세포외 도메인의 표적화 부분은 항체 또는 항체 단편이기보다는 단백질 단편 또는 펩타이드이다. 펩타이드 CAR은 면역계 세포, 전형적으로 T 세포 내로 형질감염 또는 형질도입된다. NME7 단편 또는 NME7-유래의 펩타이드는 이들의 동족 결합 파트너에의 결합 능력에 대해 선택되지만, 온전한 NME7, NME7-AB 또는 NME7-X1로서 작용할 수 없으며 종양원성 활성을 부여하지 않아야 한다. NME7 단편 또는 NME7-유래의 펩타이드는, 막관통 도메인CD8과 같은 면역계 신호전달 분자 및 세포질 신호전달 모티프, 예컨대 활성화 도메인으로도 칭해지는 T 세포 수용체 신호전달 분자, 또는 비제한적으로 CD3-제타, CD28, 41bb, OX40을 포함하는 공동-자극 도메인에 생화학적으로 융합된다.
본 발명의 일 양태에서, NME7 단편은 NME7 NDPK B 도메인의 대부분이거나 모두이다. 본 발명의 다른 양태에서, NME7 단편은 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드 서열을 하나 이상 함유하는 NME7 펩타이드이다. 실험은, NME7, NME7의 단편, NME7-AB 또는 NME7-X1을 조작된 면역 세포 치료제를 위한 키메라 항원 수용체(CAR)의 표적화 부분으로서 사용하는 전략에 있어서, 상당히 큰 NME7-AB의 단편 또는 NME7-X1이 더 짧은 펩타이드, 예를 들어 길이가 15개 아미노산 미만인 펩타이드보다 더 효과적일 것임을 가리킨다. 대안적으로, 각각이 상이한 NME7-AB 유래의 펩타이드를 가진 CAR의 컬렉션은 수집해서 면역계 세포 내로 형질감염되거나 형질도입된 다음, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 도 28 및 도 29에 도시된 실험은 이러한 접근법의 타당성을 지지한다.
NME7 단편을 이의 세포외 도메인에 함유하는 CAR은 면역계 세포, 전형적으로 T 세포 내로 형질감염되거나 형질도입된 다음, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 일 양태에서, 암은 MUC1*-양성 암이다. 또 다른 양태에서, 암은 전이성 암이다.
NME7을 절단하는 효소를 저해하는 작용제는 암을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 일부 형태의 NME7은 세포 내에서 격리되며, 따라서, 세포로부터 분비되지 않으며, 이때, 이들은 암을 촉진하는 성장 인자로서 작용할 수 있다. 전장 NME7은 42 kDa이다. 그러나, 본 발명자들은, DM10 도메인을 포함하지 않으며 본 발명자들이 생성한 재조합 NME7-AB와 본질적으로 일치하는 것으로 보이는 약 33 kDa NME7 종이 암세포 및 줄기세포로부터 분비된다는 것을 발견하였다. 이러한 약 33 kDa NME7 종 및 다른 약 25 kDa NME7 종은, NME7의 절단을 저해한 작용제에 의해 제거될 절단 생성물일 수 있다.
환자 검체에서 NME7, 또는 본 발명자들이 NME7-AB-유사 종이라고 칭하는 약 33 kDa NME7 종, 또는 NME7-X1의 상승된 수준의 검출은 암의 존재, 또는 보다 공격적인 상태 또는 전이성 상태로의 암의 진행을 나타내는 진단 지표이다. 본 발명자들은, 조기 단계의 네이브 줄기세포 및 암세포, 특히 MUC1*-양성 암세포 둘 모두가, DM10 도메인을 포함하지 않는 약 33 kDa NME7 및 NME7-X1을 높은 수준으로 발현한다는 것을 발견하였다.
NME7-X1은 최근에 NME7의 이론학적으로 대안적인 아이소폼으로서 단백질 데이터베이스에 열거되었으나, 이는 조직 또는 세포에서 전혀 검출되지 않았다. 본 발명자들은, PCR에 의해 NME7-X1을 NME7으로부터 구별하는 프라이머를 디자인하였다. 인간 NME7, NME7a, NME7b 및 NME7-X1의 발현 수준을, 섬유아세포, 인간 배아 줄기세포, 인간 iPS 세포, T47D 인간 유방암 세포, DU145 인간 전립선암 세포, PC3 인간 전립선암 세포, HEK295 인간 태아 간 세포 및 다른 인간 줄기세포주를 포함하는 세포 패널에서 PCR에 의해 측정하였다. NME7은 줄기세포에서보다 암세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 특히, NME7-X1은 섬유아세포 또는 줄기세포에서보다 전립선암 세포에서 10배 더 높게 발현되고, 유방암 세포에서 3배 더 높게 발현된다. NME7-X1은 섬유아세포 또는 줄기세포에서보다 HEK293 태아 간 세포에서 약 5배 더 높게 발현되며, 따라서, NME7-X1이 간암에서 상승된다는 것을 예측한다. NME7b는 줄기세포에서보다 전립선암 세포에서 17배 내지 25배 더 높게 발현된다.
환자 검체에서 NME7 종의 상승된 수준의 검출은, 환자가 암을 가지고 있거나 암 발병 위험에 있음을 가리는 지표일 것이다. NME7 종 수준은 PCR, 혼성화 계획(scheme), 사이클링 탐침 기술, FISH, 면역세포화학, IHC, 웨스턴 블롯, 면역침전, 샌드위치 분석법, ELISA 분석법 등에 의해 측정되거나 평가될 수 있다. 환자 검체는 체액 검체, 혈액 검체, 젖, 소변, 세포, 액체 생검, 생검 등일 수 있다. 암을 진단받은 환자에서, NME7 종의 상승된 수준은 전이 잠재력 증가의 지표이다. NME7-X1의 상승된 수준은 전립선암의 지표이다. 본 발명의 항체는 NME7 종을 검출하고 구별하는 데 사용되며, 진단 툴로서 사용된다.
성인 세포 및 조직은 NME7을 유의미한 수준으로 발현하지 않거나 NME7을 분비하지 않기 때문에, 암을 진단하거나, 보다 공격적이거나 전이성 형태를 진단하거나, 보다 공격적인 형태로의 시프트를 진단하기 위한 효과적인 방식은, 환자, 세포 또는 조직 컬렉션, 또는 배양된 세포로부터의 검체에서 NME7의 수준을, 건강한 검체 내의 NME7의 수준과 비교하거나, 건강한 성인 세포 또는 조직에 존재하는 것으로 알려진 NME7의 수준과 비교하여 측정하는 것이다. NME7의 증가된 수준은 암의 존재, 전이성 암의 존재 또는 전이의 개시를 가리킨다. NME7의 증가된 수준은 또한, MUC1*-양성 암의 지표이다. NME7의 존재에 대해 분석된 검체는 배양된 세포주 또는 환자 유래의 세포일 수 있는 세포 컬렉션, 체액, 혈액 검체, 조직 표본 또는 생검 표본일 수 있다. 따라서, 암의 존재 또는 암의 진행을 검출할 진단 분석법은, 1) 암 환자 또는 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 검체를 수득하는 단계; 2) 해당 검체를, NME7의 수준, 또는 NME7을 인코딩하는 핵산의 수준을 검출하거나 측정할 수 있는 분석법으로 처리하는 단계; 3) 시험 검체에서 측정된 NME7 단백질 또는 NME7-인코딩 핵산의 수준을 대조군 환자 또는 대조군 세포에서의 수준과 비교하는 단계; 4) NME7 또는 NME7을 인코딩하는 핵산의 수준이 대조군과 비교하여 상승되는지 확인하는 단계; 및 5) 시험이 비교되는 대조군이 이전에 암을 진단받은 공여자로부터 유래된 것이라면, 시험 검체의 공여자가 암을 가지고 있거나, 암이 진행되었다고 결론 내리는 단계를 포함한다.
이러한 분석법에서, 시험 검체가 비교되는 대조군 검체는 비-암성 세포, 배양된 세포, 건강한 공여자 유래의 검체, 공여자 유래의 비-암성 검체, 또는 시험 검체의 공여자 유래의 검체일 수 있으며, 여기서, 대조군 검체는 이전 시점에서 공여자로부터 취하였다. 이러한 검체의 공급원은 암의 존재 또는 진행에 대해 시험되고 있는 환자로부터 취한 체액, 뇌척수액, 골수 검체, 혈액, 조직, 세포, 생검 조직 또는 세포, 환자의 세포로부터 유래된 배양된 세포 등을 비롯한 임의의 표본일 수 있다. 시험 검체가 비교되는 검체의 공급원은 체액, 뇌척수액, 골수 검체, 혈액, 조직, 세포, 생검 조직 또는 세포, 또는 건강한 공여자 또는 시험 환자로부터 유래될 수 있는 배양된 세포일 수 있으며, 여기서, 검체는 이전의 시점에서 취하였다. 시험 검체가 비교되는 측정된 수준은 이전에 기록된 데이터로부터 유래될 수 있으며, 시험 검체와의 비교를 위해 목록으로 엮일 수 있다.
치료진단법(theranostics)
그런 다음, NME7 단백질 또는 NME7을 인코딩하는 핵산의 수준이 상승된 것으로 진단받은 환자를, NME7의 발현을 억제하거나, NME7의 절단을 저해하거나, 암을 촉진하는 표적으로의 NME7의 결합을 저해하는 치료제로 치료한다. NME7, 또는 NME7의 절단 생성물의 중요한 표적은 MUC1*이다. NME7은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하여, 이를 이량체화한다. 따라서, NME7 수준이 상승된 것으로 진단받은 환자는, NME7을 저해하는 치료제 및/또는 MUC1의 절단된 형태의 이량체화를 저해하는 치료제를 사용한 치료로부터 이득을 얻을 것이며, MUC1의 세포외 도메인은 PSMGFR 서열을 일부 또는 모두 포함한다. 따라서, 암 치료의 적합성, 및 암의 치료 또는 예방을 위한 치료제의 유효량의 투여를 평가하는 것은, 1) 암이 의심되는 환자, 암이 발병할 위험이 있는 환자, 또는 전이성 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 검체를 수득하는 단계; 2) NME7, 이의 절단 생성물, 또는 NME7을 인코딩하는 핵산의 양을 측정하는 단계로서, 측정된 수준이 대조군 검체에서 측정된 것보다 상당히 더 높은, 단계; 3) 환자가 암을 가지고 있거나 환자에서 보다 공격적인 암 또는 전이성 암이 발병되었음을 확인하는 단계; 4) NME7의 발현을 억제하거나, NME7의 절단을 저해하거나, 표적으로의 NME7의 결합을 저해하는 치료제를 유효량으로 환자에게 투여하고/투여하거나 NME7의 발현을 억제하거나, MUC1*로의 MUC1의 절단을 저해하거나, 표적으로의 MUC1*의 결합을 저해하는 치료제를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계로 이루어질 것이다. 바람직한 실시형태에서, 표적으로의 NME7의 결합을 저해하는 치료제는 NME7과 MUC1*와의 상호작용을 저해한다. 더 바람직한 실시형태에서, 이러한 치료제는 NME7과, 본질적으로 PSMGFR 서열로 이루어진 MUC1*의 세포외 도메인과의 상호작용을 저해한다. 바람직한 실시형태에서, 표적으로의 MUC1*의 결합을 저해하는 치료제는 MUC1*와 NME7 사이의 상호작용을 저해한다. 더 바람직한 실시형태에서, MUC1*와 NME7 사이의 상호작용을 저해하는 치료제는, 본질적으로 NME7-AB의 서열로 이루어진 NME7의 부분에 MUC1*이 결합하는 것을 저해한다.
화학적으로 변형된 펩타이드
폴리펩타이드 또는 항체 치료제는 순환 반감기가 짧고, 단백질용해성 분해되며, 용해도가 낮을 수 있다. 본 발명의 생물약제의 약물동력학 및 약력학을 개선하기 위해, 면역원성을 감소 또는 증가시키고, 단백질용해성 절단을 감소시키기 위한 아미노산의 조작과 같은 방법이 수행될 수 있으며; 면역글로불린 및 알부민과 같은 혈청 단백질에의 펩타이드의 융합 또는 공액이 수행될 수 있으며; 보호 및 서방성을 위해 생물약제, 예컨대 본 발명의 펩타이드 및 항체용 약물 전달 비히클 내로의 혼입이 또한 수행될 수 있고; 천연 중합체 또는 합성 중합체에의 공액이 또한 고려된다. 특히, 합성 중합체 공액을 위해, 페길화(pegylation) 또는 아실화, 예컨대 N-아실화, S-아실화 등이 또한 고려된다.
핵산 구축물
본 발명은 또한, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 여기서, 핵산 분자는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 본 발명은 또한, 폴리펩타이드의 제조를 위한 숙주-벡터 시스템을 제공하며, 이러한 시스템은 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포 내로 도입된 본 발명의 발현 벡터를 포함한다. 적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대 E. coli, 효모 세포, 예컨대 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충 세포, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 또는 포유류 세포, 예컨대 COS, HEK 또는 CHO 세포일 수 있다.
본 발명은 또한, 폴리펩타이드의 제조를 허용하고 결과적으로 제조된 폴리펩타이드를 회수하는 조건 하에, 본원에 기술된 숙주-벡터 시스템의 세포를 성장시킴으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명을 실시하는 데 유용한 폴리펩타이드는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 발현에 의해 제조될 수 있다.
재조합 유전자가 발현되고, 폴리펩타이드는 임의의 수의 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 유전자는 예를 들어 비제한적으로 pZErO와 같은 박테리아 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다.
폴리펩타이드는 임의의 기술에 의해 정제되어, 안정한 생물학적 활성 단백질이 후속적으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 인자들은 세포로부터 가용성 단백질 또는 봉입체(inclusion body)로서 회수될 수 있으며, 이로부터 인자들은 8 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 투석에 의해 정량적으로 추출될 수 있다. 인자들을 더 정제하기 위해, 비제한적으로 종래의 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 상이한 당 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과를 비롯한 임의의 수의 정제 방법이 사용될 수 있다.
본원에서 사용되었을 때, 폴리펩타이드는 기능적으로 동등한 분자를 포함하며, 이 분자에서 서열 내의 잔기에 대해 아미노산 잔기가 치환되어, 침묵 변화 또는 보존 변화가 초래된다. 예를 들어, 서열 내의 하나 이상 아미노산 잔기는 유사한 극성을 가진 또 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 이는 기능적 동등물로서 작용하여, 침묵 변경 또는 보존 변경이 초래된다. 서열 내 아미노산에 대한 치환기는, 해당 아미노산이 속한 부류의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 극성 중성 아미노산으로는, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양전하성(염기성) 아미노산으로는, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 있다. 음전하성(산성) 아미노산으로는, 아스파트르산 및 글루탐산이 있다. 잠재적인 글리코실화 아미노산으로는, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴이 있다. 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질, 단편 또는 이들의 유도체, 및 번역 동안이나 번역 후에 예를 들어 글리코실화, 단백질용해성 절단, 항체 분자 또는 다른 세포성 리간드에의 연결 등에 의해 상이하게 변형되는 유도체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
당업자에게 알려진, DNA 단편을 벡터 내로 삽입시키는 임의의 방법이 사용되어, 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 발현 벡터를 적절한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 코딩 서열을 사용하여 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기술, 및 생체내 재조합(유전적 재조합)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열의 발현은, 폴리펩타이드가 재조합 DNA 분자로 변형된 숙주에서 발현되도록, 제2 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 폴리펩타이드의 발현은 당업계에 알려진 프로모터/인핸서 요소에 의해 조절될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있는 프로모터로는, Squinto 등(1991, Cell 65:1-20)에 기술된 바와 같은 긴(long) 말단 반복부; SV40 조기(early) 프로모터 영역(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), CMV 프로모터, M-MuLV 5' 말단 반복부, 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 원핵 발현 벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), 또는 tac 프로모터(DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25), "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94 참조; 효모 또는 다른 진균류 유래의 프로모터 요소, 예컨대 Gal 4 프로모터, ADH(알코올 디하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 유전자 이식 동물에 이용되어 온 하기 동물 전사 조절 영역: 췌장 선포 세포(acinar cell)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프모양 세포(lymphoid cell)에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환 세포, 유방 세포, 림프모양 세포 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), 센다이 바이러스, 렌티 바이러스, 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌 내의 희돌기세포에서 활성인 미엘린 베이직 단백질 유전자 조절 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Shani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상하부에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 조절 영역(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명에 따르면, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하며 박테리아 또는 진핵 숙주에서 복제될 수 있는 발현 벡터가 사용되어, 숙주를 형질감염시키고, 이로써, 이러한 핵산이 발현되어 폴리펩타이드가 제조될 수 있게 하며, 그런 다음, 이러한 폴리펩타이드는 생물학적 활성 형태로 회수될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 형태는 관련 수용체에 결합할 수 있고, 차별화된 기능을 유발하고/거나 수용체를 발현하는 세포의 표현형에 영향을 미치는 형태를 포함한다.
핵산 삽입물을 함유하는 발현 벡터는 비제한적으로, 적어도 3개의 일반적인 접근법에 의해 확인될 수 있다: (a) DNA-DNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 제1 접근법에서, 발현 벡터 내에 삽입된 외래 핵산의 존재는, 삽입된 핵산 서열에 상동성인 서열을 포함하는 프로브를 사용하여 DNA-DNA 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 제2 접근법에서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터 내로의 외래 핵산 서열의 삽입에 의해 유발되는 소정의 "마커" 유전자 기능(예, 티미딘 키나제 활성, 항생제에 대한 내성, 변환 표현형, 배큘로바이러스(baculovirus)에서의 폐색체(occlusion body) 형성 등)의 존재 또는 부재를 기재로 확인 및 선택될 수 있다. 예를 들어, efl 핵산 서열이 벡터의 마커 유전자 서열 내에 삽입되면, 삽입체를 함유하는 재조합이 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 제3 접근법에서, 재조합 발현 벡터는 재조합 구축물에 의해 발현되는 외래 핵산 생성물을 분석함으로써 확인될 수 있다. 이러한 분석법은 예를 들어, 관심 핵산 생성물의 물리적 특성 또는 기능적 특성을 기재로 할 수 있으며, 예를 들어, 검출가능한 항체 또는 이의 일부로 태깅될 수 있는 수용체 또는 이의 일부에의 리간드의 결합, 또는 관심 단백질 또는 이의 일부에 대해 제조된 항체에의 결합에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 특히 변형된 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 일시적으로, 구성적으로 또는 영구적으로 발현될 수 있다.
본 출원에서 언급되는 질환 또는 장애의 치료에 유용한 유효 용량은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다(예, Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Treatments, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co, New York, pp. 1-46 (1975 참조). 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은, 생체내 투여되기 전에, 담체 또는 표적화 분자(예, 항체, 호르몬, 성장 인자 등)에 연결되고/연결되거나 리포좀, 미세캡슐 및 서방성 조제물 내에 혼입된 전술한 폴리펩타이드를 약물학적으로 허용가능한 액체, 고체 또는 반고체 담체 형태로 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 수용액, 예컨대 멸균 물, 식염수, 포스페이트 완충제 또는 덱스트로스 용액 내에 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성제는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식될 수 있는 고체(예, 왁스) 또는 반고체(예, 젤라틴성) 제형에 포함될 수 있다. 투여 경로는 당업계에 알려진 임의의 투여 방식일 수 있으며, 비제한적으로, 정맥내, 척추강내, 피하, 자궁내, 관련 조직 내로의 주사, 동맥내, 비내, 경구 또는 이식 장치를 통한 것이다.
투여에 의해, 본 발명의 활성제가 신체 전반적으로 또는 국소화된 영역에 분포될 수 있다. 예를 들어, 신경계의 동떨어진 영역을 수반하는 일부 조건에서, 작용제의 정맥내 또는 척추강내 투여가 바람직할 수 있다. 일부 상황에서, 활성제를 함유하는 이식물이 병변 영역 또는 그 부근에 위치될 수 있다. 적합한 이식물로는, 젤폼, 왁스, 스프레이 또는 미세입자-기재 이식물 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 폴리펩타이드를 약물학적으로 허용가능한 비히클에 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 조성물은 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적절한 투여 방식이 사용될 수 있으며, 이로는, 정맥내, 척추강내, 동맥내, 비내, 경구, 피하, 복강내 투여, 또는 국소 주사 또는 수술적 이식 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 서방성 제형 또한, 제공된다.
유전자 치료법
유전자 치료법은 발현된 핵산 또는 발현가능한 핵산을 피험자에게 투여함으로써 수행되는 치료법을 지칭한다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 핵산은 치료 효과를 매개하는, 핵산의 인코딩된 단백질을 생성한다.
당업자에게 이용가능한 임의의 유전자 치료 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 후술된다.
유전자 치료 방법에 대한 일반적인 리뷰를 위해서는, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)를 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 보편적으로 알려진 방법은 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에 기술되어 있다.
환자에게 핵산을 전달하는 것은 직접적일 수 있으며, 이 경우 환자는 핵산 또는 핵산-운반 벡터에 직접 노출되며, 또는 전달은 간접적일 수 있으며, 이 경우 세포는 우선 시험관내에서 핵산으로 변환된 다음, 환자에게 이식된다. 이들 2개의 접근법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 치료법으로서 알려져 있다.
구체적인 실시형태에서, 핵산 서열은 생체내에서 직접 투여되며, 이때, 서열이 발현되어, 인코딩된 생성물이 제조된다. 이는 당업계에 알려진 수많은 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있으며, 예를 들어, 이들을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구축하고, 이러한 벡터 일부를 투여하여, 이들이 예를 들어, 결함되거나 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해, 또는 네이키드 DNA의 직접 주사에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 코팅, 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐 내에서의 캡슐화에 의해 세포내 성분으로 되거나, 핵에 들어가는 것으로 알려진 펩타이드에 연결된 상태에서의 투여에 의해, 수용체-매개 엔도사이토시스에의 리간드에의 연결된 상태로 피험자에게 투여 등에 의해 구축될 수 있다(예, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) 참조)(수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적으로 하는 데 사용될 수 있음). 다른 실시형태에서, 핵산-리간드 복합체가 형성될 수 있으며, 이 복합체에서, 리간드는 엔도좀을 방해하기 위해 융합생성(fusogenic) 바이러스 펩타이드를 포함하며, 따라서, 핵산은 리포좀에 의해 분해를 피할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 핵산은 특정 수용체를 표적화함으로써, 세포 특이적 취득 및 발현을 위해 생체내에서 표적화될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 상동성 재조합에 의해 발현용 숙주 세포 DNA 내에서 세포내로 도입되고 혼입될 수 있다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).
구체적인 실시형태에서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터가 사용된다. 유전자 치료법에 사용되어야 하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 벡터 내로 클로닝되며, 이러한 벡터는 환자에게로의 유전자의 전달을 촉진한다. 렌티바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 및 다른 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스는 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예들이다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 올바른 패키징 및 숙주 세포 DNA 내로의 통합에 필수적인 구성성분들을 함유한다.
아데노바이러스는 특히, 경미한 질환을 유발하는 호흡기 상피를 자연적으로 감염시키기 때문에, 유전자를 호흡기 상피에 전달하기 위한 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스-기재 전달 시스템에 대한 다른 표적들은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비-분화성 세포를 감염시킬 수 있는 이점을 가지고 있다. 또한, 아데노-연관 바이러스(AAV) 또한, 유전자 치료법에서 사용되도록 제안되었다.
유전자 치료법에 대한 또 다른 접근법은, 전기천공, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 매개 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해, 유전자를 조직 배양중인 세포 내로 이송시키는 단계를 수반한다. 통상적으로, 이송 방법은 선택 마커를 세포에 이송하는 것을 포함한다. 그런 다음, 세포를 선택되도록 두어, 이송된 유전자를 취득하고 이를 발현하고 있는 세포를 단리한다. 그런 다음, 이들 세포를 환자에게 전달한다.
이러한 실시형태에서, 핵산은, 생성되는 재조합 세포의 생체내 투여 전에, 세포 내로 도입된다. 이러한 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 방법으로는, 형질감염, 전기천공, 미세주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터를 사용한 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 이송, 미세세포(micrcell)-매개 유전자 이송, 스페로플라스트(spheroplast) 융합 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 외래 유전자를 세포 내에 도입하는 수많은 기술들이 당업계에 알려져 있으며, 이들 방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있는데, 단, 수여자 세포의 필수적인 발달 및 생리학적 기능은 방해를 받지 않아야 한다. 이러한 기술은 핵산을 세포에 안정하게 이송시키며, 따라서, 핵산은 세포에 의해 발현될 수 있고, 바람직하게는 유전될 수 있고 이의 세포 자손에 의해 발현될 수 있다.
유전자 치료법을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는 임의의 요망되는 이용가능한 세포 유형을 포함하며, 상피 세포, 내피 세포, 케라틴 생성 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예컨대 T-림프구, B-림프구, 단핵구, 대식세포, 중성구, 호산구, 거핵세포, 과립세포; 다양한 줄기세포 또는 전구세포, 특히 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간으로부터 수득되는 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시형태에서, 유전자 치료법에 사용되는 세포는 환자에서 자가 유래적(autologous)이다.
재조합 세포가 유전자 치료법에 사용되는 일 실시형태에서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은, 이들 서열이 세포 또는 이의 자손에 의해 발현될 수 있도록 세포 내로 도입되며, 그런 다음, 재조합 세포는 치료 효과를 위해 생체내에 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 줄기세포 또는 전구세포가 사용된다. 시험관내에서 단리 및 유지될 수 있는 임의의 줄기세포 및/또는 전구세포는 잠재적으로는 본 발명의 이러한 실시형태에 따라 사용될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 유전자 치료법을 목적으로 도입되는 핵산은 코딩 영역에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하며, 따라서, 핵산의 발현은 적절한 전사 인듀서의 존재 또는 부재를 조절함으로써 조절될 수 있다.
치료 조성물
치료 화합물의 제형화는 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 편리하게는 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]를 참조로 할 수 있다. 예를 들어, 매일 체중 1 kg 당 약 0.05 ng 내지 약 20 mg이 투여될 수 있다. 용량 섭생법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 분할 용량들은 매일 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례해서 감소될 수 있다. 활성 화합물은 종래의 방식, 예컨대 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비내, 안내, 피내 또는 좌제 경로 또는 이식(예, 서방성 분자를 복강내 경로에 의해 사용하거나, 시험관 내에서 감작되고 수여자에게 양자 전달되는(adoptively transferred) 단핵구 또는 수지상 세포와 같은 세포를 사용함으로써)에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 펩타이드는, 효소, 산 및 상기 성분을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연적인 조건의 작용으로부터 펩타이드를 보호하기 위해 물질 내에서 코팅될 필요가 있을 수 있다.
예를 들어, 펩타이드의 낮은 친유성은, 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의해 위장관에서와 산 가수분해에 의해 위에서 펩타이드가 파괴될 수 있게 할 것이다. 비경구 투여 이외의 경로에 의해 펩타이드를 투여하기 위해, 펩타이드는 이의 불활성화를 방지하는 물질에 의해 코팅되거나 이러한 물질과 함께 투여될 것이다. 예를 들어, 펩타이드는 아쥬반트 내에서 투여되거나, 효소 저해제와 함께 공동-투여되거나 리포좀 내에서 투여될 수 있다. 본원에서 고려되는 아쥬반트는 레조르시놀, 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르를 포함한다. 효소 저해제는 췌장 트립신 저해제, 다이이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤을 포함한다. 리포좀은 수-중-유-중-수 CGF 에멀젼뿐만 아니라 종래의 리포좀을 포함한다.
활성 화합물은 비경구 또는 복강내로 투여될 수도 있다. 분산액은 또한, 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜들, 이들의 혼합물 및 오일 내에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용을 위한 통상적인 조건 하에, 이들 조제물은 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우, 이러한 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사기 사용성(syringability)이 존재하는 범위까지 유체성이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하고, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 테오머살(theomersal) 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우, 당 또는 소듐 클로라이드와 같은 등장성제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 유발될 수 있다.
멸균 주사액은, 필요한 양의 활성 화합물을 전술한 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 내에서 혼입하고, 필요하다면, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을, 염기성 분산 배지 및 전술한 것들 유래의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기술이며, 이는 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 부가적인 요망되는 성분이 더해진 활성 성분 분말을 제공한다.
펩타이드가 전술한 바와 같이 적합하게 보호될 때, 활성 화합물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용(assimilable edible) 담체와 함께 경구 투여될 수 있거나, 활성 화합물은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 내에 가두어질 수 있거나, 정제로 압축될 수 있거나, 다이어트 식품과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되고, 섭취가능한 정제, 버컬정(buccal tablet), 트로키, 캡슐, 엘릭셔, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 조제물은 활성 화합물을 적어도 1 중량%로 함유해야 한다. 조성물 및 조제물의 백분율은 당연하게도 다양할 수 있으며, 편리하게는 단위 중량의 약 5% 내지 약 80%일 수 있다. 치료적으로 유용한 이러한 조성물 내 활성 화합물의 양은, 적합한 용량이 수득될 양이다. 본 발명에 따라 바람직한 조성물 또는 조제물은, 경구 투약 단위 형태가 활성 화합물을 0.1 ㎍ 내지 2000 mg으로 함유하도록 제조된다.
정제, 알약, 캡슐 등은 또한, 하기를 함유할 수도 있다: 결합제, 예컨대 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 다이칼슘 포스페이트; 붕괴제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 사카린이 첨가될 수 있거나, 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린(wintergreen) 오일 또는 체리향이 첨가될 수 있다. 투약 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 외에도 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질들은 코팅제로서 존재하거나, 그렇지 않으면 투약 단위의 물리적 형태를 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 쉘락, 당 또는 둘 모두를 사용하여 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭셔는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 풍미제, 예컨대 체리향 또는 오렌지향을 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투약 단위 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수하고, 이용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 조제물 및 제형 내로 혼입될 수 있다.
전달 시스템
다양한 전달 시스템은 알려져 있으며, 본 발명의 화합물을 투여하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 리포좀, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현시킬 수 있는 재조합 세포 내에서의 캡슐화, 수용체-매개 엔도사이토시스, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 구축 등이 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 안내, 경막외 및 경구 경로 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사, 상피 라이닝 또는 점액피부 라이닝(예, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 뇌실내 및 척추강내 주사를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는 예를 들어 레저보어, 예컨대 Ommaya 레저보어에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 폐 투여 또한, 이용될 수 있으며, 이는 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용에 의한 것이며, 제형은 에어로졸제를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 비제한적으로 예를 들어, 수술 동안의 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 적용, 주사, 카테터, 좌제, 또는 이식에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식은 시알라스틱 막(sialastic membrane)과 같은 막 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 펩타이드를 비롯한 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하기 위해서는 주의를 기울여야 한다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 또는 조성물은 비히클, 특히 리포좀 내에서 전달될 수 있다. 보다 다른 실시형태에서, 화합물 또는 조성물은 조절 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다. 보다 다른 실시형태에서, 조절 방출 시스템은 치료 표적에 근접하여 위치될 수 있으며, 따라서, 전신 투약 중 오로지 일 분획만 필요할 수 있다.
서열 목록 프리 텍스트
a, g, c, t 이외의 뉴클레오타이드 부호의 사용과 관련하여, 이들은 WIPO 표준 ST.25, 부록 2, 표 1에 기재되어 있는 관례를 따르며, 여기서, k는 t 또는 g를 나타내며; n은 a, c, t 또는 g를 나타내며; m은 a 또는 c; r은 a 또는 g를 나타내며; s는 c 또는 g를 나타내며; w는 a 또는 t를 나타내고, y는 c 또는 t를 나타낸다.
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실시예
실시예 1 - 최소 무-혈청 베이스("MM")(500 ml)의 구성성분
400 ml DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen# 10565-018)
100 ml 넉아웃 혈청 대체물(KO-SR, Invitrogen# 10828-028)
5 ml 100x MEM 비-필수 아미노산 용액(Invitrogen# 11140-050)
0.9 ml(0.1 mM) "β-머캅토에탄올(55 mM 스탁, Invitrogen# 21985-023)
실시예 2 - NME1, NME6 및 NME7의 존재 여부를 알아보기 위한 암세포 및 줄기세포의 탐침
이러한 일련의 실험에서, 본 발명자들은 줄기세포 및 암세포에서 NME6 및 NME7의 발현에 대해 탐침하였다. 또한, 본 발명자들은 MUC1*를 NME7의 표적으로서 확인하였다. 본 발명자들은 먼저, NME1, NME6 및 NME7의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 세포 파쇄물 상에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 1A에서, 항-MUC1* 항체로 코팅된 표면 상에서 NME1 이량체에서 배양했던 BGO1v 인간 배아 줄기세포 유래의 파쇄물(레인 1), 또는 MEF 상에서 bFGF에서 배양했던 BGO1v 인간 배아 줄기세포 유래의 파쇄물(레인 2) 또는 T47D 인간 유방암 세포 파쇄물(레인 3), 또는 양성 대조군인 NME1-wt를 SDS-PAGE에 의해 분리한 다음, 항-NME1 특이적인 항체를 사용하여 탐침하였다. 그 결과, NME1 이량체 또는 bFGF에서 배양되었든지 간에 인간 ES 세포, 및 T47D 암세포에서 강하게 발현되는 것으로 나타난다. 동일한 세포 파쇄물을 SDS-PAGE에 의해 분리한 다음, 항-NME6 특이적인 항체(Abnova사의 항-NME6)를 사용하여 탐침하였다. NME6는 검출되지 않았으나(데이터는 도시되지 않음), 이것은 이후에 보다 농축된 검체에서 검출되었다(도 2 참조).
도 1B에서, 동일한 세포 파쇄물을 SDS-PAGE에 의해 분리한 다음, 항-NME7 특이적인 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc사의 nm23-H7 B9)를 사용하여 탐침하였다. 그 결과, NME7은 항-MUC1* 항체 표면 상에서 NME1 이량체에서 배양된 인간 ES 세포에서는 강하게 발현되며(레인 1), MEF 상에서 bFGF에서 배양된 동일한 ES 세포에서는 약하게 발현되고(레인 2), 유방암 세포에서는 강하게 발현된다(레인 3). NME1이 첨가된 레인 4는 블랭크로서, NME7 항체가 NME1과 교차작용하지 않는다는 것을 의미한다. NME7이 NME1 이량체에서 배양된 줄기세포에서 더 크게 발현된다는 사실은, NME7이 프라임드 세포에서의 발현과 비교해 네이브(naive) 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 의미하는 것으로, 본 발명자들은 줄기세포가 bFGF에서 배양된 세포보다 더 네이브 상태에 있음을 가리키는 마커를 발현함을 보였었다.
NME7이 이의 표적 수용체인 MUC1*와 함께 성장 인자로서 작용하는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 풀-다운 분석법을 수행하였다. 이들 실험에서, 합성 MUC1* 세포외 영역 펩타이드(His-태깅된 PSMGFR 서열)을 NTA-Ni 자기 비드 상에 고정하였다. 이들 비드를, 항-MUC1* 항체로 코팅된 표면 상에서 NME1 이량체에서 배양한 BGO1v 인간 배아 줄기세포의 세포 파쇄물(레인 1), 또는 MEF 상에서 bFGF에서 배양한 BGO1v 인간 배아 줄기세포 유래의 파쇄물(레인 2) 또는 T47D 인간 유방암 세포 파쇄물(레인 3)과 함께 인큐베이션하였다. 비드를 세정하고, 포착된 단백질은 이미다졸을 첨가하여 방출시켰다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리한 다음, 항-NME1 항체(도 1c) 또는 NME7 항체(도 1d)를 사용하여 탐침하였다. 그 결과, NME7가 MUC1* 세포외 영역 펩타이드에 결합하는 것으로 나타난다. 이는, 줄기세포 및 암세포에서, NME7은 이의 2개의 NDPK 영역의 일부를 통해, MUC1* 세포외 영역을 이량체화함으로써 전분화능 경로를 활성화한다는 것을 의미한다.
실시예 3 - MUC1 풀 다운 분석법은, NME1, NME6 및 NME7이 MUC1 종 단백질에 결합한다는 것을 보여준다.
MUC1* 세포질 꼬리(Ab-5)에 대한 항체를 사용하는 풀 다운 분석법을 세포 패널 상에서 수행하였다. 그 결과를 도 2의 A 내지 F에 나타낸다. MUC1 항체에 의해 풀 다운되는 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리한 다음, NME1, NME6 및 NME7에 특이적인 항체를 사용해 웨스턴 블롯 기술에 의해 탐침하였다. MUC1*-양성 유방암 세포주 T47D 세포(ATCC), 인간 배아 줄기세포주 BGO1v(LifeTechnologies), 인간 ES 세포(HES-3, BioTime Inc.), 인간 iPS 세포(SC101A-1, System Biosciences Inc.) 및 T47D 암세포를 10% FBS(VWR)가 더해진 RPMI-1640(ATCC)에서 ATCC 프로토콜에 따라 성장시켰다. 모든 줄기세포들을, 8 nM NM23-RS(재조합 NME1 S120G 이량체)를 포함하는 최소 줄기세포 배지 "MM"에서 배양하였다. 줄기세포를 12.5 ug/mL 항-MUC1* C3 mab로 코팅된 플라스틱 용기 상에서 성장시켰다. 세포를 얼음 상에서 200 uL RIPA 완충제을 사용해 10분 동안 파쇄하였다. 원심분리에 의해 세포 찌꺼기를 제거한 후, 상층액을 공동-면역침전 분석법에 사용하였다. MUC1*은 Dynabeads 단백질 G(Life Technologies)에 결합된, MUC1 세포질 꼬리를 인지하는 Ab-5 항체(항-MUC-1 Ab-5, Thermo Scientific)를 사용해 풀 다운되었다. 비드를 RIPA 완충제를 사용해 2회 세정한 다음, 환원성 완충제에서 재현탁시켰다. 상층액 검체를 환원성 SDS-PAGE로 처리한 다음, 단백질을 PVDF 막으로 이송시켰다. 그런 다음, 도 2에서, 막을, A) 항-NM23-H1(NME1) 항체(C-20, Santa Cruz Biotechnology); B) 항-NME6(Abnova); 또는 C) 항 NM23-H7 항체(B-9, Santa Cruz Biotechnology); D) Supersignal(Pierce)을 사용해 증강된 NME6의 염색; 및 E) Supersignal을 사용해 증강된 NME7의 염색을 사용하여, 탐침하였다.
HRP에 결합된 이들 각각의 이차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 단백질을 화학발광에 의해 검출하였다. 사진은, 본래의 NME1, NME6 및 NME7이 MUC1*-양성 유방암 세포, 인간 ES 세포 및 인간 iPS 세포에 존재하며, 이들은 MUC1*에 결합한다는 것을 보여준다. HES-3 펠렛에 존재하는 세포의 수는 다른 검체들에 존재하는 수보다 적었다는 것에 주목한다.
실시예 4 - 배아 줄기세포 및 iPS 세포에서 NME7의 검출
결과를 도 3에 나타냈다. 인간 ES 세포(BGO1v 및 HES-3)를 NME-베이스의 배지에서 배양하였으며, 여기서, 세포들을 항-MUC1* 항체의 층 상에 평판배양하였다. NME7 종을 확인하기 위해, 세포를 수집하고, 프로테아제 저해제(Pierce)가 보충된 RIPA 완충제(Pierce)로 파쇄하였다. 세포 파쇄물(20 uL)을 12% SDS-PAGE 환원성 겔 상에서의 전기영동에 의해 분리하고, PVDF 막(GE Healthcare)으로 옮겼다. 블롯을 3% 밀크를 포함하는 PBS-T로 차단한 후, 일차 항체(항 NM23-H7 클론 B-9, Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T로 세정한 후, 막을 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 이차 항체(염소 항 마우스, Pierce)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Immun-Star 화학발광 키트(Bio-Rad)를 사용해 신호를 검출하였다. 도 3a는, 인간 줄기세포 유래의 파쇄물이 3개의 NME7 종을 함유함을 보여준다: 42 kDa에서의 전장 NME7 종, 및 약 33 kDa 및 약 30 kDa에서의 2개의 보다 낮은 분자량의 NME7 종. 도 3b 및 도 3c는 분비되는 NME7 종(b)과 세포 내에서 보유되는 NME7 종(c) 사이의 차이를 보여준다. 도 3b는, 오로지 30 kDa 및 33 kDa NME7 종만이 세포로부터 분비됨을 보여준다. 도 3c는, 동일한 세포의 파쇄물이 전장 형태, 및 둘 모두가 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼일 수 있는 보다 낮은 분자량의 종 둘 모두를 가짐을 보여준다. 파트 (b)에 있어서, iPS 조건화된 배지(20 uL)를 12% SDS-PAGE 환원성 겔 상에서 전기영동에 의해 분리하고, PVDF 막(GE Healthcare)으로 옮겼다. 블롯을 3% 밀크를 함유하는 PBS-T로 차단한 다음, 일차 항체(항 NM23-H7 클론 B-9, Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T로 세정한 후, 막을 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 이차 항체(염소 항 마우스, Pierce)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Immun-Star 화학발광 키트(Bio-Rad)를 사용해 신호를 검출하였다. 파트 (c)에서 세포 파쇄물을 조건화된 배지 대신 사용한 것을 제외하고는 유사하게 실시하였다.
실시예 5 - 단백질 구축물의 생성
재조합 NME7을 생성하기 위해, 효율적으로 발현될 수 있고 가용성 형태인 재조합 NME7을 제조하기 위해, 우선 구축물을 제조하였다. 제1 접근법은 본래의 NME7(a), 또는 N-말단 결실을 가진 대안적인 스플라이스 변이체 NME7(b)를 인코딩할 구축물을 제조하는 것이었다. 일부 경우, 구축물은 히스티딘 태그 또는 스트렙(strep) 태그를 가지고 있어서, 정제에 일조하였다. NME7-a, E. coli에서 불량하게 발현되는 전장 NME7 및 NME7-b는 모두 E. coli에서 발현되지 않았다. 그러나, 제조된 신규 구축물은 DM10 서열이 결실되어 있었으며, NME7은 계산된 분자량이 33 kDa인 NDPK A 및 B 도메인을 본질적으로 포함하였다.
이러한 신규 NME7-AB는 E. coli에서 매우 양호하게 발현되었으며, 용해성 단백질로서 존재하였다. NME7-AB를 우선, NTA-Ni 컬럼에 걸쳐 정제한 다음, Sephadex 200 컬럼에 걸친 크기 배제 크로마토그래피(FPLC)에 의해 더 정제하였다(도 4a). 분획을 수집하고, SDS-PAGE에 의해 시험하여, NME7-AB의 가장 높으면서 가장 순수한 발현을 가진 분획을 동정하였다(도 4b). 도 4c는 가장 순수한 조합 분획에 대한 FPLC 트레이스(trace)를 보여준다. 그런 다음, 정제된 NME7-AB 단백질을 시험하였으며, 이는 인간 줄기세포의 성장을 전적으로 지지하고, 이러한 줄기세포를 가장 네이브한 예비-X-불활성화 상태로 역전시키는 것으로 나타났다. 정제된 NME7-AB 또한, 암세포의 성장을 가속화시키는 것으로 나타났다.
실시예 6 - NME7-AB는 2개의 MUC1 * 세포외 영역 펩타이드에 동시에 결합한다는 것을 보여주는 ELISA 분석법
결과를 도 5에 나타냈다. C-말단 시스테인을 가지는 PSMGFR 펩타이드(PSMGFR-Cys)를 Imject Maleimide 활성화된 BSA 키트(Thermo Fisher)를 사용해 BSA에 공유 결합하였다. BSA에 결합된 PSMGFR-Cys를 0.1 M 탄산염/중탄산염 완충제 pH 9.6에서 10 ug/mL로 희석시키고, 50 uL를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 플레이트 PBS-T로 2회 세정하고, 3% BSA 용액을 첨가하여, 웰 상에 잔존하는 결합 부위를 차단하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트를 PBS-T 및 NME7으로 2회 세정하고, 1% BSA가 더해진 PBS-T로 희석시키고, 상이한 농도로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트를 PBS-T 및 항-NM23-H7(B-9, Santa Cruz Biotechnology)로 3회 세정하고, 1% BSA가 더해진 PBS-T에서 희석시키고, 1/500의 희석비로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트를 PBS-T 및 염소 항 마우스-HRP로 3회 세정하고, 1% BSA가 더해진 PBS-T에서 희석시키고, 1/3333의 희석비로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트를 PBS-T로 3회 세정하고, NME7의 결합을 ABTS 용액(Pierce)을 사용해 415 nm에서 측정하였다.
ELISA MUC1* 이량체화: NME7 결합에 대한 프로토콜을 이용하였으며, NME7을 11.6 ug/mL 농도로 사용하였다.
실온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트를 PBS-T 및 His태깅된 PSMGFR 펩타이드(PSMGFR-His) 또는 비오틴화된 PSMGFR 펩타이드(PSMGFR-비오틴)로 3회 세정하고, 1% BSA가 더해진 PBS-T에서 희석시킨 다음, 상이한 농도로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트를 PBS-T 및 항 Histag-HRP(Abcam) 또는 스트렙타비딘-HRP(Pierce)로 3회 세정하고, 1% BSA가 더해진 PBS-T에서 희석시킨 다음, 1/5000의 농도로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 플레이트를 PBS-T로 3회 세정하고, PSMGFR 펩타이드가, BSA에 결합된 다른 PSMGFR 펩타이드(항-His 항체 또는 스트렙타비딘에 의해 신호전달할 수 없었음)에 이미 결합해 있는 NME7에 결합했는지의 여부를 ABTS 용액(Pierce)을 사용해 415 nm에서 측정하였다.
실시예 7 - 인간 재조합 NME7-AB의 기능 시험
전분화능을 유지하고 분화를 저해하는 능력에 대해 재조합 NME7-AB를 시험하기 위해, NME7의 가용성 변이체인 NME7-AB를 생성하고, 정제하였다. 인간 줄기세포(iPS cat# SC101a-1, System Biosciences)를 제조업체의 지시사항에 따라 마우스 섬유아세포 피더 세포 층 상에서 4 ng/ml bFGF에서 4회 계대배양하는 동안 성장시켰다. 그런 다음, 이들 소스 줄기세포를, 모노클로날 항-MUC1* 항체인 MN-C3으로 12.5 ug/웰로 코팅했던 6-웰 세포 배양 플레이트(VitaTM, Thermo Fisher) 상에 평판배양하였다. 세포는 웰 당 300,000개 세포의 밀도로 평판배양하였다. 베이스 배지는, 400 ml DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen# 10565-018), 100 ml 넉아웃 혈청 대체물(KO-SR, Invitrogen# 10828-028), 5 ml 100x MEM 비-필수 아미노산 용액(Invitrogen# 11140-050) 및 0.9 ml(0.1 mM) β-머캅토에탄올(55 mM 스탁, Invitrogen# 21985-023)로 구성된 최소 줄기세포 배지였다. 베이스 배지는 임의의 배지일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 베이스 배지는 다른 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지 않는다. 베이스 배지에, 안정한 이량체로서 다시 접혀지고 정제된 8 nM NME7-AB 또는 8 nM NM23-H1을 첨가하였다. 배지는 48시간마다 교체하였으며, 평판배양 후 3일째에 수집하고 계대배양하여야 했다. 줄기세포를 NM23-H1 이량체 또는 NME7 단량체에서 성장시켰을 때, 유사한 전분화능 줄기세포 성장이 달성되었다.
NME7 및 NM23-H1(NME1) 이량체 둘 모두 전분화능적으로 성장하였으며, 포화도가 100%에 도달할 때에도 분화를 나타내지 않았다. 사진에서 확인할 수 있듯이, NME7 세포는 NM23-H1 이량체에서 성장한 세포보다 더 빠르게 성장하였다. 처음에 수집한 세포의 계수는, NME7에서의 배양이 NM23-H1 이량체에서의 배양보다 세포를 1.4배 더 많이 생성하였음을 입증하였다. 전형적인 전분화능 마커에 대한 ICC 염색에서, NME7-AB가 인간 줄기세포 성장, 전분화능을 전적으로 지지하였으며, 분화를 저지하였음이 확인되었다.
약 30 kDa 내지 33 kDa의 NME7 종은 대안적인 스플라이스 아이소폼이거나 절단과 같은 번역-후 변형된 것일 수 있으며, 이는 세포로부터 분비될 수 있다.
실시예 8 - 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 조건 하에 세포를 배양함으로써, 전이성 암세포로의 암세포의 변이의 유도
암세포를 통상 혈청-함유 배지, 예컨대 RPMI에서 배양한다. 본 발명자들은, 줄기세포를 보다 네이브 상태로 만드는 시약의 존재 하에 암세포를 배양하면, 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킨다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은, NME7-AB, 인간 NME1 이량체, 박테리아 NME1 이량체, NME7-X1 및 "2i" 저해제가 각각 보통의 암세포를 암 줄기세포 "CSC" 또는 종양 개시 세포 "TIC"로도 칭해지는 전이성 암세포로 변환시킬 수 있었다고 언급하였다. 2i는, 연구자들이 인간 줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시킴을 발견한 2개의 생화학적 저해제에게 주어진 명칭이다. 2i는 MEK 및 GSK3-베타 저해제 PD0325901 및 CHIR99021이며, 이들은 각각 약 1 mM 및 3 mM의 최종 농도로 배양 배지에 첨가된다.
NME7-AB 및 NME7-X1은 암세포를 전이성 세포로 변환시키기 위해 최소 배지의 별개의 배치들에 첨가되었을 때, 약 4 nM의 최종 농도로 존재하긴 하지만, 약 1 nM 내지 16 nM 범위의 보다 낮은 농도 및 보다 높은 농도들에서도 양호하게 작용한다. 인간 NME1 이량체 또는 박테리아 NME1 이량체는 4 nM 내지 32 nM의 최종 농도로 사용되며, 16 nM이 이들 실험에 전형적으로 사용되고, 여기서, 인간 NME는 S120G 돌연변이를 가진다. 야생형을 사용하는 경우, 보다 낮은 농도가 필요할 수 있다. 이들 정확한 농도가 중요한 것은 아니다. NME1 단백질이 이량체이고, 이것이 발생하는 농도 범위는 낮은 나노몰 범위에 존재하는 것이 중요하지만, 소정의 돌연변이는 보다 높은 농도에서 이량체로서 유지될 수 있게 한다.
유사하게는, NME7 단백질의 농도는 다양할 수 있다. NME7-AB 및 NME7-X1은 단량체이고, 암세포를 전이성 세포로 변환시키는 데 사용된 농도는 단백질을 단량체로 유지시킬 수 있어야 한다. 다양한 분자 마커는 전이성 암세포의 지표로서 제안되었다. 서로 다른 유형의 암들은, 상향조절되는 상이한 분자들을 가질 수 있다. 예를 들어, 수용체 CXCR4는 전이성 유방암에서 상향조절되며, 한편, CHD1으로도 알려져 있는 E-캐드헤린은 전이성 전립선암에서 더 상향조절된다.
이들 특이적인 전이 마커 외에도, 전분화능에 대한 전형적인 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF4는 암이 전이성으로 됨에 따라 상향조절된다. 출발 암세포 및 이후의 전이성 암세포는 이들 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 PCR에 의해 분석될 수 있다.
도 11은, NME7-AB를 함유한 배지에서 배양된 T47D 유방암 세포의 RT-PCR 측정 그래프를 보여준다. rho I 키나제 저해제, ROCi, ROCKi 또는 Ri를 첨가하여, 변환된 세포가 플레이트로부터 탈착되어 부유하는 것을 방지하였다. 부모 세포 및 NME7-AB 배양된 세포에 대하여 다양한 전이 마커뿐만 아니라 전분화능 줄기세포 마커의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과는, 부유 세포가 ROCi를 수여받은 세포와 비교하여 전이성 마커 및 전분화능 마커를 보다 높은 양으로 발현함을 보여준다. 본 발명자들은 이들 측정 결과가, 변환되지 않은 세포와, 변환은 되었으나 ROCi에 의해 부착성을 유지하는 세포의 평균이었기 때문이라고 생각하였다. 이는 도 12에 명백하게 나타날 수 있으며, 여기서, "-Ri"는 ROCi를 수여받지 않은 부착성 세포이며, 따라서, 부유하는 고도로 전이성인 세포와 혼합되지 않았음을 의미한다.
전립선암 세포는 또한, NM23, 즉 NME1 또는 NME7-AB를 함유하는 배지에서 배양되었을 때, 보다 전이성 상태로 변환되었다. 본원에서, 본 발명자들은, 지금까지 시험된 모든 세포주들에 대해서, NME7-AB, 인간 NME1 이량체, 또는 인간 NME에 대해 높은 서열 상동성을 가진 박테리아 NME에서의 배양이 보다 전이성 상태로의 변이를 유도함을 보여준다.
도 14a는 2i 저해제, NME7-AB 또는 둘 모두를 함유하는 배지에서 배양된 유방암 세포에 대한 전이성 마커 및 전분화능 마커의 발현 수준에 대한 RT-PCR 측정의 그래프를 보여준다. 여기에서 볼 수 있는 바와 같이, 2i 저해제 또한, 보다 전이성 상태로의 암세포의 변이를 유도할 수 있다. 도 14b는 박테리아 HSP593 유래의 NME1을 함유하는 배지에서 배양된 유방암 세포에 대한 전이성 마커 및 전분화능 마커의 발현 수준에 대한 RT-PCR 측정 그래프를 보여주며, 박테리아 HSP593 유래의 NME1의 서열은 인간 NME1 및 NME7-AB에 대해 고도로 상동성이며, 이는, 높은 서열 상동성을 가진 박테리아 NME가 보다 전이성 상태로의 변이를 유도한다는 점에서, 인간 NME1 및 NME7-AB의 효과를 모방할 수 있음을 보여준다. 난소 암세포주 SK-OV3, OV-90, 췌장 암세포주 CAPAN-2 및 PANC-1, 유방암 세포주 MDA-MB는 모두 NME7-AB 및/또는 2i 저해제에서 배양되었을 때, 부착성으로부터 비-부착성으로의 형태학적 변이를 나타내었다.
도 37은 NME7-AB에서 72시간 또는 144시간 동안 배양된 다양한 암세포주들에 대한 전이성 마커 또는 전분화능 마커의 RT-PCR 측정 그래프를 보여준다. 도 37a는, SK-OV3 세포가 NME7-AB에서 배양되었을 때, 전이 마커 CHD1, SOX2 및 NME7-X1의 발현을 증가시킴을 보여준다. 도 37b는, OV-90 세포가 NME7-AB에서 배양된 후, 전이 마커 CXCR4 및 NME7-X1의 발현을 증가시킴을 보여준다.
실시예 9 - NME7에서 배양된 암세포가 전이성으로 된다는 것에 대한 입증
암세포 집단이 전이성인지 아닌지에 대한 기능 시험은, 매우 적은 수, 예를 들어 200개의 세포를 면역-약화된 마우스에 이식하고, 이들 세포가 종양으로 발병되는지 알아보는 것이다. 전형적으로, 면역-약화된 마우스에서 종양을 형성하기 위해서는 5백만개 내지 6백만개의 암세포가 필요하다. 본 발명자들은, 50개만큼 적은 수의 NME-유도 전이성 암세포가 마우스에서 종양을 형성하였음을 보여주었다. 또한, 시험 기간 전체 동안에 인간 NME7-AB, NME1 또는 NME7-X1이 주사된 마우스에서 원거리 전이가 발병되었다.
T47D 인간 유방암 세포를 표준 RPMI 배지에서 14일 동안 배양하였으며, 이때, 배지를 48시간마다 교환하였고, 약 75% 포화되었을 때, 트립신처리에 의해 계대배양하였다. 그런 다음, 세포를 6-웰 플레이트 내로 평판배양하고, 4 nM NME7-AB가 보충된 최소 줄기세포 배지(실시예 1 참조)에서 배양하였다. 배지를 48시간마다 교환하였다. 약 4일까지, 일부 세포는 표면으로부터 탈착되어, 부유 상태로 되었다. "부유 세포"가 전이 마커의 RT-PCR 측정에 의해 입증되는 바와 같이 가장 높은 전이 잠재력을 가진 세포이기 때문에, "부유 세포"를 보유하기 위해 배지를 조심스럽게 교환한다. 7일 또는 8일에, 부유 세포를 수집하고, 계수한다. RT-PCR 측정을 위해 검체를 보유시킨다. 측정된 키 마커는 CXCR4이며, 이는 NME7-AB에서 간단히 배양된 후 40배 내지 200배 상향조절된다.
방금 수집된 부유하는 전이성 세포를, 90-일 서방성 에스트로겐 펠렛이 이식되었던 암컷 nu/nu 무흉선 마우스의 옆구리에 이종 이식하였다. 부유 세포를 각각 10,000개, 1,000개, 100개 또는 50개 세포로 이종 이식하였다. 또한, 6마리로 이루어진 각각의 그룹 내의 마우스 중 절반에는 32 nM NME7-AB를 오리지널 이식 부위 근처에서 매일 주사하였다. NME7-AB를 포함하지 않는 RPMI 배지에서 배양된 부모 T47D 세포를 또한, 대조군으로서 6백만개, 10,000개 또는 100개로 마우스에게 이식하였다. NME7-유도 부유 세포를 이식한 마우스는 50개만큼 적은 수의 세포가 이식되었을 때에도 종양이 발병되었다. 부유 세포를 이식하고, NME7-AB를 매일 주사한 마우스에서는 또한, 원거리 종양이 발병되거나 다양한 기관들에서 원거리 전이가 발병되었다(도 20 내지 도 25). NME7-AB에서 배양된 암세포를 이식한 후, 인간 NME7-AB를 주사한 12마리의 마우스 중 11마리, 또는 92%의 마우스에서는 주사 부위에서 종양이 발병되었다. 이식 후 인간 NME7-AB를 주사하지 않은 12마리의 마우스 중 오로지 7마리 또는 58%의 마우스에서만 종양이 발병되었다. 종양을 가졌으며, 인간 NME7-AB가 주사된 11마리의 마우스 중 9마리 또는 82%의 마우스에서는, 주사 부위로부터 원거리에서 다중 종양들이 발병되었다. NME7-AB를 주사하지 않은 마우스 중 어떤 마우스에서도 가시적인 다중 종양이 발병되지 않았다.
안락사 후, RT-PCR 및 웨스턴 블롯은, NME7-AB를 주사한 마우스 상의 원거리 혹이 사실상 인간 유방 종양이었음을 보여주었다. 이들 기관에 대한 유사한 분석은, 원거리 혹 외에도, 마우스에서, 이식된 인간 유방암 세포의 인간 유방암 특징이 간 및 폐로 무작위로 전이되었음을 보여주었다. 예상된 바와 같이, 6백만개 세포를 이식한 마우스만 종양을 성장시켰다.
전술한 것과 유사한 몇몇 실험들을 수행하였으며, 본질적으로 동일한 결과가 나타났다. 각각의 실험에서, 모든 적절한 대조군들을 비롯하여 24마리 또는 52마리의 마우스가 존재하였다.
실시예 10 - 항-NME7 항체는 암세포 성장을 저해한다.
T47D 유방암 세포 및 DU145 전립선암 세포를 ATCC에 의해 권고된 프로토콜에 따라 배양하였다. 세포를 약 30% 포화도까지 성장시켰다. 항-NME7 폴리클로날 토끼 항체를 전체 단백질: 아미노산 100 내지 376을 거의 포함하는 NME7의 단편에 대해 생성하였다. 이러한 폴리클로날 항체를 2.7 ng/mL 내지 375 ng/mL의 농도로 암세포에 첨가하였다. 택솔을 양성 대조군으로 사용하였다. 세포의 사진을 촬영하고, 48시간째(도 6 및 도 7) 및 96시간 후(도 8) 계수하였다. 사진 및 세포 계수는, 항체가 유방암 세포 및 전립선암 세포의 성장을 강력하게 저해하였음을 보여준다. 그러나, NME7에 독특한 면역화 펩타이드를 선택하려는 시도는 없었기 때문에, 이러한 항체는 NME7-AB-유사 종 및 NME1 둘 모두에 결합하고 이들을 저해함으로써 세포독성 효과를 발휘할 수 있었다.
실시예 11 - 선택된 펩타이드는 이들의 서열이 NME7, A1, A2, B1, B2 및 B3에 독특하기 때문에, MUC1 * 세포외 도메인 펩타이드로의 NME7 종의 결합을 저해한다.
NME7 펩타이드를 항체 생성을 위한 면역화제로서 선택하였다. NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3(도 19)를, 인간 NME1, 인간 NME7, 및 인간 NME1 또는 인간 NME7에 대해 상동성인 몇몇 박테리아 NME 중에서 서열 정렬 방법을 사용하여 선택하였다. 이중에서 높은 서열 상동성을 가진 5개의 영역을 동정하였다. 그러나, 인간 NME1 뿐만 아니라 인간 NME7을 저해할 항체를 생성할 펩타이드의 선택을 방지하기 위해, 본 발명은 상동성 영역에 인접한 NME7 서열을 선택하였으며, 여기서, 이들 펩타이드는 인간 NME1과 상이한 서열을 가졌다. 본 발명자들은, 펩타이드 자체가 표면 상의 합성 MUC1* 펩타이드에 결합하고, 고정화된 펩타이드로의 인간 NME7 또는 인간 NME1의 결합을 저해할 수 있는지 알아보기 위해 ELISA 분석법을 수행하였다(도 27). 도 27은, 펩타이드가, 고정화된 펩타이드로의 NME7 및 NME1의 결합을 저해하였음을 보여준다. 이는, 펩타이드가 유래된 영역이 MUC1*와 상호작용하였으며, NME7의 영역에 결합하고 MUC1* 수용체로의 이의 결합을 저해할 항체를 생성할 영역이었음을 보여주었다.
또 다른 실험에서, 유리(free) 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를, NME7-AB 또는 2i에서 배양함으로써 보다 전이성 상태로의 변이를 수행하고 있는 배양중인 암세포에 첨가하였다. 도 30은, 암세포를 NME7-AB 또는 2i 저해제에서 성장시킬 때의 과학자들의 관찰 결과의 표를 보여주며, 유리 펩타이드가 부착성 세포에서 부유 세포로의 형태학적 변화를 저해하였으며, 이러한 형태학적 변화는 유방암 세포의 경우 전이 마커, 특히 CXCR4의 증가된 발현과 직접 상관관계가 있음을 보여준다. RT-PCR 측정은, NME7-AB 펩타이드가 전이 마커 CXCR4의 발현 증가를 저해하였음을 확인시켜 준다.
도 31은 NME7-AB 또는 2i 저해제에서 성장시킨 T47D 유방암 세포에서 CXCR4 발현, 및 전이성 변환에 미치는 NME7-유래의 펩타이드, A1, A2, B1, B2 및 B3의 저해 효과에 대한 RT-PCR 측정 그래프를 보여주며, NME7-AB 또는 2i 저해제는 각각 암세포를 보다 전이성 상태로 변환시킨다. 도 32는, 도 31에서 CXCR4의 RT-PCR 측정에 사용된 검체에서 기록된 RNA 수준뿐만 아니라 CXCR4 발현 및 대조군 하우스키핑 유전자에 대한 역치 사이클 수를 보여준다.
실시예 12 - 항-NME7 항체는 인간 NME1이 아닌 인간 NME7에 특이적으로 결합한다
인간 NME1은 건강한 기능을 가지고 이를 항체로 차단하는 것이 인간에게 유해할 수 있기 때문에 본 발명자들은 NME7-AB 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용한 면역화에 의해 생성한 NME7 항체가 인간 NME1이 아닌 NME7-AB에 특이적으로 결합할 것인지 확인하기 위해 표준 ELISA 분석법을 수행하였다. 도 26의 ELISA는, 본 발명자들이 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3로부터 생성한 모든 NME7 항체가 인간 NME1(B)이 아닌 인간 NME7-AB(A)에 결합함을 보여준다. 이들 항체를 생성하기 위해 사용된 펩타이드는 NME7-AB 및 NME7-X1 둘 모두에 보편적이다. 이러한 분석법은, 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3로부터 생성된 항체가 NME7-AB에 특이적으로 결합하며, NME7-X1에도 결합할 것임을 보여준다.
NME7A 펩타이드 1(A 도메인): MLSRKEALDFHVDHQS(서열 번호:141)
NME7A 펩타이드 2(A 도메인): SGVARTDASES(서열 번호:142)
NME7B 펩타이드 1(B 도메인): DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(서열 번호:143)
NME7B 펩타이드 2(B 도메인): EVYKGVVTEYHDMVTE(서열 번호:144)
NME7B 펩타이드 3(B 도메인): AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(서열 번호:145)
실시예 13 - 항-NME7 특이적인 항체, 및 이러한 항체를 생성한 펩타이드는 암세포 성장을 저해하였다
토끼를 NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용하여 면역화시키고, 항체를 생성시키고, 수집한 다음, 면역화 펩타이드가 공액된 컬럼에 걸쳐 정제하였다. T47D 유방암 세포를 평판배양하고, 혈청이 보충된 RPMI 배지에서 ATCC 프로토콜에 따라 배양하였다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화로부터 생성된 항체를 도 28에 지시된 농도에서 첨가하였다. 면역화 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3, 및 본원에서 "FLR"라고 하는 MUC1*의 PSMGFR 세포외 도메인 펩타이드를 또한, 성장중인 T47D 유방암 세포에 개별적으로 첨가하였다. 택솔 및 E6 항-MUC1* Fab를 대조군으로서 첨가하였다. 도 28의 그래프는, 생성된 항체뿐만 아니라 유리 펩타이드가 암세포의 성장을 강력하게 저해하였음을 보여준다. 건강한 세포 및 암세포를 유사하게 살해하는 화학치료제인 택솔을 사용한 저해와의 비교를 주지한다. 또한, 비교를 위해, 아미노산 100 내지 376 유래의 NME7의 큰 스트레치(large stretch)를 사용하여 생성된 폴리클로날 항체를 나타낸다. 이러한 항체가 암 성장의 강력한 저해제이긴 하지만, 이는 NME1 뿐만 아니라 NME7에도 결합할 수 있기 때문에, 비-특이적인 효과를 가질 수 있었다.
유사한 실험에서, 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화로부터 생성된 항체뿐만 아니라 펩타이드 자체를 성장중인 암세포에 지시된 농도로 첨가하였다. 도 29에 도시된 세포 성장의 그래프는, 항체와 펩타이드의 조합이 암세포의 성장을 강력하게 저해하였음을 보여준다. 이들 2개의 실험에서, 세포는 MUC1* 양성 유방암 세포였다.
실시예 14 - 항-NME7 항체는 전이성 암세포로의 암세포의 변이를 저해한다
줄기세포를 보다 네이브 상태로 역전시키는 작용제의 존재 하에 배양되었을 때, 암세포는 보다 전이성 상태로 변환된다. 본 발명자들은, NME7-AB, 인간 NME1 이량체, 박테리아 NME1 이량체, 또는 "2i"로 칭해지는 MEK 및 GSK3-베타 저해제에서 암세포를 배양하면, 세포가 보다 전이성 상태가 됨을 입증하였다. 세포가 보다 전이성 상태로 변이됨에 따라, 세포는 비-부착성인 상태로 되고, 배양 플레이트로부터 떨어져 나와 부유한다. 이들 부유하는 세포인 "부유 세포"를 부착성인 세포들로부터 개별적으로 수집하였으며, 이들은, a) 전이성 유전자를 훨씬 더 높은 수준으로 발현하고; b) 마우스에게 이종 이식되었을 때, 부유 세포는 매우 낮은 복사 수로 이식되었을 때, 종양을 형성할 수 있었다. RT-PCR 측정값에서, 특이적인 전이 마커, 예컨대 유방암의 경우 CXCR4, 전립선암의 경우 CHD1, 및 다른 전분화능 줄기세포 마커, 예컨대 OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, c-Myc 및 다른 마커들은 NME7-AB에서 배양된 암세포에서 급격하게 과발현되었으며, 본원 및 도면에서 "부유 세포"로 칭해지는 비-부착성으로 된 세포에서 가장 과발현되었다.
본원에서 본 발명자들은, NME7-유래의 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화에 의해 생성된 NME7-특이적인 항체뿐만 아니라 펩타이드 자체는 암세포에서 전이성 암세포로의 변이를 저해함을 보여준다. 이들 실험 중 제1 실험에서, A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화에 의해 생성된 항체를, T47D 유방암 세포를 NME7-AB 또는 2i 저해제에서 배양함으로써 유도되는 전이성 변이를 저해하는 능력에 대해 시험하였다. 가장 놀라운 관찰은, 항체 및 펩타이드가 부유 세포의 수를 급격하게 감소시켰으며, 이는, 항체 및 펩타이드가 전이성 암세포로의 변환을 저해한다는 제1 지표였다. 특히, B3 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 항체가 생성된 세포는 임의의 부유 세포를 거의 생성하지 않았다.
도 30은, 임의의 항체 치료를 수여받지 않은 대조군 웰과 비교하여, 각각의 항체에 대해 가시적인 부유 세포의 백분율의 기록된 관찰을 보여준다. mRNA를 부유 세포 및 부착성 세포 둘 모두로부터 추출하였다. RT-PCR을 사용하여, CXCR4를 비롯한 전이 마커의 발현 수준을 측정하였다. 항-NME7 항체를 사용한 치료는 전이 마커, 예컨대 CXCR4의 양을 크게 감소시켰으며, 이는, 항체가 전이성 암으로의 변이를 저해하였음을 가리킨다(도 31 참조). 주목할만하게는, 펩타이드 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체, 즉, 항체 #61은 보다 전이성 상태로의 변이를 본질적으로 완전히 저해하였다. 도 31b는, NME7-AB 펩타이드, A1, A2, B1, B2 및 B3로 치료한 유방암 세포가 단독으로, 2i 저해제를 함유하는 배지에서 세포를 배양함으로써 유도되는 보다 전이성 상태로의 변이를 강력하게 저해할 수 있었음을 보여준다. 이것이 생성한 항체 #61이었기 때문에, 펩타이드 B3가 특히 효과적이었다. 도 31c는 동일한 그래프를 보여주지만, Y-축은 전이 마커의 펩타이드 저해를 보여주기 위해 확장되었다. 세포 생존력 및 성장을 가리키는 mRNA의 양을 측정하였다. 항체로 처리된 세포는 훨씬 더 적은 양의 mRNA를 가졌으며, 이는 보다 전이성 상태로의 변이를 저해하는 것 외에도, 항-NME7-AB 항체가 암세포의 성장을 저해하였음을 가리킨다. 도 32는 도 31a에서 도시된 저해 실험을 위해 회수된 RNA의 총 양을 나타낸 표를 보여준다.
실시예 15 - NME7-유래의 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용하여 생성된 항-NME7 항체는 임의의 상업적으로 입수가능한 항체를 사용하여 검출불가능한 신규 NME7 종을 동정한다.
당업자에게 알려진 바와 같이, 일부 항체는 표적 단백질의 선형 부분을 인지하고, 웨스턴 블롯 분석법에서 사용될 수 있으며, 한편, 다른 항체들은 비-선형 구조 모티프를 인지하고, 풀-다운 또는 면역침전 분석법에서 사용될 수 있다. 본 출원 이전에, 절단된 NME7 또는 아이소폼 NME7-X1은 존재하는 것으로 알려지지 않았다. 출원 시점에서 상업적으로 입수가능한 항체를 사용하면, 기존의 항체는 이들 중요한 NME7 종을 특이적으로 검출할 수 없었음을 보여준다. B9(Santa Cruz Biotechnology)은 NME7 아미노산 100-376에 대해 생성된 모노클로날 항체이다. 도 36A는, 이 항체가 오로지 전장 42 kDa NME7만을 검출함을 보여준다. 또 다른 상업적으로 입수가능한 항체인 H278은, NME7에 독특하지 않은 아미노산 서열을 포함하는 NME7 아미노산 100-376에 대해 생성된 토끼 폴리클로날 항체이다. 도 36B는, 이러한 항체가 또한, 17 kDa인 NME1뿐만 아니라 전장 NME7, 및 NME7-AB에 특이적으로 보이지 않는 다른 밴드를 염색시킴을 보여준다.
NME7-AB 펩타이드 A1, A2, B1, B2 또는 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 NME7 항체는, 전장 42 kDa 단백질을 포함하는 새로운 NME7 종, 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼일 수 있는 약 33 kDa NME7 종, 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼일 수 있는 약 30 kDa NME7 종을 동정하며, 여기서, 약 30 kDa 종은 NME7-X1인 것으로 보인다. 도 35의 A 내지 C는, 펩타이드 A1, B1 및 B3에 의해 생성된 항체가 T47D 유방암 세포, PC3 및 DU145 전립선암 세포, HEK293 태아 간 세포, 및 백혈병 세포 IM-9, K562 및 MV411을 비롯한 광범위한 암세포주들에서 분비 형태의 NME7, NME7-AB 및 NME7-X1을 동정함을 보여준다.
본원에서 인용되는 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
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당해 기술분야의 당업자는, 단지 일상적인 실험을 이용하여, 본원에 구체적으로 기술되는 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인지하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 청구항의 범위에 포함되고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> MINERVA BIOTECHNOLOGIES <120> ANTI-NME ANTIBODY <130> 13150-70136PCT <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> full-length MUC1 Receptor <400> 1 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 150 155 160 Ala Pro Asp Thr Arg 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Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 370 375 380 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 385 390 395 400 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 405 410 415 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 420 425 430 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 435 440 445 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 450 455 460 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 465 470 475 480 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 485 490 495 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 500 505 510 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 515 520 525 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 530 535 540 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 545 550 555 560 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 565 570 575 Gly Val Thr Ser Ala Pro 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receptor isoform having nat-PSMGFR at its N-terminus <400> 5 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val 20 25 30 Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro 35 40 45 Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu 50 55 60 Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys 65 70 75 80 Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro 85 90 95 Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro 100 105 110 Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly 115 120 125 Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Ala Ser Ala 130 135 140 Asn Leu 145 <210> 6 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Native Primary Sequence of the MUC1 Growth Factor Receptor <400> 6 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NME7 nucleotide sequence <400> 12 gagatcctga gacaatgaat catagtgaaa gattcgtttt cattgcagag tggtatgatc 60 caaatgcttc acttcttcga cgttatgagc ttttatttta cccaggggat ggatctgttg 120 aaatgcatga tgtaaagaat catcgcacct ttttaaagcg gaccaaatat gataacctgc 180 acttggaaga tttatttata ggcaacaaag tgaatgtctt ttctcgacaa ctggtattaa 240 ttgactatgg ggatcaatat acagctcgcc agctgggcag taggaaagaa aaaacgctag 300 ccctaattaa accagatgca atatcaaagg ctggagaaat aattgaaata ataaacaaag 360 ctggatttac tataaccaaa ctcaaaatga tgatgctttc aaggaaagaa gcattggatt 420 ttcatgtaga tcaccagtca agaccctttt tcaatgagct gatccagttt attacaactg 480 gtcctattat tgccatggag attttaagag atgatgctat atgtgaatgg aaaagactgc 540 tgggacctgc aaactctgga gtggcacgca cagatgcttc tgaaagcatt agagccctct 600 ttggaacaga tggcataaga aatgcagcgc atggccctga ttcttttgct tctgcggcca 660 gagaaatgga gttgtttttt ccttcaagtg gaggttgtgg gccggcaaac actgctaaat 720 ttactaattg tacctgttgc attgttaaac cccatgctgt cagtgaaggt atgttgaata 780 cactatattc agtacatttt gttaatagga gagcaatgtt tattttcttg atgtacttta 840 tgtatagaaa ataa 854 <210> 13 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NME7 amino acid sequence <400> 13 Asp Pro Glu Thr Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu 1 5 10 15 Trp Tyr Asp Pro Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg 35 40 45 Thr Phe Leu Lys Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu 50 55 60 Phe Ile Gly Asn Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile 65 70 75 80 Asp Tyr Gly Asp Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu 85 90 95 Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu 100 105 110 Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys 115 120 125 Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His 130 135 140 Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly 145 150 155 160 Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp 165 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tgtggtgaag acgggccgag tcatgctcgg ggagaccaac 360 cctgcagact ccaagcctgg gaccatccgt ggagacttct gcatacaagt tggcaggaac 420 attatacatg gcagtgattc tgtggagagt gcagagaagg agatcggctt gtggtttcac 480 cctgaggaac tggtagatta cacgagctgt gctcagaact ggatctatga atga 534 <210> 15 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H1 describes amino acid sequence <400> 15 Met Val Leu Leu Ser Thr Leu Gly Ile Val Phe Gln Gly Glu Gly Pro 1 5 10 15 Pro Ile Ser Ser Cys Asp Thr Gly Thr Met Ala Asn Cys Glu Arg Thr 20 25 30 Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu 35 40 45 Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe Arg Leu Val Gly Leu Lys 50 55 60 Phe Met Gln Ala Ser Glu Asp Leu Leu Lys Glu His Tyr Val Asp Leu 65 70 75 80 Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu Val Lys Tyr Met His Ser Gly 85 90 95 Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu Asn Val Val Lys Thr Gly 100 105 110 Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr 115 120 125 Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly 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<223> NM23-H1 S120G mutant amino acid sequence <400> 17 Met Val Leu Leu Ser Thr Leu Gly Ile Val Phe Gln Gly Glu Gly Pro 1 5 10 15 Pro Ile Ser Ser Cys Asp Thr Gly Thr Met Ala Asn Cys Glu Arg Thr 20 25 30 Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu 35 40 45 Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe Arg Leu Val Gly Leu Lys 50 55 60 Phe Met Gln Ala Ser Glu Asp Leu Leu Lys Glu His Tyr Val Asp Leu 65 70 75 80 Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu Val Lys Tyr Met His Ser Gly 85 90 95 Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu Asn Val Val Lys Thr Gly 100 105 110 Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr 115 120 125 Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly Arg Asn Ile Ile His Gly 130 135 140 Gly Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys Glu Ile Gly Leu Trp Phe His 145 150 155 160 Pro Glu Glu Leu Val Asp Tyr Thr Ser Cys Ala Gln Asn Trp Ile Tyr 165 170 175 Glu <210> 18 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H2 nucleotide sequence <400> 18 atggccaacc tggagcgcac cttcatcgcc atcaagccgg acggcgtgca gcgcggcctg 60 gtgggcgaga tcatcaagcg cttcgagcag aagggattcc gcctcgtggc catgaagttc 120 ctccgggcct ctgaagaaca cctgaagcag cactacattg acctgaaaga ccgaccattc 180 ttccctgggc tggtgaagta catgaactca gggccggttg tggccatggt ctgggagggg 240 ctgaacgtgg tgaagacagg ccgagtgatg cttggggaga ccaatccagc agattcaaag 300 ccaggcacca ttcgtgggga cttctgcatt caggttggca ggaacatcat tcatggcagt 360 gattcagtaa aaagtgctga aaaagaaatc agcctatggt ttaagcctga agaactggtt 420 gactacaagt cttgtgctca tgactgggtc tatgaataa 459 <210> 19 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H2 amino acid sequence <400> 19 Met Ala Asn Leu Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val 1 5 10 15 Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly 20 25 30 Phe Arg Leu Val Ala Met Lys Phe Leu Arg Ala Ser Glu Glu His Leu 35 40 45 Lys Gln His Tyr Ile Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Pro Gly Leu 50 55 60 Val Lys Tyr Met Asn Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly 65 70 75 80 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gatgccagtg aatccattcg cgctctgttt 480 ggcaccgatg gtatccgtaa tgcagcacat ggtccggact cattcgcatc ggcagctcgt 540 gaaatggaac tgtttttccc gagctctggc ggttgcggtc cggcaaacac cgccaaattt 600 accaattgta cgtgctgtat tgtcaaaccg cacgcagtgt cagaaggcct gctgggtaaa 660 attctgatgg caatccgtga tgctggcttt gaaatctcgg ccatgcagat gttcaacatg 720 gaccgcgtta acgtcgaaga attctacgaa gtttacaaag gcgtggttac cgaatatcac 780 gatatggtta cggaaatgta ctccggtccg tgcgtcgcga tggaaattca gcaaaacaat 840 gccaccaaaa cgtttcgtga attctgtggt ccggcagatc cggaaatcgc acgtcatctg 900 cgtccgggta ccctgcgcgc aatttttggt aaaacgaaaa tccagaacgc tgtgcactgt 960 accgatctgc cggaagacgg tctgctggaa gttcaatact ttttcaaaat tctggataat 1020 tga 1023 <210> 21 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NM23-H7-2 sequence optimized for E. coli expression <400> 21 Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys Arg Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn Lys Val Asn Val 20 25 30 Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr 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caactggtcc tattattgcc atggagattt taagagatga tgctatatgt 240 gaatggaaaa gactgctggg acctgcaaac tctggagtgg cacgcacaga tgcttctgaa 300 agcattagag ccctctttgg aacagatggc ataagaaatg cagcgcatgg ccctgattct 360 tttgcttctg cggccagaga aatggagttg ttttttcctt caagtggagg ttgtgggccg 420 gcaaacactg ctaaatttac ttga 444 <210> 25 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A1 <400> 25 Met Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 20 25 30 Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val 35 40 45 Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr 50 55 60 Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys 65 70 75 80 Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr 85 90 95 Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg 100 105 110 Asn Ala Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met 115 120 125 Glu Leu Phe Phe 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acaaagcggg tttcaccatc acgaaactga aaatgatgat gctgagccgt 120 aaagaagccc tggattttca tgtcgaccac cagtctcgcc cgtttttcaa tgaactgatt 180 caattcatca ccacgggtcc gattatcgca atggaaattc tgcgtgatga cgctatctgc 240 gaatggaaac gcctgctggg cccggcaaac tcaggtgttg cgcgtaccga tgccagtgaa 300 tccattcgcg ctctgtttgg caccgatggt atccgtaatg cagcacatgg tccggactca 360 ttcgcatcgg cagctcgtga aatggaactg tttttctga 399 <210> 43 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A sequence optimized for E. coli expression <400> 43 Met Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 20 25 30 Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val 35 40 45 Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr 50 55 60 Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys 65 70 75 80 Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr 85 90 95 Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe 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ttatggcgac 240 cagtacaccg cgcgtcaact gggtagtcgc aaagaaaaaa cgctggccct gattaaaccg 300 gatgcaatct ccaaagctgg cgaaattatc gaaattatca acaaagcggg tttcaccatc 360 acgaaactga aaatgatgat gctgagccgt aaagaagccc tggattttca tgtcgaccac 420 cagtctcgcc cgtttttcaa tgaactgatt caattcatca ccacgggtcc gattatcgca 480 atggaaattc tgcgtgatga cgctatctgc gaatggaaac gcctgctggg cccggcaaac 540 tcaggtgttg cgcgtaccga tgccagtgaa tccattcgcg ctctgtttgg caccgatggt 600 atccgtaatg cagcacatgg tccggactca ttcgcatcgg cagctcgtga aatggaactg 660 tttttctga 669 <210> 47 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A2 sequence optimized for E. coli expression <400> 47 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn 50 55 60 Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr 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aaatatgata atctgcatct ggaagacctg 180 tttattggca acaaagtcaa tgtgttctct cgtcagctgg tgctgatcga ttatggcgac 240 cagtacaccg cgcgtcaact gggtagtcgc aaagaaaaaa cgctggccct gattaaaccg 300 gatgcaatct ccaaagctgg cgaaattatc gaaattatca acaaagcggg tttcaccatc 360 acgaaactga aaatgatgat gctgagccgt aaagaagccc tggattttca tgtcgaccac 420 cagtctcgcc cgtttttcaa tgaactgatt caattcatca ccacgggtcc gattatcgca 480 atggaaattc tgcgtgatga cgctatctgc gaatggaaac gcctgctggg cccggcaaac 540 tcaggtgttg cgcgtaccga tgccagtgaa tccattcgcg ctctgtttgg caccgatggt 600 atccgtaatg cagcacatgg tccggactca ttcgcatcgg cagctcgtga aatggaactg 660 tttttcccga gctctggcgg ttgcggtccg gcaaacaccg ccaaatttac ctga 714 <210> 49 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A3 sequence optimized for E. coli expression <400> 49 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu 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cagatgttca acatggaccg cgttaacgtc 180 gaagaattct acgaagttta caaaggcgtg gttaccgaat atcacgatat ggttacggaa 240 atgtactccg gtccgtgcgt cgcgatggaa attcagcaaa acaatgccac caaaacgttt 300 cgtgaattct gtggtccggc agatccggaa atcgcacgtc atctgcgtcc gggtaccctg 360 cgcgcaattt ttggtaaaac gaaaatccag aacgctgtgc actgtaccga tctgccggaa 420 gacggtctgc tggaagttca atactttttc tga 453 <210> 55 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-B2 sequence optimized for E. coli expression <400> 55 Met Pro Ser Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe Thr 1 5 10 15 Asn Cys Thr Cys Cys Ile Val Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly Leu 20 25 30 Leu Gly Lys Ile Leu Met Ala Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu Ile Ser 35 40 45 Ala Met Gln Met Phe Asn Met Asp Arg Val Asn Val Glu Glu Phe Tyr 50 55 60 Glu Val Tyr Lys Gly Val Val Thr Glu Tyr His Asp Met Val Thr Glu 65 70 75 80 Met Tyr Ser Gly Pro Cys Val Ala Met Glu Ile Gln Gln Asn Asn Ala 85 90 95 Thr Lys Thr Phe Arg Glu Phe Cys Gly Pro Ala Asp Pro Glu Ile Ala 100 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aaagaagccc tggattttca tgtcgaccac cagtctcgcc cgtttttcaa tgaactgatt 180 caattcatca ccacgggtcc gattatcgca atggaaattc tgcgtgatga cgctatctgc 240 gaatggaaac gcctgctggg cccggcaaac tcaggtgttg cgcgtaccga tgccagtgaa 300 tccattcgcg ctctgtttgg caccgatggt atccgtaatg cagcacatgg tccggactca 360 ttcgcatcgg cagctcgtga aatggaactg tttttcccga gctctggcgg ttgcggtccg 420 gcaaacaccg ccaaatttac caattgtacg tgctgtattg tcaaaccgca cgcagtgtca 480 gaaggcctgc tgggtaaaat tctgatggca atccgtgatg ctggctttga aatctcggcc 540 atgcagatgt tcaacatgga ccgcgttaac gtcgaagaat tctacgaagt ttacaaaggc 600 gtggttaccg aatatcacga tatggttacg gaaatgtact ccggtccgtg cgtcgcgatg 660 gaaattcagc aaaacaatgc caccaaaacg tttcgtgaat tctgtggtcc ggcagatccg 720 gaaatcgcac gtcatctgcg tccgggtacc ctgcgcgcaa tttttggtaa aacgaaaatc 780 cagaacgctg tgcactgtac cgatctgccg gaagacggtc tgctggaagt tcaatacttt 840 ttcaaaattc tggataattg a 861 <210> 59 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-AB sequence optimized for E. coli expression <400> 59 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caggggatgg 180 atctgttgaa atgcatgatg taaagaatca tcgcaccttt ttaaagcgga ccaaatatga 240 taacctgcac ttggaagatt tatttatagg caacaaagtg aatgtcttct ctcgacaact 300 ggtattaatt gactatgggg atcaatatac agctcgccag ctgggcagta ggaaagaaaa 360 aacgctagcc ctaattaaac cagatgcaat atcaaaggct ggagaaataa ttgaaataat 420 aaacaaagct ggatttacta taaccaaact caaaatgatg atgctttcaa ggaaagaagc 480 attggatttt catgtagatc accagtcaag accctttttc aatgagctga tccagtttat 540 tacaactggt cctattattg ccatggagat tttaagagat gatgctatat gtgaatggaa 600 aagactgctg ggacctgcaa actctggagt ggcacgcaca gatgcttctg aaagcattag 660 agccctcttt ggaacagatg gcataagaaa tgcagcgcat ggccctgatt cttttgcttc 720 tgcggccaga gaaatggagt tgttttttcc ttcaagtgga ggttgtgggc cggcaaacac 780 tgctaaattt actaattgta cctgttgcat tgttaaaccc catgctgtca gtgaaggact 840 gttgggaaag atcctgatgg ctatccgaga tgcaggtttt gaaatctcag ctatgcagat 900 gttcaatatg gatcgggtta atgttgagga attctatgaa gtttataaag gagtagtgac 960 cgaatatcat gacatggtga cagaaatgta ttctggccct tgtgtagcaa tggagattca 1020 acagaataat gctacaaaga catttcgaga attttgtgga cctgctgatc ctgaaattgc 1080 ccggcattta cgccctggaa ctctcagagc aatctttggt aaaactaaga tccagaatgc 1140 tgttcactgt actgatctgc cagaggatgg cctattagag gttcaatact tcttcaagat 1200 cttggataat acgcgtacgc ggccgctcga gcagaaactc atctcagaag aggatctggc 1260 agcaaatgat atcctggatt acaaggatga cgacgataag gtttaa 1306 <210> 81 <211> 407 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OriGene-NME7-1 full length <400> 81 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn 50 55 60 Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu Lys Thr Leu Ala 85 90 95 Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu Ile Ile Glu Ile 100 105 110 Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 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Glu Ile Ala Arg His Leu 325 330 335 Arg Pro Gly Thr Leu Arg Ala Ile Phe Gly Lys Thr Lys Ile Gln Asn 340 345 350 Ala Val His Cys Thr Asp Leu Pro Glu Asp Gly Leu Leu Glu Val Gln 355 360 365 Tyr Phe Phe Lys Ile Leu Asp Asn Thr Arg Thr Arg Arg Leu Glu Gln 370 375 380 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Asn Asp Ile Leu Asp Tyr 385 390 395 400 Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val 405 <210> 82 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abnova NME7-1 Full length <400> 82 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn 50 55 60 Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu Lys Thr Leu Ala 85 90 95 Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu Ile Ile Glu Ile 100 105 110 Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys Met Met Met Leu 115 120 125 Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser Arg Pro 130 135 140 Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly Pro Ile Ile Ala 145 150 155 160 Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp Lys Arg Leu Leu 165 170 175 Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala Ser Glu Ser Ile 180 185 190 Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Asn Ala Ala His Gly Pro 195 200 205 Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met Glu Leu Phe Phe Pro Ser 210 215 220 Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe Thr Asn Cys Thr 225 230 235 240 Cys Cys Ile Val Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly Leu Leu Gly Lys 245 250 255 Ile Leu Met Ala Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu Ile Ser Ala Met Gln 260 265 270 Met Phe Asn Met Asp Arg Val Asn Val Glu Glu Phe Tyr Glu Val Tyr 275 280 285 Lys Gly Val Val Thr Glu Tyr His Asp Met Val Thr Glu Met Tyr Ser 290 295 300 Gly Pro Cys Val Ala Met Glu Ile Gln Gln Asn Asn Ala Thr Lys Thr 305 310 315 320 Phe 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<220> <223> DNA encoding Strept II Tag <400> 85 accggttgga gccatcctca gttcgaaaag taatga 36 <210> 86 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-10 peptide <400> 86 Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln 20 25 30 Ser Gly Ala 35 <210> 87 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-10 peptide <400> 87 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val 20 25 30 Ser Asp Val 35 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 88 Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala 1 5 <210> 89 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 89 Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His 1 5 10 15 Gln Ser <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 90 Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser 1 5 10 <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 91 Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp Lys Arg Leu 1 5 10 <210> 92 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 92 Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly Pro 1 5 10 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 93 Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp 1 5 <210> 94 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 94 Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe 1 5 10 15 Gly Thr Asp Gly Ile Arg Asn Ala Ala 20 25 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 95 Glu Leu Phe Phe Pro Ser 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Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 105 Pro Glu Asp Gly Leu Leu Glu Val Gln Tyr Phe Phe Lys 1 5 10 <210> 106 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 106 Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 1 5 10 <210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 107 Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser 1 5 10 15 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 108 Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr 1 5 <210> 109 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 109 Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp Lys Arg Leu 1 5 10 <210> 110 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 110 Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp 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Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 116 Glu Val Tyr Lys Gly Val Val Thr 1 5 <210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 117 Glu Tyr His Asp Met Val Thr Glu 1 5 <210> 118 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 118 Glu Phe Cys Gly Pro Ala Asp Pro Glu Ile Ala Arg His Leu Arg 1 5 10 15 <210> 119 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 119 Ala Ile Phe Gly Lys Thr Lys Ile Gln Asn Ala Val 1 5 10 <210> 120 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 120 Leu Pro Glu Asp Gly Leu Leu Glu Val Gln Tyr Phe Phe Lys Ile Leu 1 5 10 15 Asp Asn <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME7 <400> 121 Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg 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Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu Val Lys Tyr Met 1 5 10 15 His Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu Asn 20 25 30 <210> 139 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME1 <400> 139 Asn Ile Ile His Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys Glu Ile 1 5 10 15 Gly Leu Trp Phe His Pro Glu Glu Leu Val 20 25 <210> 140 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunizing peptides derived from human NME1 <400> 140 Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile 1 5 10 <210> 141 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide A1 <400> 141 Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser 1 5 10 15 <210> 142 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide A2 <400> 142 Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala Ser Glu Ser 1 5 10 <210> 143 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide B1 <400> 143 Asp Ala Gly Phe Glu Ile Ser Ala Met Gln Met Phe Asn 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E coli expression) <400> 156 atgcatgacg ttaaaaatca ccgtaccttt ctgaaacgca cgaaatatga taatctgcat 60 ctggaagacc tgtttattgg caacaaagtc aatgtgttct ctcgtcagct ggtgctgatc 120 gattatggcg accagtacac cgcgcgtcaa ctgggtagtc gcaaagaaaa aacgctggcc 180 ctgattaaac cggatgcaat ctccaaagct ggcgaaatta tcgaaattat caacaaagcg 240 ggtttcacca tcacgaaact gaaaatgatg atgctgagcc gtaaagaagc cctggatttt 300 catgtcgacc accagtctcg cccgtttttc aatgaactga ttcaattcat caccacgggt 360 ccgattatcg caatggaaat tctgcgtgat gacgctatct gcgaatggaa acgcctgctg 420 ggcccggcaa actcaggtgt tgcgcgtacc gatgccagtg aatccattcg cgctctgttt 480 ggcaccgatg gtatccgtaa tgcagcacat ggtccggact cattcgcatc ggcagctcgt 540 gaaatggaac tgtttttccc gagctctggc ggttgcggtc cggcaaacac cgccaaattt 600 accaattgta cgtgctgtat tgtcaaaccg cacgcagtgt cagaaggcct gctgggtaaa 660 attctgatgg caatccgtga tgctggcttt gaaatctcgg ccatgcagat gttcaacatg 720 gaccgcgtta acgtcgaaga attctacgaa gtttacaaag gcgtggttac cgaatatcac 780 gatatggtta cggaaatgta ctccggtccg tgcgtcgcga tggaaattca gcaaaacaat 840 gccaccaaaa cgtttcgtga attctgtggt ccggcagatc cggaaatcgc acgtcatctg 900 cgtccgggta ccctgcgcgc aatttttggt aaaacgaaaa tccagaacgc tgtgcactgt 960 accgatctgc cggaagacgg tctgctggaa gttcaatact ttttcaaaat tctggataat 1020 <210> 157 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7 b (optimized for E coli expression) <400> 157 Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys Arg Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn Lys Val Asn Val 20 25 30 Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp Gln Tyr Thr Ala 35 40 45 Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro 50 55 60 Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala 65 70 75 80 Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu 85 90 95 Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu 115 120 125 Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn 130 135 140 Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe 145 150 155 160 Gly Thr Asp Gly Ile Arg Asn Ala Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala 165 170 175 Ser Ala Ala Arg Glu Met Glu Leu Phe Phe Pro Ser Ser Gly Gly Cys 180 185 190 Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe Thr Asn Cys Thr Cys Cys Ile Val 195 200 205 Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly Leu Leu Gly Lys Ile Leu Met Ala 210 215 220 Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu Ile Ser Ala Met Gln Met Phe Asn Met 225 230 235 240 Asp Arg Val Asn Val Glu Glu Phe Tyr Glu Val Tyr Lys Gly Val Val 245 250 255 Thr Glu Tyr His Asp Met Val Thr Glu Met Tyr Ser Gly Pro Cys Val 260 265 270 Ala Met Glu Ile Gln Gln Asn Asn Ala Thr Lys Thr Phe Arg Glu Phe 275 280 285 Cys Gly Pro Ala Asp Pro Glu Ile Ala Arg His Leu Arg Pro Gly Thr 290 295 300 Leu Arg Ala Ile Phe Gly Lys Thr Lys Ile Gln Asn Ala Val His Cys 305 310 315 320 Thr Asp Leu Pro Glu Asp Gly Leu Leu Glu Val Gln Tyr Phe Phe Lys 325 330 335 Ile Leu Asp Asn Thr Gly 340 <210> 158 <211> 858 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-AB (optimized for E coli expression) <400> 158 atggaaaaaa cgctggccct gattaaaccg gatgcaatct ccaaagctgg cgaaattatc 60 gaaattatca acaaagcggg tttcaccatc acgaaactga aaatgatgat gctgagccgt 120 aaagaagccc tggattttca tgtcgaccac cagtctcgcc cgtttttcaa tgaactgatt 180 caattcatca ccacgggtcc gattatcgca atggaaattc tgcgtgatga cgctatctgc 240 gaatggaaac gcctgctggg cccggcaaac tcaggtgttg cgcgtaccga tgccagtgaa 300 tccattcgcg ctctgtttgg caccgatggt atccgtaatg cagcacatgg tccggactca 360 ttcgcatcgg cagctcgtga aatggaactg tttttcccga gctctggcgg ttgcggtccg 420 gcaaacaccg ccaaatttac caattgtacg tgctgtattg tcaaaccgca cgcagtgtca 480 gaaggcctgc tgggtaaaat tctgatggca atccgtgatg ctggctttga aatctcggcc 540 atgcagatgt tcaacatgga ccgcgttaac gtcgaagaat tctacgaagt ttacaaaggc 600 gtggttaccg aatatcacga tatggttacg gaaatgtact ccggtccgtg cgtcgcgatg 660 gaaattcagc aaaacaatgc caccaaaacg tttcgtgaat tctgtggtcc ggcagatccg 720 gaaatcgcac gtcatctgcg tccgggtacc ctgcgcgcaa tttttggtaa 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Gly Lys Ile Leu Met Ala Ile Arg Asp Ala Gly Phe 165 170 175 Glu Ile Ser Ala Met Gln Met Phe Asn Met Asp Arg Val Asn Val Glu 180 185 190 Glu Phe Tyr Glu Val Tyr Lys Gly Val Val Thr Glu Tyr His Asp Met 195 200 205 Val Thr Glu Met Tyr Ser Gly Pro Cys Val Ala Met Glu Ile Gln Gln 210 215 220 Asn Asn Ala Thr Lys Thr Phe Arg Glu Phe Cys Gly Pro Ala Asp Pro 225 230 235 240 Glu Ile Ala Arg His Leu Arg Pro Gly Thr Leu Arg Ala Ile Phe Gly 245 250 255 Lys Thr Lys Ile Gln Asn Ala Val His Cys Thr Asp Leu Pro Glu Asp 260 265 270 Gly Leu Leu Glu Val Gln Tyr Phe Phe Lys Ile Leu Asp Asn Thr Gly 275 280 285 <210> 160 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7 X1 (optimized for E coli expression) <400> 160 atgatgatgc tgagccgtaa agaagccctg gattttcatg tcgaccacca gtctcgcccg 60 tttttcaatg aactgattca attcatcacc acgggtccga ttatcgcaat ggaaattctg 120 cgtgatgacg ctatctgcga atggaaacgc ctgctgggcc cggcaaactc aggtgttgcg 180 cgtaccgatg ccagtgaatc cattcgcgct ctgtttggca ccgatggtat ccgtaatgca 240 gcacatggtc cggactcatt cgcatcggca gctcgtgaaa tggaactgtt tttcccgagc 300 tctggcggtt gcggtccggc aaacaccgcc aaatttacca attgtacgtg ctgtattgtc 360 aaaccgcacg cagtgtcaga aggcctgctg ggtaaaattc tgatggcaat ccgtgatgct 420 ggctttgaaa tctcggccat gcagatgttc aacatggacc gcgttaacgt cgaagaattc 480 tacgaagttt acaaaggcgt ggttaccgaa tatcacgata tggttacgga aatgtactcc 540 ggtccgtgcg tcgcgatgga aattcagcaa aacaatgcca ccaaaacgtt tcgtgaattc 600 tgtggtccgg cagatccgga aatcgcacgt catctgcgtc cgggtaccct gcgcgcaatt 660 tttggtaaaa cgaaaatcca gaacgctgtg cactgtaccg atctgccgga agacggtctg 720 ctggaagttc aatacttttt caaaattctg gataat 756 <210> 161 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7 X1 (optimized for E coli expression) <400> 161 Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His 1 5 10 15 Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly 20 25 30 Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp 35 40 45 Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala 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DM10 domain of NME7 <400> 162 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn 50 55 60 Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys 85 90

Claims (78)

  1. NME 패밀리의 구성원에 대해 제조된 항체를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    NME 패밀리가 NME7 패밀리인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    항체가 NME7에 결합하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    항체가 NME7-AB 또는 NME-AB-유사 단백질에 결합하는, 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    항체가 NME7-X1에 결합하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    항체가 NME7과 이의 동족 결합 파트너(cognate binding partner) 사이의 결합을 저해하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    동족 결합 파트너가 MUC1*인, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    동족 결합 파트너가 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    도 16 내지 도 19에 열거된 것들(서열 번호:88 내지 145)로부터 선택되는 펩타이드에 결합하는 항체가 생성되거나, 이러한 결합 능력에 대해 선택되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    펩타이드가 도 19에 열거된 것들(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택되는, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    펩타이드가, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    항체가 NME7-AB 또는 NME7-X1에 결합하지만 NME1에는 결합하지 않는 능력에 대해 선택되는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 이가 항체, 일가 항체, 이중특이적 항체, 가변 영역을 함유하는 항체 단편, 또는 항체 모방체인, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    항체가 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    항체가 단쇄 scFv인, 방법.
  16. NME7-AB의 영역에 고도로 상동성이거나 일치하는 펩타이드를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    펩타이드가 도 16에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성인, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    펩타이드가 도 17에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성인, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    펩타이드가 도 18에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성인, 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    펩타이드가 도 19에 열거된 펩타이드 중 하나 이상에 적어도 80% 상동성인, 방법.
  21. 제16항에 있어서,
    펩타이드가 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)로부터 선택되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    펩타이드가 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택되는, 방법.
  23. 제16항에 있어서,
    펩타이드가, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함하는, 방법.
  24. 제16항에 있어서,
    펩타이드가 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩타이드에 연결되는, 방법.
  25. 암의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    CAR의 표적화 세포외 부분이 NME 패밀리의 구성원의 적어도 하나의 펩타이드 단편을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR).
  26. 제25항에 있어서,
    NME 패밀리가 NME7 패밀리인, 키메라 항원 수용체.
  27. 제26항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7인, 키메라 항원 수용체.
  28. 제26항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7-AB 또는 NME-AB-유사 단백질인, 키메라 항원 수용체.
  29. 제26항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7-X1인, 키메라 항원 수용체.
  30. 제25항에 있어서,
    CAR의 표적화 세포외 부분이 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145) 중의 펩타이드를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  31. 제30항에 있어서,
    펩타이드가 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택되는, 키메라 항원 수용체.
  32. 제25항에 있어서,
    펩타이드가, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  33. 제25항에 있어서,
    펩타이드가 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩타이드에 연결된, 키메라 항원 수용체.
  34. 제25항에 따른 키메라 항원 수용체를 면역계 세포 내로 조작하고, 상기 세포를 치료를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 암 전이를 치료하거나 예방하는 방법.
  35. 암의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    키메라 항원 수용체의 표적화 세포외 부분이 NME7-AB, NME-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1에 결합하는 항체의 부분을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR).
  36. 제35항에 있어서,
    항체 부분이 단쇄 scFv인, 키메라 항원 수용체.
  37. 제35항에 있어서,
    항체가 인간 항체 또는 인간화된 항체인, 키메라 항원 수용체.
  38. NME 패밀리 구성원의 펩타이드 단편으로 인간을 면역화시키는 단계를 포함하는, 암 또는 전이성 암에 대해 인간을 백신화시키는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    NME 패밀리가 NME7 패밀리인, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7 또는 NME7b인, 방법.
  41. 제39항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7-AB 또는 NME7-AB-유사 단백질인, 방법.
  42. 제39항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7-X1인, 방법.
  43. 제38항에 있어서,
    면역화 펩타이드가 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)의 펩타이드인, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    펩타이드가 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택되는, 방법.
  45. 제38항에 있어서,
    면역화 펩타이드가, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함하는, 방법.
  46. 제38항에 있어서,
    면역화 펩타이드가 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩타이드에 연결되는, 방법.
  47. NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 핵산을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    핵산이 NME7, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 억제하는 안티-센스 핵산인, 방법.
  49. 제47항에 있어서,
    핵산이 NME7, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 저해성 RNA, siRNA, RNAi 또는 shRNA인, 방법.
  50. NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전적으로 편집된 핵산을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 암을 치료하거나 예방하는 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전적으로 편집된 핵산이 세포 내로 삽입된 다음, 환자에게 투여되는, 방법.
  52. 제50항에 있어서,
    NME7, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전적으로 편집된 핵산이 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 삽입되는, 방법.
  53. 제50항에 있어서,
    바이러스 벡터가 렌티바이러스 시스템인, 방법.
  54. 암세포를 NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1, 2i 또는 5i와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포를 성장시키는 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1, 2i 또는 5i를 함유하는 배지 내에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제54항에 있어서,
    인간 NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1을 발현하는 동물, 또는 NME7-AB, NME7b, NME7-AB-유사 단백질 또는 NME7-X1이 투여되는 동물에서 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제54항에 있어서,
    암세포가 유방암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종 또는 뇌암 세포인, 방법.
  58. 제54항에 있어서,
    후보 약물이 세포 상에서 시험되는, 방법.
  59. 제58항에 있어서,
    약물의 효능이, 암 성장을 무-약물(no drug) 대조군과 비교하거나, 전이 마커 또는 줄기세포 마커의 발현 수준을 무-약물 대조군과 비교하거나, 생성되는 세포가 무-약물 대조군과 비교하여 낮은 세포 복사 수(copy number)로부터 동물에서 종양을 형성하는 능력을 비교하고, 암 또는 전이 치료용 후보 약물의 효능을 확인함으로써 평가되는, 방법.
  60. 제54항에 있어서,
    세포가 암 치료를 위해 평가되는 환자로부터 수득되고,
    해당 환자에게 효과적일 약물이 상기 청구항의 결과를 토대로 선택되는, 방법.
  61. 제54항에 있어서,
    세포가 암 치료를 위해 평가되는 환자로부터 수득되지 않으나,
    해당 환자에게 효과적일 약물이 상기 청구항의 결과를 토대로 선택되는, 방법.
  62. NME의 서열로부터 유래되는 서열을 가진 펩타이드 또는 펩타이드 모방체로부터 항체 또는 항체-유사 분자를 생성하는 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    NME가 NME7인, 방법.
  64. 제62항에 있어서,
    펩타이드가 항체 또는 항체-유사 분자를 생성하기 위한 면역원으로서 사용되는, 방법.
  65. 제63항에 있어서,
    펩타이드가, 항-NME7 항체를 생성하기 위해 동물에게 투여되는, 방법.
  66. 제65항에 있어서,
    펩타이드가, 항-NME7 항체를 생성하기 위해 인간에게 투여되는, 방법.
  67. 제62항에 있어서,
    펩타이드가 도 16 내지 도 19에 열거된 서열(서열 번호:88 내지 145)을 갖는, 방법.
  68. 제67항에 있어서,
    펩타이드가 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:141 내지 145)로부터 선택되는, 방법.
  69. 제67항에 있어서,
    펩타이드가, 도 16 내지 도 19에 열거된 펩타이드(서열 번호:88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 상기 열거된 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함하는, 방법.
  70. 1) 암 환자 또는 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 검체를 수득하는 단계;
    2) 해당 검체를, NME7 패밀리의 구성원의 수준, 또는 NME7 패밀리의 구성원을 인코딩하는 핵산의 수준을 검출하거나 측정할 수 있는 분석법으로 처리하는 단계;
    3) 시험 검체에서 측정된 NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원-인코딩 핵산의 수준을 대조군 환자 또는 대조군 세포에서의 수준과 비교하는 단계;
    4) NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원을 인코딩하는 핵산의 수준이 대조군과 비교하여 상승되는지 확인하는 단계; 및
    5) 시험이 비교되는 대조군이 이전에 암을 진단받은 공여자로부터 유래된 것이라면, 시험 검체의 공여자가 암을 가지고 있거나, 암이 진행되었다고 결론 내리는 단계
    를 포함하는, 암의 존재 또는 암의 진행을 검출하는 방법.
  71. 제70항에 있어서,
    순환계 또는 조직 내의 NME7 패밀리의 구성원의 검출이 환자에서 암의 지표(indicator)인, 방법.
  72. 제70항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7-AB-유사 단백질인, 방법.
  73. 환자에서 NME7 패밀리의 구성원 또는 MUC1*의 존재를 검출하는 단계; 및
    항-NME7 항체 또는 항-MUC1* 항체 또는 항체들을 NME7 패밀리의 구성원 또는 MUC1* 발현을 나타내는 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7-AB-유사 단백질인, 방법.
  75. 1) 암이 의심되는 환자, 암이 발병할 위험이 있는 환자 또는 전이성 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 검체를 수득하는 단계;
    2) NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원을 인코딩하는 핵산의 양을 측정하는 단계로서, 측정된 수준이 대조군 검체에서 측정된 것보다 상당히 더 높은, 단계;
    3) 환자가 암을 가지고 있거나 환자에서 보다 공격적인 암 또는 전이성 암이 발병되었음을 확인하는 단계;
    4) NME7 패밀리의 구성원의 발현을 억제하거나, NME7의 절단을 저해하거나, NME7의 표적으로의 NME7의 결합을 저해하는 치료제를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 암을 치료하거나 예방하는 방법.
  76. 제75항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원의 표적이 MUC1*인, 방법.
  77. 제76항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원의 표적이 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분인, 방법.
  78. 제75항에 있어서,
    NME7 패밀리의 구성원이 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7-AB-유사 단백질인, 방법.
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