JP2018203765A - 抗ｎｍｅ抗体 - Google Patents

抗ｎｍｅ抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2018203765A
JP2018203765A JP2018165618A JP2018165618A JP2018203765A JP 2018203765 A JP2018203765 A JP 2018203765A JP 2018165618 A JP2018165618 A JP 2018165618A JP 2018165618 A JP2018165618 A JP 2018165618A JP 2018203765 A JP2018203765 A JP 2018203765A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nme7
seq
cells
cancer
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2018165618A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6646118B2 (ja
Inventor
バンダッド，シンシア
Bamdad Cynthia
スマッジ，ブノワ
Smagghe Benoit
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Minerva Biotechnologies Corp
Original Assignee
Minerva Biotechnologies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2014/050773 external-priority patent/WO2015023694A2/en
Application filed by Minerva Biotechnologies Corp filed Critical Minerva Biotechnologies Corp
Publication of JP2018203765A publication Critical patent/JP2018203765A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6646118B2 publication Critical patent/JP6646118B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

【課題】NMEファミリーのメンバーのペプチド断片で、ヒトに免疫化することを含む、癌若しくは転移性癌に対しての、ワクチン化方法の提供。【解決手段】対象患者に、NME7-AB領域に高度に相同若しくは同一のペプチドを投与することを含む、対象患者の癌を治療若しくは予防剤。【選択図】なし

Description

本発明は、NMEタンパク質、NMEタンパク質に由来したペプチド、それらのペプチドから生成された抗体又は前記ペプチドへの結合能によって選択された抗体若しくは抗体フラグメントに関する。本発明は、さらに患者におけるNMEの発現に関連した病気の治療若しくは予防に関する。
NDPK(ヌクレオシド二リン酸蛋白質燐酸化酵素)タンパク質は、それらがすべてNDPKドメインを含んでいるので、一グループ化されたタンパク質のファミリーである。以前にはNM23タンパク質と呼ばれ、最初に発見されたNMEタンパク質は、NM23-H1及びNM23-H2であった。数十年間、それらが造血細胞の分化を誘導するかあるいは分化を阻害するかどうかは不明であった。
本発明者は、先に、NM23-H1は、二量体であるとき、それはMUC 1 *成長因子リセプターに結合し、分化を阻害するが、より高濃度NM23-H1では、六量体になり、それはMUC1*に結合せず、そして、分化を引き起こすことを見出した。NM23は、それがある非常に攻撃的な癌で発現することが見いだされた時、転移サプレッサーと呼ばれてきた。本発明者は、先に、NM23-H1二量体は、癌の大部分で過剰発現するMUC1*成長因子リセプターの細胞外ドメインに結合し及び二量化させ、そしてこのような結合は癌細胞の成長を促進することを以前に明らかにした。反対に、より高濃度では、NM23は、MUC1*に結合せず、腫瘍形成を促進しない、四量体及び六量体を形成する。
今日まで、それらの機能は解明されていないが、ごく最近、より多くのNMEファミリータンパク質(NME 1-10)が発見された。NME7は新しく発見されたNMEファミリータンパク質であるが、そのNDPKドメインは、他のNMEファミリーと異なり、酵素活性を持っていない。NME7は、成人の組織で全く発現されないか、あるいは非常に低レベルで発現される。
本発明は、対象患者にNMEファミリーのメンバーに対して生成された抗体を投与することを含む、患者の癌を治療若しくは予防する方法を志向する。該NMEファミリーは、NME7ファミリーでありうる。該抗体は、NME7に結合できる。該抗体は、NME7-ABあるいはNME-AB様タンパク質に結合できる。該抗体は、NME7-XIに結合できる。該抗体は、NME7とその同系統の結合パートナー間の結合を阻害できる。同系統の結合パートナーはMUC1*でありうる。同系統の結合パートナーは、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFR部分でありうる。1つの態様では、該抗体は、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)に、リストされたものから選ばれたペプチドへの結合能力に応じて、生成され若しくは選択されうる。好適には、該ペプチドは、図19(SEQ ID NOS: 141〜145)にリストされたものから選択されうる。
該ペプチドは、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたペプチドの高度に相同なものでありうる、又はN末端若しくはC末端で、7つ、6つ、5つ、4つ、3つ、2つ若しくは1つまでのアミノ酸残基が付加若しくは削除されたものでありうる。1つの態様で、該抗体は、NME1にではなく、NME7-AB若しくはNME7-X1への結合能力に応じて、選択されうる。該抗体は、多クローン、単クローン、二価、単価、二重特異性、可変ドメインを含む抗体フラグメント、あるいは抗体模倣物でありうる。該抗体は、ヒト抗体でありうるし又はヒト化抗体でありうる。該抗体は、単一鎖scFvでありうる。
別の態様では、本発明は、対象患者に、NME7-AB領域に高度に相同若しくは同一のペプチドを、投与することを含む対象患者の癌を治療若しくは予防する方法に向けられる。該ペプチドは、図16にリストされたペプチドの1つ以上に少なくとも80%相同でありうる。該ペプチドは、図17にリストされたペプチドの1つ以上に少なくとも80%相同でありうる。該ペプチドは、図18にリストされたペプチドの1つ以上に少なくとも80%相同でありうる。該ペプチドは、図19にリストされたペプチドの1つ以上に少なくとも80%相同でありうる。該ペプチドは、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたペプチドから選択されうる。該ペプチドは、図19(SEQ ID NOS: 141〜145)にリストされたものから選択されうる。あるいは、該ペプチドは、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたペプチドの高度に相同である、又はN末端若しくはC末端で、7つ、6つ、5つ、4つ、3つ、2つ若しくは1つまでのアミノ酸残基が、付加若しくは削除されたものでありうる。該ペプチドは、スペーサー若しくはリンカーによって、別のペプチドに結合されうる。
別の態様では、本発明は、癌の治療若しくは予防のための、キメラ抗原リセプター(CAR)を志向し、該CARの標的細胞外部分は、少なくともNMEファミリーのメンバーのペプチド断片を含む。該NMEファミリーは、NME7ファミリーでありうる。該NME7ファミリーのメンバーは、NME7でありうる。あるいは、NME7ファミリーのメンバーは、NME7-ABあるいはNME-AB様タンパク質でありうる。さらに、NME7ファミリーのメンバーは、NME7-X1でありうる。CARの標的細胞外部分は、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされた複数のペプチドの一つのペプチドを含みうる。該ペプチドは、図19(SEQ ID NOS: 141〜145)にリストされたものから選択されうる。該ペプチドは、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたペプチドの高度に相同である、又はN末端若しくはC末端で7つ、6つ、5つ、4つ、3つ、2つ、若しくは1つまでのアミノ酸残基が付加若しくは削除された、ペプチドを含みうる。該ペプチドは、スペーサー若しくはリンカーによって、別のペプチドに結合されうる。
また別の態様では、本発明は、免疫系細胞へ、キメラ抗原リセプター（CAR）をエンジニアリング（操作若しくは加工ともいう）し、そして、その必要とする対象患者への該細胞を投与することを含む、癌若しくは癌転移を処置（治療ともいう）する若しくは予防する、方法に向けられる。
別の態様では、本発明は、癌の治療若しくは予防用の、キメラ抗原リセプター(CAR)に向けられ、該キメラ抗原リセプターの標的細胞外部分はNME7-AB、NME-AB-様タンパク質若しくはNME7-X1に結合する抗体の一部を含む。該抗体の該部分は、単一鎖scFvでありうるし、あるいはヒト若しくはヒト化のものでありうる。
また別の態様では、本発明は、NMEファミリーのメンバーのペプチド断片で、ヒトに免疫化することを含む、癌若しくは転移性癌に対しての、ワクチン化方法に向けられる。該NMEファミリーは、NME7ファミリーでありうる。該NME7ファミリーのメンバーは、NME7若しくはNME7bでありうる。該NME7ファミリーのメンバーは、NME7-ABあるいはNME7-AB様タンパク質でありうる。該NME7ファミリーは、NME7-X1でありうる。免疫化ペプチドは、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされた複数のペプチドから選択される一つのペプチドでありうる。好適には、ペプチドは、図19(SEQ ID NOS: 141〜145)にリストされたものから選択されうる。該免疫化プチドは、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたペプチドの、それは高度に相同である、又はN末端若しくはC末端で7つ、6つ、5つ、4つ、3つ、2つ、若しくは1つまでのアミノ酸残基が付加若しくは削除さたペプチドを含みうる。該免疫化ペプチドは、スペーサー若しくはリンカーによって別のペプチドに結合されうる。
また別の態様では、本発明は、対象患者にNME7、NME7b、NME7-AB様タンパク質あるいはNME7-X1の発現を阻害する核酸を投与することを含む対象患者の癌を治療若しくは予防する方法に向けられる。該核酸は、NME7、NME7-AB様タンパク質あるいはNME7-X1の発現を抑える、アンティセンス核酸でありうる。該核酸は、NME7、NME7-AB様タンパク質あるいはNME7-X1の発現を阻害する、抑制RNA、siRNA、RNAiあるいはshRNAでありうる。
別の態様では、本発明は、対象患者にNME7、NME7b、NME7-AB様タンパク質あるいはNME7-X1の発現を阻害する、遺伝学的に修飾された核酸を投与することを含む対象患者の癌を治療若しくは予防する方法に向けられる。NME7、NME7b、NME7-AB様タンパク質、あるいはNME7-X1の発現を阻害する、遺伝学的に修飾された核酸は、その後、患者に投与されうる細胞に導入されうる。NME7、NME7b、NME7-AB様タンパク質、あるいはNME7-X1の発現を阻害する、遺伝学的に修飾された核酸は、ウイルスベクターを使用して、細胞に導入されうる。ウイルスベクターは、レンチウイルス（lentiviral）の系でありうる。
別の態様では、本発明は、前記細胞を、NME7-AB、NME7b、NME7-AB様タンパク質、あるいはNME7-XI、2i若しくは5iと接触させることを含む癌細胞を増殖する方法に向けられる。該方法は、NME7-AB、NME7b、NME7-AB様タンパク質あるいはNME7-X1、2i若しくは5iを含む培地中で、該細胞を培養すること、又はヒトNME7-AB、NME7b、NME7-AB様タンパク質、あるいはNME7-X1を発現する、若しくは、NME7-AB、NME7b、NME7-AB様タンパク質あるいはNME7-X1が投与される、動物で細胞を成長させること、を含む。該癌細胞は、乳、前立腺、卵巣、結腸直腸、膵臓、肝臓、黒色腫又は脳の癌細胞でありうる。薬剤候補は、該細胞上でテストされうる。該薬剤のTh効能は、薬剤なしのコントロールに対する癌増殖の比較し、又は薬剤なしのコントロールに対する転移マーカー若しくは幹細胞マーカーの発現レベルを比較し、又は薬剤なしのコントロールに比べての低細胞コピー数から動物での腫瘍形成のための得られた細胞の能力を比較し、そして、癌若しくは転移の処置のための候補薬の効能を決定することで、評価しうる。該細胞は、癌の処置のために評価されている患者から得られ、そしてその患者に有効であろう薬剤が、上記の方法を使った結果にもとづき選ばれる。該細胞は、癌の処置法のために評価されている患者から得られないが、しかし、その患者に有効な薬は上に記述された方法を使用した結果に基づいて選択される。
別の態様では、本発明は、NMEの配列に由来した配列をもつペプチドミミック（模倣物ともいう）、若しくはペプチドからの抗体様分子、若しくは抗体を生成する方法に向けられる。該NMEは、NME7でありうる。抗体、あるいは抗体様分子を生成するために、該ペプチドは免疫原として使用されてもよい。該ペプチドは、抗NME7抗体を生産するために動物に投与されうる。該ペプチドは、抗NME7抗体を生成するためにヒトに投与されうる。該ペプチドは、図16〜19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされた配列を持ちうる。好適には、該ペプチドは、図19(SEQ ID NOS: 141〜145)にリストされたものから選択されうる。該ペプチドは、図16-19(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたペプチドに、高度に相同である、又はN末端若しくはC末端で7つ、6つ、5つ、4つ、3つ、2つ、若しくは1つまでのアミノ酸残基が付加若しくは削除さた、ペプチドを含みうる。
別の態様では、本発明は、次のステップを含む、癌の存在若しくは癌の進行を検出する方法に向けられる:
１）癌にかかっている若しくは癌になるリスクにある患者から、サンプルを得ること;
２）そのサンプルを、NME7ファミリーのメンバーのレベル若しくはNME7ファミリーのメンバーをコードする核酸のレベルを検出若しくは測定することができる分析にかけること;
３）コントロール患者若しくはコントロール細胞でのレベルに対して、試験サンプルでのNME7ファミリーの測定されたメンバー、あるいはNME7ファミリーメンバーをコードする核酸のレベルを比較すること;
４）NME7ファミリーのメンバー、あるいはNME7ファミリーのメンバーをコードする核酸のレベルが、コントロールに比べ上昇していることを決定すること; そして
５）もし、該テストが比較されたコントロールが、以前、癌と診断されたドナー由来ならば、該試験サンプルのドナーは、癌にかかっているか若しくは癌の進行を持っていると結論を下すこと。この方法では、循環系、あるいは組織でのNME7ファミリーのメンバーの検出は、患者での癌の指標でありうる。NME7ファミリーのメンバーは、NME7、NME7b、NME7-X1、あるいはNME7-AB様タンパク質でありうる。
また別の態様では、発明は以下の方法を含むことに向けられる:
患者において、NME7ファミリーのメンバー若しくはMUC 1 *の存在の検出すること;そして
該NME7ファミリーのメンバー若しくはMUC1*発現を示す患者に、抗NME7若しくは抗MUCl *抗体、あるいは複数抗体を投与すること。該NME7ファミリーメンバーは、NME7、NME7b、NME7-X1あるいはNME7-AB様タンパク質でありうる。
また別の態様では、本発明は、以下を含む、癌治療若しくは予防の方法に向けられる:
１）癌を持っている疑いがある、又は発癌の危険がある、又は転移性癌になる危険がある、患者からサンプルを得ること;
２）NME7ファミリーのメンバー若しくはNME7ファミリーのメンバーをコードする核酸の量を測定することであって、そこでは測定されたレベルはコントロールサンプルで測定されたものに対し優位に高いこと;
３）該患者が、癌を保持する（発癌しているともいう）又はより攻撃的若しくは転移性癌を進展したと決定すること;
４）該患者に、NME7ファミリーのメンバーの発現を抑える、NME7の開裂を阻害する、あるいはその標的へのNME7結合を阻害する、有効な量の治療薬を投与すること。該NME7ファミリーのメンバーの標的は、MUC1*でありうる。該NME7ファミリーのメンバーの標的はMUC1*細胞外ドメインのPSMGFR部分でありうる。該NME7ファミリーのメンバーは、NME7、NME7b、NME7-X1、あるいはNME7-AB様タンパク質でありうる。
癌に関して上記方法のいずれかにおいて、癌は、乳、前立腺、卵巣、結腸直腸、膵臓、肝臓、黒色腫若しくは脳腫瘍の癌である、。
本発明は、以下の詳細な記述及び及び図式化によって表示される添付図面からより完全に理解されうるが、これは本発明を限定するものではない。
図1A-1D。細胞溶解物中のNME1若しくはNME7の発現を示すウェスタンブロットゲルの写真: 1) MUC1*抗体表面(MN-C3 mab)で覆われた表面上において、NM23-H1二量体中で培養されたBGOIVヒト胚性幹細胞; 2) マウス・フィーダー細胞(MEF)の層上において、bFGF中で標準プロトコルによって培養されたBGOIVヒト胚性幹細胞; 3) RPMI培地中で、標準法によって培養されたT47D乳癌細胞; そして4)組み換えヒトNM23-H1野生型、「wt」(A、B)。底列(C、D)はプルダウン若しくは免疫沈澱反応分析の結果を示し、そこでは細胞溶解物が、MUC1の細胞質テイル、「Ab-5」の抗体を添加された、ベッドで別々にインキュベートされた。MUC1*ペプチドへの結合により捕捉された種は、SDS-PAGEによって分離され、それぞれ個々のNM23タンパク質に対する抗体でブロットされた。同じ実験はNME6で行なわれたが、データは示していない。
図2A-2E。表題：癌と幹細胞のウェスタンブロット分析と細胞溶解物(Cell Lyssate)におけるNME1、NME6、あるいはNME7についてのプロービング 図2A-2Eは、ウェスタンブロットの写真を示し、T47D乳癌細胞、BGOIV及びHES-3ヒトES細胞及びSC101-A1 iPS細胞からの細胞溶解物が、NME1、NME6、あるいはNME7の存在のためにプローブされた。すべての細胞株のNME1は、~17kDa(A)の明白な分子量で展開した。HES-3細胞株以外(FGF中で培養された)、すべての細胞株で、NME7 ~33kDa種及び42kDa種(C、E)が検出することができた。NME6特異抗体と反応した種は、スーパーシグナル(Super Signal)を使用して、ビジュアル化が増強された時、HES-3細胞株以外のすべての細胞株に検出された。
表題 図3A ウェスタンブロットによる細胞溶解物におけるNME7の検出 1-RIPA緩衝液で細胞を溶解 2-還元SDS-PAGEをラン（レーンあたり20μｌ） 3-PVDF膜にタンパク質を移す4-抗NM23-H7(B-9,Santa Cruz Biotechnology)で膜をプローブ5-2次抗体にヤギ抗マウス-HRPを使用6-化学ルミネセンス分析でタンパク質を検出図3B ウェスタンブロットによるIPS細胞(SC101-A1)の調整培地(CM)におけるNME7の検出1-還元SDS-PAGEをラン（レーンあたりCMの20μｌ） 2-PVDF膜にタンパク質を移す3-抗NM23-H7(B-9,Santa Cruz Biotechnology)で膜をプローブ4-2次抗体にヤギ抗マウス-HRPを使用5-化学ルミネセンス分析でタンパク質を検出図3C ウェスタンブロットによるIPS細胞(SC101-A1)の溶解物におけるNME7の検出1-RIPA緩衝液で細胞を溶解 2-還元SDS-PAGEをラン（レーンあたり20μｌ） 3-PVDF膜にタンパク質を移す4-抗NM23-H7(B-9,Santa Cruz Biotechnology)で膜をプローブ5-2次抗体にヤギ抗マウス-HRPを使用6-化学ルミネセンス分析でタンパク質を検出 図3A-3Cは、NME7の存在のためにプローブされた、ヒト胚幹(ES)細胞(A)及び誘導多能性幹(iPS)細胞(B、C)のウェスタンブロットの写真のパネルを表わす。ウェスタンブロットは、細胞溶解物においてNME7の3つの形態の存在を示す。~42kDa(全長)、~33kDa(N末端DHドメインを欠くNME7-ABドメイン)及びの小さな~25kDa種の明白な分子量をもつ。しかしながら、より低い分子量種だけが調整培地(B)にある。
図4A-4C。表題 NDPKドメインA及びB,"NME7-AB"を含む組み換えNME7新規ヴァリアントは、大腸菌で高生産でうまく、そして可溶性タンパク質として発現する 図4Aは、NME7-ABの分子篩クロマトグラフィー精製（FPLC purification)の溶出プロフィールである; 図4Bは、NME7-ABピーク分画からの非還元SDS-PAGEゲルである; 図4Cは、精製NME7-ABの分子篩クロマトグラフィーの溶出プロフィールである。
表題 ELISAは、NME7がMUC1*を二量化することを示す。プレートに固定化されたMUC1*細胞外ドメインペプチドが飽和状態にNME7によって結合された。C-末端Hisタグ若しくはBiotinタグをもつ第2のMUC1*ペプチドが加えられ、Hisタグ若しくはHRPラベル化ストレプトビジンに対するHRPラベル化抗体で目視化された。 図5は、NME7-ABがMUC1*細胞外ドメインペプチドを二量化させることを示すELISAサンドイッチ分析からのHRPシグナルのグラフを示す。
表題 T47D+抗NM23-H7ウサギポリクロナール−ｔ＝48ｈ 図6A-6Gは、無処置(列A)、タキソール(列B)あるいは抗NME7抗体(列C- E)で処置されたMUC1*陽性癌細胞の写真を示す；48時間での処置に応じての細胞数を示すグラフ(F)、及び癌細胞阻害実験で使用された抗体濃度を評価するために使われたドットブロット (G) 。
表題 T47D+抗NM23-H7ウサギポリクロナール−ｔ＝48ｈ 図7A-7Kは、癌細胞増殖を阻害するために抗NME7抗体を使用した実験の48時間での結果を示す。培地単独（A）、タキソール(B)又は示された(C-J)濃度の抗NME7で培養された細胞写真; カルセインAM分析を使用して得られた細胞数のグラフが示される(K)。
表題 T47D+抗NM23-H7ウサギポリクロナール−ｔ＝96ｈ 図8A-8Kは、癌細胞増殖を阻害するために抗NME7抗体を使用して、実験の96時間での結果を示す。培地単独（A）、タキソール(B)又は示された(C-J)濃度の抗NME7で培養された細胞写真; カルセインAM分析を使用して得られた細胞数のグラフが示される(K)。 グラフと写真は、ナノモル範囲での低い濃度で抗NME7抗体が癌細胞増殖を阻害することを示す。
表題 幹細胞溶解物+NME7の存在についてプローブされた相当する調整培地 図9は、幹細胞溶解物(奇数番号が付けられたレーン)、あるいは細胞調整培地(偶数番号が付けられたレーン)が、NME7の存在のためにプローブされたウェスタンブロットの写真である。iPS(誘導多能性幹)細胞は、MEF上のFGF(レーン1、2)、抗MUCl*抗体(C3)表面上のNM23-H1二量体(レーン3、4)又は抗MUCl*抗体(C3)表面上のNME7(レーン5〜8)において培養されていた。HES-3(ヒト胚性幹)細胞は、MEF上のFGF(レーン9、10)、抗MUCl*抗体(C3)表面上のNM23-H1二量体(レーン11、12)又は抗MUCl*抗体(C3)表面上のNME7(レーン13、14)において培養された。マウスの胚繊維芽細胞(MEF)細胞もプローブされた(レーン15、16)。ウェスタンブロットは、細胞溶解物が、全長タンパク質に相当する~42kDaの分子量をもつNME7種を含むことを示す。しかしながら、分泌された種は、~33kDaの明白なMWで移動し、それは、N末端リーダー配列が欠けているNME7種に相当する。
図10A-10Bは、マウス単クローン抗体(A)又はN末端DM10配列をのみ認識する別の単クローン抗体を使用し、NME7の存在のためにプローブされた、様々な細胞溶解物及び相当する調整培地のウェスタンブロットの写真を示す。細胞の調整培地からのサンプル中の~33kDa NME7種への、DM10特異抗体の結合性の欠如は、NME7の分泌型が、N末端DM10リーダー配列の全てではないが、大部分が欠失していることを示す。
表題 癌幹細胞マーカー発現-T47D 図11は、従前の培地若しくはNME7を含んでいる培地において培養の後にT47D癌細胞のための癌幹細胞マーカー及び幹細胞マーカーについての遺伝子発現のRT-PCR測定のグラフであり、そこでは非付着性(浮遊物)になった細胞は、付着しているままのものと分離し分析された。
表題 癌幹細胞マーカー発現-T47D 図12は、T47D癌細胞用の癌幹細胞マーカーCXCR4及び幹細胞マーカーSOX2についての遺伝子発現のRT-PCR測定のグラフである。細胞は、従前の培地、あるいはNME1二量体若しくはNME7(NME7-AB)を含んでいる培地のいずれかで培養された。別々に分析された細胞型は、浮遊細胞、ローキナーゼ阻害剤プラス細胞(+Ri)(それは細胞をすべて付着させた)、あるいはローキナーゼ阻害剤がない状態(-Ri)であって浮遊物が除去された後に付着しているままだった細胞である。
表題 癌幹細胞マーカー発現-DU145 図13は、DU145前立腺癌細胞のための様々の幹及び推定上の癌幹細胞マーカーの遺伝子発現のRT-PCR測定のグラフである。細胞は、従前の培地、あるいはNME1二量体(「NM23」)又はNME7(NME7-AB)を含んでいる培地のいずれかで培養された。継代2によって、細胞が付着しているままだったので、ローキナーゼ阻害剤は使用されなかった。
表題 乳癌細胞は、2i阻害剤の存在下若しくはNME7-ABにおける培養によってより転移性の状態に進展される 図14Aは、以前、よりナイーブ状態に幹細胞に戻す（移行若しくは振向けるともいう）ことが示された2i阻害剤(GSK3ベータ及びMEK阻害剤)(A)又はヒトNME1若しくはヒトNME7への高い配列相同性をもつバクテリアNME (B)は、癌細胞を、より転移性の状態へ形質転換するということを示す、転移性のマーカー及び多能性幹細胞マーカーのRT-PCR測定のグラフである。 表題 乳癌細胞は、ヒトNME1若しくはNME7-ABに高い配列相同性をもつバクテリアNMEの存在下での培養によってより転移性の状態に進展される。
図15は、ヒトNME1及びヒトNME7-A若しくは-Bドメイン間の配列アラインメントである。
表題 癌の治療若しくは予防のためにNME7を阻害する抗体を生成するためのNME7特異的ペプチド 次のペプチド配列は、ヒトNME7を標的にするがヒトNME1を標的にしない抗体を生成する免疫原性ペプチドであるとして同定される。該配列は、ヒトNME1への配列相同性の欠如にもとづき選択された。 図16は、NME1への低い配列同一性をもつヒトNME7からの免疫原のペプチドをリストし、癌の治療若しくは予防用の抗NME7抗体を生成するそれらの能力にもとづき選択した。
表題 癌の治療若しくは予防のためにNME7を阻害する抗体を生成するためのNME7特異的ペプチド 次のものは、構造保全性にとって若しくはMUC1*への結合性にとって重要でありうるので好適である。各バリアブル領域がペアのいづれか一に結合するであろう２価抗体が好適である。 図17は、構造保全性にとって若しくはMUC1*への結合性にとって重要でありうるヒトNME7からの免疫原ペプチドをリストし、癌の治療若しくは予防用の抗NME7抗体を生成するそれらの能力にもとづき選ばれた。
表題 次のペプチド配列は、ヒトNME1由来であり、その機能を模倣できる他のバクテリアNMEタンパク質への相同性と同様に、ヒトNME7へのその高い相同性により選択された。ヒトNME7-A若しくはB及びHSP593への、高いその相同性のために特に好ましいものは、No.50〜53である。 図18は、構造保全性にとって若しくはMUC1*への結合性にとって重要でありうるヒトNME1からの免疫原ペプチドをリストし、癌の治療若しくは予防用の抗NME7抗体を生成するそれらの能力に基づき選ばれた。
表題 癌の治療及び予防のための抗体を生成するのに好適なNME7-AB特異的ペプチド 図19は、NME1へのそれらの低い配列同一性及び癌と関係があるとされるバクテリアNME1タンパク質へのそれらの相同性のために選ばれたヒトNME7からの免疫原ペプチドをリストする。これらのペプチドは、癌の治療若しくは予防用の抗NME7抗体を生成するそれらの能力のために好適である。この図で示されるペプチドは、C末端で、システインを共有結合的に含み及び付加した。
表題 癌細胞が転移性若しくは癌幹細胞かどうかのテストは、試験動物で200以下で、腫瘍を形成できるかどうかである。通常の癌細胞は、6M以上を必要とする。ほんの50ほどの少ないNME-p-誘導転移性癌細胞が、試験動物で腫瘍を形成するのに十分であった。ヒトNME-pを毎日投与された動物は、まさに局在化した腫瘍よりむしろ、転移性の癌を展開させた。図20は、最初NME7-AB中で7日間育てられた50のヒト乳癌細胞だけで移植された24匹の マウスのうちの2匹の雌無胸腺nu/nuマウスの写真を示し、そして、CXCR4、CHD1及び幹細胞のマーカーの著しく増加した発現を示した。さらに、そのマウスの半分が、ヒト組み換えNME7-ABを毎日投与された。NME7-ABを毎日投与されたマウスの82%は注射領域の腫瘍化と同様に遠隔の転移も展開した。
図21は、ヒトNME7-ABを含んでいる培地での前培養によってより転移性の状態に形質転換された癌細胞をマウスに異種移植された実験結果のテーブルを示す。
図22Aは、脇腹皮下に、50、100、1,000、あるいは10,000細胞が注入された免疫損傷nu/nu雌マウスの4つのグループの腫瘍容積測定のグラフを示し、そこで注入された細胞は、組み換えヒトNME7-ABで7日間培養されたヒトMUC1陽性の乳癌細胞であり、そこで「浮遊物」が集められ、100倍を越えるまでに、転移リセプターCXCR4を過剰発現すると確認された。各グループのマウスの半分は、ヒト組み換えNME7-ABを毎日注入された。グラフ内の番号は、マウス・トラッキング番号を指す。「M」は、多発性腫瘍を担持するマウスを示す。
図22Bは、脇腹皮下に、50、100、1,000、あるいは10,000細胞が注入された免疫損傷nu/nu雌マウスの4つのグループの腫瘍容積測定のグラフを示し、そこで注入された細胞は、組み換えヒトNME7-ABで7日間培養されたヒトMUC1陽性の乳癌細胞であり、そこで「浮遊物」が集められ、100倍を越えるまでに、転移リセプターCXCR4を過剰発現すると確認された。各グループのマウスの半分は、ヒト組み換えNME7-ABを毎日注入された。各グループ中のマウスの半分は、ヒト組み換えNME7-ABを毎日注入された。NME7-ABの毎日注射投与されたマウスのうち、80%は多発性腫瘍を生じた。このグラフは、同じマウスでの多発性腫瘍の結合された体積を示す。グラフ内の番号はマウス・トラッキング番号を指す。「M」は、外発性腫瘍をもつマウスを示す。
表題 腫瘍分析：注入部位外の隆起はヒト乳房腫瘍である。 図23は、ヒトNME7-ABを含む培地において前培養でより転移性の状態に形質転換されたヒト乳癌細胞を異種移植されたマウス上の遠隔隆起と同様に原発性腫瘍のウェスタンブロットを示す。ウェスタンは、遠隔隆起が、VU4H5抗体のみが、ヒトMUC 1（ネズミでない）を染色するヒト乳房腫瘍であることを示す。MUC1-FL（MUC1 full length)
図24は、ヒトNME7-ABを含む培地において前培養でより転移性の状態に形質転換されたヒト乳癌細胞を異種移植されたマウスでの原発性腫瘍のウェスタンブロットを示す。ウェスタンは、確認される遠隔隆起が、VU4H5抗体のみが、ヒトMUC 1（ネズミでない）を染色するヒト乳房腫瘍であることを示す。
図25は、ヒトNME7-ABを含む培地において前培養でより転移性の状態に形質転換されたヒト乳癌細胞を異種移植されたマウスでの原発性腫瘍のウェスタンブロットを示す。ウェスタンは、遠隔腫瘍を持つようには見えなかった何匹かのマウスが、その器官のうちのいくつかで、ヒトMUC1 -陽性癌を持っていることを示す。
表題 ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3によって生成された抗NME7抗体は、NME7に結合する（左）がNME1にはしない（右）；C20は、抗NMEl抗体である 図26A-26Bは、ＥＬＩＳＡ分析のグラフを示し、そこで、NME7-AB(A)若しくはNME1(B)は、プレートに結合され、及びNME7ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3によって生成された抗NME7抗体は、NME7に結合するがNME1にはしない、それらの能力に関してテストされる。C20は、抗NMEl抗体である。
表題 NME7抗体の表面上のMUC1*ペプチドへのNME7-ABの結合についての阻害能のELISA分析で、ヒトNME1二量体ではない 図27は、ELISA分析のグラフを示し、そこで、生成された抗NME7抗体が、表面に固定化されたMUC1*ペプチドに、NME7-ABの結合を阻害するが、NME1の結合を阻害しない、それらの能力に関してテストされた。
表題 ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3によって生成された抗NME7抗体は、それら免疫原ペプチドと同様に、癌細胞増殖を阻害する 図28は、癌細胞増殖実験のグラフを示し、そこで、乳癌細胞が、抗体を生成するか選択するために使用されたNME7に由来した複数ショートペプチド若しくは複数NME7抗体の存在若しくは非存在状態で育てられた。さらに、ほぼNME7-ABペプチド全体、アミノ酸100-376、での免疫化によって生成された抗体は、癌細胞増殖を阻害することが示された。
表題 NME7特異ペプチドから生成された抗体は、癌細胞増殖を阻害する；ペプチド自身もまた癌細胞増殖を阻害する T47D癌細胞。抗体コンボ52(A1),55(A2),56(B1),57(B1),58(B2),59(B2) 5μｇ/mlで各トータル30μｇ。全ての５つのペプチドは、コンバインされ各1μM若しくは10μMで加えられた。 図29は、癌細胞増殖実験のグラフを示し、そこで、乳癌細胞が、抗体を生成するか選択するために使用されたNME7に由来した複数ショートペプチドの組み合わせ若しくは複数NME7抗体の組み合わせの存在若しくは非存在状態で、育てられた。それらの免疫化NME7-ABペプチドと同様に両方の抗体も、癌細胞の増殖を阻害した。
表題 抗NME7抗体で処理された癌細胞は、浮遊細胞への変異を阻害する。PCRは、CXCR$のような転移性マーカーの非常な増加した発現を示す。異種移植実験は、該浮遊細胞は、極端に少ないコピー数-50-で癌を形成することを示し、癌幹細胞若しくは転移性癌細胞に分類されるための要件を満たしている。浮遊細胞、それは転移性マーカーの高い発現をもつもの及び極端に低いコピー数で動物に腫瘍を形成するものである、の数は、7日目プレート細胞の量の概して20％である。ここで、コントロール抗体が加えられたときの結果の浮遊細胞数が100％と定義され、浮遊細胞の他の％は、コントロールIgG抗体が加えられたコントロールへの相対である。 図30は、癌細胞が、その両方がより転移性の状態への癌細胞を形質転換することができる、NME7-AB若しくは2i阻害剤で、そしてNME7由来ペプチドA1、A2、Bl、B2とB3の存在若しくは非存在状態で、育てられた、観察テーブルを示す。NME7-ABペプチドは、浮遊細胞への付着性癌細胞の移行を阻害し、RT-PCR測定は、転移マーカー、特にCXCR4の発現を増加させたことを示す。
表題 抗NME7抗体で処理された癌細胞は転移性癌細胞への変異を阻害する；CXCR4は癌の転移性マーカーである。T47D乳癌細胞。2iはMEKとGSK3-ベータ阻害剤；FL=浮遊物、61=ウサギ＃61 NME7由来B3ペプチドで免疫、Comb-2＝A1及びA2で免疫化ウサギからの抗体の組み合わせ、Comb-3＝ペプチドA1,A2及びB1で免疫化されたウサギからの抗体の組み合わせ 図31A-31Cは、その各々が、癌細胞をより転移性状態に形質転換する、NME7-AB若しくは2i阻害剤中で育てられたT47D乳癌細胞のCXCR4発現のRT-PCR測定のグラフ、及び転移性の形質転換に対する抗NME7抗体の阻害作用を示す（図31A)。72時間あるいは144時間2i阻害剤の中で育てられたT47D乳癌細胞のCXCR4、CHD1及びSOX2発現のRT-PCR測定のグラフは、NME7-AB免疫化ペプチドは、それら自身、転移性の形質転換に阻害的であることを示す。パート(A) （図31A)における、阻害コンボ2及び3において使用されたペプチドA1、A2及びBlは、ペプチドとして阻害的である。ペプチドB3は、最も阻害的で、パート(A) （図31A)でテストされた最も阻害的抗体であった抗体61用の免疫化ペプチドである。パート(C) （図31C)において、パート(B) （図31B)のグラフのY軸のスケールは縮小される。 表題 NME7-ABペプチドで処理された癌細胞は、転移性癌細胞への変異を阻害する；CXCR4及びSOX2は、癌の転移性マーカーである 表題 NME7-ABペプチドで処理された癌細胞は、転移性癌細胞への変異を阻害する；CXCR4及びSOX2は、癌の転移性マーカーである
図32は、コントロール・ハウスキーピング遺伝子と同様にCXCR4発現のための閾値サイクル番号と同様に図31におけるCXCR4のRT-PCR測定に使用されたサンプルの中で記録されたRNAレベルのテーブルを示す。
表題 幹及び癌細胞でのNME7-X1発現 図33は、ヒト幹細胞及び癌細胞のパネルにおけるNME7-XIの発現のRT-PCR測定のグラフを示す。
表題 幹及び癌細胞でのNME7アイソフォーム発現 図34は、ヒト幹細胞及び癌細胞のパネル中のNME7、NME7a、NME7b及びNME7-X1の発現のRT-PCR測定のグラフを示す。NME7aは全長NME7であり、NME7bはDM10ドメインの小部分を欠失し、NME7-X1は、DM10ドメインの全て及び最初のNDPK AドメインのN末端の小部分を欠失する。バーラベルされたNME7(the bar labeled NME7)は、NME7aとNME7bの両方を検出したプライマーが使用されたことを意味する。
図35A-35Cは、ウェスタンブロットの写真を示し、そこで、様々な癌細胞株が、NME7由来ショートペプチドでの免疫化によって生成された抗体を使用して、NME7種の発現のためにプローブされた。
図36A-36Bは、ウェスタンブロットの写真を示し、そこで、様々な癌細胞株が、市販の抗体を使用して、NME7種の発現のためにプローブされた。
表題 図37A：SK-OV3 NME7AB 144時間 浮遊物 図37B：OV-90 NME7AB 144時間 浮遊物 図37C：MDA-MB NME7AB 144時間 浮遊物 図37A-37Cは、標準培地と比較して、NME7-AB含有無血清培地で培養された後の癌細胞での転移マーカーのRT-PCR測定グラフを示す。図37A) SK-OV3、MUC1-陽性卵巣癌細胞株は、転移性マーカーCXCR4、CDH1 aka e-カドヘリン、SOX2及びNME7-X1の発現を増加した; 図37B) OV-90、MUC1-陰性卵巣癌細胞株が、転移性マーカーCXCR4及びNME7-X1の発現を増加した； 図37C) MDA-MB、最小のレベルのMUC1を発現する乳癌細胞株が、転移性マーカーCDH1 aka e-カドヘリン及びSOX2の発現を増加した。 同上
表題 MUC1*及びNME7-AB様種を発現する種々の癌細胞株 図38A-38Fは、ウェスタンブロット及び癌増殖グラフを示す。 （図３８A)様々な癌細胞株は、抗タンデムリピート抗体VU4H5を使用して、全長MUC 1の発現に関しプローブされる。（図３８B)様々な癌細胞株は、抗PSMGFR抗体を使用して、開裂型MUC 1 *の発現に関しプローブされる。（図３８C)様々な癌細胞株が、市販の抗NME7抗体B9を使用して、NME7種の発現に関しプローブされ、33kDaと30kDaの種と同様に全長NME7を示し、NME7-X1と同様に自然発生のNME7-AB様種と一致する。 表題 BT-474HER2陽性乳癌細胞は、ハーセプチン他の化学療法剤に抵抗性である、転移性になるまで、殆どMUC1若しくはMUC1*を発現しない。siRNA若しくは抗MUC1*FabでMUC1*のブロックは、転移性変異を逆転させた。Fessier et al 2009,MUC1*は乳癌細胞におけるハーセプチン抵抗性の決定要因である、2009 Breast Cancer Res Treat （図３８D) HER2陽性BT-474乳癌細胞は、化学療法薬に対する抵抗を得て転移するまで、MUC1若しくはMUC1*を、ほとんど発現しない。親細胞は、薬のサブ致死のレベルでの細胞の培養によりハーセプチン、タキソール、アドリアマイシン及びシクロホスファミドに抵抗性になった。パート(図３８D)は、HER2の発現レベルが変わらなかったが、MUC1*の発現が劇的に増加したことを示す。（図３８E)抗MUC 1 *の存在若しくは非存在の状態で、ハーセプチンでの処置への応答において、薬剤抵抗性転移性細胞に比べての、親BT-474の細胞の増殖のグラフを示す。（図３８F)抗MUC 1*の存在若しくは非存在の状態で、タキソールでの処置への応答において、薬剤抵抗性転移性細胞に比べての、親BT-474の細胞の増殖のグラフを示す。
表題 血清増殖T47D乳癌細胞におけるMUC1*及びNME7の共免疫沈降 図39A-39Eは、共免疫沈降実験のウェスタンブロットの写真を表す。T47D乳癌細胞抽出物が、MUC1の細胞質側末端、Ab-5、あるいは、コントロール抗体、IgG、に対する抗体とインキュベートされ、そして共免疫沈降させた。ゲルは、2つの異なる市販の抗NME7抗体B9(A)及びCF7(B)でブロットされた。両方のゲルは、~33kDaと~30kDaでユニークなNME7バンドを示す。ゲルは、ストリップ（取除）され、MUC1*の細胞外ドメインに対する抗体、抗PSMGFR(C)及び(D)で再プローブされた。それはNME7種及びMUC1*が、相互作用することを示す。組み換えNME7-AB及び組み換えNME7-X1はともに混合され、ゲル上で展開させ、その後、抗NME7抗体でプローブされた。乳癌細胞において自然発生し及びそれがMUC1*と相互作用する、2つのユニークなNME7種が、NME7-AB様種及びNME7-X1(E)であることを示す。
表題 ヒト胚性幹細胞＆iPS細胞からのMUC1*とNME7の共免疫沈降 図40A-40Cは、共免疫沈降実験のウェスタンブロットの写真を表す。ヒト誘導多能性幹、iPS7、あるいは胚性幹、HES3、細胞抽出液が、MUC1の細胞質側末端に対する抗体、Ab -5、あるいはコントロール抗体、IgGとインキュベートされ、そして共免疫沈降させた。ゲルは市販の抗NME7抗体B9(A)でブロットされた。両方の細胞型は、~33kDaと~30kDaで、ユニークなNME7バンドを示す。ゲルはストリップされ、そしてMUC1*の細胞外ドメインに対する抗体、抗PSMGFR(B)で再プローブされた。それは、NME7種及びMUC1*が相互作用することを示す。組み換えNME7-AB及び組み換えNME7-X1はともに混合され、ゲル上で展開させ、その後、抗NME7抗体でプローブされた。乳癌細胞において自然発生し及びそれがMUC1*と相互作用する、2つのユニークなNME7種が、NME7-AB様種及びNME7-X1(E)であることを示す。
定義
本発明英文原文で、「a」及び「an」は、単一及び複数の両方を参照するために使用される。
本発明英文原文で、「about」（約）、あるいは「substantially」（本質的に）は、一般的に、正確な数字に制限されることからの許容数字を意味する。例えば、ポリペプチド配列の長さの内容で使用されるとき、「約」、あるいは「本質的に」は、該ポリペプチドがアミノ酸の特定された数に制限されたものでないことを示す。少数のアミノ酸の、N末端若しくはC末端から付加若しくは欠失は、その結合活性のような機能的活性が存在する限り、含まれうる。
本発明での文言において、1つ以上のさらなる治療薬との組み合わせでの投与は、任意の順による連続投与及び同時投与(協力的)を含む。
本発明での文言において、「amino acid」及び「amino acids」はすべての自然発生のL-ot-アミノ酸を指す。この定義は、ノルロイシン、オルニチン及びホモシステインを含むことを意図する。
本発明での文言において、一般に、"アミノ酸配列バァリアント(variant)"は、参照ポリペプチド(例えばネイテイブ配列)と比較して、それらのアミノ酸配列に、ある差異をもつ分子を指す。アミノ酸変異(alteration)は、ネイテイブアミノ酸配列における、置換、挿入、欠失、あるいはこのような変化の任意のコンビネーションでありうる。
置換バァリアントは、ネイテイブ配列における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、同じ領域であるその場所に挿入された異なるアミノ酸をもつようなものである。置換は単一でありうることができ、その場合、分子中の1つのアミノ酸だけが置換され、あるいは、置換は複数でありうることができ、その場合、その同じ分子において、2つ以上のアミノ酸が置換されうる。
配列内のアミノ酸の置換は、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されうる。例えば、非極性(疎水性)のアミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む。陽性荷電の(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。陰性荷電の(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸とグルタミン酸を含む。同じ若しくは類似の生物活性を示すタンパク質若しくは断片もそれらの誘導体、及び翻訳中に若しくは翻訳の後に、例えばグリコシレーション、蛋白質分解、抗体分子あるいは他の細胞配位子へのリンケージ等によって、別に、修飾される誘導体もまた、本発明の範囲内に含まれる。
挿入バリアントは、ネイテイブアミノ酸配列の特別な位置にあるアミノ酸の真隣に一つ以上のアミノ酸が挿入されるようなものである。あるアミノ酸の真隣とは、そのアミノ酸のカルボキシ若しくはアミノ官能基に結合されることを意味する。
欠失バリアントは、ネイテイブアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸が除去されたようなものである。通常、欠失バリアントは、分子の特別の領域で、1つあるいは2つのアミノ酸を欠失する。
本発明での文言において、「断片」あるいは「機能的な誘導体」は、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なアミノ酸配列バリアント及び断片を意図し、同様に、有機的な誘導剤との反応によって得られた誘導体、翻訳後修飾、非蛋白質のポリマーをもつ誘導体、及びイムノアドヘシンを含む、共有結合性修飾を意図する。
本発明での文言において、「キャリアー：担体」は、薬学的に許容されるキャリアー、賦形剤、あるいは安定剤を含み、それは使用された投与量と濃度で、それにさらされた細胞若しくは哺乳動物に無毒である。多くの場合、薬学的に許容されるキャリアーは、水溶性pH緩衝液である。薬学的に許容されるキャリアーの例は、制限することなく、リン酸塩、クエン酸及び他の有機酸のような緩衝液; アスコルビン酸を含む酸化防止剤; 低分子量(約10未満の残渣)ポリペプチド; 血清、アルブミン、ゼラチンあるいは免疫グロブリンのようなタンパク質; ポリビニルピロリドンのような親水性重合体; グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、あるいはリジンのようなアミノ酸; 単糖類、二糖類、及びブドウ糖、マンノースあるいはデキストリンを含む他の炭水化物; EDTAのようなキレート剤; マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール; ナトリウムのような塩形成カウンターイオン; 及び/又はTWEENR、ポリエチレングリコール(PEG)及びPLURONICSRのような非イオン性界面活性剤を含む。
本発明での文言において、「薬学的に許容されるキャリアー（担体）及び/又は希釈剤」は、いかなるもの及び全ての溶剤、分散媒体、抗菌性及び抗真菌コーティング剤、等張性の吸収遅延剤等を含む。薬学的活性物質のこのような媒体及び剤の使用は、当業者には周知であるいかなる慣例の媒体若しくは剤も、有効成分との調和がとれないことが知られる場合を除けば、該処置用組成物におけるその利用は、十分に考慮されうる。補足的な活性成分もまた、該組成に組み入れることができる。
投与のしやすさ及び投与量の均一性のための投与量単位型での、非経口組成物を製剤化することは特に有利である。ここに使用されるような投与量単位型は、処置されるべき哺乳類対象患者にとっての単一投与量として適した物理的に分離したユニットを指す; 各ユニット（単位）は、必要な薬学的担体と共同して所望の処置効果を生み出すために計算された活性物質の前もって定義した量を含んでいる。 本発明の投与量単位型のための明細は、 (a)活性物質の特別の特徴及び達成されるべき格別の処置効果、及び(b)肉体の健康が害されている病気状態がある対象生体患者の疾病の処置（治療ともいう）用の活性物質のような調剤技術分野での固有の制限によって規定され及びそれに直接依存する。
主要な活性成分は、投与量単位型での適切な薬学的に許容されるキャリアーと共に有効な量で、便利で有効な投与のために調剤される。ユニット剤形は、例えば、0.5μgから約2000 mgまでの幅のある量で主要な活性成分を含むことができる。割合で表されるなら、活性成分は、キャリアーの約0.5μg/mlから一般的に存在する。補足的有効成分を含んでいる組成の場合には、投与量は、該成分の投与の常用量及び方法を参照することによって決定される。
本発明での文言において、「ベクター」「ポリヌクレオチドベクター」「構築物」及び「ポリヌクレオチド構築物」は、互換的に使用される。本発明のポリヌクレオチドベクターは、RNA、DNA、レトロウイルスコートでカプセル化されたRNA、アデノウイルスコートでカプセル化されたDNA、別のウイルス若しくはウイルス様フォーム (単純疱疹のような、及びポリアミドのようなアデノ構造)で包まれたDNAを含み、これらに限定されず、ある型のうちのいずれでも可能である。
本発明での文言において、「宿主細胞」は、本発明のベクターの受容体でありうる若しくはだった、個々の細胞若しくは細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含む。また、後代は、自然か、偶然か、計画的突然変異及び/又は変異により、オリジナルの親細胞と必ずしも、形態学的に、あるいは全DNAコンプリメントにおいて、完全な同一性は必要でない。
本発明での文言において、「対象」は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適にはヒトである。
本発明での文言において、処置目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物に分類されるいかなる動物をも含み、ヒト、家畜、及び動物園、スポーツ若しくはペット動物、犬、猫、牛、馬、羊、ブタなどが例示される。好適には、哺乳動物はヒトである。
本発明での文言において、「処置」は、有益な若しくは所望の臨床の結果を得るためのアプローチを意図する。本発明の目的のために、有益な若しくは所望の臨床の結果は、制限されることなく、以下を含む症状の緩和、疾病の程度の減少、疾病の安定した(つまり、悪化せずに)状態、疾病進行の遅延若しくは緩徐化、疾病状態の改善、あるいは緩和、また緩解(部分的でも、あるいは全体的でも)、検出及び非検出。「処置」は、さらに、処置を受けないならば、予測された生存と比較して生存を延長することを意味する場合がある。「処置」は、治療的処置及び予防的若しくは再発防止の両方を指す。処置を必要とするものは、該疾病が予防されるべきものと同様に、既に該疾病をもつものを含む。疾病を「軽減する」ことは、疾病状態の程度及び/又は不適当な臨床症状が、減少すること、及び/又は、処置のない状況と比較して、進行のタイムコースが遅くなるか延長されることを意味する。
本発明での文言において、「A1」ペプチド、「A2」ペプチド、「B1」ペプチド、「B2」ペプチド及び「B3」ペプチドは、ヒトNME1には結合しないあるいは著しく少なくしか結合しないが、ヒトNME7-ABに結合するペプチドを指す。これらの抗体を生成するために使用されるペプチドは、NME7-AB及びNME7-X1の両方に共通で、下記のように特定される。
A1は、NME7Aペプチド1(Aドメイン)である: MLSRKEALDFHVDHQS(配列番号: 141)
A2は、NME7Aペプチド2(Aドメイン)である: SGVARTDASES(配列番号: 142)
Blは、NME7Bペプチド1(Bドメイン)である: DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(配列番号: 143)
B2は、NME7Bペプチド2(Bドメイン)である: EVYKGVVTEYHDMVTE(配列番号: 144)
B3は、NME7Bペプチド3(Bドメイン)である:
AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 145)
さらに、明瞭さの助けのために、NME7A(大文字「A」をもつ)は、NME7のサブユニットA部分を指す。NME7a(小文字「a」を持つ)は、本願で別記されている全長NME7を指す。また、NME7B(大文字「B」を持つ)は、NME7のサブユニットB部分を指す。NME7b(小文字「b」を持つ)は、DM10領域が部分的に欠けている、1種のNME7を指し、それは本願で別記されている。
本発明での文言において、用語「抗体様」は、それが抗体の部分を含んでいるが、自然界に天然に生じる抗体ではないようなもので、操作されうる分子を意味する。例は、限定されないが、CAR(キメラ抗原リセプター)T細胞技術及びYlanthiaRtechnologyを含む。CAR技術は、身体の免疫系が特定の標的タンパク質、あるいは細胞を攻撃するように指向されるように、T細胞の一部に付着された抗体エピトープを使用する。YlanthiaRtechnologyは、標的タンパク質からのペプチドエピトープに結合するためにスクリーニングされる、合成ヒトfabsのコレクションである「antibodylike」ライブラリーから成る。そして、選択されたFab領域は、それらが抗体に似ているように、スキャフォールド若しくはフレームワーク中へ操作（エンジニアリングともいう）されることができる。
本発明での文言において、「NMEファミリータンパク質を阻害する作用剤の有効な量」は、NMEファミリータンパク質とその同系統のリセプターの間の活性化相互作用を阻害する際の作用薬の有効量を指す。
本発明での文言において、「NME由来断片」は、NMEの断片あるいはNMEの断片であるペプチド配列に高度に相同であるペプチド配列を指す。
本発明での文言において、「MUC1*」細胞外ドメインは、主としてPSMGFR配列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 6))によって定義される。MUC1開裂の正確なサイトは、それを切り取る酵素に依存し、その開裂酵素が細胞型、組織タイプあるいは細胞の進化での時間に依存して変化するので、MUC1*細胞外ドメインの正確な配列は、N末端で変わりうる。
本発明での文言において、用語「PSMGFR」は、以下のように定められる、MUC1成長因子リセプターの一次配列の頭字語（アクロニム）である； GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 6)。この点で、「N-10 PSMGFR」、「N-15 PSMGFR」あるいは「N-20 PSMGFR」でのような「N-数」は、PSMGFRのN末端エンドで欠失されたアミノ酸残基の数を指す。同様に、「C-10 PSMGFR」、「C-15 PSMGFR」、あるいは「C-20 PSMGFR」でのような「C-数」は、PSMGFRのC末端エンドで欠失されたアミノ酸残基の数を指す。
本発明での文言において、「MUC1*の細胞外ドメイン」は、タンデム（直列の）リピートドメインが欠けているMUC1タンパク質の細胞外の部分を指す。ほとんどの場合、MUC1*は、開裂産物で、そのMUC1*部分は、タンデムリピート、膜貫通ドメイン及び細胞質側末端が欠けている短い細胞外ドメインからなる。恐らく1つを超える酵素によってそれを開裂することができるようなので、MUC 1の開裂の正確な位置は知られていない。MUC1 *の細胞外ドメインは、ほとんどのPSMGFR配列を含んでいるが、付加的な10-20のN-末端アミノ酸があってもよい。
本発明での文言において、「高い相同性」は、任意の2つのポリペプチド間の指定されたオーバーラップ領域において、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、あるいは97%の同一性であると考えられる。
本発明での文言において、1-10と番号付けられた「NMEファミリータンパク質」、あるいは「NMEファミリータンパク質」は、それらすべてが、少なくとも1つのNDPK(ヌクレオチド・ピロ燐酸塩キナーゼ)ドメインをもつので、共にグループ化されたタンパク質である。ある場合には、NDPKドメインは、ATPのADPへの転換を触媒することができるかの点では機能的ではない。NMEタンパク質は、以前は、HIとH2と番号付けられたNM23タンパク質として知られていた。最近、10ものNMEファミリーが同定された。ここに、NM23とNMEという用語は、相互使用可能である。ここに、用語NME1、NME2、NME5、NME6、NME7、NME8及びNME9は、NMEバリアントと同様にネイテイブ蛋白質に参照して使用される。ある場合には、これらのバリアントは、より可溶であり、大腸菌においてよりよく発現し、ネイテイブ配列タンパク質より可溶である。例えば、本明細書で使用されるようにNME7は、その移行が、大腸菌での可溶の、適切に折り重ねられたタンパク質の高収率発現を可能にするので、優れた商用適用可能性を持っているNME7-ABのような、ネイテイブ蛋白質、あるいはバリアントを意味する場合がある。NME7-ABは、主としてNME7 A及びBドメインから成るが、ネイテイブ蛋白質のN末端にあるDM10ドメイン(配列番号: 39)の殆どを欠く。ここに引用されるような「NME1」は、「NM23-H1」と交換利用可能である。本発明は、NMEタンパク質の正確な配列によって制限されていないことはさらに意図される。NM23-S120Gとも呼ばれる突然変異体NME1-S120Gは、本願の全体にわたって相互的に使用される。S120G突然変異体及びP96S突然変異体は、二量体形成に対するそれらの指向性のために好適であるが、NM23二量体、NME1二量体あるいは二量体型NME1あるいは二量体型NM23としてここに参照されうる。
ここに参照されるようなNME7は、約42kDaの分子量をもつネイテイブNME7を意味することを意図する。
「NME7のファミリー」は、全長NME7を参照し、同様に、天然に生じ若しくは人工的に作られた開裂型であって分子量約30kDa、33kDaをもつ、あるいは約25kDaの分子量をもつ開裂型； NME7b、NME7-X1、NME7-AB、あるいは組み換えNME7タンパク質のような配列番号:82あるいは147であらわされるNME7のNME7アミノ酸1-91であるDM10リーダー配列（配列番号:162）の欠失若しくは部分欠失バリアント； 又はその配列が効率的な発現あるいはその増加産出、溶解性、あるいは、NME7をより効果的にする若しくはより商業的に可能にする他の特徴を可能にするように変異されうるそのバリアントをも参照する。「NME7のファミリー」は、さらに「NME7-AB様」タンパク質を含んでもよく、それは、癌細胞で発現される30~33kDaの範囲のタンパク質である。
本発明での文言において、「ナイーブな状態に幹細胞を維持するか、あるいはナイーブな状態へ刺激を受けた(primed)幹細胞を振り向ける作用薬」は、胚の内部細胞塊の細胞に似ている、ナイーブな状態に幹細胞を、単独で若しくは組み合わせで維持する、タンパク質、低分子、あるいは核酸を参照する。例は、制限されず、ヒトNME1二量体、バクテリア、(fungal)菌類、酵母、ウイルス若しくは寄生性NMEタンパク質であって、ヒトNMEタンパク質、特にNME1、NME7、NME7-X1、NME7-AB、NME6への高い配列同一性をもつもの、2i(Silva J et al,2008;Hanna et al,2010)、5i(Theunissen TW et al,2014)、MBD3,CHD4(Rais YI et al,2013)、BRD4若しくはJMJD6(Liu W et al,2013) の発現を抑えるsiRNAのような核酸、を含む。
本発明での文言において、1つの「多分化能を促進する作用薬」あるいは、「幹様若しくは癌様の状態へ体細胞を振り向ける作用薬」は、タンパク質、小分子、あるいは核酸を参照し、それらは単独若しくは組み合わせで、遺伝的な態様がより密接に幹細胞又は癌細胞に似ているものに変わるように、ある遺伝子の発現を誘導し若しくは抑制する。具体例は、制限されず、NME1二量体、NME7、NME7-X1、NME7-AB、2i、5i、MBD3若しくはCHD4若しくはBRD4若しくはJMJD6の発現を抑えるsiRNAのような核酸、ヒトNME1、NME2、NME5、NME6、NME7、NME8あるいはNME9、好適にはそのNDPKドメインをもつ領域と高い配列相同性がある微生物NMEタンパク質を含む。
本発明での文言において、「低分子」と呼ばれている作用薬に関して、それは、50Daと2000Daの間、好適には150Daと1000Daの間、さらにより好適には 200Daと750Daの間の分子量をもつ合成化学品あるいは化学に基礎をもつ分子でありうる。
本発明での文言において、「天然物」と呼ばれている作用薬に関して、当該分子が自然界において存在する限り、それは化学的分子、あるいは生物学的分子でありうる。
本発明での文言において、FGF、FGF-2あるいはbFGFは、繊維芽細胞成長因子を指す(Xu RH et al, 2005; Xu C et al, 2005)。
本発明での文言において、「ロー関連キナーゼ阻害剤」は、低分子、ペプチドあるいはタンパク質でありうる(Rath N, et al, 2012)。ローキナーゼ阻害剤は、ここ及び他の箇所で、ROCiかROCKi、あるいはRiと短縮表現される。特定のローキナーゼ阻害剤の使用は、例示であり、他のローキナーゼ阻害剤を置換して用いることができる。
本発明での文言において、用語、「癌幹細胞」、あるいは「腫瘍始原細胞」は、より転移性状態あるいはより攻撃的な癌にリンクされた遺伝子のレベルを発現する癌細胞を指す。「癌幹細胞」、あるいは「腫瘍始原細胞」は、また、動物へ移植された時に、極めて少ない細胞で、腫瘍を生じさうる癌細胞を指す。癌幹細胞及び腫瘍始原細胞は、多くの場合化学療法薬に抵抗性をもつ。
本発明での文言において、用語「幹/癌」、「癌様」、「幹様」は、細胞が、幹細胞若しくは癌細胞の特性を得ている又は 幹細胞、癌細胞、あるいは癌幹細胞の遺伝子発現プロフィールの重要な要素を共有する、状態であることを指す。幹様細胞は、多分化能遺伝子の増加する発現のような、より少ない成熟した状態への誘導を受けている体細胞でありうる。幹様細胞は、さらに、ある脱分化をうけたか、それらがターミナル分化を移行することができるメタ安定状態にある細胞を指す。癌様細胞は、アンカレッジ(anchorage)独立的に成長することができるか或は動物において腫瘍を生じさせうるような、まだ完全には特徴づけられていない癌細胞だが癌細胞の形態と特性を示す癌細胞を指す。
本発明での文言において、異なる長さの「スペーサー」、あるいは「リンカー」は、ペプチドのいかなる場所にも組込むことができる。スペーサー接続は、通常アミドリンケージによってなされるが、他の機能であっても可能である。
NME、NME7及びNME7のタンパク質ファミリー
本発明者らは、初期ヒト幹細胞、及びさらにほとんどの癌細胞でNME7が高度に発現されることを見出した(図1、2、3、35、36、38、39及び40、実施例2、3及び4)。さらに、本発明者らは、NM23-H1のように、NME7が、幹細胞と癌細胞の両方で、MUC1*成長因子リセプターに結合し二量化させることを実証した。図15は、NME1及びNME7 A及びBドメインの配列アラインメントを示す。
本発明者は、NME7が、非常に初期の胚性幹細胞で発現されるNME1(NM23-H1)の原始的な型であることを最近見出した。NME7は、成人の組織で、全く発現されないか、あるいは非常に低レベルで発現される。しかしながら、本発明者らは、癌細胞と組織でハイレベルで、及び転移性癌細胞及び組織でさらに高レベルで、NME7が発現されることを見出した。NME7の開裂された型は、それが細胞外のリセプターに結合し、活性化することを可能にする、分泌型でありうる。本発明者らは、全長NME7、MW 42kDa、さらにほぼ33kDa及び30kDaであるNME7種を検出した。33kDaと30kDaの種は、癌細胞から分泌される。ウェスタンブロットは、細胞溶解物に全長NME7を検出するが、それらの条件培地に、より小さな30-33kDa NME7種を検出する(図9及び10)。NME7を認識する抗体、あるいは単にDM10ドメインを認識する抗体のいずれかでプローブされたウェスタンブロットは、調整培地へ分泌されるより低分子量NME7種がDM10ドメインが欠けていることを示す(図10)。これらのデータは、自然発生のNME7種が、それらとほぼ同じ分子量をもつとして、本発明者らが生成した組み換えNME7-ABに匹敵するという考えと一致し、両方は分泌され、両方とも細胞内にタンパク質を維持しうるDM10ドメインの91アミノ酸が欠けている。
本発明者らは、新しいNME7アイソフォーム、NME7-X1、を発見し、さらに、それが癌で過剰発現され及び特に前立腺癌で過剰発現されることを見出した(図33及び34)。NME7-X1、分子量~30kDa、は、NME7アミノ酸125-376を含む、一方、本発明者らが生成した組み換えNME7-AB、分子量~33kDa、はアミノ酸92-376の範囲であり、したがって、さらなる33のN-末端アミノ酸を含む。NME7bは、アミノ酸37-376の範囲であり、またDM10ドメインの37のアミノ酸のみが欠け、さらに前立腺癌で過剰発現される(図34)。本発明者らは、ヒト組み換えNME7-X1を生成した、そして、それは開裂産物か代替アイソフォームである自然発生の「NME7-AB様」タンパク質であるようである自然発生の~33kDa NME7種よりちょっと低い癌細胞中の分泌30kDa NME7種であることを示す。
本発明者らは、癌細胞株のパネルをテストし、それらがNME7-AB様タンパク質のようなNME7-AB、あるいはNME7-X1のような互換性のアイソフォームに似て、切断されうる低分子量種及びNME7をハイレベルで発現することを見出した。
NM23-H1(aka NME1)は、二量体であらねばならないのに反して、NME7は、MUC1*細胞外ドメインに対し2つの結合領域を持つモノマーである。本発明者らは、DM10ドメインが欠けている組み換えヒトNME7を生成し、本発明者らはそれをNME7-ABと呼ぶ。図4A-4Cは、NME7-ABの分子篩クロマトグラフィー精製の溶出プロフィール、NME7-ABピーク分画からの非還元SDS-PAGEゲル及び精製NME7-ABの分子篩クロマトグラフィーの溶出プロフィールを示す。サンドイッチELISA結合分析は、組み換えNME7、NME7-ABは、MUC1 *細胞外ドメインがPSMGFR配列のすべて若しくは殆どを含む2つのPSMGFRペプチドに同時に結合することを示す。
(図5、 実施例6)。ナノ粒子結合分析では、NME7も、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFR部分に結合することができ、二量化させることができることを示す。
NME7を無力化するか、その結合パートナーとの相互作用を遮断するか、その発現を抑制する作用薬は、有力な抗癌治療薬である。そのような作用薬は、抗体、低分子、あるいは核酸でありうる。それらは、NME7に直接に、NME7発現を制御する分子に、あるいは癌を促進する型へNME7を開裂する酵素に対して作用できる。
本発明者らは、NM23-H1二量体のように、組み換えNME7-ABモノマーが、他の成長因子、サイトカイン、あるいは血清がない状態で、多能性のヒト幹細胞増殖を完全にサポートすることができることを見出した。NME7及びMUC1*細胞外ドメイン、本質的にPSMGFR配列を含む、の間の相互作用を競合的に阻害することは、幹細胞の分化を導き、それは、幹細胞増殖を促進し及び分化を阻害するのはNME7及びMUC1*の相互作用であることを示す。
次に、本発明者らは、さらに、NME7-ABだけが、ヒト癌細胞増殖を全面的にサポートすることができることを示した。レギュラーな癌細胞増殖培地に加えられるとき、NME7-ABは、癌細胞増殖を刺激し及び特にMUC1 -陽性及びMUC1*- 陽性の癌細胞の成長を刺激した。MUC1*とNME7の相互作用を阻害することは、癌細胞増殖を阻害した。抗MUCl* FabでのMUC1*成長因子リセプターのブロッキングは、強力に、癌細胞増殖を阻害した。同様に、NME7に結合する抗体は、癌細胞増殖を阻害した。抗NME7抗体による癌増殖の阻害の1つの例は、図6-8及び例10において示される。この場合、多クローン性抗体は、アミノ酸100-376にまたがるNME7の部分で、動物を免疫にすることで生成された。しかしながら、本発明者らは、NME7-ABから、あるいはNME7-X1からのより短いペプチドで免疫にすることから生成された抗体もまた、癌増殖を阻害することを見出した。特に、それらは、MUC1とMUC1* -陽性癌の増殖を阻害する。
NME7は癌転移を引き起こす
本発明者は、NME7-ABを含む最小培地での癌細胞の培養は、より転移性の状態に形質転換されるように種々様々の癌細胞を誘導することをさらに見出した。この誘導された転移性の状態の証拠は、付着細胞増殖から有走性の細胞増殖、aka、「浮遊物」細胞への変化を含み、特に浮遊細胞でアップレギュレートされた特定の転移マーカーのアップレギュレーションを伴う。NME7-ABでの培養の後にアップレギュレートされる、これらの転移性のマーカーは、CXCR4、CHD1 aka E-カドヘリン、CD44、及びOCT4、SOX2、NANOGとKLF2/4のような多能性幹細胞マーカーを制限されず含む。NME7-AB中で培養された癌細胞は、試験動物へ異種移植された時、劇的により高い生着率を持ち、それは90%以上であった。さらに、注入された癌細胞の非常に低い数が、試験動物で腫瘍を形成した。それは、NME7-ABが転移性癌細胞として知られている、癌幹細胞にそれらを形質転換したという証拠である。癌細胞は、NME7開裂産物若しくはNME7-ABと本質的に等価な代替アイソフォームを作るので、ここで記述された方法は、NME7-ABの使用に制限されていない; 他のNME7種もまた同様に働くことができた。 例えば、本発明者らは、別のNME7アイソフォーム、NME7-X1、が癌細胞によって発現されるを見出した。それは、XIアイソフォームがN末端から33のアミノ酸を欠失しているという例外を除いて、本発明者らの組み換えNME7-ABと同一である。NME7-X1は、NME7-ABのように機能することが期待される。「NME7-AB様」タンパク質も、33Da種においてそうであるように癌細胞に検出された。
本発明者らは、本発明者らの前の仕事で、NME7-ABだけが、ヒト幹細胞を、初期のナイーブな状態へ振り向けることができることを示した。本発明者らは、よりナイーブな状態に幹細胞を仕向ける他の試薬の存在下での癌細胞の培養は、癌細胞をより転移性状態に形質転換することを見出した。本発明者らは、NME7-AB(図11及び12)、「2i」阻害剤(図14A)、ヒトNME1二量体、あるいはヒトNME1若しくはヒトNME7(図14B)への高い配列相同性をもつバクテリアNME1二量体は、レギュラーな癌細胞を転移性癌細胞、それらは癌幹細胞「CSC」あるいは腫瘍始原細胞「TIC」(図- 14 11)と呼ばれる、に各々形質転換することができることを実証した。
2iは、本発明者が、ヒト幹細胞をよりナイーブな状態に戻すのを見つけた、2つの生化学的阻害剤に与えられた名前である。2iは、MEK及びGSK3ベータ阻害剤、PD0325901及びCHIR99021で、それは、各々約1 mM及び3 mMの終濃度で培地に加えられる。NME7-AB及びNME7-X1は、癌細胞を転移性細胞へ形質転換するのに、細胞最少培地のバッチを分けるために添加される時、約4nMの終濃度である。なお、これらは、約１nMから16nM範囲のより低及び高濃度でも十分に機能する。ヒト若しくはバクテリアのNME1二量体は、4nM〜32nMの終濃度で使用され、これらの実験では典型的に使用される16nMで使用された。ここでヒトNMEは、S120G変異をもつ。野生型を使用する場合は、より低い濃度が必要でありうる。これらの正確な濃度が、重要であることは意図していない。NME1タンパク質が二量体であることは重要であり、また、これが起こる濃度の範囲は、ある変異は二量体として維持するのに高濃度を許容するが、低いナノモルの範囲である。同様に、NME7タンパク質の濃度は変わりうる。NME7-AB及びNME7-X1は、モノマーであり、また、癌細胞を転移性の細胞へ形質転換するために使用される濃度は、タンパク質がモノマーとして残ることを可能にする。
NME7、NME7-AB、NME7-X1、及び2i阻害剤、MEKiとGSK3iに加えて、他の試薬及び阻害剤が、幹細胞をよりナイーブな状態に戻らせることを他の者によって示された。これらの阻害剤「i's」は、JNKi、p38i、PKCi、ROCKi、BMPi、BRAFi、SRCi、同様に成長因子アクチビン及びLIFを含む(Gafni et al 2013, Chan et al 2013, Valamehr et al 2014, Ware et al 2014, Theunissen et al 2014)。これらの試薬も、癌細胞をより転移性の状態に移行させるために使用することができる。幹細胞をよりナイーブな状態に戻らせる、阻害剤若しくは成長因子を単独若しくはコンビネーションで使用して、より転移性の状態に形質転換するために誘導された細胞は、癌転移を処置するか予防するための薬剤を同定したりテストするための発見ツールとして使用することができる。
様々な分子マーカーが、転移性癌細胞の指標であるとして提案された。異なる癌タイプは、アップレギュレートされる異なる分子をもち、例えば、リセプター、CXCR4は、転移性の乳癌でアップレギュレートされ、その一方で、CHD1として知られるE-カドヘリンは、転移性の前立腺癌でよりアップレギュレートされている。これらの特異的な転移マーカーに加えて、OCT4、SOX2、NANOG及びKLF4のような多分化能の典型的なマーカーは、癌が転移性になるとアップレギュレートされる。スタートの癌細胞及び後の転移性癌細胞は、これらの遺伝子の発現レベルを測定するために、PCRによって分析される。本発明者らは、転移性のマーカー及び多能性幹細胞マーカーの増加した発現によって証拠づけられる、より転移性の状態にそれらを形質転換させる、NME7-ABのような作用薬中で培養されたこれらの癌細胞は、転移性癌細胞として機能することを実証した。
癌細胞の個体群が転移性かどうかの機能テストは、免疫不全マウスに、該細胞の、非常に低い数、例えば200を植えつけ、それらが腫瘍化するかどうかを確認することである。典型的には、5-6百万の癌細胞が、免疫不全マウスで、腫瘍を形成するのに必要とされる。本発明者らは、NME誘導転移性癌細胞の50ほどが、マウスで腫瘍を形成したことを示した。さらに、試験期間中、ヒトNME7-AB、NME1あるいはNME7-X1を注入されたマウスは、遠隔領域への腫瘍転移をおこした。
1つの特別の実験で、T47Dヒト乳癌細胞は、48時間ごとに培地交換して14日間標準RPMI培地において培養され、およそ75%集密度状態でトリプシン処理をおこなった。その後、細胞は6つのウェルプレートへ植えられ、4nM NME7-ABを補われた最小幹細胞培地(実施例1参照)中で培養された。培地は48時間ごとに変更された。4日目までに、ある細胞は、表面から分離し、浮遊した。培地は、これらが転移マーカーのRT-PCR測定による証拠として最も高い転移性の可能性を持っている細胞であるので、「浮遊物」を保持するように注意深く変更される。7日目、あるいは8日目においては、浮遊物が回収され数えられる。サンプルはRT-PCR測定のために保持される。測定された重要なマーカーは、CXCR4であり、それはNME7-AB中で簡潔に培養された後に40-200-倍までにアップレギュレートされる。
新鮮な回収された浮遊性の転移性細胞が、90日間の徐放性発情ホルモン物質ペレット剤が注入されたメスnu/nu無胸腺マウスの脇腹に異種間移植された。浮遊性細胞は、各々10,000、1,000、100、あるいは50細胞で、移植された。6の各グループ中のマウスの半分が、又、オリジナルの移植サイトの近くに、32nM NME7-ABを毎日注入された。NME7-ABのないRPMI培地において培養された親T47D細胞は、又、コントロールとして100、10,000、あるいは600万をマウスへ注入された。わずか50の細胞が注入された時でさえ、NME7誘導浮遊性細胞が注入されたマウスは、腫瘍を生じた。浮遊性細胞が注入され、NME7-ABの毎日の投与を受けたマウスは、又、様々な器官で遠隔性腫瘍若しくは遠隔性転移を生じた(図20-25)。NME7-AB培養癌細胞の移植後、ヒトNME7-ABを注入された12匹のマウスのうちの11匹のマウス(92%)が、注射領域で腫瘍を生じた。移植後ヒトNME7-ABを注入されなかった、12匹のマウスのうちの7匹だけ（58%）が、腫瘍を生じた。ヒトNME7-ABを注入され、腫瘍を担持する11匹のマウスのうちの9匹(82%)のマウスが、注射領域から遠隔部で外発性腫瘍を生じた。NME7-ABを注入されなかったマウスのどれも、複数の可視の腫瘍を生じなかった。
屠殺後、RT-PCR及びウェスタンブロットは、NME7-ABを注入されたマウスでの遠隔性の隆起は確かにヒト乳房腫瘍だったことを示した。それらの器官の同様の分析は、遠隔性の隆起に加えて、マウスは、移植されたヒト乳癌細胞のヒト乳癌特性を持つて、肝臓及び肺にランダムに転移したことを示した。予想通り、600万個の細胞が移植されたマウスだけで、腫瘍が育った。
本発明者らは、ヒト組み換えNME7-ABが、NME7-X1、及び30-33kDa NME7開裂産物に、サイズ及び配列で、比較可能であることを実証した。本発明者らは、NME7-ABが、癌腫瘍の増殖を促進し、癌細胞を、腫瘍始原細胞(TIC)とも呼ばれる高い転移性の癌幹細胞(CSC)状態に加速させることを示した。したがって、本発明者らは、NME7-X1、及びDM10ドメインを欠失するNME7開裂産物が、さらに癌増殖を促進し、また癌細胞を、腫瘍始原細胞(TIC)ともよぶ、高度に転移性の癌幹細胞(CSC)状態に加速させる、ということを結論づけた。1例において、NME7-ABが、無血清培地において及び何らの他の成長因子若しくはサイトカインの欠如において、癌細胞に添加された。7-10日以内に、癌細胞は、転移性癌細胞の指標であるCXCR4のような分子マーカーの発現の100倍の増加以上によって証拠づけられるように、高度に転移性のCSCs/TICsに移行した。1例において、T47D乳癌細胞が、標準RPMI培地、あるいは16nMの終濃度に組み換えNME7-ABを添加された最小幹細胞培地(実施例1)において培養された。10日後に、細胞は、集められ、それは10-200倍までに上げられていたCSCsの分子マーカーの発現についてのRT-PCRによって分析された(図11及び12)。これは、本発明者らが、1つの癌細胞タイプをより転移性の状態に形質転換した方法の特異的で詳細な実施例である。本発明は、これらの詳細によって限定されることを意図するのではない。この方法で形質転換される一連の癌細胞があり、幹細胞をよりナイーブな状態へ振り向け、さらに癌細胞をより転移性の状態に進展させる、一連の作用薬があり及び添加された作用薬が癌細胞を形質転換する一連の濃度がある。癌細胞の他のタイプは、転移性のマーカーの劇的なアップレギュレーション及び移植された癌細胞の非常に低い数から腫瘍を形成する能力のために、NME7-ABの中で、培養のより長い期間を要した。例えば、NME7-AB、2i、ヒトNME1、又はヒトNME1若しくはヒトNME7に対して高い相同性をもつバクテリアNME1中で培養された前立腺癌細胞は、2-3継代の後に転移性マーカーの劇的な増加を示した。
転移性マーカーCXCR4は、転移性の乳癌細胞の中で特に増加し、一方、CHD1は転移性の前立腺癌で特に上昇した。ここで、本発明者らは、癌細胞がより転移性の細胞へ形質転換する場合OCT4、SOX2、NANOG、KLF2/4及びTBX3のような多能性幹細胞マーカーもアップレギュレートされることを示す。
DU145前立腺癌細胞は、同様に培養され、そして、NME7-AB中で培養されたこれら細胞は、さらにCSCマーカー発現の劇的な増加を示した(図13)。前立腺癌細胞では、CHD1(aka E-カドヘリン)及びCXCR4が、他の多能性幹細胞マーカーと共に、NME7-AB中で成長しないコントロール癌細胞と比較して、アップレギュレートされた。卵巣癌細胞、膵癌細胞及びメラノーマ細胞も、NME7-AB中で培養され、培養3日ほど後に、より転移性の状態に形質転換された。図37A- Cは、卵巣癌細胞株SK-OV3、OV-90及び乳癌細胞株MDA-MBのすべてが、付着性から非付着性の浮遊細胞に形質転換したことを示し、NME7-ABでの培養で72時間あるいは144時間の後に転移性のマーカーの発現が増加したことを示す。
ここで、本発明者らは、NME7-ABが、より転移性の状態へ、癌細胞の広い範囲を形質転換することを示した。さらに、本発明者らは、癌細胞が、組み換えNME7-AB 33kDaとほぼ同じ分子量であり(図33-36及び図38)、及び、NME7-AB のようにDM10ドメインを欠けている(図10)、及び、N末端から33アミノ酸を欠くことを除き、NME7-ABと同じ配列である代替アイソフォームNME7-X1 30kDaを発現するところの、自然発生の種を発現することを示した。共免疫沈降実験は、T47D乳癌細胞上で行なわれ、そこで、細胞抽出液は、MUC1の細胞質側末端、Ab-5あるいはコントロール抗体、IgGに対する抗体とインキュベートされ、そして共免疫沈降させた。免疫沈降した種は、ゲル電気泳動法によって分離された。ゲルは2つの異なる市販の抗NME7抗体でブロットされた。両方のゲルは~33kDa及び~30kDaでユニークなNME7バンドを示す(図39 A、B)。ゲルは、ストリップされ、MUC1 *の細胞外ドメインに対する抗体、抗PSMGFR、で再プローブされ (図39C、D)、それはNME7種及びMUC1 *が相互作用することを示す。本発明者らが作った組み換えNME7-AB及び組み換えNME7-XIが、ともに混合され、ゲル上で走らせ、その後、抗NME7抗体でプローブした。それは、乳癌細胞において自然発生し、それがMUC1 *と相互作用する、2つのユニークなNME7種は、NME7-AB様種及びNME7-X1であることを示す(図39E)。同様の実験はヒト幹細胞で実行された。図40A-Cは、共免疫沈降実験のウェスタンブロットの写真を表す。ヒト誘導多能性幹、iPS7、あるいは胚性幹、HES3、細胞抽出液が、MUC1の細胞質側末端に対する抗体、Ab-5、あるいはコントロール抗体、IgG、とインキュベートされ、そして、共免疫沈降させた。ゲルは市販の抗NME7抗体B9(A)でブロットした。両方の細胞型は、~33kDaと~30kDaでユニークなNME7バンドを示す。ゲルは、ストリップされ、そしてMUC1*の細胞外ドメインに対する抗体、抗PSMGFR(B)で、再プローブした。それは、NME7種及びMUC1 *が相互作用することを示す。次に、本発明者らが作った組み換えNME7-AB及び組み換えNME7-X1は、ともに混合され、ゲル上で走せ、抗NME7抗体でプローブした。それは、乳癌細胞において自然発生し、MUC1 *と相互作用する、2つのユニークなNME7種は、NME7-AB様種及びNME7-X1(C)であることを示す。NME7-ABは、組換え型タンパク質であるので、本発明者らは、自然発生の種が、余分な1-15の付加アミノ酸を含むか又は組み換えNME7-ABより1-15付加アミノ酸が欠けている、かどうかは知らないが、同じ明白な分子量で展開する。「NME7-AB様」とは、組み換えNME7-ABが行うように機能することができるおよそ33kDaの明白な分子量で展開するNME7種を意味し、それが癌細胞増殖を刺激することができ、より転移性の状態への癌細胞の移行を引き起こし、またヒト幹細胞の多能性の展開を全面的にサポートすることができる。
本発明者らは、NME7及び低分子量NME7種を発現する癌細胞株及び癌細胞個体群が、CSCあるいは転移性癌細胞であるいくつかの癌細胞を含むと結論した。これらの癌は、NME7-AB、NME7-X1、あるいは低分子量NME7種の中で、細胞を培養することにより、より転移性になるか、あるいは転移性の細胞の個体群を増加させうる。図35は、30kDaにあるNME7-X1、33kDaにある低分子量種NME7-AB様と同様にNME7を発現する癌細胞のパネルのウェスタンブロットを示す。図38は、癌細胞株T47D乳癌、PC3及びDU145前立腺癌、BT-474乳癌、CHL-1とA2058、両方がメラノーマ細胞株、及びCAPAN-2とPANC-1、両方が膵細胞株、のすべてが、MUC1、MUC1*、及びNME7-AB様種及びNME7-X1を発現する。図38Aでは、BT0474細胞は、MUC1あるいはMUC1*を発現しないように見えるが、これらのHER2陽性乳癌細胞が、化学療法薬に抵抗性となるとき、つまり転移性になるとき、それらはMUC1*の発現を増加することによってそうなることを本発明者らは以前にしめした（Fessler et al 2009）(図38 D)。抗MUCl*Fabで、MUC1*リセプターをブロッキングすることは、他の化学療法剤と同様に、ハーセプチン(図38E)、タキソール(図38F)に対するそれらの抵抗性を逆転させた。NME7及び33kDa 、30kDaのような低分子量NME7種を発現する、これらの癌タイプ及び他の癌は、NME7-AB、NME7-X1あるいは低分子量NME7種中での細胞の培養により、より転移性にし、あるいは転移性である細胞群を増加させる。
反対に、NME7及び33kDa又は30kDaのようなより低い分子量のNME7種を発現するこれら及び他の癌のタイプでは、その転移性の潜在力が、抗NME7抗体で細胞を処置することにより逆転させることができる。抗NME7抗体又はNME7-AB若しくはNME7-X1に結合する抗体は、乳、前立腺、卵巣、膵臓及び肝臓癌を含む癌の治療若しくは予防のために患者に投与される。NME7-ABが、MUC1*成長因子リセプターに結合しそして活性化により、その腫瘍原性の効果を発揮することを本発明者らが示した。その結果、抗NME7抗体は、それらは制限されていないが、乳、肺、肝臓、膵臓、胃、結腸直腸、前立腺、脳、黒色腫、腎臓他を含む任意のMUC1*陽性癌に対して有効であることを示す。抗NME7、抗-NME7-AB、あるいは抗-NME7-Xl抗体は、NME7-AB、NME7-AB様、あるいはNME7-X1陽性、あるいはMUC1*陽性の癌の治療若しくは予防のために患者に投与される。
有効な治療のために患者癌細胞をテストすること
NME7-AB、
2i及びよりナイーブな状態へ幹細胞を変える他の試薬と同様にNME7-AB、NME7-X1は、さらにより転移性の状態に癌細胞を形質転換することを引き起こす。任意のもの、あるいはこれらの試薬のコンビネーションでの処置の後、癌細胞はより高い生着率を持っており、腫瘍を試験動物に生じさせるのに100,000倍までより少ない細胞を要求する。したがって、本願で開示された方法は、患者の試験動物の中への原発性腫瘍細胞の異種移植を可能にするために使用することができる。
ついで、候補治療薬は、レシピーエント動物でテストすることができる。このように同定された有効な治療薬は、当該ドナー患者又は同様の癌をもつ他の患者を治療するために使用することができる。1つの実施態様で、特別の患者あるいは特別のタイプの癌のために有効な治療薬を同定する方法は、次のステップを含む: 1) 癌細胞が、細胞株、患者あるいはテストされている治療薬が投与されるだろう患者から得られる; 2) 癌細胞は、NME7-AB、NME7-X1、ヒトNME1、ヒトNME1若しくはNME7に対して高い相同性をもつバクテリアNME1、2iあるいはよりナイーブな状態へ幹細胞を転換することが示された他の試薬において培養される; 3) 得られた癌細胞は、ヒトNME7-AB、NME7-X、ヒトNME1、ヒトNME1若しくはNME7に対して高い相同性をもつバクテリアNME1、2iあるいはよりナイーブな状態への幹細胞を転換することが示された他の試薬が投与されうる、又は動物が、ヒトNME7-ABあるいはNME7-X1に関し遺伝子組み換えされた、テスト動物に移植される。; 4) 候補癌治療薬は、動物に投与される; 5) 治療薬の効果が評価される; そして、6) 有効な治療薬は、ドナー患者あるいは同様の癌をもつ別の患者に投与される。
抗NME7抗体
抗NME7抗体は、有力な抗ガン剤である。NME7は、癌細胞の増殖を促進し、さらにより転移性の状態、あるいはより攻撃的な状態にそれらの進行を促進する成長因子である。NME7、及び~ 33 kDa若しくは30 kDaであるNME7のトランケート型は、他の成長因子あるいはサイトカインが欠けている無血清培地でさえ、癌増殖を全面的にサポートすると示された。プルダウン分析、ELISA及びナノ粒子結合実験で、本発明者らは、成長因子リセプターMUC1*がNME7及びNME7-ABの結合パートナーであることを示した。他のすべての成長因子あるいはサイトカインの排除によるこの相互作用の促進は、癌幹細胞マーカーの発現を増加させた。血清の存在状態でさえ、活性的にNME7に特異的に結合するポリクローナル抗体をつかっての、相互作用の遮断は、癌細胞を殺した。したがって、抗NME7あるいは抗-NME7-AB抗体は、癌の治療若しくは予防のために患者に投与することができる有力な抗ガン剤である。すべての癌の75%以上は、MUC1*陽性である。MUC1*は、MUC1の膜貫通型開裂産物で、殆どのPSMGFR配列を含んでいる細胞外ドメインの一部を残して、細胞外ドメインの殆どが欠失されており、PSMGFR配列の境界へ9-20の付加的アミノ酸N末端を含みうる。
本発明の1つの態様は、対象患者に有効な量の抗NME7抗体を投与することを含む対象患者の癌を治療若しくは予防する方法である。1つの実例では、抗NME7抗体は、NME7-ABに結合することができる。別の実例では、抗NME7抗体は、NME7-X1に結合することができる。また別の実例では、患者に投与される抗NME7抗体は、癌の促進においてその標的へのその結合を阻害する若しくは予防する。1つのケースでは、標的は、開裂されたMUC1の細胞外ドメインである。より具体的には、癌を促進するNME7標的は、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFR領域である。1つの態様では、有効な治療薬は、主としてMUC1*のPSMGFR部分あるいはPSMGFRペプチドから成る、MUC1*細胞外ドメインとNME7種間の相互作用を破壊するか阻止するものである。癌の治療若しくは予防のための作用薬は、NME7、NME7-AB様開裂産物、あるいはNME7-X1を含む代替アイソフォームの発現若しくは機能を直接若しくは間接的に阻害する作用薬である。1つのケースでは、有効な癌治療薬は、NME7種に結合するもの、又はその腫瘍原性の活性を不能にするものである。癌の治療若しくは予防用の有効な治療薬は、NME7、NME7-AB様開裂産物、若しくは代替アイソフォーム、あるいはNME7-X1に結合する若しくは不能にする作用薬である。1つの態様で、NME7種に結合する治療薬は、抗体である。該抗体は多クローン、単クローン、二重特異性、二価、単価、単一鎖、scFvあるいはそれは起源において動物でありうる抗体模倣物、ヒト動物のキメラ、ヒト化、あるいはヒト抗体である。例えば、抗体は、NME7種若しくはその断片での接種あるいは免疫化によって生成することができるか、あるいは、NME7を含むNME7種、NME7-AB様開裂産物、あるいはNME7-X1を含む代替アイソフォームへのその結合能に基づき、抗体ライブラリーあるいは抗体のプールから選ぶことができる。
抗NME7抗体の生成
抗NME7抗体は、宿主動物でのように患者の外部で又は患者において生成することができる。抗体は、NME7又はNME7断片による免疫化によって生成するか、あるいはNME7-AB若しくはNME7-X1のような所望のNME7種への結合能に基づいた、天然、合成、全若しくは抗体断片でありうる抗体のライブラリー若しくはプールから選ぶことができる。1つの態様では、該抗体は、図16-19にリストされたものから選ばれたペプチドによる免疫化から生成される、あるいは該ペプチドへの結合能によって選ばれうる。別の態様では、該抗体は、その配列がヒトNMElのものと同一でないペプチドから生成される、あるいは、該抗体は、NME7種への結合能及びヒトNMElへの非結合性によって選ばれる。
癌増殖を阻害し、転移性の移行を阻害する抗体を生み出す、NME7あるいはNME7-X1由来ペプチド、又はそれら自身が阻害するペプチドを同定するために使われる一つの方法は、次のようである； 1) ヒトNMEl、ヒトNME7、ヒトNME7-X1及びヒトNMEl若しくはヒトNME7のいずれかに対して高い配列相同性を持っているバクテリア若しくは真菌NMEタンパク質の蛋白質配列がアラインされる; 2) すべてのNMEでの高い配列相同性の領域が同定される; 3) NME7若しくはNME7-X1に特異的であるが、高い配列相同性の領域に隣接するペプチド配列が同定される。 その後、ペプチドは合成され、ヒト又は宿主動物中で抗体を生成するために使用される。えられた抗体は、癌増殖を阻害するか、あるいは転移性癌細胞への移行を阻害するそれらの能力に関してテストされる。
癌の処置のための抗NME7抗体の使用
癌増殖あるいはより転移性の状態への移行を阻害するこれらの抗体は、抗癌治療薬として使用のために選ばれ、癌の治療若しくは予防のために患者に投与されうる。選択された抗体は、例えば、ヒトキメラ抗体あるいは完全ヒト化抗体を設計若しくは作ることによりさらに最適化されうる。このアプローチの効果を実証するために、本発明者らは、その癌性機能に重大であると推定されたNME7の複数領域から複数NME7ペプチドを選んだ。その後、本発明者らは、これらのペプチドを使用して、抗体を生成し、次に、次のことへのそれらの能力に関し、免疫化ペプチド及び抗体をテストした: a) 癌増殖を阻害すること; そして、b) 癌細胞から転移性癌細胞へ誘導移行を阻害すること。NME7ペプチドは、抗体産生のための免疫化剤、及び阻害剤自体として選択された(図19及び例11)。ペプチドA1 (配列番号: 141)、A2(配列番号: 142)、Bl(配列番号: 143)、B2(配列番号: 144)及びB3(配列番号: 145)、そこでAは、ペプチドが由来するドメインを指す、つまり、NDPK Aドメインをさし及びBはそのペプチドがNDPK Bドメインに由来することをさす(図15)。各々のペプチドは、免疫原として使用され、多クローン性抗体の産生のために2羽のウサギ各々に注入された。免疫化ウサギ血液から回収された抗体は、免疫化ペプチドで調製されたカラムで精製された。その後、精製された抗体は、ヒトNME7への結合能に関してテストされた。得られた抗体はすべて、所望のように、ヒトNMElではなくヒトNME7に結合する(図26 A-B、実施例12)。これらの結果は、その配列がNME7で見つかるが、NMElにおいては正確に同一でないペプチドを選ぶことによって、NMElではなくNME7に特異的に結合する抗体が生成されることを示す。NMElは健康な機能を有するので、NMElに影響をしない抗体を生成することは、ほとんどの場合、好適である。該抗体は、また、MUC1*細胞外ドメインペプチドへのNME7の結合を阻害するそれらの能力に関してテストされた。図27に示されるELISA実験は、該抗体が、それらがNMElの結合を阻害したよりはるかに多くのMUC1*細胞外ドメインペプチドへのNME7-ABの結合を阻害したことを示す。
これは、NME7とNME7種の癌性機能を阻害する抗体を生成するペプチドを選択するほんの1つの例である。ヒトNMEl、ヒトNME7、ヒトNMEl、ヒトNME7-X1若しくはヒトNME7に対して高い配列相同性を持っていたバクテリアNMEタンパク質での配列アラインメントは、5つの相同ドメインを同定した。ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3はすべて、癌増殖あるいは転移性の状態へのそれらの移行を阻害した抗体を作り出したという事実は、これらのペプチドが由来した5つの領域が、癌の活性化におけるその機能にとって重要なNME7の領域であることを意味する。これらの領域からの他のペプチドは、さらに癌増殖及び転移を阻害し、したがって有力な抗癌治療薬である、抗NME7抗体を生じさせうる。ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3から生成された抗体は、癌増殖を阻害し、より転移性の状態への転換を阻害した。同じか同様のペプチドでの免疫化によって生成され、次いで、テストを受けた単クローン抗体は、当業者に既知のヒト化若しくは他の手段で処理後、癌の治療若しくは予防のために患者に投与されるうる。
特別の実験において、抗体あるいは免疫化ペプチドの添加が癌細胞増殖を阻害するかどうか確かめるために、免疫化ペプチドそれ自体と同様にペプチドA1、A2、B l、B2及びB3での免疫化によって生成された抗体が、培養中の癌細胞に添加された。低濃度で、そして別々に加えられ、該免疫化ペプチドと同様に該抗体も、癌細胞増殖を阻害した(1実施例のために図28を参照)。より高い濃度で若しくは組み合わせで、添加された時、該免疫化ペプチドと同様に該抗体も、強く、癌細胞増殖を阻害した(図29)。免疫化ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3の相当するヒトNME7アミノ酸番号は、配列番号：８２若しくは147をもつヒト全長NME7からの、各々127-142、181-191、263-282、287-301、343-371である。
明確にするために、NME7のアミノ酸番号が議論される場合、それらは、配列番号：８２若しくは147で記述されるようなNME7のアミノ酸番号を指す。
図28に示される抗体の一つと図6-8に示される癌増殖阻害実験で使用される抗体は、NME7(配列番号: 82又は147)のアミノ酸100-376に相当するNME7ペプチドで免疫化することにより生成された。より高い親和性及び特異性をもつ抗NME7抗体を生成するために、次のステップにしたがった: ヒトNME7アミノ酸100-376を含むペプチドで動物を免疫化する、その後: 1) ヒトNME1に結合する抗体を排除する; 2) NME7-AB、2iあるいはより転移性の状態へ癌細胞の変異を誘導する他のNMEを阻害する抗体を選択する; 3) 癌細胞の増殖を阻害する抗体を選択する; 4) MUC1*陽性癌細胞の増殖を阻害する抗体を選択する; 5) MUC1 *細胞外ドメインへのNME7-ABあるいはNME7-X1の結合を阻害する、本質的にPSMGFRペプチドへの結合を阻害する抗体を選択する; 及び／又は 6) 図19にリストされたペプチドA1、A2、Bl、B2、あるいはB3ペプチドの1つ以上に結合する抗体を選択する。
より高い親和性単クローン抗体、あるいはより長いペプチドから生成された単クローン抗体は、より有効な抗体治療薬でありうる。あるいは、抗-NME7、抗-NME7-AB、あるいは抗-NME7-Xl抗体のコンビネーションは、効能を高めるために患者に投与されうる。
抗NME7抗体は、転移性癌細胞への癌細胞の移行を阻害する。
抗NME7抗体は、癌幹細胞(CSC)と呼ばれる転移性癌細胞あるいは腫瘍始原細胞(TIC)への癌細胞の移行を阻害する。NME7-ABが存在する状態で、種々様々の癌細胞を培養すると、通常の癌細胞が転移性のCSCあるいはTICに移行することを本発明者らが実証した。したがって、NME7、NME7-ABあるいはNME7-X1に結合する抗体は、より転移性の状態への癌細胞の進行を阻害する。
癌細胞は、よりナイーブな状態への幹細胞を振り向ける作用薬の存在下で培養された時、より転移性の状態に形質転換する。本発明者らは、NME7-AB、ヒトNME1二量体、バクテリアNME1二量体あるいはMEK及びGSK3ベータ阻害剤（「2i」と呼ぶ）中で癌細胞を培養することは、該細胞をより転移性になならせるということを実証した。該細胞がより転移性の状態に移行するとともに、それらは付着していないかそれほど付着しなくなり、培養皿で離れて浮遊する。これら浮遊細胞、「浮遊物」は、付着していものから分離して回収され、次のことが示された: a) 転移性遺伝子のより高位レベルを発現すること; そして、b) 非常に低いコピー数でマウスへ異種移植された時、腫瘍を生成した。乳癌用のCXCR4、前立腺癌用のCHD1のような特異的転移性マーカー、及びOCT4、SOX2、NANOG、KLF4及び他のような他の多能性幹細胞マーカーのRT-PCR測定値は、NME7-ABにおいて培養された癌細胞において、劇的に過剰発現され、及びここで及び図で「浮遊物」と呼ばれる細胞である非付着となった細胞が最も過剰発現した。
一つの実施例において、該免疫化ペプチドそれ自身と同様に、NME7由来ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3での免疫化によって生成されたNME7-AB特異抗体について、それらが、転移性癌幹細胞への一般的な癌細胞の形質転換を阻害したかどうか判断するために、NME7-ABあるいは2iのいずれかと共に培地へ添加された。抗体とペプチドが別々に、転移性への形質転換を引き起こす作用薬、このケースで、NME7-ABあるいは2i阻害剤PD0325901及びCHIR99021、と共に添加された。 NME7-AB及び2iは、癌細胞の、より攻撃的な転移性の状態に形質転換を引き起こすために別々に使用された。2iが使用されたが、培地に添加された抗体がNME7-ABのすべての反応の口をふさいだとは議論できなかった。というのは、作因となる作用薬が効果的にそこに存在しなかった（実施例14）。
目視観測が、おこなわれた実験について、2人の科学者によって独立して記録された(図30)。最も著しい観察は、該抗体と該ペプチドが劇的に浮遊性細胞の数を減らしたというもので、それは、抗体とペプチドが転移性癌細胞への形質転換を阻害するという最初の兆候であった。特に、細胞へのB3ペプチドでの免疫化から生成した抗体は、どんな浮遊性細胞も殆ど生成しなかった。mRNAが、両方の浮遊性細胞、付着細胞及びコントロール癌細胞から抽出された。mRNAの量、それらは細胞の生存能力と増殖を示す、が測定された。抗体で処置された細胞は、非常により少ないmRNAが存在し、それは少ない実際の分裂する細胞を示し(図32)、それは抗-NME7-AB抗体が、より転移性の状態へのそれらの移行に対すると同様に癌細胞増殖も阻害することを確認する。RT-PCRが、CXCR4を含む、転移性に関するマーカーの発現レベルを測定するために使用された。抗NME7抗体での処置は、抗NME7抗体あるいはペプチドが、転移性癌への移行を阻害することを示し、CXCR4のような転移性のマーカーの量を大幅に減らした(図31A-C)。これらの結果は、NME7-ABに結合する抗体は、転移性癌の治療若しくは予防のために、患者に投与することができることを示す。
NME7-AB、あるいはNME7-X1に由来したペプチドは、競合的に、インタクトNME7-ABとNME7-X1の結合を阻害し、それは抗ガン剤である。
本発明の別の態様では、癌の治療若しくは予防用治療薬は、NME7配列に由来したペプチドであり、それは癌の治療若しくは予防のために患者に投与される。1つの態様では、NME7由来ペプチドは、患者に投与され、その結果、該ペプチド、それらは全NME7より短くあるべきであり及びNME7の腫瘍形成活性を与ええない、が、NME7の標的に結合し、競合的にその標的とインタクトNME7の相互作用、このような相互作用は癌を促進する、を阻害する。NME7-ABは、腫瘍形成活性を完全に付与することができるので、NME7-ABの配列は、より短いペプチド源として好適であり、そこでは、該ペプチドがそれ自体、癌腫瘍増殖あるいは他の癌形成性か腫瘍形成活性を促進することができないことを確認される必要がある。好適な実施例では、NME7-ABの一部の配列を持っており、好適には長さ約12-56のアミノ酸である１又はそれ以上のペプチドが、患者に投与される。半減期を増加させるために、ペプチドは、LのためのD型アミノ酸若しくは非天然バックボーンを持つペプチドのようなペプチド模倣物（mimics）でありうる。また別の場合では、抗癌治療薬は、ペプチドかペプチド模倣物であり、そこにおいて、該ペプチドは、少なくとも、NME7、NME7-AB、あるいはNME7-X1、あるいはその標的であり、何カ所かで「FLR」とも呼ばれるPSMGFRペプチドを含む、MUC1*の細胞外ドメインの一部に高度に相同の配列をもつ。
図16-19は、その同系統の標的への、NME7結合を阻害すると予想される、好ましいアミノ酸配列のリストを提供する。さらに好適な実施態様では、癌の患者あるいは癌になる危険がある患者への投与のために選ばれるペプチドは、それらがNME7結合パートナーに結合すること、及びそれら自身が腫瘍形成活性を与えるものではないということから選ばれる。さらに好適な実施態様では、NME7結合パートナーは、MUC1*の細胞外ドメインである。さらに好適な実施態様では、NME7結合パートナーは、PSMGFRペプチドである。
"発癌活性あるいは腫瘍形成活性を与える"という用語は、当該ペプチドが、それ自体が癌の増殖をサポートし、促進することができることを意味する。NME7に由来したペプチド若しくは複数ペプチドが、腫瘍形成を促進することができるかどうかをテストする別の方法は、該ペプチドが、ヒト幹細胞の多能性の増殖をサポートすることができるかどうかをテストすることである。多能性のヒト幹細胞増殖をサポートするNMEタンパク質及びペプチドは、また癌増殖をサポートする。また別の方法では、それらが、より少ない成熟した状態に体細胞を戻らせる場合がある場合には、当該ペプチドは選択から外される。
NME7-ABの断片は、癌細胞増殖及びより転移性の状態への癌細胞の移行（transfection:変異ともいう）を阻害する。デモンストレーションとして、別々に(図28)あるいはコンビネーション(図29)で添加された、NME7ペプチドA1、A2、B l、B2及びB3は、癌細胞の増殖を阻害する。さらに、NME7ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3は、より転移性の状態への癌細胞の移行を阻害した(図31 B-C)。
したがって、NME7に特異的及びNME7-AB若しくはME7-X1に特異的であるペプチドでの免疫化により生成された抗体は、NME7種の癌性アクションを阻み、有力な抗ガン剤になるであろう。同様に、これらの結果は、NME7に特異的及びNME7-AB若しくはNME7-X1に特異的であるペプチドが、NME7種の癌性のアクションを阻むであろうことを示す。本発明の1つの態様では、該ペプチドは、図16に示されるリストから選ばれうる。本発明の1つの態様では、該ペプチドは、図17に示されるリストから選ばれうる。本発明の1つの態様では、該ペプチドは、図18に示されるリストから選ばれうる。さらに本発明の別の態様では、該ペプチドは、図19に示されるリストから選ばれうる。
癌の治療若しくは予防で使用される抗NME7抗体は、当業者に既知の標準法で調製でき、そこにおいて、このような方法は、NME7、NME7-ABあるいは付加的な10-25のアミノ酸（Nを形成）が存在しないNME7-ABのより短い型を認識する抗体あるいは抗体様分子を生成するために使用される。
本発明の別の態様では、低分子は、NME7、NME7-ABあるいはNME7-XIの腫瘍形成性の効果を阻害するそれらの能力によって選ばれる抗ガン剤である。例えば、ハイスループットスクリーニングは、癌を処置する低分子を同定する。マルチウェルプレートで、低分子は、癌細胞がNME7-ABを含んでいる培地において培養されたウェルに別々に加えられる。もし低分子が、浮遊物になる細胞の量を縮小し 及び/又は CXCR4、CHD1のような転移性マーカーあるいは多能性幹細胞マーカーの発現を減少する場合、その低分子は、抗癌剤候補である。抗ガン剤である低分子を同定する別の方法は、NME7、NME7-ABあるいはNME7-X1と結合するあるいはNME7種の発現を抑制する、低分子を選択するこである。しかし、別のハイスループットスクリーニングは、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFRペプチドへのNME7-ABの結合を阻害する低分子を選択することであり、そしてこれらの低分子は抗ガン剤になる。
NME7-AB及びNME7-X1の配列は、NME7-X1が、NME7-ABがもつ、N末端配列のいくらかを欠いている点でのみ異なる。実験は、本発明者らはそれをNME-AB様種と呼ぶ、NME7-ABとほとんど同一の自然発生のNME7種が存在することを示す。もし抗体が区別することができるコンフォメーショナルな違いがなければ、NME7-X1に結合する抗体は、さらにNME7-ABを模倣する自然発生の種にも結合できる。したがって、それがNME7-AB様種ではなくNME7-X1を阻害することが所望される又はその逆(vice versa)の場合、siRNA、アンティセンス核酸、あるいは遺伝子編集技術は、他ではなく1(one but not other)の発現を阻害するために使用することができる。
1つのケースでは、癌治療薬は、NME7、NME7-X1あるいはNME7-AB様種の特異的発現を直接あるいは間接的に抑える核酸である。そのような核酸は、siRNA、RNAi、アンティセンス核酸及び直接NME7種を抑えるようなものなどでありえる。本発明の別の態様では、核酸は、それを調整する分子の発現の変更により例えばNME7種を間接的に抑制することができる。例えば、スーパーエンハンサーBRD4は、NME7の発現を抑制する。したがって、癌の治療若しくは予防に有効な治療薬は、BRD4の発現を増加させる作用薬である。1つの有効な治療薬は、BRD4のコファクター、JMJD6の発現を増加させる作用薬でありうる。
NME7-ABあるいはNME7-X1に由来したペプチド又は全タンパク質は、本発明者らが実証した、癌増殖を阻害し、転移性癌細胞への癌細胞の移行を阻害する、抗-NME7及び抗-NME7-Xl抗体を、動物で、生成するために使用される。同様に、NME7由来ペプチドは、ヒトに投与可能であり、それにより、それらが、癌を治療若しくは予防する又は転移性癌細胞への癌細胞の移行を阻害する抗体を生成する。NME7ペプチドあるいはタンパク質は、受容者において、抗NME7、抗-NME7-AB、あるいは抗-NME7-Xl抗体の産生を刺激するために、一種のワクチンとしてヒトに投与される。図28及び29に示される結果は、特にNME7-X1あるいはNME7-AB配列で、NME7に由来したペプチドのコレクションでヒトを免疫化することが、単一のペプチドでの免疫化より、より有効なワクチンでありうることを示す。当該ペプチド又はタンパク質は、免疫反応の刺激を補助するために、当業者に知られる担体蛋白質又は他のアジュバントにさらに結合することは可能である。
DM10ドメインの外側に位置するNME7ペプチドは、癌の治療若しくは予防用抗体を生成するために好適である。癌又は転移の予防のために患者に投与することができるペプチドは、図16-19にリストされたペプチドの配列を含む。A1、A2、Bl、B2及びB3は、NME7-AB及びNME7-X1に結合し、癌の治療若しくは予防のために患者に投与される抗体を生成するペプチドの例である。本発明は、NME7あるいはNME7-X1において自然発生でのように、正確な配列のペプチドに限定されない。当業者に知られているように、ペプチド配列のあるアミノ酸の置換は、なお、自然なタンパク質配列を特異的に認識する抗体を生じさせることができる。癌増殖を阻害するか、あるいは転移性癌細胞への通常の癌細胞の移行を阻害する、ここに実証されたペプチドに、本発明が制限されることは意図していない。ペプチドA1、A2、Bl、B2とB3を同定するためにここで使用された方法は、ここで実証されたペプチドと等しい若しくはより効果的な他のペプチド配列を同定するためにも使用することができる。
ヒトNME7-ABあるいはNME7-X1の部分を含むか、NME7-ABあるいはNME7-X1に結合する抗体フラグメントを含む、キメラ抗原リセプター分子は、抗癌治療薬であり、及び癌の治療若しくは予防のために患者に投与される。
1つの実例では、抗NME7抗体の認識ユニットあるいは可変領域は、CAR(キメラ抗原リセプター)技術あるいはCAR T技術として知られている技術を使用して、T細胞の分子に融合される。癌を処置するか予防するために治療上使用することができる抗体あるいはその断片の顕著な特徴は、NME7を認識しそして癌を促進する標的とのその相互作用を阻止する、抗体様可変領域の同定である。1つのケースでは、標的は、MUC1 *のPSMGFR領域である。
抗体、抗体フラグメント、あるいは単一鎖抗体は、CARｓとして知られる、キメラ抗原リセプターを含むキメラ分子へ加工(エンジニアリング、操作ともいう)されえ、その後、その分子は、T細胞のような免疫系細胞へトランスフェクトされるかトランスデュースされ、そして患者に投与される。ヒト化抗体あるいは抗体フラグメント、典型的には、scFvは、CARの細胞外ドメインの多くを含む。抗体フラグメントは、膜貫通ドメインとしてのCD8、活性化ドメインとも呼ばれるT細胞受容体シグナリング分子のような細胞質シグナリングモチーフ、あるいは、限定されないがCD3-zeta, CD28、41bb、OX40を含む共刺激ドメイン(co-stimulatory domain)、のような、免疫系シグナリング分子に生化学的に融合される。CARsは、T細胞あるいは他の細胞、好適には免疫系細胞へトランスフェクトすることができ、そして患者に投与されうる。ここで、その細胞外部分が、抗NME7、抗-NME7-ABあるいは抗-NME7-Xl抗体、抗体フラグメントあるいは単一の鎖、scFv抗体フラグメントを含むCARsについて記述する。好ましい実施態様では、抗体か抗体フラグメントは、ヒトである若しくはヒト化される。
有効な抗NME7あるいは抗-NME7-Xl抗体、あるいは断片は、ネイテイブNME7、NME7-ABあるいはNME7-X1に結合する能力を持つ。実際、親抗体、それからCARの細胞外ドメインが加工される、は、NME7、NME7-ABあるいはNME7-X1由来ペプチドで動物を免疫化することにより生成される。発明の1つの態様では、免疫化ペプチドは、NME7アミノ酸1-376で構成される。発明の1つの態様では、免疫化ペプチドは、NME7アミノ酸92-376で構成される。発明の別の態様では、免疫化ペプチドは、NME7アミノ酸125-376で構成される。また発明の別の態様では、免疫化ペプチドは、図16-18にリストされた配列から構成される。発明の別の態様では、免疫化ペプチドは、図19にリストされた配列から構成される。二者択一で、該親抗体あるいは該抗体フラグメントは、抗体ライブラリーあるいはプールから選ばれ、それは天然、合成あるいはどちらかの断片でありえ、そこではそれらは、NME7、NME7-ABあるいはNME7-X1、図16-18にリストされたペプチドあるいは図19にリストされたペプチドに結合する能力によって選ばれる。
CARの標的部分は、抗体若しくは抗体フラグメントである必要はない。ここで、本発明者らは、細胞外ドメインがNME7断片を含んでいるCARについて記述する。NME7-由来ペプチドは、細胞外ドメインの標的部分が、抗体若しくは抗体フラグメントというより、タンパク質断片若しくはペプチドであるCARの異なる種類へ加工される。ペプチドCARｓは、免疫系細胞、典型的にはT細胞、のなかにトランスフェクトされるかトランスデュースされる。NME7断片若しくはNME7由来ペプチドは、それらの同系統の結合パートナーへ結合するが、インタクトNME7、NME7-A、あるいはNME7-X1のように機能することはできない及び腫瘍形成活性を与えることはできない、という能力に基づき選択される。NME7断片あるいはNME7由来ペプチドは、膜貫通ドメインとしてのＣＤ８、活性化ドメインとも呼ばれるＴ細胞受容体シグナリング分子のような細胞質シグナリングモチーフ、或は、限定されず、ＣＤ３-zeta、ＣＤ２８、41bb、OX40を含む共刺激ドメイン、のような免疫系シグナリング分子に生化学的に融合される。
本発明の1つの態様では、NME7断片は、NME7 NDPK Bドメインの大部分若しくは全てである。発明の別の態様では、NME7断片は、図16-19にリストされたペプチド配列の1つ以上を含んでいるNME7ペプチドである。実験結果は、加工された免疫細胞治療剤としての、キメラ抗原リセプター(CAR)の標的部分として、NME7あるいはNME7、NME7-AB若しくはNME7-X1の断片を使用する戦略は、NME7-ABあるいはNME7-X1のかなり大きな断片が、より短いペプチド、例えば長さで15のアミノ酸未満のペプチド、より有効だろうということを示す。二者択一で、CARのコレクション、各々は異なるNME7-AB由来ペプチドをもつ、は、集合的に、免疫系細胞にトランスフェクトされる若しくはトランスデュ―スすることができ、そして、癌の治療若しくは予防のために患者に投与することができる。図28及び29に示される実験は、このアプローチの妥当性をサポートする。
その細胞外ドメインに、NME7断片を含んでいるCARは、免疫系細胞、典型的にはT細胞、にトランスフェクトされる若しくはトランスデュースされ、そして、癌の治療若しくは予防のために患者に投与された。1つの態様では、癌はMUCl*陽性の癌である。別の態様では、癌は転移性癌である。
NME7を開裂する酵素を阻害する作用薬は、癌を処置する若しくは予防するために使用することができる。NME7のある型は、細胞内に隔離され、したがって、細胞から分泌されない、その上で、それらは癌を促進するための成長因子として働きうる。全長NME7は、42kDaである。しかしながら、本発明者らは、DM10ドメインが欠けていて、本発明者らが生成した組み換えNME7-ABと本質的に同一に見える、~33kDa NME7種が、癌細胞と幹細胞から分泌されることを見出した。この-33kDa NME7種及び別の~25kDa NME7種は、NME7の開裂を阻害する作用薬の利用によってなくなる開裂産物である。
患者サンプル中の、NME7、~33kDa NME7種、本発明者らはそれをNME7-AB様種と呼ぶ、あるいはNME7-X1の高いレベルの検出は、癌の存在あるいはより攻撃的若しくはより転移性の状態へのその進行の症状を示す。本発明者は次のことを見出した、両方の初期段階、ナイーブ幹細胞及び癌細胞、特にMUC1*陽性の癌細胞は、DM10ドメイン及びNME7-X1が欠けている~33kDa NME7をハイレベルで発現する。
NME7-X1は、NME7の理論的な代替アイソフォームであるとしてタンパク質データベースに最近リストされた。しかし、それは組織又は細胞で検出されていない。本発明者らは、PCRによってNME7-X1とNME7を区別するプライマーを設計した。ヒトNME7、NME7a、NME7b及びNME7-X1の発現レベルが、繊維芽細胞細胞、ヒト胚性幹細胞、ヒトiPS細胞、T47Dヒト乳癌細胞、DU145のヒト前立腺癌細胞、PC3のヒト前立腺癌細胞、HEK295のヒト胎児肝細胞及び他のヒト幹細胞株を含む細胞のパネル中でPCRによって測定された。NME7は、幹細胞より癌細胞でより高位レベルで発現される。特に、NME7-X1は、それが繊維芽細胞細胞あるいは幹細胞にあるより、前立腺癌細胞において10倍高く、及び乳癌細胞において3倍高く、発現した。NME7-X1は、それが繊維芽細胞細胞あるいは幹細胞にあるより、HEK293胎児肝細胞において〜５倍高く発現し、したがって、NME7-X1は、肝臓癌で上昇すると予想される。NME7bは、幹細胞より前立腺癌細胞において、17〜25倍高く発現する。
患者サンプル中のNME7種の高いレベルの検出は、患者が、癌を保持する、あるいは癌になる危険性がある指標になる。NME7種レベルが、PCR、ハイブリダイゼーションスキーム、サイクリングプローブテクニック、FISH、免疫細胞化学、IHC、ウェスタンブロット、免疫沈降、サンドイッチ分析、ELISA分析、など、によって測定する若しくは評価することができる。患者サンプルは、液体サンプル、血液サンプル、ミルク、尿、細胞、液体生検、生検などでありうる。癌と診察された患者においては、NME7種の高いレベルが、増加した転移性潜在力の指標である。NME7-X1の高いレベルは、前立腺癌の指標である。本発明の抗体は、NME7種を検出し同定するために使用され、診断のツールとして使用される。
成人ヒト細胞及び組織は、NME7の有意のレベルの発現をしない、若しくはNME7を分泌しないので、癌を診断する又はより攻撃的な若しくは転移性型を診断する又はより攻撃的な型へのシフトを診断する有効な方法は、健康サンプルでのＮＭＥ７レベルに比べての及び/又は健康な成人細胞若しくは組織に存在することが知られるＮＭＥ７のレベルに比べての、患者から、細胞若しくは組織のコレクションから、又は培養細胞からのサンプル中のＮＭＥ７レベルを測定することである。NME7の増加したレベルは、癌の存在、転移性癌の存在、あるいは転移性の兆候を示す。また、NME7の増加したレベルは、MUC1* -陽性癌を示す。NME7の存在のために分析されたサンプルは、患者からの細胞、培養細胞株、体液、血液サンプル、組織標本あるいは生検材料である細胞のコレクションでありうる。したがって、癌の存在あるいは癌の進行を検出する診断アッセイは、次のステップを含む: 1) 癌患者から、あるいは癌になる危険がある患者からサンプルを得ること; 2) NME7の検出又はＮＭＥ７のレベルあるいはNME7をコードする核酸のレベルを測定できる分析法にサンプルを調製する ; 3) コントロール患者若しくはコントロール細胞でのレベルに対して、試験サンプル中の測定されたNME7タンパク質あるいはNME7 -コード化核酸のレベルの比較; 4) NME7のレベル若しくはＮＭＥ７をコードする核酸のレベルが、コントロールと比較して、上昇したことの確認 ; 5) そして該試験サンプルのドナーが、癌にかかっている若しくはテストが比較されたコントロールが癌であると以前に診断されたドナーからのものであれば、癌が進行していると結論を下す。
この分析では、試験サンプルが比較されるコントロールサンプルとしては、非癌性細胞、培養細胞、健康なドナーからのサンプル、ドナーからの非癌性のサンプル、あるいはコントロールサンプルが前の時点でドナーから採取された試験サンプルのドナーからのサンプルがなりえる。このようなサンプルの源は、体液、脳脊髄液、骨髄サンプル、血液、組織、細胞、生検組織若しくは細胞、患者細胞由来の培養細胞等を含む、癌のため若しくは癌の進行に関してテストされる患者から受け取られた任意の標本でありうる。試験サンプルが比較されるサンプルの源は、体液、脳脊髄液、骨髄サンプル、血液、組織、細胞、生検組織若しくは細胞、あるいは健康なドナー若しくは該サンプルが前の時点で得られたテスト患者に由来する培養細胞でありうる。試験サンプルが比較される測定されたレベルは、以前に記録されたデータからでもよく、また試験サンプルへの比較のためのリストに組み込まれる。
Theranostics（セラノスティクス）（診断と治療）
NME7タンパク質若しくはNME7をコードする核酸の高いレベルを診断された患者は、結果として、NME7の発現を抑えるか、NME7の開裂を阻害するか、その標的へのNME7結合、そのような相互作用は癌を促進する、を阻害する治療薬が投与される。NME7の重要な標的あるいはNME7の開裂産物は、MUC1 *である。NME7はMUC1*細胞外ドメインへ結合し二量化させる。したがって、NME7の高いレベルを診断された患者は、NME7を阻害する治療薬及び/又はMUC1の開裂された型、その細胞外ドメインはPSMGFR配列のいくらか若しくはすべてからなる、の二量体化を阻害する治療薬での処置から利益を得る。癌治療の適合性及び癌の治療若しくは予防のための治療薬の有効な量の投与を評価することは、次のステップから成る： 1) 癌を持っている疑いのある、癌になる危険のある、あるいは転移性癌になる危険のある、患者からサンプルを得ること; 2) NME7、あるいはその開裂産物、NME7コード化核酸の量を測定すること、ここで測定されたレベルは、コントロールサンプルで測定した量に対し優位に上であること; 3) 患者が、癌にかかっているか又はより攻撃的な癌若しくは転移性の癌に進展したことを決めること、; 4) NME7の発現を抑える、NME7の開裂を阻害する、あるいはその標的へのNME7結合を阻害する、治療剤の有効量を患者に投与すること、及び/又は MUC1の発現を抑える、MUC1*へのMUC 1の開裂を阻害する、あるいはその標的へのMUC1*結合を阻害する、治療薬の有効量を患者に投与すること。好ましい実施態様において、その標的へのNME7結合を阻害する治療薬は、MUC1*とのその相互作用を阻害する。より好適な実施態様では、それは、PSMGFR配列で本質的に構成されたMUC1 *の細胞外ドメインとのその相互作用を阻害する。好ましい実施態様では、その標的へのMUC1 *結合を阻害する治療薬は、MUC1 *とNME7の間の相互作用を阻害する。もっと好ましい実施態様では、MUC1*とNME7の間の相互作用を阻害する治療薬は、NME7-ABの配列で本質的に構成されるNME7の部分へのMUC1*の結合を阻害する。
化学的修飾ペプチド
ポリペプチドあるいは抗体治療薬は、短い生体内循環半減期及び蛋白質分解的崩壊及び低い溶解性に問題をもつ。発明バイオ医薬品の薬物動態学的及び薬動力学的の特性を改善するために、アミノ酸配列の操作のような方法は、免疫原性を減少させるか増加させて、かつ蛋白質分解的崩壊を減少させうる; アルブミンのような血清タンパク質及び免疫グロブリンへのペプチドの融合あるいは結合はなされうる; 保護及び遅い（遅延放出）リリースのために本発明ペプチド及び抗体のようなバイオ医薬品のドラッグデリバリー媒体の中へのとり込みもなされうる; また、自然若しくは合成ポリマーへの結合も考慮されうる。 特に、合成ポリマー結合のために、ＰＥＧ化あるいはN-アシル化、Sアシル化などのようなアシル化も考慮されうる。
核酸構築物
ここに記述されるような本発明の核酸分子を含む発現ベクターもまた提供される。そこでは核酸分子は、発現調節配列に作動可能にリンクされる。さらに、宿主‐ベクター系がポリペプチドの発現に適している宿主細胞へ導入された本発明の発現ベクターを含むポリペプチドの生産のために提供される。適切な宿主細胞は、大腸菌のような細菌細胞、ピキアパストリスのような酵母細胞、Spodoptera frugiperdaのような昆虫細胞、あるいはCOS、HEKあるいはCHO細胞のような哺乳動物細胞でありうる。
本発明は、ポリペプチドの生産を許容する条件下で、ここに記述の宿主−ベクター系の細胞増殖により本発明のポリペプチドを生産し、そのように生産された該ポリペプチドを回収する方法も又提供する。本発明を履行するのに役立つポリペプチドは、原核生物若しくは真核生物の発現系での発現によって調製されうる。
該組み換え遺伝子は、発現され、また、該ポリペプチドは多くの方法を利用して精製される。遺伝子は、制限されないが、例えばpZErOのような、バクテリア発現ベクターへサブクローン化されうる。
該ポリペプチドは、安定で、生物学的活性タンパク質の形成を許容するあらゆる技術によって精製されうる。例えば、制限されないが、因子は、可溶性タンパク質あるいは封入体として細胞から回収されえ、それから8M グアニジウム塩酸塩によって定量的に抽出され、そして透析される。さらに該因子を精製するために、数多くの精製法が使用され、制限されないが、従来的なイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、デイファレント糖クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、あるいはゲル濾過を含む。
ここに使用された時、ポリペプチドは、サイレントか保存的な変化を結果的にもたらす、アミノ酸残基について、配列内の残基が置換される、機能的に等価な分子を含む。例えば、配列内の1つ以上のアミノ酸残基は、同様の極性の別のアミノ酸によって置換することができ、それはサイレントか保存的な変更であり、機能的に等価物として機能する。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されうる。例えば、非極性の(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む。陽性荷電の(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。陰性荷電の(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸とグルタミン酸を含む。潜在的なグリコシレーションアミノ酸はセリン、スレオニン及びアスパラギンを含む。さらに、本発明の範囲内に含まれるのは、タンパク質あるいは断片あるいは同一若しくは同様の生物活性を呈するその誘導体、及び翻訳中若しくは後に、例えばグリコシレーション、蛋白質分解による分割、抗体分子あるいは他の細胞の配位子等へのリンケージなどの差別的に修飾される誘導体である。
ベクターへのDNA断片の挿入のために、当業者に既知の方法のうちのいずれかが、適切な転写/翻訳調節シグナル及びタンパク質コード化配列を使用して、本発明のポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために使用されうる。これらの方法は、生体外の組換DNA及び合成技術、及び生体内の組換え(遺伝的組換)を含みうる。本発明の当該ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、第二の核酸配列によって調整されえ、その結果、該ポリペプチドは、組換えDNA分子で形質転換された宿主で発現される。例えば、ここに記述された該ポリペプチドの発現は、当技術分野で既知の任意のプロモーター/エンハンサーによってコントロールされうる。該ポリペプチドの発現をコントロールするために使用されうるプロモーターは、制限されることなく以下を含む；Squintoら(1991, Cell 65: 1-20)に記述の末端反復配列;SV40アーリープロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、CMVプロモーター、M-MuLV5'末端反復、ラウス肉腫ウィルスの3'ロング末端反復に含まれていたプロモーター(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); β-lactamaseプロモータのような原核生物の発現ベクター(Villa- Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)、あるいはtacプロモータ(DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)、Scientific American, 1980, 242:74-94の「組み換えバクテリアからの有用なタンパク質」も参照;酵母あるいは他の菌類由来のプロモーター要素、例示するとギャル4プロモーター、ADH(アルコール脱水素酵素)プロモーター、PGK(phosphoglycerolキナーゼ)プロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、及び次のような動物転写調節領域であって、それらは組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用された: 膵臓の胞状細胞において活性をもつエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 膵臓のβ細胞において活性を持つインシュリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122)、リンパ球様細胞において活性をもつ免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、睾丸、胸、リンパ、肥満細胞において活性を持つマウス乳腺腫瘍ウィルス制御領域 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495)、センダイウィルス、レンチウイルス、肝臓において活性をもつアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓において活性をもつアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 肝臓において活性をもつアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1 :161-171)、ミエロイド細胞において活性をもつβ‐グロビン遺伝子制御領域(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 脳の乏突起膠細胞細胞において活性をもつミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 骨格筋において活性をもつミオシンL鎖-2遺伝子制御領域(Shani, 1985, Nature 314:283-286),及び (メーソンら、1986年、サイエンス234:1372-1378) 視床下部において活性をもつ生殖腺刺激性放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)。
したがって、本発明によって、ここに記述されたポリペプチドをコードする核酸を含む、バクテリアか真核生物の宿主で複製することができる発現ベクターは、宿主を形質転換するために使用され、そして、それにより、生物学的活性型で回収されうるポリペプチドを生産するためにこのような核酸の発現を支配する。本発明での文言において、生物学的活性型とは、関連するリセプターに結合し、そして識別機能を起こし、及び/又は該リセプターを発現する細胞の発現型に影響を及ぼしうる型を含む。
核酸挿入物を含んでいる発現ベクターは、制限することなく、少なくとも3つの一般的なアプローチで同定することができる:(a) DNA‐DNAハイブリダイゼーション、 (b)「マーカー」遺伝子機能の存在若しくは不存在、ならびに(c)挿入された配列の発現。 最初のアプローチでは、発現ベクターに挿入された異種核酸の存在は、挿入された核酸配列に相同である配列を含むプローブを使用して、DNA‐DNAハイブリダイゼーションによって検出することができる。第2のアプローチでは、組み換えベクター/宿主システムは、ベクター中の異種核酸配列の挿入によって引き起こされた、ある「マーカー」遺伝子機能(例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換発現型、バキュロウィルスでの顆粒体形成等)の存在若しくは不存在に基づいて、同定し選択することができる。例えば、efl核酸配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、挿入物を含んでいる組み換え体は、マーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。3番目のアプローチでは、組み換え発現ベクターは、組み換え構成物によって発現された異種核酸生成物の分析により同定することができる。そのような分析は、例えば、検知できる抗体若しくはその部分でタグ化できるレセプター若しくはその部分へのリガンドの結合のような、又は対象のタンパク質若しくはその部分に対して生産された抗体への結合のような、対象の核酸生成物の物理的か機能的特性に、例えば、基づくことができる。
該ポリペプチドは、特に本発明において修飾されものは、宿主細胞で、一時的に、恒常的にあるいは永久に発現されうる。
本発明で示された疾病又は病気を処置するのに有効な投与量は、当業者に公知の方法によって決定されうる(例えば、Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Oilman, eds. Macmillan Publishing Co, New York, pp. 1-46 (1975))。本発明による使用のための医薬組成物は、上記記述のポリペプチドを薬学的に許容される液体、固体、あるいは半固形担体に含み、それは担体若しくは標的分子（例えば、抗体、ホルモン、成長因子など)に結合され及び/又はリポソーム、マイクロカプセル及び生体への投与まえに徐放性製剤に組み入れらる。例えば、医薬組成物は、ポリペプチドを、滅菌水、食塩水、燐酸緩衝液、あるいはデキストロース溶液のような水溶液中に含みうる。あるいは、活性ある作用薬が、患者へそのような処置を必要に応じ注入される固体(例えば、ワックス)若しくは半固形(例えば、ゼラチン状)剤型中に含まれうる。投与経路は、当該技術分野で既知の投与の任意の態様でありえ、限定されずに、静脈内、鞘内、皮下、子宮内、関与する組織への注射、動脈内、鼻腔内、経口、あるいは注入装置によるを含む。
投与は、全身又は局所的なエリアに、本発明の活性作用物質の分布をもたらす。例えば、ある状態において、それらは神経系の離れた領域を含み、作用薬の静脈内か脊髄内投与は望ましい。ある状況で、活性作用薬を含むインプラントは、傷害のあるエリアあるいはそのエリアの近くに置かれうる。適切なインプラントは、制限されないが、ゲルフォーム、ワックス、スプレー、あるいはマイクロベースインプラントを含む。
本発明は、さらに、薬理学的に許容される賦形剤において、ここに記述された該ポリペプチドを含む医薬組成物を調製可能である。その組成は、全身的にあるいはローカルに投与されうる。当該技術分野で既知の投与のどんな適切な態様も使用されえ、制限されることなく、静脈内、鞘内、動脈内、鼻腔内、経口、皮下、腹腔内、あるいはローカルの注入若しくは手術移植によるものを含む。徐放性処方もまた適用されうる。
遺伝子療法
遺伝子療法は、発現する若しくは発現しうる核酸の対象患者への投与によって行なわれる療法を指す。本発明のこの実施態様において、核酸は、治療効果を媒介するそれらのコード化されたタンパク質を生産する。
当該技術分野において利用可能な遺伝子療法のための方法のいずれも、本発明によって使用することができる。典型的な方法が下記に述べられる。
遺伝子療法一般評論については、Goldspielらを参照、Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5): 155-215 (1993)。 使用することができる組換DNA技術の技術分野で一般に知られる方法は、Ausubelら(編集者) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)を参照。
患者への核酸のデリバリーは、直接若しくは間接的でありえ、直接の場合には、患者は、核酸若しくは核酸担持ベクターに接触させ、間接の場合には、細胞が核酸で最初に生体外で形質転換され、次に、患者へ移植される。これらの2つのアプローチは、生体内若しくは生体外の遺伝子療法として、それぞれ知られている。
特定の実施態様では、該核酸配列は、直接生体内に投与され、それがコード化された生成物を生産するように発現される。これは、当該技術分野で知られる多数の方法のうちのどれによっても遂行することができ、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれらを構築しそしてそれを投与することによって細胞内となる； 例えば、不完全あるいは減じられたレトロウイルスあるいは他のウイルスベクターを使い感染による若しくは裸のDNAの直接注入による、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクテイング作用薬でのコーティング、リポソーム、マイクロ粒子若しくはマイクロカプセルへの封入、又は核酸に入ることが知られるペプチドへのリンケージでそれらを投与することによって、又は受容体仲介エンドサイトーシスへのリガンド体へのリンケージでそれを投与することによって (参照、例えば、 Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987))(それは、特にリセプターを発現する標的細胞タイプに使用することができる)、等。別の実施態様では、核酸―リガンド複合体が形成され、そこで、核酸がリソソームの低下を回避することを可能にする、リガンドが核内体を分裂させる融合性ウイルスペプチド(核酸)を含む。また別の実施態様では、核酸は、特定のリセプターを標的にすることによって、細胞特異的取得及び発現のために、生体内で、標的化処理可能である。あるいは、核酸は、細胞内部に導入し、相同組換えによって、発現用の宿主細胞DNAの内に組込むことができる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
特別な実施態様では、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。遺伝子療法で使用される該ポリペプチドをコードする核酸配列は、1つ以上のベクターへクローンされ、それは患者への遺伝子のデリバリーを促進する。レトロウイルスベクターのようなレンチウイルスベクター、及びアデノウイルスベクター及びアデノ関連ウィルスのような他のベクターは、使用されうるウイルスベクターの例である。レトロウイルスベクターは、ウィルスゲノムの正確なパッケージング及び宿主細胞DNAへの組み込みに必要なコンポーネントを含む。
アデノウィルスは、穏やかな疾病を引き起こす気道上皮を自然に感染するので、気道上皮に遺伝子をデリバリーする特に魅力的な手段である。アデノウイルスに基づいたデリバリーシステムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞及び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染させることができるという長所を持つ。さらに、アデノ関連ウィルス(AAV)も、遺伝子療法での使用を提案されてきた。
遺伝子療法の別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェククチン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションあるいはウィルス感染のような方法によって、組織培養において、細胞へ遺伝子を移送することを含む。通常、移送の方法は、細胞への選択可能なマーカーの移送を含む。その後、取得された移送された遺伝子を発現している細胞を分離するために、細胞は選択処理される。その後、それらの細胞は患者にデリバーされる。
この実施態様では、核酸は結果として生じる組み換え細胞の生体内への投与に先立って細胞へ導入される。そのような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ミクロ注入、核酸配列を含むウィルスのベクター若しくはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、マイクロ細胞媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含み、これらに限定されずに、当該技術分野で既知の任意の方法によって行なうことができる。もし受容細胞の必要な発育的な及び生理的機能が破壊しなければ、多数の技術は、細胞の中への外来遺伝子の導入用の技術が知られており、本発明において使用されうる。該技術は、細胞への核酸の安定した移送に提供でき、その結果、核酸は細胞によって発現でき、好適には相続可能で、その細胞後代によって発現できる。
核酸が遺伝子療法の目的のために導入することができる細胞は、いかなる所望の利用可能な細胞型も包含し、そして、限定されず、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞;Tリンパ球、B -リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞; 様々な幹若しくは始原細胞、特に造血性幹若しくは始原細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる。
好ましい実施態様では、遺伝子療法に使用される細胞は、患者自己由来である。
組み換え細胞が、遺伝子療法で使用される実施態様では、ポリペプチドをコードする核酸配列は、細胞へそれらがその細胞によって又はそれらの後代によって発現できるように導入され、また、組み換え細胞は治療効果のためについで生体内に投与される。特定の実施態様では、幹若しくは始原細胞が使用される。分離されそして生体外で維持することができるどんな幹及び/又は始原細胞も、潜在的に、本発明のこの実施態様に従って使用することができる。
特定の実施態様では、遺伝子療法の目的のために導入される核酸は、コードイング領域に操作可能にリンクされた誘導可能なプロモータを含み、その結果、核酸の発現は、転写の適切なインデュサーの存在若しくは不存在をコントロールすることにより制御可能である。
治療組成物
治療用化合物の製剤化は、当該技術分野で一般に知られており、レミングトンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA）。例えば、1日当たりの体重Ｋｇあたり、約0.05ナノグラムから約20mgまでが、投与されうる。投与量は、最適の治療効果を提供するために調整されうる。例えば、ある分割された投与量が日単位で投与されうる。あるいは、治療状況の危急性よって症状におうじて、比例して減少されうる。活性成分は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、眼内、皮内あるいは坐薬ルートあるいはインプランティング(例えば、腹腔内経路によって若しくは細胞、例えば、生体外で感受性化された及び受容体に適合するように変異された単球若しくは樹状突起細胞、による徐放性分子をつかう)のような慣例的な方法で投与される。投与経路によって、該ペプチドは、酵素、酸及び当該活性物質を不活化する他の自然な条件のアクションからそれを防御する材料でコートすることが出来る。
例えば、ペプチドの低い親油性は、酸加水分解により胃で、及びペプチド結合を切断することができる酵素による胃腸管でそれらが破壊されることを可能にする。非経口投与以外の方法によってペプチドを投与するために、その不活性化を予防する材料、によってコートされる 又は と共に投与されうる。例えば、ペプチドは、アジュバントとともに、酵素阻害剤との共投与で、あるいはリポソームに封入されて投与されうる。ここに考慮されたアジュバントは、レゾルシノール、ポリオキシエチレン・オレイル・エーテル及びn-ヘキサデシル・ポリエチレン・エーテルのような非イオン性の界面活性剤を含む。酵素阻害剤は、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスファート(DEP)及びトラジロールを含む。リポソームは従来のリポソームと同様にウォータインオイルインウォーター（水中油中水）CGF乳剤も含む。
活性成分も、非経口的にあるいは腹腔内に投与されうる。分散もグリセロール液ポリエチレングリコール及びその合剤、及び油剤中で調製することができる。貯蔵と使用の通常の条件の下では、これらの調製は、微生物の増殖を予防するために防腐剤を含む。
注射可能な使用に適している剤形は、無菌水溶液（可溶性の場合）若しくは分散剤と、無菌注射溶液若しくは分散剤の用時製剤化用の滅菌粉末を含む。すべての場合に、剤型は無菌であれねばならないし、容易な注射投与が可能な程度の流動性があらねばならない。それは製造と貯蔵の条件の下で安定であらねばならないし、バクテリアと菌類のような微生物の汚染アクションに対して保護されねばならない。キャリアーは、例えば、次のものを含む溶媒若しくは分散媒体でありうる；常水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど)、その適切なそれらの混合物及び植物油。適切な流動性は、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散の場合の必要とされた粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物のアクションの予防は、様々抗菌性・抗真菌物質(例えばクロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等)によってもたらされうる。多くの場合、等張剤(例えば砂糖、塩化ナトリウム)を含むことは好適である。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収遅延剤(例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン)の組成物での使用によってもたらされうる。
無菌注射用水溶液は、上記列挙される種々の組成成分と共に適当な溶媒中に必要量の有効成分を組み込むことにより、必要であれば除菌ろ過され、調製される。一般に、分散は、上に列挙されたものから選ばれる必要な組成成分と基礎的な分散媒を含んでいる無菌の賦形剤中に様々な無菌の有効成分を組み入れることにより調製される。無菌注射用水溶液の調製のための無菌粉末の場合には、好ましい調製法は、有効成分と何らかの付加的所望成分の事前調製された滅菌ろ過溶液からの粉末を調製する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
上述されるように、該ペプチドが適切に保護される場合、活性成分は、経口で、例えば、不活性の希釈剤若しくは同化可能な食用のキャリアーと共に投与される、あるいは、それは固い若しくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されて、あるいは、それは圧縮されてタブレットに詰め込まれて、あるいは、それは、治療食の食品に直接組み入れられて、投与される。経口治療投与については、活性成分は、添加剤に組み入れられ、消化できる錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁、シロップ剤、ウエハーなどの剤型で使用されうる。そのような組成及び製剤は、活性成分の重量によって少なくとも1%を含んでいるべきである。該組成と製剤のパーセンテージは、無論、変化しうるし、ユニット重量の約5〜約80%の間に便宜的にありうる。そのような治療上有用な組成物中の活性成分の量は、適切な投与量が確保できる状態に調整される。経口投与量単位剤型が、約0.1μgと2000 mgの間に活性成分を含んでいるように、本発明による、好適な組成物若しくは製剤は調製されうる。
タブレット、ピル、カプセル剤などはさらに次のようなものを含みうる: トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンあるいはゼラチンのようなバインダー; リン酸カルシウムのような添加剤; トウモロコシデンプン、じゃが芋澱粉、アルギン酸などのような崩壊剤; ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤; 及び、シュークロース、ラクトースあるいはサッカリンのような甘味料、あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、あるいはチェリー風味剤のような香料が加えられうる。 投与量単位剤型が、カプセルである場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、液状キャリアを含みうる。様々な他の材料はコーティング剤として存在しうる、あるいはそうでなければ投与量ユニットの物理的な剤型を調整するために存在しうる。例えば、タブレット、ピル、あるいはカプセル剤は、セラック、砂糖、あるいは両方でコートされうる。シロップ若しくはエリキシルは、活性成分、甘味料としてシュークロース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、及び、チェリー若しくはオレンジ風味の風味剤をも含みうる。もちろん、どんな投与量単位剤型を準備するのに使用されるどんな材料も、使用された量において、薬学的に純粋で、本質的に無毒であるべきである。さらに、活性成分は、徐放性製剤及び剤型に組み入れられうる。
デリバリーシステム
様々なデリバリーシステムは知られており、また本発明の化合物を投与するために使用することができる、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組み換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス、レトロウイルス若しくは他のベクターなどの一部としての核酸の構築物中への封入。導入の方法は、制限されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、眼内、硬膜外及び経口経路等を含む。化合物又は組成物は、任意の便宜なルートで投与されえ、例えば、注入又は大量注射によって、上皮あるいは粘膜皮膚の裏(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など)による吸収によって投与されうるし、他の生理活性物質と共に投与されうる。投与は、全身性でありえるし、あるいは局所的でありえる。さらに、本発明の薬剤化合物若しくは組成物を、何らかの適当なルートで中枢神経系へ導入することは好適である；それは脳室内及び髄腔内注射を含む。脳室内注射は、脳室内のカテーテル、例えば、オヤマレザバーのようなレザーバーに取り付けられる、によって促進されうる。経肺投与も使用することができる、例えば、吸入器か噴霧器の使用及びアエロゾル化剤との製剤化による。
特定の実施態様では、投与を必要とするエリアへ、本発明の製薬化合物あるいは組成物を、局所的に投与することは好適でありえる; 例えば、制限されないが、手術中の局所注入、局所適用、例えば、手術後の傷包帯と共に、注射によって、カテーテルによって、坐薬によって、あるいは移植によって達成しえる。この移植は、多孔性、非多孔性、ゼラチン状材料でありえ、シリコン膜のような膜、あるいはファイバーであり得る。 好適には、本発明の抗体あるいはペプチドを含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を使用することに注意しなければならない。別の実施態様では、化合物若しくは組成物は、小胞、特にリポソーム中でデリバーされることができる。また別の実施態様では、化合物若しくは組成物は、制御放出システムでデリバーされることができる。1つの実施態様では、ポンプは使用されてもよい。別の実施態様では、高分子材料は使用することができる。また別の実施態様では、制御放出システムは、治療標的の近傍に置き、それにより、全身性投与量のほんの一画分だけの投与必要量とすることができる。
フリーテキスト配列リスト
"a、g、c、t"以外のヌクレオチドシンボルの使用については、それらは、WIPO標準ＳＴ25、付録2、表1(に設定された約束にしたがい、そこでは、kはt又はgを表わし; nはa、c、t、あるいはgを表わし; mはa若しくはcを表し; rはa若しくはgを表し; sはc又はgを表わすし; wはa若しくはt、及びyはc又はtを表わす。
配列番号１(全長ＭＵＣＩ受容体：ムシン １前駆体)
MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS
TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD
TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL (SEQ ID NO: l) describes full-length MUCl Receptor (Mucin 1 precursor, Genbank Accession number: P15941).
配列番号２ MTPGTQSPFFLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2)
配列番号３ MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA (SEQ ID NO:3)
配列番号４ MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG (SEQ ID NO:4)
配列番号２，３及び４は、N-terminal MUC-1 signaling sequenceであり、それはMUCl receptorとトランケートされたアイソフォームを指向する。3個までのアミノ酸残基が、配列番号2，3及び４におけるバリアントによって示されるようにＣ-末端において欠失する。
配列番号５
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGW GIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHG RYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL (SEQ ID NO:5)
そのＮ-末端でnat-PSMGFR をもつトランケートされたＭＵＣＩ受容体アイソフォームで全長ＭＵＣＩ受容体の膜貫通型及び細胞質側配列を含む。
配列番号６
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO: 6)
MUCl Growth Factor Receptor のネイテイブ1次配列の細胞外ドメイン (nat-PSMGFR - "PSMGFR"の例):
配列番号７
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO:7)
MUCl Growth Factor Receptor のネイテイブ一次配列の細胞外ドメイン (nat-PSMGFR - "PSMGFR"の例)であって、配列番号６のＮ-末端において単一アミノ酸が欠失
配列番号８
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO: 8)
促進された安定性もつMUCl Growth Factor Receptorのネイテイブ一次配列の"SPY" functional variantの細胞外ドメイン (var-PSMGFR - "PSMGFR"の例)
配列番号９
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO: 9)
促進された安定性もつMUCl Growth Factor Receptorのネイテイブ一次配列の"SPY" functional variantの細胞外ドメイン (var-PSMGFR - "PSMGFR"の例)であって、配列番号８のＣ-末端において単一のアミノ酸欠失。
配列番号１０
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagta ccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggc agcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg (SEQ ID NO: 10)
MUCl cytoplasmic domain nucleotide sequence.
配列番号１１
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVS AGNGGSSLSYTNPAVAAASANL (SEQ ID NO: l l)
MUCl cytoplasmic domain amino acid sequence.
配列番号１２
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgac gttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgata acctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctc gccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataa acaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagacc ctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactg ctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcag cgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaa atttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagag caatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa (SEQ ID NO: 12)
NME7 nucleotide sequence (NME7: GENBANK ACCESSION AB209049).
配列番号１３
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRT
FLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAI
SKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEIL
RDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELF
FPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMY
RK (SEQ ID NO: 13)
NME7 amino acid sequence (NME7: GENBANK ACCESSION AB209049).
配列番号１４
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggc caactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaag gattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgcc ggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctc ggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagt gattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggat ctatgaatga (SEQ ID NO: 14)
NM23-H1 nucleotide sequence (NM23-H1 : GENBANK ACCESSION AF487339).
配列番号１５
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKR FEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGL NVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEEL VDYTSCAQNWIYE (SEQ ID NO: 15)
NM23-H1の amino acid sequence (NM23-Hl : GENBANK ACCESSION AF487339).
配列番号１６
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggc caactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaag gattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgcc ggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctc ggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggt gattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggat ctatgaatga (SEQ ID NO: 16)
NM23-H1 S120G mutant nucleotide sequence (NM23-Hl : GENBANK ACCESSION AF487339).
配列番号１７
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKR FEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGL NVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEEL VDYTSCAQNWIYE (SEQ ID NO: 17)
NM23-H1 S120G mutant amino acid sequence (NM23-H1 : GENBANK ACCESSION AF487339).
配列番号１８
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatc aagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgac ctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtg gtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggtt ggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgacta caagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa (SEQ ID NO: 18)
NM23-H2 nucleotide sequence (NM23-H2: GENBANK ACCESSION AK313448).
配列番号１９
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQH YIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRG DFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE (SEQ ID NO: 19)
NM23-H2 amino acid sequence (NM23-H2: GENBANK ACCESSION AK313448).
E. coli での発現にオプティマイズされたHuman NM23-H7-2 配列:
(DNA)配列番号２０
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggc aacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaa aacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaac tgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatc accacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtg ttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcat cggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgta ttgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcag atgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatg tactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaat cgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaa gacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga (SEQ ID NO:20)
(amino acids)配列番号２１
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTAR
QLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRP
FFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNA
AHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIR
DAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNN
ATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILD
N- (SEQ ID N0:21)
Human NME7-A:
(DNA)配列番号２２
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagct ggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaat gagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacc tgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggc cctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga (SEQ ID NO:22)
(amino acids)配列番号２３
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR NAAHGPDSFASAAREMELFF- (SEQ ID NO:23)
Human NME7-A1 :
(DNA) 配列番号２４
[00266] atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagct ggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaat gagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacc tgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggc cctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga
(SEQ ID NO:24)
(amino acids) 配列番号２５
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR N AAHGPD SFAS A AREMELFFPS S GGC GPANT AKFT- (SEQ ID NO:25)
Human NME7-A2:
(DNA) 配列番号２６
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttatttt acccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaag atttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagta ggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttact ataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgat ccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaact ctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct tttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga (SEQ ID NO:26)
(amino acids) 配列番号２７
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR
TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA
GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD
AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF- (SEQ ID NO:27)
Human NME7-A3:
(DNA) 配列番号２８
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttatttt acccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaag atttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagta ggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttact ataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgat ccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaact ctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct tttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga (SEQ ID NO:28)
(amino acids) 配列番号２９
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR
TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA
GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD
AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSS
GGCGPANTAKFT- (SEQ ID NO:29)
Human NME7-B:
(DNA) 配列番号３０
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgaga tgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccg aatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattt tgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttc actgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga (SEQ ID NO:30)
(amino acids) 配列番号３１
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFY EVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTL RAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF- (SEQ ID NO:31)
Human NME7-B 1 :
(DNA)配列番号３２
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgaga tgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccg aatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattt tgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttc actgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga (SEQ ID NO: 32)
(amino acids)配列番号３３
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFY EVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTL RAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN- (SEQ ID NO: 33)
Human NME7-B2:
(DNA)配列番号３４
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgct gtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgg gttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagc aatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctgga actctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatactt cttctga (SEQ ID NO: 34)
(amino acids)配列番号３５
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAM QMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFC GPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF- (SEQ ID NO: 35)
Human NME7-B3:
(DNA)配列番号３６
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgct gtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgg gttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagc aatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctgga actctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatactt cttcaagatcttggataattagtga (SEQ ID NO: 36)
(amino acids)配列番号３７
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAM QMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFC GPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN- (SEQ ID NO:37)
Human NME7-AB:
(DNA)配列番号３８
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagct ggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaat gagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacc tgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggc cctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaatt gtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctc agctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtga cagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcct gaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccag aggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga (SEQ ID NO:38)
(amino acids) 配列番号３９
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS
RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR
NAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILM
AIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQ
NNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFK
ILDN-- (SEQ ID NO:39)
Human NME7-AB 1 :
(DNA) 配列番号４０
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagct ggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaat gagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacc tgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggc cctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaatt gtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctc agctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtga cagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcct gaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccag aggatggcctattagaggttcaatacttcttctga (SEQ ID NO:40)
(amino acids) 配列番号４１
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS
RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR
NAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILM
AIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQ
NNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF- (SEQ ID N0:41)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-A 配列:
(DNA)配列番号４２
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcg ggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttca atgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgg gcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacat ggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga (SEQ ID NO:42)
(amino acids) 配列番号４３
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS
RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR
NAAHGPDSFASAAREMELFF- (SEQ ID NO:43)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-A1 配列:
(DNA) 配列番号４４
[00316] atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcg ggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttca atgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgg gcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacat ggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatt tacctga (SEQ ID NO:44)
(amino acids) 配列番号４５
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR N A AHGPD SFAS A AREMELFFPS S GGC GPANT AKFT- (SEQ ID NO:45)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-A2 配列:
(DNA)配列番号４６
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgct gttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctg gaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactg ggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgg gtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaa tgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctggg cccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatg gtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga (SEQ ID NO:46)
(amino acids) 配列番号４７
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:47)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-A3 配列:
(DNA)配列番号４８
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgct gttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctg gaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactg ggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgg gtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaa tgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctggg cccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatg gtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaattt acctga (SEQ ID NO:48)
(amino acids) 配列番号４９
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSS GGCGPANTAKFT- (SEQ ID NO:49)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-B 配列:
(DNA) 配列番号５０
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtg atgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggtta ccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgt gaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaa cgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga (SEQ ID NO:50)
(amino acids)配列番号５１
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFY EVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTL RAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF- (SEQ ID NO:51)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-B 1配列:
(DNA)配列番号５２
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtg atgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggtta ccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgt gaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaa cgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga (SEQ ID NO:52)
(amino acids)配列番号５３
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFY EVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTL RAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN- (SEQ ID NO: 53)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-B2配列
(DNA)配列番号５４
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcac gcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggac cgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgc gtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcg tccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaa gttcaatactttttctga (SEQ ID NO: 54)
(amino acids)配列番号５５
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAM QMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFC GPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF- (SEQ ID NO: 55)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-B3 配列:
(DNA) 配列番号５６
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcac gcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggac cgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgc gtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcg tccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaa gttcaatactttttcaaaattctggataattga (SEQ ID NO: 56)
(amino acids) 配列番号５７
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAM QMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFC GPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN- (SEQ ID NO:57)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-AB 配列:
(DNA)配列番号５８
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcg ggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttca atgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgg gcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacat ggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatt taccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggcttt gaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatca cgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtgg tccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcact gtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga (SEQ ID NO:58)
(amino acids)配列番号５９
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS
RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR
NAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILM
AIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQ
NNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFK
ILDN- (SEQ ID NO:59)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME7-AB1 配列:
(DNA)配列番号６０
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagc gggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttc aatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctg ggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcaca tggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaat ttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctt tgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatca cgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtgg tccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcact gtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga (SEQ ID NO: 60)
(amino acids)配列番号６１
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR NAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILM AIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQ
NNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:61)
Mouse NME6
(DNA)配列番号６２
atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccaccca ctgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggact gccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatc cttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaat tcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttctt ccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtat ccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag (SEQ ID NO: 62)
(amino acids)配列番号６３
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWK
LEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARY
IAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHY
SPEEGIHCAAETGGHKQPNKT- (SEQ ID NO: 63)
Human NME6:
(DNA)配列番号６４
atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgat caagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagag aactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggcc agcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccga gcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttc agccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccct gtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga (SEQ ID NO:64)
(amino acids)配列番号６５
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIV
RMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMG
PTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEE
PQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA- (SEQ ID NO: 65)
Human NME6 1 :
(DNA)配列番号６６
atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgat caagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagag aactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggcc agcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccga gcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttc agccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccct gtgtga (SEQ ID NO: 66)
(amino acids)配列番号６７
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIV
RMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMG
PTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEE
PQLRCGPV- (SEQ ID NO: 67)
Human NME6 2:
(DNA)配列番号６８
atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaa gcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgtttt ttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggagga cgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaa caccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgagg aggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga (SEQ ID NO: 68)
(amino acids) 配列番号６９
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYRE HEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSF GLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV- (SEQ ID NO:69)
Human NME6 3:
(DNA)配列番号７０
atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaa gcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgtttt ttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggagga cgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaa caccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgagg aggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctagga ccagcctga (SEQ ID NO:70)
(amino acids) 配列番号７１
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYRE HEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSF GLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHY VAGTGGLGPA- (SEQ ID NO:71)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME6 配列:
(DNA)配列番号７２
atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgat caaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcg aactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctct ggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgt catgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtc ccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgtt attctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga (SEQ ID NO:72)
(amino acids) 配列番号７３
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIV
RMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMG
PTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEE
PQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA- (SEQ ID NO:73)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME6 1 配列:
(DNA)配列番号７４
atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgat caaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcg aactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctct ggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgt catgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtc ccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga
(SEQ ID NO:74)
(amino acids) 配列番号７５
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIV RMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMG PTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEE PQLRCGPV- (SEQ ID NO:75)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME6 2 配列:
(DNA) 配列番号７６
atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctg agcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttct tttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctg atgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccac gcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaag aaccgcaactgcgctgtggcccggtctga (SEQ ID NO:76)
(amino acids) 配列番号７７
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYRE HEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSF GLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV- (SEQ ID NO:77)
E. coli 発現にオプティマイズされたHuman NME6 3 配列:
(DNA) 配列番号７８
atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctg agcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttct tttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctg atgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccac gcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaag aaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatg a (SEQ ID NO:78)
(amino acids) 配列番号７９
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYRE
HEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSF
GLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHY
VAGTGGLGPA- (SEQ ID NO:79)
OriGene-NME7-l full length
(DNA) 配列番号８０
gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcg atcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttaccc aggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagattta tttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtagga aagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataa ccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatcca gtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctg gagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattctttt gcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttg cattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcag atgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgta ttctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgccc ggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcct attagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcag caaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa (SEQ ID NO: 80)
(amino acids) 配列番号８１
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR
TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA
GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD
AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSS
GGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNV
EEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLR
PGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTRTRRLEQKLISEEDLAAN
DILDYKDDDDKV (SEQ ID NO:81)
Abnova NME7-1 Full length
(amino acids)配列番号８２
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR
TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA
GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD
AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSS
GGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNV
EEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLR
PGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN (SEQ ID NO:82)
Abnova Partial NME7-B
(amino acids) 配列番号８３
DRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREF CGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKIL (SEQ ID NO:83)
Histidine Tag 配列番号８４
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga (SEQ ID NO: 84)
Strept II Tag 配列番号８５
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga (SEQ ID NO:85)
N-10 peptide: 配列番号８６
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO:86)
C- 10 peptide
配列番号８７ GTINVHD VETQFNQYKTE AASRYNLTISD VS VSD V (SEQ ID NO : 87)
配列番号８８ LALIKPDA (SEQ ID NO: 88)
配列番号８９ MMMLSRKEALDFHVDHQS (SEQ ID NO: 89)
配列番号９０ ALDFHVDHQS (SEQ ID NO: 90)
配列番号９１ EILRDD AICEWKRL (SEQ ID NO : 91 )
配列番号９２ FNELIQFITTGP (SEQ ID NO : 92)
配列番号９３ RDDAICEW (SEQ ID NO:93)
配列番号９４ SGVARTDASESIRALFGTDGIRNAA (SEQ ID NO: 94)
配列番号９５ ELFFPSSGG (SEQ ID NO:95)
配列番号９６ KFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMA (SEQ ID NO:96)
配列番号９７ LMAIRDAGFEIS AMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVT (SEQ ID NO : 97)
配列番号９８ EFYEVYKGVVTEYHD (SEQ ID NO:98)
配列番号９９ EIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNA (SEQ ID NO:99)
配列番号１００ YSGPCVAM (SEQ ID NO: 100)
配列番号１０１ FREFCGP (SEQ ID NO: 101)
配列番号１０２ VHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN (SEQ ID NO : 102)
配列番号１０３ IQNA VHCTD (SEQ ID NO : 103)
配列番号１０４ TDLPEDGLLEVQYFFKILDN (SEQ ID NO : 104)
配列番号１０５ PEDGLLEVQYFFK (SEQ ID NO: 105)
配列番号１０６ EIINKAGFTITK (SEQ ID NO: 106)
配列番号１０７ MLSRKEALDFHVDHQS (SEQ ID NO: 107)
配列番号１０８ NELIQFITT (SEQ ID NO : 108)
配列番号１０９ EILRDD AICEWKRL (SEQ ID NO : 109)
配列番号１１０ SGVARTDASESIRALFGTDGI (SEQ ID NO: 110)
配列番号１１１ SGVARTDASES (SEQ ID NO: 111)
配列番号１１２ ALFGTDGI (SEQ ID NO: 112)
配列番号１１３ NCTCCIVKPHAVSE (SEQ ID NO: 113)
配列番号１１４ LGKILMAIRDA (SEQ ID NO: 114)
配列番号１１５ EISAMQMFNMDRVNVE (SEQ ID NO: 115)
配列番号１１６ EVYKGVVT (SEQ ID NO : 116)
配列番号１１７ EYHDMVTE (SEQ ID NO : 117)
配列番号１１８ EFCGPADPEIARHLR (SEQ ID NO : 118)
配列番号１１９ AIFGKTKIQNA V (SEQ ID NO : 119)
配列番号１２０ LPEDGLLEVQYFFKILDN (SEQ ID NO : 120)
配列番号１２１ GPDSFAS AAREMELFFP (SEQ ID NO : 121 )
ヒトＮＭＥ７由来免疫化用ペプチド
配列番号１２２ ICEWKRL (SEQ ID NO : 122)
配列番号１２３ LGKILMAIRDA (SEQ ID NO: 123)
配列番号１２４ HA VSEGLLGK (SEQ ID NO : 124)
配列番号１２５ VTEMYSGP (SEQ ID NO: 125)
配列番号１２６ NATKTFREF (SEQ ID NO: 126)
配列番号１２７ AIRD AGFEI (SEQ ID NO : 127)
配列番号１２８ AICEWKRLLGPAN (SEQ ID NO: 128)
配列番号１２９ DHQSRPFF (SEQ ID NO : 129)
配列番号１３０ AICEWKRLLGPAN (SEQ ID NO: 130)
配列番号１３１ VDHQSRPF (SEQ ID NO: 131)
配列番号１３２ PDSFAS (SEQ ID NO: 132)
配列番号１３３KAGEIIEIINKAGFTITK (SEQ ID NO: 133)
ヒトＮＭＥ１由来免疫化用ペプチド
配列番号１３４ M ANCERTFIAIKPDG VQRGLVGEIIKRFE (SEQ ID NO : 134)
配列番号１３５ VDLKDRPF (SEQ ID NO : 135)
配列番号１３６ HGSDS VES AEKEIGLWF (SEQ ID NO : 136)
配列番号１３７ ERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE (SEQ ID NO: 137)
配列番号１３８ VDLKDRPFFAGL VKYMHS GP V VAM VWEGLN (SEQ ID NO: 138)
配列番号１３９ NIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELV (SEQ ID NO: 139)
配列番号１４０ KPDGVQRGLVGEII (SEQ ID NO: 140)
ヒトＮＭＥ７由来免疫化用ペプチドであって、ＮＭＥ１には結合しない
配列番号１４１ MLSRKEALDFHVDHQS (SEQ ID NO: 141) peptide Al
配列番号１４２ SGVARTDASES (SEQ ID NO: 142) peptide A2
配列番号１４３ DAGFEISAMQMFNMDRVNVE (SEQ ID NO: 143) peptide B 1
配列番号１４４ EVYKGVVTEYHDMVTE (SEQ ID NO: 144) peptide B2
配列番号１４５ AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF (SEQ ID NO: 145) peptide B3
Human NME7 a
(DNA) 配列番号１４６
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttatttt acccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaag atttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagta ggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttact ataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgat ccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaact ctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct tttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgtt gcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgca gatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgt attctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcc cggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggc ctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag (SEQ ID NO: 146)
(amino acids) 配列番号１４７
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR
TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA
GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD
AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSS
GGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNV
EEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLR
PGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN (SEQ ID NO: 147)
Human NME7 b
(DNA) 配列番号１４８
atgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggc aacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaa acgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactc aaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattaca actggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggca cgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcg gccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaa ccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaata tggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggccct tgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttac gccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagagg ttcaatacttcttcaagatcttggataattag (SEQ ID NO: 148)
(amino acids) 配列番号１４９
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTAR
QLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRP
FFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNA
AHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIR
DAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNN
ATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILD
N (SEQ ID NO: 149)
Human NME7-AB
(DNA) 配列番号１５０
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagct ggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaat gagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacc tgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggc cctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaatt gtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctc agctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtga cagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcct gaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccag aggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag (SEQ ID NO: 150)
(amino acids) 配列番号１５１
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS
RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR
NAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILM
AIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQ
NNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFK
ILDN (SEQ ID NO: 151)
Human NME7-X1
(DNA) 配列番号１５２
atgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccag tttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctgg agtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgc ttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcat tgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagat gttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtatt ctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccg gcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggccta ttagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag (SEQ ID NO: 152)
(amino acids) 配列番号１５３
MMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRL
LGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANT
AKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYK
GVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFG
KTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN* (SEQ ID NO: 153)
Human NME7 a (optimized for E coli expression) E. coli 発現にオプティマイズされたヒトＮＭＥ７a
(DNA)配列番号１５４
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgct gttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctg gaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactg ggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgg gtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaa tgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctggg cccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatg gtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaattt accaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggcttt gaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatca cgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtgg tccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcact gtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat (SEQ ID NO: 154)
(amino acids) 配列番号１５５
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR
TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKA
GEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDD
AICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSS
GGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNV
EEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLR PGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTG (SEQ ID NO: 155)
Human NME7 b (optimized for E coli expression) E. coli 発現にオプティマイズされたヒトＮＭＥ７ｂ
(DNA) 配列番号１５６
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggc aacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaa aacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaac tgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatc accacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtg ttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcat cggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgta ttgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcag atgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatg tactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaat cgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaa gacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat (SEQ ID NO: 156)
(amino acids) 配列番号１５７
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTAR
QLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRP
FFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNA
AHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIR
DAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNN
ATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILD
NTG (SEQ ID NO: 157)
Human NME7-AB (optimized for E coli expression) E. coli 発現にオプティマイズされたヒトＮＭＥ７−ＡＢ
(DNA)配列番号１５８
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcg ggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttca atgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgg gcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacat ggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatt taccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggcttt gaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatca cgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtgg tccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcact gtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat (SEQ ID NO: 158)
(amino acids) 配列番号１５９
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQS
RPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIR
NAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILM
AIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQ
NNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFK
ILDNTG (SEQ ID NO: 159)
Human NME7-X1 (optimized for E coli expression) E. coli 発現にオプティマイズされたヒトＮＭＥ７−Ｘ１
(DNA) 配列番号１６０
atgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaa ttcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactc aggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcatt cgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgt gctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggcca tgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacgg aaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccg gaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgcc ggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat (SEQ ID NO: 160)
(amino acids）配列番号１６１
MMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRL
LGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANT
AKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYK
GVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFG
KTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTG (SEQ ID NO: 161)
DM10 domain of NME7 ＮＭＥ７のＤＭ10ドメイン
(amino acids) 配列番号１６２
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKR TKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRK (SEQ ID NO: 162)
実施例1 - 最小無血清ベースのコンポーネント(「MM」)(500mls)
400ml DME/F 12/ＧｌｕｔａＭ AX I(Invitrogen# 10565-018)、100ml ノックアウト血清代替物(KO-SR、Invitrogen# 10828-028)、5ml lOOx MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen# 11140-050)、0.9ml(0． ImM) β - メルカプトエタノール(55mMストック、Invitrogen# 21985-023)
実施例2 - NMEl、NME6及びNME7の存在についての癌及び幹細胞のプロービング
実験のこのシリーズでは、本発明者らは、幹細胞と癌細胞中のNME6及びNME7の発現をプローブした。さらに、本発明者らはMUC1*をNME7の標的であると確認した。NMEl、NME6及びNME7の存在・不存在を決定するために、本発明者らは、細胞溶解物で、最初にウェスタンブロット分析を行なった。図1Aで、抗MUCl*抗体でコートされた表面上においてＮＭＥ１二量体中で培養された（レーン１）又はＭＥＦｓ上においてｂＦＧＦ中で（レーン２）若しくはＴ４７Ｄヒト乳癌細胞溶解物で(レーン3)若しくは陽性コントロールとしてのＮＭＥ１−ｗｔで培養された、BGOlvヒト胚性幹細胞からの溶解産物が、SDS-PAGEによって分離され、その後、抗NMEl特異抗体でプローブされた。結果は、NMEl二量体あるいはbFGF中で培養されたかどうかで、ヒトES細胞及びT47D癌細胞で、NMElが強く発現されることを示す。同じ細胞溶解物は、SDS-PAGEによって分離され、次に、抗NME6特異抗体(Abnovaからの抗NME6)でプローブされた。NME6は検出されなかった(データは示されない)が、それは、その後、もっと濃縮されたサンプルで検出された(図2参照)。
図IBでは、同細胞溶解物はSDS-PAGEによって分離され、次に、抗NME7特異抗体(Santa Cruz Biotechnology社からのnm23-H7 B9)でプローブされる。結果は、NME7は、抗MUCl*抗体表面でNMEl二量体中で培養されたヒトES細胞において強く発現し(レーン1)、MEFでbFGFにおいて培養された同ES細胞において弱く発現し(レーン2)、乳癌細胞において強く発現する(レーン3)ことを示した。NMElが添加されたレーン4は、NME7抗体がNME1と交差反応しないことを示すブランクである。NME7は、NMEl二量体（これは、本発明者が示した、ｂFGFで培養された細胞よりよりナイーブ状態にそれがあることを示す表現マーカーである）中で培養された幹細胞中にかなりの程度に発現されるという事実は、NME7は、プライム化細胞での発現に比べ、ナイーブ細胞でより高いレベルに発現されることを意味する。
NME7が、その標的リセプターとしてMUC1*と共に成長因子としても機能するかどうか判断するために、本発明者らはプルダウン分析を行なった。これらの実験で、合成MUC1*細胞外ドメインペプチド(His タグ化PSMGFR配列)が、NTA-Niマグネテックベッドに固定化された。これらのベッドは、抗MUCl*抗体で覆われた表面でNMEI二量体中で培養された(レーン1)若しくはMEFs上でbFGF中で培養された(レーン2) ところのBGOlvヒト胚性幹細胞の細胞溶解物、又はT47Dヒト乳癌細胞溶解物(レーン3)でインキュベートされた。リンスされそしてタンパク質を捕獲したベッドは、イミダゾールの添加によってリリースされた。タンパク質は、SDS-PAGEによって分離され、次に、抗NMEl抗体(図1C)あるいはNME7抗体(図ID)のいずれかでプローブされた。結果は、NME7がMUC1*細胞外ドメインペプチドに結合することを示す。これは、幹細胞と癌細胞において、その2つのNDPKドメインのその部分を介してNME7は、MUC 1 *細胞外ドメインを二量化させることによって多分化能パスウェイを活性化することを意味する。
実施例3 - MUC1プルダウン分析は、NME1、NME6及びNME7がMUC1種タンパク質に結合することを示す。
MUC1*細胞質側末端(Ab-5)への抗体を使用するプルダウン分析を、細胞のパネル上で行なった。結果は、図2A-2Fで示される。MUC1抗体によってプルダウンされたタンパク質は、SDS-PAGEによって分離され、ウェスタンブロット法を使用して、NME1、NME6及びNME7に特異的な抗体でプローブされた。MUCl*-陽性乳癌細胞株T47D細胞(ATCC)、ヒト胚性幹細胞株BGOlv(LifeTechnologies)、ヒトES細胞(HES-3、バイオタイム社)、ヒトiPS細胞(SCIOIA-I、System Biosciences社)及びT47D癌細胞を、RPMI-1640(ATCC)プラス10%FBS(VWR)でATCCプロトコルによって成長させた。すべての幹細胞は、8nM NM23-RS(組み換えNME1 S120G二量体)をもつ最小幹細胞培地「MM」において培養された。幹細胞は、12.5μｇ/mL抗MUCl* C3 mabでコートされたプラスチック容器で成長させた。細胞は、氷上で、10分間200μｌ RIPAバッファーで溶解された。遠心分離による細胞デブリスの除去の後、上澄みは共免疫沈降分析に供された。MUC1*は、Ab-5抗体(抗MUC-1 Ab-5、Thermo Scientific)を使用して、プルダウンされた。該抗体はダイナベットプロテインG(Life Technologies)にカップル化され、MUC1細胞質側末端を認識する。ベットは、RIPAバッファーで2度洗われ、還元(reducing)バッファーで再懸濁した。上澄みのサンプルは、還元SDS-PAGE で処理され、ついでPVDF膜へのタンパク質の移送につなげた。図2では、その後、膜は次のものでプローブされた: A) 抗-NM23-Hl(NME1)抗体(C-20、Santa Cruz Biotechnology); B) 抗NME6(Abnova); C) 抗-NM23-H7抗体(B-9、Santa Cruz Biotechnology); D) NME6の染色がSupersignal(Pierce)を使用して増強された;そして、 E) NME7の染色がSupersignalを使用して増強された。
HRPに結合されたそれぞれの二次抗体との培養の後、該タンパク質は化学発光によって検出された。写真は、ネイテイブNME1、NME6及びNME7が、ヒトES細胞及びヒトiPS細胞におけるMUC 1*陽性乳癌細胞に存在すること、及びそれらは、MUC1*に結合することを示す。HES-3ペレットに存在する細胞の数が、他のサンプル中に存在する数より少ないことに留意。
実施例4 - 胚性幹細胞とiPS細胞におけるNME7の検出
結果は、図3に示される。ヒトES細胞(BGOlv及びHES-3)が、NMEベース培地において培養され、そこにおいて、細胞は抗MUCl*抗体の層上に植え付けられた。NME7種を同定するために、細胞は、回収され、プロテアーゼ阻害剤(Pierce)が補われたRIPAバッファー(Pierce)で溶解された。細胞溶解物(20 uL)が、12%SDS-PAGE還元ゲル上で電気泳動によって分離され、PVDF細胞膜(GE helthcare)に移送された。ブロットが、PBS-T含有3%ミルクでブロックされ、次に、4℃で夜通し、一次抗体(anti NM23-H7クローンB-9、Santa Cruz Biotechnology)で培養された。PBS-Tで洗浄後に、膜はホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)結合２次抗体（goat anti mouse, Pierce）と、１時間室温でインキュベートした。シグナルは、Immun-Star化学発光キット(Bio-rad)で検出された。図3 Aは、ヒト幹細胞からの溶解産物が、3つのNME7種: 42kDaの全長及び~33kDa と~30kDaの2つのより低分子量NME7種を含むことを示す。 図3BとCは、分泌されたＮＭＥ７種（Ｂ）と細胞内に保持されたもの（Ｃ）の間の差異を示す。図3Bは、30-33kDa NME7種だけが、細胞から分泌されることを示す。図3Cは、これらの同じ細胞の溶解産物が、全長型と開裂産物でありうるより低分子量種の両方、又は両方の互換的アイソフォームを持つことを示す。パート(B)については、iPS調整培地(20 μｌ)が、12%SDS-PAGE還元ゲル及びPVDF膜(GE Healthcare)に移され、どちらかの上で電気泳動によって分離された。ブロットは、PBS-T含有3%ミルクでブロックされ、次に、4℃で一次抗体(anti NM23-H7クローンB-9、Santa Cruz Biotechnology)で夜通し培養された。PBS-Tで洗浄後に、膜は、室温で1時間、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)-結合二次抗体(goat anti mouse, Pierce)で培養された。シグナルはImmun-Star化学発光キット(Bio-Rad)で検出された。部分(C)については、細胞溶解物が、調整培地の代わりに使用されたという点を除いて、実験は同様に行なわれた。
実施例5 - タンパク質構成物の生成
組み換えNME7の生成のために、最初に、構成物は、効率的に可溶型で発現することができる組み換えNME7を作るために調製された。最初のアプローチは、ネイテイブNME7(a)、あるいはN末端欠失がある代替的スプライスバリアントNME7(b)をコードする構成物を作ることであった。ある場合には、該構成物は、精製を助けるためにヒスチジンタグ若しくはストレプタグを担持する。大腸菌で少量発現する全長NME7、NME7-a及びNME7-bは、大腸菌で全く発現しなかった。しかしながら、DM10配列が削除され、NME7が、33kDaの計算された分子量をもつ、NDPK A及びBドメインを本質的に含んだ、新しい構成物が作られた。
この新規NME7-ABは、大腸菌の中で非常によく発現され、また可溶性タンパク質として存在した。NME7-ABは、NTA-Niカラムでまず精製され、次に、セファデックス200カラムで分子篩クロマトグラフィー(FPLC)によってさらに精製された(図4A)。分画が、集められ、そしてNME7-ABの最も高く最も純粋な発現をもつ分画を同定するために、SDS-PAGEによってテストされた（図4B）。図4Cは、最も純粋であった結合された分画のFPLCトレースを示す。その後、精製されたNME7-ABタンパク質はテストされ、全面的にヒト幹細胞の増殖をサポートすること、及び最もナイーブで、プレ-X不活性化状態にそれらを戻すことを示した。精製されたNME7-ABは、癌細胞の増殖をも、加速することが示された。
実施例6 - NME7-ABが、2つのMUC1*細胞外ドメインペプチドに、同時に結合することを示すELISA分析
結果は図5に示される。C末端システイン(PSMGFR-Cys)を担持するPSMGFRペプチドが、Imject Maleimide活性化BSAキット(Thermo Fisher)を使用して、BSAに共有結合でつながれた。PSMGFR-Cys結合BSAは、0.1M炭酸塩/重炭酸塩バッファーpH 9.6で10μｇ/ｍｌに希釈され、そして50μｌが、96ウェルプレートの各ウェルに添加された。4℃で一夜インキュベーション後、該プレートは、PBS-Tで2度洗浄され、また、3%BSA溶液がウェル上で残りの結合領域をブロックするために添加された。RTでの１時間後、プレートは、PBS-Tで2度洗浄され、また、PBS-T +1%BSAで希釈されたNME7が、異なる濃度で添加された。RTでの１時間後、プレートはPBS-Tで３ｘ洗浄され、また、PBS-T +1%BSAで希釈された抗-NM23-H7(B-9、Santa Cruz Biotechnology)が、1/500希釈で添加された。RTでの１時間後、プレートはPBS-Tで３Ｘ洗浄され、また、PBS-T +1%BSAで希釈されたヤギantiマウスHRPが、1/3333の希釈で添加された。RTでの１時間後、プレートはPBS-Tで３Ｘ洗浄され、また、NME7の結合がABTS溶液(Pierce)を使用して、415nmで測定された。
ELISA MUC1*二量体化: NME7結合のためのプロトコルが使用され、また、NME7は11.6μｇ/mLで使用された。
RTでの１時間後、プレートは、PBS-Tで３Ｘ洗浄され、そしてPBS-T +1%BSAで希釈された、Hisタグ化 PSMGFRペプチド(PSMGFR-His)若しくはビオチン化PSMGFRペプチド(PSMGFR-biotin)が、異なる濃度で添加された。RTでの１時間後、プレートはPBS-Tで３X洗浄され、そして、PBS-T +1%BSAで希釈された抗-Histag-HRP(Abeam)若しくはstreptavidin-HRP(Pierce)が、1/5000の濃度で添加された。RTでの１時間後、プレートは、PBS-Tで３X洗浄され、そして、BSAに結合した別のPSMGFRペプチド（それは、抗-His抗体若しくはstreptavidinによってシグナルすることができなかった）に既に結合するNME7へのPSMGFRペプチドの結合が、ABTS溶液(Pierce)を使用して、415nmで測定された。
実施例7 - ヒト組み換えNME7-ABの機能試験
多分化能を維持し、かつ分化を阻害する能力に関して、組み換えNME7-ABをテストするために、NME7の可溶性バリアント、NME7-AB、が生成され精製された。ヒト幹細胞(iPS cat# SClOla-1、System Biosciences)は、4継代用のマウス繊維芽細胞フィーダー細胞の層上で、4ナノグラム/mlのbFGF中で、製造メーカー指針に基づき成長させた。その後、これらのソース(source)幹細胞は、単クローンの抗MUCl*抗体(MN-C3)の12.5μｇ/ウェルでコートされた６ウェル細胞培養プレート(VitaTM、Thermo Fisher)に植えつけられた。細胞は、ウェル当たり300,000個の細胞の密度で植え付けられた。ベース培地は次から成る最小幹細胞培地であった: 400ml DME/F12/GlutaM AX I(Invitrogen# 10565-018)、100ml ノックアウト血清代替物(KO-SR、Invitrogen# 10828-028)、5ml 100x MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen# 11140-050)及び0.9ml(0.1 mM) β- メルカプトエタノール(55mMストック、Invitrogen# 21985-023)。 ベース培地は任意の培地でありうる。好ましい実施態様では、ベース培地は、他の成長因子及びサイトカインを欠く。ベース培地に、NME7-ABの8nMあるいは安定化二量体として折りたたまれ精製されたNM23-H1の8nMのいずれかが添加された。培地は、48時間ごとに変更され、加速的成長により、植え付け3日後に回収、継代されなければならなかった。幹細胞が、NM23-H1二量体、あるいはNME7モノマー中で育てられた時、比較可能な多能性幹細胞増殖が達成された。
NME7及びNM23-H1(NME1)二量体は、両方、多能性に成長し、そして100%培養密度の時でさえ分化がなかった。写真で見ることができるように、NME7細胞は、NM23-H1二量体中で育てられた細胞より速く成長した。最初の回収での細胞数は、NME7中での培養がNM23-H1二量体中での培養より、１．４倍多くの細胞を生産することを確認した。典型的な多能性のマーカーのICC染色は、NME7-ABが全面的にヒト幹細胞増殖、多分化能、及び分化抵抗性をサポートしたことを確認した。
〜30と〜33kDaのNME7種は、代替的スプライスアイソフォームあるいは開裂のような翻訳後修飾でありえ、それは、細胞からの分泌を可能にする。
実施例8 - よりナイーブな状態への幹細胞を戻す条件下での細胞培養による転移性癌細胞への癌細胞の移行の誘導
癌細胞は通常、RPMIのような血清含有培地で培養される。本発明者らは、幹細胞を、よりナイーブな状態に戻させる薬剤が存在する状態での癌細胞の培養は、癌細胞をより転移性の状態に形質転換することを見出した。
本発明者らは、NME7-AB及びヒトNME1二量体、バクテリアのNME1二量体、NME7-X1及び「2i」阻害剤の各々が、一般的な癌細胞を、癌幹細胞「CSCs」あるいは腫瘍始原細胞「TICs」と呼ばれる、転移性癌細胞に形質転換することができることを実証した。2iは、本発明者が、ヒト幹細胞をよりナイーブな状態に向けさせることを見つけた、2つの生化学的阻害剤に与えられた名前である。2iは、MEK及びGSK3ベータ阻害剤（PD0325901及びCHIR99021）であり、それは約１ｍMと３ｍMの終濃度で、各々、培地に加えられる。
NME7-AB及びNME7-X1は、より低濃度及びより高濃度の、約１ｎM〜１６ｎMの範囲でも十分に作用するが、癌細胞を転移性の細胞へ形質転換させるために、最少培地のバッチを分離するために添加された時には、約４ｎMの終濃度で用いられる。ヒト若しくはバクテリアのNME1二量体は、これらの実験で典型的に使用される16nMと共に、4nM〜32nMの終濃度で使用され、そこではヒトNMEはS120Gミューテーションを担持する。野生型を使用する場合、より低い濃度が必要である。これらの正確な濃度が重要であることは意図されない。NME1タンパク質が二量体であることが重要で、あるミューテーションはより高濃度で二量体として存在することを許容するが、これが起こる濃度の範囲は低いナノモーラー範囲にある。
同様に、NME7タンパク質の濃度は、変異しうる。NME7-AB及びNME7-XIはモノマーであり、また、転移性の細胞へ癌細胞を形質転換するために使用される濃度は、タンパク質がモノマーとして存在することを許容する。様々な分子のマーカーは、転移性癌細胞の指標であるとして提案された。異なる癌タイプは、アップレギュレートされる異なる分子を持ち得る。例えば、受容体CXCR4は、転移性の乳癌でアップレギュレートされ、その一方で、CHD1としても知られるE-カドヘリンは、転移性の前立腺癌でよりアップレギュレートされる。
これらの特定の転移マーカーに加えて、OCT4、SOX2、NANOG及びKLF4のような多分化能の典型的なマーカーは、癌が転移性になるとともに、アップレギュレートされる。スタートの癌細胞及び後の転移性癌細胞が、これらの遺伝子の発現レベルを測定するためにPCRによって分析することができる。
図11は、NME7-AB含有培地において培養されたT47D乳癌細胞のRT-PCR測定のグラフを示す。ロー I キナーゼ(rho I kinase)阻害剤、ROCi、ROCKiあるいはRiは、形質転換細胞がプレートから浮遊するのを防ぐために添加された。多能性幹細胞マーカーと同様に様々な転移性のマーカーの発現レベルが、親細胞及びNME7-AB培養細胞について測定された。結果は、ROCiを受けた細胞と比較して、浮遊性細胞が、より高い量の転移と多分化能マーカーを発現することを示す。本発明者らは、それらの測定が形質転換しなかった細胞としたものの平均であって、ROCiはそれらが付着しているままにさせたからであると推論した。これは、はっきりと図12で見ることができ、そこで"-Ri"は、ROCiを受けず、したがって、浮遊するより高い転移性の細胞と混じり合っていなかった、付着した細胞を意味する。
前立腺癌細胞は、NM23、aka NMElあるいはNME7-ABを含んでいる培地で培養された時、さらにより転移性の状態に移行した。ここで、本発明者らは、ここまでテストされたすべての細胞株で、NME7-AB、ヒトNMEl二量体、若しくはヒト間に対して高い配列相同性を持っているバクテリアのNMEでの培養は、より転移性の状態への移行を引き起こすことをしめした。
図14Aは、2i阻害剤、NME7-ABあるいは両方のいずれかを含む培地において培養された乳癌細胞の転移性と多分化能マーカーの発現レベルのRT-PCR測定のグラフを示す。さらに、見ることができるように、2i阻害剤は、より転移性の状態への癌細胞の移行を引き起こすことができる。図14Bは、ヒトNMEl及びNME7-ABに高い配列相同性をもつバクテリアHSP593 からのNMEI含有培地で培養された乳癌細胞の転移性と多分化能マーカーの発現レベルのRT-PCR測定のグラフを示し、高い配列相同性をもつバクテリアNMEsは、より転移性の状態への移行を引き起こす、ヒトNMEl及びNME7-ABの効果を模倣できることを示す。卵巣癌細胞株SK-OV3、OV-90、膵癌細胞株CAPAN-2及びPANC-1、乳癌細胞株MDA-MBは、すべて、NME7-AB及び／又は2i阻害剤で培養された時、付着性から非付着性への形態的移行を示した。
図37は、NME7-AB中で72時間あるいは144時間培養された様々な癌細胞株の転移性マーカーあるいは多分化能マーカーのRT-PCR測定のグラフを示す。図37 A は、SK-OV3細胞が、NME7-AB中で培養された時、転移性のマーカーCHD1、SOX2及びNME7-X1の発現を増加することを示す。図37Bは、OV-90細胞が、NME7-AB中での培養の後に転移性のマーカーCXCR4及びNME7-X1の発現を増加させることを示す。
実施例9 - NME7中で培養された癌細胞が転移性になるという実証
癌細胞の個体群が、転移性かどうかの機能テストは、免疫不全マウスに該細胞の非常に低い数、例えば200、を注入し、それらが腫瘍に進展するかどうかを確かめることである。典型的には、500-600万の癌細胞が、免疫不全マウスで腫瘍を形成するのに要求される。本発明者らは、NME誘導転移性癌細胞の50ほどの少なさで、マウスでの腫瘍を形成したことを示した。さらに、試験期間中、ヒトNME7-AB、NMElあるいはNME7-X1を注入されたマウスは、遠隔の転移を展開した。
T47Dヒト乳癌細胞が、48時間ごとの培地交換の条件で14日間標準RPMI培地において培養され、そして約７５％培養密度で、トリプシン処理された。その後、該細胞は、6つのウェルプレートへ植え付けられ、4nM NME7-ABが補充された最小の幹細胞培地(実施例1を参照)中で培養された。培地は、48時間ごとに交換された。4日頃までに、ある細胞は、表面から分離され、浮遊状態になる。培地は、これらが転移性のマーカーのRT-PCR測定によって証拠づけられる最も高い転移性能をもつ細胞であるので、「浮遊物」を保持するために注意深く変更される。7日目あるいは8日目において、浮遊物が、回収されそしてカウントされた。サンプルは、RT-PCR測定のために保持された。測定されたキーマーカーは、NME7-AB中で簡潔に培養された後に、40-200倍までアップレギュレートされるCXCR4である。
新鮮に回収された浮遊性転移性細胞が、90日間の遅延リリース発情ホルモン物質ペレット剤が注入されたメスnu/nu無胸腺マウスの脇腹に異種移植された。浮遊性細胞は、各々10,000個、1,000個、100個、あるいは50細胞として、異種移植された。6つの各グループ中のマウスの半分が、オリジナルの移植サイトの近くに32nM NME7-ABを毎日注入された。NME7-ABのないRPMI培地において培養された、親T47D細胞も、コントロールとしての、600万、10,000、あるいは100がマウスへ注入された。わずか50個の細胞が注入された時でさえ、NME7誘導浮遊性細胞が注入されたマウスは、腫瘍を生じた。浮遊性細胞が注入され、NME7-ABの毎日の注射を受けたマウスは、さらに様々な器官で遠隔の腫瘍若しくは遠隔の転移を生じた(図20-25)。NME7-AB培養癌細胞の移植後、ヒトNME7-ABを注入された12匹のマウスのうちの１１、すなわち92%が、注射部位に腫瘍を生じた。移植後ヒトNME7-ABを注入されなかった12匹のマウスのうちの7匹だけ、すなわち58%が、腫瘍を生じた。腫瘍を得て、ヒトNME7-ABを注入された１１匹マウスの9匹、すなわち82%が、注射領域から遠隔で多発性腫瘍を生じた。NME7-ABを注入されなかったマウスのどれも、多発性の可視の腫瘍を生じなかった。
屠殺の後、RT-PCR及びウェスタンブロットは、NME7-ABを注入されたマウスの遠隔隆起は、確かにヒト乳房の腫瘍だったことを示した。それらの器官の同様の分析は、遠隔隆起に加えて、マウスは、注入されたヒト乳癌細胞のヒト乳癌特性を持って、肝臓及び肺にランダムに転移したことを示した。予想通りに、600万個の細胞が注入されたマウスだけが腫瘍を展開した。
上に記述されたものに似たいくつかの実験が、本質的に、同じ結果で行なわれた。各実験では、すべての適正管理を含み、24匹あるいは52匹のマウスでおこなった。
実施例10 - 抗NME7抗体は、癌細胞増殖を阻害する。
T47D乳癌細胞及びDU145前立腺癌細胞は、ATCCによる推奨されたプロトコルによって培養された。細胞は、〜30%培養密度に育てられた。抗NME7多クローンウサギ抗体を、全タンパク質：アミノ酸100〜376、をほとんど包含するNME7の断片に対してつくった。 この多クローン性抗体は、2.7〜375ナノグラム/mL間の濃度で、癌細胞に添加された。タキソールは陽性対照として使用された。細胞は、48時間(図6及び7)で、及び96時間(図8)で撮影され数えられた。写真と細胞数は、該抗体が乳と前立腺癌の細胞の増殖を強力に阻害したことを示す。しかしながら、NME7に特異的な免疫化ペプチドを選択する試みをしなかったので、この抗体は、NME7-AB様種及びNME1の両方に結合し阻害することにより、細胞毒性を働かせた。
実施例11 -それらの配列がNME7、A1、A2、Bl、B2及びB3に特異的であるように選択されたペプチドは、MUC1*細胞外ドメインペプチドへのNME7種の結合を阻害する。
NME7ペプチドが、抗体産生用免疫化剤として選ばれた。NME7ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3(図19)は、ヒトNME1、ヒトNME7、及びヒトNME1若しくはヒトNME7に相同だったバクテリアNMEｓでの配列アラインメントのプロセスを使用して選ばれた。すべての中の高い配列相同性があった5つの領域が、同定された。しかしながら、ヒトNME7と同様にヒトNME1も阻害する抗体を生じさせるペプチドを選択することを防止するために、本発明者らは、それらのペプチドがヒトNME1とは異なる配列をもつ相同の領域に隣接していたNME7配列を選んだ。本発明者らはELISAを行って、該ペプチド自身がその表面上の合成MUC 1 *ペプチドに結合し、該固定化ペプチドへのヒトNME7若しくはヒトNME1の結合を阻害することができたかどうかを分析した（図２７）。図27は、該ペプチドは、該固定化ペプチドへのNME7及びNME1の結合を阻害したことを示す。これは、該ペプチドが由来したこれら領域が、MUC 1 *と相互作用し、NME7のそれらの領域へ結合し、MUC 1 *リセプターへのその結合を阻害する抗体を生じさせる領域だったことを示した。
別の実験では、フリーペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3が、NME7-ABあるいは2iのいずれかの中で培養することによりより転移性の状態への移行をうけた培養中の癌細胞に添加された。図30は、癌細胞がNME7-ABあるいは2i阻害剤のいずれかの中で育てられるときの科学者観察のテーブルを示し、そして、該フリーペプチドは、付着細胞から浮遊物への形態的変化を阻害することを示す。それらは、乳癌細胞にとって、転移性のマーカー、特にCXCR4の増加した発現に直接関連づけられる。RT-PCR測定は、NME7-ABペプチドが転移マーカーCXCR4の発現の増加を阻害したことを確認した。
図31は、転移性の形質転換に関し、NME7-ABあるいは2i阻害剤、その各々はより転移性の状態への癌細胞を形質転換する、のいずれかの中で育てられたT47D乳癌細胞のCXCR4発現のRT-PCR測定のグラフ、及びNME7由来ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3の阻害作用を示す。図32は、コントロールとしてのハウスキーピング遺伝子と共に、CXCR4発現の初期サイクル数(the threshold cycle number)と図31におけるCXCR4のRT-PCR測定サンプルで記録されたRNAレベルのテーブルを示す。
実施例12 - 抗NME7抗体は、特に、ヒトNME1ではなくヒトNME7に結合する。
本発明者らが、NME7-ABペプチドA1、A2、Bl、B2、若しくはB3での免疫化によって生成された、NME7抗体が、それは健康な機能をもち及びある抗体でそれをブロックするためにヒトに有害でありえるように、NME7-ABに特異的に結合し及びヒトNME1には結合しないことを、決定するために標準ELISA分析が行なわれた。図26のELISAは、ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3から本発明者らが生成したNME7抗体のすべてが、ヒトNME1(B)ではなく、ヒトNME7-AB(A)に結合することを示す。これらの抗体を生成するために使用される該ペプチドは、NME7-AB及びNME7-X1の両方に共通である。この分析は、これはA1、A2、Bl、B2及びB3から生成された該抗体が、NME7-ABに特異的に結合し、伸展(extension)によって、NME7-X1に結合することを示す。
配列番号１４１： NME7Aペプチド1(Aドメイン)
MLSRKEALDFHVDHQS(配列番号: 141)
配列番号１４２：NME7Aペプチド2(Aドメイン)
SGVARTDASES(配列番号: 142)
配列番号１４３：NME7Bペプチド1(Bドメイン)
DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(配列番号: 143)
配列番号１４４：NME7Bペプチド2(Bドメイン)
EVYKGVVTEYHDMVTE(配列番号: 144)
配列番号１４５：NME7Bペプチド3(Bドメイン)
AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 145)
実施例13 - 抗NME7特異抗体及びそれらを生成したペプチドは、癌細胞増殖を阻害する。
ウサギが、NME7ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3で免疫化され、そして、抗体が生成され集められ、免疫化ペプチドが結合したカラムで精製された。T47D乳癌細胞は、植え付けられ、血清が補充されたRPMI培地中でATCCプロトコルによって培養された。ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3での免疫化によって生成された抗体は、図28に示された濃度で添加された。免疫化ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3とMUC1*のPSMGFR細胞外ドメインペプチド(以下「FLR」)も、T47D乳癌細胞を育てるために別々に添加された。タキソール及びE6抗MUCl* Fabは、コントロールとして添加された。図28のグラフは、フリーペプチドと同様に、生成された抗体も癌細胞の増殖を強力に阻害したことを示す。タキソール、それは健康細胞及び癌細胞を同様に殺す化学療法作用薬である、を使用しての、阻害との比較に注意のこと。さらに、比較のために、アミノ酸100〜376からのNME7の大きな伸張を使用して生成された多クローン性抗体が示される。この抗体は、癌増殖の有力な阻害剤であるが、NME7にもNME1にも結合することができるので、それには非特異的影響がありえる。
同様の実験では、ペプチドそれら自身と同様に、ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3での免疫化から生成された抗体のコンビネーションは、示された濃度で、癌細胞を育てるのに添加された。図29に示される細胞増殖のグラフは、抗体とペプチドのコンビネーションが、強力に癌細胞の増殖を阻害したことを示す。これらの2つの実験で、細胞は、MUC1*陽性乳癌細胞であった。
実施例14 - 抗NME7抗体は、転移性癌細胞への癌細胞の移行を阻害する。
癌細胞は、よりナイーブな状態へ幹細胞を振り向ける作用薬の存在下で培養された時、より転移性の状態に形質転換する。本発明者らは、NME7-AB、ヒトNME1二量体、バクテリアNME1二量体又はMEKとGSK3ベータ阻害剤（「2i」を呼ぶ）中で癌細胞を培養することは、その細胞をより転移性にする、ことを実証した。細胞が、より転移性の状態に移行するとともに、それらは非付着性になり、培養皿から離れて浮遊する。これら浮遊する細胞、「浮遊物」は、付着していているものから分けられて集められ、次のことが示された:a) 転移性の遺伝子のより高位レベルを発現する; そして、b） マウスへ異種移植された時、非常に低い数で注入された時に、この浮遊細胞は腫瘍を生成することができた。乳癌のCXCR4、前立腺癌のCHD1のような特異的転移性マーカー、及びOCT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-Myc他のような他の多能性幹細胞マーカーのRT-PCR測定は、NME7-ABにおいて培養された癌細胞において劇的な過剰発現、及びここで及び図で「浮遊物」と呼ばれた、非付着性になった細胞でもっと過剰発現を示した。
ここで、本発明者らは、ペプチドそれ自体と同様に、NME7の-由来ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3での免疫化によって生成されたNME7特異抗体は、癌細胞から転移性癌細胞への移行を阻害することを示す。これらの実験の最初では、A1、A2、Bl、B2及びB3での免疫化によって生成された抗体は、NME7-AB、あるいは2i阻害剤中でのT47D乳癌細胞の培養によって引き起こされた転移性への移行を阻害するそれらの能力に関してテストされた。最も著しい観察は、該抗体と該ペプチドは、劇的に、浮遊性細胞の数を減らし、それは、該抗体と該ペプチドが、転移性癌細胞への形質転換を阻害したという最初の示唆であった。特に、該抗体がB3ペプチドでの免疫化から生成した細胞は、なんらかの浮遊性細胞をかろうじて生成した。
図30は、どんな抗体処理も受けなかったコントロールウェルに対比しての、各抗体における可視の浮遊性細胞のパーセンテージについての記録された観察を示す。mRNAは、浮遊性細胞及び付着細胞の両方から抽出された。RT-PCRが、CXCR4を含む転移性マーカーの発現レベルを測定するために使用された。抗NME7抗体での処置は、CXCR4のような転移性マーカーの量を大幅に減らし、該抗体が転移性癌への移行を阻害したことを示した(図31を参照)。顕著に、ペプチドB3での免疫化によって生成された抗体、aka抗体#61、は、完全に、より転移性の状態への移行を阻害した。図3 IBは、NME7-ABペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3の単独で処置された乳癌細胞が、2i阻害剤含有培地中での細胞の培養により引き起こされたより転移性の状態への移行を、強力に阻害することができたことを示す。ペプチドB3は、それが生成した抗体#61のように、特に有効であった。図31Cは、同じグラフを示すが、転移性のマーカーのペプチド阻害を示すためにY軸を拡大した。mRNAの量、それらは細胞の生存率と増殖を示す、が測定された。抗体で処理された細胞は、より少ないmRNAをもち、より転移性の状態への移行を阻害することに加えて、抗-NME7-AB抗体が癌細胞の増殖を阻害したことを示している。図32は、図31 Aで示される阻害実験で得られたRNA量のテーブルを示す。
実施例15 - NME7由来ペプチドA1、A2、Bl、B2及びB3で生成された抗NME7抗体は、どんな市販の抗体を使用しても、検出できない新しいNME7種を同定した。
当業者に知られているように、ある抗体は、標的タンパク質の直線部分を認識し、ウェスタンブロット分析で使用することができる。一方、他の抗体は、非直線のコンフォメーションモチーフを認識し、プルダウンでの分析、あるいは免疫沈降分析で使用することができる。本願発明以前、開裂NME7あるいはアイソフォームNME7-X1は、存在するとは知られていなかった。本願出願時に市販で入手可能だった抗体の使用は、既存の抗体は、特に、ここで重要なNME7種を検出することができなかった。B9(Santa Cruz Biotechnology)は、NME7アミノ酸100-376に対して生じた単クローン抗体である。図36Aは、それが、全長42kDa NME7のみを検出することを示す。別の市販の抗体、H278、はNME7アミノ酸100-376に対して生じたウサギ多クローン性で、それは、NME7に特異的でないアミノ酸配列順序を含む。図36Bは、この抗体は、さらに、NMEl、それは、全長NME7と同じ17kDaである、及びNME7-ABに特異的であるとは見えない他のバンドを染色する。
NME7-ABペプチドA1、A2、Bl、B2又はB3での免疫化によって生成されたNME7抗体は、全長42kDaタンパク質、開裂産物若しくは代替アイソフォームでありうる~33kDa NME7種、開裂産物あるいは代替アイソフォームでありうる~30kDa NME7種、を含む新規NME7種を同定し、そこでは~30kDa種は、NME7-X1であるように見える。図35A-Cは、ペプチドA1、Bl及びB3によって生成された抗体が、T47D乳癌細胞、PC3及びDU145前立腺癌細胞、HEK293胎児肝細胞及び白血病細胞IM-9、K562及びMV411を含む、広範囲の癌細胞株において、NME7、NME7-AB及びNME7-X1の分泌型を同定することを示す。
ここに引用された参照文献のすべては、その全体において、本願発明の中に含まれる。
引用された参照文献
Clarke MF, Dick JE, Dirks PB, Eaves CJ, Jamieson CH, Jones DL, Visvader J, Weissman IL, Wahl GM. (2006) Cancer stem cells- erspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cell.. Cancer Res. Oct 1;66(19):9339- 44. Epub 2006 Sep 21.
Chen K, Huang YH, Chen JL. (2013) Understanding and targeting cancer stem cells: therapeutic implications and challenges. Acta Pharmacologica Sinica 34: 732-740; Review
Darash-Yahana M, Pikarsky E, Abramovitch R, Zeira E, Pal B, Karplus R, Beider K, Avniel S, Kasem S, Galun E, Peled A (2004) Role of high expression levels of CXCR4 in tumor growth, vascularization, and metastasis. FASEB J 18(11): 1240-1242
Mahanta S, Fessler S, Park J, Bamdad C. A Minimal Fragment of MUCl Mediates Growth of Cancer Cells, 2008 PLoS ONE 3:e2054-2065.
Hikita S, Clegg O, Kosik K, Bamdad C. MUCl* Mediates the Growth of Human Pluripotent Stem Cells, 2008 PLoS ONE 3 :e3312-3325.
Kumar SM, Liu S, Lu H, Zhang H, Zhang PJ, Gimotty PA, Guerra M, Guo W, Xu X. (2012) Acquired cancer stem cell phenotvpes through Oct4-mediated dedifferentiation. Oncogene. Nov 22;31(47):4898-911.
Liu K, Lin B, Zhao M, Yang X, Chen M, Gao A, Liu F, Que J, Lan X. (2013) The multiple roles for Sox2 in stem cell maintenance and tumorigenesis. Cellular Signaling May;25(5): 1264-71. Review
Wang ML, Chiou SH, Wu CW. (2013) Targeting cancer stem cells: emerging role of Nanog transcription factor. Onco targets and Therapy. Sep 4;6: 1207-20. Review.
Xu C, Rosier E, Jiang J, Lebkowski JS, Gold JD, et al. (2005) Basic Fibroblast Growth Factor Supports Undifferentiated Human Embryonic Stem Cell Growth Without Conditioned Medium. STEM CELLS 23: 315-323.
Fessler S, Wotkowicz M, Mahanta S, Bamdad C (2009) MUCl* is a determinant of trastuzumab (Herceptin) resistance in breast cancer cells, Breast Cancer Res Treat 118:113-124 DOI 10.1007/sl0549-009-0412-3
Miki J, Furusato B, Li H, Gu Y, Takahashi H, Egawa S, Sesterhenn IA, McLeod DG, Srivastava S, Rhim JS. Identification of putative stem cell markers, CD133 and CXCR4, in hTERT-immortalized primary nonmalignant and malignant tumor-derived human prostate epithelial cell lines and in prostate cancer specimens. Cancer Res. 2007 Apr 1;67(7):3153-61.
Jeter CR, Liu B, Liu X, Chen X, Liu C, Calhoun-Davis T, Repass J, Zaehres H, Shen JJ, Tang DG. NANOG promotes cancer stem cell characteristics and prostate cancer resistance to androgen deprivation. Oncogene. 2011 Sep 8;30(36):3833-45. PMCID:
Faber A, Goessler UR, Hoermann K, Schultz JD, Umbreit C, Stern-Straeter J. SDF-1-CXCR4 axis: cell trafficking in the cancer stem cell niche of head and neck squamous cell carcinoma. Oncol. Rep. 2013 Jun;29(6):2325-31.
Mukherjee D, Zhao J. The Role of chemokine receptor CXCR4 in breast cancer metastasis. Am J Cancer Res. 2013;3(l):46-57. PMCID: PMC3555200
Herreros-Villanueva M, Zhang J-S, Koenig A, Abel EV, Smyrk TC, Bamlet WR, de Narvajas AA-M, Gomez TS, Simeone DM, Bujanda L, Billadeau DD. SOX2 promotes dedifferentiation and imparts stem cell-like features to pancreatic cancer cells. Oncogenesis. 2013;2:e61. PMCID: PMC3759123
Hanna J, Cheng AW, Saha K, Kim J, Lengner CJ, et al. (2010) Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 9222-9227.
Smagghe, B.J. Stewart A.K., Carter M.G., Shelton L.S., Bernier K.J., Hartman E.J., Calhoun A.K., Hatziioannou V.M., Lillacci G., Kirk B.A., DiNardo B.A., Kosik K.S., Bamdad C. (2013) MUC1* Ligand, NM23-H1, Is a Novel Growth Factor That Maintains Human Stem Cells in a More Naive State. PLoS ONE 8(3): e58601
Theunissen TW, Powell BE, Wang H, Mitalipova M, Faddah DA, Reddy J, Fan ZP, Maetzel D, Ganz K, Shi L, Lungjangwa T, Imsoonthornruksa S, Stelzer Y, Rangarajan S, D'Alessio A, Zhang J, Gao Q, Dawlaty MM, Young RA, Gray NS, Jaenisch R. (2014) Systematic Identification of Culture Conditions for Induction and Maintenance of Naive Human Pluripotency. Cell Stem Cell. 2014 Jul 24, S1934-5909(14)00298-7.
Rais Yl, Zviran A, Geula S, Gafni O, Chomsky E, Viukov S, Mansour AA, Caspi I, Krupalnik V, Zerbib M, Maza I, Mor N, Baran D, Weinberger L, Jaitin DA, Lara- Astiaso D, Blecher-Gonen R, Shipony Z, Mukamel Z, Hagai T, Gilad S, Amann- Zalcenstein D, Tanay A, Amit I, Novershtern N, Hanna JH (2013). Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. , 502(7469):65-70.
Xu RH, Peck RM, Li DS, Feng X, Ludwig T, et al. (2005) Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods 2: 185-190.
Liu W, Ma Q, Wong K, Li W, Ohgi K, Zhang J, Aggarwal AK, Rosenfeld MG. Brd4 and JMJD6-Associated Anti-Pause Enhancers in Regulation of Transcriptional Pause Release. Cell. 2013 Dec 19;155(7):1581-95. PMCID: PMC3886918.
Silva J, Barrandon O, Nichols J, Kawaguchi J, Theunissen TW, Smith A. Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signal inhibition. PLoS Biol. 2008 Oct 21 ;6(10):e253. PMCID: PMC2570424
Takahashi K and Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4):663-676 .
Porter D et al. (2011) Chimeric antigen receptor- modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 365:725-733 DOI: 10.1056/NEJMoal 103849
Tiller T et al. (2013) A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties. MABs 9:5(3) PMID: 23571156
Webb PA, Perisic O, Mendola CE, Backer JM and Williams RL. The crystal structure of a human nucleoside diphosphate kinase, NM23-H2. J Mol Biol. 1995, 251:574-587.
Min K, Song HK, Chang C, Kim SY, Lee KJ and Suh SW. Crystal structure of human nucleoside diphosphate kinase A, a metastasis suppressor. Proteins. 2002, 46:340- 342.
Okabe-Kado et al., "A new function of Nm23/NDP kinase as a differentiation inhibitory factor, which does not require it's kinase activity", FEBS Letters 363: 311-315, 1995 Lombardi et al., "nm23: Unraveling Its Biological Function in Cell Differentiation" JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY 182: 144-149 (2000)
当業者は、ルーチン実験、ここに詳細に記述された発明の特定の実施態様への多くの等価物を、認識するか、あるいは確認することができる。そのような等価物は、本願発明の請求の範囲内に包含されることを意図する。

Claims (9)

  1. 対象患者に、NME7-AB領域に高度に相同若しくは同一のペプチドを投与することを含む、対象患者の癌を治療若しくは予防剤。
  2. 該ペプチドは、以下の表(SEQ ID NOS:88〜121)にリストしたペプチドの1若しくはそれ以上に、少なくとも80%相同である、請求項１に記載の剤。
  3. 該ペプチドは、以下の表(SEQ ID NOS:122〜133)にリストしたペプチドの1若しくはそれ以上に、少なくとも80%相同である、請求項１に記載の剤。
  4. 該ペプチドは、以下の表(SEQ ID NOS:134〜140)にリストしたペプチドの1若しくはそれ以上に、少なくとも80%相同である、請求項１に記載の剤。
  5. 該ペプチドは、以下の表(SEQ ID NOS:141〜145)にリストしたペプチドの1若しくはそれ以上に、少なくとも80%相同である、請求項１に記載の剤。
  6. 該ペプチドは、以下の表(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたものから選ばれる、請求項１に記載の剤。
  7. 該ペプチドは、以下の表(SEQ ID NOS: 141〜145)にリストされたものから選ばれる、請求項６に記載の剤。
  8. 該ペプチドは、以下の表(SEQ ID NOS: 88〜145)にリストされたペプチドに、高度に相同である、あるいはN末端若しくはC末端で7つまでのアミノ酸残基が付加若しくは欠失されたものである、請求項１に記載の剤。
  9. 該ペプチドは、スペーサー若しくはリンカーによって別のペプチドに結合される、請求項１に記載の剤。
JP2018165618A 2014-04-07 2018-09-05 抗ｎｍｅ抗体 Active JP6646118B2 (ja)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461976390P 2014-04-07 2014-04-07
US61/976,390 2014-04-07
PCT/US2014/050773 WO2015023694A2 (en) 2013-08-12 2014-08-12 Method for enhancing tumor growth
USPCT/US2014/050773 2014-08-12
USPCT/US2014/061821 2014-10-22
USPCT/US2014/061821 2014-10-22
US201562114526P 2015-02-10 2015-02-10
US62/114,526 2015-02-10
US201562127746P 2015-03-03 2015-03-03
US62/127,746 2015-03-03

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016561611A Division JP6401292B2 (ja) 2014-04-07 2015-04-07 抗ｎｍｅ抗体

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020001446A Division JP7042854B2 (ja) 2014-04-07 2020-01-08 抗ｎｍｅ抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018203765A true JP2018203765A (ja) 2018-12-27
JP6646118B2 JP6646118B2 (ja) 2020-02-14

Family

ID=54288530

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016561611A Active JP6401292B2 (ja) 2014-04-07 2015-04-07 抗ｎｍｅ抗体
JP2018165618A Active JP6646118B2 (ja) 2014-04-07 2018-09-05 抗ｎｍｅ抗体
JP2020001446A Active JP7042854B2 (ja) 2014-04-07 2020-01-08 抗ｎｍｅ抗体
JP2022040438A Pending JP2022095648A (ja) 2014-04-07 2022-03-15 抗ｎｍｅ抗体
JP2024032381A Pending JP2024084747A (ja) 2014-04-07 2024-03-04 抗ｎｍｅ抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016561611A Active JP6401292B2 (ja) 2014-04-07 2015-04-07 抗ｎｍｅ抗体

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020001446A Active JP7042854B2 (ja) 2014-04-07 2020-01-08 抗ｎｍｅ抗体
JP2022040438A Pending JP2022095648A (ja) 2014-04-07 2022-03-15 抗ｎｍｅ抗体
JP2024032381A Pending JP2024084747A (ja) 2014-04-07 2024-03-04 抗ｎｍｅ抗体

Country Status (11)

Country Link
US (4) US20170204196A1 (ja)
EP (2) EP3129476B1 (ja)
JP (5) JP6401292B2 (ja)
KR (2) KR20210107166A (ja)
CN (1) CN106414726A (ja)
AU (1) AU2015243948B2 (ja)
CA (1) CA2945162A1 (ja)
IL (2) IL248220A0 (ja)
SG (2) SG11201608389RA (ja)
TW (1) TWI746420B (ja)
WO (1) WO2015157322A2 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015243948B2 (en) 2014-04-07 2020-10-15 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-NME antibody
AU2016219350A1 (en) 2015-02-10 2017-08-24 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-MUC1* antibodies
JP2020500031A (ja) * 2016-10-11 2020-01-09 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション ヒト化抗ｍｕｃ１＊抗体及び開裂酵素の使用
CA3058190A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Minerva Biotechnologies Corporation Agents for differentiating stem cells and treating cancer
EP3920693A4 (en) 2019-02-04 2022-10-05 Minerva Biotechnologies Corporation ANTI-NME ANTIBODIES AND METHOD FOR TREATING CANCER OR CANCER METASTASIS
WO2021252551A2 (en) * 2020-06-08 2021-12-16 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-nme antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
WO2021263227A2 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-nme antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
US20240261406A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Minerva Biotechnologies Corporation Chimeric antigen receptor compositions and methods for treating muc1* diseases

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059373A2 (en) * 2011-10-17 2013-04-25 Minerva Biotechnologies Corporation Media for stem cell proliferation and induction
WO2014018679A2 (en) * 2012-07-24 2014-01-30 Minerva Biotechnologies Corporation Nme variant species expression and suppression
WO2014130741A2 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Minerva Biotechnologies Corporation Nme inhibitors and methods of using nme inhibitors

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5874285A (en) * 1996-09-13 1999-02-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide encoding a novel human nm23-like protein
EP1265582A2 (en) 1999-09-29 2002-12-18 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
US7202346B2 (en) * 2002-07-03 2007-04-10 Immunogen Inc. Antibodies to non-shed Muc1 and Muc16, and uses thereof
AU2003299643A1 (en) * 2002-12-04 2004-06-23 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to colon specific genes and proteins
WO2010144887A1 (en) * 2009-06-11 2010-12-16 Minerva Biotechnologies Corporation Methods for culturing stem and progenitor cells
SG190997A1 (en) * 2010-12-09 2013-07-31 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2013151664A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
CA2882222A1 (en) * 2012-08-14 2014-02-20 Minerva Biotechnologies Corporation Stem cell enhancing therapeutics
US20160326263A1 (en) 2013-02-20 2016-11-10 Minerva Biotechnologies Corporation NME Inhibitors and Methods of Using NME Inhibitors
AU2015243948B2 (en) 2014-04-07 2020-10-15 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-NME antibody

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013059373A2 (en) * 2011-10-17 2013-04-25 Minerva Biotechnologies Corporation Media for stem cell proliferation and induction
WO2014018679A2 (en) * 2012-07-24 2014-01-30 Minerva Biotechnologies Corporation Nme variant species expression and suppression
WO2014130741A2 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Minerva Biotechnologies Corporation Nme inhibitors and methods of using nme inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
US20190031778A1 (en) 2019-01-31
TWI746420B (zh) 2021-11-21
EP4050103A1 (en) 2022-08-31
JP2017512825A (ja) 2017-05-25
JP6646118B2 (ja) 2020-02-14
US20220289865A1 (en) 2022-09-15
US20170204196A1 (en) 2017-07-20
CA2945162A1 (en) 2015-10-15
JP2024084747A (ja) 2024-06-25
US11702483B2 (en) 2023-07-18
KR20160142372A (ko) 2016-12-12
IL291164A (en) 2022-05-01
EP3129476B1 (en) 2022-01-05
AU2015243948A1 (en) 2016-10-27
TW201542595A (zh) 2015-11-16
CN106414726A (zh) 2017-02-15
US20190031779A1 (en) 2019-01-31
KR20210107166A (ko) 2021-08-31
WO2015157322A3 (en) 2015-12-23
SG11201608389RA (en) 2016-11-29
EP3129476A2 (en) 2017-02-15
JP2022095648A (ja) 2022-06-28
JP7042854B2 (ja) 2022-03-28
JP6401292B2 (ja) 2018-10-10
EP3129476A4 (en) 2017-11-08
JP2020073562A (ja) 2020-05-14
WO2015157322A2 (en) 2015-10-15
KR102294483B1 (ko) 2021-08-27
SG10201808867PA (en) 2018-11-29
IL248220A0 (en) 2016-11-30
AU2015243948B2 (en) 2020-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6646118B2 (ja) 抗ｎｍｅ抗体
US12037413B2 (en) Anti-NME antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
US12049514B2 (en) Anti-NME antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
US20230242678A1 (en) Anti-nme antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
JPWO2021263227A5 (ja)
JPWO2021252551A5 (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180905

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190618

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190911

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20191111

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191128

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20191212

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200109

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6646118

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250