KR20210106880A - 폴리뉴클레오티드 클러스터 클론형성능 우선성을 개선하는 방법 - Google Patents

폴리뉴클레오티드 클러스터 클론형성능 우선성을 개선하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 표적 핵산 어댑터와 어레이에 부착된 프라이머 간의 상동성의 정도를 조정하여 시딩된 표적 핵산으로의 운동 지연을 인코딩함으로써 어레이의 단일 클론 클러스터의 생성을 개선하는, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

폴리뉴클레오티드 클러스터 클론형성능 우선성을 개선하는 방법
본원은 2018년 12월 19일에 출원된 미국 가출원번호 제62/782,279호의 이점을 주장하며, 이의 개시 내용의 전문은 본원에 참조로 원용된다.
본 개시 내용은, 무엇보다도 표적 핵산의 배제 증폭을 이용한 앰플리콘의 서열분석의 클러스터 생성에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 단일 클론성인 클러스터의 수 증가에 관한 것이다.
차세대 서열분석(NGS) 기술이 개선됨에 따라, 서열분석 속도와 데이터 출력이 크게 증가하여, 현재 서열분석 플랫폼의 대량 샘플 처리량이 발생하였다. 약 10년 전에, Illumina Genome Analyzer는 실행당 최대 1GB의 서열 데이터를 생성할 수 있었다. 오늘날, Illumina NovaSeqTM 시스템 시리즈는 2일 만에 최대 2TB의 데이터를 생성할 수 있으며, 이는 용량이 2000배 넘게 증가한 것이다.
이러한 증가된 용량을 실현하는 한 가지 양태는 클러스터 생성이다. 클러스터 생성은, 라이브러리의 구성원들이 각 말단에 존재하는 범용 서열을 포함하는 라이브러리의 생성을 포함할 수 있다. 라이브러리는 플로우셀에 로딩되고, 라이브러리의 개별 구성원들은 범용 서열에 대하여 상보적인 표면 결합 올리고의 론(lawn)에서 포획된다. 이어서, 각 구성원은 브리지 증폭을 통해 별개의 클론 클러스터로 증폭된다. 클러스터 생성이 완료되면, 개별 클러스터는 라이브러리의 단일 구성원에 대한 약 1000개의 복제를 포함할 수 있으며, 라이브러리는 서열분석할 준비가 된다.
브리지 증폭의 한 방법은 운동 배제 증폭이라고도 하는 배제 증폭(ExAmp)이다. 이 방법은, 패턴화된 어레이 및 등온 조건을 사용하여 라이브러리를 증폭하는 재조합효소 촉진 증폭 반응으로서, 증폭이 더 빠르고 시약을 덜 사용하여 어레이의 웰에서 클론 클러스터를 생성한다. 배제 증폭 방법은 클론 클러스터의 생성에 매우 유용한 것으로 입증되었으나, 더 많은 점유 웰을 초래하는 조건으로 인해 더 많은 다클론성 웰을 또한 생성한다.
차세대 서열분석(NGS) 기술은, 단일 표적 핵산으로부터 생성된 앰플리콘의 단일 클론성 집단의 고 병렬 서열분석에 의존한다. 앰플리콘의 단일 클론성 집단을 서열분석하면, 신호 대 잡음비가 훨씬 더 높아지고, 강도가 증가하고, 및 필터를 통과하는 클러스터의 퍼센트가 증가하며, 이들 모두는 데이터 출력 및 데이터 품질의 향상에 기여한다.
배제 증폭 방법은, 패턴화된 플로우셀에서의 웰당 단일 표적 핵산의 증폭 및 웰에서의 앰플리콘의 단일 클론성 집단의 생성을 가능하게 한다. 통상적으로, 웰 내에서 제1 포획 표적 핵산의 증폭 속도는 웰에서 표적 핵산의 훨씬 느린 수송 및 포획 속도에 비해 더 빠르다. 웰에서 포획되는 제1 표적 핵산은, 빠르게 증폭되어 전체 웰을 충전(fill)할 수 있어서, 동일한 웰에서 추가 표적 핵산이 포획되는 것을 방지할 수 있다. 대안으로, 제2 표적 핵산이 제1 표적 핵산 후에 동일한 웰에 부착되는 경우, 제1 표적 핵산의 빠른 증폭은 종종 웰을 충분히 충전하여 필터를 통과하는 신호를 초래한다. 배제 증폭의 사용은, 또한, 단일 클론성 웰의 슈퍼 푸아송 분포(super-Poisson distributions)를 초래할 수 있으며, 즉, 어레이에서 단일클론성인 웰의 비율은 푸아송 분포에 의해 예측되는 비율을 초과할 수 있다.
유용한 클러스터들의 슈퍼 푸아송 분포를 증가시키는 것은, 더 많은 단일 클론성 웰이 더 많은 데이터 출력을 초래하기 때문에 매우 바람직하지만, 표적 핵산을 웰 내에 시딩(seeding)하는 것은 일반적으로 공간적인(spatial) 푸아송 분포를 따르며, 여기서 더 많은 점유 웰에 대한 트레이드오프는 더 많은 다클론성 웰이다. 더 높은 슈퍼 푸아송 분포를 취득하는 한 방법은, 시딩을 빠르게 발생하게 하고 이어서 시딩된 표적 핵산들 간에 지연이 발생하게 하는 것이다. 생화학적 반응 역학을 통해 발생하는 것으로 여겨지기 때문에 "운동 지연"(kinetic delay)이라고 일컬어지는 지연은, 하나의 시딩된 표적 핵산이 다른 시딩된 표적보다 일찍 시작되게 하는 것이다.
배제 증폭(exclusion amplification)은, 서열 일치를 발견할 때, 재조합효소를 사용하여 프라이머(예를 들어, 웰에 부착된 프라이머)가 이중 가닥 DNA(예를 들어, 표적 핵산) 내로 침입하는 것을 용이하게 함으로써 기능한다. 증폭 효율을 최대화하기 위해, 배제 증폭이 침입 프라이머와 어댑터 서열 간에 완전한 동일성(identify)을 사용하는 것이 표준 관행이다. 본 발명자들은, 표적 핵산 어댑터와 웰에 부착된 프라이머 간의 상동성의 정도를 조정함으로써 시딩된 표적 핵산으로 운동 지연을 인코딩하는 방법을 확인하였다. 침입 프라이머와 어댑터 서열 간의 평균 상동성을 줄임으로써, 평균 증폭 속도가 감소되었음에도 불구하고 웰의 소위 단일클론성의 속도가 놀랍도록 개선되었다. 일반적으로, 더 많은 불일치가 도입됨에 따라, 증폭 효율은 감소되었다. 예상 외로, 높고 낮은 증폭 효율 모두를 갖는 어댑터 서열들의 혼합물들이 사용되었을 때, 혼합물은, 개별 구성요소의 평균 성능(고 효율과 저 효율의 중간) 성능을 발휘하지 못했지만, 필터를 통과하는 클러스터와 강도 모두에 있어서 모든 단일 유형 어댑터 서열의 성능을 능가하였다.
정의
본원에서 사용되는 용어들은, 달리 명시되지 않는 한 관련 기술에서 일반적인 해당 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 여러 용어와 이의 의미는 아래에 설명되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "앰플리콘"이라는 용어는, 핵산에 대한 언급에서 사용되는 경우, 핵산의 복제 산물을 의미하고, 여기서 산물은, 핵산의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 동일하거나 이러한 일부에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 앰플리콘은, 예를 들어, 중합효소 연장(polymerase extension), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 회전환 증폭(RCA), 결찰 연장(ligation extension), 또는 결찰 연쇄 반응을 비롯한, 핵산, 예를 들어 표적 핵산 또는 핵산의 앰플리콘을 주형(template)으로서 사용하는 임의의 다양한 증폭 방법에 의해서 생산될 수 있다. 앰플리콘은, 특정 뉴클레오티드 서열의 단일 복제(예를 들어, 중합효소 연장 산물) 또는 뉴클레오티드 서열의 다수의 복제(예를 들어, RCA의 콘카터머 산물(concatameric product))를 갖는 핵산 분자일 수 있다. 표적 핵산의 제1 앰플리콘은 전형적으로 상보성 복제이다. 후속 앰플리콘은, 제1 앰플리콘의 생성 후에, 표적 핵산으로부터 또는 제1 앰플리콘으로부터 생성되는 복제이다. 후속 앰플리콘은, 표적 핵산에 대하여 실질적으로 상보성이거나 표적 핵산과 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "증폭 부위"라는 용어는, 하나 이상의 앰플리콘이 생성될 수 있는 어레이 내의 또는 어레이 상의 부위를 지칭한다. 증폭 부위는, 이의 부위에서 생성되는 적어도 하나의 앰플리콘을 함유하거나, 보유하거나, 부착하도록 추가로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "어레이"라는 용어는, 상대적인 위치에 따라 서로 구별될 수 있는 부위들의 집단을 지칭한다. 어레이의 상이한 부위들에 존재하는 상이한 분자들은, 어레이 내의 부위들의 위치에 따라 서로 구별될 수 있다. 어레이의 개별 부위는 특정 유형의 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 부위는 특정 서열을 갖는 단일 표적 핵산 분자를 포함할 수 있거나, 부위는 동일한 서열(및/또는 이의 상보성 서열)을 갖는 몇몇 핵산 분자를 포함할 수 있다. 어레이의 부위들은 동일한 기판 상에 위치하는 상이한 특징부들일 수 있다. 예시적인 특징부는, 기판 내의 웰, 기판 내 또는 기판 상의 비드(또는 다른 입자)，기판로부터의 돌출부, 기판 상의 리지(ridge), 또는 기판 내의 채널을 비제한적으로 포함한다. 어레이의 부위들은, 상이한 분자를 각각 보유하는 별개의 기판들일 수 있다. 별개의 기판에 부착되는 상이한 분자는, 해당 기판이 회합된 표면 상의 기판의 위치에 따라 또는 액체 또는 젤 중의 기판의 위치에 따라 식별될 수 있다. 별개의 기판이 표면 상에 위치하는 예시적인 어레이는, 웰 내에 비드를 갖는 것을 비제한적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "용량(capacity)"이라는 용어는, 핵산 물질에 대한 언급에서 사용되는 경우, 핵산 물질, 예를 들어, 부위를 점유할 수 있는, 표적 핵산으로부터 유래된 앰플리콘의 최대량을 의미한다. 예를 들어, 이 용어는, 특정 조건에서 부위를 점유할 수 있는 핵산 분자의 총 수를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 핵산 물질의 총 질량 또는 특정 조건에서 부위를 점유할 수 있는 특정 뉴클레오티드 서열의 복제의 총수를 비롯한 다른 측정값도 사용될 수 있다. 전형적으로, 표적 핵산에 대한 부위의 용량은 표적 핵산의 앰플리콘에 대한 부위의 용량과 실질적으로 동일할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포획제(capture agent)"라는 용어는, 표적 분자(예를 들어, 표적 핵산)를, 부착하고, 보유하고, 또는 표적 분자에 결합할 수 있는 물질, 화학 물질, 분자, 또는 이의 모이어티를 지칭한다. 예시적인 포획제는, 변형된 표적 핵산의 적어도 일부(예를 들어, 범용 포획 결합 서열)에 대하여 상보적인 포획 핵산, 변형된 표적 핵산(또는 이에 부착된 연결 모이어티)에 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등)，또는 변형된 표적 핵산(또는 이에 부착된 연결 모이어티)과 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 시약을 비제한적으로 포함한다. 일 구현예에서, 포획제는 핵산이다. 핵산 포획제를 또한 증폭 프라이머로서 사용할 수 있다.
"P5" 및 "P7"이라는 용어는 핵산 포획제를 지칭할 때 사용될 수 있다. 용어 "P5'"(P5 프라임) 및 "P7'"(P7 프라임)은 P5 및 P7의 보체를 각각 지칭한다. 임의의 적합한 핵산 포획제를 본원에 제시된 방법에서 사용할 수 있고, P5 및 P7의 사용은 예시적인 구현예뿐이라는 점을 이해할 것이다. 플로우셀 상에서의 P5 및 P7 등의 핵산 포획제의 사용은, 국제 특허 WO 2007/010251, WO 2006/064199, WO 2005/065814, WO 2015/106941, WO 1998/044151, 및 WO 2000/018957호의 개시 내용에 의해 예시된 바와 같이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 당업자는, 핵산 포획제가 또한 증폭 프라이머로서 기능할 수 있다는 점을 인식할 것이다. 예를 들어, 임의의 적합한 핵산 포획제는, 고정되어 있든 용액 중에 존재하든, 정방향 증폭 프라이머로서 기능할 수 있고, 서열(예를 들어, 범용 포획 결합 서열)에 대한 혼성화 및 서열의 증폭을 위해 본원에 제시된 방법에서 유용할 수 있다. 유사하게, 임의의 적합한 핵산 포획제는, 고정되어 있든 용액 중에 존재하든, 역방향 증폭 프라이머로서 기능할 수 있고, 서열(예를 들어, 범용 포획 결합 서열)에 대한 혼성화 및 서열의 증폭을 위해 본원에 제시된 방법에서 유용할 수 있다. 본 개시 내용의 교시와 이용가능한 일반적인 지식에 비추어 볼 때, 당업자는, 본원에 제시된 바와 같은 표적 핵산의 포획 및 증폭에 적합한 서열의 설계 및 사용 방법을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "범용 서열(universal sequence)"이라는 용어는, 두 개 이상의 표적 핵산에 대하여 공통적인 서열 영역을 지칭하며, 여기서 분자들은 또한 서로 다른 서열 영역들을 갖는다. 분자 집합의 상이한 구성원들에 존재하는 범용 서열은, 범용 서열의 일부, 예를 들어, 범용 포획 결합 서열에 대하여 상보적인 포획 핵산 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산의 포획을 허용할 수 있다. 범용 포획 결합 서열의 비제한적인 예로는, P5 및 P7 프라이머와 동일하거나 이러한 프라이머에 대하여 상보적인 서열이 있다. 본원에 상세히 설명된 범용 포획 결합 서열의 다른 비제한적인 예는, P5 및 P7 프라이머에 대해 감소된 동일성(예를 들어, 하나 이상의 불일치) 또는 감소된 상보성을 갖는 서열을 포함하고/하거나 P5 및 P7 프라이머 미만의 길이를 갖는다. 유사하게, 분자 집합의 상이한 구성원들에 존재하는 범용 서열은, 범용 서열의 일부, 예를 들어, 범용 프라이머 결합 부위에 대하여 상보적인 범용 프라이머들의 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산의 복제 또는 증폭을 허용할 수 있다. 표적 핵산 분자는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 상이한 표적 서열들의 일측 또는 양측 말단에서 범용 어댑터(본원에서 어댑터라고도 함)를 부착하도록 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "어댑터"(adapter)라는 용어 및 이의 유도체, 예컨대, 범용 어댑터는, 일반적으로 표적 핵산에 결찰될 수 있는 임의의 선형 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 어댑터는 샘플 중에 존재하는 임의의 표적 서열의 3' 말단 또는 5' 말단에 대하여 실질적으로 비-상보적이다. 일부 구현예에서, 적합한 어댑터 길이의 범위는, 약 10개 내지 100개 뉴클레오티드, 약 12개 내지 60개 뉴클레오티드, 및 약 15개 내지 50개 뉴클레오티드이다. 일반적으로, 어댑터는 뉴클레오티드 및/또는 핵산의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 어댑터는 하나 이상의 위치에서 1종 이상의 절단가능한 기를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 어댑터는, 프라이머, 예를 들어, 포획 핵산의 적어도 일부와 실질적으로 동일하거나, 실질적으로 상보적 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 어댑터는, 하류 오차 검정, 식별, 또는 서열분석을 보조하도록 본원에서 태그 또는 인덱스라고도 하는 바코드를 포함할 수 있다. "어댑터"(adaptor) 또는 "어댑터"(adapter)는 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "샘플" 및 이의 유도체는, 가장 넓은 의미로 사용되며, 표적 핵산을 포함하는 것으로 의심되는 모든 표본, 배양물 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은, DNA, RNA, PNA, LNA, 키메라(chimeric), 또는 하이브리드 형태의 핵산을 포함한다. 샘플은, 하나 이상의 핵산을 포함하는 임의의 생물학적, 임상적, 수술적, 농업적, 대기, 또는 수생 기반 표본들을 포함할 수 있다. 이 용어는, 또한, 게놈 DNA, 신선 냉동된 또는 포르말린 고정된 파라핀 포매 핵산 샘플 등의 임의의 단리된 핵산 샘플을 포함한다. 또한, 샘플은, 단일 개인, 유전적으로 관련된 구성원들의 핵산 샘플 집합체, 유전적으로 관련이 없는 구성원들의 핵산 샘플, 종양 샘플과 정상 샘플 등의 단일 개인의 핵산 샘플(일치)， 또는 모체 피험자로부터 취득된 모체 및 태아 DNA 등의 두 개의 다른 형태의 유전 물질을 포함하는 단일 소스의 샘플, 식물 또는 동물 DNA를 포함하는 샘플 내에 존재하는 오염된 박테리아 DNA를 고려할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 물질의 공급원은, 예를 들어, 신생아 스크리닝(newborn screening)에 전형적으로 사용되는 바와 같이 신생아로부터 취득되는 핵산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "클론 집단"이라는 용어는, 특정한 뉴클레오티드 서열과 관련하여 균일한 핵산들의 집단을 지칭한다. 균일한 서열은, 전형적으로 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이이지만, 예를 들어, 적어도 약 50개, 적어도 100개, 적어도 250개, 적어도 500개, 또는 적어도 1000개의 뉴클레오티드 길이를 포함하여 훨씬 더 길 수 있다. 클론 집단은 단일 표적 핵산으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 클록 집단의 모든 핵산은 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 것이다. 클론형성능(clonality)에서 벗어나지 않고 클론 집단에서 적은 수의 돌연변이가 (예를 들어, 증폭 아티팩트(artifact)로 인해) 발생할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 클론형성능에서 벗어나지 않고 클론 집단에서 적은 수의 상이한 표적 핵산이 (예를 들어, 제한된 정도로 증폭되거나 증폭되지 않은 표적 핵산으로 인해) 발생할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상이한"이라는 용어는, 핵산과 관련하여 사용될 때, 핵산들이 서로 동일하지 않은 뉴클레오티드 서열들을 갖는다는 것을 의미한다. 2개 이상의 핵산은 그들의 전체 길이에 따라 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 핵산은 자신의 길이의 상당 부분을 따라 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 핵산은, 상이한 표적 뉴클레오티드 서열 부분들을 가지면서 서로 동일한 범용 서열 영역도 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유체 접근(fluidic access)"이라는 용어는, 유체에서의 분자 및 유체와 접촉하는 부위와 관련하여 사용될 때, 유체에서 또는 유체를 통해 이동하여 해당 부위와 접촉하거나 해당 부위에 진입하는 분자의 능력을 지칭한다. 이 용어는, 또한, 분자가 해당 부위로부터 분리되거나 해당 부위를 빠져나가 용액에 진입하는 능력을 지칭할 수 있다. 유체 접근은, 분자가 부위에 진입하고, 부위와 접촉하고, 부위로부터 분리 및/또는 부위를 빠져나가는 것을 막는 장벽이 없을 때 발생할 수 있다. 그러나, 유체 접근은, 접근이 절대적으로 방지되지 않는 한, 확산이 지연되거나 감소되거나 변경되더라도 존재하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이중 가닥"이라는 용어는, 핵산 분자와 관련하여 사용될 때, 핵산 분자의 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합됨을 의미한다. 부분적으로 이중 가닥인 핵산은, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합된 뉴클레오티드의 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "각각"이라는 용어는, 항목의 집합과 관련하여 사용될 때, 문맥상 명확히 달리 기재하지 않는 한, 집합의 개별 항목을 식별하도록 의도된 것이지만, 반드시 집합의 모든 항목을 지칭하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "배제된 용적"이라는 용어는, 다른 분자의 배제로 특정한 분자에 의해 점유된 공간의 용적을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "개재성 영역"(interstitial region)이라는 용어는, 기판 또는 표면의 다른 영역을 분리하는 기판에서의 또는 표면 상의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 개재성 영역은 어레이의 하나의 특징부를 어레이의 다른 특징부로부터 분리할 수 있다. 서로 분리된 2개의 영역은 이산적(discrete)일 수 있어서, 서로와의 접촉이 결여될 수 있다. 다른 예에서, 개재성 영역은 특징부의 제1 부분을 특징부의 제2 부분으로부터 분리할 수 있다. 개재성 영역에 의해 제공된 분리는 부분적 분리 또는 완전 분리일 수 있다. 개재성 영역은 전형적으로 표면 상의 특징부의 표면 물질과는 상이한 표면 물질을 갖는다. 예를 들어, 어레이의 특징부는, 개재성 영역에 존재하는 양 또는 농도를 초과하는 포획제의 양 또는 농도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 포획제는 개재성 영역에 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "중합효소"라는 용어는, 해당 분야에서의 용도와 일치하도록 의도되고, 예를 들어, 핵산을 주형 가닥으로서 사용하여 핵산 분자의 상보적 복제물을 생산하는 효소를 포함한다. 전형적으로, DNA 중합효소는, 주형 가닥에 결합한 후, 주형 가닥 아래로 이동하여, 핵산의 성장하는 가닥의 3' 말단에서 유리 하이드록실기에 뉴클레오티드를 순차적으로 추가한다. DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 분자를 합성하고, RNA 중합효소는 전형적으로 DNA 주형으로부터 RNA 분자를 합성한다(전사)． 중합효소는 가닥 성장을 시작하도록 프라이머라 칭하는 짧은 RNA 또는 DNA 가닥을 사용할 수 있다. 일부 중합효소는, 염기를 사슬에 추가하는 부위의 상류에서 가닥을 치환할 수 있다. 이러한 중합효소는 가닥 치환이라 칭해지고, 이는 중합효소가 자신에 의해 판독되는 주형 가닥으로부터 상보적 가닥을 제거하는 활성을 갖는다는 것을 의미한다. 가닥 치환 활성을 갖는 예시적인 중합효소는, 제한 없이, Bsu(바실러스 서브틸리스), Bst(바실러스 스테야로서모필루스) 중합효소, 엑소-Klenow 중합효소, 또는 서열분석 등급 T7 엑소-중합효소의 큰 단편을 포함한다. 일부 중합효소는, 이들 앞의 가닥을 분해하여, 뒤에서 성장하는 사슬에 의해 이것을 효과적으로 치환한다(5' 엑소뉴클레아제 활성). 일부 중합효소는 이들 뒤의 가닥을 분해하는 활성(3' 엑소뉴클레아제 활성)을 갖는다. 일부 유용한 중합효소는, 돌연변이 또는 기타 방법에 의해 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"이라는 용어는, 당해 분야에서 해당 용도와 일치하도록 의도된 것이고, 천연 발생 핵산 또는 이의 기능적 유사체를 포함한다. 특히 유용한 기능적 유사체는, 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화될 수 있으며 또는 특정한 뉴클레오티드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 포스포디에스터르 결합을 함유하는 골격을 갖는다. 유사체 구조는 당해 분야에 공지된 임의의 다양한 것을 포함하는 대체 골격 연결을 가질 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 (예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견되는) 데옥시리보스 당 또는 (예를 들어, 리보핵산(RNA)에서 발견되는) 리보스 당을 갖는다. 핵산은 당해 분야에 공지된 이들 당 모이어티의 임의의 다양한 유사체를 함유할 수 있다. 핵산은 천연 또는 비천연 염기를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 데옥시리보핵산은 아데닌, 타이민, 사이토신, 또는 구아닌으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 가질 수 있고, 리보핵산은 유라실, 아데닌, 사이토신, 또는 구아닌으로부터 선택되는 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산에 포함될 수 있는 유용한 비천연 염기는 당해 분야에 공지되어 있다. "표적"이라는 용어는, 핵산과 관련하여 사용될 때, 본원에 기재된 방법 또는 조성물의 맥락에서 핵산에 대한 의미론적인 식별자로서 의도된 것이며, 명확히 달리 제시되는 것을 넘어 핵산의 구조 또는 기능을 반드시 제한하는 것은 아니다. 각 말단에 범용 서열, 예를 들어, 각 말단에서의 범용 어댑터를 갖는 표적 핵산은 변형 표적 핵산이라고 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합효소 로딩 단백질" 및 "재조합효소"라는 용어들은, 상호교환 가능하게 사용되며, 당해 분야에서의 해당 용도와 일치하도록 의도된 것이며, 예를 들어, RecA 단백질, T4 UvsX 단백질, RB69 박테이로파지 UvsX 단백질, 임의의 문(phyla)으로부터의 임의의 상동성 단백질 또는 단백질 복합체, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 진핵생물 RecA 동족체는 일반적으로 식별된 이 그룹의 제1 구성원의 이름을 떠서 Rad51이라 칭해진다. RecA 대신에 다른 비상동성 재조합효소, 예를 들어, RecT 또는 RecO가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "SSB 단백질" 또는 "SSB"라고도 하는 "단일 가닥 결합 단백질"이라는 용어는, 예를 들어, 조기 어닐링을 방지하도록, 뉴클레아제 분해로부터 단일 가닥 핵산을 보호하도록, 핵산으로부터 이차 구조를 제거하도록, 또는 핵산의 복제를 촉진하도록, 단일 가닥 핵산에 대한 결합 기능을 갖는 임의의 단백질을 지칭하도록 의도된 것이다. 이 용어는, 예를 들어, 국제 생화학 및 분자 생물학 연합의 명명위원회(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology: NC-IUBMB)에 의해 단일 가닥 결합 단백질로서 공식적으로 식별되는 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않도록 의도된 것이다. 예시적인 단일 가닥 결합 단백질은, 예를 들어, 대장균 SSB, T4 gp32, T7 유전자 25 SSB, 파지 phi29 SSB, RB69 박테리오파지 gp32 단백질, 임의의 문으로부터의 임의의 상동성 단백질 또는 단백질 복합체, 또는 이들의 기능적 변이체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "보조 단백질"(accessory protein)이라는 용어는, ssDNA 상에서의 UvsX 필라멘트의 핵 생성을 보조하도록 재조합효소 및 단일 가닥 결합 단백질과 상호작용하는 기능을 갖는 임의의 단백질을 지칭하도록 의도된 것이다. "보조 단백질", "재조합효소 보조 단백질", 및 "재조합효소 헬퍼 단백질"이라는 용어들은 상호교환 가능하게 사용된다. 예시적인 보조 단백질은, T4 UvsY, RB69 박테리오파지 UvsY 단백질, 대장균 RecO, 대장균 RecR, 임의의 문으로부터의 임의의 상동성 단백질 또는 단백질 복합체, 및 이들의 기능적 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "수송"이라는 용어는 유체를 통한 분자의 이동을 의미한다. 이 용어는, 수동 수송, 예컨대, 분자의 농도 구배를 따른 분자의 이동(예를 들어, 수동 확산)을 포함할 수 있다. 이 용어는, 또한, 분자들이 자신의 농도 구배를 따라 또는 자신의 농도 구배에 대항하여 이동할 수 있는 능동 수송을 포함할 수 있다. 따라서, 수송은, 원하는 방향으로 또는 원하는 위치, 예컨대, 증폭 부위로 하나 이상의 분자를 이동시키도록 에너지를 인가하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "속도"라는 용어는, 수송, 증폭, 포획, 또는 다른 화학 프로세스와 관련하여 사용될 때, 화학 동역학 및 생화학 동역학에서의 해당 의미와 일치하도록 의도된 것이다. 2개 프로세스에 대한 속도는, (예를 들어, 포화시) 최대 속도, 정상 상태 전 속도(예를 들어, 평형 전)，운동 속도 상수, 또는 해당 분야에 공지된 다른 측정치와 관련하여 비교될 수 있다. 특정한 예에서, 특정한 프로세스의 속도는 프로세스의 완료에 대한 전체 시간과 관련하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 증폭 속도는 증폭이 완료되는 데 걸린 시간과 관련하여 결정될 수 있다. 그러나, 특정한 프로세스의 속도는 프로세스의 완료에 대한 전체 시간과 관련하여 결정될 필요가 없다.
"및/또는"이라는 용어는 열거된 요소들 중 하나 또는 전부 혹은 열거된 요소들 중 임의의 두 개 이상의 조합을 의미한다.
"바람직한" 및 "바람직하게는"라는 용어들은 특정 상황에서 특정 이익을 제공할 수 있는 본 발명의 구현예를 지칭한다. 그러나, 다른 구현예도 동일하거나 다른 상황에서 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 구현예의 언급은, 다른 구현예가 유용하지 않음을 의미하는 것이 아니며, 본 발명의 범주로부터 다른 구현예를 배제하도록 의도된 것이 아니다.
"포함한다" 및 이의 변형 용어들은, 이들 용어가 발명의 설명 및 청구범위에 존재하는 경우 제한적인 의미를 갖지 않는다.
구현예가 "포함하다", "포함한다", 또는 "포함하는" 등과 함께 본 명세서에 기술되어 있는 경우, "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는"과 관련하여 기술된 다른 유사한 구현예도 제공된다는 점을 이해할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 단수 표현 및 "적어도 하나"는 상호교환 가능하게 사용되고, 하나 또는 하나 초과를 의미한다.
두 개의 핵산 서열의 혼성화와 같은 이벤트가 발생하기에 "적합한" 조건 또는 "적합한" 조건은, 이러한 이벤트가 발생하는 것을 방지하지 않는 조건이다. 따라서, 이들 조건은 이벤트를 허용하고, 향상시키고, 촉진하며, 및/또는 이벤트에 도움이 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조성물, 물품, 또는 핵산과 관련하여 "제공"이라는 것은, 조성물, 물품, 또는 핵산을 제조하거나, 조성물, 물품, 또는 핵산을 구매하거나, 그 외에는 화합물, 조성물, 물품, 또는 핵산을 취득하는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서, 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내의 하위 범위의 모든 수를 포함한다(예를 들어 1 내지 5는, 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다).
본 명세서 전체에 걸쳐 "일 구현예", "구현예", "소정의 구현예", 또는 "일부 구현예" 등에 대한 언급은, 해당 구현예와 관련하여 기술된 특정 특징부, 구성, 조성물, 또는 특징이 본 개시 내용의 적어도 일 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 부분에 존재하는 이러한 표현은 반드시 본 개시 내용의 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징부, 구성, 조성물, 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
개별 단계들을 포함하는 본 명세서에 개시된 임의의 방법의 경우, 단계는 임의의 실행가능한 순서로 수행될 수 있다. 그리고, 적절한 경우, 2개 이상의 단계의 임의의 조합이 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 요약은 개시된 각각의 구현예 또는 본 발명의 모든 구현을 설명하기 위한 것이 아니다. 다음 설명은 예시적인 구현예를 보다 구체적으로 예시한다. 본원 전체에 걸쳐 여러 위치에서, 구현예 목록을 통해 지침이 제공되며, 이러한 구현예는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각 경우에, 언급되는 목록은, 대표 그룹으로서만 기능하며, 배타적 목록으로서 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 예시적인 구현예에 대한 다음의 상세한 설명은 다음의 도면과 함께 읽을 때 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1a와 도 1b는, 어레이의 웰에 부착된 제1 및 제2 포획 서열의 예시적인 일례의 개략도(도 1a), 및 각 말단에 부착된 범용 어댑터를 갖는 표적 핵산의 예시적인 일례의 개략도(도 1b)이다.
도 2는 어레이의 웰에 부착된 제1 포획 핵산 및 표적 핵산의 혼성화된 단일 가닥의 예시적인 일례의 개략도이다.
도 3a는 어댑터들의 개별 및 그룹의 밀도 통과 필터를 도시한다. k/mm2는 제곱 밀리미터당 천이다. 레인은 구현예의 표 2에 표시된 플로우셀의 레인을 나타낸다. 도 3b는 개별 돌연변이 어댑터에 연관된 최종 판독의 비를 도시한다.
도 4a와 도 4b는 가닥 침입 및 복제의 예시적인 예의 개략도를 도시한다("RPA"는 재조합효소 중합효소 증폭을 지칭한다). 도 4a에서, 재조합효소는, 상동성 서열(즉, 일치하는 P7 말단)을 함유하는 이중 가닥 주형 내로 유리 P7 프라이머의 침입을 용이하게 한다. 완벽한 상동성은 필요하지 않지만 (여기서는 P7에 도입된 두 개의 고의적 불일치로 표시되어 있음)，감소된 상동성 어댑터(여기서는 돌연변이 가닥에 대한 작은 화살표로 표시되어 있음)에 의해 침입 및 증폭 속도가 감소될 것이다. 도 4b에서, 양쪽 말단으로부터의 재조합효소 매개 침입은 돌연변이되지 않은 론 프라이머(lawn-primer)로 발생하고 딸 가닥(daughter strand)의 돌연변이를 효과적으로 보정하여, 완전한 어댑터로 다시 변환한다. 그러나 원래 가닥과 론 가닥 간의 상동성이 감소하였으므로, 첫 번째 복제가 발생할 때까지의 시간 지연은 돌연변이의 수와 정도에 비례한다.
도 5a와 도 5b는 증폭 속도에 대한 짧은 및 돌연변이 어댑터 라이브러리들의 효과를 도시한다. 도 5a에서, 성공적인 복제 하나는 각 주형을 완벽한 주형으로 변환한다. 그러나, 해당 전환에 대한 시간 상수는, 극복해야 할 비상동성의 정도에 의존한다(큰 비율은 두꺼운 화살표로 표시된다). 도 5b에서, 짧은 및 돌연변이 어댑터 라이브러리들에서의 느린 증폭 속도는 실시간 증폭 곡선의 오른쪽 시프트에 의해 표시된다.
도 6은 개별 패드에서 클론 우위에 대한 상이한 주형들 간의 경쟁을 예시한다. 시딩된 주형은 증폭 편향(즉, 운동 지연)과 함께 표시되며, 1 = 가장 빠름, 6 = 가장 느림이다. 주형들의 동일한 몰비는 필요하지 않거나 바람직하지도 않는다. 더욱 많은 수의 더욱 빠른 주형이 바람직하다. 그러나, 가장 느린 주형(6)도 패드에 경쟁이 없는 경우 패드를 단일 클론성 클러스터로 채울 수 있다.
개략도는 반드시 축척대로 된 것이 아니다. 도면에 사용된 유사 번호는 유사한 구성요소, 단계 등을 나타낸다. 그러나, 주어진 도면에서 구성요소를 지칭하기 위해 번호를 사용하는 것은 동일한 번호로 라벨링된 다른 도면에서의 구성요소를 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 또한, 구성요소를 참조하기 위해 다른 번호를 사용하는 것이 그 다른 번호가 매겨진 구성요소가 또 다른 번호가 매겨진 구성요소와 같을 수 없거나 유사할 수 없음을 나타내려는 것이 아니다.
본원에서는 서열분석에 사용될 수 있는 단일 클론성 클러스터의 생산을 증가시키는 것과 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 핵산 증폭 방법 및 핵산 서열 결정 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은, (i) 증폭 부위들의 어레이 및 (ii) 복수의 상이한 표적 핵산을 갖는 용액을 포함하는 증폭 시약을 제공하는 단계를 포함한다. 증폭 부위들은 포획 핵산들의 적어도 두 개의 집단을 포함한다. 한 집단인 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함한다. 상이한 표적 핵산들은 3' 말단에 제1 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 일 실시에서, 표적 핵산은 이중 가닥이다. 제1 범용 포획 결합 서열은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 제1 포획 서열에 대해 친화도가 덜하다. 예를 들어, 도 1a에 도시된 바와 같이, 제1 포획 핵산 집단의 핵산(100)은 제1 포획 서열(110)을 포함하며, 여기서 핵산(100)은 증폭 부위(120)의 표면에 부착된다. 도 1b에는, 각 말단에 범용 어댑터(140)를 포함하고 각 범용 어댑터(140)의 3' 말단에 제1 범용 포획 결합 서열(150)을 포함하는 이중 가닥 표적 핵산(130)이 도시되어 있다.
선택적으로, 상이한 표적 핵산들은 5' 말단에 제2 범용 포획 결합 서열도 포함한다. 제2 범용 포획 결합 서열의 보체는, 제2 포획 서열에 대해 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열보다 제2 포획 서열에 대해 친화도가 덜하다. 예를 들어, 도 1a에 도시된 바와 같이, 제2 포획 핵산 집단의 핵산(160)은 제1 포획 서열(170)을 포함하며, 여기서 핵산(160)은 증폭 부위(120)의 표면에 부착된다. 도 1b에는, 각 말단에 범용 어댑터(140)를 포함하고 각 범용 어댑터(140)의 5' 말단에 제2 범용 포획 결합 서열(180)을 포함하는 이중 가닥 표적 핵산(130)이 도시되어 있다.
방법은, 증폭 시약을 반응시켜 용액으로부터 개별 표적 핵산으로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 각각 갖는 복수의 증폭 부위를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 반응은, 상이한 표적 핵산들을 증폭 부위로 수송하고 증폭 부위에서 표적 핵산들을 증폭시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 도 2에 도시된 바와 같이, 제1 포획 핵산 집단의 핵산(200)은 제1 포획 서열(210)을 포함하며, 여기서 핵산(200)은 증폭 부위(220)의 표면에 부착된다. 단일 가닥의 3' 말단에 제1 범용 포획 결합 서열(250)을 포함하는 표적 핵산(230)의 한 가닥은 핵산(200)의 제1 포획 서열(210)에 혼성화된다. 제1 범용 포획 결합 서열(250)은 제1 범용 포획 결합 서열(250)과 제1 포획 서열(210) 간의 불일치의 존재를 나타내는 'X'를 포함한다. 이는, 이어서 예를 들어 브리지 증폭을 통해 클러스터 증폭을 수행할 수 있어서, 클러스터를 생성할 수 있다.
또한, 본원에서는 핵산 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 라이브러리는 본원에 기재된 증폭 방법에 사용될 수 있다. 방법은 복수의 상이한 표적 핵산의 용액을 제공하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 표적 핵산은 이중 가닥이다. 범용 어댑터는 이중 가닥 표적 핵산의 양측 말단에 결찰되어 제1 복수의 변형된 표적 핵산을 형성하고, 여기서 변형된 표적 핵산 각각은, 범용 어댑터가 측면에 있는 표적 핵산을 포함한다. 범용 어댑터는, 이중 가닥 핵산 영역 및 단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥 영역을 포함한다. 단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역은 3' 말단에 제1 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 제1 범용 포획 결합 서열은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 제1 포획 서열에 대해 친화도가 덜하다. 선택적으로, 단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥 영역은 5' 말단에 제2 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 제2 범용 포획 결합 서열의 보체는, 제2 포획 서열에 대해 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열보다 제2 포획 서열에 대해 친화도가 덜하다.
어레이
본원에 기재된 방법에서 사용되는 증폭 부위들의 어레이는 하나 이상의 기판로서 존재할 수 있다. 어레이에 사용될 수 있는 기판 물질의 예시적인 유형은, 유리, 변형된 유리, 기능화된 유리, 무기 유리, 미소구체(예를 들어, 불활성 및/또는 자기 입자)，플라스틱, 다당류, 나일론, 나이트로셀룰로스, 세라믹, 수지, 실리카, 실리카계 물질, 탄소, 금속, 광학 섬유 또는 광학 섬유 다발, 중합체, 및 멀티웰(예를 들어, 미세적정) 플레이트를 포함한다. 예시적인 플라스틱은, 아크릴, 폴리스티렌, 스티렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 및 TeflonTM을 포함한다. 예시적인 실리카계 물질은 실리콘 및 변형된 실리콘의 다양한 형태를 포함한다.
특정한 구현예에서, 기판은, 용기, 예컨대, 웰, 튜브, 채널, 큐벳, 페트리 플레이트, 병 등 내에 있거나 그 일부일 수 있다. 특히 유용한 용기는, 예를 들어, 미국 특허번호 제8,241,573호 또는 문헌(Bentley et al, Nature 456:53-59 (2008))에 기재된 바와 같은 플로우셀이다. 예시적인 플로우셀은, Illumina, Inc(캘리포니아주 샌디에고)에 의해 시판되는 것이다. 특히 유용한 다른 용기는 멀티웰 플레이트 또는 미세적정 플레이트에서의 웰이다.
일부 구현예에서, 어레이의 부위는 표면 상의 특징부로서 구성될 수 있다. 특징부는 임의의 다양한 원하는 포맷으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 부위는 웰, 피트(pit), 채널, 리지, 융기 영역, 못(peg), 기둥(post) 등일 수 있다. 전술한 바와 같이, 부위는 비드를 함유할 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 부위는 비드 또는 입자를 함유할 필요가 없다. 예시적인 부위는, 454 LifeSciences(Roche(스위스 바젤)의 자회사) 또는 Ion Torrent(Life Technologies(캘리포니아주 칼스배드)의 자회사)에 의해 판매되는 상업용 서열분석 플랫폼에 사용되는 기판에 존재하는 웰을 포함한다. 웰을 갖는 다른 기판은, 예를 들어, 미국 특허 제6,266,459호; 미국 특허 제6,355,431호; 미국 특허 제6,770,441호; 미국 특허 제6,859,570호; 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호; 미국 특허 제6,274,320호; 미국 특허 제8,262,900호; 미국 특허 제7,948,015호; 미국 특허 공보 제2010/0137143호; 미국 특허 제8,349,167호, 또는 PCT 공보 WO 제00/63437호에 기재된 에칭된 광학 섬유 및 다른 기판을 포함한다. 일부 예에서, 기판은, 웰에서 비드를 사용하는 응용분야에 대해 이들 참조문헌에 예시되어 있다. 웰 함유 기판은, 본 개시 내용의 방법 또는 조성물에서 비드와 함께 또는 비드 없이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 기판의 웰은, 미국 특허 제9,512,422호에 기재된 바와 같은 (비드를 갖는 또는 비드가 없는) 젤 물질을 포함할 수 있다.
어레이의 부위는, 비금속 표면, 예컨대, 유리, 플라스틱, 또는 상기 예시된 다른 물질 상의 금속 특징부일 수 있다. 금속 층은, 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대, 습식 플라스마 에칭, 건식 플라스마 에칭, 원자 층 증착, 이온 빔 에칭, 화학 기상 증착, 진공 스퍼터링 등을 이용하여 표면 상에 증착될 수 있다. 예를 들어, FlexAL® OpAL® Ionfab 300plus®, 또는 Optofab®3000 시스템(Oxford Instruments(영국))을 포함하는 임의의 다양한 상업용 기구를 적절히 사용할 수 있다. 금속 층은, 또한, 문헌(Thornton, Ann Rev Mater Sci 7:239-60(1977))에 기재된 바와 같이 e-빔 증발 또는 스퍼터링에 의해 증착될 수 있다. 금속 층 증착 기술, 예컨대, 상기 예시된 것은, 표면 상에 금속 영역 또는 패치를 생성하도록 포토리소그래피 기술과 조합될 수 있다. 금속 층 증착 기술과 포토리소그래피 기술을 조합하기 위한 예시적인 방법은 미국 특허 제8,778,848호 및 미국 특허 제8,895,249호에 제공된다.
특징부들의 어레이는 패치들 또는 스팟들의 그리드(grid)로서 나타날 수 있다. 특징부는 반복 패턴으로 또는 불규칙적인 비-반복 패턴으로 위치할 수 있다. 특히 유용한 패턴은, 육각형 패턴, 직선 패턴, 그리드 패턴, 반사 대칭을 갖는 패턴, 회전 대칭을 갖는 패턴 등이다. 비대칭 패턴도 유용할 수 있다. 피치는 최근접 이웃 특징부들의 상이한 쌍들 간에 동일할 수 있거나 피치는 최근접 이웃 특징부들의 상이한 쌍들 간에 가변될 수 있다. 특정한 구현예에서, 어레이의 특징부들 각각은, 약 100 nm2, 250 nm2, 500 nm2, 1 μm2, 2.5 μm2, 5 μm2, 10 μm2, 100 μm2, 또는 500 μm2를 초과하는 면적을 가질 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 어레이의 특징부들 각각은, 약 1 mm2, 500 μm2, 100 μm2, 25 μm2, 10 μm2, 5 μm2, 1 μm2, 500 nm2, 또는 100 nm2 미만인 면적을 가질 수 있다. 실제로, 영역은, 상기 예시된 것으로부터 선택되는 상한과 하한 사이의 범위에 있는 크기를 가질 수 있다.
표면 상의 특징부들의 어레이를 포함하는 구현예에 대해, 특징부들은 개재성 영역들에 의해 분리되어 개별적일 수 있다. 특징부의 크기 및/또는 영역 사이의 간격은 가변될 수 있어서, 어레이는 고 밀도, 중간 밀도, 또는 저 밀도일 수 있다. 고 밀도 어레이는 약 15 μm 미만만큼 분리된 영역을 갖는 것을 특징으로 한다. 중간 밀도 어레이는 약 15 내지 약 30 μm만큼 분리된 영역을 갖는 한편, 저 밀도 어레이는 30 μm 초과만큼 분리된 영역을 갖는다. 본 개시 내용에서 유용한 어레이는, 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 1 μm, 또는 약 0.5 μm 미만만큼 분리된 영역을 가질 수 있다.
특정한 구현예에서, 어레이는 비드들 또는 다른 입자들의 집합을 포함할 수 있다. 입자들은, 용액 중에 현탁될 수 있거나, 기판의 표면 상에 위치할 수 있다. 용액 중의 비드 어레이의 예는 Luminex(텍사스주 오스틴)에 의해 상업화된 것이다. 표면 상에 위치하는 비드들을 갖는 어레이의 예는, 비드가 웰에 위치하는 것, 예컨대, BeadChip 어레이(Illumina Inc.(캘리포니아주 샌디에고)), 또는 454 LifeSciences(Roche(스위스 바젤)의 자회사) 또는 Ion Torrent(Life Technologies(캘리포니아주 칼스배드)의 자회사)로부터의 서열분석 플랫폼에서 사용되는 기판을 포함한다. 표면 상에 위치하는 비드들을 갖는 다른 어레이는, 미국 특허 제6,266,459호; 미국 특허 제6,355,431호; 미국 특허 제6,770,441호; 미국 특허 제6,859,570호; 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호; 미국 특허 제6,274,320호; 미국 특허 공보 제2009/0026082호 A1; 미국 특허 공보 제2009/0127589호 A1; 미국 특허 공보 제2010/0137143호 A1; 미국 특허 공보 제2010/0282617호 A1 또는 PCT 공보 WO 제00/63437호에 기재되어 있다. 상술한 참조문헌 중 몇몇은, 어레이 기판에서의 또는 어레이 기판 상의 비드들의 로딩 전에 표적 핵산을 비드에 부착하기 위한 방법을 기재한다. 그러나, 비드가 증폭 프라이머를 포함하도록 제조될 수 있고, 이어서 비드를 사용하여 어레이를 로딩할 수 있으며, 이에 따라 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 증폭 부위를 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에서 전술한 바와 같이, 기판은 비드 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 증폭 프라이머는 직접적으로 웰에 또는 웰 내의 젤 재료에 부착될 수 있다. 따라서, 참조 문헌들은, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하도록 변형될 수 있는 물질, 조성물, 또는 장치를 예시한다.
어레이의 증폭 부위들은, 표적 핵산에 결합할 수 있는 복수의 포획제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 포획제는 포획 핵산을 포함한다. 서열분석을 위해 어레이를 준비하는 데 사용되는 전형적인 조건에서, 포획 핵산의 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 포획 핵산의 서열에 대하여 상보적이다. 대조적으로, 본 개시 내용의 포획 핵산의 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 표적 핵산의 서열에 대하여 완전하게 상보적인 것은 아니다. 본 개시 내용에 제시된 방법에 유용한 포획 핵산의 뉴클레오티드 서열을 여기서 상세히 설명한다. 일부 구현예에서, 포획 핵산은, 또한, (범용 서열을 함유하든 또는 아니든) 표적 핵산 증폭을 위한 프라이머로서 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 핵산의 한 집단은 P5 프라이머 또는 이의 보체를 포함하고, 포획 핵산의 제2 집단은 P7 프라이머 또는 이의 보체를 포함한다.
특정 구현예에서, 포획제, 예컨대, 포획 핵산은 증폭 부위에 부착될 수 있다. 예를 들어, 포획제는 어레이의 특징부의 표면에 부착될 수 있다. 부착은 중간 구조물, 예컨대, 비드, 입자 또는 젤을 통해서일 수 있다. 젤을 통한 어레이에 대한 포획 핵산의 부착은, 미국 특허 제8,895,249호에 기재되어 있으며, 또한, Illumina Inc.(캘리포니아주 샌디에고)로부터 시판되는 플로우셀에 의해 예시되어 있거나 WO 제2008/093098호에 기재되어 있다. 본원에 기재된 방법 및 장치에서 사용될 수 있는 예시적인 젤은, 콜로이드 구조, 예컨대, 아가로스; 중합체 메시 구조, 예컨대, 젤라틴; 또는 가교결합된 중합체 구조, 예컨대, 폴리아크릴아미드, SFA(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2011/0059865호 A1 참조) 또는 PAZAM(예를 들어, 미국 가특허 출원 시리즈 번호 제61/753,833호 및 미국 특허 제9,012,022호 참조)를 갖는 것을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 비드를 통한 부착은, 본원에서 전술한 설명 및 인용 문헌에 예시된 바와 같이 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 어레이 기판의 표면 상의 특징부들은 표면의 개재성 영역들에 의해 분리되어 인접하지 않는다. 어레이의 특징부들에 비해 상당히 적은 양 또는 농도의 포획제를 갖는 개재성 영역들이 유리하다. 포획제가 없는 개재성 영역이 특히 유리하다. 예를 들어, 개재성 영역에서의 포획 모이어티의 비교적 적은 양 또는 부재는, 표적 핵산과 후속 생성되는 클러스터의 원하는 특징부로의 국부화를 선호한다. 특정한 구현예에서, 특징부는 표면에서의 오목한 특징부(예를 들어, 웰)일 수 있고, 특징부는 젤 물질을 함유할 수 있다. 젤 함유 특징부들은, 젤이 실질적으로 없거나, 또는 존재한다면 젤이 핵산의 국부화를 실질적으로 지지할 수 없는 표면 상의 개재성 영역들에 의해 서로 분리될 수 있다. 젤 함유 특징부, 예컨대, 웰을 갖는 기판을 제조하고 사용하기 위한 방법 및 조성물은 미국 특허 제9,512,422호에 기재되어 있다.
표적 핵산
본원에 기재된 방법에서 사용되는 증폭 시약의 용액은 표적 핵산을 포함한다. "표적 핵산", "표적 단편", "표적 핵산 단편", "표적 분자", 및 "표적 핵산 분자"라는 용어들은, 예컨대 어레이 상에 서열분석화하는 것이 바람직한 핵산 분자를 지칭하도록 상호교환 가능하게 사용된다. 표적 핵산은 본질적으로 알려진 또는 알려지지 않은 서열의 임의의 핵산일 수 있다. 이것은, 예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA의 단편일 수 있다. 서열분석은 표적 분자의 전체 또는 일부의 서열을 결정할 수 있다. 표적은 무작위로 단편화된 일차 핵산 샘플로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 표적은, 범용 증폭 서열, 예를 들어, 범용 어댑터에 존재하는 서열을 각 표적 단편의 말단에 배치함으로써 증폭에 적합한 주형으로 처리될 수 있다.
일차 핵산 샘플은, 샘플로부터의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 형태(예를 들어, 게놈 DNA 단편, PCR 및 증폭 산물 등)에서 유래될 수 있거나 샘플로부터 단일 가닥 형태로 DNA 또는 RNA로서 유래되었을 수 있고 dsDNA 형태로 전환되었을 수 있다. 예를 들어, mRNA 분자는, 당업계에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 이중 가닥 cDNA로 복제될 수 있다. 일차 핵산 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드 분자의 정확한 서열은, 일반적으로 본 개시 내용에서 중요하지 않으며, 알려지거나 알려지지 않았을 수 있다.
일 구현예에서, 일차 핵산 샘플로부터의 일차 폴리뉴클레오티드 분자는 DNA 분자이다. 보다 구체적으로, 일차 폴리뉴클레오티드 분자는, 유기체의 전체 유전적 보체를 나타내며, 인트론과 엑손 서열 뿐만 아니라 프로모터와 인핸서 서열 등의 비코딩 조절 서열을 포함하는 게놈 DNA 분자이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 게놈 DNA의 특정한 하위세트, 예를 들어, 특정 염색체가 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 일차 폴리뉴클레오티드 분자의 서열은 알려져 있지 않다. 더욱 구체적으로, 일차 폴리뉴클레오티드 분자는 인간 게놈 DNA 분자이다. DNA 표적 단편은, 임의의 랜덤한 단편화 프로세스 전에 또는 후에, 및 범용 어댑터 서열의 결찰 전에 또는 후에, 화학적으로 또는 효소적으로 처리될 수 있다.
핵산 샘플은 게놈 DNA(gDNA)와 같은 고 분자량 물질을 포함할 수 있다. 샘플은, FFPE 또는 보관된 DNA 샘플로부터 취득되는 핵산 분자와 같은 저 분자량 물질을 포함할 수 있다. 다른 일 구현예에서, 저 분자량 물질은 효소적으로 또는 기계적으로 단편화된 DNA를 포함한다. 샘플에는 무 세포(cell-free) 순환 DNA가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은, 생검, 종양, 스크래핑, 면봉, 혈액, 점액, 소변, 혈장, 정액, 모발, 레이저 포획 미세 절제, 외과적 절제, 및 기타 임상적 또는 실험실 취득 샘플로부터 취득되는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 역학적, 농업적, 법의학적, 또는 병원성 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은, 인간 또는 포유동물 공급원과 같은 동물로부터 취득되는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 다른 일 구현예에서, 샘플은, 식물, 박테리아, 바이러스, 또는 진균과 같은 비포유류 공급원으로부터 취득되는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자의 공급원은 보관된 또는 멸종된 샘플 또는 종일 수 있다.
또한, 본원에 개시된 방법 및 조성물은, 법의학적 샘플로부터의 분해된 및/또는 단편화된 게놈 DNA와 같은 저 품질 핵산 분자를 갖는 핵산 샘플을 증폭하는 데 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 법의학적 샘플은, 범죄 현장에서 취득되는 핵산, 실종자 DNA 데이터베이스로부터 취득되는 핵산, 법의학적 조사에 연관된 실험실로부터 취득되는 핵산을 포함할 수 있고, 또는 법 집행 기관, 하나 이상의 군 기관, 또는 임의의 이러한 직원에 의해 취득되는 법의학적 샘플을 포함할 수 있다. 핵산 샘플은, 정제된 샘플, 예를 들어, 타액, 혈액, 또는 기타 체액으로 함침될 수 있는 협측 면봉, 종이, 직물, 또는 기타 기판로부터 유래된 용해물을 포함하는 미정제 DNA일 수 있다. 이처럼, 일부 구현예에서, 핵산 샘플은 게놈 DNA와 같은 DNA의 소량 또는 단편화된 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은, 혈액, 가래, 혈장, 정액, 소변, 및 혈청을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 체액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 모발, 피부, 조직 샘플, 부검, 또는 희생자의 유골로부터 취득될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 핵산은 사망한 동물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은, 미생물, 식물, 또는 곤충학적 DNA와 같은 비인간 DNA로부터 취득되는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열 또는 증폭된 표적 서열은 인간 확인의 목적으로 지향된다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은 일반적으로 법의학적 샘플의 특성을 식별하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용은, 일반적으로 본원에 개시된 하나 이상의 표적 특이적 프라이머, 또는 본원에 개략된 프라이머 설계 기준을 사용하여 설계된 하나 이상의 표적 특이적 프라이머를 사용하는 인간 식별 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 법의학적 또는 인간 식별 샘플은, 본원에 개시된 표적 특이적 프라이머들 중 임의의 하나 이상을 사용하거나 본원에 개략된 프라이머 기준을 사용하여 증폭될 수 있다.
생물학적 샘플의 공급원의 비제한적인 추가 예에는, 전체 유기체 및 환자로부터 취득되는 샘플이 포함될 수 있다. 생물학적 샘플은, 임의의 생물학적 유체 또는 조직으로부터 취득될 수 있으며, 액체 유체 및 조직, 고체 조직, 및 건조, 냉동, 및 고정 형태와 같은 보존된 형태를 포함한 다양한 형태일 수 있다. 샘플은 생물학적 조직, 세포, 또는 유체일 수 있다. 이러한 샘플은, 가래, 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 세포(예를 들어, 백혈구)，복수액, 소변, 타액, 눈물, 가래, 질액(방출), 의료 시술 중에 취득되는 세척물(예를 들어, 생검, 내시경, 또는 수술 중에 취득되는 골반 또는 기타 세척물)，조직, 유두 흡인물, 코어 또는 미세 바늘 생검 샘플, 세포 함유 체액, 자유 부동 핵산, 복막액, 흉막액, 또는 이들로부터의 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 샘플은, 또한, 조직학적 목적을 위해 취해진 냉동된 또는 고정된 섹션 등의 조직의 섹션 또는 미세 해부된 세포 또는 이의 세포외 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은, 예를 들어, 전혈 샘플과 같은 혈액 샘플일 수 있다. 또 다른 예에서, 샘플은 처리되지 않은 건조된 혈반(DBS) 샘플이다. 또 다른 예에서, 샘플은 포르말린 고정된 파라핀 포매(FFPE) 샘플이다. 또 다른 예에서, 샘플은 타액 샘플이다. 또 다른 예에서, 샘플은 건조된 타액 반점(DSS) 샘플이다.
표적 핵산이 유래될 수 있는 예시적인 생물학적 샘플은, 진핵 생물, 예를 들어, 포유류, 예컨대, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 유제류, 말, 양, 돼지, 염소, 소, 고양이, 개, 영장류, 인간 또는 비인간 영장류; 식물, 예컨대, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 옥수수, 수수, 귀리, 밀, 쌀, 카놀라 또는 대두; 조류, 예컨대, 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii); 선충, 예컨대, 카이노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans); 곤충, 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 모기, 과실 파리, 꿀벌 또는 거미; 어류, 예컨대, 제브라피시; 파충류; 양서류, 예컨대, 개구리 또는 제노푸스 래비스(Xenopus laevis); 딕티오스텔륨 디스코이듐(dictyostelium discoideum); 진균, 예컨대, 뉴모시스티스 카리니(pneumocystis carinii), 타키푸구 루브리페스(Takifugu rubripes), 효모, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharamoyces cerevisiae) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 또는 플라스모듐 팔시파룸(plasmodiwn falciparum)으로부터의 것을 포함한다. 표적 핵산은, 또한, 원핵 생물, 예컨대, 박테리아, 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 또는 마이코플라스마 뉴모니아에(mycoplasma pneurnomae); 고세균; 바이러스, 예컨대, C형 간염 바이러스 또는 인간 면역곁핍 바이러스; 또는 비로이드로부터 유래될 수 있다. 표적 핵산은, 상기 유기체들의 균일한 배양물 또는 집단으로부터, 또는 대안으로 예를 들어 지역 사회 또는 생태계에서의 몇몇 상이한 유기체의 집합으로부터 유래될 수 있다.
무작위 단편화는, 효소적, 화학적, 또는 기계적 수단에 의한 비정렬된 방식의 일차 핵산 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드 분자의 단편화를 지칭한다. 이러한 단편화 방법은, 해당 분야에 알려져 있으며, 표준 방법을 사용한다(Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition). 일 구현예에서, 단편화는 태그먼트화(tagmentation)라고도 칭하는 프로세스를 사용하여 달성될 수 있다. 태그먼트화는, 트랜스포솜 복합체를 사용하고 단일 단계 단편화 및 결찰로 조합하여 범용 어댑터를 추가한다(Gunderson et al., WO 2016/130704). 명확성을 위하여, 이러한 작은 단편의 특이적 PCR 증폭을 통해 큰 조각의 핵산의 작은 단편을 생성하는 것은, 큰 조각의 핵산 서열이 온전하게 유지되기 때문에(즉, PCR 증폭에 의해 단편화되지 않기 때문에)， 큰 조각의 핵산의 단편화와 동등하지 않다. 더욱이, 무작위 단편화는, 파단부를 포함하고/하거나 파단부를 둘러싸는 뉴클레오티드들의 서열 동일성 또는 위치와 관계없이 단편을 생성하도록 설계된다. 더욱 구체적으로, 무작위 단편화는, 기계적 수단, 예컨대 분무화 또는 초음파 분해에 의해 이루어져, 약 50개 염기쌍 길이 내지 약 1500개 염기쌍 길이, 더욱 구체적으로는 50개 내지 700개 염기쌍 길이, 더욱 구체적으로는 50개 내지 400개 염기쌍 길이의 단편을 생성한다. 가장 구체적으로, 상기 방법을 사용하여 50개 내지 150개 염기쌍 길이의 작은 단편을 생성한다.
기계적 수단(예를 들어, 분무화, 초음파 분해, 및/또는 하이드로전단(Hydroshear))에 의한 폴리뉴클레오티드 분자의 단편화는, 블런트(blunt) 및 3'- 및 5'-돌출된 말단의 불균질 혼합을 갖는 단편을 초래한다. 따라서, 예를 들어, 클로닝 벡터의 블런트 부위에 삽입하기에 최적인 말단을 생성하도록 당업계에 공지된 방법 또는 키트(예를 들어, Lucigen DNA 종결자 말단 복구 키트)를 사용하여 단편 말단을 복구하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 핵산의 집단의 단편 말단은 블런트 말단이다. 더욱 구체적으로, 단편 말단은 블런트 말단이며 인산화된다. 포스페이트 모이어티는, 효소적 처리를 통해, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 도입될 수 있다.
표적 핵산 또는 이의 앰플리콘의 집단은, 본원에 기재된 방법 또는 조성물의 특정 적용에 대하여 필요하거나 적절한 평균 가닥 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 평균 가닥 길이는, 약 100,000개의 뉴클레오티드, 50,000개의 뉴클레오티드, 10,000개의 뉴클레오티드, 5,000개의 뉴클레오티드, 1,000개의 뉴클레오티드, 500개의 뉴클레오티드, 100개의 뉴클레오티드, 또는 50개의 뉴클레오티드 미만일 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 평균 가닥 길이는, 약 10개의 뉴클레오티드, 50개의 뉴클레오티드, 100개의 뉴클레오티드, 500개의 뉴클레오티드, 1,000개의 뉴클레오티드, 5,000개의 뉴클레오티드, 10,000개의 뉴클레오티드, 50,000개의 뉴클레오티드, 또는 100,000개의 뉴클레오티드 초과일 수 있다. 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘의 집단에 대한 평균 가닥 길이는 상술한 최대값과 최소값 사이의 범위에 있을 수 있다. 증폭 부위에서 생성된(또는 다르게는 본원에서 제조되거나 사용된) 앰플리콘은 상기에서 예시된 것으로부터 선택된 상한과 하한 사이의 범위에 있는 평균 가닥 길이를 가질 수 있음을 이해할 것이다.
일부 경우에, 표적 핵산의 집단은, 표적 핵산의 구성원에 대한 최대 길이를 갖는 조건 하에 생성될 수 있으며 또는 그렇지 않으면 그러한 최대 길이를 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법의 하나 이상의 단계에서 사용되거나 특정한 조성물에 존재하는 구성원에 대한 최대 길이는, 100,000개의 뉴클레오티드, 50,000개의 뉴클레오티드, 10,000개의 뉴클레오티드, 5,000개의 뉴클레오티드, 1,000개의 뉴클레오티드, 500개의 뉴클레오티드, 100개의 뉴클레오티드, 또는 50개의 뉴클레오티드 미만일 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘의 집단은, 해당 구성원에 대한 최소 길이를 갖는 조건에서 생성될 수 있고 또는 그렇지 않으면 그러한 최소 길이를 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법의 하나 이상의 단계에서 사용되거나 특정한 조성물에 존재하는 구성원에 대한 최소 길이는, 10개의 뉴클레오티드, 50개의 뉴클레오티드, 100개의 뉴클레오티드, 500개의 뉴클레오티드, 1,000개의 뉴클레오티드, 5,000개의 뉴클레오티드, 10,000개의 뉴클레오티드, 50,000개의 뉴클레오티드, 또는 100,000개의 뉴클레오티드를 초과할 수 있다. 집단에서의 표적 핵산에 대한 최대 및 최소 가닥 길이는 상기 기재된 최대값과 최소값 사이의 범위에 있을 수 있다. 증폭 부위에서 생성된(또는 달리 본원에서 제조되거나 사용된) 앰플리콘은 상기 예시된 상한값과 하한값 사이의 범위에 있는 최대 및/또는 최소 가닥 길이를 가질 수 있음을 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 표적 핵산은, 예를 들어, 배제 증폭을 촉진하도록 증폭 부위의 영역에 대해 사이징된다. 예를 들어, 어레이의 각 부위에 대한 영역은, 배제 증폭을 달성하도록 표적 핵산의 배제된 용적의 직경보다 클 수 있다. 예를 들어, 표면 상의 특징부들의 어레이를 사용하는 구현예를 예로 들면, 각 특징부에 대한 영역은 증폭 부위로 수송되는 표적 핵산의 배제된 용적의 직경보다 클 수 있다. 표적 핵산에 대한 배제된 용적 및 그 직경은, 예를 들어, 표적 핵산의 길이로부터 결정될 수 있다. 핵산의 배제된 용적 및 배제된 용적의 직경을 결정하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,785,790호; Rybenkov et al, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5307-5311 (1993); Zimmerman et al, J Mol Biol 222:599-620 (1991); 또는 Sobel et al, Biopolymers 31:1559-1564 (1991)에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 표적 단편 서열은, 소정 유형의 DNA 중합효소, 예컨대, Taq 중합효소 또는 클레노브 엑소 마이너스(Klenow exo minus) 중합효소(이것은 단일 데옥시뉴클레오티드, 예를 들어, 데옥시아데노신 (A)를 DNA 분자, 예를 들어, PCR 산물의 3' 말단에 추가하는 비-주형-의존성 말단 트랜스퍼라제 활성을 가짐)의 활성에 의해 단일 오버행 뉴클레오티드를 사용하여 제조된다. 이러한 효소를 사용하여 단일 뉴클레오티드 'A'를 이중 가닥 표적 단편의 각각의 가닥의 블런트 말단형 3' 말단에 추가할 수 있다. 따라서, 'A'는 Taq 또는 클레노브 엑소 마이너스 중합효소를 사용한 반응에 의해 이중 가닥 표적 단편의 각각의 가닥의 3' 말단에 추가될 수 있는 반면, 범용 어댑터 폴리뉴클레오티드 구조체는, 범용 어댑터의 이중 가닥 핵산의 각 영역의 3' 말단 상에 존재하는 호환성 있는 'T' 오버행이 있는 T-구조체일 수 있다. 이러한 단부 변형은, 또한, 결합된 결찰된 어댑터-표적-어댑터 분자들의 형성으로의 편향이 존재하도록 벡터와 표적 모두의 자가 결찰을 방지한다.
일부 경우에, 이러한 소스로부터 유래되는 표적 핵산은 본원에서의 방법 또는 조성물에서 사용되기 전에 증폭될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR), 회전 환증폭(RCA), 다중 변위 증폭(MDA) 또는 무작위 프라임 증폭(random prime amplification: RPA)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 다양한 공지된 증폭 기술을 이용할 수 있다. 본원에 기재된 방법 또는 조성물에서 사용하기 전의 표적 핵산의 증폭은 선택적인 것임을 이해할 것이다. 이처럼, 표적 핵산은, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서 사용되기 전에 증폭되지 않을 것이다. 표적 핵산은 합성 라이브러리로부터 선택적으로 유래될 수 있다. 합성 핵산은, 천연 DNA 또는 RNA 조성물을 가질 수 있거나, 이의 유사체일 수 있다.
범용 어댑터
본원에 기재된 방법 또는 조성물에 사용되는 표적 핵산은 각 말단에 부착된 범용 어댑터를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 표적 핵산의 각 말단에 범용 어댑터를 부착하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 부착은, 결찰을 사용하는 표준 라이브러리 제조 기술(Chesney et al. U.S. Pat. Pub. No. 2018/0305753 A1)을 통해 또는 트랜스포사제 복합체를 사용한 태그먼트화(Gunderson et al., WO 2016/130704)를 통해 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 샘플, 예를 들어, 단편화된 샘플로부터의 이중 가닥 표적 핵산은, 먼저 동일한 범용 어댑터 분자('불일치 어댑터' 이것의 일반적인 특징은 아래에 정의되며 Gormley et al., US 7,741,463, 및 Bignell et al., US 8,053,192에서 추가로 설명됨)를 (알려진, 부분적으로 알려진, 또는 알려지지 않은 서열을 가질 수 있는) 이중 가닥 표적 핵산의 5' 및 3' 말단에 결찰함으로써, 처리된다. 일 구현예에서, 범용 어댑터는, 후속 서열분석을 위해 어레이 상에 표적 핵산을 고정하는 데 필요한 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 다른 일 구현예에서, PCR 단계는, 고정화 및 서열분석 전에 표적 핵산의 각 말단에 존재하는 범용 어댑터를 추가로 변형하는 데 사용된다. 예를 들어, 초기 프라이머 연장 반응은, 각각의 개별 표적 핵산의 양측 가닥에 대하여 상보적인 연장 산물이 형성되고 범용 포획 결합 서열을 추가하는 범용 프라이머 결합 부위를 사용하여 수행된다. 생성된 프라이머 연장 산물 및 선택적으로 증폭된 이의 복제는, 고정된 다음 서열분석될 수 있는 변형된 표적 핵산 라이브러리를 집합적으로 제공한다. 라이브러리라는 용어는, 알려진 공통 서열을 3' 및 5' 말단에서 함유하는 표적 핵산의 집합을 지칭하며, 3' 및 5' 변형된 라이브러리라고도 할 수 있다. 표적 핵산에 부착된 범용 어댑터의 3' 말단 및 선택적으로 5' 말단은, 본원에 기재된 범용 포획 결합 서열의 동종 집단 또는 이종 집단을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 방법에 사용되는 범용 어댑터는, 본원에 상세히 설명되는 바와 같이, 어댑터가 서열 불일치 영역을 포함하기 때문에, 즉, 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥의 어닐링에 의해 형성되지 않기 때문에 '불일치' 어댑터라고 한다.
본원에서 사용하기 위한 불일치 어댑터는, 두 개의 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥이 어닐링될 때, 이중 가닥 핵산 영역이라고도 하는 적어도 하나의 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥 영역이라고도 하는 적어도 하나의 미일치 단일 가닥 영역을 제공하도록, 그 두 개의 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥의 어닐링에 의해 형성된다.
범용 어댑터의 '이중 가닥 영역'은, 두 개의 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥의 어닐링에 의해 형성된, 전형적으로 5개 이상의 연속 염기 쌍을 포함하는 짧은 이중 가닥 영역이다. 이 용어는, 두 개의 가닥이 어닐링된 핵산의 이중 가닥 영역을 지칭하며, 임의의 특정한 구조적 입체구조를 의미하지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "이중 가닥"이라는 용어는, 핵산 분자와 관련하여 사용될 때, 핵산 분자의 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합됨을 의미한다. 부분 이중 가닥 핵산은, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합된 뉴클레오티드의 적어도 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 가질 수 있다.
일반적으로, 이중 가닥 영역이 기능 손실 없이 가능한 짧게 되는 것이 유리하다. 이러한 맥락에서, '기능'은, 효소 촉매 핵산 결찰 반응에 대한 표준 반응 조건에서 안정적인 이중체를 형성하는 이중 가닥 영역의 능력을 의미하며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있으며(예를 들어, 효소에 적합한 결찰 완충액에서 4℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서의 배양), 이때, 범용 어댑터를 형성하는 두 개의 가닥은 범용 어댑터를 표적 분자에 결찰하는 동안 부분적으로 어닐링된 상태로 유지된다. 프라이머 연장 또는 PCR 반응의 어닐링 단계에서 전형적으로 사용되는 조건에서 이중 가닥 영역이 안정될 필요는 전혀 없다.
범용 어댑터의 이중 가닥 영역은 전형적으로 결찰에 사용되는 모든 범용 어댑터에서 동일하다. 범용 어댑터가 각 표적 분자의 양측 말단에 결찰되기 때문에, 변형된 표적 핵산에서는, 범용 어댑터의 이중 가닥 영역으로부터 유래되는 상보적 서열이 측면에 위치한다. 이중 가닥 영역이 길수록 이에 따라 변형된 표적 핵산 구조체에서 그로부터 유래되는 상보적 서열이 길수록, 프라이머 연장 및/또는 PCR에 사용되는 어닐링 조건에서 변형된 표적 핵산 구조체가 이러한 내부 자기 상보적 영역에서 접혀 자신에 대하여 염기쌍으로 될 수 있는 가능성이 커진다. 따라서, 일반적으로 이중 가닥 영역은 이 효과를 감소시키기 위해 길이가 20개 이하, 15개 이하, 또는 10개 이하의 염기쌍인 것이 바람직하다. 이중 가닥 영역의 안정성은, 표준 Watson-Crick 염기쌍보다 더 강한 염기쌍을 나타내는 비천연 뉴클레오티드의 포함에 의해 증가될 수 있으며 이에 따라 길이가 잠재적으로 감소될 수 있다.
일 구현예에서, 범용 어댑터의 두 개의 가닥은 이중 가닥 영역에서 100% 상보적이다. 두 개의 가닥이 표준 결찰 조건에서 안정적인 이중체를 형성할 수 있다면, 이중 가닥 영역 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드 불일치가 허용될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용하기 위한 범용 어댑터는, 일반적으로 어댑터의 '결찰가능한' 말단, 예를 들어, 결찰 반응에서 이중 가닥 표적 핵산에 연결되는 말단을 형성하는 이중 가닥 영역을 포함한다. 범용 어댑터의 결찰가능한 말단은 블런트형일 수 있고, 또는 다른 구현예에서, 결찰을 용이하게 하도록/촉진하도록 하나 이상의 뉴클레오티드의 짧은 5' 또는 3' 오버행이 존재할 수 있다. 범용 어댑터의 결찰가능한 말단에 있는 5' 말단 뉴클레오티드는, 표적 폴리뉴클레오티드 상의 3' 히드록실기에 포스포디에스테르 결합을 가능하게 하도록 전형적으로 인산화된다.
'미일치 영역'이라는 용어는, 단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역인 범용 어댑터의 영역을 지칭하며, 여기서 범용 어댑터를 형성하는 두 개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 서열은, 프라이머 연장 또는 PCR 반응을 위한 표준 어닐링 조건에서 두 개의 가닥이 서로에 대해 완전히 어닐링할 수 없는 정도의 비-상보성을 나타낸다. 미일치 영역(들)은 효소 촉매 결찰 반응에 대한 표준 반응 조건에서 어느 정도 어닐링을 나타낼 수 있으며, 단, 두 개의 가닥이 증폭 반응에 있어서 어닐링 조건에서 단일 가닥 형태로 되돌아간다.
'미일치 영역'은, 이중 가닥 영역(들)을 형성하는 동일한 두 개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 상이한 부분들에 의해 제공되는 것으로 이해해야 한다. 어댑터 구조체의 불일치는 한 가닥이 다른 가닥보다 긴 형태를 취할 수 있고, 이때 가닥들 중 한 가닥 상에 단일 가닥 영역이 존재하거나, 두 개의 가닥이 혼성화하지 않고 이에 따라 양측 가닥 상에 단일 가닥 영역을 형성하도록 선택된 서열이 존재한다. 불일치는 또한 '버블'의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 범용 어댑터 구조체(들)의 양측 말단은 서로 혼성화하여 이중체를 형성할 수 있지만, 중앙 영역은 그렇지 않다. 미일치 영역을 형성하는 가닥(들)의 부분은, 동일한 두 개의 가닥의 다른 부분들이 어닐링되어 하나 이상의 이중 가닥 영역을 형성하는 조건에서 어닐링되지 않는다. 의심의 여지를 없애기 위해, 후속적으로 표적 서열에 대한 결찰을 거치는 폴리뉴클레오티드 이중체의 3' 말단에 있는 단일 가닥 또는 단일 염기 오버행은 본 개시 내용의 맥락에서 '미일치 영역'을 구성하지 않는다는 점을 이해해야 한다.
미일치 영역의 길이에 대한 하한은, 전형적으로 기능에 의해, 예를 들어, i) 프라이머 연장, PCR 및/또는 서열분석을 위한 프라이머의 결합(예컨대, 프라이머를 범용 프라이머 결합 부위에 결합)을 위한 또는 ii) 변형된 표적 핵산을 표면에 고정하도록 포획 서열에 대한 범용 포획 결합 서열의 결합을 위한 적절한 서열을 제공할 필요에 의해 결정된다. 이론적으로는, 미일치 영역의 길이에 대한 상한이 없지만, 예외로, 일반적으로 예컨대, 결찰 단계에 후속하여 미결합 범용 어댑터를 변형된 표적 핵산 구조체로부터 분리하는 것을 용이하게 하도록 범용 어댑터의 전체 길이를 최소화하는 것이 유리하다. 따라서, 일반적으로 미일치 영역은 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 또는 25개 미만의 연속 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하다.
단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역은 3' 말단에 적어도 하나의 범용 포획 결합 서열을 포함한다(도 lb, 범용 포획 결합 서열 150 참조). 범용 어댑터의 3' 말단은, 포획 핵산에 존재하는 제1 포획 서열에 혼성화되는 제1 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 예를 들어, 도 2에 도시된 바와 같이, 제1 포획 핵산 집단의 핵산(200)은 제1 포획 서열(210)을 포함한다. 단일 가닥의 3' 말단에 제1 범용 포획 결합 서열(250)을 포함하는 변형된 표적 핵산(230)의 한 가닥은 제1 포획 서열(210)에 혼성화된 것으로 도시된다. 친화도를 감소시키고 웰에 시딩된 표적 핵산으로의 운동 지연을 인코딩하도록 변경되는 것은 제1 범용 포획 결합 서열(250)과 제1 포획 서열(210) 간의 상호작용이다. 표준 ExAmp 방법은, 포획 서열의 전체 길이에 걸쳐 완전히 상보적인 포획 서열 및 범용 포획 결합 서열을 사용한다. 본원에 기술된 ExAmp 방법은, 하나 이상의 불일치를 포함하고, 길이가 감소되고, 또는 이들의 조합을 갖는 범용 포획 결합 서열을 사용한다. 불일치(들) 및/또는 감소된 길이의 결과는, 두 개의 완전히 상보적인 전체 길이 서열의 친화도에 비해 두 개의 서열 간의 감소된 친화도이다. 감소된 친화도는 증폭 효율의 감소를 야기하며, 여기서 결과적인 증폭 효율은 일반적으로 범용 포획 결합 서열과 포획 서열 간의 차이 수의 함수이다.
선택적으로, 범용 어댑터의 5' 말단은 표적 핵산의 각 말단에 부착된 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하며, 여기서 제2 범용 포획 결합 서열은 포획 핵산에 존재하는 제2 포획 서열에 혼성화된다. 예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 범용 포획 결합 서열(180)이 있다. 따라서, 달리 언급되지 않는 한, 범용 포획 결합 서열이 친화도를 감소시키기 위해 어떻게 조정되는지에 대한 다음 논의는 3' 및 5' 범용 포획 결합 서열 모두에 적용된다.
포획 서열의 3' 말단은 본원에 기술된 방법에서 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성의 시작점으로서 기능한다. 당업자는, 포획 서열의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드 및 범용 포획 결합 서열에 있는 상응하는 뉴클레오티드가 DNA 합성을 개시하는 DNA 중합효소의 능력을 보존하도록 상보적이어야한다는 것을 인식할 것이다.
범용 포획 결합 서열은 포획 서열에 대하여 비-상보적인 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열은, 본원에 기술된 증폭 반응에 사용되는 포획 서열에 비해 1개 내지 5개의 불일치 뉴클레오티드(비-상보적 뉴클레오티드라고도 함), 예를 들어, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 5개의 불일치 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 불일치 뉴클레오티드는 워블 불일치 또는 참 불일치일 수 있다.
워블 불일치는, 범용 포획 결합 서열의 집단에서 4개의 뉴클레오티드가 모두 나타나는 위치를 지칭한다. 예를 들어, N이 ACTNGC의 워블 뉴클레오티드이면, 범용 포획 결합 서열의 집단은 ACTTGC, ACTAGC, ACTCGC 및 ACTGGC를 포함하고, 그 집단의 범용 포획 결합 서열의 25%는 포획 서열의 상응하는 뉴클레오티드에 대하여 상보적이다. 일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열은, 본원에 설명된 증폭 반응에 사용되는 포획 서열에 비해, 1개 내지 5개의 워블 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 5개의 워블 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 워블 뉴클레오티드는 범용 포획 결합 서열의 전체에 걸쳐 어디에나 위치할 수 있다.
참 불일치는, 4개의 뉴클레오티드 중 3개만이 범용 포획 결합 서열의 집단의 특정 위치에 나타나는 위치를 지칭한다. 예를 들어, G가 ACTTGC에서 실제 참 불일치 뉴클레오티드의 위치이면, 범용 포획 결합 서열의 집단은 ACTTCC, ACTTTC, 및 ACTTAC를 포함하고, 그 집단의 범용 포획 결합 서열 중 어느 것도, 포획 서열의 상응하는 뉴클레오티드, 이 경우, C에 대하여 비-상보적일 것이다. 일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열은, 본원에 설명되는 증폭 반응에 사용되는 포획 서열에 비해, 1개 내지 5개의 불일치 뉴클레오티드, 예를 들어, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 5개의 워블 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 워블 뉴클레오티드는 범용 포획 결합 서열 전체에 걸쳐 어디에나 위치할 수 있다.
당업자는, 워블 불일치 또는 참 불일치의 사용이 범용 포획 결합 서열의 친화도를 변경하는 더 큰 제어를 제공한다는 것을 인식할 것이다. 단일 워블 뉴클레오티드만을 갖는 범용 포획 결합 서열을 사용함으로써, 그 위치에서 상보성을 갖는 범용 포획 결합 서열의 25%가, 나머지 75%보다 친화도가 크고 나머지 75%보다 증폭 효율이 높을 것으로 예상된다. 하나의 참 불일치 뉴클레오티드만을 갖는 범용 포획 결합 서열을 사용하면, 모든 범용 포획 결합 서열이 그 위치에서 상보성이 없고, 친화도가 감소되고, 감소된 증폭 효율이 예상된다.
다른 일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열은, 전체 길이 범용 포획 결합 서열과 포획 서열 간의 친화도보다 작은 친화도를 초래하는 단축된 길이를 갖는다. 본원에 기술된 표준 증폭 방법에 유용한 포획 서열은, 필요에 따라 더 길거나 더 짧을 수 있지만 전형적으로 약 20개 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 본원에 기술된 방법에 유용한 범용 포획 결합 서열은, 본원에 기재된 증폭 반응에 사용되는 포획 서열보다 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 뉴클레오티드 길이만큼 짧은 길이를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열의 길이는, 제1 범용 포획 결합 서열의 3' 말단 및/또는 제2 범용 포획 결합 서열의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드를 제거함으로써 감소된다.
본원에 기술된 증폭 반응은, 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 사용할 수 있다(예를 들어, 복수의 상이한 표적 핵산은, 3' 말단에 존재하고 선택적으로 5' 말단에 존재하는 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함할 수 있다). 일 구현예에서, 이종 집단은 불일치 뉴클레오티드를 갖는 개별 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 불일치 뉴클레오티드를 갖는다. 불일치 뉴클레오티드는 워블 불일치, 참 불일치, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, 이종 집단은 단축된 길이를 갖는 개별 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 이종 집단은, 본원에 기술된 증폭 반응에 사용되는 포획 서열보다 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개 뉴클레오티드 길이만큼 짧은 길이를 갖는 개별 범용 포획 결합 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 이종 집단은, 하나 이상의 불일치 뉴클레오티드 및 단축된 길이의 조합을 갖는 개별 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 범용 포획 결합 서열에서 누락된 뉴클레오티드의 수 및 불일치 뉴클레오티드의 수는 임의의 조합으로 존재할 수 있으며, 예를 들어, 불일치 뉴클레오티드의 수 및 누락된 뉴클레오티드의 수는 독립적이다.
이종 집단은, 또한, 3' 말단 및 선택적으로 5' 말단에 포획 서열과 100% 상보적인 범용 포획 결합 서열을 갖는 개별 표적 핵산을 포함할 수 있다. 이종 집단에서 상이한 범용 포획 결합 서열의 몰 비는 동일하거나 변경될 수 있다. 몰 비가 동일하지 않은 구현예에서, 높은 증폭 효율을 갖는 범용 포획 결합 서열의 높은 몰 비가 바람직하다. 이에 따라, 이종 집단이 포획 서열과 100% 상보적인 범용 포획 결합 서열을 포함하는 이러한 구현예에서, 100% 상보성을 갖는 범용 포획 결합 서열은 이종 집단의 다른 임의의 구성원보다 큰 비율로 존재할 수 있다.
단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역은 전형적으로 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위도 포함한다. 범용 프라이머 결합 부위는, 범용 어댑터에 결찰된 표적 핵산의 증폭 및/또는 서열분석에 사용될 수 있는 범용 서열이다.
단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역은 적어도 하나의 인덱스도 포함할 수 있다. 인덱스는 어레이 상의 특정 표적 핵산의 공급원의 특징적 마커로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 인덱스는, 라이브러리 제조 단계의 일부로서 표적 핵산에 추가되는 범용 어댑터의 일부인 뉴클레오티드의 합성 서열이다. 이에 따라, 인덱스는 특정 샘플의 각 표적 분자에 부착된 핵산 서열이며, 그 존재는, 표적 분자가 분리된 샘플 또는 공급원을 나타내거나 식별하는 데 사용된다.
바람직하게, 인덱스는, 최대 20개의 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 1개 내지 10개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 4개 내지 8개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 4-뉴클레오티드 인덱스는 동일한 어레이 상에서 256(44)개의 샘플을 다중화할 수 있는 가능성을 제공하는 반면, 6 염기 인덱스는 동일한 어레이 상에서 4,096(46)개의 샘플을 처리할 수 있게 한다.
일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열은, 이중 가닥 표적 단편에 결찰될 때 범용 어댑터의 일부이고, 또 다른 구현예에서, 범용 프라이머 연장 결합 부위는, 범용 어댑터가 이중 가닥 표적 단편에 결찰된 후에 범용 어댑터에 추가된다. 추가는, PCR 기반 방법을 포함하는 일상적인 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
범용 어댑터의 정확한 뉴클레오티드 서열은, 일반적으로 본 발명에서 중요하지 않으며, 예를 들어, 범용 증폭 프라이머 및/또는 서열분석 프라이머의 특정 세트에 대한 범용 포획 결합 서열 및 결합 부위를 제공하기 위해, 원하는 서열 요소들이 궁극적으로 복수의 상이한 변형된 표적 핵산의 공통 서열에 포함되도록 사용자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 라이브러리에서 표적 핵산의 서열분석에 궁극적으로 사용될 서열분석 프라이머에 대한 결합 부위, 또는 예를 들어 고체 지지부 상의 라이브러리의 표적 핵산의 증폭으로부터 유래되는 산물을 제공하기 위해 추가 서열 요소들이 포함될 수 있다.
범용 어댑터의 정확한 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 본 개시 내용으로 한정되지 않지만, 미일치 영역의 개별 가닥의 서열은, 개별 가닥이 표준 어닐링 조건에서 자기-어닐링, 헤어핀 구조의 형성 등을 초래할 수 있는 어떠한 내부 자기-상보성도 나타내지 않도록 해야 한다. 미일치 영역에서의 가닥의 자기 어닐링은, 이 가닥에 대한 증폭 프라이머의 특이적 결합을 방지하거나 감소시킬 수 있으므로 피해야 한다.
불일치 어댑터는, 바람직하게 DNA의 두 개의 가닥으로부터 형성되지만, 포스포디에스테르 및 비-포스포디에스테르 백본 연결의 혼합물에 의해 연결된 천연 및 비천연 뉴클레오티드(예를 들어, 하나 이상의 리보뉴클레오티드)의 혼합물을 포함할 수 있다.
결찰 및 증폭
결찰 방법은 당업계에 공지되어 있으며 표준 방법을 사용한다. 이러한 방법은, DNA 리가제와 같은 리가제 효소를 사용하여, 공유 결합이 형성되도록 이 경우 범용 어댑터와 이중 가닥 표적 핵산의 두 개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 말단 연결에 영향을 주거나 촉매 작용을 한다. 범용 어댑터는, 표적 단편 상에 존재하는 3'-OH에 대한 결찰을 용이하게 하도록 5'-포스페이트 모이어티를 포함할 수 있다. 이중 가닥 표적 핵산은, 전단 프로세스로부터 잔류하거나 효소 처리 단계를 사용하여 추가된 5'-포스페이트 모이어티를 포함하고, 말단 복구되었으며, 오버행잉 염기 또는 염기들에 의해 선택적으로 연장되어 결찰에 적합한 3'-OH를 제공한다. 이러한 맥락에서, 연결은, 이전에 공유적으로 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드 가닥들의 공유 연결을 의미한다. 본 개시 내용의 특정 양태에서, 이러한 연결은 두 개의 폴리뉴클레오티드 가닥 간의 포스포디에스테르 연결의 형성에 의해 발생하지만, 다른 공유 연결 수단(예를 들어, 비-포스포디에스테르 백본 연결)이 사용될 수 있다.
본원에서 설명하는 바와 같이, 일 구현예에서, 결찰에 사용되는 범용 어댑터는, 완전하며, 범용 포획 결합 서열 및 기타 범용 서열, 예를 들어, 범용 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 포함한다. 생성되는 복수의 표적 핵산은 서열분석을 위해 고정된 샘플을 제조하는 데 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 논의된 바와 같이, 일 구현예에서, 결찰에 사용되는 범용 어댑터는, 범용 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 포함하고, 범용 포획 결합 서열을 포함하지 않는다. 생성되는 복수의 변형된 표적 핵산은, 범용 포획 결합 서열과 같은 특정 서열을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 이중 가닥 표적 단편에 결찰된 범용 프라이머에 범용 포획 결합 서열과 같은 특정 서열을 추가하는 방법은, PCR 기반 방법을 포함하며, 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Bignell et al.(US 8,053,192) 및 Gunderson et al.(WO2016/130704)에 기재되어 있다.
범용 어댑터가 변형된 구현예에서는, 증폭 반응을 준비한다. 증폭 반응의 내용은, 당업자에게 공지되어 있으며, 증폭 반응에 필요한 적절한 기판(예를 들어, dNTP), 효소(예를 들어, DNA 중합효소), 및 완충 성분을 포함한다. 일반적으로, 증폭 반응은, 증폭 반응의 각 사이클의 프라이머 어닐링 단계에서 직면하는 조건에서, 증폭될 폴리뉴클레오티드 서열의 일부, 예를 들어, 표적 핵산에 특이적으로 어닐링될 수 있는 '정방향' 및 '역방향' 프라이머(프라이머 올리고뉴클레오티드)로 종종 표시되는 적어도 두 개의 증폭 프라이머를 필요로 한다. 프라이머가 제1 증폭 사이클에서 변형된 표적 핵산에 어닐링되지 않는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 이 서열이 증폭 산물로 복제될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 범용 포획 결합 서열, 즉, 변형된 표적 핵산에 어닐링되지 않는 서열을 갖는 프라이머를 사용하면, 범용 포획 결합 서열이 생성되는 앰플리콘에 혼입될 것이다.
증폭 프라이머는 일반적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 구조이다. 이들은 또한, 천연 및 비천연 염기의 혼합물 및 천연 및 비천연 백본 연결을 포함할 수 있으며, 단, 증폭 반응의 조건 동안 주형 폴리뉴클레오티드 가닥에 대하여 어닐링하고 주형 가닥에 대하여 상보적인 새로운 폴리뉴클레오티드 가닥의 합성을 위한 개시점으로서 기능하는 능력으로서 정의되는 임의의 비천연 변형이 프라이머로서의 기능을 배제하지 않는다. 프라이머는, 또한 변형이 프라이머 기능을 방해하지 않는 경우, 비-뉴클레오티드 화학적 변형, 예를 들어, 엑소뉴클레아제 내성을 증가시키기 위한 포스포로티오에이트를 추가로 포함할 수 있다.
서열분석을 위한 고정된(immobilized) 샘플의 준비
본 개시 내용의 방법은, 증폭 시약(증폭 부위의 어레이 및 복수의 상이한 변형된 표적 핵산)을 반응시켜 부위를 시딩한 개별 표적 핵산으로부터 앰플리콘의 클론 집단을 각각 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 표준 반응에서, 배제 증폭은, 표적 핵산 시딩의 상대적으로 느린 속도(예를 들어, 상대적으로 느린 확산 또는 수송) 대 부위를 핵산 시드의 복제로 부위를 충전하도록 증폭이 발생하는 비교적 빠른 속도로 인해, 발생한다. 본원에 기술된 방법에서, 배제 증폭은, 부위를 시딩한 표적 핵산의 제1 복제의 형성에서의 운동 지연 대 부위를 충전하도록 후속 복제가 만들어지는 비교적 빠른 속도로 인해, 발생할 수 있다. 예를 들어, 개별 부위는, 상이한 범용 포획 결합 서열을 각각 갖는 여러 다른 표적 핵산으로 시딩되었을 수 있다(예를 들어, 다수의 상이한 변형된 표적 핵산은 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함한다). 그러나, 임의의 주어진 표적 핵산에 대한 제1 복제 형성은 그 범용 포획 결합 서열의 증폭 효율에 의존할 것으로 예상되며, 이때, 제1 복제 형성의 평균 속도는 후속 복제가 생성되는 속도에 비해 상대적으로 느리다. 이 경우, 개별 부위가 여러 개의 상이한 표적 핵산으로 시딩되었을 수 있지만, 하나만이 먼저 증폭을 시작하고, 배제 증폭은 전형적으로 해당 표적 핵산만이 증폭 부위를 충전할 수 있게 한다. 보다 구체적으로, 일단 제1 표적 핵산이 증폭을 시작하면, 부위는 이의 복제로 용량이 빠르게 충전되어, 제2 표적 핵산의 복제가 해당 부위에서 만들어지는 것을 방지한다.
일부 구현예에서, 제2 표적 핵산이 부위에서 증폭을 시작하기 전에 증폭 부위가 용량까지 채워지지 않더라도, 명백한 클론형성능을 달성할 수 있다. 일부 조건에서, 제1 표적 핵산의 증폭은, 부위로 수송되는 제2 표적 핵산으로부터의 복제 생성을 효과적으로 능가하거나 압도하도록 충분한 수의 복제가 만들어지는 지점까지 진행될 수 있다. 예를 들어, 직경이 500nm 미만인 원형 특징부에 대하여 브리지 증폭 프로세스를 사용하는 구현예에서, 제1 표적 핵산에 대한 지수 증폭의 14 사이클 후에, 동일한 부위에서의 제2 표적 핵산으로부터의 오염이 Illumina 서열분석 플랫폼에 대한 합성에 의한 서열분석 분석에 악영향을 미치는 오염 앰플리콘의 불충분한 수를 생성한다고 결정되었다.
어레이의 증폭 부위는 모든 구현예에서 완전히 클론성일 필요는 없다. 오히려, 일부 응용 분야에서, 개별 증폭 부위는, 제1 표적 핵산으로부터의 앰플리콘으로 우세하게 채워질 수 있고, 또한, 제2 표적 핵산으로부터의 낮은 수준의 오염 앰플리콘을 가질 수 있다. 어레이는, 오염 수준이 어레이의 후속 사용에 허용할 수 없는 영향을 미치지 않는 한, 낮은 수준의 오염 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이가 검출 응용분야에 사용될 때, 허용가능한 오염 수준은, 검출 기술의 신호 대 잡음 또는 분해능에 허용할 수 없는 방식으로 영향을 주지 않는 수준이다. 이에 따라, 명백한 클론형성능은 일반적으로 본원에 제시된 방법에 의해 만들어진 어레이의 특정 용도 또는 응용분야에 관련될 것이다. 특정 응용분야를 위해 개별 증폭 부위에서 허용될 수 있는 예시적인 오염 수준은, 최대 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 또는 25%의 오염 앰플리콘을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 어레이는 이러한 예시적인 수준의 오염 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어레이의 증폭 부위들 중 최대 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%까지 일부 오염된 앰플리콘이 있을 수 있다.
상이한 속도의 제1 앰플리콘 및 후속 앰플리콘의 형성을 유발하기 위한 차등 활성 프라이머의 사용이, 증폭 전에 표적 핵산이 증폭 부위에 존재하는 구현예에 대해 위에서 예시되었지만, 방법은, 또한, 증폭이 발생함에 따라 표적 핵산이 (예를 들어, 확산을 통해) 증폭 부위로 수송되는 조건에서 수행될 수 있다. 따라서, 배제 증폭은, 상대적으로 느린 수송 속도와 후속 앰플리콘 형성에 비해 상대적으로 느린 제1 앰플리콘 생성을 모두 활용할 수 있다. 따라서, 본원에 제시된 증폭 반응은, 표적 핵산이 (i) 제1 앰플리콘의 생성 및 (ii) 어레이의 다른 부위에서 후속 앰플리콘의 생성과 동시에 용액에서 증폭 부위로 수송되도록 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 증폭 부위에서 후속 앰플리콘이 생성되는 평균 속도는, 표적 핵산이 용액에서 증폭 부위로 수송되는 평균 속도를 초과할 수 있다. 일부 경우에는, 개별 증폭 부위의 단일 표적 핵산으로부터 충분한 수의 앰플리콘이 생성되어, 각 증폭 부위의 용량을 채울 수 있다. 각 증폭 부위의 용량을 채우기 위해 앰플리콘이 생성되는 속도는, 예를 들어, 개별 표적 핵산이 용액에서 증폭 부위로 수송되는 속도를 초과할 수 있다.
본원에 제시된 방법에서 사용되는 증폭 시약은, 바람직하게 증폭 부위에서 표적 핵산의 복제를 신속하게 만들 수 있다. 전형적으로, 본 개시 내용의 방법에 사용되는 증폭 시약은 중합효소 및 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP)를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 다양한 중합효소가 사용될 수 있지만, 일부 구현예에서, 엑소뉴클레아제 음성인 중합효소를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. NTP는, DNA 복제가 만들어지는 구현예의 경우 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)일 수 있다. 전형적으로, 4개의 천연 종인 dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP가 DNA 증폭 시약에 존재하지만, 필요한 경우 유사체를 사용할 수 있다. NTP는, RNA 복제가 만들어지는 구현예의 경우 리보뉴클레오티드 트리포스페이트(rNTP)일 수 있다. 전형적으로, 4개의 천연 종인 rATP, rUTP, rGTP, 및 rCTP가 RNA 증폭 시약에 존재하지만, 필요한 경우 유사체를 사용할 수 있다.
증폭 시약은, 앰플리콘 형성을 용이하게 하고 일부 경우에는 앰플리콘 형성 속도를 증가시키는 추가 성분을 포함할 수 있다. 일례로는 재조합효소 로딩 단백질이 있다. 재조합효소는, 반복적 침입/연장을 허용함으로써 앰플리콘 형성을 용이하게 할 수 있다. 보다 구체적으로, 재조합효소는, 표적 핵산을 앰플리콘 형성을 위한 주형으로서 사용하여 중합효소에 의한 표적 핵산의 침입 및 중합효소에 의한 프라이머의 연장을 용이하게 할 수 있다. 이 프로세스는, 각 라운드의 침입/연장에서 생성되는 앰플리콘이 후속 라운드에서 주형으로서 기능하는 연쇄 반응으로서 반복될 수 있다. (예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통한) 변성 사이클이 필요하지 않으므로, 프로세스가 표준 PCR보다 빠르게 발생할 수 있다. 이와 같이, 재조합효소 촉진 증폭은 등온적으로 수행될 수 있다. 일반적으로 증폭을 용이하게 하도록 재조합효소 촉진 증폭 시약에 ATP 또는 기타 뉴클레오티드(또는 일부 경우에는 이의 가수분해 불가능 유사체)를 포함하는 것이 바람직하다. 재조합효소, 단일 가닥 결합(SSB) 단백질, 및 보조 단백질의 혼합물이 특히 유용하다. 재조합효소 촉진 증폭을 위한 예시적인 제형은, TwistDx(영국 캠브리지)에 의해 TwistAmp 키트로서 시판되는 것을 포함한다. 재조합효소 촉진 증폭 시약의 유용한 성분 및 반응 조건은, 미국 특허 제5,223,414호 및 미국 특허 제7,399,590호에 기재되어 있으며, 이들 문헌 각각은 본원에 참고로 원용된다.
앰플리콘 형성을 촉진하고 일부 경우에는 앰플리콘 형성 속도를 증가시키도록 증폭 시약에 포함될 수 있는 성분의 다른 예는 헬리카제(helicase)이다. 헬리카제는, 앰플리콘 형성의 연쇄 반응을 허용함으로써 앰플리콘 형성을 용이하게 할 수 있다. (예를 들어, 가열 또는 화학적 변성을 통한) 변성 사이클이 필요하지 않으므로, 프로세스가 표준 PCR보다 빠르게 발생할 수 있다. 이와 같이, 헬리카제 촉진 증폭은 등온적으로 수행될 수 있다. 헬리카제와 단일 가닥 결합(SSB) 단백질의 혼합물은, SSB가 증폭을 더욱 용이하게 할 수 있으므로, 특히 유용하다. 헬리카제 촉진 증폭을 위한 예시적인 제형은, Biohelix(매사추세츠주 비벌리)에 의해 IsoAmp 키트로서 시판되는 것을 포함한다. 추가로, 헬리카제 단백질을 포함하는 유용한 제형의 예는, 미국 특허 제7,399,590호 및 미국 특허 제7,829,284호에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 각각은 본원에 참고로 원용된다.
앰플리콘 형성을 용이하게 하고 일부 경우에는 앰플리콘 형성 속도를 증가시키도록 증폭 시약에 포함될 수 있는 성분의 또 다른 예는 기원 결합 단백질이다.
용액에 존재하는 분자 크라우딩 시약은 배제 증폭을 돕도록 사용될 수 있다. 유용한 분자 크라우딩 시약의 예는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), Ficoll®, 덱스트란, 또는 폴리비닐 알코올을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 분자 크라우딩 시약 및 제형은 미국 특허 제7,399,590호에 기재되어 있다.
증폭 반응이 발생하는 속도는, 증폭 반응의 하나 이상의 활성 성분의 농도 또는 양을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 중합효소, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 프라이머, 재조합효소, 헬리카제, 또는 SSB의 양 또는 농도를 증가시켜 증폭 속도를 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 양 또는 농도가 증가된 (또는 다르게는 본원에 기재된 방법에서 조작된) 증폭 반응의 하나 이상의 활성 성분은 증폭 반응의 비핵산 성분이다.
증폭 속도는, 또한, 온도를 조정함으로써 본원에 제시된 방법에서 증가될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 증폭 부위에서의 증폭 속도는, 변성 또는 기타 부작용으로 인해 반응 속도가 감소하는 최대 온도까지 부위(들)의 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 최적 또는 원하는 온도는, 사용 중인 증폭 성분의 알려진 특성으로부터 또는 주어진 증폭 반응 혼합물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 이러한 조정은 프라이머 용융 온도(Tm)의 사전 예측을 기반으로 하거나 경험적으로 이루어질 수 있다.
증폭 반응이 발생하는 속도는 하나 이상의 증폭 시약의 활성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 중합효소의 연장 속도를 증가시키는 보조 인자를, 중합효소가 사용 중인 반응에 추가할 수 있다. 일부 구현예에서, 마그네슘, 아연, 또는 망간과 같은 금속 보조 인자를 중합효소 반응에 추가할 수 있거나 베타인을 추가할 수 있다.
본원에 제시된 방법의 일부 구현예에서는, 이중 가닥인 표적 핵산 집단을 사용하는 것이 바람직하다. 배제 증폭 조건에서 부위들의 어레이에서의 앰플리콘 형성이 이중 가닥 표적 핵산에 대해 효율적이라는 것이 관찰되었다. 예를 들어, 앰플리콘의 클론 집단을 갖는 복수의 증폭 부위는, 재조합효소 및 단일 가닥 결합 단백질의 존재 하에서 (동일한 농도의 단일 가닥 표적 핵산에 비해) 이중 가닥 표적 핵산으로부터 더욱 효율적으로 생성될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 단일 가닥 표적 핵산을 본원에 제시된 방법의 일부 구현예에서 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 설명된 방법은 다양한 증폭 기술 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 기술은, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 회전환 증폭(RCA), 다중 변위 증폭(MDA), 또는 무작위 프라임 증폭(RPA)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 증폭은, 예를 들어, 증폭 부위가 원하는 용량을 갖는 용적에 앰플리콘을 함유할 수 있는 경우 용액에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 개시 내용의 방법에서 배제 증폭 조건 하에 사용되는 증폭 기술은 고체 상에서 수행된다. 예를 들어, 증폭에 사용되는 하나 이상의 프라이머는 증폭 부위에서 고체 상에 부착될 수 있다. PCR 구현예에서, 증폭에 사용되는 프라이머들 중 하나 또는 양측 모두는 고체 상에 부착될 수 있다. 이중 가닥 앰플리콘이 복제된 주형 서열의 측면에 있는 두 개의 표면 부착 프라이머 사이에 브리지와 같은 구조를 형성하기 때문에, 표면에 부착된 두 종류의 프라이머를 이용하는 포맷을 종종 브리지 증폭이라고 한다. 브리지 증폭에 사용될 수 있는 예시적인 시약 및 조건은, 예를 들어, 미국 특허 제5,641,658호, 미국 특허 공개공보 제2002/0055100호, 미국 특허 제7,115,400호, 미국 특허 공개공보 제2004/0096853호, 미국 특허 공개공보 제2004/0002090호, 미국 특허 공개공보 제2007/0128624호, 및 미국 특허 공개공보 제2008/0009420호에 기재되어 있다. 고체 상 PCR 증폭은, 또한, 용액 내의 제2 프라이머와 고체 지지체에 부착된 증폭 프라이머들 중 하나로 수행될 수 있다. 표면 부착된 프라이머와 가용성 프라이머의 조합을 사용하는 예시적인 포맷은, 예를 들어, Dressman et a , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), WO 05/010145 또는 미국 특허 공개공보 제2005/0130173호 또는 제2005/0064460호에 기재된 바와 같은 에멀션 PCR이다. 에멀션 PCR은 포맷을 예시하는 것이며, 본원에 제시된 방법을 위해 에멀션의 사용은 선택 사항이며 실제로 여러 구현예에서 에멀션이 사용되지 않는다는 점을 이해할 것이다. 기재된 PCR 기술은, 증폭 속도를 촉진하거나 증가시키도록 본원의 다른 곳에서 예시된 성분을 사용하여 비순환 증폭(예를 들어, 등온 증폭)을 위해 변형될 수 있다. 이에 따라, 설명된 PCR 기술은 배제 증폭 조건에서 사용될 수 있다.
RCA 기술은 본 개시 내용의 방법에서 사용하도록 수정될 수 있다. RCA 반응에 사용될 수 있는 예시적인 성분 및 RCA가 앰플리콘을 생성하는 원리는, 예를 들어, Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998), 및 미국 특허 공개공보 2007/0099208 A1에 기재되어 있다. RCA에 사용되는 프라이머는, 용액에 있거나 증폭 부위의 고체 지지체 표면에 부착될 수 있다. 상기 참고문헌에 예시된 RCA 기술들은, 예를 들어, 특정 응용분야에 적합하게끔 증폭 속도를 증가시키도록 본 명세서의 교시에 따라 수정될 수 있다. 따라서, RCA 기술은 배제 증폭 조건에서 사용될 수 있다.
MDA 기술은 본 개시의 방법에서 사용하도록 수정될 수 있다. MDA에 대한 일부 기본 원리와 유용한 조건은, 예를 들어, Dean et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002); Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003); Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992); 미국 특허 제5,455,166호; 미국 특허 제5,130,238호; 및 미국 특허 제6,214,587호에 기재되어 있다. MDA에 사용되는 프라이머는, 용액에 있거나 증폭 부위의 고체 지지체 표면에 부착될 수 있다. 상기 참고문헌에 예시된 MDA 기술들은, 예를 들어, 특정 응용분야에 적합하게끔 증폭 속도를 증가시키도록 본 명세서의 교시에 따라 수정될 수 있다. 이에 따라, MDA 기술은 배제 증폭 조건에서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서는, 설명된 증폭 기술들의 조합을 사용하여 배제 증폭 조건에서 어레이를 만들 수 있다. 예를 들어, RCA와 MDA는, （예를 들어, 용액 상 프라이머를 사용하여) RCA가 용액에서 연쇄 앰플리콘을 생성하는 데 사용되는 조합으로 사용될 수 있다. 이어서, 증폭 부위에서 고체 지지체 표면에 부착된 프라이머를 사용하여 앰플리콘을 MDA의 주형으로서 사용할 수 있다. 이 예에서, RCA와 MDA 조합 단계 후에 생성되는 앰플리콘은 증폭 부위의 표면에 부착된다.
위의 여러 구현예에 대해 예시된 바와 같이, 본 개시 내용의 방법은 순환 증폭 기술을 사용할 필요가 없다. 예를 들어, 표적 핵산의 증폭은, 변성 사이클이 없는 증폭 부위에서 수행될 수 있다. 예시적인 변성 사이클은, 증폭 반응에 대한 화학적 변성제의 도입 및/또는 증폭 반응의 온도 상승을 포함한다. 따라서, 표적 핵산의 증폭은, 증폭 용액을 표적 핵산 및 앰플리콘을 변성시키는 화학 시약으로 대체하는 단계를 포함할 필요가 없다. 유사하게, 표적 핵산의 증폭은, 표적 핵산 및 앰플리콘을 변성시키는 온도로 용액을 가열하는 것을 포함할 필요가 없다. 이에 따라, 증폭 부위에서의 표적 핵산의 증폭은 본원에 제시된 방법의 기간 동안 등온적으로 수행될 수 있다. 실제로, 본원에 제시된 증폭 방법은, 표준 조건에서 일부 증폭 기술에 대해 수행되는 하나 이상의 순환 조작 없이 발생할 수 있다. 또한, 일부 표준 고체 상 증폭 기술에서는, 표적 핵산이 기판 상에 로딩된 후 증폭이 시작되기 전에 세척이 수행된다. 그러나, 본 방법의 구현예에서, 표적 핵산의 반응 부위로의 수송과 증폭 부위에서의 표적 핵산의 증폭 사이에 세척 단계를 수행할 필요는 없다. 대신, 배제 증폭을 제공하기 위해 (예를 들어, 확산을 통한) 수송과 증폭이 동시에 발생하도록 한다.
일부 구현예에서는, 배제 증폭 조건에서 발생하는 증폭 사이클을 반복하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 표적 핵산의 복제가 사이클 조작 없이 개별 증폭 부위에서 만들어질 수 있지만, 증폭 부위의 어레이는 주기적으로 처리되어 각 사이클 후에 앰플리콘을 포함하는 부위의 수를 증가시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 증폭 조건은 사이클마다 수정될 수 있다. 예를 들어, 수송 속도를 변경하거나 증폭 속도를 변경하도록 위에서 설명한 조건들 중 하나 이상이 사이클들 간에 조정될 수 있다. 이처럼, 수송 속도는 사이클마다 증가될 수 있거나, 수송 속도는 사이클마다 감소될 수 있거나, 증폭 속도는 사이클마다 증가될 수 있거나, 증폭 속도는 사이클마다 감소될 수 있다.
조성물
본 명세서에 기재된 증폭 클러스터링 방법 동안 또는 그 후에, 상이한 조성물이 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 증폭 부위의 어레이를 포함한다. 각 부위는, 제1 포획 서열 및 제2 포획 서열을 각각 포함하는 제1 포획 핵산 및 제2 포획 핵산을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 포획 핵산은 부위의 표면에 결합된다. 어레이의 상이한 부위들은, 제1 포획 핵산의 제1 포획 서열에 혼성화된 표적 핵산들을 포함한다. 상이한 부위들에서의 표적 핵산들 각각은 3' 말단에서 포획 서열에 혼성화된 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 범용 포획 결합 서열보다 포획 서열에 대해 친화도가 덜한 범용 포획 결합 서열이 존재한다. 일 구현예에서, 상이한 범용 포획 결합 서열들이 각 부위에 존재하며, 예를 들어, 범용 포획 결합 서열들의 제1 이종 집단이 존재한다. 제1 이종 집단은, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 상이한 범용 포획 결합 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 1개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함한다. 조성물은, 제1 포획 서열에 대해 100% 상보적인 범용 포획 결합 서열을 갖는 일부 표적 핵산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 이종 집단의 구성원들은 제1 이종 집단의 다른 구성원들보다 많은 수로 존재한다. 제1 이종 집단은, 또한, 제1 포획 서열의 길이보다 1개 내지 12개의 뉴클레오티드 짧은 길이와 같이, 제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함할 수 있다. 제1 이종 집단의 개별 구성원은, 제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 가질 수 있으며, 제1 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 1개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 제1 포획 서열의 서열에 대한 100% 상보성을 포함할 수 있다.
5' 말단은, 제2 포획 서열에 대해 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열보다 제2 포획 서열에 대해 친화도가 낮은 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열에 대해 비-상보적인 1개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함한다. 조성물은, 제2 포획 서열에 대해 100% 상보성을 갖는 보체와 함께 제2 범용 포획 결합 서열을 갖는 일부 표적 핵산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상이한 제2 범용 포획 결합 서열들이 각 부위에 존재하고, 예를 들어, 제2 범용 포획 결합 서열들의 제2 이종 집단이 존재한다. 제2 이종 집단은, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 상이한 제2 범용 포획 결합 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 포획 서열에 대해 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 이종 집단의 구성원들은 제2 이종 집단의 다른 구성원들보다 많은 수로 존재한다. 5' 말단에 있는 범용 포획 결합 서열의 제2 이종 집단은, 또한, 제2 포획 서열의 길이보다 1개 내지 12개의 뉴클레오티드 짧은 길이와 같이, 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함할 수 있다. 제2 이종 집단의 개별 구성원들은, 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 가질 수 있고, 제2 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 1개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 제2 포획 서열의 서열에 대한 100% 상보성을 갖는 보체를 포함할 수 있다.
생성될 수 있는 다른 조성물은, 단일 샘플 또는 공급원, 예를 들어, 라이브러리로부터의 상이한 이중 가닥 표적 핵산들을 포함하는 용액을 포함하며, 여기서 각 표적 핵산은 각 말단에 부착된 범용 어댑터를 포함한다. 범용 어댑터는 범용 포획 결합 서열을 포함하고, 범용 포획 결합 서열은 이종 집단이다. 이종 집단은, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 상이한 범용 포획 결합 서열을 포함할 수 있다.
서열분석/서열분석 방법에서의 사용
예를 들어, 본원에 제시된 방법에 의해 생성되고 증폭 부위에서 증폭된 표적 핵산을 포함하는 본 개시 내용의 어레이는 임의의 다양한 응용분야에 사용될 수 있다. 특히 유용한 응용분야는 핵산 서열분석이다. 일례는 합성에 의한 서열분석(sequencing-by-synthesis; SBS)이다. SBS에서, 핵산 주형(예를 들어, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)을 따른 핵산 프라이머의 연장을 모니터링하여 주형의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 기저 화학적 프로세스는 (예를 들어, 중합효소 효소에 의해 촉매화되는 것처럼) 중합화일 수 있다. 특정한 중합효소 기반 SBS 구현예에서, 형광 표지된 뉴클레오티드는, 프라이머에 추가되는 뉴클레오티드의 순서 및 유형의 검출을 이용하여 주형의 서열을 결정할 수 있도록, 주형 의존적 방식으로 프라이머에 추가된다(따라서 프라이머를 연장한다). 본원에 설명된 어레이의 상이한 부위들에 있는 복수의 상이한 주형은, 상이한 주형에 대해 발생하는 이벤트가 어레이에서의 위치로 인해 구별될 수 있는 조건에서 SBS 기술이 적용될 수 있다.
플로우셀은, 본 개시 내용의 방법에 의해 생성되고 주기적으로 시약의 반복 전달을 포함하는 SBS 또는 다른 검출 기술을 받는 어레이를 수용하기 위한 편리한 포맷을 제공한다. 예를 들어, 제1 SBS 사이클을 시작하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드, DNA 중합 효소 등이 핵산 주형의 어레이를 수용하는 플로우셀 내로/플로우셀을 통해 흐를 수 있다. 프라이머 연장으로 인해 표지된 뉴클레오티드가 혼입되는 그러한 어레이의 부위를 검출할 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오티드는, 일단 뉴클레오티드가 프라이머에 추가되면 추가 프라이머 연장을 종결하는 가역적 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오티드 유사체를 프라이머에 추가할 수 있으며, 이때 모이어티를 제거하기 위해 디블로킹제(deblocking agent)가 전달될 때까지 후속 연장이 일어날 수 없도록 한다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 구현예의 경우, (검출이 발생하기 전에 또는 후에) 디블로킹 시약이 플로우셀에 전달될 수 있다. 세척은 다양한 전달 단계 간에 수행될 수 있다. 이어서, 사이클을 n번 반복하여 프라이머를 n개의 뉴클레오티드만큼 연장할 수 있고, 이에 따라 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시 내용의 방법에 의해 생성되는 어레이와 함께 사용하도록 쉽게 구성될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템, 및 검출 플랫폼은, 예를 들어, Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; 미국 특허 제7,057,026호; WO 91/06678; WO 07/123,744; 미국 특허 제7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 미국 특허 제7,315,019호; 미국 특허 제7,405,281호, 및 미국 특허 제8,343,746호에 기재되어 있다.
파이로서열분석과 같은 순환 반응을 사용하는 다른 서열분석 절차를 사용할 수 있다. 파이로서열분석은, 특정 뉴클레오티드가 초기 핵산 가닥에 혼입됨에 따라 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다((Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호, 및 미국 특허 제6,274,320호). 파이로서열분석에 있어서, 방출되는 PPi는 ATP 술퍼릴라제에 의해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 즉시 변환됨에 의해 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제 생성 광자를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 서열분석 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 사용되는 여기 방사선원은 파이로서열분석 절차에 필요하지 않다. 본 개시 내용의 어레이에 파이로서열분석을 적용하기 위해 사용될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기, 및 절차는, 예를 들어, WIPO에 공개된 특허출원 제2012/058096호, 미국 특허 공개공보 2005/0191698 A1, 미국 특허 제7,595,883호, 및 미국 특허 제7,244,559호 에 기재되어 있다.
예를 들어, Shendure et al. Science 309:1728-1732 (2005); 미국 특허 제5,599,675호; 및 미국 특허 제5,750,341호에 설명된 것들을 포함하여 결찰에 의한 서열분석 반응도 유용하다. 일부 구현예는, 예를 들어, Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor et al., Science 251(4995), 767-773 (1995); 및 WO 1989/10977에 설명된 바와 같은 혼성화에 의한 서열분석 절차를 포함할 수 있다. 결찰에 의한 서열분석과 혼성화에 서열분석 절차 모두에 있어서, 어레이의 부위에 존재하는 주형 핵산(예를 들어, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)은 올리고뉴클레오티드 전달 및 검출의 반복 사이클을 거치게 된다. 본 명세서에 또는 본 명세서에서 인용된 참고 문헌에 기재된 SBS 방법을 위한 유체 시스템은, 결찰에 의한 서열분석 또는 혼성화에 의한 서열분석 절차를 위한 시약을 전달하도록 쉽게 구성될 수 있다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는, 형광 표지되고, 본원에서 또는 본원에서 인용된 참고 문헌에서의 SBS 절차에 관련하여 기재된 것과 유사한 형광 검출기를 사용하여 검출될 수 있다.
일부 구현예는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 혼입은, 형광단 함유 중합효소와 γ-포스페이트 표지된 뉴클레오티드 간의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 상호작용을 통해 또는 제로모드 도파관(ZMWs)을 사용하여 검출될 수 있다. FRET 기반 서열분석을 위한 기술 및 시약은, 예를 들어, Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)에 기재되어 있다.
일부 SBS 구현예는 뉴클레오티드를 연장 산물 내로 혼입할 때 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출되는 양성자의 검출에 기반한 서열분석은, Ion Torrent(Guilford, Conn., Life Technologies 자회사)에서 시판되는 전기 검출기 및 관련 기술, 또는 US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; 또는 US 2010/0282617 A1에 설명된 서열분석 방법 및 시스템을 사용할 수 있다. 배제 증폭을 사용하여 표적 핵산을 증폭하도록 본원에 제시된 방법은 양성자를 검출하는 데 사용되는 기판에 쉽게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 제시된 방법을 사용하여, 양성자를 검출하는 데 사용되는 어레이의 부위에서 앰플리콘의 클론 집단을 생성할 수 있다.
예를 들어, 본원에 제시된 방법에 의해 생성된 본 개시 내용의 어레이에 대한 유용한 응용분야는 유전자 발현 분석이다. 유전자 발현은, 디지털 RNA 서열분석이라고 하는 것과 같은 RNA 서열분석 기술을 사용하여 검출되거나 정량화될 수 있다. RNA 서열분석 기술은 상술한 바와 같은 당업계에 공지된 서열분석 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 유전자 발현은, 또한, 어레이에 대한 직접 혼성화에 의해 수행되는 혼성화 기술을 사용하거나 어레이 상에서 산물이 검출되는 멀티플렉스 분석을 사용하여 검출되거나 정량화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 방법에 의해 생성된 본 개시 내용의 어레이는, 또한, 하나 이상의 개인으로부터의 게놈 DNA 샘플에 대한 유전자형을 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 개시 내용의 어레이 상에서 수행될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전자형 분석을 위한 예시적인 방법은, 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허 공개공보 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 또는 US 2005/0181440 A1에 기재되어 있다.
본원에 제시된 방법에 의해 생성된 어레이에 대한 다른 유용한 응용분야는 단일 세포 서열분석이다. 인덱싱 방법과 조합하면, 염색질 접근성 분석에 단일 세포 서열분석을 사용하여 수천 개의 단일 세포에서 활성 조절 요소의 프로파일을 생성할 수 있으며, 단일 세포 전체 게놈 라이브러리를 생성할 수 있다. 본 개시 내용의 어레이에서 수행될 수 있는 단일 세포 서열분석의 예는, 미국 특허 공개공보 2018/0023119 A1, 미국 가특허출원 62/673,023 및 62/680,259에 설명되어 있다.
본원에 제시된 방법의 장점은, 다양한 핵산 라이브러리 중 임의의 것으로부터 어레이의 빠르고 효율적인 생성을 제공한다는 점이다. 이에 따라, 본 개시 내용은, 본원에 제시된 방법들 중 하나 이상을 사용하여 어레이를 만들 수 있고 또한 상기 예시된 것과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 어레이 상의 핵산을 추가로 검출할 수 있는 통합 시스템을 제공한다. 따라서, 본 개시 내용의 통합 시스템은, 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인 등과 같은 증폭 부위의 어레이에 증폭 시약을 전달할 수 있는 유체 성분을 포함할 수 있다. 특히 유용한 유체 성분은 플로우셀이다. 플로우셀은, 본 개시 내용의 어레이를 생성하고 어레이를 검출하도록 통합 시스템에서 구성 및/또는 사용될 수 있다. 예시적인 플로우셀은, 예를 들어, 미국 특허 공개공보 2010/0111768 A1 및 미국 특허 제8,951,781에 기재되어 있다. 플로우셀에 대해 예시된 바와 같이, 통합 시스템의 유체 성분들 중 하나 이상은 증폭 방법 및 검출 방법에 사용될 수 있다. 핵산 서열분석의 구현예를 예로 들면, 통합 시스템의 유체 성분들 중 하나 이상은, 본원에 제시된 증폭 방법 및 상기 예시된 것과 같은 서열분석 방법에서의 서열분석 시약의 전달을 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 통합 시스템은, 증폭 방법을 수행하고 검출 방법을 수행하도록 별도의 유체 시스템을 포함할 수 있다. 핵산 어레이를 생성할 수 있고 또한 핵산 서열을 결정할 수 있는 통합 서열분석 시스템의 예는, MiSeqTM, HiSeqTM, NextSeqTM, MiniSeqTM, NovaSeqTM, 및 iSeqTM 플랫폼(Illumina, Inc., 캘리포니아주 샌디에고), 및 미국 특히 제8,951,781호에 기재된 장치를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 장치는, 본원에 설명된 지침에 따라 배제 증폭을 사용하여 어레이를 만들도록 수정될 수 있다.
본원에 설명된 방법을 수행할 수 있는 시스템은 검출 장치와 통합될 필요가 없다. 오히려, 독립형 시스템 또는 다른 장치와 통합된 시스템도 가능하다. 통합 시스템의 맥락에서 위에 예시된 것과 유사한 유체 성분들이 이러한 구현예에서 사용될 수 있다.
본원에 설명된 방법을 수행할 수 있는 시스템은, 검출 기능과 통합되었는지 여부에 관계없이, 본원에 설명된 방법, 기술, 또는 프로세스의 하나 이상의 단계를 수행하도록 일련의 명령어를 실행할 수 있는 시스템 제어기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 명령어는 배제 증폭 조건에서 어레이를 생성하는 단계의 수행을 지시할 수 있다. 선택적으로, 명령어는, 본원에서 앞서 설명한 방법을 사용하여 핵산 검출 단계의 수행을 추가로 지시할 수 있다. 유용한 시스템 제어기는, 마이크로컨트롤러를 사용하는 시스템, RISC, ASIC, FPGA, 논리 회로, 및 본원에 설명된 기능을 실행할 수 있는 다른 임의의 회로나 프로세서를 사용하는 시스템을 포함하는, 임의의 프로세서 기반 또는 마이크로프로세서 기반 시스템을 포함할 수 있다. 시스템 제어기에 대한 일련의 명령어는 소프트웨어 프로그램의 형태일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "소프트웨어" 및 "펌웨어"라는 용어는, 상호교환 가능하며, RAM 메모리, ROM 메모리, EPROM 메모리, EEPROM 메모리, 및 비휘발성 RAM(NVRAM) 메모리를 포함하여 컴퓨터에 의해 실행되도록 메모리에 저장된 임의의 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 소프트웨어는 시스템 소프트웨어 또는 애플리케이션 소프트웨어와 같은 다양한 형태로 될 수 있다. 또한, 소프트웨어는, 별도의 프로그램들의 모음 또는 더 큰 프로그램 내의 프로그램 모듈 혹은 프로그램 모듈의 일부의 형태일 수 있다. 소프트웨어는, 또한, 객체 지향 프로그래밍 형태의 모듈식 프로그래밍을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 어레이에 대한 여러 애플리케이션이 앙상블 검출의 맥락에서 위에서 예시되었으며, 여기서 각 증폭 부위에 존재하는 다중 앰플리콘이 함께 검출된다. 대체 구현예에서, 표적 핵산이든 이의 앰플리콘이든, 단일 핵산은 각 증폭 부위에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 증폭 부위는, 검출될 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 핵산 분자 및 복수의 필러 핵산을 함유하도록 구성될 수 있다. 이 예에서, 필러 핵산은, 증폭 부위의 용량을 충전하도록 기능하며, 반드시 검출되도록 의도된 것은 아니다. 검출될 단일 분자는, 필러 핵산의 배경에서 단일 분자를 구별할 수 있는 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 증가된 이득에서 부위를 검출하도록 또는 보다 민감한 표지를 사용하도록 위에 제시된 앙상블 검출 기술의 변형을 포함하는 다양한 단일 분자 검출 기술 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 단일 분자 검출 방법의 다른 예는, 미국 특허 공개공보 2011/0312529 A1; 미국 특허 제9,279,154호: 및 미국 특허 공개공보 2013/0085073 A1에 기재되 어 있다.
단일 분자 핵산 검출에 유용한 어레이는, 다음에 따르는 변형과 함께 본원에 제시된 방법들 중 하나 이상을 사용하여 생성될 수 있다. 복수의 상이한 표적 핵산은, 검출될 표적 뉴클레오티드 서열 및 필러 앰플리콘을 생성하기 위해 증폭될 하나 이상의 필러 뉴클레오티드 서열 모두를 포함하도록 구성될 수 있다. 복수의 상이한 표적 핵산은, 본원의 다른 곳에 제시된 것과 같은 증폭 시약에 포함될 수 있고, 필러 뉴클레오티드 서열(들)이 증폭 부위를 충전하도록 하는 배제 증폭 조건에서 증폭 부위 어레이와 반응할 수 있다. 표적 서열의 증폭을 금지하면서 필러 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있는 예시적인 구성은, 예를 들어, 증폭 부위에 존재하는 증폭 프라이머에 대한 결합 부위가 옆에 있는 필러 서열을 갖는 제1 영역 및 측면 영역의 밖에 표적 서열을 갖는 제2 영역을 갖는 단일 표적 분자를 포함한다. 다른 구성에서, 표적 핵산은, 각각 표적 서열 및 필러 서열(들)을 운반하는 별개의 분자 또는 가닥을 포함할 수 있다. 별개의 분자 또는 가닥은, 입자에 부착될 수 있거나 핵산 덴드리머 또는 다른 분지형 구조의 아암(arm)으로서 형성될 수 있다.
특정 구현예에서, 필러 서열과 표적 서열을 각각 함유하는 증폭 부위들을 갖는 어레이는, 프라이머 연장 분석 또는 합성에 의한 서열분석 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 경우, 적절하게 배치된 프라이머 결합 부위를 사용함으로써 대량의 필러 서열과는 대조적으로 표적 뉴클레오티드 서열에서 특이적 연장을 달성할 수 있다. 예를 들어, 서열분석 프라이머에 대한 결합 부위는, 표적 서열의 상류에 배치될 수 있으며, 어떠한 필러 서열에도 없을 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 표적 서열은, 표준 뉴클레오티드에 수소 결합할 수 없는 하나 이상의 비천연 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 비천연 뉴클레오티드(들)는, 프라이머 결합 부위의 하류(예를 들어, 표적 서열 또는 표적 서열과 프라이머 결합 부위를 개재하는 영역)에 위치할 수 있으며, 따라서 적절한 뉴클레오티드 파트너(즉, 표적 서열에서 비천연 유사체(들)에 수소 결합할 수 있는 파트너)가 추가될 때까지 연장 또는 합성에 의한 서열분석을 방지할 것이다. 뉴클레오티드 유사체 이소시토신(isoC) 및 이소구아닌(isoG)은, 서로 특이적으로 쌍을 이루지만 대부분의 연장 및 합성에 의한 서열분석 기술에 사용되는 다른 표준 뉴클레오티드와는 짝을 이루지 않으므로, 특히 유용하다. 표적 서열 또는 표적 서열의 상류에서 isoC 및/또는 isoG를 사용하는 추가 이점은, 증폭에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물로부터 각 파트너를 생략함으로써, 증폭 단계 동안 표적 서열의 원치 않는 증폭을 방지하는 것이다.
예를 들어, 본원에 제시된 방법에 의해 생성된 본 개시 내용의 어레이는 검출 방법에 사용될 필요가 없다는 점을 이해할 것이다. 오히려, 어레이를 사용하여 핵산 라이브러리를 저장할 수 있다. 이에 따라, 어레이는 핵산이 내부에 보존된 상태로 저장될 수 있다. 예를 들어, 어레이는 건조된 상태, 동결된 상태(예를 들어, 액체 질소 내에) 또는 핵산을 보호하는 용액에 저장될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 어레이는 핵산 라이브러리를 복제하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 어레이 상의 하나 이상의 부위로부터 복제 앰플리콘을 생성하는 데 어레이를 사용할 수 있다.
본 개시 내용의 여러 구현예는, 표적 핵산을 어레이의 증폭 부위로 수송하고 증폭 부위에서 포획된 표적 핵산의 복제를 만드는 것과 관련하여 본원에서 예시되었다. 유사한 방법을 비핵산 표적 분자에 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 제시된 방법은 예시된 표적 핵산 대신 다른 표적 분자와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 방법은 상이한 표적 분자들의 집단으로부터 개별 표적 분자들을 수송하도록 수행될 수 있다. 각 표적 분자는 포획 부위에서 반응을 시작하도록 어레이의 개별 부위로 수송될 수 있다(일부 경우에는 그 개별 부위에서 포획될 수 있다). 각 부위에서의 반응은 예를 들어 포획된 분자의 복제를 생성할 수 있고, 또는 반응은 포획된 분자를 분리하거나 격리하도록 부위를 변경할 수 있다. 두 경우 모두에 있어서, 최종 결과는, 상이한 유형의 표적 분자들을 함유하는 집단으로부터 존재하는 표적 분자 유형과 관련하여 각각 순수한 어레이의 부위들일 수 있다.
핵산이 아니라 표적 분자를 사용하는 특정 구현예에서, 배제 증폭을 이용하는 방법을 사용하여 상이한 표적 분자들의 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들어, 표적 분자 어레이는, 어레이의 부위들이 용액으로부터의 표적 분자로 무작위로 시딩되고 표적 분자의 복제들이 생성되어 각각의 시딩된 부위를 용량까지 충전하는 조건에서 만들어질 수 있다. 본 개시 내용의 배제 증폭 방법에 따라, 시딩 및 복제 프로세스는, 복제가 생성되는 속도가 시딩 속도를 초과하는 조건에서 동시에 진행될 수 있다. 이와 같이, 제1 표적 분자에 의해 시딩된 부위에서 복제가 생성되는 비교적 빠른 속도는, 제2 표적 분자가 부위를 시딩하는 것을 효과적으로 배제한다. 일부 경우에, 표적 분자의 시딩은 표적 분자의 복제 이외의 프로세스에 의해 부위를 용량까지 충전하는 반응을 시작한다. 예를 들어, 한 부위에서 표적 분자를 포착하면, 연쇄 반응이 시작되어 결국 부위가 제2 표적 분자를 포착할 수 없게 된다. 연쇄 반응은, 표적 분자가 포획되는 속도를 초과하는 속도로 발생하여, 배제 증폭 조건에서 발생할 수 있다.
표적 핵산에 대해 예시된 바와 같이, 배제 증폭은, 다른 표적 분자에 적용될 때, 어레이의 부위에서 반복적 반응(예를 들어, 연쇄 반응)을 시작하기 위한 상대적으로 느린 속도 대 일단 시작되었다면 반복적 반응을 계속하기 위한 상대적으로 빠른 속도를 이용할 수 있다. 이전 단락의 예에서, 배제 증폭은, 표적 분자 시딩의 상대적으로 느린 속도(예를 들어, 상대적으로 느린 확산) 대 예를 들어 부위를 표적 분자 시드의 복제로 충전하기 위한 반응이 발생하는 상대적으로 빠른 속도로 인해 발생한다. 예시적인 다른 일 구현예에서, 배제 증폭은, 부위를 시딩한 표적 분자의 제1 복제의 형성의 지연(예를 들어, 지연된 또는 느린 활성화) 대 부위를 충전하도록 후속 복제가 생성되는 비교적 빠른 속도로 인해 발생할 수 있다. 이 예에서, 개별 부위는, 여러 개의 상이한 표적 분자로 시딩되었을 수 있다. 그러나, 임의의 주어진 표적 분자에 대한 제1 복제 형성은, 제1 복제 형성의 평균 속도가 후속 복제가 생성되는 속도에 비해 상대적으로 느린 것처럼 무작위로 활성화될 수 있다. 이 경우, 개별 부위는 여러 개의 상이한 표적 분자로 시딩되었을 수 있지만, 배제 증폭을 통해 그러한 표적 분자들 중 하나만이 복제되도록 할 것이다.
이에 따라, 본 개시 내용은 분자들의 어레이를 생성하는 방법을 제공하며, 이 방법은, (a) (i) 부위들의 어레이와 (ii) 복수의 상이한 표적 분자를 갖는 용액을 포함하는 시약을 제공하는 단계; 및 (b) 시약을 반응시켜, 복수로부터 단일 표적 분자를 각각 갖는 복수의 부위를 생성하거나, 용액으로부터의 개별 표적 분자로부터 복제들의 순수 집단을 각각 갖는 복수의 부위를 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 용액의 표적 분자들의 수는 어레이의 부위들의 수를 초과하고, 상이한 표적 분자들은 복수의 부위에 대한 유체 접근을 갖고, 각 부위는, 복수의 상이한 표적 분자 내의 여러 개의 표적 분자에 대한 용량을 포함하고, 상기 반응 단계는, (i) 상이한 분자들을 부위들에 평균 수송 속도로 수송하는 단계 및 (ii) 평균 반응 속도로 부위를 용량까지 충전하는 반응을 시작하는 단계를 동시에 포함하고, 평균 반응 속도는 평균 수송 속도를 초과한다. 일부 구현예에서, (b) 단계는, 시약을 반응시켜 복수로부터 단일 표적 분자를 각각 갖는 복수의 부위를 생성하거나 용액으로부터의 개별 표적 분자로부터 복제들의 순수 집단을 각각 갖는 복수의 부위를 생성함으로써 대신 실행될 수 있으며, 상기 반응 단계는, (i) 반복적 반응(예를 들어, 연쇄 반응)을 시작하여 각 부위에서 표적 분자로부터 산물을 형성하는 단계 및 (ii) 각 부위에서 반응을 계속하여 후속 산물을 형성하는 단계를 포함하고, 부위에서 반응이 발생하는 평균 속도는, 부위에서 반응이 시작되는 평균 속도를 초과한다.
상술한 비핵산 구현예에서, 표적 분자는 어레이의 각 부위에서 발생하는 반복적 반응의 개시자일 수 있다. 예를 들어, 반복적 반응은, 다른 표적 분자가 해당 부위를 점유하지 못하도록 하는 중합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 반복적 반응은, 부위로 수송된 표적 분자의 분자 복제를 구성하는 하나 이상의 중합체를 형성할 수 있다.
예시적인 구현예
구현예 1.
(a) 증폭 시약을 제공하는 단계로서,
증폭 시약은 (i) 증폭 부위의 어레이 및 (ii) 복수의 상이한 변형된 이중 가닥 표적 핵산을 포함하는 용액을 포함하고,
증폭 부위는 각 집단마다 포획 서열을 포함하는 포획 핵산의 두 개의 집단을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하고,
상이한 변형된 표적 핵산은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하는 것인, 단계, 및
(b) 증폭 시약을 반응시켜 용액으로부터의 개별 표적 핵산으로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 각각 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하는 단계
를 포함하는, 핵산을 증폭하는방법.
구현예 2.
(a) 증폭 시약을 제공하는 단계로서,
상기 증폭 시약은 (i) 증폭 부위의 어레이 및 (ii) 복수의 상이한 변형된 표적 핵산을 포함하는 용액을 포함하고,
증폭 부위는 각 집단마다 포획 서열을 포함하는 포획 핵산의 두 개의 집단을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하고,
상이한 변형된 표적 핵산은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하는 것인, 단계, 및
(b) 증폭 시약을 반응시켜 용액으로부터의 개별 표적 핵산으로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 각각 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하는 단계로서,
상기 반응은,
(i) 증폭 부위의 각각으로 수송되는 개별 표적 핵산으로부터 제1 앰플리콘을 생성하는 단계, 및
(ii) 상기 증폭 부위의 각각으로 수송되는 개별 표적 핵산으로부터 또는 상기 제1 앰플리콘으로부터 후속 앰플리콘을 생성하는 단계
를 포함하고, 후속 앰플리콘이 증폭 부위에서 생성되는 평균 속도는 제1 앰플리콘이 증폭 부위에서 생성되는 평균 속도보다 느린 것인 단계
를 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법.
구현예 3. 어레이 상의 복수의 앰플리콘 부위의 각각에서 앰플리콘의 명백한 클론 집단을 검출하는 서열분석 절차를 수행하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 결정하는 방법으로서,
상기 어레이는,
(a) 증폭 시약을 제공하는 단계로서,
증폭 시약은 (i) 복수의 증폭 부위 및 (ii) 복수의 상이한 변형된 표적 핵산을 포함하는 용액을 포함하고,
증폭 부위는 각 집단마다 포획 서열을 포함하는 포획 핵산의 두 개의 집단을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하고,
상이한 변형된 표적 핵산은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하는 것인, 단계, 및
(b) 증폭 시약을 반응시키는 단계
를 포함하는 프로세스에 의해 만들어지는 것인, 방법:
구현예 4. 구현예 1 내지 구현예 3 중 어느 하나에 있어서, 용액 내 상이한 변형된 표적 핵산의 수는 어레이의 증폭 부위의 수를 초과하고,
상이한 변형된 표적 핵산은 복수의 증폭 부위에 대한 유체 접근을 갖고,
증폭 부위의 각각은 복수의 상이한 핵산 중 여러 개의 핵산에 대한 용량을 포함하는 것인, 방법.
구현예 5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응은,
(i) 상이한 변형된 표적 핵산을 증폭 부위로 평균 수송 속도로 수송하는 단계, 및
(ii) 상기 증폭 부위에 있는 표적 핵산을 평균 증폭 속도로 증폭하는 단계
를 동시에 포함하고, 상기 평균 증폭 속도는 상기 평균 수송 속도보다 느린 것인, 방법.
구현예 6. 구현예 1 내지 구현예 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 용액 내 복수의 상이한 변형된 표적 핵산은,
(i) 상이한 변형된 표적 핵산을 용액으로부터 증폭 부위로 수송하는 것, 및
(ii) 증폭 부위에 있는 표적 핵산을 증폭 속도로 증폭하여, 앰플리콘의 명백한 클론 집단을 각각 포함하는 앰플리콘 부위의 어레이를 생성하는 것
을 동시에 발생시키는 농도에 있는, 방법.
구현예 7. 구현예 1 내지 구현예 6 중 어느 하나에 있어서, 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는 것인, 방법.
구현예 8. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는 것인, 방법.
구현예 9. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, 상이한 변형된 표적 핵산은 제1 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 (i) 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
구현예 10. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 하나에 있어서, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는 것인, 방법.
구현예 11. 구현예 1 내지 구현예 10 중 어느 하나에 있어서, 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 12. 구현예 1 내지 구현예 11 중 어느 하나에 있어서, 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 13. 구현예 1 내지 구현예 12 중 어느 하나에 있어서, 상이한 변형된 표적 핵산은 제1 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
구현예 14. 구현예 1 내지 구현예 13 중 어느 하나에 있어서, 이종 집단은 (iii) 제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 15. 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 하나에 있어서, 개별 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 16. 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 하나에 있어서, 제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 이종 집단의 개별 구성원은, 제1 포획 서열의 서열에 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하거나 제1 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는 것인, 방법.
구현예 17. 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 하나에 있어서, 상이한 변형된 표적 핵산은 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제2 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열을 5' 말단에 포함하는 것인, 방법.
구현예 18. 구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는 것인, 방법.
구현예 19. 구현예 1 내지 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는 것인, 방법.
구현예 20. 구현예 1 내지 구현예 19 중 어느 하나에 있어서, 상이한 변형된 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 (i) 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
구현예 21. 구현예 1 내지 구현예 20 중 어느 하나에 있어서, 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는 것인, 방법.
구현예 22. 구현예 1 내지 구현예 21 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 23. 구현예 1 내지 구현예 22 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 24. 구현예 1 내지 구현예 23 중 어느 하나에 있어서, 상이한 변형된 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
구현예 25. 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 하나에 있어서, 이종 집단은 (iii) 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 26. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 하나에 있어서, 개별 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 뉴클레오티드인 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 27. 구현예 1 내지 구현예 26 중 어느 하나에 있어서, 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 이종 집단의 개별 구성원은, 제2 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하거나 제2 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 것인, 방법.
구현예 28. 구현예 1 내지 구현예 27 중 어느 하나에 있어서, 표적 핵산이 DNA인, 방법.
구현예 29. 구현예 1 내지 구현예 28 중 어느 하나에 있어서, 증폭 부위의 어레이는 표면 상의 특징부의 어레이를 포함하는 것인, 방법.
구현예 30. 구현예 1 내지 구현예 29 중 어느 하나에 있어서, 특징부의 각각에 대한 면적은 증폭 부위로 수송되는 표적 핵산의 제외된 부피의 직경보다 큰 것인, 방법.
구현예 31. 구현예 1 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서, 특징부는 비연속적이며, 포획제가 없는 표면의 개재성 영역(interstitial region)에 의해 분리된 것인, 방법.
구현예 32. 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 특징부 각각은, 비드, 웰, 채널, 리지, 돌출부, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
구현예 33. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 증폭 부위의 어레이는 용액 내의 비드 또는 표면 상의 비드를 포함하는 것인, 방법.
구현예 34. 구현예 1 내지 구현예 3 중 어느 하나에 있어서, 증폭 부위로 수송되는 표적 핵산의 증폭은 등온선상으로 발생하는 것인, 방법.
구현예 35. 구현예 1 내지 구현예 34 중 어느 하나에 있어서, 증폭 부위로 수송되는 상이한 변형된 표적 핵산의 증폭은 변성 사이클을 포함하지 않는 것인, 방법.
구현예 36. 구현예 1 내지 구현예 35 중 어느 하나에 있어서, 앰플리콘의 클론 집단을 포함하는 복수의 증폭 부위가, 단계 (b) 동안 상이한 변형된 표적 핵산이 유체 접근을 가졌던 증폭 부위의 40%를 초과하는 것인, 방법.
구현예 37. 구현예 1 내지 구현예 36 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b) 동안 각 증폭 부위의 용량을 채우도록 개별 증폭 부위에서 각각 개별 표적 핵산으로부터 충분한 수의 앰플리콘이 생성되는 것인, 방법.
구현예 38. 구현예 1 내지 구현예 37 중 어느 하나에 있어서, 각 증폭 부위의 용량을 채우도록 앰플리콘이 생성되는 속도는 개별 표적 핵산이 개별 증폭 부위로 각각 수송되는 속도 미만인, 방법.
구현예 39. 구현예 1 내지 구현예 38 중 어느 하나에 있어서, 수송은 수동 확산을 포함하는 것인, 방법.
구현예 40. 구현예 1 내지 구현예 39 중 어느 하나에 있어서, 증폭 시약은 폴리머라제와 재조합효소를 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 41.
복수의 이중 가닥 표적 핵산의 용액을 제공하는 단계; 및
범용 어댑터를 이중 가닥 표적 핵산의 양측 말단에 결찰(ligate)하여 제1 복수의 변형된 표적 핵산을 형성하는 단계
를 포함하는 라이브러리를 생성하는 방법으로서,
변형된 표적 핵산의 각각은 범용 어댑터가 측면에 있는 표적 핵산을 포함하고,
범용 어댑터는 (i) 이중 가닥 핵산의 영역, 및 (ii) 3' 말단에서 범용 포획 결합 서열을 포함하는 단일 가닥 비-상보 핵산 가닥의 영역을 포함하고,
범용 포획 결합 서열은 이종 집단을 포함하고,
결찰은 범용 어댑터의 이중 가닥 핵산의 영역을 이중 가닥 표적 단편의 각 말단에 공유적으로 부착하는 것인, 방법.
구현예 42. 구현예 41에 있어서, 상기 3' 말단에서의 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다른 것인, 방법.
구현예 43. 구현예 41 또는 구현예 42에 있어서, 3' 말단에서의 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다른 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 44. 구현예 41 내지 구현예 43 중 어느 하나에 있어서, 3' 말단에서의 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다르거나, 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다르거나, 또는 이들의 조합에 의해 서로 다른 것인, 방법.
구현예 45. 구현예 41 내지 구현예 44 중 어느 하나에 있어서, 단일 가닥 비-상보 핵산 가닥의 영역은 5' 말단에서 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
구현예 46. 구현예 41 내지 구현예 45 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단에서의 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다른 것인, 방법.
구현예 47. 구현예 41 내지 구현예 46 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단에서의 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다른 길이를 갖는 것인, 방법.
구현예 48. 구현예 41 내지 구현예 47 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단에서의 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다르거나, 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다르거나, 또는 이들의 조합에 의해 서로 다른 것인, 방법.
구현예 49. 증폭 부위의 어레이 및 증폭 부위에 결합된 적어도 하나의 표적 핵산을 포함하는 조성물로서,
증폭 부위는 포획 핵산의 2개 집단을 포함하고, 각 집단은 포획 서열을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하며,
표적 핵산은 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하고,
표적 핵산 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열에 혼성화되는 것인, 조성물.
구현예 50. 구현예 49에 있어서, 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는, 조성물.
구현예 51. 구현예 49 또는 구현예 50에 있어서, 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는, 조성물.
구현예 52. 구현예 49 내지 구현예 51 중 어느 하나에 있어서, 어레이의 증폭 부위의 적어도 30%가 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 점유되는, 조성물.
구현예 53. 구현예 49 내지 구현예 52 중 어느 하나에 있어서, 제1 범용 포획 결합 서열은 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 (i) 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하고,
이종 집단의 구성원은 상이한 증폭 부위에 결합되는 것인, 조성물.
구현예 54. 구현예 49 내지 구현예 53 중 어느 하나에 있어서, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는, 조성물.
구현예 55. 구현예 49 내지 구현예 54 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는, 조성물.
구현예 56. 구현예 49 내지 구현예 55 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
구현예 57. 구현예 49 내지 구현예 56 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
상이한 표적 핵산은 제1 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 58. 구현예 49 내지 구현예 57 중 어느 하나에 있어서, 이종 집단은 (iii) 제1 포획 서열의 길이 미만인 길이를 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 59. 구현예 49 내지 구현예 58 중 어느 하나에 있어서, 감소된 길이를 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
구현예 60. 구현예 49 내지 구현예 59 중 어느 하나에 있어서, 감소된 길이를 갖는 이종 집단의 개별적인 구성원은, 제1 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나, 제1 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는, 조성물.
구현예 61. 구현예 49 내지 구현예 60 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
상이한 표적 핵산은 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제2 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열을 5' 말단에 포함하는, 조성물.
구현예 62. 구현예 49 내지 구현예 61 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는, 조성물.
구현예 63. 구현예 49 내지 구현예 62 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는, 조성물.
구현예 64. 구현예 49 내지 구현예 63 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
상이한 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 (i) 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 65. 구현예 49 내지 구현예 64 중 어느 하나에 있어서, 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는, 조성물.
구현예 66. 구현예 49 내지 구현예 65 중 어느 하나에 있어서, 표적 핵산은 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열을 5' 말단에 포함하는, 조성물.
구현예 67. 구현예 49 내지 구현예 66 중 어느 하나에 있어서, 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
구현예 68. 구현예 49 내지 구현예 67 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
상이한 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
이종 집단은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 69. 구현예 49 내지 구현예 68 중 어느 하나에 있어서, 이종 집단은 (iii) 제2 포획 서열의 길이 미만인 길이를 갖는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는, 조성물.
구현예 70. 구현예 49 내지 구현예 69 중 어느 하나에 있어서, 개별 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
구현예 71. 구현예 49 내지 구현예 70 중 어느 하나에 있어서, 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 이종 집단의 개별적 구성원은, 제2 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하거나, 제2 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는, 조성물.
구현예 72. 구현예 49 내지 구현예 71 중 어느 하나에 있어서, 표적 핵산은 DNA인, 조성물.
실시예
본 발명은 다음에 따르는 예들에 의해 예시된다. 특정 예, 물질, 양, 및 절차는 본원에 설명된 바와 같은 본 발명의 범위 및 사상에 따라 광범위하게 해석되어야 함을 이해해야 한다.
실시예 1
일반 분석 방법 및 조건
달리 언급되지 않는 한, 이것은 본원에 기술된 실시예들에서 사용되는 일반적인 분석 조건을 설명한다.
인간 gDNA의 태그먼트화를 통해 어댑터의 범용 부분을 도입하도록 표준 NexterTM 라이브러리 준비로 시작하여 핵산 라이브러리를 생성하였다. 이어서, 이러한 범용 태그먼트화를, 상이한 어댑터 쌍들(PCR1-PCR21)의 각각에 대해 하나의 반응씩 개별적 반응들로 분할하였다. 이러한 각 반응에서, Nextera™ XT 라이브러리 준비 시약(Illumina, Inc., 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여, 표준 P5/P7 어댑터를 변형된 어댑터로 대체함으로써 12 사이클의 PCR을 통해 변형된 어댑터를 도입하였다. 변형된 어댑터는, (이하에서 개략적으로 설명하는 바와 같은) 표준 P5/P7 서열로부터의 변경을 이용하여 설계되었으며, Integrated DNA Technologies(IDT Inc., 일리노이주 Skokie)에 의해 합성되었다.
실시예 2
운동 지연에 대한 어댑터 돌연변이체의 평가
다양한 변형된 어댑터를 사용하여, 표준 Nextera™ 라이브러리(표 1)와는 다른 라이브러리를 생성하였다. 이들 어댑터는, 표준 (-4bp 또는 -9bp)보다 약간 짧았으며, 또는 P5/P7 영역의 길이를 따라 도입된 1개, 2개, 또는 3개의 불일치('워블' 염기: 각각 1W, 2W, 또는 3W)를 가졌다. 돌연변이의 범위는 완벽한 P5&P7 서열(PCR 1)에서 양측 말단(PCR 21)의 3개 불일치까지였다.
이어서, 각 라이브러리의 농도를 정량화하고, 라이브러리들을 동일한 농도로 정규화하였다. 이어서, 상이한 변형된 어댑터가 있는 라이브러리를, 맞춤형 프라이머와 함께 Illumina 플랫폼용 KAPA 라이브러리 정량화 키트(Kapa Biosystems)를 사용하여 qPCR 기기(BioRad CFX384 실시간 시스템)에서 별도로 증폭하여, 플로우셀 조건을 시뮬레이션하여 표 1의 결과를 생성하였다. 효율성은, qPCR에 대해 표준 정의된 바와 같이 Ct(임계 사이클)에 도달하는 데 필요한 사이클의 수로부터 계산되었다.
　 　 FCP5 FCP7
　 　 효율성
어댑터 번호 어댑터의 동일성 qPCR 3
1 PCR 1 - Nex Control 1.5079
2 PCR 2 αβ-4 1.4875
3 PCR 3 αβ-9 1.5229
4 PCR 4 - Nex P5 + 1W 1.4305
5 PCR 5 - Nex P5 + 2W 1.4160
6 PCR 6 - Nex P5 + 3W 1.3716
7 PCR 7 αβ-4 + 1W 1.3577
8 PCR 8 αβ-4 + 2W 1.3673
9 PCR 9 αβ-4 + 3W 1.3273
10 PCR 10 αβ-9 + 1W 1.4236
11 PCR 11 αβ-9 + 2W 1.4179
12 PCR 12 αβ-9 + 3W 1.3691
13 PCR 13 - 1MM + 1MM 1.3692
14 PCR 14 - 1MM + 2W 1.3789
15 PCR 15 - 1MM + 3W 1.3488
16 PCR 16 - 2W + 1MM 1.3504
17 PCR 17 - 2W + 2W 1.2971
18 PCR 18 - 2W + 3W 1.2980
19 PCR 19 - 3W + 1MM 1.2861
20 PCR 20 - 3W + 2W 1.2498
21 PCR 21 - 3W + 3W 1.2261
αβ-4는 어댑터에서 제거된 4개의 염기쌍을 가리키며, αβ-9는 어댑터에서 제거된 9개의 염기 쌍을 가리키며, 1W, 2W, 3W는, 어레이의 표면 상에 존재하는 포획 핵산에 결합되는 영역의 길이만을 따라 존재하는 1개, 2개, 또는 3개의 워블 불일치를 각각 가리키며, 1MM은 참 불일치를 가리키며, FCP5 및 FCP7은 전장 P5 및 P7 프라이머를 각각 가리킨다.
실시예 3
서열분석을 사용한 운동 지연에 대한 어댑터 돌연변이체의 평가
상이한 돌연변이 어댑터들을 선택하고 단독으로 또는 HiSeq™ 플로우셀에서 그룹으로 실행하였다(표 2). 모든 서열분석은 표준 시약 키트를 사용하여 Illumina HiSeqTMX 기기에서 수행되었다.
플로우셀의 레인 레인에 사용된 어댑터
레인 1 PCR 1
레인 2 PCR 2
레인 3 PCR 18
레인 4 PCR 6
레인 5 PCR 10
레인 6 PCR 1-2, 4-6, 10
레인 7 PCR 1-2, 7-8, 10, 11
레인 8 PCR 2, 6, 8, 12
결과도 3a에 도시된 바와 같이, 레인 1, 2, 및 4는, 불일치가 적고 효율성이 높은 어댑터를 사용한 반응이었으며, 예상대로 필터를 통과한 클러스터의 퍼센트와 강도가 높아졌다. 레인 3과 5는, 불일치가 많고 효율성이 낮은 어댑터를 사용한 반응이었으며, 예상대로 필터를 통과한 클러스터의 퍼센트와 강도가 낮았다. 레인 6, 7, 8은 고 효율 어댑터와 저 효율 어댑터의 혼합이었다. 반직관적으로, 혼합물은, 개별 구성요소들의 성능의 평균(예를 들어, 고 효율과 저 효율의 중간)의 성능을 발휘하지 못했지만, 필터를 통과하는 클러스터와 강도 모두에 있어서 모든 단일 유형 라이브러리를 능가하였다. 따라서, 놀라운 결과는, 평균 상동성을 줄임으로써, 평균 증폭 속도가 감소하더라도 나노웰의 소위 단일클론형성능의 속도가 개선되었다는 점이다. 신규한 점은, 어댑터 서열에 어느 정도의 가변성이 도입되어, 이제 주형 집단 간에 다양한 효율성이 있다는 점이다. 이러한 식으로, 다수의 주형이 패드 상에 시딩될 때, 일반적으로 나머지 주형보다 이점이 있는 주형이 패드를 명백하게 지배하도록 존재한다. 또한, 감소된 상동성은, 후속 증폭의 효율성에 영향을 주지 않고 첫 번째 복제에만 지연이 도입되도록 부속 복제에서 보정된다.
상이한 돌연변이 어댑터들을 선택하고 단독으로 또는 HiSeq™ 플로우셀에서 그룹으로 실행하였다(표 3). 이처럼, 모든 서열분석은 표준 시약 키트를 사용하여 Illumina HiSeq™ 기기에서 수행되었다.
플로우셀의 레인 레인에 사용된 어댑터
레인 1 PCR 1
레인 2 PCR 3
레인 3 PCR 10
레인 4 PCR 16
레인 5 PCR 1, 3, 6, 8, 9, 10, 16-18
레인 6 PCR 21
레인 7 PCR 1, 3, 6, 8, 9, 10, 16-18
레인 8 PCR 1, 3, 10
돌연변이 어댑터들의 그룹이 혼합물(예를 들어, 레인 7)에서 실행될 때, 이들은 동일한 농도로 조합되었다. 종래의 서열분석 실행, 즉, 제안된 방법을 사용하지 않는 경우에, 동일한 어댑터들의 혼합된 라이브러리들의 동일한 농도로 사용하면 플로우셀에서 동일한 비의 판독이 발생한다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 상이한 돌연변이 어댑터들의 혼합물은 최종 판독 카운트의 재표현을 초래하였으며, 이는 시드 농도가 아닌 해당 효율에 비례하였으며, 이에 따라 제안된 방법의 효능을 입증하였으며, 즉, 친화도가 낮은 어댑터는 더 긴 운동 지연을 가짐으로써, 결과적으로, 최종 판독의 비율이 낮았다.
본원에서 인용되는 모든 특허, 특허출원, 공개물, 및 전자적으로 이용가능한 자료(예를 들어, GenBank 및 RefSeq의 뉴클레오티드 서열 제출물, SwissProt, PIR, PRF, PDB의 아미노산 서열 제출물, 및 GenBank 및 RefSeq에 있어서 주석 있는 코딩 영역으로부터의 번역문을 포함함)의 완전한 개시 내용 전체는, 본원에 참고로 원용된다. 공개물에서 참조된 보충 자료(예를 들어, 보충 표, 보충 도면, 보충 자료와 방법, 및/또는 보충 실험 데이터)의 전문도 마찬가지로 참고로 원용된다. 본원의 개시 내용과 본원에 참조로 원용되는 임의의 문헌의 개시 내용(들) 간에 불일치가 존재하는 경우, 본원의 개시 내용이 우선한다. 전술한 상세한 설명 및 실시예는 명확한 이해를 위해서만 제공된 것이다. 이로부터 불필요한 제한사항만이 이해되어서는 안된다. 본 개시 내용은, 도시되고 설명된 정확한 세부 사항으로 제한되지 않으며, 당업자에게 명백한 변형은 청구범위에 의해 정의된 개시 내용에 포함될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분, 분자량 등의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 있어서 "약"이라는 용어에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 이에 따라, 달리 반대로 지시되지 않는 한, 명세서와 청구범위에 기재된 수치 파라미터는, 본 개시 내용에 의해 취득하고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사값이다. 적어도 청구범위에 대한 등가의 원칙을 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수를 고려하여 또한 일반적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 개시 내용의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위와 파라미터가 근사값임에도 불구하고, 특정 실시예에 설명된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된 것이다. 그러나, 모든 수치 값은, 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 범위를 본질적으로 포함한다.
모든 표제는, 독자의 편의를 위한 것이며, 별도로 명시하지 않는 한 표제 다음에 오는 텍스트의 의미를 제한하는 데 사용해서는 안 된다.

Claims (72)

  1. (a) 증폭 시약을 제공하는 단계로서,
    증폭 시약은 (i) 증폭 부위의 어레이 및 (ii) 복수의 상이한 변형된 이중 가닥 표적 핵산을 포함하는 용액을 포함하고,
    증폭 부위는 각 집단마다 포획 서열을 포함하는 포획 핵산의 두 개의 집단을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하고,
    상이한 변형된 표적 핵산은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하는 것인, 단계, 및
    (b) 증폭 시약을 반응시켜 용액으로부터의 개별 표적 핵산으로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 각각 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하는 단계
    를 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법.
  2. (a) 증폭 시약을 제공하는 단계로서,
    상기 증폭 시약은 (i) 증폭 부위의 어레이 및 (ii) 복수의 상이한 변형된 표적 핵산을 포함하는 용액을 포함하고,
    증폭 부위는 각 집단마다 포획 서열을 포함하는 포획 핵산의 두 개의 집단을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하고,
    상이한 변형된 표적 핵산은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하는 것인, 단계, 및
    (b) 증폭 시약을 반응시켜 용액으로부터의 개별 표적 핵산으로부터의 앰플리콘의 클론 집단을 각각 포함하는 복수의 증폭 부위를 생성하는 단계로서,
    상기 반응은,
    (i) 증폭 부위의 각각으로 수송되는 개별 표적 핵산으로부터 제1 앰플리콘을 생성하는 단계, 및
    (ii) 상기 증폭 부위의 각각으로 수송되는 개별 표적 핵산으로부터 또는 상기 제1 앰플리콘으로부터 후속 앰플리콘을 생성하는 단계
    를 포함하고, 후속 앰플리콘이 증폭 부위에서 생성되는 평균 속도는 제1 앰플리콘이 증폭 부위에서 생성되는 평균 속도보다 느린 것인 단계
    를 포함하는, 핵산을 증폭하는 방법.
  3. 어레이 상의 복수의 앰플리콘 부위의 각각에서 앰플리콘의 명백한 클론 집단을 검출하는 서열분석 절차를 수행하는 단계를 포함하는, 핵산 서열을 결정하는 방법으로서,
    상기 어레이는
    (a) 증폭 시약을 제공하는 단계로서,
    증폭 시약은 (i) 복수의 증폭 부위 및 (ii) 복수의 상이한 변형된 표적 핵산을 포함하는 용액을 포함하고,
    증폭 부위는 각 집단마다 포획 서열을 포함하는 포획 핵산의 두 개의 집단을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하고,
    상이한 변형된 표적 핵산은, 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하는 것인, 단계, 및
    (b) 증폭 시약을 반응시키는 단계
    를 포함하는 프로세스에 의해 만들어지는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    용액 내 상이한 변형된 표적 핵산의 수는 어레이의 증폭 부위의 수를 초과하고,
    상이한 변형된 표적 핵산은 복수의 증폭 부위에 대한 유체 접근을 갖고,
    증폭 부위의 각각은 복수의 상이한 핵산 중 여러 개의 핵산에 대한 용량을 포함하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 반응은,
    (i) 상이한 변형된 표적 핵산을 증폭 부위로 평균 수송 속도로 수송하는 단계, 및
    (ii) 상기 증폭 부위에 있는 표적 핵산을 평균 증폭 속도로 증폭하는 단계
    를 동시에 포함하고, 상기 평균 증폭 속도는 상기 평균 수송 속도보다 느린 것인, 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 용액 내 복수의 상이한 변형된 표적 핵산은,
    (i) 상이한 변형된 표적 핵산을 용액으로부터 증폭 부위로 수송하는 것, 및
    (ii) 증폭 부위에 있는 표적 핵산을 증폭 속도로 증폭하여, 앰플리콘의 명백한 클론 집단을 각각 포함하는 앰플리콘 부위의 어레이를 생성하는 것
    을 동시에 발생시키는 농도에 있는, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는 것인, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상이한 변형된 표적 핵산은 제1 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 (i) 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는 것인, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상이한 변형된 표적 핵산은 제1 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    이종 집단은 (iii) 제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    개별 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는 것인, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    제1 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 이종 집단의 개별 구성원은, 제1 포획 서열의 서열에 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하거나 제1 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는 것인, 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상이한 변형된 표적 핵산은 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제2 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열을 5' 말단에 포함하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는 것인, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상이한 변형된 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 (i) 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는 것인, 방법.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는 것인, 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상이한 변형된 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
  25. 제20항에 있어서,
    이종 집단은 (iii) 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    개별 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 뉴클레오티드인 길이를 갖는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 이종 집단의 개별 구성원은, 제2 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하거나 제2 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 것인, 방법.
  28. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 핵산이 DNA인, 방법.
  29. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    증폭 부위의 어레이는 표면 상의 특징부의 어레이를 포함하는 것인, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    특징부의 각각에 대한 면적은 증폭 부위로 수송되는 표적 핵산의 제외된 부피의 직경보다 큰 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    특징부는 비연속적이며, 포획제가 없는 표면의 개재성 영역(interstitial region)에 의해 분리된 것인, 방법.
  32. 제29항에 있어서,
    특징부 각각은, 비드, 웰, 채널, 리지, 돌출부, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  33. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    증폭 부위의 어레이는 용액 내의 비드 또는 표면 상의 비드를 포함하는 것인, 방법.
  34. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    증폭 부위로 수송되는 표적 핵산의 증폭은 등온선상으로 발생하는 것인, 방법.
  35. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    증폭 부위로 수송되는 상이한 변형된 표적 핵산의 증폭은 변성 사이클을 포함하지 않는 것인, 방법.
  36. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    앰플리콘의 클론 집단을 포함하는 복수의 증폭 부위가, 단계 (b) 동안 상이한 변형된 표적 핵산이 유체 접근을 가졌던 증폭 부위의 40%를 초과하는 것인, 방법.
  37. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b) 동안 각 증폭 부위의 용량을 채우도록 개별 증폭 부위에서 각각 개별 표적 핵산으로부터 충분한 수의 앰플리콘이 생성되는 것인, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    각 증폭 부위의 용량을 채우도록 앰플리콘이 생성되는 속도는 개별 표적 핵산이 개별 증폭 부위로 각각 수송되는 속도 미만인, 방법.
  39. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    수송은 수동 확산을 포함하는 것인, 방법.
  40. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    증폭 시약은 폴리머라제와 재조합효소를 더 포함하는 것인, 방법.
  41. 복수의 이중 가닥 표적 핵산의 용액을 제공하는 단계; 및
    범용 어댑터를 이중 가닥 표적 핵산의 양측 말단에 결찰(ligate)하여 제1 복수의 변형된 표적 핵산을 형성하는 단계
    를 포함하는 라이브러리를 생성하는 방법으로서,
    변형된 표적 핵산의 각각은 범용 어댑터가 측면에 있는 표적 핵산을 포함하고,
    범용 어댑터는 (i) 이중 가닥 핵산의 영역, 및 (ii) 3' 말단에서 범용 포획 결합 서열을 포함하는 단일 가닥 비-상보 핵산 가닥의 영역을 포함하고,
    범용 포획 결합 서열은 이종 집단을 포함하고,
    결찰은 범용 어댑터의 이중 가닥 핵산의 영역을 이중 가닥 표적 단편의 각 말단에 공유적으로 부착하는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 3' 말단에서의 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다른 것인, 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    3' 말단에서의 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다른 길이를 갖는 것인, 방법.
  44. 제41항에 있어서,
    3' 말단에서의 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다르거나, 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다르거나, 또는 이들의 조합에 의해 서로 다른 것인, 방법.
  45. 제41항에 있어서,
    단일 가닥 비-상보 핵산 가닥의 영역은 5' 말단에서 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는 것인, 방법.
  46. 제41항에 있어서,
    5' 말단에서의 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다른 것인, 방법.
  47. 제41항에 있어서,
    5' 말단에서의 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다른 길이를 갖는 것인, 방법.
  48. 제41항에 있어서,
    5' 말단에서의 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단의 구성원은 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오티드에서 서로 다르거나, 1개 내지 12개의 뉴클레오티드만큼 서로 다르거나, 또는 이들의 조합에 의해 서로 다른 것인, 방법.
  49. 증폭 부위의 어레이 및 증폭 부위에 결합된 적어도 하나의 표적 핵산을 포함하는 조성물로서,
    증폭 부위는 포획 핵산의 2개 집단을 포함하고, 각 집단은 포획 서열을 포함하고, 제1 집단은 제1 포획 서열을 포함하고, 제2 집단은 제2 포획 서열을 포함하며,
    표적 핵산은 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 제1 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제1 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 제1 범용 포획 결합 서열을 3' 말단에 포함하고,
    표적 핵산 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열에 혼성화되는, 조성물.
  50. 제49항에 있어서,
    제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는, 조성물.
  51. 제49항에 있어서,
    제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는, 조성물.
  52. 제49항에 있어서,
    어레이의 증폭 부위의 적어도 30%가 적어도 하나의 표적 핵산에 의해 점유되는, 조성물.
  53. 제52항에 있어서,
    제1 범용 포획 결합 서열은 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 (i) 제1 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하고,
    이종 집단의 구성원은 상이한 증폭 부위에 결합되는 것인, 조성물.
  54. 제53항에 있어서,
    제1 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는, 조성물.
  55. 제49항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는, 조성물.
  56. 제55항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
  57. 제56항에 있어서,
    조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
    상이한 표적 핵산은 제1 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 포함하는, 조성물.
  58. 제53항에 있어서,
    이종 집단은 (iii) 제1 포획 서열의 길이 미만인 길이를 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는, 조성물.
  59. 제58항에 있어서,
    감소된 길이를 갖는 개별 제1 범용 포획 결합 서열은 제1 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
  60. 제58항에 있어서,
    감소된 길이를 갖는 이종 집단의 개별적인 구성원은, 제1 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나, 제1 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는, 조성물.
  61. 제49항에 있어서,
    조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
    상이한 표적 핵산은 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열보다 낮은 제2 포획 서열에 대한 친화도를 갖는 보체를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열을 5' 말단에 포함하는, 조성물.
  62. 제61항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는, 조성물.
  63. 제62항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열의 보체는 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하는, 조성물.
  64. 제62항에 있어서,
    조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
    상이한 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 (i) 제2 포획 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 갖거나 (ii) 제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는, 조성물.
  65. 제62항에 있어서,
    제2 포획 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는 이종 집단의 구성원은 이종 집단의 나머지 구성원보다 많은 수로 존재하는, 조성물.
  66. 제49항에 있어서,
    표적 핵산은 제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 제2 범용 포획 결합 서열을 5' 말단에 포함하는, 조성물.
  67. 제66항에 있어서,
    제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
  68. 제66항에 있어서,
    조성물은 복수의 상이한 표적 핵산을 포함하고,
    상이한 표적 핵산은 제2 범용 포획 결합 서열의 이종 집단을 포함하고,
    이종 집단은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하는, 조성물.
  69. 제64항에 있어서,
    이종 집단은 (iii) 제2 포획 서열의 길이 미만인 길이를 갖는 개별 제2 범용 포획 결합 서열을 더 포함하는, 조성물.
  70. 제69항에 있어서,
    개별 제2 범용 포획 결합 서열은 제2 포획 서열의 길이보다 뉴클레오티드가 1개 내지 12개 적은 길이를 갖는, 조성물.
  71. 제70항에 있어서,
    제2 포획 서열의 길이 미만의 길이를 갖는 이종 집단의 개별적 구성원은, 제2 포획 서열의 서열에 대하여 비-상보적인 뉴클레오티드를 1개, 2개, 또는 3개 포함하거나, 제2 포획 서열의 서열과 100% 상보성을 갖는 보체를 포함하는, 조성물.
  72. 제49항에 있어서,
    표적 핵산은 DNA인, 조성물.
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