KR20210105833A - 자금우 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자금우(Ardisia japonica) 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루미틴을 마스킹하여 세포 내 수용체와의 결합을 억제함으로써, 인플루엔자 바이러스의 세포 내 유입을 억제할 수 있으며, 다양한 인플루엔자 서브타입에도 광범위하게 적용이 가능하여 다양한 항 인플루엔자 바이러스 식품, 의약, 사료 조성물에 널리 활용될 수 있다.

Description

자금우 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물 {Composition comprising extract of Ardisia japonica for anti-influenza virus}

본 발명은 자금우(Ardisia japonica) 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 급성 호흡기 감염질환인 독감의 원인체로, 공중보건학적으로 매우 중요하게 여겨지는 병원체 중의 하나이다. H1N1과 H3N2 아형의 A형 인플루엔자 바이러스와 Victoria와 Yamagata lineage의 B형 인플루엔자 바이러스로 구성되는 계절성 인플루엔자 바이러스(seasonal influenza virus)는 매년 겨울철 유행하며 사람들에게 큰 피해를 입히고 있다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 매년 전 세계적으로 약 3백만~5백만 명의 사람들이 계절성 인플루엔자 바이러스에 감염되어 심각한 병증을 겪고, 그 중 약 25만~50만 명의 사람들이 사망하는 것으로 알려졌다.

1918년 발생한 인플루엔자 바이러스 대유행 시 약 5천만 명의 사람이 사망하였으며, 1957년과 1968년에 발생한 인플루엔자 바이러스 대유행 시에는 약 백만 명의 사람이 사망한 것으로 알려졌다. 지난 2009년 신종 인플루엔자 바이러스에 의해 발생한 대유행 시에도 심각한 인적, 경제적 피해 및 사회적 혼란을 경험한 바 있다.

조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus) 역시 심각한 위협으로 여겨지고 있는데, 현재까지도 조류인플루엔자 바이러스의 지속적인 사람 감염 사례가 보고되고 있다. 특히, 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스는 약 59%, H7N9 조류인플루엔자 바이러스는 약 32%의 높은 치사율을 나타내는 것으로 분석되고 있어 WHO에서 예의주시하고 있는 질병의 하나이다.

이러한 인플루엔자 바이러스를 예방하기 위한 가장 효과적인 방법은 백신접종으로 알려졌으나, 백신만으로 인플루엔자 바이러스에 의한 피해를 조절하기에는 한계가 있다. 현재 계절성 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 접종하고 있음에도 전 세계적으로 매년 25만~50만 명의 사망자가 발행하고 있기 때문이다.

인플루엔자 백신은 인플루엔자 바이러스가 갖는 항원성 변이 특성 때문에 그 해 겨울에 유행할 바이러스를 연초에 예측한 뒤, 이에 대한 백신을 생산하는 생산체계에 따라 제작된다. 따라서, 제작된 백신이 그해 겨울 유행하는 인플루엔자 바이러스의 항원과 일치하지 않을 수 있으며, 이러한 경우 인플루엔자 바이러스 감염을 효과적으로 방어하지 못할 수도 있다. 또한, 예측하지 못한 시기에 신종인플루엔자 바이러스가 갑작스럽게 유행할 경우, 백신으로는 신속한 초기대응이 어려운 문제가 있다.

한편, 항바이러스제의 사용은 이러한 백신의 한계점을 극복할 수 있었다. 실제로 지난 2009년 발생한 신종인플루엔자 바이러스 대유행 시, 충분한 도즈(dose)의 백신이 준비되기 전, 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질 중 하나인 뉴라미다아제 (neuraminidase, NA)를 억제하는 항바이러스제인 오셀타미비르(oseltamivir, 상품명: Tamiflu)가 효과적인 신종 인플루엔자 바이러스 조절 수단으로 널리 처방되었다. 최근 연구에 따르면, 2009년 당시 오셀타미비르의 처방은 신종인플루엔자 바이러스로(A/Korea/01/2009(H1N1)부터 효과적으로 사람들을 보호한 것으로 분석되었다.

그러나 위와 같은 항바이러스제의 장점에도 불구하고, 지속적인 항바이러스제의 사용은 항바이러스제 내성 인플루엔자 바이러스의 출현을 유도할 수 있다. 실제로 지난 2007~2009년 사이 오셀타미비르에 대한 내성을 획득한 H1N1 아형의 계절성 인플루엔자 바이러스(A/Brisbane/59/2007)가 전세계적으로 출현하여 유행하였다. 이와 같은 상황이 현재 유행하고 있는 인플루엔자 바이러스에서도 나타날 수 있는 가능성이 높은 것으로 여겨지고 있으며, 실제로 국내 질병관리본부에서 오셀타미비르에 내성을 갖는 신종인플루엔자 바이러스 분리 사례를 보고한 바 있다. 또한, B형 인플루엔자 바이러스의 경우 A형 인플루엔자 바이러스에 비해 상대적으로 뉴라미다아제 억제제에 대한 감수성이 낮은 것으로 알려져 있다.

따라서, 항바이러스제에 내성을 갖는 바이러스의 발생 시 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항바이러스제 또는 항바이러스제와 함께 사용하였을 때 상승효과를 보일 수 있는 보조제의 개발이 매우 시급한 상황이다.

CN 106177400 A

본 발명자들은 새로운 항 인플루엔자 바이러스제에 대하여 연구를 수행하던 중, 자금우 추출물이 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 기능을 억제함을 확인하여 본 발명은 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자금우 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 자금우(Ardisia japonica) 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 자금우에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루미틴을 마스킹하여 세포 내 수용체와의 결합을 억제함으로써, 인플루엔자 바이러스의 세포 내 유입을 억제할 수 있으며, 다양한 인플루엔자 서브타입에도 광범위하게 적용이 가능하여 다양한 항 인플루엔자 바이러스 식품, 의약, 사료 조성물에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 자금우 추출물의 다양한 처리 조건을 나타낸 도이다.
도 2는 자금우 추출물 처리 방식에 따른 인플루엔자 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 자금우 추출물의 인플루엔자 바이러스 증식 억제 효과를 용균반 검사를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 자금우 추출물의 인플루엔자 바이러스 억제 프로세스를 확인하기 위한 표현형 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 자금우 추출물 처리 후 바이러스 단백질(Viral protein)인 NP(Nucleo protein)의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 자금우 추출물이 인플루엔자 바이러스 막 융합 기능에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 자금우 추출물이 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 분열에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 자금우 추출물의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 수용체 결합 억제 효과를 H1N1 및 H5N1 슈도 바이러스를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 자금우 추출물의 분획물 제조공정을 나타낸 모식도이다.
도 10은 자금우 추출물 분획물의 인플루엔자 바이러스 증식 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 자금우(Ardisia japonica) 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 마스킹하여 세포내 수용체와의 결합을 억제함으로써, 인플루엔자 바이러스의 세포 내 유입을 방해할 수 있으며, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 다양한 서브 타입에 효과를 나타낼 수 있다. 또한 인플루엔자 바이러스 전파에 관한 초기 대응에 효율적으로 이용될 수 있는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어, “자금우”는 지길자(地桔子)·왜각장(矮脚樟)이라고도 하며, 산지의 숲 밑에서 자란다. 땅속줄기가 옆으로 벋으면서 군데군데에서 줄기가 나오고, 가지가 갈라지지 않으며, 높이는 15～20cm이다. 어린 가지의 끝에 선모가 있으며, 잎은 어긋나지만 위의 1～2층은 돌려나고, 긴 타원형으로 두꺼우며 윤기가 있고, 가장자리에 잔 톱니가 있다. 꽃은 6월에 피고 양성이며 흰색 또는 연한 홍색이고 잎겨드랑이에서 밑을 향하여 핀다. 화관은 깊게 5개로 갈라지고 잔 점이 있으며, 5개의 수술과 1개의 암술이 있다. 열매는 장과로서 9월에 둥글고 붉게 익으며 다음해 꽃필 때까지 남아 있다.

본 발명의 자금우 추출물은 자금우 전체, 자금우 가지, 잎, 뿌리 또는 줄기를 제한없이 포함하여 추출한 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 자금우 전체를 추출용매를 통해 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 당업계에 공지된 추출, 분리 및 분획하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출, 분리 및 분획하여 수득한 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 자금우 추출 처리에 의해 얻어지는 것이며, 예를 들어 자금우의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함하며, 그 중에서도 극성용매 가용 추출물인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 자금우 추출물은 다양한 추출 용매와 추출 방법에 따라 추출될 수 있으며, 자금우부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매, 예를 들어 상기 용매로는 물, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등의 C₁-C₄ 저급 알코올 또는 이의 혼합용매를 사용할 수 있다.

바람직하게는 본 발명 추출물의 추출 용매로 메탄올을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 70 내지 100% (v/v) 메탄올을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 80% 내지 99.9% (v/v) 메탄올을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 메탄올을 사용하여 자금우 추출물을 제조하는 경우 항 인플루엔자 바이러스에 최적 효과를 나타내는 추출물을 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 자금우 추출물은 메탄올 추출물의 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 추출물의 물, 헥세인, 클로로포름, 에틸 아세테이트 또는 부틸 알코올 분획물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 헥세인, 클로로포름, 에틸 아세테이트 또는 부틸 알코올 분획물일 수 있다. 상기 헥세인, 클로로포름, 에틸 아세테이트 또는 부틸 알코올 분획물은 모두 자금우 메탄올 추출물이 나타내는 항 인플루엔자 바이러스 효과를 동등한 정도로 나타낼 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포 내 유입에 관여하는헤마글루티닌의 기능을 억제함으로써, 뉴라미니다아제를 억제하여 바이러스의 방출을 억제하는 타미플루(Tamiflu)와는 다른 기전으로 인플루엔자 바이러스를 억제할 수 있다.

따라서, 인플루엔자 바이러스에 존재하는 헤마글루티닌의 기능을 차단하는 것을 기전으로 하는 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스의 세부 유형과 무관하게 다양한 인플루엔자 바이러스에 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스일 수 있고, 바람직하게는 A형 인플루엔자 바이러스일 수 있고, 인간 인플루엔자 바이러스 및 조류 인플루엔자 바이러스가 모두 포함될 수 있다.

본 발명에서는 인간에게 독감을 유발하는 인플루엔자 H1N1 및 고병원성 조류인플루엔자 H5N1에 대하여, 자금우 추출물이 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 숙주 세포의 수용체 결합을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였으며, 이를 통해 자금우 추출물이 인간을 대상으로 하는 항바이러스제 뿐만 아니라 조류 독감을 예방하기 위한 목적의 항바이러스제로도 활용가능함을 확인하였다. 따라서 본 발명의 항 바이러스제의 타깃이 되는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 H1N1 또는 인플루엔자 H5N1 일 수 있다.

또한, 본 발명은 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 자금우 추출물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스를 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료" 는 본 발명에 따른 자금우 추출물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어, 상기 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스가 숙주세포의 막에 결합하는 것을 억제하는 것일 수 있고, 비리온의 숙주세포로의 침투를 억제할 수 있는 것일 수 있으며, 상기 결합 및 침투 억제능을 바탕으로 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 또는 폐렴일 수 있다.

본 발명의 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물은 자금우 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물에 있어서, 자금우 추출물은 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물은 또는 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001중량％ 내지 99.99중량％ 로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 자금우 추출물은 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물에 이들의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 자금우 추출물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물은 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스 감염과 동시에, 감염 즉시, 바이러스 감염의 초기 단계에서 바이러스의 세포 내 진입을 억제함으로써, 가장 효과적인 치료 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스 초기 감염 억제용일 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있고, 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다. 본 발명의 자금우 추출물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 본 발명의 짜금우 추출물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 자금우 추출물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 이들의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물의 일일 투여량은 약 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물은 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 항 인플루엔자 바이러스 조성물 또는 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 인플루엔자를 예방, 개선 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물, 및 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품, 건강기능식품 조성물에 있어, 상기 자금우 추출물은 바람직하게 조성물 대비 0.00001~50 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.

본 발명의 건강기능식품 또는 식품 조성물은 일 예로 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 또는 건강기능식품 조성물에 있어서, 자금우 추출물의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물, 또는 사료 첨가제에 관한 것이다.

본 발명의 자금우 추출물은 고위험성 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 기능을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 특히 조류 인플루엔자에 의한 감염 질환을 예방 또는 치료하기 위한 사료 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 조류는 조류 인플루엔자에 감염될 수 있는 개체를 제한없이 포함하나, 닭, 오리, 거위, 칠면조의 군으로부터 선택된 어느 하나의 조류일 수 있다. 자금우 추출물을 조류용 사료에 첨가 시 상기 사료 중량 대비 0.00001~50%의 함량으로 사료에 첨가하여 조류에 급여할 수 있다.

또한 본 발명은 자금우에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 항 인플루엔자 바이러스 조성물은 약학, 식품, 건강기능식품, 사료 조성물을 모두 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1: 자금우 추출물의 인플루엔자 바이러스 억제 효과 평가

1.1 자금우 추출물의 제조

전체 자금우를 메탄올로 추출한 메탄올 추출물 분획을 제조하여 사용하였다. 구체적으로 메탄올 추출은 출력주파수 40.0KHz, 1500W의 SD-ULTRASONIC(MUJIGAE) 및 99.9%(v/v) 메탄올(HPLC Grade) 추출 용매를 이용하여 수행하였으며, 30분 음파처리(Sonication) 후 2시간 정지를 10회 반복하여 추출하였다.

1.2 자금우 추출물 처리에 따른 효과

GFP 신호를 발현하는 재조합 PR8 인플루엔자 A 바이러스는 Dr. Adolfo Garcia-Sastre (Icahn School of Medicin at Mount Sinai, USA)로부터 제공받아 사용하였다. GFP 신호 발현 재조합 PR8 인플루엔자 A 바이러스를 Multiplicity of Infection (MOI) 0.1과 MOI 3.0으로 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)세포에 1시간 동안 감염시키고 실시예 1.1 에서 제조한 자금우 추출물을 처리하였다.

자금우 추출물은 (1) 바이러스 감염시키기 전에 자금우 추출물을 세포에 12시간 동안 처리하는 전 처리(pre-treatment), (2) 바이러스를 감염시키기 전 1시간 동안 바이러스와 추출물을 같이 배양한 다음 이들의 혼합물을 이용하여 세포를 바이러스에 감염시키는 동시 전처리(co-pre treatment), (3) 바이러스와 추출물을 전 배양시간 없이 동시 감염시키는 동시처리(co-treatment), (4) 바이러스 감염 후 12시간 동안 세포에 추출물을 처리하는 후처리(post-treatment) 방식으로 진행하였다. 본 발명 자금우 추출물의 처리 방식 모식도를 도 1에 나타냈다. 자금우 추출물은 0.01, 0.02, 0.05mg/ml 로 바이러스에 처리하였으며, 대조군으로 재조합 인플루엔자 바이러스만을 처리한 군, DMSO 1μl를 처리한 군을 설정하였다.

자금우 추출물 처리군에서의 인플루엔자 바이러스 MOI 값을 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 동시 전처리(co-pre treatment)와 동시처리(co-treatment) 방식에서 인플루엔자 바이러스만 감염시킨 대조군과 DMSO를 처리한 군에 비해, 자금우 추출물을 처리한 군의 경우, low MOI(:0.1) 와 high MOI(3.0) 모두에서 현저하게 낮은 GFP 신호를 확인하였다. 이러한 결과는 자금우 추출물이 인플루엔자 바이러스 증식을 억제한다는 것을 의미한다.

자금우 추출물의 항 인플루엔자 효과를 정량적으로 검증하기 위하여, 용균반검사(plaque assay)를 수행하였다. 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포의 배양액을 10배에서 100,000배까지 희석하여 바이러스의 역가(titer)를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 동시 전처리(co-pre treatment)와 동시 처리(co-treatment) 방식으로 자금우 추출물을 처리하였을 때, 바이러스 생성이 현저히 억제되는 것을 다시 한번 확인하였다. 특히 이러한 결과는 자금우 추출물이 바이러스의 세포 유입 시 수용체인 살리실산의 저해가 아닌 인플루엔자의 세포유입에 관여하는 바이러스의 단백질을 억제할 가능성을 시사하며, 인플루엔자 바이러스의 초기 감염 단계에서 자금우 추출물이 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.

실시예 2. 자금우 추출물의 인플루엔자 바이러스 억제 프로세스 확인

자금우 추출물의 인플루엔자 바이러스 억제 프로세스를 확인하기 위하여, 항바이러스제로 알려진 EGCG(Epigallocatechin gallate)와 리바비린(Ribavirin; RBV)을 이용하였다. EGCG는 인플루엔자 바이러스의 엔트리(entry)를 억제하고, 리바비린은 인플루엔자의 폴리머라아제(polymerase)를 억제하여 인플루엔자 바이러스의 복제(replication)를 억제하는 것으로 알려져 있는 물질이다.

MDCK 세포에 상기 시판용 항바이러스제 EGCG(Epigallocatechin gallate) 50 mM, 리바비린(Ribavirin; RBV) 100 mM와 자금우 추출물을 0.01 내지 0.05mg/ml 각각 인플루엔자 바이러스와 함께 처리하여 4시간 동안 감염시킨 후 인플루엔자 바이러스의 바이러스 단백질(viral protein)인 NP(Nucleo protein) 및 핵(Nucleus)를 염색(staining)하고, 이때 나타나는 표현형(Phenotype)을 비교하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 자금우 추출물을 처리한 실험군의 이미지는 EGCG를 처리한 결과와 매우 유사하게 나타났다. 이러한 결과는 자금우 추출물이 EGCG와 유사하게 인플루엔자 바이러스가 숙주세포의 막(membrane)에 결합하는 것을 억제하거나 비리온(Virion)의 숙주세포로의 침투를 억제하는 역할을 할 것임을 보여주는 결과이다.

실시예 3. 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포 진입 정도 비교

인플루엔자 바이러스가 숙주 세포로 진입 후 자손 바이러스(Progeny virus)를 생성하는데 걸리는 시간은 6시간으로 알려져 있다. 실시예 1에 기재된 동시 전처리 (Co-pre treatment) 방법으로 인플루엔자 바이러스 및 자금우 추출물을 처리하고, 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에 감염시켰다. 8시간 후에 MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스의 바이러스 단백질(Viral protein)인 NP(Nucleo protein)의 발현 정도를 웨스턴 블랏(western blot) 기법으로 비교하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 바이러스만 감염시킨 대조군과 DMSO 처리군에서는 NP(Nucleo protein)의 발현이 강하게 나타났다. 하지만 자금우 추출물을 동시 전처리한 실험군에서는 모두 NP 의 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 0.01mg/ml 처리한 실험군에서만 아주 희미한 NP(Nucleo protein)의 발현을 볼 수 있고, 0.02 mg/ml, 0.05 mg/ml 처리한 실험군에서는 인플루엔자 바이러스를 감염시키지 않은 음성 대조군(Negative control)인 MOCK과 같이 전혀 NP(Nucleo protein)의 발현을 확인할 수 없었다. 이러한 결과는 실시예 2의 결과와 일치하는 것으로, 자금우 추출물이 초기 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포로의 진입을 억제하는 것을 보여주는 결과이다.

실시예 4. 자금우 추출물의 숙주 세포 진입 억제 기전 확인

자금우 추출물이 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포로의 진입을 억제함을 확인한 상기 결과를 토대로, 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포로 진입에 가장 중요한 역할을 하는 인플루엔자 바이러스의 당단백질(Glycoprotein)인 헤마글루티닌(Hemagglutinin)의 기능을 저해하여, 숙주세포로의 진입 또는 막융합 기능을 억제하는지 확인하였다.

4.1 막 융합(Membrane fusion) 기능 억제 여부 확인

막융합 기능 억제 여부를 확인하기 위하여, 먼저 MDCK 세포에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 후, 실시예 1의 자금우 추출물을 처리하고 MDKC 세포들의 막 융합(Membrane fusion)을 유도한 뒤 핵을 염색하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 자금우 추출물을 처리하여도 인플루엔자 바이러스 막 융합 기능에는 크게 영향을 끼치지 않는 것을 확인하였다.

4.2 헤마글루티닌의 분열 억제 효과 확인

인플루엔자 바이러스의 막 융합이 일어나기 위해서는 인플루엔자 바이러스의 당단백질인 헤마글루티닌의 분열이 필요하다. 따라서, 자금우 추출물이 헤마글루티닌의 분열에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여, 293T 세포에 인플루엔자 바이러스의 당단백질인 헤마글루티닌 플라스미드를 형질주입(Transfection)을 통해 과발현 시킨 후, 실시예 1의 자금우 추출물을 0.01 내지 0.05mg/ml 1시간 동안 처리하였다. 이후, TPCK-trypsin(5μg/ml)을 처리하여 헤마글루티닌의 분열을 유도하였다. 헤마글루티닌의 분열 여부를 확인하기 위한 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 자금우 추출물 처리 실험군에서는 모두 헤마글루티닌의 분열이 일어났으며, 헤마글루티닌 2(HA₂, Hemagglutinin2) 발현 정도가 DMSO 처리군과 비교하여 영향을 받지 않음을 확인하였다.

4.3 헤마글루티닌의 수용체 결합 억제 확인

자금우 추출물이 헤마글루티닌의 기능 중 수용체 결합을 억제함으로써 항바이러스 효과를 나타내는 것인지 여부를 확인하기 위하여 슈도바이러스(Pseudovirus)를 이용한 실험을 수행하였다. 먼저 293T 세포에 형질주입(Transfection)을 통해, 마우스 백혈병 바이러스(Murine leukemia virus)의 구조 단백질(structural protein), 인플루엔자 바이러스의 당단백질인 헤마글루티닌, 뉴라미니데이즈(Neuraminidase)를 당단백질로 갖고 게놈에 루시퍼레이즈를 갖는 슈도바이러스를 제작하였다. 인플루엔자 바이러스로는 사람에게 독감을 유발하는 인플루엔자 H1N1뿐만 아니라 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 를 이용하여 H1N1 및 H5N1 슈도바이러스 2종을 제작하였다. 슈도바이러스에 실시예 1의 자금우 추출물을 처리하고 Vero 세포에 형질도입을 시킨 후, 루시퍼레이즈의 기질을 첨가하고 Microplate Reader(VARIOSAKN LUX, Thermo Fisher)를 이용하여 루미네센스(Luminescence)를 측정한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 자금우 추출물 처리는 0.01 내지 0.05mg/ml 처리군 모두에서 H1N1과 H5N1 슈도바이러스에 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 자금우 추출물이 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 숙주 세포의 수용체 결합을 억제하는 방식에 의해 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하여 항바이러스 효과를 나타냄을 보여주는 결과이다. 또한 자금우 추출물이 사람에게 독감을 유발하는 인플루엔자 H1N1뿐만 아니라 고병원성 조류인플루엔자 H5N1에도 효과가 있기 때문에 다양한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 서브타입에도 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 5. 자금우 추출물 분획 별 항바이러스 효과 확인

자금우 추출물의 다양한 분획을 제조하고 각 추출물 및 분획물에 따른 항바이러스 효과를 확인하였다. 먼저 실시예 1의 자금우 메탄올 추출물을 무극성 용액 헥세인(Hexane)과 증류수에 녹인 후, 헥세인과 증류수 층으로 분리하고 헥세인은 감압농축을 통해 분획물을 얻었다. 이후 위와 같은 방법으로 분획을 순차적으로 진행하였으며, 각 분획물 제조 공정을 도 9에 나타내었다. 도 9의 공정에 따라, 각각 헥세인 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 부틸 알코올 분획물, 증류수 분획물을 수득하였다. 각 분획물을 도 1에 따른 동시 전처리 방법에 따라 세포에 처리하고 감염된 세포의 배양액을 10배에서 100,000배까지 희석하여 바이러스의 역가(titer)를 측정하였다. 이들에서 용균반 검사를 수행하여 바이러스 증식 억제 효과를 정량하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 증류수 분획에서는 0.02 mg/ml에서부터 항바이러스 효과가 보였지만, 나머지 모든 분획에서는 모든 처리 농도에서 강하게 바이러스 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 인플루엔자 바이러스에 항바이러스 효과는 증류수 분획에서 가장 약하게 나타나고, 헥세인 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 부틸 알코올 분획물에서는 0.01mg/ml 처리만으로도 바이러스 증식이 효과적으로 억제됨을 확인하였다.

제제예 1. 식품 제제의 제조

1. 건강식품의 제조

자금우 추출물 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 g

비타민 C 10 mg

비오틴 10 g

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 g

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강음료의 제조

자금우 추출물 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 2. 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

자금우 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조할 수 있다.

2. 정제의 제조

자금우 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조할 수 있다.

3. 캡슐제의 제조

자금우 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조할 수 있다.

4. 주사제의 제조

자금우 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조할 수 있다.

5. 액제의 제조

자금우 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 다시 정제수를 가한다. 전체를 정제수로 가한 액제의 약을 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 최종적으로 액제를 제조할 수 있다.

Claims (12)

1. 자금우(Ardisia japonica) 추출물을 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 자금우 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 4 이하의 저급 알코올 추출물인, 항인플루엔자 바이러스 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 자금우 추출물은 메탄올 추출물의 물, 헥세인, 클로로포름, 에틸 아세테이트 또는 부틸 알코올 분획물인, 항 인플루엔자 바이러스 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스인, 항 인플루엔자 바이러스 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 H1N1 또는 인플루엔자 H5N1 유형인, 항 인플루엔자 바이러스 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 자금우 추출물은 인플루엔자 바이러스 초기 감염 억제용인, 항 인플루엔자 바이러스 조성물.
   
7. 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 또는 폐렴인, 약학적 조성물.
   
9. 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
   
10. 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    
11. 자금우 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 관련 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
    
12. 자금우에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는 항 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법.

Images