KR20210101481A

KR20210101481A - 초음파 출력부를 포함하는 노화세포 제거 장치

Info

Publication number: KR20210101481A
Application number: KR1020200015524A
Authority: KR
Inventors: 김소연; 김형민; 박기주; 김인우; 이수현
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2020-02-10
Filing date: 2020-02-10
Publication date: 2021-08-19
Also published as: US20210244972A1

Abstract

본 발명은 초음파 출력부를 이용하여 노화세포를 특이적으로 자극함으로써 노화세포 대식작용 촉진에 의해 노화세포를 제거할 수 있는 장치, 노화세포 제거용 키트, 세포 재생 촉진용 키트 및 피부 노화 억제를 위한 미용 방법으로, 특정 조건의 초음파 조사 시 노화세포를 선택적, 특이적으로 자극하고, 이로 인해 면역세포를 리쿠르팅하는 각종 사이토카인의 분비가 촉진되어, 노화세포만을 특이적으로 제거하고 더 나아가 세포 재생을 촉진하는 우수한 효과가 있다.

Description

초음파 출력부를 포함하는 노화세포 제거 장치 {A device for removing senescent cells comprising an ultrasound output unit}

본 명세서에는 초음파 출력부를 이용하여 노화세포를 특이적으로 자극함으로써 노화세포 대식작용 촉진에 의해 노화세포를 제거할 수 있는 장치, 노화세포 제거용 키트, 세포 재생 촉진용 키트 및 피부 노화 억제를 위한 미용 방법이 개시된다.

노화세포는 넓은 범위에서 단순히 세포 분열이 지속되어 노화된 세포(aged cell, senescent cell) 뿐 아니라, 다양한 원인에 의해 세포가 손상되어 세포 분열이 억제되어 증식이 불가능하거나 기능이 현격히 저하된 상태의 세포를 의미한다. 우리 몸에는 다양한 종류의 노화세포가 존재할 수 있는데, 기존의 항암제, 또는 방사선, 자외선 등 물리적 자극에 의해 손상된 노화세포, 발암 유전자의 축적에 의해 손상된 노화세포, 나이에 따라 지속된 세포분열 의한 노화세포 등이 그러한 예이다.

정상적인 상황에서, 세포 손상 또는 계속된 세포 분열에 의해 축적된 노화세포는 노화-관련 분비 표현형(senescent-associated secretory phenotype, SASP)이라는 염증 유발 사이토카인의 분비를 통해 대식세포 또는 CD4+ T 세포 등의 면역 작용에 의해 제거되어 신체 항상성을 유지한다.

그러나, 신체 및 조직의 노화, 면역작용의 저하 등으로 인해 조직의 노화세포가 적절히 제거되지 않으면 노화세포가 분비하는 SASP와 같은 사이토카인에 의해 염증반응이 증가되고, 특발성 폐섬유화증, 지방간, 간경변, 동맥경화, 당뇨, 관절염 등 노인성 질환을 일으키는 것으로 알려져 있다. 즉 노화세포는 단순히 늙은 세포가 아니라 제거가 되어야 하는 질병의 원인으로 인식되고 있는 실정이다.

이러한 노화세포를 제거함으로써, 생명연장 혹은 항노화 효과뿐 아니라 실제로 질병을 치료할 수 있음이 밝혀지고 있으며, 노화세포 특이적 바이오마커인 p16^INK4a를 프로모터로 이용하여 노화세포를 선별한 후 세포 사멸을 유도하는 방법, 노화세포와 노화되지 않은 세포를 비교하여 노화세포를 선택적으로 사멸할 수 있는 약물 스크리닝 등의 방법 등이 그러한 예이다. 동물 모델의 경우 노화세포를 선택적으로 제거하면, 평균 수명이 연장될 뿐 아니라, 털의 윤기, 눈의 맑기, 피부의 윤기, 개체 크기 등 노화 표현형 또한 월등히 차이나는 것으로 밝혀졌다.

또한, 노화세포를 선택적으로 제거하는 약물을 세놀리틱 약물(senolytic drug)이라고 하는데, 대표적인 예로, D+Q (Dasatinib + Quercetin), UBX0101 등이 있다. 세놀리틱 약물을 이용하면 수명 연장과 더불어 노화의 전반적인 현상을 줄일 뿐 아니라, 관절염 치료의 효과도 있음이 동물 모델을 통해 검증되었다. 2019년 발표된 임상 보고에 의하면, 폐섬유화증(IPF) 환자에게 세놀리틱 약물인 D+Q를 처리한 결과, 환자들의 보행시간과 의자에서 일어나는 시간 등이 회복되었다. 최근 세놀리틱 약물을 본격적인 치료제로 개발하고자 하는 노력들이 부각되고 있는데, 미국의 Oisin, 네델란드의 Cleara Biotech에서는 노화세포를 선택적으로 제거함으로써 노화 관련 질병 치료와 암을 치료하려는 시도를 진행하고 있고, 최근 우리나라에서도 세놀리틱 약물을 개발하려는 시도가 보고된 바 있다.

한편, 초음파 자극을 이용하여 질병을 치료하는 기술은 크게 고강도 초음파와 저강도 초음파를 이용한 기술로 나눌 수 있는데, 고강도 초음파는 주로 열적 삭마 효과를 이용하여 자궁근종, 전립선비대증, 전립선암, 전이성 골종양 및 수전증의 치료 목적으로 현재 임상에서 환자에게 사용되고 있다. 또한 골격계 질환 치료 및 관절 통증 완화에도 고강도 초음파를 이용한 임상 치료, 예를 들어 체외충격파치료술이 수행되고 있다. 저강도 초음파는 신경학/정신과적 장애 치료에 적용 가능하며, 현재 전임상 및 임상 연구가 진행되고 있고, 최근 관절염 치료 효과와 중간엽 줄기세포의 뼈 분화를 촉진하는 것으로 보고된 바 있다. 특히 관절염 치료의 경우, 염증 반응을 일으키는 사이토카인의 분비를 억제하여, 통증을 완화하는 효과를 나타낸다고 알려져 있다.

반면, 노화세포와 관련한 초음파 이용 기술은 아직 개발되지 않았는바, 본 발명자들은 초음파 자극을 이용하여 노화세포만을 특이적, 선택적으로 자극하고, 이에 의하여 면역세포 혹은 대식세포 리쿠르팅 효과를 증진시키고, 노화세포가 제거되는 효과를 촉진할 수 있는지 여부를 확인하고자 연구하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2016-0001890 A KR 10-2068724 B

Low-intensity pulsed ultrasound promotes bone morphogenic protein 9-induced osteogenesis and suppresses inhibitory effects of inflammatory cytokines on cellular responses via Rho-associated kinase 1 in human periodontal ligament fibroblasts, Joji Kusuyama 외 7인, J. Cell Biochem., 2019. Low-intensity pulsed ultrasound promotes spinal fusion by regulating macrophage polarization, Zi-Cheng Zhang 외 8인, Biomedicine & Pharmacotherapy, Volume 120, December 2019.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 초음파 출력부를 포함하고, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 노화세포 제거 장치를 제공하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 초음파 출력부; 및 설명서;를 포함하고,상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는 것이 기재된, 노화세포 제거용 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 초음파 출력부; 및 설명서;를 포함하고, 상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용 및 세포 재생을 촉진하고, 상기 세포 재생은 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파에 의한 정상 세포 이동 촉진에 의한 것이라는 것이 기재된, 세포 재생 촉진용 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 초음파를 피부 표면에 조사하는 단계를 포함하고, 상기 피부에 조사된 초음파는 피부 세포 중 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 피부 노화 억제를 위한 미용 방법을 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은, 초음파 출력부를 포함하고, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 노화세포 제거 장치를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은, 초음파 출력부; 및 설명서;를 포함하고,상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는 것이 기재된, 노화세포 제거용 키트를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 초음파 출력부; 및 설명서;를 포함하고, 상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용 및 세포 재생을 촉진하고, 상기 세포 재생은 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파에 의한 정상 세포 이동 촉진에 의한 것이라는 것이 기재된, 세포 재생 촉진용 키트를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 초음파를 피부 표면에 조사하는 단계를 포함하고, 상기 피부에 조사된 초음파는 피부 세포 중 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 피부 노화 억제를 위한 미용 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 특정 조건의 초음파 조사 시 노화세포를 선택적, 특이적으로 자극하고, 이로 인해 면역세포를 리쿠르팅하는 각종 사이토카인의 분비가 촉진되어, 노화세포만을 특이적으로 제거하고 더 나아가 세포 재생을 촉진하는 우수한 효과가 있다. 따라서, 노화세포가 제거 되지 않아 문제가 될 수 있는 노화 관련 질병 치료에 응용 가능하고, 초음파 조사(자극)가 용이한 피부에 적용 시, 노화세포 제거에 의한 피부 재생 및 피부 항노화 치료 장치로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용한 초음파 조사에 의한 노화세포 특이적 자극 및 이에 의한 효과를 모식화한 그림이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용한 초음파 조사에 의한 노화세포 자극 실험의 예시이다. 구체적으로, 도 2a는 초음파 조사 실험의 예시로, 초음파 트랜스듀서 위에 세포가 배양된 유리기판 기반 배양용기(정상 피부 섬유아세포, 또는 노화된 피부 섬유아세포를 포함)를 두고 초음파를 조사하는 사진이다. 또한, 도 2b는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 피부 섬유아세포에 초음파를 조사하고 그 효과를 분석하고자 하는 실험을 실시하는 일정을 나타낸 도이다.
도 3는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사에 의한 세포 활성 변화 여부를 확인한 그래프로, 구체적으로, 초음파 조사 전(con)과 초음파를 조사하고 난 후(+ US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old)의 활성 변화를 측정한 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사에 의한 세포 증식 속도 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 구체적으로, 초음파 조사 전(con)과 초음파를 조사하고 난 후(+ US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old)의 세포 증식 변화를 측정한 그래프이다.
도 4b 및 도 4c는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사에 의한 세포 주기 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 4b는 초음파 조사 전(con)과 초음파를 조사하고 난 후(+ US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old)에서 세포 주기 관련 단백질인 p16, p21의 mRNA를 qRT-PCR로 정량하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 또한, 도 4c는 초음파 조사 전(con)과 초음파를 조사하고 난 후(+ US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old)에서 세포 주기를 DNA 양을 통해 FACS로 분석한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사 전(Con)과 초음파를 조사하고 난 후(US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old)에서의 노화세포 특이적인 노화 관련 β-갈락토시다제(senescent associated beta galactosidase, SA β-gal) 단백질의 활성을 x-gal로 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사 전(con)과 초음파를 조사하고 난 후(+ US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old)에서의 노화세포 특이적인 사이토카인인 IL-6, IL-8, MMP-1 및 IL-1B의 4 종의 노화-관련 분비 표현형(senescent-associated secretory phenotype, SASP) 변화를 qRT-PCR로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사에 의한 노화세포 특이적 단핵구(THP-1) 및 대식세포(M0, M1, M2)의 이동 증가 내지 리쿠르팅 효과를 측정하기 위한 트랜스웰(transwell) 실험의 개요를 모식화한 도이다.
도 7b 내지 도 7d는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사에 의한 노화세포 특이적 단핵구(THP-1) 및 대식세포의 이동 변화를 확인하기 위해 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 단핵구 및 대식세포를 염색한 결과를 나타낸 도로서, 도 7b는 이동한 단핵구 및 대식세포를 염색한 결과를 나타낸 사진이고, 도 7c는 단핵구를 염색한 사진을 이용하여 이동한 단핵구의 염색계수를 수치화한 그래프이며, 도 7d는 이동한 대식세포(M0, M1, M2)의 염색계수를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사 전(Con)과 초음파를 조사하고 난 후(+US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old)에서의 면역세포를 리쿠르팅하는 사이토카인의 변화를 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 이용하여 초음파 조사 전(Con)과 초음파를 조사하고 난 후(US) 정상 피부 섬유아세포(Young)와 노화 피부 섬유아세포(Old) 각각의 배양액에 의해 정상 섬유아세포의 이동 정도를 측정하여 세포 재생 효과를 확인한 사진 및 그래프이다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.

본 명세서의 일 측면에서, "특이적"이라는 용어는 "선택적"이라는 용어와 동일한 의미를 가지고, 서로 교환하여 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 초음파 출력부를 포함하고, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 노화세포 제거 장치를 제공한다.

본 발명의 일 측면은 초음파 출력부를 포함하는 노화세포 제거 장치를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 초음파 출력부는 초음파를 출력 내지 조사할 수 있는 구성으로, 구체적으로, 초음파 트랜스듀서를 포함할 수 있으나, 개체에 초음파를 조사 가능한 것이라면 그 종류 및 초음파 출력부를 이루는 개별 구성요소는 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 5 kHz 내지 450 MHz의 중심 주파수를 가지는 저강도 초음파일 수 있다. 구체적으로 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파의 중심 주파수는 5 kHz 이상, 10 kHz 이상, 50 kHz 이상, 100 kHz 이상, 150 kHz 이상, 200 kHz 이상, 250 kHz 이상, 300 kHz 이상, 350 kHz 이상, 400 kHz 이상, 450 kHz 이상, 500 kHz 이상, 550 kHz 이상, 600 kHz 이상, 650 kHz 이상, 700 kHz 이상, 750 kHz 이상, 800 kHz 이상, 850 kHz 이상, 900 kHz 이상, 910 kHz 이상, 920 kHz 이상, 930 kHz 이상, 940 kHz 이상, 950 kHz 이상, 960 kHz 이상, 970 kHz 이상, 980 kHz 이상, 990 kHz 이상, 1 MHz 이상, 1.1 MHz 이상, 1.2 MHz 이상, 1.3 MHz 이상, 1.4 MHz 이상, 1.5 MHz 이상, 1.6 MHz 이상, 1.7 MHz 이상, 1.8 MHz 이상, 1.9 MHz 이상, 2 MHz 이상, 2.1 MHz 이상, 2.2 MHz 이상, 2.4 MHz 이상, 2.5 MHz 이상, 2.6 MHz 이상, 2.7 MHz 이상, 2.8 MHz 이상, 2.9 MHz 이상, 3 MHz 이상, 4 MHz 이상, 5 MHz 이상, 10 MHz 이상, 50 MHz 이상, 100 MHz 이상, 150 MHz 이상, 200 MHz 이상, 250 MHz 이상, 300 MHz 이상, 350 MHz 이상, 400 MHz 이상일 수 있고, 450 MHz 이하, 400 MHz 이하, 350 MHz 이하, 300 MHz 이하, 250 MHz 이하, 200 MHz 이하, 150 MHz 이하, 100 MHz 이하, 50 MHz 이하, 10 MHz 이하, 5 MHz 이하, 4 MHz 이하, 3 MHz 이하, 2.9 MHz 이하, 2.8 MHz 이하, 2.7 MHz 이하, 2.6 MHz 이하, 2.5 MHz 이하, 2.4 MHz 이하, 2.3 MHz 이하, 2.2 MHz 이하, 2.1 MHz 이하, 2 MHz 이하, 1.9 MHz 이하, 1.8 MHz 이하, 1.7 MHz 이하, 1.6 MHz 이하, 1.5 MHz 이하, 1.4 MHz 이하, 1.3 MHz 이하, 1.2 MHz 이하, 1.1 MHz 이하, 1 MHz 이하, 990 kHz 이하, 980 kHz 이하, 970 kHz 이하, 960 kHz 이하, 950 kHz 이하, 940 kHz 이하, 930 kHz 이하, 920 kHz 이하, 910 kHz 이하, 900 kHz 이하, 850 kHz 이하, 800 kHz 이하, 750 kHz 이하, 700 kHz 이하, 650 kHz 이하, 600 kHz 이하, 550 kHz 이하, 500 kHz 이하, 450 kHz 이하, 400 kHz 이하, 350 kHz 이하, 300 kHz 이하, 250 kHz 이하, 200 kHz 이하, 150 kHz 이하, 100 kHz 이하, 50 kHz 이하 또는 10 kHz 이하일 수 있고, 보다 구체적으로 15 kHz 이상 150 MHz 이하일 수 있고, 보다 더 구체적으로 150 kHz 이상 15 MHz 이하일 수 있으나, 초음파의 중심 주파수는 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 조절할 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 -10 MPa 내지 10 MPa의 음향 압력을 가질 수 있다. 구체적으로 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파의 음향 압력은 -10 MPa 이상, -8 MPa 이상, -6 MPa 이상, -4 MPa 이상, -2 MPa 이상, -1 MPa 이상, -800 kPa 이상, -600 kPa 이상, -400 kPa 이상, -200 kPa 이상, -80 kPa 이상, -60 kPa 이상, -40 kPa 이상, -20 kPa 이상, 0 kPa 이상, 20 kPa 이상, 40 kPa 이상, 60 kPa 이상, 80 kPa 이상, 100 kPa 이상, 120 kPa 이상, 140 kPa 이상, 160 kPa 이상, 180 kPa 이상, 200 kPa 이상, 210 kPa 이상, 220 kPa 이상, 230 kPa 이상, 240 kPa 이상, 260 kPa 이상, 280 kPa 이상, 300 kPa 이상, 500 kPa 이상, 1 MPa 이상, 2 MPa 이상, 3 MPa 이상, 4 MPa 이상, 5 MPa 이상, 6 MPa 이상, 7 MPa 이상, 8 MPa 이상 또는 9 MPa 이상일 수 있고, 10 MPa 이하, 9 MPa 이하, 8 MPa 이하, 7 MPa 이하, 6 MPa 이하, 5 MPa 이하, 4 MPa 이하, 3 MPa 이하, 2 MPa 이하, 1 MPa 이하, 900 kPa 이하, 800 kPa 이하, 700 kPa 이하, 600 kPa 이하, 500 kPa 이하, 400 kPa 이하, 300 kPa 이하, 280 kPa 이하, 260 kPa 이하, 250 kPa 이하, 240 kPa 이하, 230 kPa 이하, 220 kPa 이하, 200 kPa 이하, 150 kPa 이하, 100 kPa 이하, 50 kPa 이하, 0 kPa 이하, -50 kPa 이하, -100 kPa 이하, -500 kPa 이하, -1 MPa 이하, -5 MPa 이하 또는 -10 MPa 이하일 수 있으나, 초음파의 음향 압력은 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 조절할 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 0.02 Hz 내지 500 kHz의 펄스반복주파수(Pulse repetition frequency)를 가질 수 있다. 구체적으로 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파의 펄스반복주파수는 0.02 Hz 이상, 0.1 Hz 이상, 1 Hz 이상, 10 Hz 이상, 50 Hz 이상, 60 Hz 이상, 70 Hz 이상, 75 Hz 이상, 80 Hz 이상, 85 Hz 이상, 90 Hz 이상, 91 Hz 이상, 92 Hz 이상, 93 Hz 이상, 94 Hz 이상, 95 Hz 이상, 96 Hz 이상, 97 Hz 이상, 98 Hz 이상, 99 Hz 이상, 100 Hz 이상, 101 Hz 이상, 102 Hz 이상, 103 Hz 이상, 104 Hz 이상, 105 Hz 이상, 106 Hz 이상, 107 Hz 이상, 108 Hz 이상, 109 Hz 이상, 110 Hz 이상, 150 Hz 이상, 200 Hz 이상, 300 Hz 이상, 400 Hz 이상, 500 Hz 이상, 600 Hz 이상, 700 Hz 이상, 800 Hz 이상, 900 Hz 이상, 1 kHz 이상, 10 kHz 이상, 100 kHz 이상, 200 kHz 이상, 300 kHz 이상 또는 400 kHz 이상일 수 있고, 500 kHz 이하, 400 kHz 이하, 300 kHz 이하, 200 kHz 이하, 100 kHz 이하, 10 kHz 이하, 1 kHz 이하, 900 Hz 이하, 800 Hz 이하, 700 Hz 이하, 600 Hz 이하, 500 Hz 이하, 400 Hz 이하, 300 Hz 이하, 200 Hz 이하, 150 Hz 이하, 140 Hz 이하, 130 Hz 이하, 120 Hz 이하, 110 Hz 이하, 109 Hz 이하, 108 Hz 이하, 107 Hz 이하, 106 Hz 이하, 105 Hz 이하, 104 Hz 이하, 103 Hz 이하, 102 Hz 이하, 101 Hz 이하, 100 Hz 이하, 99 Hz 이하, 98 Hz 이하, 97 Hz 이하, 96 Hz 이하, 95 Hz 이하, 94 Hz 이하, 93 Hz 이하, 92 Hz 이하, 91 Hz 이하, 90 Hz 이하, 85 Hz 이하, 80 Hz 이하, 75 Hz 이하, 70 Hz 이하, 60 Hz 이하, 50 Hz 이하, 40 Hz 이하, 30 Hz 이하, 20 Hz 이하, 10 Hz 이하, 1 Hz 이하 또는 0.1 Hz 이하일 수 있고, 보다 구체적으로 0.2 Hz 이상 50 kHz 이하일 수 있고, 보다 더 구체적으로 2 Hz 이상 5 kHz 이하일 수 있으나, 초음파의 펄스반복주파수는 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 조절할 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 0.1 내지 99.9%의 듀티 사이클(duty cycle)을 가질 수 있다. 구체적으로 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파의 듀티 사이클은 0.1 % 이상, 1 % 이상, 5 % 이상, 10 % 이상, 11 % 이상, 12 % 이상, 13 % 이상, 14 % 이상, 15 % 이상, 16 % 이상, 17 % 이상, 18 % 이상, 19 % 이상, 20 % 이상, 25 % 이상, 30 % 이상, 35 % 이상, 40 % 이상, 45 % 이상, 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상 또는 90 % 이상일 수 있고, 99 % 이하, 90 % 이하, 80 % 이하, 70 % 이하, 60 % 이하, 50 % 이하, 45 % 이하, 40 % 이하, 35 % 이하, 30 % 이하, 29 % 이하, 28 % 이하, 27 % 이하, 26 % 이하, 25 % 이하, 24 % 이하, 23 % 이하, 22 % 이하, 21 % 이하, 20 % 이하, 15 % 이하, 10 % 이하, 5 % 이하 또는 1 % 이하일 수 있고, 보다 구체적으로 1 % 이상 90 % 이하일 수 있고, 보다 더 구체적으로 5 % 이상 80 % 이하일 수 있으나, 초음파의 듀티 사이클을 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 조절할 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 따른 노화세포 제거 장치는 초음파 조절부를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 초음파 조절부는 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 초음파의 중심 주파수, 음향 압력, 펄스반복주파수 및 듀티 사이클로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조건을 최적화하여 조절할 수 있다.

본 발명의 일 측면은 상기 초음파 조절부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하는 노화세포 제거 장치를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 세포는 초음파 조사를 통해 노화세포를 제거하기 위한 목적의 개체의 세포라면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용 가능하다. 구체적으로 상기 개체는 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 또는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 개체는 노화세포를 갖는 개체일 수 있고, 구체적으로 노화세포의 적절한 제거가 일어나지 않아 발현되는 노화 표현형이 발현된 개체, 보다 구체적으로, 노화 관련 β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase)의 활성이 증가되거나, 노화세포 특이적 사이토카인, 예를 들어 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8), 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 및 인터루킨-1B (interleukin-1B, IL-1B)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가되거나, 노화-관련 분비 표현형(senescent-associated secretory phenotype, SASP)의 분비량이 증가된 개체일 수 있고, 보다 구체적으로 피부 노화가 진행된 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 노화세포는 단순히 세포 분열이 지속되어 노화된 노화된 세포(aged cell, senescent cell) 뿐만 아니라, 다양한 원인에 의해 세포가 손상되어 세포 분열이 억제되어 증식이 불가능하거나 기능이 현격히 저하된 상태의 세포를 의미한다. 상기 노화세포는 구체적으로 세포 분열이 지속되어 노화된 세포(aged cell, senescent cell), 항암제, 독성 물질 등과 같은 화학적 자극, 방사선, 자외선 등과 같은 물리적 자극에 의해 손상된 노화세포 또는 발암 유전자의 축적에 의해 손상된 노화세포일 수 있고, 보다 구체적으로 노화 관련 β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase)의 활성이 증가되거나, 노화세포 특이적 사이토카인, 예를 들어 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8), 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 및 인터루킨-1B (interleukin-1B, IL-1B)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가되거나, 노화-관련 분비 표현형(senescent-associated secretory phenotype, SASP)의 분비량이 증가된 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 노화세포는 노화 섬유아세포, 노화 멜라노사이트(melanocyte), 노화 케라티노사이트(keratinocyte), 노화 근육세포, 노화 상피세포, 노화 혈관 내피세포, 노화 뼈세포, 노화 연골세포, 노화 심장 근육세포, 노화 간세포, 노화 췌장세포 및 노화 신장세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 노화 섬유아세포, 노화 멜라노사이트 및 노화 케라티노사이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로 노화 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위 내지 초음파 조사의 목적에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 자극은 세포, 구체적으로 노화세포를 포함하는 세포에 초음파가 조사되는 것을 의미하며, 구체적으로 자극은 세포에 초음파가 조사되어 세포에서 특정 반응을 촉진 또는 억제하거나, 특정 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 촉진 또는 억제하여 세포의 표현형에 영향을 끼치는 것일 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 초음파는 1 분 내지 400 분 동안 조사될 수 있고, 구체적으로, 초음파는 1 분 이상, 2 분 이상, 3 분 이상, 4 분 이상, 5 분 이상, 6 분 이상, 7 분 이상, 8 분 이상, 9 분 이상, 10 분 이상, 11 분 이상, 12 분 이상, 13 분 이상, 14 분 이상, 15 분 이상, 16 분 이상, 17 분 이상, 18 분 이상, 19 분 이상, 20 분 이상, 25 분 이상, 30 분 이상, 35 분 이상, 40 분 이상, 45 분 이상, 50 분 이상, 60 분 이상, 90 분 이상, 120 분 이상, 180 분 이상, 240 분 이상, 300 분 이상 또는 360 분 이상 조사될 수 있고, 400 분 이하, 360 분 이하, 300 분 이하, 240 분 이하, 180 분 이하, 120 분 이하, 90 분 이하, 60 분 이하, 50 분 이하, 45 분 이하, 40 분 이하, 39 분 이하, 38 분 이하, 37 분 이하, 36 분 이하, 35 분 이하, 34 분 이하, 33 분 이하, 32 분 이하, 31 분 이하, 30 분 이하, 29 분 이하, 28 분 이하, 27 분 이하, 26 분 이하, 25 분 이하, 24 분 이하, 23 분 이하, 22 분 이하, 21 분 이하, 20 분 이하, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하로 조사될 수 있으나, 초음파의 조사 시간은 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 조절할 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에서, 초음파는 하루에 1 회 내지 10 회의 횟수로 조사될 수 있고, 구체적으로, 초음파는 하루에 1 회 이상, 2 회 이상, 3 회 이상, 4 회 이상, 5 회 이상, 6 회 이상, 7 회 이상, 8 회 이상 또는 9 회 이상 조사될 수 있고, 10 회 이하, 9 회 이하, 8 회 이하, 7 회 이하, 6 회 이하, 5 회 이하, 4 회 이하, 3 회 이하 또는 2 회 이하로 조사될 수 있으나, 초음파의 조사 횟수는 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 조절할 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에서, 초음파는 하루에 1 회 내지 한 달에 1 회의 간격으로 조사될 수 있고, 구체적으로 1 일에 1 회, 2 일에 1 회, 3 일에 1 회, 4 일에 1 회, 5 일에 1 회, 6 일에 1 회, 7 일에 1 회, 10 일에 1 회, 15 일에 1 회, 20 일에 1 회, 25 일에 1 회, 30 일에 1 회의 간격으로 조사될 수 있으나, 초음파의 조사 간격은 초음파가 조사되는 개체, 개체의 부위, 세포 종류 내지 초음파 조사의 목적에 따라 조절할 수 있으며, 상기 범위에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 노화세포 특이적 자극은 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서 특이적으로 특정 반응이 촉진 또는 억제되거나, 특정 유전자의 발현 또는 단백질의 활성이 촉진 또는 억제되어 특정 유전자의 발현량 또는 단백질의 활성 정도의 변화가 큰 것을 의미하고, 이로 인해 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서의 표현형의 변화가 큰 것일 수 있다. 구체적으로, 노화세포 특이적 자극은 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화 관련 β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase)의 활성; 또는 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8), 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 및 인터루킨-1B (interleukin-1B, IL-1B)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 노화세포 특이적 사이토카인의 발현;을 노화세포 특이적으로 증가시키는 것일 수 있거나, 정상 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서의 단핵구 또는 대식세포의 이동 정도가 큰 것일 수 있거나, 정상 또는 어린 세포에 비하여 콜로니-자극 인자(colony-stimulating factor, CSF), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (chemokine (C-X-C motif) ligand 1, CXCL1) 및 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3 (chemokine (C-C motif) ligand 3, CCL3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역세포 리쿠르팅(recruiting) 사이토카인의 발현량을 증가시키는 것일 수 있거나, 정상 또는 어린 세포에 비하여 노화세포의 사멸을 촉진하거나 세포 재생을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화 관련 β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase, SA β-gal)의 활성을 노화세포 특이적으로 증가시키는 것일 수 있다. 상기 노화 관련 β-갈락토시다제는 오직 노화세포에서만 β-갈락토시드의 단당류로의 가수분해를 촉매하는 가수 분해 효소로, p16^INK4a와 함께 세포 노화의 바이오마커로 알려져 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파에 의해 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서의 노화 관련 β-갈락토시다제의 활성 증가 정도가 클 수 있고, 구체적으로, 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포에서의 노화 관련 β-갈락토시다제의 활성 정도가 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.5 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상 또는 10 배 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8), 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 및 인터루킨-1B (interleukin-1B, IL-1B)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 노화세포 특이적 사이토카인의 발현을 노화세포 특이적으로 증가시키는 것일 수 있다. 상기 노화세포 특이적 사이토카인은 노화-관련 분비 표현형(senescent-associated secretory phenotype, SASP)이라고도 불리며, 상기 노화-관련 분비 표현형을 발현 내지 나타내는 노화세포는 높은 수준의 염증성 사이토카인, 면역 조절제, 성장 인자 및 프로테아제를 분비한다. 또한, 상기 노화-관련 분비 표현형은 만성 염증을 유도하여 정상적인 조직 기능을 방해하고, 면역계를 자극하여 노화 세포를 제거한다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 노화세포 특이적 사이토카인 또는 노화-관련 분비 표현형은 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8), 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 및 인터루킨-1B (interleukin-1B, IL-1B)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서의 노화세포 특이적 사이토카인의 발현량을 증가시킬 수 있고, 구체적으로, 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포 특이적 사이토카인의 발현량을 초음파 조사 전 또는 초음파를 조사하지 않은 때에 비하여 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.5 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상 또는 10 배 이상 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포에서 특이적으로 단핵구(monocyte) 또는 대식세포(macrophage)의 이동을 촉진시키는 것일 수 있다. 상기 단핵구는 혈관에서 발견되는 대식작용을 할 수 있는 백혈구 세포로서, 단핵구는 조직으로 이동한 후 거기서 대식세포가 되어 대식작용을 일으키므로, 단핵구의 이동이 증가 또는 활발해졌다는 것은 대식작용이 촉진된 것을 의미할 수 있다. 상기 대식세포는 개체, 구체적으로 동물 체내 모든 조직에 분포하여 면역을 담당하는 세포로서, 대식세포는 M0 대식세포, M1 대식세포, M2 대식세포 등이 있고, 이 중 M0 대식세포 및 M1 대식세포는 대식작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서 특이적으로 단핵구 또는 대식세포의 이동을 촉진시킬 수 있고, 구체적으로 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서의 단핵구 또는 대식세포의 이동을 초음파 조사 전 또는 초음파를 조사하지 않은 때에 비하여 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.5 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상 또는 10 배 이상 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서 특이적으로 M0 대식세포 또는 M1 대식세포의 이동을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 콜로니-자극 인자(colony-stimulating factor, CSF), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (chemokine (C-X-C motif) ligand 1, CXCL1) 및 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3 (chemokine (C-C motif) ligand 3, CCL3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역세포 리쿠르팅(recruiting) 사이토카인의 발현을 노화세포 특이적으로 증가시키는 것일 수 있다. 상기 면역세포 리쿠르팅 사이토카인은 대식세포 또는 면역세포를 리쿠르팅하는 것으로 알려져 있는 사이토카인으로, 상기 면역세포 리쿠르팅 사이토카인의 발현량 증가는 대식작용이 촉진된 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 면역세포 리쿠르팅 사이토카인은 콜로니-자극 인자(colony-stimulating factor, CSF), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (chemokine (C-X-C motif) ligand 1, CXCL1) 및 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3 (chemokine (C-C motif) ligand 3, CCL3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포에서의 면역세포 리쿠르팅 사이토카인의 발현량을 초음파 조사 전 또는 초음파를 조사하지 않은 때에 비하여 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.5 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상 또는 10 배 이상 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 세포 활성, 세포 증식 및 세포 주기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 있어 노화세포 특이적인 영향이 없는 것일 수 있고, 상기 노화세포 특이적인 영향이 없다는 것은, 정상 세포 또는 어린 세포의 초음파 조사 전 또는 초음파를 조사하지 않은 때와 초음파를 조사한 후의 세포 활성, 세포 증식 또는 세포 주기의 변화 정도와 노화세포의 초음파 조사 전 또는 초음파를 조사하지 않은 때와 초음파를 조사한 후의 세포 활성, 세포 증식 또는 세포 주기의 변화 정도가 통계적으로 유의미한 차이가 없는 것을 의미한다. 이로부터, 본 발명의 일 측면의 장치는 초음파 조사로 세포 활성, 세포 증식 또는 세포 주기에 영향을 끼치지 않고, 노화세포만을 특이적으로 자극하여 노화세포에서의 대식작용을 촉진시켜 노화세포 특이적으로 사멸을 촉진시킬 수 있고, 이로써 노화세포를 제거할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포 특이적으로 노화세포의 대식작용을 촉진하는 것일 수 있다. 상기 대식작용은 세포 찌꺼기, 이물질, 미생물, 암세포, 비정상적인 단백질 등을 집어삼켜서 분해하는 식작용(phagocytosis)을 의미하며, 구체적으로 대식세포의 식작용일 수 있다. 본 발명의 일 측면에서 있어서, 노화세포의 대식작용 촉진은 노화세포가 분해되는 식작용이 촉진되는 것일 수 있고, 노화세포 특이적 대식작용 촉진은 정상 세포 또는 어린 세포에 비하여 노화세포만을 특이적으로 제거 내지 사멸시키는 대식작용이 촉진되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포 특이적으로 사멸을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 세포 재생을 촉진하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파에 의해 세포 이동이 촉진되어 세포 재생이 촉진되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 세포 이동은 정상 세포 또는 어린 세포의 이동일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 정상 세포 또는 어린 세포보다 노화세포를 특이적으로 제거하여 정상 세포 또는 어린 세포의 이동을 촉진시켜 이러한 세포 이동 정도를 초음파 조사 전 또는 초음파를 조사하지 않은 때에 비하여 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.5 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상 또는 10 배 이상 증가시킴으로써 세포 재생을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명은 초음파 출력부; 및 설명서;를 포함하고, 상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는 것이 기재된, 노화세포 제거용 키트를 제공한다. 상기 초음파 출력부, 초음파 조건, 노화세포, 자극, 대식작용 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 설명서에는 상기 초음파가 조사되는 세포 종류에 따라 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파의 초음파 중심 주파수, 음향 압력, 펄스반복주파수(Pulse repetition frequency) 및 듀티 사이클(duty cycle)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조건을 최적화하여 조절하는 것이 추가로 기재된 것일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 노화세포 제거용 키트는 초음파 조절부를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 초음파 출력부; 및 및 설명서;를 포함하고, 상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용 및 세포 재생을 촉진하고, 상기 세포 재생은 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파에 의한 세포 이동 촉진에 의한 것이라는 것이 기재된, 세포 재생 촉진용 키트를 제공한다. 상기 초음파 출력부, 초음파 조건, 노화세포, 자극, 대식작용, 세포 재생, 세포 이동 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 일 측면에 따른 세포 재생 촉진용 키트는 초음파 조절부를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 초음파를 피부 표면에 조사하는 단계를 포함하고, 상기 피부에 조사된 초음파는 피부 세포 중 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 피부 노화 억제를 위한 미용 방법을 제공한다. 상기 초음파, 초음파 조사, 세포, 노화세포, 대식작용 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 피부에 초음파가 조사되는 개체는 초음파 조사를 통해 피부 노화를 억제 또는 피부 노화세포를 제거하기 위한 미용 목적의 개체라면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용 가능하다. 구체적으로 상기 개체는 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 또는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 개체는 노화세포를 갖는 개체일 수 있고, 구체적으로 노화세포의 적절한 제거가 일어나지 않아 발현되는 노화 표현형이 발현된 개체, 보다 구체적으로, 노화 관련 β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase)의 활성이 증가되거나, 노화세포 특이적 사이토카인, 예를 들어 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8), 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 및 인터루킨-1B (interleukin-1B, IL-1B)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가되거나, 노화-관련 분비 표현형(senescent-associated secretory phenotype, SASP)의 분비량이 증가된 개체일 수 있고, 보다 구체적으로 피부 노화가 진행된 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예] 초음파를 이용한 세포 자극

초음파 조사 시 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포를 제거하는지를 확인하기 위해, ATCC 사(USA)에서 구매한 인간 피부 섬유아세포 HS68 (CRL-1635)을 이용하여 하기와 같은 과정을 수행하였다.

먼저, 상기 HS68 세포를 10% 소태아혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다. 배지 및 배지 첨가물은 모두 Gibco사의 제품을 사용하였다. 하기 실험예들의 대조군인 어린 세포(young)는 상기 HS68 세포를 20번 이내로 계대 배양한 것(P20)으로 주로 P16-20을 사용하였고, 실험군인 노화세포(old)는 오랜 세포분열에 의한 결과 노화된 세포로서, 상기 HS68 세포를 40번 정도 계대 배양한 것으로 주로 P38-43을 사용하였다.

초음파 조사는 도 2a와 같이 이루어졌으며, 저강도 초음파 자극을 위한 트랜스듀서(NMB-M155A, 동일기연)를 장착한 용기(SPL Life science) 위에 지름이 35 mm인 세포 배양 용기를 위에 두고 초음파 자극을 유도하였다. 구체적으로, 상기 어린 세포 및 노화세포 각각을 계대하여 35pi 디쉬에 각 1x10⁵ 개씩 도포하고 하루 후에 초음파를 세포에 조사하였다. 세포 배양 용기의 경우 바닥의 두께가 180 um 정도, 넓이가 3 cm²의 유리판으로 되어있어 초음파의 통과가 용이하다. 세포 자극을 위한 초음파 조건은 구체적으로 다음과 같다. 1.5 MHz, 243 kPa 음향 압력, 20 % duty cycle, 100 Hz 반복율(repetition rate)으로 고정하였고, 세기는 800 mW/cm²로 20 분간 1회 조사하였다. 이 후, 세포 계대 후 2일(Day 2, 초음파 조사 후 1일), 4일(Day 4, 초음파 조사 후 3일)에 세포를 거두어 하기 실험예의 실험을 각각 진행하였으며, 실험 스케쥴은 도 2b와 같다.

[실험예 1] 초음파 조사에 의한 세포 활성, 세포 증식, 세포 주기 변화 여부 확인

초음파 조사에 의하여 세포 활성, 세포 증식, 세포 주기가 변화하는지 여부를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

[실험예 1-1] 세포 활성 변화 여부 확인

초음파 조사에 의한 세포의 활성 변화를 확인하기 위해 트리판 블루 제외실험(Trypan blue exclusion test)을 하기와 같이 수행하였다.

먼저, 실시예의 세포 계대 후 2일, 4일이 지난 세포를 아큐타제(Accutase)(Gibco)를 이용하여 용기에서 떼어낸 후 기존에 있던 배지를 세척하고 세포를 트리판 블루(Trypan blue)(Sigma-Aldrich) 와 1:1 비율로 섞었다. 섞은 용액을 혈구계(hemocytometer)(DHC-N01-5, incyto)에 넣고 트리판 블루가 염색되지 않은 살아있는 세포의 수를 세었다. 이 때 초음파 세기를 0, 7.5, 60, 800 mW/cm²로 바꾸어 가며 세포의 활성 변화를 측정하였고, 그 중 800 mW/cm² 로 실험한 경우의 활성 변화를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 도 3a 및 도 3b의 활성 변화는 초음파를 조사하지 않은 세포의 활성을 100%로 두고, 초음파를 조사한 후 세포의 활성 변화를 상대적으로 나타낸 것이다.

도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 어린 세포 및 노화세포 모두 초음파를 조사한 후 1일(Day 2+US) 혹은 3일(Day 4+US) 후 세포 활성이 약간 감소하였으나, 이러한 변화는 통계적으로 유의미한 수준은 아니다. 즉, 초음파 조사에 의해 세포의 활성의 변화는 미미함을 확인하였다.

[실험예 1-2] 세포 증식 변화 여부 확인

초음파 조사에 의한 세포 증식 변화를 확인하기 위해 상기 실험예 1-1의 실험으로부터 세포의 증식 속도를 측정하고 그 결과를 도 4a에 나타내었고, 이로부터 세포가 증식되어 원래 숫자의 2배가 되는 정도(doubling time)를 유추하여 이러한 doubling time으로부터 세포 증식 변화 여부를 확인하였다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 노화세포의 경우 세포의 증식 속도가 어린 세포에 비해 훨씬 늦어져, 약 2 배 이상 차이가 나는 것으로 확인되었으나, 어린 세포와 노화세포 모두 초음파를 조사하여도 세포의 증식 속도(도 4a의 그래프의 기울기)가 변하지 않은 것을 확인하였다.

[실험예 1-3] 세포 주기 변화 여부 확인

초음파 조사에 의한 세포 주기 변화를 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 세포의 주기에 중요한 역할을 하는 단백질, 구체적으로 p16 및 p21의 mRNA 발현량을 qRT-PCR을 통해 측정하고 이의 변화를 초음파 조사 후 3일 후(세포 계대 후 4일)에 살펴보았다.

먼저, GeneJET RNA purification kit(Thermofisher)을 이용하여 실시예의 세포 계대 후 4일이 지난 세포의 세포 내에서 RNA를 분리하였다. 그 후 1ug의 RNA를 기반으로 cDNA를 합성하여 SYBRgreen을 사용하여 타겟 유전자 발현 분석을 시행하였으며, 그 결과는 도 4b에 나타내었다. 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.

타겟 유전자명	구분	염기서열	서열번호
p16	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-GATCCAGGTGGGTAGAAGGTC-3'	서열번호 1
p16	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-CCCCTGCAAACTTCGTCCT-3'	서열번호 2
p21	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG-3'	서열번호 3
p21	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG-3'	서열번호 4
GAPDH	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'	서열번호 5
GAPDH	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3'	서열번호 6

또한, 실시예의 세포 계대 후 4일이 지난 세포를 이용하여 FACS 분석을 통해 세포 주기를 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예의 세포 계대 후 4일이 지난 세포를 아큐타제(Accutase)(Gibco)를 이용하여 단일 세포로 분리한 후, 차가운 PBS(Cold PBS)로 세척하였다. 그 후 70% 에탄올 용액을 사용하여 세포를 고정시킨 다음, 50 μg/mL의 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide, PI) 용액을 사용하여 4℃에서 10분간 DNA를 염색하였다. 상기 프로피디움 요오드화물로 염색된 DNA의 양을 유세포 분석(flow cytometry)(cytoflex, beckman)을 통해 알아보았으며 데이터는 flowjo 프로그램을 이용하여 분석하고, 그 결과를 도 4c에 나타내었다.

도 4b에 나타난 바와 같이, 노화세포에서 p16의 발현량은 차이가 나지 않으나 p21의 발현량은 증가되었다. p16의 경우 어린 세포와 노화세포 모두 초음파에 의해 약간 증가하는 경향을 보였고, p21의 경우 초음파에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.

또한, 도 4c에 나타난 바와 같이, 노화세포(Old)의 경우 어린 세포(Young)에 비해 G0/G1기에 정지되어 있는 세포의 분포가 증가되었다. 초음파를 조사한 경우 어린 세포(Young의 US)와 노화세포(Old의 US) 모두 G2기 세포의 분포가 변화되었으나 이러한 변화는 어린 세포와 노화세포에서 나타나는 세포 주기 변화를 고려할 때 미미한 수준이었다.

도 4b 및 도 4c의 결과를 통해, 초음파 조사 시 노화세포 특이적으로 세포 주기가 변하지 않는 것을 확인하였다.

상기 실험예 1-1 내지 1-3으로부터, 초음파 조사는 어린 세포와 노화세포 모두에 있어, 세포의 활성, 세포 증식 속도 및 세포 주기에 영향을 끼치지 않음을 확인하였다.

[실험예 2] 초음파 조사에 의해 노화 관련 β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase) 활성의 노화세포 특이적 증가 여부 확인

초음파 조사에 의한 세포의 노화 정도의 변화를 노화 관련(SA) β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase, SA β-gal)의 활성 변화로 확인하기 위해, β gal staining kit(Cell Signaling, S9860)를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하여 x-gal 염색으로 SA β-gal 단백질 활성을 확인하였다. 상기 SA β-gal은 노화세포에서 특이적으로 증가한다고 알려져 있는 단백질이다.

상기 실시예의 계대 후 2일, 4일이 지난 세포를 고정시킨 후, β gal 용액 (1 mg/mL)을 넣고 공기의 흐름을 차단하기 위해 배양 용기를 접착하였다. 상기 배양 용기를 37℃에 하룻밤 둔 후 PBS로 씻고 나서 색상의 변화를 현미경을 통해 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 초음파 조사 전(Con) 어린 세포(Young)에 비해 노화세포(Old)의 경우 SA β-gal 단백질 양이 증가되고 단백질 활성을 나타내어, 파란색으로 염색되는 양이 보다 많았다. 초음파를 조사 후 3일 후(계대 후 4일, US)에는 어린 세포의 경우 별다른 변화가 관찰되지 않았으나, 노화세포의 경우 SA-β-gal 활성이 더욱 증가되어 더 많은 세포에서 염색이 되는 것을 확인하였다.

[실험예 3] 초음파 조사에 의한 노화세포 특이적 사이토카인 증가 여부 확인

초음파 조사에 의해 노화세포 특이적 사이토카인인 노화-관련 분비 표현형(senescent-associated secretory phenotype, SASP)의 발현 증가 여부를 상기 실험예 1-3과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 확인하였다.

이 때 사용한 프라이머는 표 2와 같으며, qRT-PCR 수행 결과는 도 6에 나타내었다.

타겟 유전자명	구분	염기서열	서열번호
IL-6	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-CCACACAGACAGCCACTCACC-3'	서열번호 7
IL-6	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-CTACATTTGCCGAAGAGCCCTC-3'	서열번호 8
IL-8	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-CTCTCTTGGCAGCCTTCCTGATT-3'	서열번호 9
IL-8	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-AACTTCTCCACAACCCTCTGCAC-3'	서열번호 10
MMP-1	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-AGCTAGCTCAGGATGACATTGATG-3'	서열번호 11
MMP-1	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-GCCGATGGGCTGGACAG-3'	서열번호 12
IL-1B	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-CAGCTACGAATCTCCGACCAC-3'	서열번호 13
IL-1B	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-GGCAGGGAACCAGCATCTTC-3'	서열번호 14

도 6에 나타난 바와 같이, 어린 세포(Young)에 비해 노화세포(Old)의 경우 SASP 사이토카인들이 모두 증가되어 있음을 확인하였고, 어린 세포의 경우 초음파 조사 후 3일 후(계대 4일 후, Young + US)에는 SASP 사이토카인의 변화가 미비하였으나, 노화 세포(계대 4일 후, Old + US)의 경우 SASP 사이토카인들이 큰 폭으로 증가한 것을 확인하였다.

상기 실험예 2 및 3을 통해, 초음파 자극은 어린 세포에는 영향이 없으나, 노화세포만 선택적 또는 특이적으로 노화세포 특이적 마커와 사이토카인을 모두 증가시키는 것을 확인하였다.

[실험예 4] 초음파 조사에 의한 노화세포 특이적 대식작용 촉진 여부 확인

초음파 조사에 의해 노화세포 특이적으로 면역세포 리쿠르팅(recruiting), 및 단핵구 및 대식세포의 이동이 촉진되는지를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

[실험예 4-1] 노화세포 특이적 단핵구 및 대식세포의 이동 증가 여부 확인

초음파 조사에 의해 노화세포 특이적으로 단핵구 및 대식세포의 이동이 증가하는지를 확인하기 위해, 인간 단핵구 THP-1을 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받았고, 8 μm 포어 사이즈의 팔콘 세포 배양 인서트(Falcon cell culture inserts)(Corning Co., NY, USA) 및 24 웰 플레이트 (SPL life science)를 사용하였다. 실험 과정은 도 7a에 나타난 바와 같이 우선 transwell 위쪽에는 단핵구 또는 대식세포를 배양하고, transwell의 아래쪽에는 초음파가 조사된 또는 조사되지 않은 어린 세포 또는 노화세포의 배양액을 배양하였다. 이 때 상층액에 포함된 어린 세포 또는 노화세포에서 분비된 사이토카인의 정도에 따라 단핵구 또는 대식세포가 transwell의 아래쪽으로 이동하게 되고, 이동된 세포는 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인 가능하다.

구체적으로, THP-1은 RPMI-1640(Welgene, Korea)를 바탕으로 10% 소태아혈청(fetal bovine resrum, FBS), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (P/S) 및 0.1 mM β-머캅도에탄올(mercaptoethanol)을 첨가한 배지에서, 37℃ 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. THP-1 세포주는 단핵구와 대식세포의 중간단계의 세포로, 대식세포로 분화시키기 위해 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 처리하는 방법을 따랐다. 간단히 기술하면, THP-1 단핵구 세포주에 20 nM의 PMA (Tocris Bioscience)를 2일 동안 처리하여 M0 대식세포로 분화시켰고, M0 대식세포에 20 ng/ml LPS 와 20 ng/ml INF-γ를 처리하여 M1 대식세포로, 40 ng/ml IL-4와 20 ng/ml IL-13을 처리하여 M2 대식세포로 편향시켰다.

그 후, 각 2Х10⁵의 상기 단핵구(THP-1) 및 대식세포(MO 대식세포, M1 대식세포, M2 대식세포)를 200 μL의 RPMI-1640(Welgene, Korea)에 섞어 인서트에 넣고, underwell에는 실시예의 초음파가 조사되지 않은 어린 세포 및 노화세포, 3일간 초음파가 조사(계대 4일 후)된 어린 세포와 노화세포의 배양액을 각각 800 μL 씩 넣었다. 그런 다음, 준비된 인서트를 각 underwell에 삽입하고 37℃ 5% CO₂ 환경에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후에 이동 및 침윤하지 않은 필터 윗부분의 세포를 면봉으로 제거하고, 폴리카보네이트 필터(polycarbonate filter)를 통해 이동한 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 염색계수 하였으며, 그 결과는 도 7b 내지 도 7d와 같다.

도 7b는 단핵구 및 대식세포를 transwell 위쪽에 배양한 경우의 세포 사진 및 크리스탈 바이올렛 염색 결과이다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 어린 세포(Young)에 비해 노화세포(Old)의 경우 초음파를 조사(US)하게 되면 염색되는 정도가 증가하는바, 이를 통해 초음파 조사가 노화세포 특이적으로 단핵구 및 대식세포의 이동을 촉진시킴을 확인하였다.

도 7c는 상기 크리스탈 바이올렛으로 염색된 단핵구(THP-1)를 계수한 결과를 나타낸 그래프로, 어린 세포는 초음파 조사 유무에 따른 단핵구의 이동 변화가 크기 않은 반면, 노화세포는 단핵구의 이동이 초음파 조사 후 노화세포(Old)에서 유의미하게 증가함을 확인하였다.

도 7d는 단핵구(THP-1) 대신 상기 3 종의 대식세포(M0, M1, M2)를 사용하여 동일한 실험을 반복한 결과로, 어린 세포는 초음파 조사 유무에 따른 상기 3 종의 대식세포의 이동 변화가 크기 않은 반면, 노화세포는 대식세포의 경우 특이하게도 대식작용에 중요한 M0 대식세포, M1 대식세포의 이동이 초음파 조사 후 노화세포(Old)에서 유의미하게 증가하나, M2 대식세포의 경우에는 그 증가가 미미함을 확인하였다.

[실험예 4-2] 면역세포 리쿠르팅 사이토카인 증가 여부 확인

상기 실험예 4-1로부터 초음파 조사 시 노화세포 특이적으로 단핵구 및 대식세포의 이동이 촉진됨을 확인하였는바, 그 원인을 확인하기 위해 상기 실험예 1-3과 동일한 방법으로 어린 세포와 노화세포에서 발현되는 사이토카인들 중 대식세포 또는 면역세포를 리쿠르팅한다고 알려져 있는 사이토카인의 mRNA 발현을 qRT-PCR로 측정하였다.

이 때 사용한 프라이머는 표 3과 같으며, qRT-PCR 수행 결과는 도 8에 나타내었다.

타겟 유전자명	구분	염기서열	서열번호
TNF-α	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-ATGAGCACTGAAAGCATGATCC-3'	서열번호 15
TNF-α	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-GAGGGCTGATTAGAGAGAGGTC-3'	서열번호 16
TGF-β1	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-AGGGCTACCATGCCAACTTCT-3'	서열번호 17
TGF-β1	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-CCGGGTTATGCTGGTTGTACA-3'	서열번호 18
GM-CSF	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-CACTGCTGCTGAGATGAATGAAA-3'	서열번호 19
GM-CSF	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-GTCTGTAGGCAGGTCGGCTC-3'	서열번호 20
CXCL1	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-GAAAGCTTGCCTCAATCCTG-3'	서열번호 21
CXCL1	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-CTTCCTCCTCCCTTCTGGTC-3'	서열번호 22
CCL2	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-GAGAGGCTGAGACTAACCCAGA-3	서열번호 23
CCL2	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-ATCACAGCTTCTTTGGGACACT-3'	서열번호 24
CCL3	전방향 프라이머 (Forward primer)	5'-GGCTCTCTGCAACCAGTTCT-3'	서열번호 25
CCL3	역방향 프라이머 (Reverse primer)	5'-TGAAATTCTGTGGAATCTGCC-3'	서열번호 26

도 8에 나타난 바와 같이, 세포의 종류와 관계없이 초음파 조사에 의해 염증관련 사이토카인인 TNF-α, TGF-β1의 변화는 미미하였다. 다만, 노화세포(Old con)의 경우 면역세포 리쿠르팅 사이토카인으로 알려진 CSF, CXCL1, CCL3가 증가하고, 상기 3 종의 사이토카인은 초음파 조사 시 노화세포 특이적으로 더욱 증가하는 것을 확인하였다.

즉, 실험예 4-1 및 4-2로부터 초음파 조사에 의해 노화세포에서만 특이적으로 면역세포 리쿠르팅 사이토카인이 증가하고 이러한 결과로 인해 실제로 단핵구 또는 대식세포(M0 대식세포 및 M1 대식세포)의 이동이 실제로 증가하는 것을 확인하였다.

[실험예 5] 초음파 조사에 의한 세포 재생 촉진 확인

초음파 조사 시 노화세포 특이적 사이토카인 분비량 증가 및 노화세포 특이적 제거에 의해 세포 재생이 촉진되는지를 확인하기 위해, 정상 섬유아세포 집단에 상처를 낸 뒤 초음파를 조사하지 않은 어린 세포 및 노화세포 각각의 배양액과, 초음파가 조사된 어린 세포 및 노화세포 각각의 배양액을 모아서 상처가 난 정상 섬유아세포에 처리하고, 시간이 흐른 뒤 상처가 난 자리가 정상 섬유아세포로 채워짐을 통해 이들의 이동 정도를 관찰하고 상처 치유 분석(wound healing assay)을 수행하였다.

구체적으로, 24-웰 플레이트에 단일 세포층의 섬유아세포가 90% 이상 융합(confluent)하도록 접종하였다. 그 후, 옐로우 피펫팁(Yellow pipette tip)을 이용하여 플레이트 바닥을 긁어 세포가 부착되지 않은 부분을 만들었다. 그런 다음, PBS로 2번 헹궈 떨어져 나간 세포들을 제거하고 상기 실시예의 초음파를 조사하지 않은 어린 세포 및 노화세포 각각의 배양액과, 3일간 초음파가 조사된 어린 세포 및 노화세포(계대 4일 후) 각각의 배양액을 처리하였다. 상처가 생긴 후 0 시간과 20 시간에 같은 위치를 현미경(x40)으로 촬영하여 20시간 동안 줄어든 면적을 ImageJ (National Institutes of Health, USA)로 측정하고, 그 결과를 도 9a 및 9b에 나타내었다.

도 9a에 나타난 바와 같이, 어린 세포(Young)는 초음파 조사에 의한 정상 섬유아세포의 이동 정도가 크지 않은 반면, 노화세포(Old)에 초음파를 조사한 후 모은 배양액을 처리한 경우 정상 섬유아세포가 가장 많이 이동하는 것을 확인하였다. 즉, 초음파 조사에 의한 노화세포 특이적인 사이토카인의 변화는 정상 섬유아세포의 이동을 또한 촉진하여, 대식작용에 의해 세포가 제거된 후 세포 재생을 촉진하는 효과가 있다.

종합적으로, 초음파 조사 시, 노화세포만을 특이적으로 자극하여 노화세포가 분비하는 면역세포 리쿠르팅 관련 사이토카인의 분비가 증진되고, 이에 의하여 단핵구 및 대식세포 (M0 대식세포, M1 대식세포)의 리쿠르팅이 촉진되어 노화세포 특이적으로 대식작용이 증진되며, 정상 섬유아세포의 이동이 촉진되어 재생능력 또한 증가함을 알 수 있었다. 이를 통해, 초음파는 노화세포를 특이적으로 자극하여 세포 활성, 세포 증식 속도 및 세포 주기에 영향 없이 노화세포에서 특이적으로 대식작용을 촉진하여 노화세포를 제거하고 세포 재생을 촉진하는 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A device for removing senescent cells comprising an ultrasound output unit <130> 20p040/ind <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16 forward primer <400> 1 gatccaggtg ggtagaaggt c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16 reverse primer <400> 2 cccctgcaaa cttcgtcct 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 forward primer <400> 3 aggtggacct ggagactctc ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 reverse primer <400> 4 tcctcttgga gaagatcagc cg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 acccactcct ccacctttga 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 ctgttgctgt agccaaattc gt 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 7 ccacacagac agccactcac c 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 8 ctacatttgc cgaagagccc tc 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 forward primer <400> 9 ctctcttggc agccttcctg att 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 reverse primer <400> 10 aacttctcca caaccctctg cac 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 forward primer <400> 11 agctagctca ggatgacatt gatg 24 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 reverse primer <400> 12 gccgatgggc tggacag 17 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1B forward primer <400> 13 cagctacgaa tctccgacca c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1B reverse primer <400> 14 ggcagggaac cagcatcttc 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 15 atgagcactg aaagcatgat cc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 16 gagggctgat tagagagagg tc 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta1 forward primer <400> 17 agggctacca tgccaacttc t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta1 reverse primer <400> 18 ccgggttatg ctggttgtac a 21 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF forward primer <400> 19 cactgctgct gagatgaatg aaa 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-CSF reverse primer <400> 20 gtctgtaggc aggtcggctc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1 forward primer <400> 21 gaaagcttgc ctcaatcctg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1 reverse primer <400> 22 cttcctcctc ccttctggtc 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 forward primer <400> 23 gagaggctga gactaaccca ga 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 reverse primer <400> 24 atcacagctt ctttgggaca ct 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3 forward primer <400> 25 ggctctctgc aaccagttct 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3 reverse primer <400> 26 tgaaattctg tggaatctgc c 21

Claims

초음파 출력부를 포함하고,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 5 kHz 내지 450 MHz의 중심 주파수를 갖는 초음파인, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 - 10 MPa 내지 10 MPa의 음향 압력을 갖는 초음파인, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 0.02 Hz 내지 500 kHz의 펄스반복주파수(Pulse repetition frequency)를 갖는 초음파인, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 0.1 내지 99.9%의 듀티 사이클(duty cycle)을 갖는 초음파인, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 노화세포는 노화 섬유아세포, 노화 멜라노사이트(melanocyte), 노화 케라티노사이트(keratinocyte), 노화 근육세포, 노화 상피세포, 노화 혈관 내피세포, 노화 뼈세포, 노화 연골세포, 노화 심장 근육세포, 노화 간세포, 노화 췌장세포 및 노화 신장세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화 관련 β-갈락토시다제(senescence associated β-galactosidase)의 활성; 또는 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 인터루킨-8 (interleukin-8, IL-8), 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 및 인터루킨-1B (interleukin-1B, IL-1B)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 노화세포 특이적 사이토카인의 발현;을 노화세포 특이적으로 증가시키는, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포에서 특이적으로 단핵구(monocyte) 또는 대식세포(macrophage)의 이동을 촉진시키는, 노화세포 제거 장치.
제8항에 있어서,
상기 대식세포는 M0 대식세포 또는 M1 대식세포인, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 콜로니-자극 인자(colony-stimulating factor, CSF), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (chemokine (C-X-C motif) ligand 1, CXCL1) 및 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3 (chemokine (C-C motif) ligand 3, CCL3)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역세포 리쿠르팅(recruiting) 사이토카인의 발현을 노화세포 특이적으로 증가시키는, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 세포 활성, 세포 증식 및 세포 주기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 있어 노화세포 특이적인 영향이 없는, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 노화세포 특이적으로 사멸을 촉진하는, 노화세포 제거 장치.
제1항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 세포 재생을 촉진하는, 노화세포 제거 장치.
제13항에 있어서,
상기 세포 재생 촉진은 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파에 의한 세포 이동 촉진에 의한 것인, 노화세포 제거 장치.
초음파 출력부; 및 설명서;를 포함하고,
상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는 것이 기재된, 노화세포 제거용 키트.
제15항에 있어서,
상기 설명서에는 상기 초음파가 조사되는 세포 종류에 따라 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파의 초음파 중심 주파수, 음향 압력, 펄스반복주파수(Pulse repetition frequency) 및 듀티 사이클(duty cycle)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조건을 조절하는 것이 추가로 기재된, 노화세포 제거용 키트.
제15항에 있어서,
상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파는 5 kHz 내지 450 MHz의 중심 주파수를 갖는 저강도 초음파인, 노화세포 제거용 키트.
제15항에 있어서,
상기 노화세포는 노화 섬유아세포, 노화 멜라노사이트(melanocyte) 노화 케라티노사이트(keratinocyte), 노화 근육세포, 노화 상피세포, 노화 혈관 내피세포, 노화 뼈세포, 노화 연골세포, 노화 심장 근육세포, 노화 간세포, 노화 췌장세포 및 노화 신장세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 노화세포 제거용 키트.
초음파 출력부; 및 및 설명서;를 포함하고,
상기 설명서에는 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파가 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용 및 세포 재생을 촉진하고, 상기 세포 재생은 상기 초음파 출력부에서 출력되는 초음파에 의한 세포 이동 촉진에 의한 것이라는 것이 기재된, 세포 재생 촉진용 키트.
제19항에 있어서,
상기 세포는 섬유아세포, 멜라노사이트(melanocyte), 케라티노사이트(keratinocyte), 근육세포, 상피세포, 혈관 내피세포, 뼈세포, 연골세포, 심장 근육세포, 간세포, 췌장세포 및 신장세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 세포 재생 촉진용 키트.
초음파를 피부 표면에 조사하는 단계를 포함하고,
상기 피부에 조사된 초음파는 피부 세포 중 노화세포를 특이적으로 자극하여 노화세포의 대식작용을 촉진하는, 피부 노화 억제를 위한 미용 방법.
제21항에 있어서,
상기 초음파는 5 kHz 내지 450 MHz의 중심 주파수를 갖는 저강도 초음파인, 피부 노화 억제를 위한 미용 방법.
제21항에 있어서,
상기 피부 세포는 섬유아세포, 멜라노사이트(melanocyte) 및 케라티노사이트(keratinocyte)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 피부 노화 억제를 위한 미용 방법.