KR101550370B1

KR101550370B1 - 저선량 방사선을 이용한 손상된 연골세포의 복구방법

Info

Publication number: KR101550370B1
Application number: KR1020130164277A
Authority: KR
Inventors: 황상구; 홍은희
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2015-09-07
Also published as: US10301596B2; WO2015099446A1; US20160362660A1; KR20150075885A

Abstract

본 발명은 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선을 손상된 연골세포에 조사하여 연골세포의 염증반응, 탈분화 또는 파괴를 억제하는 방법 및 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선을 손상된 연골세포에 조사하여 연골질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 연골세포에 손상을 유발하지 않는 LDR을 이용하여 손상된 연골을 회복시킬 수 있으므로, 연골의 염증성 질환의 치료에 응용될 수 있을 것이다.

Description

저선량 방사선을 이용한 손상된 연골세포의 복구방법{Method for recovering damaged chondrocyte using low-dose radiation}

본 발명은 저선량 방사선을 이용한 손상연골세포의 복구방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선을 손상된 연골세포에 조사하여 연골세포의 염증반응, 탈분화 또는 파괴를 억제하는 방법 및 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선을 손상된 연골세포에 조사하여 연골질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

연골은 발생학적으로 경골조직과 같은 중배엽에서 기원한 조직으로, 뼈와 함께 내골격을 형성한다. 또한, 연골손상이 심한 경우 연골뿐만 아니라 연골 밑의 골조직까지 손상을 입는 경우도 있다. 특히, 관절 연골의 경우에는 혈관, 신경, 임파 조직이 없기 때문에 관절에 손상을 입게 되면 손상된 관절 연골은 자생적으로 재생되기가 어렵다. 따라서 관절 연골에서는 작은 손상이어도 상처가 진전, 관절의 퇴화 현상이 일어날 수 있다. 그러므로, 골, 연골 조직의 기능을 회복, 유지하기 위해서 의학적으로 여러 가지 방법이 도모되고 있는 실정이다.

대표적인 연골손상에 의한 질환인 관절염은 퇴행성 질환의 일종으로, 우리나라에서 55세 이상에서는 80%, 70세 이상에서는 거의 전 인구에서 나타나는 것으로 보고되었고, 이를 치료하는 방법의 개발이 가속화되고 있다. 현재 사용되고 있는 치료방법으로는 관절 연골의 결손부위 치유를 위해 다발성 천공술, 미세 골절술, 연마술, 골막 또는 연골막 이식술 등이 임상적으로 사용되고 있으나, 이들의 치료효과가 저조하기 때문에, 새로운 치료방법의 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근에는, 줄기세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 방법, 자가 혹은 동종의 연골조직으로 연골 결손 부위에 이식하는 방법, 연골 결손부위의 표면에 연골을 유도할 수 있는 조직 또는 화합물 등을 이식하는 방법, 연골 세포 이식술로 연골 결손부위에 연골 세포를 이식함으로써 연골 재생을 유도하는 방법 등이 개발되어 그들의 전임상 또는 임상시험결과가 보고되었다. 예를 들어, 특허공개 제2010-0051294호에는 연골세포로 분화된 세포군집체를 하이드로겔 매트릭스 내에 분산시킨 후 이를 고분자 지지체에 접종하여 고분자 지지체의 공극에 세포군집체-하이드로겔 복합체가 주입되어 있는 연골 손상의 치료에 유용한 연골세포로 분화된 세포군집체-하이드로겔-고분자 지지체 복합체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 연골 손상 치료용 조성물이 개시되어 있고, 특허공개 제2010-0061605호에는 중간엽 줄기세포로부터의 연골화분화 방법 및 이에 의해 분화된 연골발생세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 특허공개 제2011-0134137호에는 검상돌기로부터 분리한 연골세포를 함유하는 연골질환 치료용 조성물, 세포 치료제, 및 상기 세포를 이용하여 제조된 인공연골 및 그의 제조방법이 개시되어 있고, 특허공개 제2012-0111380호에는 생분해성 고분자와 생체적합성 세라믹으로 이루어지는 골 재생층과 상기 골 재생층과 접합되고, 연골 세포로 분화 가능한 세포가 고정된 연골 재생층을 포함하여 이루어지는 골-연골 재생용 복합 지지체, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 골, 연골 질환 치료용 조성물이 개시되어 있다.

그러나, 이들 방법은 이식된 조직이 생체에 적응하거나 재생하는데 소요되는 시간이 과다하고, 이식된 조직의 경우에는 면역거부반응이 발생할 수 있으며, 이식 또는 재생된 조직이 원래의 연골자리에 정확하게 안착하지 못하여 추후에 추간판 탈출증과 같은 후유증이 발생될 수 있다는 다양한 문제점이 발생할 여지가 있어 아직까지는 실질적인 치료에 사용되지 못하고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 손상된 연골의 염증으로 인한 질환을 부작용 없이 치료하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 지금까지 치료에는 사용하지 않았던 저선량 방사선을 손상된 연골에 조사할 경우, 손상된 연골을 부작용없이 회복시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 저선량 방사선을 조사하여 연골세포의 염증반응을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 저선량 방사선을 조사하여 연골세포의 탈분화를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 저선량 방사선을 조사하여 연골세포의 파괴를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 저선량 방사선을 조사하여 연골질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 생체로부터 분리된 연골세포에 0 보다 크고 2 cGy(centigray) 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선(low-dose radiation, LDR)을 조사하는 단계를 포함하는 연골세포의 염증반응, 탈분화 또는 파괴를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 손상된 연골의 염증으로 인한 질환을 부작용 없이 치료하는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 저선량 방사선(low-dose radiation, LDR)에 주목하게 되었다. 통상적으로 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 LDR은 세포에 치명적인 손상을 유발시키는 고선량 방사선(high-dose radiation, HDR)과는 다른 효과를 연골에서 유발할 것으로 기대하였다. 실제로, 연골세포에 손상을 유발하는 HDR과는 달리 2 cGy 이하의 LDR를 연골세포에 조사하면, 연골세포에 어떠한 손상도 유발하지 않는 안전성을 나타내고, IL-1β 처리에 의해 유도된 연골세포의 탈분화와 염증을 억제할 수 있는데, 이는 관절연골에서 MAPK 경로가 아닌 IL-1β 유도성 PI3K/Akt 신호전달 경로를 차단함으로서 수행되며, 연골세포의 IL-1β 유도성 탈분화와 염증을 매개하는 카테닌 유도성 탈분화와 염증을 억제하고, EGF-, PMA- 및 RA-유도성 탈분화 및 염증을 억제함을 확인하였다.

따라서, 연골의 염증으로 인한 질환의 발생시에 LDR을 단독으로 조사하거나 또는 공지된 치료제와 조합하여 처리할 경우, 별다른 부작용 없이 상기 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 용어 "저선량 방사선(low-dose radiation, LDR)"이란, 0 보다 크고 2 cGy(centigray) 이하의 선량을 나타내는 방사선을 의미하는데, 주로 호르미시스(Hormesis) 현상을 유도하는데 사용되는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 있어서, LDR은 장기간동안 지속적으로 연골세포에 조사하여도 연골세포에서 손상을 유발시키지 않으므로, LDR의 조사시간이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 6 내지 90시간, 보다 바람직하게는 24 내지 72시간 동안 조사할 수 있으며, 가장 바람직하게는 48시간 동안 조사할 수 있다. 지금까지 연구된 바에 의하면, 약 20 cGy로 누적시킨 저선량 전리 방사선은 사이토카인의 방출을 조절하여 면역세포를 증가시킬 수 있고(특허공개 제10-2012-0051478호, 2012.05.22), 1 내지 100Gy 선량의 이온화 방사선을 해조류의 포자에 조사하면, 해조류의 양식시간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 해조류의 수확량을 증진시킬 수 있음이(특허공개 제10-2013-0047793호, 2013.05.09) 알려져 있으나, 연골의 손상과 관련된 용도에 대하여는 전혀 보고되지 않았다. 본 발명에서는 LDR을 조사함으로써 염증반응에 의하여 저하된 I-κB 단백질의 수준과 증가된 COX-2 단백질의 수준을 정상상태로 회복시킬 수 있을 뿐만 아니라, 연골세포의 탈분화 또는 파괴에 의하여 수반되는 억제된 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질 발현수준 및 증가된 COX-2 단백질 발현수준과 NF-κB 전사활성을 정상상태로 회복시킬 수 있으므로, 본 발명의 LDR을 연골세포에 조사하면 연골세포의 염증반응, 탈분화 또는 파괴를 억제할 수 있으며, 이러한 연골세포의 염증반응, 탈분화 또는 파괴에 대한 LDR 조사의 효과는 본 발명에서 최초로 제시하였다.

본 발명의 용어 "호르미시스(Hormesis)"란, 일반적으로 생체에 유해한 영향을 미치는 유형 또는 무형의 대상을 생체에 유해한 영향을 나타내지 못하는 농도로 생체에 처리할 경우 나타나는 증상을 의미하는데, 상기 유형 또는 무형의 대상은 예를 들어 방사선이 될 수 있다. 상기 방사선은 그의 선량에 따라 인체에 치명적인 효과를 나타낼 수도 있도, 고선량 방사선은 암치료 등에 응용될 수도 있는데, 암치료에도 사용할 수 없는 수준의 자연 방사선의 수준과 유사한 저선량 방사선을 인체에 조사하면 인체의 면역기능 증진, 수명연장, 생식능력 향상 등에 긍정적인 효과를 나타낼 수도 있다.

본 발명의 용어 "자연 방사선"이란, 인위적이 아닌 자연적인 방사선을 의미하는데, 예를 들어 외계에서 오는 우주선, 지각 또는 공기 중에 존재하는 천연 방사성동위원소로부터 나오는 방사선, 우주선에 의하여 지구상의 원소가 분열되어 생성된 방사성동위원소로부터의 방사선, 이러한 동위원소를 섭취함으로써 인체 내부에 존재하는 방사성동위원소로부터 방출되는 방사선 등을 들 수 있고, 이러한 자연방사선에 의한 피폭은 지구상의 지역에 따라 큰 차이를 보이고 있으나 평균 1mSv/y정도이다.

본 발명의 용어 "연골세포"란, 연골기질의 연골소 내에 존재하며 연골기질을 합성 및 분비하는 세포를 의미하는데, 구조적으로는 조면소포체, 골지장치 등이 발달되어 있고, 외형은 연골소강의 외형과 일치하는데, 연골막 밑 및 관절연골 표층에서는 장타원형 혹은 편평, 심층부에서는 반원형 또는 다각형으로 존재한다. 연골세포의 세포막에는 다당체나 단백질의 복합체가 결합되어 있고, 이들 복합체는 기질의 다당체나 섬유와 입체적으로 결합하고 있기 때문에 연골세포는 기질 속에서 부유하는 형태로 존재하므로, 외부의 충격에 대하여 상당한 수준의 완충효과를 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 먼저, 배양된 연골세포에 HDR과 LDR을 각각 조사하여 연골세포에 미치는 영향을 분석한 결과, HDR을 조사한 경우와는 달리 LDR을 조사한 경우에는 분화마커 단백질 및 염증관련 단백질의 전사 및 활성에 어떠한 변화도 유도하지 않았고(도 1a 및 1b), 연골세포의 형태를 변화시키지 않았고 세포노화를 유도하지도 않았으며(도 1c), 노화단백질의 발현수준을 증가시키지 않았고(도 1d), 연골세포의 증식을 억제하거나 연골세포의 사멸율을 증가시키지 않았으며(도 1e), 연골세포의 DNA를 손상시키지도 않았다(도 1f).

다음으로, 유도성 연골세포 파괴에 대한 LDR의 억제효과를 분석한 결과, 연골세포에 IL-1β를 처리함에 의하여 유도되는 섬유성 제1형 콜라겐의 발현유도, 제2형 콜라겐 및 Sox-9의 발현억제 및 단백질수준 감소, Sox-9 전사활성 감소 등의 연골세포의 탈분화를 촉진시키는 현상(도 2a)은 LDR 조사에 의하여 회복되고(도 2b), 연골세포에 IL-1β를 처리함에 의하여 유도되는 COX-2의 발현수준 증가, I-κB 단백질의 수준감소 및 NF-κB 전사활성 증가 등의 현상(도 2c) 역시 LDR 조사에 의하여 회복되었다(도 2d).

또한, LDR 매개성 연골세포 파괴억제에 대한 PI3K/Akt 신호전달의 연관성을 분석한 결과, IL-1β 처리에 의해 활성화되는 p38과 c-Jun N-말단 인산화효소와 같은 모든 MAPK 단백질의 수준은 LDR 조사에 의하여 변화되지 않았으나(도 3a), IL-1β 유도성 연골세포 장해에 밀접하게 연관된 Akt 활성화(도 3b 및 3c)를 LDR 조사에 의하여 억제할 수 있음을 확인하였다(도 3d).

한편, 연골세포 파괴에 대한 IL-1β 유도성 카테닌 단백질의 역할을 분석한 결과, IL-1β가 처리된 연골세포에서는, α-, β- 및 γ-카테닌 단백질의 발현이 시간의존적으로 유도되고(도 4a), 연골세포에서 카테닌 단백질의 과발현은 제2형 콜라겐과 Sox-9의 발현억제, COX-2 발현의 유도 및 I-κB 단백질 수준의 저하를 유도하였으며(도 4b), Sox-9 활성을 감소시키고 NF-κB 활성을 증가시켰으며(도 4c), 연골세포에서 카테닌을 과발현시킴과 동시에 IL-1β를 처리하면, IL-1β를 단독으로 처리한 경우보다도 그 효과를 증가시킬 수 있었다(도 4d).

아울러, IL-1β 유도성 카테닌 발현 및 카테닌 유도성 연골파괴에 대한 LDR의 효과를 분석한 결과, LDR을 단독으로 처리한 경우에는 카테닌 단백질의 발현을 변화시킬 수 없었으나(도 5a), IL-1β가 처리된 조건에서는 0.5 및 1 cGy의 LDR은 모든 카테닌 단백질의 IL-1β 유도성 발현을 감소시킬 수 있고(도 5b), 카테닌 단백질을 IL-1β가 처리되기 이전의 기저수준으로 저하시키며(도 5c), LDR은 카테닌이 과발현된 연골세포에서 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질의 발현을 회복시키고, I-κB 저하와 COX-2 발현을 억제시켰으며(도 5d), LDR은 카테닌이 과발현된 연골세포에서 Sox-9의 활성을 증가시키고, NF-κB 전사활성을 감소시켰으며(도 5e), NF-κB 억제제인 BAY 11-7082는 카테닌-과발현 연골세포에서 용량의존적으로 I-κB 저하를 억제하고, IL-1β 처리된 연골세포와 비교하여 COX-2 발현을 억제하였으며(도 5f), I-κB의 저하와 COX-2의 발현유도를 역전시켰다(도 5g).

끝으로, 수용성인자 유도성 연골세포 파괴에 대한 LDR의 억제효과를 분석한 결과, β- 및 γ-카테닌이 과발현된 연골세포에서는 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질 발현의 억제 및 COX-2 단백질 발현의 유도와 같은 EGF, PMA 및 RA 유도성 병리학적 변화가 발생하였으나, LDR의 조사에 의하여 상기 병리학적 변화가 회복됨을 확인하였다(도 6).

상기 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 LDR은 부작용이 전혀 없으면서도, 연골세포의 염증반응을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 연골세포의 손상에 의하여 유발된 연골질환이 발병된 개체의 손상된 연골부위에 0 보다 크고 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 LDR을 조사하는 단계를 포함하는 연골질환의 치료방법을 제공한다. 이때, LDR의 처리와 관련된 조건은 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 용어 "연골질환"이란, 연골손상 질환이라고도 하고, 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환을 의미한다. 상기 연골질환은 본 발명의 LDR 조사에 의하여 치료될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 외상에 의한 관절손상 등이 될 수 있다.

한편, 상기 연골질환을 치료하기 위하여 본 발명에서 제공하는 LDR을 손상된 연골부위에 단독으로 조사할 수도 있고, 다른 공지된 관절염 치료제 등의 연골세포 손상억제제와 함께 LDR을 조사하여 복합적으로 처리할 수도 있다. 이때, 상기 관절염 치료제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 진통제, 비스테로이드성 진통소염제, 스테로이드 제제, 콕스II 억제제, 연골재생촉진제 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 인도메타신, 펠덴, 썰감, 낙센, 볼타렌, 로딘, 소말겐, 에어탈, 브랙신 등의 비스테로이드성 진통소염제 또는 우딘정, 콘드론, 카티스템 등의 연골재생촉진제 등이 될 수 있다.

또한, 상기 연골세포 손상억제제와 함께 LDR 조사를 복합적으로 처리할 경우, 상기 연골세포 손상억제제를 처리한 후에 LDR을 조사하거나, LDR을 조사한 후에 연골세포 손상억제제를 처리하거나 또는 LDR을 조사하면서 동시에 연골세포 손상억제제를 처리하는 방식으로 수행할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면, 연골세포에 손상을 유발하지 않는 LDR을 이용하여 손상된 연골을 회복시킬 수 있으므로, 연골의 염증성 질환의 치료에 응용될 수 있을 것이다.

도 1은 연골세포 표현형에 대한 LDR의 효과를 나타낸다. 연골세포에 각 실험조건하에서 서로다른 선량의 방사선을 조사하였다. 분화관련 단백질(a, 상단)과 염증관련 단백질(b, 상단)의 수준은 웨스턴블럿 분석에 의해 결정되었다. Sox-9(a, 하단)의 전사활성과 NF-κB의 전사활성(b, 하단)은 리포터 유전자 분석에 의해 결정되었다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였고, x는 처리되지 않은 대조군 대비 유의성이 없음을 나타낸다. 세포 형태의 변화는 광학현미경에 의해 관찰되었고(c, 상단; 스케일바: 1mm), 세포노화는 SA-β-gal 양성염색에 의해 평가되었다(청색, c, 하단; 스케일바: 1mm). 노화연관 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정되었다(d). 총 세포수는 trypan blue solution을 이용하여 생존세포수를 계수하여 정량하였고(e, 좌측), 세포사멸은 FACS 분석을 통해 결정하였다(e, 우측). 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였고, **p<0.005 이고, ***p<0.0005 이며, x는 처리되지 않은 대조군 대비 유의성이 없음을 나타낸다. H2AX의 인산화는 공초점 형광현매경에 의해 결정되었고, 세포의 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole 염색으로 확인하였다(f, 스케일바: 40㎛).
도 2는 IL-1β 유도성 연골세포 파괴에 대한 LDR의 억제효과를 나타낸다. 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 단독으로 처리하거나(a 및 c) 또는 지정된 시간동안 0.5 또는 1 cGy LDR을 조합하여 처리하였다(b 및 d). 탈분화연관 유전자의 전사체 수준은 대조군으로서 GAPDH를 사용한 PCR에 의해 결정되었다(a 및 b, 상단). Sox-9 전사활성은 리포터 유전자 분석에 의해 결정되었다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였다(a의 중단은 처리되지 않은 대조군 대비 *p<0.05 및 **p<0.005이고; b의 중단은 IL-1β 단독처리 세포 대비 **p<0.005이다). 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 검출하였다(a 및 b 하단). COX-2 전사체의 수준은 대조군으로서 GAPDH를 사용한 일반 PCR과 정량적 실시간 PCR에 의해 결정되었다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였다(c의 상단은 처리되지 않은 대조군 대비 ***p<0.0005이고; d의 상단은 IL-1β 단독처리 세포 대비 ***p<0.0005이다). I-κB 및 COX-2 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 검출하였다(c 및 d 중단). NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석에 의해 결정되었다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였다(c의 하단은 처리되지 않은 대조군 대비 ***p<0.0005이고; d의 하단은 IL-1β 단독처리 세포 대비 ***p<0.0005이다).
도 3은 LDR 매개성 연골세포 파괴억제에 대한 PI3K/Akt 신호전달의 연관성을 나타낸다. (a) 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하거나(+) 또는 처리하지 않은(-) 조건에서 0.5 또는 1 cGy의 LDR을 처리하였다. ERK, p38, JNK의 발현 및 인산화수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다. (b) 연골세포에 지정된 시간동안 10 ng/mL IL-1β를 처리하고(상단), IL-1β처리 1시간 전에 40 μM Tribiricine을 처리하지 않거나 또는 처리하였다(하단). Akt 및 GSK3α/β의 발현 및 인산화수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다. (c) 연골세포에 10 ng/mL IL-1β 처리 1시간 전에 10 또는 20 μM LY294002을 처리하지 않거나 또는 처리하였다. 48시간이 경과한 후, 제2형 콜라겐, Sox-9, I-κB 및 COX-2 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(상단). NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석법으로 결정하였다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였다(하단은 IL-1β 단독처리 세포 대비 **p<0.005 및 ***p<0.0005이다). (d) 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하지 않거나(-) 또는 처리한 조건(+)에서 12시간 동안 0.5 또는 1 cGy의 LDR을 처리하였다. Akt 및 GSK3α/β의 발현 및 인산화 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다.
도 4는 연골세포 파괴에 대한 IL-1β 유도성 카테닌 단백질의 역할을 나타낸다. (a) 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 지정된 시간동안 처리하였다. 카테닌 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다. (b 및 c) 연골세포에 Sox-9을 처리하지 않거나 또는 처리한 조건(c 좌측) 또는 NF-κB 리포터 유전자를 처리하지 않거나 또는 처리한 조건(c 우측)에서, GFP-표지된 S83A α-카테닌, FLAG-표지된 S33A β-카테닌 또는 야생형 γ-카테닌을 도입하였다. 분화 및 염증관련 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하고(b), Sox-9 또는 NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석에 의해 결정하였다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였다(c, 처리하지 않은 대조군 대비 *p<0.05, **p<0.005 및 ***p<0.0005이다). (d) 연골세포에 24시간 동안 각각의 카테닌 플라스미드 3 ㎍을 도입한 다음, 10 ng/mL IL-1β을 48시간 동안 처리하지 않거나(-) 또는 처리하였다(+). 분화 및 염증관련 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하고(상단), IL-1β 처리후 24시간 경과시점에서의 NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석에 의해 결정하였다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였다(하단, IL-1β 단독처리 세포 대비 *p<0.05 및 **p<0.005이다).
도 5는 IL-1β 유도성 카테닌 발현 및 카테닌 유도성 연골파괴에 대한 LDR의 효과를 나타낸다. (a 및 b) 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하지 않거나(a) 또는 처리한(b) 조건하에서 48시간 동안 LDR을 서로다른 선량으로 조사하였다. 카테닌 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다. (c) 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하지 않거나 또는 처리한 조건하에서 1 cGy의 LDR을 48시간 동안 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 각 카테닌의 발현은 공초점 형광현미경으로 검출하였다(스케일바: 50 ㎛). (d 및 e) 연골세포에 3 ㎍ FLAG-표지된 S33A β-카테닌 또는 야생형 γ-카테닌을 도입한 다음, 서로 다른 선량의 LDR을 48시간 동안 조사하였다. 분화 및 염증관련 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(d). Sox-9(e 좌측) 또는 NF-κB 전사활성(e 우측)은 리포터 유전자 분석에 의해 결정하였다. 실험결과는 평균±표준편차 값으로 표시하였다(e, IL-1β 단독처리 세포 대비 *<0.05, **p<0.005 및 ***p<0.0005이다). (f) 세포에 10 ng/mL IL-1β 처리 1시간 전에 5 또는 10 μM Bay 11-7082을 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 48시간 경과후, I-κB 및 COX-2 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다. (g) 연골세포에 24시간 동안 3 ㎍의 GFP-표지된 S83A α-카테닌(좌측), FLAG-표지된 S33A β-카테닌(중앙) 또는 야생형 γ-카테닌(우측)을 도입한 다음, 24시간 동안 5 또는 10 μM의 Bay 11-7082를 처리하거나 또는 처리하지 않았다. I-κB 및 COX-2 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다.
도 6은 수용성인자 유도성 연골세포 파괴에 대한 LDR의 억제효과를 나타낸다. 연골세포에 2시간 동안 10 ng/mL EGF(a), 10 nM PMA(b) 및 1 μM RA(c)를 처리하거나 또는 처리하지 않고, 36시간 동안 0.5 또는 1 cGy의 LDR을 조사하거나 또는 조사하지 않았다. 카테닌 단백질의 수준(상단) 및 분화/염증 연관 단백질(하단)의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 연골세포에 대한 LDR 의 효과

3-10 Gy의 고선량 방사선(high-dose radiation, HDR)은 연골세포의 병리학적 조절장애를 유도한다고 알려져 있으므로, 이보다 낮은 수준인 2 cGy 이하의 저선량 방사선(low-dose radiation, LDR)이 연골세포에 미치는 효과를 확인하고자 하였다.

먼저, 관절에서 유래된 연골세포는 공지된 방법에 따라 DMEM 배지에서 배양하였다(E.H. Hong, et al., J. Biol. Chem. 285:1283-1295, 2010).

다음으로, 상기 배양된 연골세포를 5 x 10⁴세포수/㎠의 밀도로 배양용기에 접종하고, 이에 137Cs-ray source(KIRMS, 한국)를 사용하여 0, 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 cGy의 LDR을 48시간 동안 조사하고, 연골특이적인 분화마커 단백질인 제2형 콜라겐 또는 Sox-9 단백질과 염증관련 단백질인 I-κB 또는 COX-2 단백질의 단백질 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하고, 상기 Sox-9 단백질과 I-κB에 의해 영향을 받는 NF-κB의 전사활성을 리포터 유전자 분석으로 결정하였다(도 1a 및 b).

우선, 도 1a에서 보듯이, LDR은 연골특이적인 분화마커 단백질인 제2형 콜라겐 또는 Sox-9 단백질 수준에 별다른 영향을 주지 않았고(상단), Sox-9 단백질의 활성에도 별다른 영향을 주지 않았다(하단). 또한, 도 1b에서 보듯이, LDR은 연골염증의 1차 매개체로서 사용되는 COX-2 단백질 또는 NF-κB 전사인자의 억제제인 I-κB 단백질의 발현수준에 별다른 영향을 미치지 않았고(상단), 상기 COX-2 단백질의 조절에 관여하는 NF-κB 전사활성을 유도하거나 또는 억제하지도 않았다(하단).

한편, 연골세포의 형태적인 변화를 확인하기 위하여, 연골세포에 상기 LDR을 처리하거나 또는 6 cGy의 HDR을 처리하고, 이들 연골세포를 광학현미경하에서 관찰하거나(도 1c 상단), 또는 상기 연골세포를 SA-β-gal(β-galactosidase)로 염색한 후 공초점 형광 현미경하에서 관찰하였다(도 1c 하단). 이때, SA-β-gal의 염색은 다음과 같이 수행하였다: 방사선이 조사된 연골세포를 3.7% 포름알데히드 용액을 사용하여 10분동안 고정시키고, PBS를 사용하여 고정액을 제거하였으며, 세포에 SA-β-gal 염색용액(1 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside, 40 mM citric acid/sodium phosphate buffer, pH 6.0, 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂)을 가하고, CO₂가 없는 오븐온도 조건에서 16시간 동안 반응시켰다. 도 1c에서 보듯이, LDR을 처리한 경우에는 연골세포의 형태가 변화되지 않았고 SA-β-gal에 대하여 양성반응을 나타내지 않아 세포노화가 유도되지도 않았으나, HDR을 처리한 경우에는 연골세포가 크고 평편한 형태로 변화되었고, SA-β-gal에 대하여 양성반응을 나타내어 세포노화가 유도됨을 확인하였다.

이에, 2 cGy의 LDR 또는 6 cGy의 HDR이 3시간 동안 조사된 연골세포에서 노화와 관련된 단백질의 수준을 조사시간의 경과에 따라 웨스턴블럿 분석을 통해 평가하였다(도 1d). 도 1d에서 보듯이, 2 cGy의 LDR을 처리한 경우에는 조사시간이 경과하여도 연골세포 노화의 생화학적인 마커인 p53 및 p21의 단백질 수준이 변화되지 않았으나(상단), 6 cGy의 HDR을 처리한 경우에는 조사시간이 경과함에 따라 상기 마커인 p53 및 p21의 단백질 수준이 점차 증가함을 확인하였다(상단). 이는 HDR과는 달리 LDR이 세포노화를 유발하지 않음을 입증하는 것으로 분석되었다.

아울러, LDR이 연골세포의 생존에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자, 연골세포를 48시간 동안 배양하면서 방사선을 조사하지 않은 대조군, 2 cGy의 LDR을 조사한 시료 또는 6 cGy의 HDR을 조사한 시료를 대상으로 조사시간의 경과에 따라 hemocytometer와 trypan blue solution을 이용하여 연골세포의 수를 계수하였다(도 1e 좌측). 도 1e 좌측그래프에서 보듯이, 대조군과 LDR이 조사된 연골세포는 배양시간이 경과함에 따라 세포수가 증가하였으나, HDR을 조사한 연골세포는 배양시간이 경과하여도 세포수가 증가하지 않음을 확인하였다. 이에, 연골세포에 0, 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 cGy의 LDR을 48시간 동안 조사하고 propidium iodide(2.5 mg/mL)를 상온에서 5분동안 가한 다음, FACScan flow cytometer(Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 분석함으로써, 각 연골세포의 사멸율을 산출하였다(도 1e 우측). 도 1e 우측그래프에서 보듯이, 대조군과 LDR이 조사된 연골세포의 사멸율은 동일한 수준을 나타냄을 확인하였다.

끝으로, LDR 조사에 의하여 연골세포의 DNA가 손상되는지의 여부를 확인하고자 하였다. 이에, 연골세포에 방사선을 조사하지 않은 대조군, 2 cGy의 LDR을 30분 및 3시간 동안 조사한 시료 또는 6 cGy의 HDR을 30분 및 3시간 동안 조사한 시료를 대상으로 DNA 손상마커인 히스톤 변이체인 γ H2AX의 인산화 여부를 확인할 수 있도록 γH2AX에 대한 항체를 10 ㎍/㎖농도로 처리하고 1시간 동안 반응시켜서 면역염색을 수행한 다음, 로다민 또는 플로로세인 이소티오시아네이트가 표지된 이차항체를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 또한, 연골세포의 핵을 4',6-diamidino-2-phenylindole을 이용하여 염색하여 핵의 손상여부를 확인하고, Merge 염색을 수행하여 세포질의 손상여부를 확인하였다(도 1f). 도 1f에서 보듯이, 대조군과 2 cGy의 LDR을 조사한 시료에서는 조사시간에 상관없이 γ H2AX의 인산화가 검출되지 않았고, 핵 및 세포질의 손상 역시 검출되지 않았으나, 6 cGy의 HDR을 조사한 시료에서는 γ H2AX의 인산화가 검출되었고, 핵 및 세포질에서도 손상이 확인되었다.

상기 결과를 종합하면, 연골세포에 손상을 유발하는 HDR과는 달리 2 cGy 이하의 LDR은 연골세포에 어떠한 손상도 유발하지 않는 안전성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 2: IL -1β 유도성 연골세포 파괴에 대한 LDR 의 억제효과

연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 단독으로 처리하거나 또는 IL-1β와 0.5 또는 1 cGy의 LDR을 조합하여 처리하고, 대조군으로서 GAPDH를 사용한 PCR과 정량적 실시간 PCR 분석을 통해 제1형 콜라겐, 제2형 콜라겐, Sox-9, COX-2 및 I-κB의 전사체 수준을 측정하고, NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석에 의해 측정되었다(도 2a, 2b, 2c 및 2d).

먼저, 도 2a에서 보듯이, 연골세포에 IL-1β를 단독으로 처리하면 섬유성 제1형 콜라겐의 발현을 유도하고, 제2형 콜라겐 및 상기 제2형 콜라겐의 주요전사 조절자인 Sox-9의 발현을 억제하며(상단), 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질의 수준을 감소시키고(하단), Sox-9 전사활성은 IL-1β 처리후 24시간 및 48시간에 대조군 세포에 비하여 각각 약 32% 및 60%가 감소되었다(중단). 이로부터, IL-1β가 연골세포의 탈분화를 촉진시킴을 알 수 있었다.

또한, 도 2b에서 보듯이, 연골세포에 IL-1β를 처리한 후, 0.5 및 1 cGy의 LDR을 조사하면, IL-1β 처리에 의해 연골세포에서 발현이 유도된 제1형 콜라겐의 발현수준과 발현이 억제된 제2형 콜라겐 및 Sox-9의 발현수준이 정상수준으로 회복되었고(상단), IL-1β 처리에 의해 연골세포에서 감소된 Sox-9의 전사활성이 0.5 및 1 cGy의 LDR 조사에 의하여 각각 약 2.3배 및 2.9배 증가하였으며(중단), IL-1β 처리에 의해 연골세포에서 감소된 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질 수준 역시 LDR에 의해 완전히 회복되었다(하다). 상기 결과는 LDR이 IL-1β 유도성 연골세포 탈분화에 대한 강력한 억제효과를 나타냄을 입증하는 것으로 분석되었다.

다음으로, 도 2c에서 보듯이, NF-κB 경로의 표적이면서 연골염증의 1차적인 매개체인 COX-2의 발현수준에 미치는 IL-1β 처리효과를 분석한 결과, IL-1β 처리후 24시간 및 48시간이 경과된 시점에서 COX-2의 발현수준은 대조군에 비하여 각각 약 9.8배 및 7.7배 정도 증가하였고(상단), 동일한 조건에서 NF-κB 전사인자의 억제제인 I-κB 단백질의 수준이 급격히 감소하였으며(중단), NF-κB 전사활성은 IL-1β 처리후 24시간 및 48시간이 경과된 시점에서 각각 약 8.6배 및 6.7배 정도로 증가하였다(하단).

끝으로, 도 2d에서 보듯이, 연골세포에 IL-1β를 처리한 후, 0.5 및 1 cGy의 LDR을 조사하면, IL-1β 처리에 의하여 증가된 COX-2 전사체의 수준을 정상수준으로 회복시켰는데, 0.5 및 1 cGy의 LDR을 처리한 경우에는 IL-1β을 단독으로 처리한 세포에 비하여 mRNA 수준이 각각 약 70% 및 80%가 감소되었고(상단), 동일한 조건에서 IL-1β 처리에 의하여 감소된 I-κB 단백질의 수준이 정상수준으로 회복되었으며(중단), 동일한 조건에서 IL-1β 처리에 의하여 증가된 NF-κB 전사활성 역시 정상수준으로 회복되었는데, 0.5 및 1 cGy의 LDR을 처리한 경우에는 IL-1β을 단독으로 처리한 세포에 비하여 NF-κB 전사활성 수준의 약 76% 및 83%가 감소하였다(하단).

상기 결과를 종합하면, LDR은 IL-1β 처리에 의해 유도된 연골세포의 탈분화와 염증을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 3: LDR 매개성 연골세포 파괴억제에 대한 PI3K / Akt 신호전달의 연관성 분석

LDR이 연골세포 표현형을 조절하는 작용기작을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 IL-1β가 처리된 연골세포에서 LDR 처리전 및 후에 MAPK(mitogen-avtivated protein kinase) 활성화 또는 Akt 활성화 수준을 측정하였다.

먼저, 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하거나(+) 또는 처리하지 않은(-) 조건에서 0.5 또는 1 cGy의 LDR을 처리하고, ERK, p38, JNK의 발현 및 인산화수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 3a). 도 3a에서 보듯이, 세포외 신호조절 인산화효소인 p38과 c-Jun N-말단 인산화효소와 같은 모든 MAPK 단백질은 IL-1β 처리에 의해 활성화되고, 이러한 현상은 LDR 처리에 의하여 변화되지 않았는데, 이는 연골세포 표현형의 LDR 매개성 조절이 MAPK 신호전달 비의존성 경로에 의한 것임을 암시하는 것으로 분석되었다.

다음으로, 연골세포에 40 μM Tribiricine을 처리하지 않거나 또는 처리하고 1시간 동안 반응시킨 다음, 10 ng/mL IL-1β를 처리하였으며, Akt 및 GSK3α/β의 발현 및 인산화수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 3b). 도 3b에서 보듯이, IL-1β를 처리한 연골세포에서는 Akt 인산화를 유도한 다음 Akt의 기질인 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β)를 불활성화시키는 반면(상단), Akt 신호전달경로에 대한 특이적인 억제제인 triciribine은 IL-1β 처리에 의해 증가된 Akt 인산화를 현저하게 억제하고, 이에 따라 연골세포에서 GSK3β를 다시 활성화시킴을 확인하였다(하단).

한편, 연골세포에 PI3K/Akt 신호전달의 또 다른 화학적 억제제인 LY294002를 10 또는 20 μM의 농도로 처리하고 1시간동안 반응시킨 다음, 10 ng/mL IL-1β 처리하고 48시간동안 반응시켰다. 반응 후, 제2형 콜라겐, Sox-9, I-κB 및 COX-2 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하고, NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석법으로 결정하였다(도 3c). 도 3c에서 보듯이, 상기 LY294002는 IL-1β가 처리된 연골세포에서 제2형 콜라겐과 Sox-9 발현의 회복, COX-2 발현의 감소 및 I-κB 저하의 억제를 유도하였고(상단), 10 또는 20 μM의 LY294002는 IL-1β가 처리된 연골세포에 비하여 각각 약 48% 및 68%로 NF-κB 활성을 감소시킴을 확인하였다(하단). 상기 결과는 Akt 활성화가 IL-1β 유도성 연골세포 장해에 밀접하게 연관됨을 암시하는 것으로 분석되었다.

끝으로, LDR이 IL-1β 유도성 Akt 활성을 조절하는지의 여부를 확인하기 위하여, 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하지 않거나(-) 또는 처리한 조건(+)에서 12시간 동안 0.5 또는 1 cGy의 LDR을 처리하여 반응시키고, 반응이 종료된 후, Akt 및 GSK3α/β의 발현 및 인산화 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 3d). 도 3d에서 보듯이, IL-1β에 의해 연골세포에서 유도된 Akt 활성화를 0.5 및 1 cGy의 LDR 조사에 의해 억제할 수 있음을 확인하였다.

상기 결과를 종합하면, LDR은 관절연골에서 MAPK 경로가 아닌 IL-1β 유도성 PI3K/Akt 신호전달 경로를 차단하여, IL-1β이 처리된 연골세포의 파괴를 억제함을 알 수 있었다.

실시예 4: 연골세포 파괴에 대한 IL -1β 유도성 카테닌 단백질의 역할

Akt 신호전달의 하류표적인 세포-세포 접착 및 유전자 전사의 조정에 관여하는 카테닌 단백질이 연골세포의 파괴에 관여하는지의 여부를 확인하였다.

먼저, 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 지정된 시간동안 처리하고, 카테닌 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 4a). 도 4a에서 보듯이, IL-1β가 처리된 연골세포에서는, α-, β- 및 γ-카테닌 단백질의 발현이 시간의존적으로 유도됨을 확인하였다.

다음으로, 연골세포에 Sox-9을 처리하지 않거나 또는 처리한 조건 또는 NF-κB 리포터 유전자를 처리하지 않거나 또는 처리한 조건에서, GFP-표지된 S83A α-카테닌, FLAG-표지된 S33A β-카테닌 또는 야생형 γ-카테닌을 도입하여 이소성 과발현을 수행하였다. 이어, 분화 및 염증관련 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하고(도 4b), Sox-9 또는 NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석에 의해 결정하였다(도 4c). 이때, 상기 카테닌의 이소성 과발현은 야생형 α-카테닌을 주형으로 사용한 부위특이적 돌연변이 방법으로 제조된 GFP 표지된 α-카테닌의 S83A 점돌연변이체 및 Addgene에서 구입한 유비퀴틴화 될 수 없는 FLAG-표지된 S33A β-카테닌과 야생형 γ-카테닌을 Lipofectamine PLUS(Invitrogen)를 사용하여 연골세포에 발현벡터를 도입함으로써 수행하였다. 도 4b에서 보듯이, 연골세포에서 β-카테닌 결합결핍 변이체 α-카테닌, 비유비퀴틴화 변이체 β-카테닌 또는 야생형 γ-카테닌의 이소성 과발현은 모든 실험군에서 제2형 콜라겐과 Sox-9의 발현억제, COX-2 발현의 유도 및 I-κB 단백질 수준의 저하를 유도하였다. 또한, 도 4c에서 보듯이, 3 ㎍의 α-, β- 및 γ-카테닌 플라스미드의 도입은 대조군에 비하여 Sox-9 활성을 각각 약 60%, 79% 및 63% 감소시키고(도 4c 상단), NF-κB 활성을 각각 약 5.0배, 7.8배 및 6.0배 증가시켰다(도 4c 하단).

끝으로, 연골세포에 24시간 동안 각각의 카테닌 플라스미드 3 ㎍을 도입한 다음, 10 ng/mL IL-1β을 48시간 동안 처리하지 않거나(-) 또는 처리하였다(+). 이어, 분화 및 염증관련 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하고, IL-1β 처리후 24시간 경과시점에서의 NF-κB 전사활성은 리포터 유전자 분석에 의해 결정하였다(도 4d). 도 4d에서 보듯이, 연골세포에서 카테닌을 과발현시킴과 동시에 IL-1β를 처리하면, 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질의 발현을 억제하고, I-κB 단백질의 저하를 유도하며, COX-2 단백질의 발현을 촉진시키며, 이러한 효과는 연골세포에 IL-1β를 단독으로 처리한 것보다 현저히 증가함을 확인하였으며(상단), 연골세포에서 α-, β- 및 γ-카테닌을 과발현시킴과 동시에 IL-1β를 처리하면, NF-κB 활성이 각각 약 12.4배, 15.5배 및 14.2배 증가함에 반하여, 연골세포에 IL-1β를 단독으로 처리한 경우에는 NF-κB 활성이 약 8.5배 증가함을 확인하였다(하단).

상기 결과를 종합하면, IL-1β 뿐만 아니라 카테닌 신호전달이 연골세포의 파괴에 중요한 역할을 수행하며, 연골세포의 IL-1β 유도성 탈분화와 염증을 매개함을 알 수 있었다.

실시예 5: IL -1β 유도성 카테닌 발현 및 카테닌 유도성 연골파괴에 대한 LDR의 효과

먼저, 연골세포에서 LDR이 카테닌의 발현을 직접적으로 조절할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하지 않거나 또는 처리한 조건하에서 48시간 동안 LDR을 서로다른 선량으로 조사하고, 카테닌 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 5a 및 b). 그 결과, 도 5a에서 보듯이, LDR을 단독으로 처리한 경우에는 카테닌 단백질의 발현을 변화시킬 수 없었으나, 도 5b에서 보듯이, IL-1β가 처리된 조건에서는 0.5 및 1 cGy의 LDR은 모든 카테닌 단백질의 IL-1β 유도성 발현을 극적으로 감소시킬 수 있었다.

다음으로, 연골세포에 10 ng/mL IL-1β를 처리하지 않거나 또는 처리한 조건하에서 1 cGy의 LDR을 48시간 동안 조사하거나 또는 조사하지 않은 다음, 면역염색을 수행하여 각 카테닌의 발현수준을 검출하였다(스케일바: 50 ㎛)(도 5c). 이때, 각 카테닌의 면역염색은 각 연골세포에 α-, β- 및 γ-카테닌에 대한 항체를 10 ㎍/㎖농도로 처리하고 1시간 동안 반응시켜서 면역염색을 수행하였으며, 상기 세포에 로다민 또는 플로로세인 이소티오시아네이트가 표지된 이차항체를 처리하고 1시간 동안 반응시킨 다음, 공초점 현미경을 통하여 면역염색 수준을 평가하였다. 도 5c에서 보듯이, 연골세포에 IL-1β를 처리하면 대조군 세포에 비하여 세포질과 핵의 영역에서 모든 카테닌 단백질의 수준이 유의하게 증가하였고, 이에 1 cGy의 LDR을 조사하면 IL-1β이 처리된 세포에서 기저수준으로 카테닌 단백질의 발현을 억제하였는데, 이는 LDR이 카테닌의 IL-1β 의존성 해독후 안정화를 억제함을 나타내는 것으로 분석되었다.

끝으로, 연골세포에서 α-, β- 및 γ-카테닌 단백질의 과발현에 의해 유도된 탈분화 및 염증반응을 되돌릴 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.

우선, 연골세포에 3 ㎍ FLAG-표지된 S33A β-카테닌 또는 야생형 γ-카테닌을 도입한 다음, 서로 다른 선량의 LDR을 48시간 동안 조사하고, 분화 및 염증관련 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 5d). 도 5d에서 보듯이, LDR은 카테닌이 과발현된 연골세포에서 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질의 발현을 회복시키고, I-κB 저하와 COX-2 발현을 억제시켰는데, 이는 LDR이 탈분화 유발가능성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 분석되었다.

다음으로, Sox-9 또는 NF-κB 전사활성을 리포터 유전자 분석에 의해 결정하고, 실험결과를 평균±표준편차 값으로 표시하였다(도 5e). 그 결과, LDR은 카테닌이 과발현된 연골세포에서 Sox-9의 활성을 증가시키고, NF-κB 전사활성을 감소시킴을 확인하였다. 구체적으로, 도 5e의 좌측에서 보듯이, 1 cGy의 LDR은 α-, β- 및 γ-카테닌이 도입된 세포의 Sox-9 활성에 비하여, 각각 약 2.2배, 2.7배 및 2.4배로 Sox-9 활성을 증가시켰고, 도 5e의 우측에서 보듯이, α-, β- 및 γ-카테닌이 도입된 세포의 NF-κB 활성에 비하여, 각각 약 74%, 78% 및 75%로 NF-κB 활성을 감소시킴을 확인하였는데, 이는 LDR이 염증 유발가능성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 분석되었다.

또 다음으로, COX-2 발현의 카테닌-매개성 유도에 있어서 NF-κB 신호전달의 역할을 추가로 확인하기 위하여, NF-κB 억제제인 BAY 11-7082를 카테닌-과발현 연골세포에 처리하였다. 구체적으로, 연골세포에 5 또는 10 μM Bay 11-7082을 처리하거나 또는 처리하지 않고 1시간 동안 반응시킨 다음, 10 ng/mL IL-1β를 처리하여 48시간 동안 반응시켰으며, 반응이 종료된 후 I-κB 및 COX-2 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 5f). 도 5f에서 보듯이, BAY 11-7082의 전처리에 의하여 용량의존적으로 I-κB 저하를 억제하고, IL-1β 처리된 연골세포와 비교하여 COX-2 발현을 억제함을 확인하였다.

마지막으로, 연골세포에 24시간 동안 3 ㎍의 GFP-표지된 S83A α-카테닌, FLAG-표지된 S33A β-카테닌 또는 야생형 γ-카테닌을 도입한 다음, 24시간 동안 5 또는 10 μM의 bay 11-7082를 처리하거나 또는 처리하지 않고 반응시킨 다음, I-κB 및 COX-2 단백질의 수준을 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 5g). 도 5g에서 보듯이, α-카테닌(좌측), β-카테닌(중앙) 및 γ-카테닌(우측)이 도입된 세포에서 I-κB의 저하와 COX-2의 발현유도가 BAY 11-7082의 처리에 의하여 역전되었는데, 이는 NF-kB 신호전달이 카테닌 경로의 하류임을 의미하는 것으로 분석되었다.

상기 결과를 종합하면, LDR의 조사는 연골세포에서 카테닌 유도성 탈분화와 염증을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 6: 수용성인자 유도성 연골세포 파괴에 대한 LDR 의 억제효과

연골세포 장애에 대한 LDR의 억제효과가 IL-1β에 대한 반응과 독점적으로 연관되는지의 여부를 확인하기 위하여, 연골세포의 탈분화를 유도하는 것으로 공지된 제제인 EGF, PMA 및 RA를 세포에 처리하였다. 구체적으로, 연골세포에 2시간 동안 10 ng/mL EGF(a), 10 nM PMA(b) 및 1 μM RA(c)를 처리하거나 또는 처리하지 않고, 36시간 동안 0.5 또는 1 cGy의 LDR을 조사하거나 또는 조사하지 않았으며, 카테닌 단백질의 수준 및 분화/염증 연관 단백질의 수준은 웨스턴블럿 분석으로 결정하였다(도 6a, 6b 및 6c).

도 6a, 6b 및 6c의 상단에서 보듯이, IL-1β 처리에 의한 연골세포의 탈분화 및 염증과 유사하게, 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질 발현의 억제 및 COX-2 단백질 발현의 유도와 같은 EGF, PMA 및 RA 유도성 병리학적 변화가 β- 및 γ-카테닌의 발현증가와 연관됨을 확인하였고; 도 6a, 6b 및 6c의 하단에서 보듯이, 0.5 및 1 cGy LDR은 모든 카테닌 단백질의 EGF, PMA 또는 RA 유도성 발현을 극적으로 감소시키고, 상기 물질의 처리에 의하여 변화된 제2형 콜라겐, Sox-9 및 COX-2 단백질의 발현수준을 회복시킬 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 LDR이 서로다른 수용성 인자에 의해 유도된 연골세포 표현형의 손상을 억제하는 중요한 역할을 수행함을 암시하는 것으로 분석되었다.

상기 결과로부터, LDR의 조사는 연골세포에서 EGF-, PMA- 및 RA-유도성 탈분화 및 염증을 억제함을 알 수 있었다.

Claims

생체로부터 분리된 연골세포에 0 보다 크고 2 cGy(centigray) 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선(low-dose radiation, LDR)을 조사하는 단계를 포함하는, 연골세포의 염증반응을 억제하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 연골세포의 염증반응을 억제하는 방법은 in vitro 또는 ex vivo의 조건에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 저선량 방사선은 6 내지 90시간동안 조사하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 LDR을 조사함에 따라, 염증반응에 의하여 연골세포에서 저하된 I-κB 단백질의 수준과 증가된 COX-2 단백질의 수준을 정상상태로 회복시키는 것인 방법.
생체로부터 분리된 연골세포에 0 보다 크고 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선(low-dose radiation, LDR)을 조사하는 단계를 포함하는 연골세포의 탈분화를 억제하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 연골세포의 탈분화를 억제하는 방법은 in vitro 또는 ex vivo의 조건에서 수행되는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 저선량 방사선은 6 내지 90시간동안 조사하는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 탈분화는 인터루킨-1β(IL-1β), α-카테닌, β-카테닌, γ-카테닌 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 연골세포에 처리하여 유발되는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 LDR을 조사함에 따라, 상기 탈분화에 의하여 연골세포에서 억제된 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질 발현수준 및 증가된 COX-2 단백질 발현수준과 NF-κB 전사활성을 정상상태로 회복시키는 것인 방법.
생체로부터 분리된 연골세포에 0 보다 크고 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 저선량 방사선(low-dose radiation, LDR)을 조사하는 단계를 포함하는 연골세포의 파괴를 억제하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 연골세포의 파괴를 억제하는 방법은 in vitro 또는 ex vivo의 조건에서 수행되는 것인 방법.
제10항에 있어서,
상기 저선량 방사선은 6 내지 90시간동안 조사하는 것인 방법.
제10항에 있어서,
상기 연골세포의 파괴는 EGF, PMA, RA 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 연골세포에 처리하여 유발되는 것인 방법.
제10항에 있어서,
상기 LDR을 조사함에 따라, 상기 연골세포의 파괴에 의하여 연골세포에서 억제된 제2형 콜라겐과 Sox-9 단백질 발현수준 및 증가된 COX-2 단백질 발현수준과 NF-κB 전사활성을 정상상태로 회복시키는 것인 방법.
연골세포의 손상에 의하여 유발된 연골질환이 발병된 인간을 제외한 포유동물의 손상된 연골부위에 0 보다 크고 2 cGy 이하의 선량을 나타내는 LDR을 조사하는 단계를 포함하는 연골질환의 치료방법.