KR20210096598A - Ilt2에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ILT2에 대한 모노클로날 항체, 또는 이의 항원-결합부뿐만 아니라 이를 포함하는 약학 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 암을 치료하는 방법, 조합 치료, 및 환자 선택이 또한 제공된다.

Description

ILT2에 대한 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 6월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/034,569호, 및 2019년 8월 12일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/885,374호의 우선권 이익을 청구하며, 그 내용은 모두 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 모노클로날 항체 및 암에 대한 면역 반응의 조절 분야에 대한 것이다.
LILRB1, LIR1 및 CD85j로도 알려져 있는 ILT2는 면역 반응의 억제에서 알려진 기능을 갖는 면역 세포 상에서 발현되는 세포 표면 단백질이다. 이 단백질은 세포외 영역에 4개의 IgC 도메인 및 4개의 세포내 ITIM 도메인을 함유한다. 이는 ILT1, ILT2, ILT3 및 ILT4로 제조되는, ILT 패밀리의 구성원이다. ILT2는 가지며, ILT4와 가장 유사하며, 약 80% 상동성을 갖는다. ILT2의 알려진 리간드에는 MHC-1 뿐만 아니라 비-전통적 MHC 분자, 예컨대 HLA-F, HLA-G, HLA-B27 및 UL18(인간 CMV)이 포함된다. 인간 게놈에서 ILT2의 알려진 가장 강력한 상호작용인자는 HLA-G1이다.
HLA-G1은 유방암, 자궁경부암, CRC, 폐암, 위암, 췌장암, 갑상샘암 및 난소암 세포 뿐만 아니라 다형성 교모세포종, 흑색종 세포를 포함하는 다양한 악성물의 표면 상에서 널리 발현된다. 그 발현은 불량한 임상 결과와 연관된다. 또한, 종양 미세환경에서의 ILT2 발현은 HLA-G1이 존재하지 않는 경우라도, 종양용해 면역 치료법에 대해 불량한 임상 반응과 연관되었다. 암에 대한 무기로서 그리고 암 감독을 위한 면역 반응의 이용은 암 방지 및 치료를 위해 유망한 방법이다. 그러나, ILT2는 효과적인 면역 치료법에 대한 장애물을 제시한다. ILT2-HLA-G1 축뿐만 아니라 ILT2의 HLA-G1-독립적 기능을 우회할 수 있는 치료 방식이 크게 요구된다.
본 발명은 ILT2에 결합하고 ILT2-매개 면역 세포 저해를 억제하는 모노클로날 항체; 뿐만 아니라 이를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법, 본 발명의 항체, 결합 단편 및 조성물을 제조하는 방법뿐만 아니라 PD-1/PD-L1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 방법이 제공된다.
제1 양태에 따르면, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
a. CDR-H1은 SEQ ID NO: 13(SGYYWN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 14(YISYDGSNNYNPSLKN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 15(GYSYYYAMDX)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 16(RTSQDISNYLN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 17(YTSRLHS)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 18(QQGNTLPT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 식 중 X는 A, C 및 S로부터 선택되거나;
b. CDR-H1은 SEQ ID NO: 1(DHTIH)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 2(YIYPRDGSTKYNEKFKG)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 3(TWDYFDY)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 4(RASESVDSYGNSFMH)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 5(RASNLES)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 6(QQSNEDPYT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나;
c. CDR-H1은 SEQ ID NO: 7(GYTFTSYGIS)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 8(EIYPGSGNSYYNEKFKG)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 9(SNDGYPDY)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 10(KASDHINNWLA)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 11(GATSLET)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 12(QQYWSTPWT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 19(QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGSTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARTWDYFDYWGQGTTLTVSS), SEQ ID NO: 21(QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWVGEIYPGSGNSYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARSNDGYPDYWGQGTTLTVSS) 및 SEQ ID NO: 23(DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDXWGQGTSVTVSS)으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 식 중 X는 A, C 및 S로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 20(DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK), SEQ ID NO: 22(DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK), SEQ ID NO: 24(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPTFGQGTKLEIK) 및 SEQ ID NO: 45(DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPTFGSGTKLEIK)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화되며, X는 A 및 S로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, X는 A이며, SEQ ID NO: 15는 GYSYYYAMDA(SEQ ID NO: 25)이고 SEQ ID NO: 23은 DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 28)이다.
또 다른 양태에 따르면, VKKGQFPIPSITWEH(SEQ ID NO: 41), LELVVTGAYIKPTLS(SEQ ID NO: 42), VILQCDSQVAFDGFS(SEQ ID NO: 43) 및 WYRCYAYDSNSPYEW(SEQ ID NO: 44)로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 인간 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1(ILT2) 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 에피토프는 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44를 포함하는 3-차원 에피토프이다.
또 다른 양태에 따르면, ILT2에 결합하고 ILT2 및 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 간 직접적 상호작용을 억제하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은 B2M과의 ILT2 직접적 상호작용의 억제를 통해 ILT2 및 HLA 단백질 또는 MHC-I 단백질의 상호작용을 억제한다.
일부 구현예에 따르면, HLA는 HLA-G이다.
또 다른 양태에 따르면, ILT2에 결합하며 암을 앓는 대상체에서 하기 중 적어도 세 가지를 유도하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다:
a. 증가된 자연 살해(NK) 세포 세포독성;
b. 증가된 T 세포 세포독성, 증식, 또는 둘 다;
c. 증가된 대식구 포식작용, 증가된 M1 염증성 대식구의 생성, 감소된 M2 저해성 대식구의 생성 또는 이의 조합; 및
d. 증가된 암의 종양으로 귀소하는 수지상 세포, 증가된 수지상 세포 활성화 또는 이의 조합.
일부 구현예에 따르면, 암은 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 결합, 항-종양 T-세포 반응의 유도/증강, T-세포 증식의 증가, 암-유도 저해성 골수 활성의 감소, 자연 살해 세포 세포독성의 증가, 대식구 포식작용의 증가, M1 염증성 대식구의 생성 증가, M2 억제성 대식구의 생성 감소, 종양 미세환경에서 수지상 세포수의 증가, 수지상 세포 활성화의 증가, HLA-G 발현 암의 치료, 및 MHC-I 발현 암의 치료 중 적어도 하나에서 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하기 위해 옵소닌화제와 병용하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하기 위해 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법과 병용하기 위한 것이다.
또 다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 옵소닌화제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 옵소닌화제는 EGFR 억제제이며, 선택적으로 EGFR 억제제는 세툭시맙(Cetuximab)이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항-PD-L1/PD-1 기반 면역치료법을 대상체에 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은:
a. 대상체에서 ILT2 또는 가용성 HLA-G의 발현이 사전 결정된 역치 초과임을 확인하는 단계; 및
b. ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제를 대상체에 투여하는 단계;
를 포함하며, 이에 의해 대상체에서 암을 치료한다.
일부 구현예에 따르면, 확인은 투여 전에 대상체에서 ILT2 또는 가용성 HLA-G의 발현 측정을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 ILT2의 발현을 확인하는 단계를 포함하며 ILT2의 발현은 대상체의 면역 세포 내이다.
일부 구현예에 따르면, 면역 세포는 말초혈 면역 세포 및 종양내 면역 세포로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 면역 세포는 CD8 양성 T 세포, 대식구, NK 세포 및 TEMRA 세포로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 면역 세포는 말초혈 CD8 양성 T 세포이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 가용성 HLA-G의 발현을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법을 대상체에 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은:
a. ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제를 대상체에 투여하는 단계; 및
b. 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법을 대상체에 수행하는 단계;
를 포함하며, 이에 의해 대상체에서 암을 치료한다.
또 다른 양태에 따르면, HLA-G, MHC-I 또는 둘 다를 발현하는 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 방법이 제공되며, 방법은 암 세포를 ILT2 길항제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제는 ILT2 길항제이다.
일부 구현예에 따르면, ILT2 길항제는 ILT2에 특이적으로 결합하고 ILT2-매개 면역 세포 저해를 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구현예에 따르면, 방법의 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에서 기재되는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구현예에 따르면, 항-PD-L1/PD-1 기반 면역치료법은 항-PD-1 차단 항체이다.
일부 구현예에 따르면, 암은 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법에 불응성이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 옵소닌화제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 옵소닌화제는 EGFR 억제제이며, 선택적으로 EGFR 억제제는 세툭시맙이다.
또 다른 양태에 따르면, 암을 앓는 대상체를 치료하기 위해 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법과 병용하기 위한, ILT2에 결합하고 ILT2-매개 면역 세포 저해를 억제하는 제제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에 따르면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화 및 증가된 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계, 및 증가된 포식작용, 증가된 활성, 증가된 생성, 감소된 생성, 모집, 증가된 활성화, 감소된 활성 및 증가된 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계; 또는
제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화 및 증가된 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계; 및
iii. 증가된 포식작용, 증가된 활성, 증가된 생성, 감소된 생성, 모집, 증가된 활성화, 감소된 활성 및 증가된 세포독성 중 적어도 두 가지를 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
를 포함하며, 이에 의해 제제를 제조한다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화 및 증가된 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 세 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계 및 적어도 세 가지를 유도하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 제제가 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 능력을 평가하는 단계 및 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계; 또는 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 제제가 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 능력을 평가하는 단계; 및
iii. 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
를 포함하며, 이에 의해 제제를 제조한다.
일부 구현예에 따르면, 유효성 증가는 전염증성 사이토카인 분비에서의 상승적 증가를 포함하거나 증가된 세포독성은 전염증성 사이토카인 분비에서의 증가를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 전염증성 사이토카인은 GM-CSF, TNFα 및 IFNγ로부터 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 유효성 증가는 T 세포 활성화, 세포독성 또는 둘 다의 상승적 증가를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, T 세포 활성화, 세포독성 또는 둘 다의 증가는 증가된 막 CD107a 발현을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 유효성 증가는 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법에 대한 불응성 암의 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법에 반응하는 암으로의 전환을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 암 세포는 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암이다.
또 다른 양태에 따르면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 제제가 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 능력을 평가하는 단계 및 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계; 또는 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 제제가 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 능력을 평가하는 단계; 및
iii. ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
를 포함하며, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 따르면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 ILT2 에피토프에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 또는 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 ILT2 에피토프에 결합하는 제제를 수득함으로써 선택된 제제의 서열인, 단계를 포함하며; 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 핵산 분자는 발현 벡터이다.
본 발명의 추가 구현예 및 적용 가능성의 전체 범위는 이후 본원에서 주어지는 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명해질 것이므로, 상세한 설명 및 특정한 실시예는, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 단지 예시로서 주어짐이 이해되어야 한다.
도 1. 림프구 상에서 ILT2의 발현을 도시하는 히스토그램. 5 ㎍/㎖ 최종 농도로 상업적 항체 #1을 사용하였다. 결합은 검은색 히스토그램으로 도시된 반면 이소형 대조군 염색은 밝은 회색 히스토그램으로 나타낸다.
도 2. 다양한 면역 세포 상에서 ILT2의 발현을 도시하는 히스토그램. 5 ㎍/㎖ 최종 농도로 상업적 항체 #1을 사용하였다. 결합은 검은색 히스토그램으로 도시된 반면 이소형 대조군 염색은 밝은 회색 히스토그램으로 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c. (도 3a) ILT2 RNA가 과발현되는 TCGA 데이터베이스로부터의 암 적응증 표 (도 3b) 종양에서의 MDSC 농축 및 ILT2 발현 간 연관성의 점 그래프. M2 농축 및 ILT2 발현 간 연관성을 도시하는 막대 그래프가 또한 제시된다. (도 3c). 상이한 종양에서 ILT2를 발현하는 다양한 면역 세포%의 산란 그래프.
도 4a 내지 도 4b. (도 4a) 면역조직화학(IHC)에 의해 결정되는 HLA-G 양성인 다양한 암에 대한 사례%의 막대 그래프. (도 4b) 다양한 암에 대한 HLA-G IHC 스코어의 산란 그래프.
도 5. 다양한 암에서 가용성 HLA-G 수준의 산란 그래프.
도 6. 3개의 항-ILT2 항체의 중쇄 및 경쇄의 서열. KABAT 시스템에 의해 결정되는 CDR은 밑줄치거나 빨간색으로 나타낸다.
도 7a 내지 도 7e. (도 7a) ILT2 및 ILT2 패밀리 구성원에 대한 항체 결합가의 표. (도 7b) 인간 ILT2로 전달감염된 BW 세포의 세포 표면 상 ILT2에 대한 항체 결합의 히스토그램. (도 7c) 인간 ILT2로 전달감염된 BW 세포의 표면 상에서 발현되는 ILT2에 대한 키메라 및 인간화 19E3(왼쪽 패널) 및 키메라 및 인간화 15G8(오른쪽 패널) 결합의 선 그래프. (도 7d) 19E3 항체를 이용한 위암 샘플 상의 면역염색. (도 7e) 15G8 인간화 항체를 사용하는 건강한 대조군 및 암 환자로부터의 PBMC 샘플에서 ILT2를 발현하는 다양한 면역 세포%의 산란 그래프.
도 8a 내지 도 8p. (도 8a) 각각의 ILT2 항체 및 양성 대조군(PC, GHI/75 항체)에 대한 차단%의 막대 그래프. (도 8b) ILT2 차단 항체의 존재 하에 HLA-G를 발현하는 세포에 대한 ILT2-바이오틴 결합의 히스토그램. 세포에 대한 ILT2-바이오틴의 결합은 유세포 측정 분석에 의해 스트렙타비딘-PE를 사용하여 결정되었다. 항체 없음(회색선), 15G8(밝은 회색선), 이소형 대조군(검은색선). (도 8c) HLA-G를 발현하는 세포에 대한 ILT2-바이오틴 결합에 의해 결정되는 15G8 인간화 항체의 차단 활성의 선 그래프. (도 8d) 항체의 존재 하에 HLA-G를 발현하는 세포에 대한 ILT2-바이오틴의 결합에 의해 결정되는 키메라 및 인간화 19E3(왼쪽 패널) 및 키메라 및 인간화 15G8(오른쪽 패널)의 차단 활성의 선 그래프. (도 8e) HLA-G-발현 세포의 존재 하에 및 ILT2 차단 항체의 존재 또는 부재 하에 ILT2 신호전달 리포터 작제물을 발현하는 세포로부터의 마우스 IL-2 분비의 막대 그래프. PC=양성 대조군(GHI/75 항체). (도 8f) 리포터 검정에 의해 결정되는 15G8 인간화 항체의 차단 활성의 선 그래프. (도 8g) ILT2 차단 항체 및 양성 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 ILT2 신호전달 리포터 작제물을 발현하는 세포로부터의 마우스 IL-2 분비의 막대 그래프. (도 8h 내지 도 8k) (도 8h) ILT2가 없거나, (도 8i 내지 도 8k) (도 8i)MHC-I 발현만을 갖거나 (도 8j 내지 도 8k) ILT2 차단 항체 및 양성 대조군 (도 8i 내지 도 j) 범-HLA 항체 또는 (도 8k) HLA-G 특이적 항체의 존재 또는 부재 하에 MHC-I 및 외인성 HLA-G를 모두 발현하는, A375 암 세포와 공동 배양된 ILT2를 발현하는, Jurkat 세포로부터의 인간 IL-2 분비의 막대 그래프. (도 8l 내지 도 8n) (도 8l) 15G8 항체, (도 8m) GHI/75 항체 및 (도 8n) HP-F1 항체의 존재 또는 부재 하에 HLA-G를 발현하는 A375 암 세포와 배양된 ILT2를 발현하는 Jurakt 세포로부터의 인간 IL-2 분비의 막대 그래프. (도 8o 내지 도 8p) 15G8 항체의 존재를 포함하고 및 포함하지 않고 HLA-G-양성 암 세포와 인큐베이션된, 각각 TIL 세포 및 NK 세포에서의, 활성화 마커 (도 8o) 인산화된 ZAP70 및 (도 8p) 인산화된 Syk의 발현의 점 그래프.
도 9a 내지 도 9d. (도 9a) FACS-기반 방법에 의해 결정되는 ILT2 항체의 존재 하에 대식구와 공동 배양된 HLA-G 발현 암 세포의 대조군으로부터의 %로 포식작용을 측정하는 막대 그래프. (도 9b) Incucyte® 시스템에 의해 결정되는 ILT2 항체의 존재 하에 대식구에 의한 암 세포의 실시간 포식작용의 선 그래프. (도 9c) ILT2 항체 15G8의 존재 하에 대식구와 공동 배양된 다양한 HLA-G 및 MHC-I 발현 암 세포의 대조군으로부터의 %로 포식작용을 측정하는 막대 그래프. (도 9d) ILT2 항체, 에르비툭스(Erbitux), hIgG 대조군 또는 이의 조합의 존재 하에 A253-HLA-G 세포와 공동 배양된 대식구에 의한 포식작용의 막대 그래프.
도 10a 내지 도 10b. ILT2 항체의 존재 하에 (도 10a) 야생형 721.221 세포 또는 HLA-G 발현 721.221 세포 또는 (도 10b) HLA-G 발현 A375 세포와 공동-배양된 활성화된 CD8 T 세포로부터의 IFNγ 분비 및 그랜자임 B 분비의 막대 그래프.
도 11a 내지 도 11h. (도 11a 내지 도 11b) ILT2 항체의 존재 하에 (도 11a) HLA-G 및 (도 11b) MHC-I을 발현하는 다양한 암 세포주와 공동 배양된 NK 세포주 세포로부터의 세포독성%의 막대 그래프. (도 11c 내지 도 11d) 15G8 ILT2 항체의 존재 하에 각각 H&N 암 및 흑색종 세포와 공동 배양된 NK 세포주 세포로부터의 (도 11c) 그랜자임 B 및 (도 11d) IFNγ 분비의 막대 그래프. (도 11e 내지 도 11f) ILT2 항체의 존재 하에 표적 암 세포와 인큐베이션된 ILT2 양성 일차 NK 세포에서 (도 11e) IFNγ 발현 및 (도 11f) CD107A 발현의 막대 그래프. (도 11g 내지 도 11h) ILT2 항체에 반응하는 ILT2 양성 세포 및 (도 11g) IFNγ 발현 및 (도 11h) CD107A 발현의 연관성을 나타내는 개별 발현의 산란 그래프.
도 12. IgG 또는 항-ILT2 항체의 존재 하에 건강한 공여자로부터 단리된 단핵구로부터 M0, M1 또는 M2 대식구로 분화된 대식구에서의 유세포 측정에 의해 결정되는 HLA-DR 및 CD80 발현(MFI)의 선 그래프. 대조군 IgG 대비 특정된 마커의 증가된 발현을 나타낸 환자의 수를 평가된 각각의 조건에 대해 나타낸다.
도 13a 내지 도 13c. (도 13a) 다양한 일차 종양 세포와 공동-배양된 대식구에 의한 포식작용의 막대 그래프. (도 13b 내지 도 13c) 본 발명의 인간화 항체의 존재 하에 자가 대식구에 의해 (도 13b) RCC 환자 및 (도 13c) H&N 환자로부터 단리된 일차 종양 세포의 용량 의존적 포식작용의 막대 그래프.
도 14a 내지 도 14l. (도 14a) RCC 및 식도암 환자로부터의 종양 세포(왼쪽 패널) 및 PBMC(오른쪽 패널)에서 ILT2 및 PD-1 발현의 점 그래프. (도 14b 내지 도 14c) CRC 환자의 TME에서 CD8 T 세포 집단에서 (도 14b) PD-1 및 (도 14c) ILT2 RNA 발현의 상자 및 휘스커 그래프. (도 14d 내지 도 14e) (도 14d) 건강한 공여자의 말초혈로부터의 CD8 T 세포에서의 ILT2 발현 및 (도 14e) 식도암으로부터의 TIL에서의 ILT2 및 PD-1 발현의 점 그래프. (도 14f) 15G8, 항-PD-1 항체 또는 둘의 조합의 존재 하에 스타필로코커스 내독소 B(SEB)로 활성화된 10명의 건강한 공여자로부터의 PBMC 상에서 막 CD107a에서의 증가의 산란 그래프. (도 14g) 3명의 공여자로부터의 예시적 PBMC에서의 발현에서 CD107a 증가의 막대 그래프. (도 14h 내지 도 14j) 항-PD-1 항체, 인간화 항-ILT2 항체 또는 둘 다의 존재 하에 다양한 일차 암 세포와 공동 배양된 활성화된 PBMC로부터의 염증성 사이토카인 (도 14h) IFNγ, (도 14i) TNFα, (도 14j) GM-CSF 분비 수준의 막대 차트. (도 14k 내지 도 14l). 혼합 림프구 반응에서 (도 14k) 수지상 세포 또는 (도 14l) 대식구와 공동 배양된 T 세포로부터의 IFNγ 분비 수준의 막대 차트.
도 15a 내지 15f. (15a) 인간 대식구 및 항-ILT2 항체가 보충된 면역손상된 마우스에서 성장시킨 HLA-G 및 MHC-I 발현 종양의 종양 부피의 선 그래프. (도 15b). 폐 종양을 방지하기 위한 마우스 치료 일정의 예시. (도 15c) 인간 PBMC 및 ILT2 항체를 포함하거나 포함하지 않는 HLA-G 양성 암 세포가 접종된 면역손상된 마우스로부터의 폐의 사진. (도 15d) 15c로부터의 데이터를 요약하는 산란 그래프. (도 15e) 이미 확립된 폐 종양을 치료하기 위한 마우스 치료 일정의 예시. (도 15f) 종양 중량의 상자 및 휘스커 그래프.
도 16a 내지 도 16f. (도 16a 내지 도 16f) (도 16a) 전체 CD8 T 세포에서의 CD107A 발현, (도 16b) TEMRA 세포에서의 CD107A 발현, (도 16c) NK 세포에서의 CD69 발현, (도 16d) 전체 CD8 T 세포에서의 CD69 발현, (도 16e) TEMRA 세포에서의 CD107 발현 및 (도 16f) 각각 이의 TEMRA 세포 또는 NK 세포에서 저수준 또는 고수준의 ILT2를 갖는 공여자로부터의 PBMC를 수여받은 마우스에서 조합 처리된 NK 세포에서의 CD69 발현의 상자 및 휘스커 그래프. *은 P< 0.005이다. **은 P< 0.0005이다. ***은 P< 0.0001이다.
도 17a 내지 도 17f. (도 17a) H&N 암이 접종되고 항-ILT2 또는 대조군 항체로 처리된 인간화 NSG 마우스의 마우스 치료 일정의 예시. (도 17b) IgG 및 항-ILT2 처리된 마우스로부터의 종양 중량의 선 그래프. (도 17c 내지 도 17e) (도 17c) BND-22 처리에 반응하거나(R) 반응하지 않은(NR) 마우스에서 말초 CD8 T 세포에서의 기준선 ILT2 수준의 막대 그래프. 종양-내 처리-후 항-ILT2 항체로 처리된 4마리 마우스에서의 (도 17d) CD107A 발현, (도 17e) M1/M2 비 및 (도 17f) 전체 CD80 양성 수지상 세포수.
도 18a 내지 도 18f. (도 18a) 유의미한 예측 결합을 갖는 잔기를 나타내는 ILT2의 부분 서열. 이들 잔기는 에피토프에 속하는 이의 미가공 확률의 함수로서, 가장 높은 확률에 대한 보라색부터 가장 낮은(그러나 여전히 유의미한) 확률에 대한 연한 청록색까지의 4개 분류로 구분된다. 별은 선택된 돌연변이의 위치를 표시한다. (도 18b 내지 도 18c) (도 18b) 18a로부터의 잔기의 위치 및 (도 18c) ILT2 상의 4개의 주요 상호작용 영역을 나타내는 ILT2 표면 구조의 3D 렌더링. (도 18d 내지 도 18f) (도 18d) 15G8 항체의 에피토프(노란색/분홍색) 및 WO2020/136145로부터의 3H5, 12D12 및 27H5 항체의 에피토프(빨간색)뿐만 아니라 3H5 항체의 이차 에피토프(진청색) 및 (도 18e 내지 도 18f) (도 18e) HLA-A(파란색) 또는 (도 18f) HLA-G(파란색)와의 복합체에서 ILT2 상의 15G8 에피토프(분홍색)와 B2M(라일락색)의 상호작용을 나타내는 ILT2의 3D 리본 또는 표면 다이어그램.
도 19a 내지 도 19c. (도 19a 내지 도 19b) 다양한 항-ILT2 항체의 존재 하에 대식구와 공동배양된 (도 19a) A375-HLA-G 및 (도 19b) SKMEL28-HLA-G 암 세포의 IgG 대조군 대비 증가된 포식작용%의 막대 그래프. (도 19c) 경쟁하는 비바이오틴화 GHI/75, HP-F1 및 15G8 항체의 존재 하에 바이오틴화 15G8 항체를 사용하는 경쟁 ILT 결합 ELISA의 선 그래프.
본 발명은 ILT2에 결합하고 ILT2-매개 면역 저해를 억제하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편 및 약학 조성물에 대한 것이다. 암을 치료하는 방법 및 PD-1/PD-L1 면역치료법을 증강시키는 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 적어도 부분적으로 ILT2 길항작용이 암 세포에 대항하기 위해 PD-1 및 PD-L1-기반 면역치료법과 상승적으로 작용한다는 놀라운 발견에 기반한다. 구체적으로, 항-PD-1 항체와 조합된 ILT2 차단 항체가 면역 세포에 의한 전염증성 사이토카인 분비를 증가시킴이 확인되었다. 상기 증가는 단순히 부가적인 것이 아니라, 오히려 개별적으로 각각의 제제의 효과의 합보다 컸다. 실제로, 적어도 하나의 사이토카인에 있어서 드 노보(de novo) 증가가 관찰되었고, 여기서 제제 단독으로는 임의의 효과를 갖지 않았다. 상기 조합된 처리는 PD-1/PD-L1 불응성 암을 반응성으로 만드는 전환을 허용한다.
또한 놀랍게도 환자의 면역 세포에서 ILT2 발현 수준은 ILT2 차단 치료법의 효과와 연관됨이 확인되었다. 치료법에 대한 반응체는 높은 ILT2 수준을 가진 반면, 비-반응체는 낮은 ILT2 수준을 가졌다. 특히, 순환 CD8 양성 T 세포는 치료 결과를 예측하였다.
마지막으로, 본 발명의 항체는 D1 및 D2 도메인 간 ILT2 사이도메인(interdomain) 내의 고유한 에피토프에 결합하는 것으로 확인되었다. 상기 영역은 ILT2 및 B2M 간 상호작용 도메인으로 알려져 있고 본 발명의 항체는 상기 상호작용을 직접적으로 차단하는 것으로 알려진 첫 번째 항체이다. 또한, 본 발명의 항체는 다른 항-ILT2 항체에 대해 보고되지 않은 면역-자극 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 항체는 HLA-G 및 MHC-I 발현 암 세포에 대해 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 대식구의 면역감독을 조절할 수 있었다. 특히, 첫 번째로 면역치료법으로 사용된 항-ILT2 항체는 암 세포의 포식작용을 증강시킬 수 있었다.
항체
제1 양태에서, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 CDR-H1은 SEQ ID NO: 1(DHTIH)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 2(YIYPRDGSTKYNEKFKG)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 3(TWDYFDY)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 4(RASESVDSYGNSFMH)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 5(RASNLES)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 6(QQSNEDPYT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 CDR-H1은 SEQ ID NO: 7(GYTFTSYGIS)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 8(EIYPGSGNSYYNEKFKG)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 9(SNDGYPDY)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 10(KASDHINNWLA)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 11(GATSLET)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 12(QQYWSTPWT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 CDR-H1은 SEQ ID NO: 13(SGYYWN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 14(YISYDGSNNYNPSLKN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 15(GYSYYYAMDX)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 16(RTSQDISNYLN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 17(YTSRLHS)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 18(QQGNTLPT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 식 중 X는 A, C 및 S로부터 선택된다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 16은 GYSYYYAMDA(SEQ ID NO: 25)이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 16은 SEQ ID NO: 25이며 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 16은 GYSYYYAMDS(SEQ ID NO: 26)이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 16은 SEQ ID NO: 26이며 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 16은 GYSYYYAMDC(SEQ ID NO: 27)이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 16은 SEQ ID NO: 27이며 항체 또는 항원 결합 단편은 쥣과 항체이다.
또 다른 양태에서, 도메인 D1 및 D2 간 인간 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1(ILT2) 사이도메인에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다.
또 다른 양태에서, VKKGQFPIPSITWEH(SEQ ID NO: 41), LELVVTGAYIKPTLS(SEQ ID NO: 42), VILQCDSQVAFDGFS(SEQ ID NO: 43) 및 WYRCYAYDSNSPYEW(SEQ ID NO: 44)로부터 선택되는 ILT2의 서열 내 ILT2 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다.
또 다른 양태에서, ILT2에 결합하고 ILT2 및 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 간 상호작용을 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다.
또 다른 양태에서, ILT2에 결합하고 암을 앓는 대상체에서 하기 중 적어도 하나를 유도하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다:
a. 증가된 자연 살해(NK) 세포 세포독성;
b. 증가된 T 세포 세포독성, 증식 또는 둘 다;
c. 증가된 대식구 포식작용, 증가된 M1 염증성 대식구의 생성, 감소된 M2 저해성 대식구의 생성 또는 이의 조합; 및
d. 증가된 상기 암의 종양으로의 수지상 세포 귀소, 증가된 수지상 세포 활성화 또는 이의 조합.
일부 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 쥣과 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 본원에서 사용되는 "인간화" 항체는 인간 골격을 갖지만, 비-인간 항체로부터 유래되거나 취해지는 CDR을 갖는 항체를 나타낸다. 일부 구현예에서, 인간화 동안 CDR은 변경될 수 있지만 일반적으로 여전히 비-인간 항체의 CDR로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 단일쇄 항체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 단일 도메인 항체이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1(ILT2)에 결합한다. 일부 구현예에서, ILT2는 인간 ILT2이다. 일부 구현예에서, ILT2는 포유류 ILT2이다. 일부 구현예에서, ILT2는 영장류 ILT2이다. 일부 구현예에서, ILT2는 쥣과 ILT2이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2의 리간드 포켓에 결합한다. 일부 구현예에서, 리간드는 B2M이다. 일부 구현예에서, 리간드는 HLA가 아니다. 일부 구현예에서, 리간드는 HLA이다. 일부 구현예에서, HLA는 HLA-G이다. 일부 구현예에서, 리간드는 MHC가 아니다. 일부 구현예에서, 리간드는 MHC이다. 일부 구현예에서, MHC는 MHC 클래스 I(MHC-I)이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 사이도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이도메인은 D1 및 D2 도메인 간 계면이다. 일부 구현예에서, 사이도메인은 D1 및 D2 도메인 간 힌지 도메인이다. 일부 구현예에서, 사이도메인은 D1의 N-말단 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 사이도메인은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 54 내지 184로부터이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 31의 아미노산 54 내지 184는 사이도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이도메인은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 90 내지 184로부터이다. 일부 구현예에서, 아미노산 90 내지 184는 사이도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 사이도메인 내 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 사이도메인의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 에피토프는 D2 내에 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 D2에서 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 적어도 부분적으로 D2에 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 적어도 부분적으로 D2에서 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 D1 및 D2에 걸쳐있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 HLA-G의 α3 도메인과 상호작용하는 ILT2 도메인에 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, ILT2는 포유류 ILT2이다. 일부 구현예에서, ILT2는 인간 ILT2이다. 일부 구현예에서, ILT2는 NCBI 참조 서열: NP_006660.4에서 제공되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, ILT2는 하기 아미노산 서열을 갖는다: MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH(SEQ ID NO: 31).
일부 구현예에서, ILT2는 NCBI 참조 서열: NP_001075106.2에서 제공되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, ILT2는 NCBI 참조 서열: NP_001075107.2에서 제공되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, ILT2는 NCBI 참조 서열: NP_001075108.2에서 제공되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, ILT2는 NCBI 참조 서열: NP_001265328.2에서 제공되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, ILT2의 D1 도메인은 아미노산 서열 GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGA(SEQ ID NO: 46)를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, ILT2의 D1 도메인은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 24 내지 121을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, ILT2의 D2 도메인은 아미노산 서열 YIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGV(SEQ ID NO: 47)를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, ILT2의 D2 도메인은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 122 내지 222를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, ILT2의 사이도메인은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 Gln41, Lys65, Trp90, Gly120, Ala121, Val122, Ile123, Gln148, Val149, Ala150, Phe151, Asp201, Asn203 및 Glu207을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 SEQ ID NO: 31의 아미노산 Gln41, Lys65, Trp90, Gly120, Ala121, Val122, Ile123, Gln148, Val149, Ala150, Phe151, Asp201, Asn203 및 Glu207을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 SEQ ID NO: 31의 아미노산 Gln41, Lys65, Trp90, Gly120, Ala121, Val122, Ile123, Gln148, Val149, Ala150, Phe151, Asp201, Asn203 및 Glu207로부터 선택되는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개 또는 14개 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 SEQ ID NO: 31의 아미노산 Gln41, Lys65, Trp90, Gly120, Ala121, Val122, Ile123, Gln148, Val149, Ala150, Phe151, Asp201, Asn203 및 Glu207로부터 선택되는 적어도 10개 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 41에서 제공되는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 42에서 제공되는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 43에서 제공되는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 44에서 제공되는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44 중 적어도 2개를 포함하는 3차원 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 3차원 에피토프는 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44 중 적어도 3개를 포함한다. 일부 구현예에서, 3차원 에피토프는 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Q18, G19, K42, L45, S64, I65, T66, W67, E68, G97, A98, Y99, I100, Q125, V126, A127, F128, D178, N180, S181, 및 E184로부터 선택되는 ILT2의 잔기를 포함하는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 G97, A98, Y99, I100, Q125 및 V126으로부터 선택되는 ILT2의 잔기를 포함하는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Q18, G19, K42, L45, S64, I65, T66, W67, E68, G97, A98, Y99, I100, Q125, V126, A127, F128, D178, N180, S181, 및 E184로부터 선택되는 ILT2의 복수의 잔기를 포함하는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 G97, A98, Y99, I100, Q125 및 V126으로부터 선택되는 ILT2의 복수의 잔기를 포함하는 ILT2 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Q18, G19, K42, L45, S64, I65, T66, W67, E68, G97, A98, Y99, I100, Q125, V126, A127, F128, D178, N180, S181, 및 E184로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 21개 잔기에 결합한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 G97, A98, Y99, I100, Q125 및 V126으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 잔기에 결합한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 G97, A98, Y99, I100, Q125 및 V126에 결합한다. 본원에서 사용되는 숫자는 SEQ ID NO: 31에 대한 것임이 이해될 것이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 길항제이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 작용제가 아니다. 일부 구현예에서, 길항작용은 ILT2-매개 면역 저해의 길항작용이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2-매개 면역 저해를 억제한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 신호전달을 억제한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 상호작용은 직접적 상호작용이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 B2M과의 ILT2 접촉을 억제한다. 일부 구현예에서, 접촉은 직접적 접촉이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 및 HLA, MHC 또는 둘 다 간 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 B2M과의 ILT2 상호작용의 억제를 통해 ILT2 및 HLA, MHC 또는 둘 다 간 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 상호작용은 B2M에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 항체는 B2M과의 상호작용의 억제를 통해 HLA, MHC 또는 둘 다와의 상호작용을 간접적으로 억제한다. 일부 구현예에서, 상호작용은 B2M 매개 상호작용이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 및 B2M/HLA 복합체 간 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 및 B2M/MHC 복합체 간 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 복합체는 B2M 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체는 HLA 또는 MHC 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체는 B2M 이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체는 HLA 또는 MHC 이량체를 포함한다.
일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 면역 세포의 저해이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 대식구, 수지상 세포 및 자연 살해(NK) 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 T 세포, 대식구, 수지상 세포 및 NK 세포의 저해이다. 일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 T 세포, 대식구 및 NK 세포의 저해이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD8 양성 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 TEMRA 세포(CD45RA를 재발현하는 말단 분화된 효과기 메모리 세포)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8 양성 T 세포, TEMRA 세포, 수지상 세포, 대식구 및 자연 살해(NK) 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 대식구이다. 일부 구현예에서, 대식구는 종양-연관 대식구(TAM)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 수지상 세포는 내성생성 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 말초혈 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 종양내 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 종양 미세환경(TME) 내 면역 세포이다. 일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 대식구 포식작용의 저해이다. 일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 NK 세포 세포독성의 저해이다. 일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 T 세포 세포독성의 저해이다. 일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 T 세포 증식의 저해이다. 일부 구현예에서, ILT2-매개 면역 저해는 면역 세포 증식의 저해이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 이외의 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B의 구성원에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2에 특이적이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2에 우선적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ILT2 이외의 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B의 구성원을 억제하지 않는다.
본원에서 사용되는 "증가된 결합 유효성"은 이소형 대조군의 결합보다 큰 표적 또는 항원에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 증가된 결합은 결합 유효성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 증가이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 증가된 결합은 결합하지 않는 이소형 대조군 대비 결합의 존재이다. 특정 도메인에 대한 항체의 결합은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 항체 결합은 비제한적으로 x-선 결정측정, 면역침전, 면역블로팅, 경쟁 검정, 및 역학적 배제 검정을 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 방식으로 검정될 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 결합 유효성은 특이적 결합이다.
본원에서 개시되는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 103 M"1 초"1, 5×103 M"1 초"1, 104 M"1 초"1 또는 5×104 M"1 초"1 이상의 속도(k(on))로 표적 항원, 예로, ILT2에 결합하는 것으로 언급될 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 본원에서 개시되는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 10-6 M 이상의 친화도로 표적 항원에 결합하는 것으로 언급될 수 있는 반면, 대부분의 항체는 10-9 M의 전형적 친화도를 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 19(QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGSTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARTWDYFDYWGQGTTLTVSS)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 21(QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWVGEIYPGSGNSYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARSNDGYPDYWGQGTTLTVSS)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 23(DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDXWGQGTSVTVSS)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 식 중 X는 A, C 및 S로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 20(DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 22(DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 24(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPTFGQGTKLEIK의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 45(DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPTFGSGTKLEIK)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 23은 DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 28)이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 23은 SEQ ID NO: 28이며 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 23은 DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDSWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 29)이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 23은 SEQ ID NO: 29이며 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 23은 DVQLQGSGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTSEDTATYYCAHGYSYYYAMDCWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 30)이다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 23은 SEQ ID NO: 30이며 항체 또는 항원 결합 단편은 쥣과이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나 완화하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 암은 HLA-G 양성 암이다. 일부 구현예에서, 암은 MHC-I 양성 암이다. 일부 구현예에서, 암은 HLA-G 발현 암이다. 일부 구현예에서, 암은 MHC-I 발현 암이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 종양 미세환경을 면역억제성에서 면역자극성으로 변화시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 종양 미세환경의 변화는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 항-종양 T-세포 반응의 유도/증강, T-세포 증식의 증가, 암-유도 저해성 골수 활성의 감소, 수지상 세포(DC) 활성화의 증가, 수지상 세포의 종양으로의 귀소 증가, 대식구 포식작용의 증가, M1 대식구의 생성 증가, M2 대식구의 생성 감소 및 NK 세포 활성의 증가. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암 세포에 대한 T-세포 반응을 증가시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, T 세포 반응은 증가된 전염증성 사이토카인 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 반응은 증가된 세포독성을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 반응은 증가된 T 세포 증식을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암 세포의 대식구 포식작용을 증가시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 수지상 세포의 종양 또는 암으로의 귀소를 증가시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 대식구의 포식작용을 증가시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암의 대식구 포식작용을 증가시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 M1 대식구의 생성을 증가시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 M2 대식구의 생성을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암 세포에 대한 NK 세포 세포독성을 증가시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암-유도 저해성 골수 활성을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 내성생성 수지상 세포(DC) 활성을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 M1 단핵구 활성 또는 수를 증가시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 M2 단핵구 활성 또는 수를 감소시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 M1 대식구의 생성을 증가시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 M2 대식구의 생성을 감소시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, M1 단핵구/대식구는 염증성 대식구/단핵구이다. 일부 구현예에서, M2 단핵구/대식구는 억제성 대식구/단핵구이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 종양에서 DC 수를 증가시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 DC의 종양으로의 모집을 증가시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 DC의 종양으로의 모집을 증가시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 DC 활성화를 증가시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, DC 활성화 증가는 내성생성 수지상 세포 활성의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 항원 제시를 증가시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 종양에 대한 것은 종양 미세환경(TME)에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 대상체에서 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 항암 효과를 유도한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 대상체에서 적어도 2개 효과를 유도한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 대상체에서 적어도 3개 효과를 유도한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 대상체에서 적어도 4개 효과를 유도한다. 일부 구현예에서, 효과는 하기로부터 선택된다: 증가된 NK 세포 세포독성, 증가된 T 세포 세포독성, 증가된 T 세포 증식, 증가된 대식구 포식작용, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 암의 종양으로의 귀소, 및 증가된 수지상 세포 활성화. 일부 구현예에서, 효과는 하기로부터 선택된다 a) 증가된 NK 세포 세포독성; b) 증가된 T 세포 세포독성, 증식 또는 둘 다; c) 증가된 대식구 포식작용, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성 또는 이의 조합; 및 d) 증가된 수지상 세포의 암의 종양으로의 귀소, 증가된 수지상 세포 활성화 및 이의 조합. 일부 구현예에서, 세포독성은 암에 대한 세포독성이다. 일부 구현예에서, 포식작용은 암 또는 암 세포의 포식작용이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 대상체에서 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 대식구 상의 항암 효과를 유도한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 대상체에서 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 대식구 중 적어도 3개 상에서 항암 효과를 유도한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 단독치료법으로서 효과를 유도한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 조합하지 않고 효과를 유도한다.
일부 구현예에서, 증가된 세포독성은 증가된 전염증성 사이토카인 분비를 포함한다. 전염증성 사이토카인은 당분야에 잘 알려져 있고 비제한적으로 하기가 포함된다: IL-1, IL-1B, IL-6, TNFα, IFNγ, MCP-1, IL-12, IL-18, IL-2, IL-15, IL-17, IL-21 및 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF). 일부 구현예에서, 전염증성 사이토카인은 IL-6, 인터페론 감마(IFNγ) 및 GM-CSF로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전염증성 사이토카인은 GM-CSF이다.
"항-ILT2 항체", "ILT2를 인식하는 항체", 또는 "ILT2에 대한 항체"는 충분한 친화도 및 특이성을 가지고, ILT2에 결합하는 항체이다. 일부 구현예에서, 항-ILT2 항체는 이것이 결합하는 항원으로 ILT2를 갖는다.
"항원"은 항체 형성을 유발할 수 있고 항체에 의해 결합되는 분자 또는 분자의 일부이다. 항원은 하나 또는 하나를 초과하는 에피토프를 가질 수 있다. 상기 언급되는 특이적 반응은 항원이 고도로 선택적 방식으로, 그 대응하는 항체와 반응하고 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 여러 다른 항체와는 반응하지 않을 것임을 시사하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 용어 "항원 결정기" 또는 "에피토프"는 특정 항체와 특이적으로 반응하는 항원 분자의 영역을 나타낸다. 에피토프로부터 유래되는 펩티드 서열은 동물을 면역접종하고 추가적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조하기 위해, 당분야에 알려진 방법을 적용하여, 단독으로 또는 담체 모이어티와 함께 사용될 수 있다. 면역글로불린 가변 도메인은 또한 IMGT 정보 시스템(www://imgt. cines.fr/)(IMGT® V-Quest)을 사용하여 분석되어, CDR을 포함하는 가변 영역 절편을 확인할 수 있다. 예로, 문헌[Brochet, X. et al, Nucl. Acids Res. J6:W503-508 (2008)]을 참고한다.
Kabat 등은 또한 모든 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어서는 임의의 실험 데이터에 대한 의존 없이, 임의의 가변 도메인 서열에 대해 상기 시스템의 "Kabat 넘버링"을 모호하지 않게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 "Kabat 넘버링"은 문헌[Kabat et al, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 넘버링 시스템을 나타낸다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 또 다른 제제와 병용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 또 다른 제제와의 병용은 HLA-G 및/또는 MHC-I 발현 암을 치료하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 제제는 옵소닌화제이다. 일부 구현예에서, 제제는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 제제이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항-PD-1/PD-L1 기반 치료법과 병용하기 위한 것이다.
본원에서 사용되는 "옵소닌화제"는 표적 세포(예로, 암 세포, 세포내 병원체를 보유하는 세포 등)에 결합하여 표적 세포를 옵소닌화할 수 있는 임의의 제제이다. 예를 들어, 표적 세포에 결합할 수 있는 임의의 항체로서, 항체가 Fc 영역을 갖는 항체는 표적 세포를 옵소닌화하는 제제인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 옵소닌화제는 항체 의존적 세포성 포식작용(ADCP)을 유도하는 항체이다. 옵소닌화제의 예에는 비제한적으로 항-CD47 항체, 항-CD20 항체, 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 항-CD52 항체 및 항-CD30 항체가 포함된다. 일부 구현예에서, 옵소닌화제는 리툭시맙(Rituximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 페르투주맙(Pertuzumab), 허셉틴(Herceptin), 세툭시맙, 파니투무맙(Panitumumab), 및 에르비툭스로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 옵소닌화제는 항-EGFR 항체이다. 일부 구현예에서, 옵소닌화제는 에르비툭스이다.
본원에서 사용되는 "항-PD-1/PD-L1 치료법" 및 "PD-1/PD-L1 치료법"은 동의어이며 상호 교환적으로 사용되고 PD-1 및 PD-L1 신호전달 축의 차단을 포함하는 치료 요법을 나타낸다. 일부 구현예에서, 암은 PD-L1 양성 암이다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 PD-1/PD-L1 면역치료법이다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 PD-1/PD-L1 차단이다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 PD-1 기반 면역 억제를 차단하는 제제이다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 항-PD-1 차단 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 항-PD-L1 차단 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 면역 감독을 증가시킨다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 항암 치료법이다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 치료법은 종양 면역 감독을 증가시킨다. 용어 "항체"(또한 "면역글로불린"으로 언급됨)는 가장 광의의 개념으로 사용되며 이들이 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체 및 항체 단편을 구체적으로 포괄한다. 소정 구현예에서, 키메라 항체 또는 인간화 항체의 사용도 본 발명에 의해 포괄된다.
자연 발생 항체 구조의 기본 단위는 비공유 연합 및 디설피드 결합 모두에 의해 함께 연결되는, 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종이량체성 당단백질 복합체이다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 배치된 사슬-내 디설피드 가교를 갖는다. 5개의 인간 항체 클래스(IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE)가 존재하며, 이들 클래스 내에서, 다양한 하위클래스가 구조적 차이, 예컨대 단일 항체 분자에 존재하는 면역글로불린 단위의 수, 개별 단위의 디설피드 가교 구조, 그리고 사슬 길이 및 서열에서의 차이에 기반하여 인식된다. 항체의 클래스 및 하위클래스가 그 이소형이다.
중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 영역은 카복시 말단 영역보다 서열이 더 다양하며, 이에 따라 가변 도메인으로 명명된다. 상기 부분의 항체 구조는 항체의 항원-결합 특이성을 부여한다. 중쇄 가변(VH) 도메인 및 경쇄 가변(VL) 도메인이 함께 하나의 항원-결합 부위를 형성하며, 이에 따라 기본 면역글로불린 단위는 2개의 항원-결합 부위를 갖는다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 간 계면을 형성한다고 여겨진다(Chothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-63 (1985); Novotny and Haber, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4592-4596).
중쇄 및 경쇄의 카복시 말단부는 불변 도메인, 즉 CH1, CH2, CH3, CL을 형성한다. 이들 도메인에서는 다양성이 훨씬 더 적지만, 하나의 동물 종과 또 다른 종 간 차이가 존재하며, 또한 동일한 개체 내에서는, 항체의 여러 상이한 이소형이 존재하고, 각각 상이한 기능을 갖는다.
용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 항체의 가변 도메인 내 아미노산 잔기를 나타내며, 이는 본원에서 정의되는 고가변 영역 아미노산 잔기가 아니다. 본원에서 사용되는 용어 "고가변 영역"은 항체의 가변 도메인 내 아미노산 잔기를 나타내며, 이것이 항원 결합에 관여된다. 고가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. CDR이 항원의 에피토프에 대한 결합에 일차적으로 관여된다. FR 및 CDR의 범위는 정확하게 정의되었다(문헌[Kabat et al.] 참고). 일부 구현예에서, CDR은 KABAT 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, CDR은 Clothia 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, Clothia 시스템은 강화된 Clothia 시스템(Martin 시스템)이다.
본원에서 모노클로날 항체에는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체뿐만 아니라 이들이 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편이 포함된다(미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984)). 또한, 상보성 결정 영역(CDR) 그래프팅이 친화도 또는 특이성을 포함하는 항체 분자의 소정 특성을 변경하기 위해 수행될 수 있다. CDR 그래프팅의 비제한적 예가 미국 특허 제5,225,539호에 개시된다.
키메라 항체는 그 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자, 예컨대 쥣과 mAb로부터 유래되는 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 분자이다. 실질적으로 인간 항체(수신체 항체로 명명됨)로부터의 가변 영역 프레임워크 잔기 및 실질적으로 마우스 항체(공여자 항체로 명명됨)로부터의 상보성 결정 영역을 갖는 항체는 또한 인간화 항체로 언급된다. 키메라 항체는 주로 적용 시 면역원성을 감소시키기 위해 그리고 생산 시 수율을 증가시키기 위해 사용되며, 예를 들어, 쥣과 mAb가 하이브리도마로부터 더 높은 수율을 갖지만 인간에서 더 높은 면역원성을 갖는 경우, 인간/쥣과 키메라 mAb가 사용되도록 한다. 키메라 항체 및 이의 제조 방법은 당분야에 알려져 있다(예를 들어 PCT 특허 출원 WO 86/01533, WO 97/02671, WO 90/07861, WO 92/22653 및 미국 특허 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호, 제5,530,101호 및 제5,225,539호). 본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간 항체로부터의 프레임워크 영역 및 비-인간(보통 마우스 또는 래트) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체를 나타낸다. 가능하게는 CDR을 제외한, 인간화 면역글로불린의 일부는 천연 인간 면역글로불린 서열의 대응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 그러나 일부 경우에서, 예를 들어 프레임워크 영역에서의, 특정 아미노산 잔기가 인간화 항체의 성능을 최적화하기 위해 변형될 수 있다. 중요하게는, 인간화 항체는 CDR을 제공하는 공여자 항체와 동일한 항원에 결합할 것으로 예상된다. 추가 상세사항에 대해서는, 예로 Medical Research Council, UK에 양도된 미국 특허 제5,225,539호를 참고한다. 용어 "수신체 인간 면역글로불린으로부터의 프레임워크 영역" 및 "수신체 인간 면역글로불린으로부터의 프레임워크 영역" 그리고 유사한 문법적 표현은 본원에서 상호 교환적으로 사용되어 수신체 인간 면역글로불린의 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 또는 이의 일부를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 수득된 항체를, 즉 모노클로날 항체의 제조 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고, 집단을 이루는 개별 항체가 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합함을 나타내며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량 조내한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체가 포함되는 폴리클로날 항체 제조물과는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 이의 특이성에 부가하여, 모노클로날 항체는 이들이 다른 면역글로불린으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 시사하며, 본원에서 제공되는 방법에 따라 사용될 항체가 문헌[Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 의해 최초 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나 재조합 DNA 방법(예로, 미국 특허 제4,816,567호 참고)에 의해 제조될 수 있다는 것으로 간주되어서는 안 된다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌[Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 mAb는 IgG, IgM, IgE 또는 IgA를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. mAb를 제조하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내 배양될 수 있다. 고역가의 mAb가 개별 하이브리도마로부터의 세포가 프리스틴-프라이밍된 Balb/c 마우스 내로 복강내 주사되어 고농도의 요망되는 mAb를 함유하는 복수를 제조하는 생체내 제조에서 수득될 수 있다. 이소형 IgM 또는 IgG의 mAb는 이러한 복수로부터 또는 배양 상청액으로부터, 당업자에게 잘 알려진 칼럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
"항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 동의어로 사용되며, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함하는, 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 일렬 디아바디(taDb), 선형 항체(예로, 미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 1-팔 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체(예로, 비제한적으로 Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 디-scFv, 바이-scFv, 또는 일렬(디,트리)-scFv 포함); 및 이중-특이적 T-세포 연루체(BiTE)가 포함된다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 제조하며, 각각 하나의 항원-결합 부위, 및 그 명칭이 쉽게 결정화하는 그 능력을 반영하는, 잔여 "Fc" 단편을 갖는다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 산출한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 단단히, 비-공유 연합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 구성에서는 VH-VL 이량체의 3개 표면이 존재한다. 종합적으로, 6개의 고가변 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 하나의 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 고가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖지만, 전체 결합 부위보다는 친화도가 낮다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 소수의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 자유 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본원에서의 명명이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 페어로 제조되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파 및 람다로 명명되는 2개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 클래스로 할당될 수 있다. 온전한 항체에는 5개의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위클래스(이소형), 예로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가 구분될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 a, 델타, e, 감마, 및 마이크로로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 삼차원 구성은 잘 알려져 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드쇄로 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 간 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 리뷰에 대해서는 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참고한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드쇄(VH - VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개 도메인 간 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 페어링하도록 강제되어 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 문헌[Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 광의의 개념으로 사용되며 다중에피토프 특이성을 갖는 항체를 구체적으로 커버한다. 이러한 다중특이적 항체에는 비제한적으로 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며 여기서 VHVL 단위가 다중에피토프 특이성을 갖는 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 가지며 각각의 VHVL 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 2개 이상의 단일 가변 도메인을 가지며 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼중-기능적 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편이 포함된다. "다중에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상에서 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낸다.
본 발명의 모노클로날 항체는 당분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예에는 다양한 기법, 예컨대 문헌[Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al, pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)]에서의 기법이 포함된다.
생체내 항체를 유도하는 통상적 방법에 더하여, 항체는 파지 디스플레이 기법을 사용하여 시험관내 생성될 수 있다. 이러한 재조합 항체의 제조는 통상적인 항체 제조에 비해 훨씬 더 빠르고 이들은 수많은 항원에 대해 생성될 수 있다. 또한, 통상적 방법을 사용하는 경우, 여러 항원은 비-면역원성이거나 매우 독성인 것으로 증명되며, 이에 따라 동물에서 항체를 생성하기 위해 사용될 수 없다. 또한, 재조합 항체의 친화도 성숙(즉, 친화도 및 특이성 증가)이 매우 단순하고 비교적 빠르다. 마지막으로, 특정 항원에 대해 다수의 상이한 항체가 한 번의 선택 절차에서 생성될 수 있다. 재조합 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 상이한 항원 인식 부위를 갖는 큰 항체 풀을 생성하기 위해 모두 파지 라이브러리에 기반한 다양한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 라이브러리는 몇몇 방식으로 제조될 수 있다: 중쇄 생식계열 유전자 풀에서 합성 CDR3 영역을 클로닝하고 이에 따라 대규모 항체 레퍼토리를 생성함으로써 합성 레퍼토리를 생성할 수 있고, 이로부터 다양한 특이성을 갖는 재조합 항체 단편이 선택될 수 있다. 항체 라이브러리의 작제를 위한 시작 물질로서 인간의 림프구 풀을 사용할 수 있다. 인간 IgM 항체의 나이브 레퍼토리를 작제하고 이에 따라 큰 다양성의 인간 라이브러리를 생성할 수 있다. 상기 방법은 상이한 항원에 대해 다수의 항체를 선택하기 위해 널리 성공적으로 사용되어 왔다. 박테리오파지 라이브러리 작제 및 재조합 항체의 선택을 위한 프로토콜은 잘 알려진 참조 텍스트[Current Protocols in Immunology, Colligan et al (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Chapter 17, Section 17.1]에 제공된다.
비-인간 항체는 당분야에 알려진 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 하나의 방법에서, 비-인간 상보성 결정 영역(CDR)이 인간 항체 또는 공통 항체 프레임워크 서열 내로 삽입된다. 이어서 추가적인 변화가 친화도 또는 면역원성을 조절하기 위해 항체 프레임워크 내로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재되는 항체는 중화 항체이다. 본원에서 논의되는 "중화"는 본 발명의 항체에 의한 단백질 기능의 감소로서 정의된다. 일 구현예에서, 본원에서 논의되는 "중화"는 면역 세포의 표면에 대한, 바람직하게는 미성숙 및 성숙 골수 게통 유래 세포, T 세포 및 NK 세포에 대한 항체의 결합, 이에 의한 이들 세포 내부 억제 신호의 전파 차단 및 억제성이 더 적은 표현형 및 기능의 부여이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 일 구현예에서, 본원에서 기재되는 항체는 본원에서 기재되는 DNA 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, 본원에서 기재되는 항체는 본원에서 기재되는 DNA 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, 본원에서 기재되는 항체는 본원에서 기재되는 DNA 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, 본원에서 기재되는 항체는 본원에서 기재되는 DNA 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, 본원에서 기재되는 항체는 본원에서 기재되는 DNA 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 의해 인코딩된다.
또 다른 양태에 의하면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열이 제공된다.
또 다른 양태에 의하면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열은 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGGTTGGAGAGATTTATCCTGGAAGTGGTAATTCTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGAATGATGGTTACCCTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 32), GATGTACAGCTTCAGGGGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGATGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTTCTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCCCATGGTTACTCATATTACTATGCTATGGACTGCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 33), GATGTCCAGCTGCAAGGCTCTGGCCCTGGACTGGTTAAGCCTTCCGAGACACTGTCCCTGACCTGCTCTGTGACCGGCTACTCTATCACCTCCGGCTACTACTGGAACTGGATCAGACAGTTCCCCGGCAAGAAACTGGAATGGATGGGCTACATCTCCTACGACGGCTCCAACAACTACAACCCCAGCCTGAAGAACCGGATCACCATCTCTCGGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCCGTGACCGCTGCCGATACCGCTACCTACTACTGTGCTCACGGCTACTCCTACTACTACGCCATGGATGCTTGGGGCCAGGGCACATCTGTGACAGTGTCCTCT(SEQ ID NO: 34) 및 CAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGACGCTGAGTTGGTGAAACCTGGAGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGTTTCTGGCTACACCTTCACTGACCATACTATTCACTGGATGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATATATTTATCCTAGAGATGGTAGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAACCTGGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 35)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열은 GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO: 36), GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGACAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTCCTACACATCAAGATTGCACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO: 37), GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGACCTCTCAGGACATCTCCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCGTGAAGCTGCTGATCTCCTACACCTCCAGACTGCACTCTGGCGTGCCCTCCAGATTTTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGTTCTCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGGGCAACACCCTGCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG(SEQ ID NO: 38) 및 GACATCCAGATGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTATCTCTAGGAGGCAGAGTCACCATTACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTAATAATTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO: 39)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 쥣과이며 중쇄를 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 32, 33, 및 35로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 쥣과이며 경쇄를 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 36, 37, 및 39로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화되며 중쇄를 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 34이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화되며 경쇄를 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 38이다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 나타내며, DNA 및 RNA가 포함된다.
폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출 가능한 수준으로 발현하는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조되는 cDNA 라이브러리를 포함하는 임의의 원천으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득될 수 있다. 폴리펩티드-인코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 알려진 합성 절차(예로, 자동화된 핵산 합성)에 의해 수득될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 면역글로불린 분자쇄, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 인코딩할 수 있다. 전체 중쇄에는 중쇄 가변 영역(VH)뿐만 아니라 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3을 포함할, 중쇄 불변 영역(CH); 및 "힌지" 영역이 포함될 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재가 요망된다.
폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드에는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 CHI가 포함되며 CK 또는 CL 도메인이 절제되었다. 미니바디는 통상적 항체보다 작으므로 이들은 임상/진단 사용에서 더 우수한 조직 침투를 달성할 것이지만 2가이고 이들은 1가 항체 단편, 예컨대 dAb보다 높은 결합 친화도를 보유할 것이다. 따라서, 맥락 상 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 상기 논의되는 유형의 항원-결합 항체 단편을 포괄한다. 인코딩되는 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 대응하는 인간 수신체 프레임워크 대비 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역은 수신체 프레임워크 영역 대비 전체 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 개시된 단백질 산물을 이루는 개별 아미노산의 특성에 기반하여, 일부 합리적인 치환이 당업자에 의해 인식될 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은, 예를 들어, 관여되는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기반하여 제조될 수 있다.
적합하게는, 본원에서 기재되는 폴리뉴클레오티드는 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본원에서 사용되는 용어 "비-자연 발생" 성분, 조성물, 물체, 및/또는 성분, 조성물, 또는 물체의 임의의 조합, 또는 이의 임의의 문법적 변이체는 "자연-발생"인 것으로 당업자에게 잘-이해되거나, 임의의 시점에 판사 또는 행정부 또는 재판부에 의해 "자연-발생"인 것으로 결정되거나 해석되거나 결정될 수 있거나 해석될 수 있는 성분, 조성물, 물체 형태, 및/또는 성분, 조성물, 또는 물체의 임의의 조합을 명시적으로 배제하지만 이것만을 배제하는 조건적 용어이다.
치료 방법 및 진단 방법
또 다른 양태에 의하면, 이를 필요로 하는 대상체에서 HLA, MHC-I 또는 둘 다를 발현하는 암을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 의하면, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에서의 ILT2의 발현이 사전 결정된 역치 초과임을 확인하는 단계 및 ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 대상체에서 암을 치료한다.
또 다른 양태에 의하면, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 ILT2-매개 면역 저해를 억제하는 제제를 대상체에 투여하는 단계; 및 PD-1/PD-L1 기반 치료법을 대상체에 수행하는 단계를 포함하고; 이에 의해 대상체에서 암을 치료한다.
또 다른 양태에 의하면, 암 세포에 대해 PD-1/PD-L1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 방법이 제공되며, 방법은 암 세포를 ILT2-매개 면역 저해를 억제하는 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 의하면, 암을 앓는 대상체를 치료하기 위해 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법과 병용하기 위한 ILT2에 결합하고 ILT2 매개 면역 세포 저해를 억제하는 제제가 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 질환, 장애, 또는 병태의 "치료" 또는 "치료하는"은 이의 적어도 하나의 증상 경감, 이의 중증도 감소, 또는 이의 진행 억제를 포괄한다. 치료는 질환, 장애 또는 병태가 완전 치유되는 것을 의미할 필요는 없다. 효과적인 치료가 되기 위해, 본원에서 유용한 조성물은 질환, 장애, 또는 병태의 중증도를 감소시키거나, 이와 연관된 증상의 중증도를 감소시키거나, 환자 또는 대상체의 삶의 질에 대한 개선을 제공하는 것만을 필요로 한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 치료받는 개체에서 질환의 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내며 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 병리적 결과 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화, 관해 또는 개선된 예후가 포함된다. 용어 "치료"는 또한 배양 중인 세포 또는 조직에 영향을 미치는 생체외 절차를 포괄할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 단일치료법으로 수행된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-1/PD-L1 치료법과 함께 수행된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 옵소닌화제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 옵소닌화제는 항-CD47 제제가 아니다. 일부 구현예에서, 항-CD47 제제는 항-CD47 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항-CD47 제제 또는 치료법과 함께 수행되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항-CD47 제제 또는 치료법과 조합되지 않는다.
일부 구현예에서, 치료는 면역 감독의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 면역 반응의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 종양 부담의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 암 전이의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 암에 대한 세포독성의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 암에 대한 염증성 반응의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 암의 증가된 포식작용을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 척추동물, 예로 특히 인간을 포함하는 포유류인 개체, 또는 환자를 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 앓는다.
일부 구현예에서, 암은 HLA 발현 암이다. 일부 구현예에서, HLA는 HLA-G이다. 일부 구현예에서, 암은 MHC-I 발현 암이다. 일부 구현예에서, 암은 PD-1 발현 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형암이다. 일부 구현예에서, 암은 혈액암이다. 일부 구현예에서, 암은 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료법에 대해 불응성이다. 일부 구현예에서, 암은 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료법에 전혀 반응하지 않았다. 일부 구현예에서, 암은 PD-1 및/또는 PD-L1 기반 치료법에 반응성이었으나 불응성이 되었다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 불응성 암을 반응성 암으로 전환한다.
일부 구현예에서, 방법은 암이 HLA, MHC-I 또는 둘 다를 발현함을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 암이 HLA를 발현함을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 암이 MHC-I을 발현함을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 암이 HLA 및 MHC-I을 발현함을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 확인은 암에서의 발현 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 확인은 암의 표면 상에서의 발현 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 암 내 및/또는 암 상은 암 세포 내 및/또는 암 세포 상이다. 일부 구현예에서, 확인은 암에 의해 분비되는 HLA-G의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 확인은 가용성 HLA-G의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 가용성 HLA-G는 체액 중에 있다. 일부 구현예에서, 체액은 혈액이다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체에서 ILT2의 발현을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에서 ILT2의 발현이 사전 결정된 역치 초과임을 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 확인은 대상체에서 ILT2의 발현 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 확인은 투여 이전이다. 일부 구현예에서, 측정은 투여 이전이다. 일부 구현예에서, ILT2의 발현은 면역 세포 내에서의 발현이다. 일부 구현예에서, ILT2의 발현은 대상체의 면역 세포 내에서의 발현이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 말초혈 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 종양내 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 종양 미세환경(TME) 내에서의 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8 양성 T 세포, 대식구, NK 세포 및 TEMRA 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD8 양성 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 말초혈 CD8 양성 T 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 투여는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편이 투여된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 애주번트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 담체는 약학적으로 허용 가능한 담체이다.
본원에서 사용되는 용어 "담체", "부형제" 또는 "애주번트"는 활성 제제가 아닌 약학 조성물의 임의의 성분을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 무독성, 비활성 고체, 반-고체 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 임의의 유형의 제형화 보조제, 또는 단순히 멸균 수성 매질, 예컨대 식염수를 나타낸다. 약학적으로 허용 가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스, 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분, 셀룰로스 및 그 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트, 분말화된 트래거캔스; 맥아, 젤라틴, 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대 땅콩 오일, 면실 오일, 잇꽃 오일, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트, 한천; 완충제, 예컨대 마그네슘 하이드록시드 및 알루미늄 하이드록시드; 알긴산; 발열원-비함유수; 등장성 식염수, 링거 용액; 에틸 알코올 및 포스페이트 완충 용액뿐만 아니라 약학 제형에서 사용되는 다른 무독성 상용성 성분이다. 본원에서 담체로 작용할 수 있는 성분의 일부 비제한적인 예에는 설탕, 전분, 셀룰로스 및 그 유도체, 분말화된 트래거캔스, 맥아, 젤라틴, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 설페이트, 식물성 오일, 폴리올, 알긴산, 발열원-비함유수, 등장성 식염수, 포스페이트 완충 용액, 코코아 버터(좌약 기재), 유화제 뿐만 아니라 다른 약학 제형에서 사용되는 다른 무독성 약학적 상용성 성분이 포함된다. 수화제 및 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트뿐만 아니라 착색제, 풍미제, 부형제, 안정화제, 항산화제, 및 보존제가 또한 존재할 수 있다. 임의의 무독성, 비활성, 및 효과적인 담체가 본원에서 고려되는 조성물을 제형화하기 위해 사용될 수 있다. 이에 관해 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 및 희석제는 당업자에게 잘 알려져 있고, 예컨대 문헌[The Merck Index, Thirteenth Edition, Budavari et al., Eds., Merck & Co., Inc., Rahway, N.J. (2001); the CTFA (Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association) International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Tenth Edition (2004); 및 the "Inactive Ingredient Guide," U.S. Food and Drug Administration (FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Office of Management]에 기재된 것들이며, 그 모든 내용은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 조성물에서 유용한 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 및 희석제의 예에는 증류수, 생리 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 행크 용액, 및 DMSO가 포함된다. 이들 추가적인 불활성 성분뿐만 아니라 효과적인 제형 및 투여 절차는 당분야에 잘 알려져 있고 표준 교과서, 예컨대 [Goodman and Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Gilman et al. Eds. Pergamon Press (1990); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1990); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., (2005)]에 기재되어 있고, 그 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 기재되는 조성물은 또한 인공적으로 생성된 구조, 예컨대 리포좀, ISCOMS, 서방성 입자, 및 혈청 중 펩티드 또는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 다른 비히클에 함유될 수 있다. 리포좀에는 에멀션, 폼, 마이셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 판상 층 등이 포함된다. 본원에서 기재되는 펩티드와 함께 사용하기 위한 리포좀은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤이 포함되는 표준 소포-형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로 고려사항, 예컨대 리포좀 크기 및 혈중 안정성에 의해 결정된다. 다양한 방법이, 예를 들어 문헌[Coligan, J. E. et al, Current Protocols in Protein Science, 1999, John Wiley & Sons, Inc., New York]에 개요로 나타낸 바와 같이 리포좀을 제조하기 위해 이용 가능하며, 또한 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호, 및 제5,019,369호를 참고한다.
담체는 전체적으로 본원에서 제시되는 약학 조성물 중량의 약 0.1% 내지 약 99.99999%를 포함할 수 있다.
용어 "치료 유효량"은 포유류에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 효과적인 약물의 양을 나타낸다. 용어 "치료 유효량"은 요망되는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 및 필요한 시기 동안, 효과적인 양을 나타낸다. 정확한 투여형 및 요법은 환자의 상태에 따라 의사에 의해 결정될 것이다.
일부 구현예에서, 방법은 옵소닌화제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 옵소닌화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 옵소닌화제는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제이다. 일부 구현예에서, EGFR 억제제는 세툭시맙이다. 일부 구현예에서, 옵소닌화제는 항-CD47 제제가 아니다. 일부 구현예에서, 방법은 PD-1/PD-L1 기반 치료법을 대상체에 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 PD-1/PD-L1 기반 치료법과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 PD-1/PD-L1 기반 치료법의 존재 하에 세포를 성장시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 기반 치료법은 PD-1 또는 PD-L1 차단 항체이다. 일부 구현예에서, 방법은 항-CD47 제제 또는 치료법을 수행하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 방법은 항-CD47 제제 또는 치료법의 수행을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 방법은 항-CD47 제제 또는 치료법을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제는 ILT2에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 ILT2 세포외 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 제제는 ILT2 길항제이다. 일부 구현예에서, 제제는 ILT2 차단 항체이다. 일부 구현예에제제는 B2M과의 ILT2 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 제제는 본 발명의 항체이다.
일부 구현예에서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제는 옵소닌화제 이전, 이후 또는 이와 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제 및 옵소닌화제는 하나의 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제 및 옵소닌화제는 별도 조성물로 투여된다.
일부 구현예에서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제는 PD-1/PD-L1 치료법 이전, 이후 또는 이와 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제 및 PD-1/PD-L1 치료법은 하나의 조성물로 수행된다. 일부 구현예에서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제 및 PD-1/PD-L1 치료법은 별도 조성물로 수행된다. 일부 구현예에서, 제제 또는 치료법 중 적어도 하나는 공동-투여를 위해 적응된다.
본원에서 사용되는 용어 "공동-투여를 위해 적응된"은 이들이 대상체에 안전하고 용이하게 투여될 수 있도록 하는 형태로 항체가 존재함을 나타낸다. 일부 비제한적 구현예에서, 공동-투여는 경구로, 주사에 의해, 또는 흡입에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약학 조성물 내에 포함될 것이며, 예컨대 대상체에 안전하고 용이하게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
일부 구현예에서, HLA는 HLA-G이다. 일부 구현예에서, HLA는 비-정규 HLA이다. 일부 구현예에서, HLA는 정규 HLA이다. 일부 구현예에서, mRNA 발현이 확인된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현이 확인된다. 일부 구현예에서, 단백질의 표면 발현이 확인된다. 발현을 측정하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고 PCR, Q-PCR, 노던 블롯, 면역블롯, 원 위치 혼성화, 면역염색, 및 FACS가 포함된다. 일부 구현예에서, 방법은 표면 발현을 확인하기 위한 암의 FACS 분석을 포함한다.
제형
본 발명은 또한 인간 의학 용도를 위한 약학 제형을 고려하며, 이는 본원에서 다양하게 기재되는 병태의 치료, 진단 또는 예방용 치료 조성물의 제조를 위한, ILT2를 인식하는 적어도 하나의 항체를 활성 제제로서 포함한다.
이러한 약학 및 약제 제형에서, 활성 제제는 바람직하게는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(들) 및 선택적으로 임의의 다른 치료 성분과 함께 이용된다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 상용성이고 이의 수신체에 과도하게 유해하지 않은 관점에서 약학적으로 허용 가능해야 한다. 활성 제제는 상술된 바와 같은 요망되는 약리학적 효과를 달성하기 위해 효과적인 양으로, 그리고 요망되는 1일 용량을 달성하기 적절한 양으로 제공된다.
전형적으로, 항체의 항원 결합부를 포함하는 본 발명의 분자는 치료 용도를 위해 멸균 식염수 용액 중에 현탁되어야 한다. 약학 조성물은 대안적으로 활성 성분(항체의 항원 결합부를 포함하는 분자)의 방출을 제어하거나 환자의 시스템에서의 그 존재를 연장하기 위해 제형화될 수 있다. 여러 적합한 약물 전달 시스템이 알려져 있고, 예로, 이식 가능한 약물 방출 시스템, 하이드로겔, 하이드록시메틸셀룰로스, 마이크로캡슐, 리포좀, 마이크로에멀션, 마이크로스피어 등이 포함된다. 제어 방출 제조물은 본 발명에 따른 분자를 복합체화하거나 흡착하기 위한 중합체의 사용을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 중합체에는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 및 스테아르산 이량체 및 세바린산의 폴리무수물 공중합체의 매트릭스가 포함된다. 이러한 매트릭스로부터의 본 발명에 따른 분자, 즉, 항체 또는 항체 단편의 방출 속도는 분자의 분자량, 매트릭스 내 분자의 양, 및 분산된 입자의 크기에 의존한다.
본 발명의 약학 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 경구, 국소, 비강내, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 관절내, 병소내 또는 비경구 투여될 수 있다. 보통, 정맥내(i.v.), 관절내, 국소 또는 비경구 투여가 바람직할 것이다.
당업자에게는 본 발명에 따른 분자의 치료 유효량이, 특히 투여 일정, 투여되는 분자의 단위 용량, 분자가 다른 치료제와의 조합으로 투여되는지 여부, 환자의 면역 상태 및 건강, 투여되는 분자의 치료 활성 및 치료의의 판단에 의존할 것임이 자명할 것이다.
본 발명의 분자(항체 또는 이의 단편)의 적절한 투여량은 투여 경로, 분자(폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 분자 등)의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 또는 상태에 따라 변하며, 결국 의사에 의해 결정되어야 하지만, 경구 투여의 경우, 1일 투여량은 일반적으로 체중 ㎏ 당 약 0.01 ㎎ 내지 약 500 ㎎, 바람직하게는 약 0.01 ㎎ 내지 약 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 0.1 ㎎ 내지 약 10 ㎎일 수 있다. 비경구 투여의 경우, 1일 투여량은 일반적으로 체중㎏ 당 약 0.001 ㎎ 내지 약 100 ㎎, 바람직하게는 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎, 보다 바람직하게는 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎일 수 있다. 1일 투여량은, 예를 들어 매일 1회 내지 4회 개별 투여의 전형적 요법으로 투여될 수 있다. 다른 바람직한 투여 방법에는 체중 ㎏ 당 약 0.01 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 관절내 투여가 포함된다. 유효량에 도달하는 데 있어서의 다양한 고려사항은, 예로, 문헌[Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990; 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.
조합 화학치료법의 적합한 투여 요법은 당분야에 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Saltz et al. Proc ASCO 1999, 18, 233a 및 Douillard et al., Lancet 2000, 355, 1041-7]에 기재되어 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 분자는 약학적으로 허용 가능하고 잘 알려진 바와 같이 활성 성분과 상용성인 부형제 중에 용해되거나, 분산되거나, 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 조합이다. 다른 적합한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 요망되는 경우, 조성물은 소량의 보조 성분, 예컨대 수화제 또는 유화제, pH 완충제를 함유할 수 있다.
제조 방법
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은: ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 제제가 대식구 염증성 활성, 암 세포에 대한 T 세포 활성, 수지상 세포 활성, 및 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 하나를 증가시키는 능력을 평가하는 단계 및 대식구 활성, T 세포 활성, 수지상 세포 활성 및 세포독성 중 적어도 하나를 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은: 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 상기 제제가 대식구 염증성 활성, 암 세포에 대한 T 세포 활성, 수지상 세포 활성, 및 암 세포에 대한 NK 세포 세포독성 중 적어도 하나를 증가시키는 능력을 평가하는 단계; 및
iii. 포식작용, 활성 및 세포독성 중 적어도 하나를 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은: ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 제제가 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 능력을 평가하는 단계 및 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은: 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 제제가 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 능력을 평가하는 단계; 및
iii. 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 상기 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화, 및 증가된 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계 및 상기 증가된 포식작용, 상기 증가된 활성, 상기 증가된 생성, 상기 감소된 생성, 상기 모집, 상기 증가된 활성화, 상기 감소된 활성 및 상기 증가된 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 상기 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화, 및 증가된 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계; 및
iii. 상기 증가된 포식작용, 상기 증가된 활성, 상기 증가된 생성, 상기 감소된 생성, 상기 모집, 상기 증가된 활성화, 상기 감소된 활성 및 상기 증가된 세포독성 중 적어도 두 가지를 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 상기 제제가 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 능력을 평가하는 단계 및 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은:
제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
ii. 상기 제제가 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 능력을 평가하는 단계; 및
iii. ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은: SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 ILT2 에피토프에 결합하는 제제를 수득하는 단계를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
또 다른 양태에 의하면, 제제를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은 하기 단계: 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 ILT2 에피토프에 결합하는 제제를 수득함으로써 선택된 제제의 서열인, 단계를 포함하고, 이에 의해 제제를 제조한다.
일부 구현예에서, 방법은 제제가 ILT2 매개 면역 저해를 억제하는 능력을 평가하는 단계 및 ILT2 매개 면역 저해를 억제하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 제제가 ILT2 매개 면역 저해를 억제하는 능력을 평가하는 단계 및 ILT2 매개 면역 저해를 억제하는 제제를 선택하는 단계에 의해 선택되는 제제의 서열이다. 일부 구현예에서, 방법은 상기 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화, 및 증가된 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 세 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계 및 적어도 세 가지를 유도하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제제가 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 대식구 중 적어도 3개에서 효과를 유도하는 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제제가 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 대식구에서 효과를 유도하는 능력을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 유효성 증가는 항암 효과에서의 상승적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 항암 효과는 전염증성 사이토카인 분비이다. 일부 구현예에서, 전염증성 사이토카인은 GM-CSF, IL-6 및 IFNγ로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 친 염증성 사이토카인은 GM-CSF, IL-6 또는 IFNγ이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 친 염증성 사이토카인은 GM-CSF이다. 일부 구현예에서, 증가된 유효성은 T 세포 활성화에서의 상승적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 유효성은 T 세포 세포독성에서의 상승적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 유효성은 T 세포 활성화 및 세포독성 둘 다의 상승적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가는 증가된 막 CD107a 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가는 증가된 막 CD107a 발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 증가는 제제가 투여되거나 접촉되지 않은 경우의 유효성과 대비된다. 일부 구현예에서, 유효성 증가는 PD-1/PD-L1 기반 치료법에 불응성인 암의 치료법에 반응하는 암으로의 전환을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 HLA를 발현한다. 일부 구현예에서, 암은 MHC-I을 발현한다.
일부 구현예에서, 증가된 대식구 염증성 활성은 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용을 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 대식구 염증성 활성은 M1 대식구의 생성 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 대식구 염증성 활성은 M2 대식구의 생성 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 대식구 염증성 활성은 대식구 상에서 M1 표현형의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 대식구 염증성 활성은 대식구 상에서 M2 표현형의 감소를 포함한다.
일부 구현예에서, 수지상 세포 활성은 수지상 세포 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 수지상 세포 활성은 종양에 대한 수지상 세포 모집을 포함한다. 일부 구현예에서, 수지상 세포 활성은 암 세포에 대한 활성이다. 일부 구현예에서, 암 세포에 대한 활성은 TME에서의 활성이다. 일부 구현예에서, 종양은 TME이다. 일부 구현예에서, 수지상 세포 활성은 항원 제시를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제의 능력 평가는 제제가 암 세포에 대한 T 세포 활성, 대식구 염증성 활성, 수지상 세포 활성, 및 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 전체를 증가시키는 능력을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 제제의 선택은 암 세포에 대한 T 세포 활성, 대식구 염증성 활성, 수지상 세포 활성, 및 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 전체를 증가시키는 제제의 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 대식구 염증성 활성의 증가는 M1 대식구의 생성 증가 및/또는 대식구에 의한 암 세포의 포식작용 증가이다. 일부 구현예에서, 대식구 염증성 활성의 증가는 M2 대식구의 생성 감소이다. 일부 구현예에서, 제제의 능력 평가는 제제가 대식구 염증성 활성을 증가시키는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제의 능력 평가는 제제가 수지상 세포 활성을 증가시키는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양에 대한 것은 TME에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 제제의 능력 평가는 제제가 암 세포에 대한 NK 세포 세포독성을 증가시키는 능력을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제제가 ILT2 및 B2M의 상호작용을 억제하는 능력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상호작용은 직접적 상호작용이다. 일부 구현예에서, 방법은 제제가 ILT2 및 B2M의 접촉을 억제하는 능력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상호작용은 결합이다. 일부 구현예에서, 접촉은 결합이다. 일부 구현예에서, 방법은 제제가 에피토프에 결합하는 능력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
하기 실시예는 본 발명의 화합물 및 방법을 어떻게 제조하고 사용하는지를 예시하기 위한 것이며 결코 제한으로 간주되어서는 안 된다. 본 발명이 이제 이의 구체적 구현예와 함께 기재될 것이지만, 여러 변형 및 변이가 당업자에게 자명할 것임이 명백하다. 따라서, 이는 첨부되는 청구범위의 정신 및 광의의 범위 내에 속하는 모든 이러한 변형 및 변이를 포괄하려는 것이다.
실시예
일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 본 발명에서 이용되는 실험실 절차에는 분자, 생화학, 미생물 및 재조합 DNA 기법이 포함된다. 이러한 기법은 문헌에서 철저히 설명된다. 예를 들어, 모두 참조로 포함되는 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 나타낸 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); "Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols". Vincent Ossipow, Nicolas Fischer. Humana Press (2014); "Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols". Maher Albitar. Springer Science & Business Media (2007)]을 참고한다. 다른 일반 참고문헌은 본 문헌을 통해 제공된다.
물질 및 방법
항체 - 상업적 항-ILT2 mAb는 하기와 같다: 클론 #1 - GHI/75(BioLegend, Cat. No. 333704), 클론 #2 - HP-F1(eBioscience, Cat. No. 16-5129). 사용되는 추가적인 mAb: HLA-G(MEM-G/9; Abcam, Cat. No. ab7758; G-0031,), ILT4(42D1, Biolegend, Cat. No. 338704), ILT6(Sino Biological, Cat No. 13549-MM06), LILRA1(R&D systems, Cat. No. MAB30851), 범-HLA(W6/22; eBioscience, Cat. No. 16-9983-85) 및 His(Proteintech, Cat. No. 10001-0-AP).
유세포 측정 - 일반적으로, 세포를 모든 단계 동안 얼음 상에서 또는 4℃에서 유지하였다. 염색 전에, 5X105 세포를 15분 동안 FACS 완충액(0.1% BSA 함유 PBS) 중 50 ㎍/㎖ 인간 IgG(Sigma, cat#I4506)로 차단하였다. 항체를 제조업체에 의해 권장된 농도로 사용하고 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 96-웰 U형 바닥 플레이트에서 100 ㎕ 중에 수행하였고, 세포를 200 ㎕ FACS 완충액으로 2회 세척하고 분석용 150 ㎕ FACS 완충액 중 FACS 튜브로 옮겼다. 세포를 Gallios 유세포 측정 획득 소프트웨어용 Kaluza를 사용하여 Gallios 유세포 측정기(Beckman coulter) 상에서 분석하였다.
골수 세포 분화 - 단핵구를 음성 선택 방법에 의해 EasySep™ 인간 단핵구 농축 키트(STEMCELL, cat#19059)를 사용하여 건강한 공여자로부터의 신선 혈액 샘플로부터 단리하였다. 상이한 세포 집단을 관련 마커의 FACS 분석에 의해 그리고 특징적 사이토카인의 분비 분석에 의해 나타낸 표현형에 대해 평가하였다. 성숙을 위해, 단핵구를 3일 및 6일에 교체한 성장 인자 함유 RPMI 배지 중 0.8X106/㎖의 농도로 배양하였다. 염증성 M1 대식구를 6일 동안 50 ng/㎖ GM-CSF(M1 표현형)에 이어 48 hr 동안 20 ng/㎖ IFN-감마 및 50 ng/㎖ LPS의 존재 하에 성숙시켰다. 저해성 M2 대식구를 6일 동안 50 ng/㎖의 M-CSF, 이어서 48 hr 동안 10 ng/㎖ M-CSF 및 20 ng/㎖ IL-4 및 IL-10을 사용하여 분화시켰다. 수지상 세포를 6일 동안 50 ng/㎖ GM-CSF 및 20 ng/㎖ IL-4에 의해 유도하고 성숙(100 ng/㎖ LPS) 또는 내성생성(IL-10 100 U/㎖) 및 IFN-a2b(1000 U/㎖) 수지상 세포로 추가 분화시켰다.
전달감염 - HLA-G1 cDNA를 PCDNA3.1 벡터 내로 클로닝함으로써 HLA-G1(전장 HLA-G 전사체를 인코딩함) 플라스미드를 생성하였다. jetPEI® 전달감염 시약(PolyPlus Transfections)을 사용하여 전달감염을 수행하였다. 인간 ILT2 단백질의 세포외 부분을 마우스 CD3 유전자의 막통과 및 세포질 잔기와 프레임에 맞춰 조합함으로써 ILT2/CD3z 플라스미드를 생성하였다. 플라스미드를 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 Nucleofector II(Lonza)를 사용하여 마우스 BW5417.3 T 세포주 내로 핵감염시켰다. 안정한 형질전환체를 G418-함유 배지 중에 선택하였다.
NK 및 암 세포주 공동-배양 검정 - NK 세포를 37℃에서 5시간 동안 항-ILT2 항체 및 매칭되는 이소형 대조군의 존재 하에 나타낸 세포주와 인큐베이션하였다. 세포독성 수준을 형광측정 LDH 검출 키트(Promega)를 사용하여 측정하였다.
유세포 측정 차단 검정 - N 말단에서 인간 IgG1의 Fc 부분과 융합된 재조합 인간 ILT2 단백질을 바이오틴(Innova bioscience)과 콘주게이션하였다. 전체 5X105 A375/HLA-G1 세포를 실온에서 30분 동안 항-ILT2 클론 #1 또는 이소형 매칭된 대조군 mAb 및 바이오틴과 콘주게이션된 ILT2-Fc(10 ㎍/㎖)의 존재 하에 100 ㎕의 부피로 인큐베이션하였다. 몇 번의 세척 단계 후, 스트렙타비딘-PE를 0.2 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후 FACS 분석하였다.
BW ILT2/CD3z-쇄 키메라 검정 - 3X104 BW/ILT2z를 24 hr 동안 동등한 수의 A375/WT 또는 A375/HLA-G1 세포와 혼합하였다. 기능적 mAb를 나타낸 농도로 매칭되는 이소형 대조군과 사용하였다. 분비된 마우스 IL2의 양을 상업적 ELISA 키트(BioLegend)에 의해 평가하였다.
실시예 1
ILT2 및 HLA-G가 암 세포 및 암 관련 면역 세포 상에서 확인됨
ILT2는 건강한 면역 세포 뿐만 아니라 여러 종양 세포의 표면 상에서 확인되는 알려진 면역저해성 분자이다. ILT2는 MHC-1 뿐만 아니라 HLA 클래스 분자(HLA-G뿐만 아니라 HLA-F 및 HLA-B27)에 결합하고, CD8과 경쟁하며, 이에 의해 T 세포 활성화를 억제하는 것으로 나타났다. ILT2를 발현하는 세포의 범위를 추가로 이해하기 위해, 유세포 측정 분석을 다양한 면역 세포 상에서 상업적 항체(항체 #1)를 사용하여 수행하였다. 문헌에서 보고된 바와 같이, 흑색종 환자로부터 유래된 세포독성 T 세포(CTL)뿐만 아니라 자연 살해(NK) 세포가 ILT2의 표면 발현에 대해 양성이었다(도 1). 건강한 공여자의 혈액으로부터의 단핵구를 또한 조사하였고 ILT2를 고도 발현하는 것으로 확인되었다(도 2, 가장 왼쪽 패널). 단핵구의 상이한 골수 세포 집단(수지상 세포 및 대식구)으로의 분화 시, 미성숙이건, 염증성이건 또는 내성생성이건, ILT2 발현이 유지되었다(도 2, 오른쪽 패널).
상이한 암 적응증에서의 ILT2 발현을 TCGA 데이터베이스의 바이오인포마틱 분석에 의해 조사하였다(도 3a). 흥미롭게도, ILT2 RNA 발현 수준 및 TCGA에 제시된 샘플의 종양 내 골수 유래 저해성 세포(MDSC) 및 저해성 M2 종양 연관 대식구(TAM)의 존재 간 연관성이 관찰되었다(도 3b). 유세포 측정에 의한 상이한 고형 종양으로부터의 신선 종양 샘플의 분석은 종양 미세환경(TME)에서 선천성 및 적응 면역 세포에 의한 ILT2의 발현을 실증하였다. 비-소세포 폐암(NSCLC), 신장암(RCC), 두부경부암, 식도암 및 결장암 환자로부터 종양 샘플을 수집하고 단세포 현탁액을 효소적 소화에 의해 생성하였다. ILT2 양성 세포%를 전체 면역 세포, 종양 연관 대식구(TAM), CD4 양성 T 세포, CD8 양성 T 세포 및 자연 살해 세포(NK)에 대해 도 3c에 제시한다. 따라서, ILT가 항암 활성을 갖는 세포(염증성 세포)뿐만 아니라 암-촉진 및 면역저해 활성을 갖는 세포(내성생성 및 MDSC) 상에서 모두 발현됨이 자명하다.
HLA-G 발현을 또한 다양한 암에서 연구하였다. 상이한 적응증으로부터의 암 샘플의 조직 마이크로어레이(TMA)를 면역-조직화학에 의해 상업적 폴리클로날 HLA-G 항체로 염색하였다. 각각의 암 유형에 대한 양성 사례%를 나타낸다(도 4a). 또한, 몇몇 적응증에 있어서, 연장된 TMA를 조사하였다. 염색 세기 및 양성 세포%의 곱에 의해 HLA-G 염색 스코어를 계산하였다. 100 초과의 높은 HLA-G 염색 스코어가 높은 백분율의 식도암, 위암, 두부경부암 및 신장암에서 검출되었다(도 4b). 각각의 적응증에서의 양성 사례%를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
HLA-G는 가용성 분비 형태뿐만 아니라 보다 일반적인 막 형태를 갖는다. 암 환자에서 가용성 HLA-G의 발현 수준을 조사하기 위해, 혈장 샘플을 상업적 ELISA를 사용하여 HLA-G의 존재에 대해 조사하였다. HLA-G는 정상(건강한) 대조군 대비 몇몇 암 적응증에서 과발현되는 것으로 확인되었다(도 5). 또한, 소정 암 유형에서 유의미하게 더 높은 수준을 갖는 환자 집단을 검출할 수 있었다.
실시예 2
ILT2 차단 항체의 생성
하이브리도마 기술을 채택하여 모노클로날 ILT2 길항제 항체를 생성하였다. 69개의 ILT2-특이적 하이브리도마가 원래 생성되었다. 조사된 다양한 검정에서 이의 바람직한 결합, 교차 반응성 프로필 및 기능적 활성에 따라 3개의 선도 항체를 선택하였다. 선택된 항체는 19E3, 15G8 및 17F2였다. 이들 항체를 일반적 방법을 사용하여 서열분석하였다. 선택된 항체의 서열을 도 6에 나타낸다. CDR을 KABAT 시스템에 의해 결정하였다. 일반적 CDR-그래프트 접근을 사용하여 15G8 및 19E3을 인간화하였다. 간략하게, 원래 하이브리도마-유래 항체로부터 필수 CDR 및 프레임워크 잔기를 확인하고 생식계열 인간 항체의 가변 및 불변 영역 내로 그래프팅하였다. 최종 인간화 항체는 IgG4 항체이다. 최종 인간화 15G8은 또한 CDR-H3에서의 시스테인을 제거하고 이를 알라닌 또는 세린으로 대체하는, 단일 아미노산 변화를 함유하였다. 개발 가능성을 개선하기 위해 상기 변화를 제조하였다. 두 생성 항체의 결합을 확인하고, 알라닌을 갖는 15G8 항체를 추가 평가를 위해 선택하였다. 인간화 15G8에 대한 모든 향후 언급은 알라닌 변이체를 나타낸다.
항-ILT2 항체가 ILT2에 결합하는 능력을 3개의 상이한 시스템을 사용하여 평가하였다. 재조합 ILT2에 대한 결합을 ELISA(도 7a)를 사용하여, 그리고 Biacore T200(표 2)를 사용하여 평가하고, 막 ILT2에 대한 결합을 ILT2로 전달감염된 BW 세포를 사용하여 평가하였다(도 7b 내지 도 7c). 키메라 쥣과 및 인간화 항체는 유사한 결합을 나타내었다(도 7d). 상업적 마우스 항-인간 ILT2 항체(Biolegend; 클론 GHI/75)를 양성 대조군으로 사용하였다. 3개의 평가된 항체는 용액 중에서건 세포의 표면 상에서건 ILT2에 성공적으로 결합하였다. 몇몇 유사한 ILT 패밀리 구성원-PIRB, ILT6 및 LILRA1에 대한 교차-반응성을 또한 결합 ELISA를 사용하여 조사하였다. 이들 단백질에 대한 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. 어느 항체도 PIRB, ILT6 및 LILRA1와 교차-반응하지 않았다. 항체는 면역염색에도 효과적이었다(도 7e). 흥미롭게도, PBMC가 암 환자의 혈액으로부터 단리되면, ILT2는 건강한 대조군에서보다 암 환자에서 더 많은 T 세포 및 NK 세포 상에 발현됨을 확인하였다(도 7f).
Figure pct00002
실시예 3
ILT2 항체가 ILT2-HLA-G 상호작용을 차단함
생성된 항-ILT2 항체가 HLA-G 및 ILT2 간 상호작용을 차단하는 능력을 4개의 상이한 검정을 사용하여 평가하였다. 첫 번째로, 차단 유세포 측정 검정을 수행하였다. HLA-G 전달감염된 A375 세포를 본 발명의 항체 및 양성 대조군 항체의 존재 하에 바이오틴화된 ILT2와 인큐베이션하였다. 상업적으로 이용 가능한 항-ILT2 항체 GHI/75(BioLegend, cat#333704)를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포에 대한 ILT2-바이오틴의 결합을 유세포 측정 분석에 의해 스트렙타비딘-PE를 사용하여 결정하였다(도 8a). 차단%는 음성 대조군에 대해 정상화함으로써 결정하였다(대조군 IgG의 존재 하의 ILT2 결합). 항체 부재(회색선), 15G8 존재(밝은 회색선), 및 이소형 대조군 존재(검은색선) 하의 ILT2 결합을 나타내는 대표적 FACS 분석을 도 8b에 나타낸다. 차단 백분율을 다양한 농도의 항체로 계산하였다(도 8c). 키메라 쥣과 및 인간화 항체는 유사한 차단 능력을 나타내었다(도 8d).
ILT2 항체가 HLA-G 및 ILT2 간 상호작용을 기능적으로 차단하는 능력을 또한 BW ILT2/마우스 Z-쇄 키메라 리포터 검정에서 조사하였다. BW 세포를 마우스 T 세포 제타쇄에 융합된 인간 ILT2(BW-ILT2)로 전달감염시켰다. 이어서 세포를 선택된 ILT2 항체의 존재 하에 A375-HLA-G 세포와 인큐베이션하였다. 기능적 ILT2-HLA-G 상호작용 시 BW 세포는 리포터 사이토카인인 마우스 IL-2를 분비한다. 상호작용의 차단은 리포터 사이토카인의 분비를 감소시킬 것이다. 마우스 IL-2의 분비를 24시간의 인큐베이션 후 ELISA에 의해 결정하였다. 결과는 처리 당 3개씩의 웰로부터의 mIL-2 수준의 평균±SE를 나타낸다(도 8e). 상업적 마우스 항-인간 ILT2 항체(Biolegend; 클론 GHI/75)를 두 검정 모두에 대해 양성 대조군(PC)으로 사용하였다. 차단 백분율을 나타낸 농도의 항체로 계산하였다(도 8f). 상기 동일한 BW ILT2/마우스 Z-쇄 키메라 리포터 검정을 사용하여 새로운 항체가 이 자체 상에서 ILT2 활성화 효과를 가질 수 있는 가능성을 배제하였다. 세포를 암 세포가 없이 ILT2 항체와 인큐베이션하고 마우스 IL-2 분비를 다시 측정하였다(도 8g). 새로운 ILT2 항체는 작용성 효과를 갖지 않는 것으로 확인되었지만, 동일한 하이브리도마 공정에 의해 생성된 다른 항체(1G7)는 ILT2에 결합하고 그 활성을 유도할 수 있다.
기능성 차단을 또한 인간 Jurkat 세포(T 세포)에서 조사하였다. Jurkat 세포를 HLA-G 및 단일쇄 항-CD3(OKT3)을 외인성으로 발현하는 A375 암 세포를 포함하거나 포함하지 않고 인큐베이션하였다. 전염증성 인간 IL-2의 분비를 측정하였다. 미변형 Jurkat 세포(ILT2 음성인 세포)가 사용된 경우, Jurkat 세포를 암 세포와 공동-배양했을 때 고수준의 IL-2가 분비되었다(도 8h). 놀랍지 않게, 15G8 항체의 첨가는 차단할 ILT2가 없는 것과 마찬가지로 IL-2 분비에 대해 효과를 갖지 않았다. 따라서 Jurkat 세포를 인간 ILT2를 발현하도록 전달감염시켰다. 첫 번째로, ILT2-양성 Jurkat 세포를 OKT3을 외인성으로 발현하는 A375 암 세포를 포함하고 및 포함하지 않고 배양하였다. 이들 암 세포는 자연적으로 MHC-I 양성이다. 암 세포로부터의 MHC-I은 IL-2 분비를 강력히 억제하였다(도 8i). 이 경우, 15G8 항체의 첨가는 용량 의존적 방식으로 ILT2/MHC-I 상호작용을 차단하고 IL-2 분비를 증가시켰다. 범-HLA 항체를 양성 대조군으로 사용하였고, 동일한 농도에서 15G8 항체는 범-HLA 항체와 필적하였다(도 8i). 억제 효과를 증강시키기 위해, A375 세포를 또한 HLA-G로 전달감염시켜, 이를 MHC-I 및 HLA-G 양성으로 만들었다. 이들 세포는 ILT2 양성 세포에 대해 더 강력한 억제 효과를 생성하여, IL-2 분비를 단독 배양된 Jurkat 세포의 분비만큼 감소시켰다(도 8j). 15G8 항체가 투여된 경우 용량 의존적 효과가 다시 관찰되었고, 다시 동일한 투여량으로, 15G8 항체 및 범-HLA 항체가 필적하게 효과적이었다(도 8j). 특히, HLA-G 특이적 항체만 범-HLA 대신 사용된 경우, 효과가 크게 감소되었고 1/100 수준 농도로 사용된 15G8 항체와 필적하였다(도 8k).
상기 Jurkat 시스템을 또한 사용하여 15G8 항체를 2개의 상업적으로 이용 가능한 항체: GHI/75 및 HP-F1과 비교하였다. 인간 ILT2를 발현하는 Jurkat 세포를 다양한 농도의 15G8, GHI/75 및 HP-F1의 존재 및 부재 하에 HLA-G/OKT3을 발현하는 A375 세포와 배양하였다. 이미 관찰된 바와 같이, 15G8는 IL-2 분비에서 통계적으로 유의미한, 용량 의존적 증가를 유도하였다(도 8l). GHI/75는 배지 단독 대비 IL2 분비에 대한 효과를 갖지 않았으나 IgG 대조군 대비 작은 증가를 유도하였다(도 8m). HP-F1은 작지만 유의미한 증가를 생성하였고 증가된 용량과 함께 정체를 형성하여 증가하지 않았다(도 8n). 20 ㎍/㎖에서도 HP-F1은 단지 4 ㎍/㎖의 15G8에 비해 열등하였다.
마지막으로, 활성화를 TIL, 및 NK 세포에서 직접 측정하였다. TIL을 5분 동안 A375-HLA-G-OKT3 세포와 인큐베이션한 후 T 세포 활성화 마커인 인산화된 ZAP70을 검출하였다. NK 세포를 2분 동안 A253-HLA-G 세포와 인큐베이션한 후 NK 세포 활성화 마커인 인산화된 Syk를 검출하였다. 암 세포와 공동 배양된 경우 두 세포 유형에서 모두 활성화가 관찰되었으나, 상기 활성화는 ILT2 항체의 존재 하에 증강되었다(도 8o 내지 도 8p). 이들 결과는 ILT2 항체가 증강된 T 세포 및 NK 세포 활성화를 유도하는 ILT2-HLA-G 상호작용을 효율적으로 차단할 수 있음을 실증한다.
실시예 4
ILT2 항체가 HLA-G 및 MHC-I-양성 종양 세포의 포식작용을 증강시킴
생성된 항-ILT2 항체가 종양 세포의 포식작용을 증강시키는 능력을 2개의 상이한 시스템을 사용하여 평가하였다. 단핵구를 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리하고 M-CSF의 존재 하에 6일 내지 7일 동안 인큐베이션하여 대식구를 생성하였다. 첫 번째로, 유세포 측정-기반 검정을 채택하였다. PKH67-FITC로 염색된 상이한 암 세포주를 나타낸 항체의 존재 하에 eFluor 670-APC로 염색된 대식구와 인큐베이션하였다. 표적 세포의 포식을 시사하는 이중 염색된 대식구%에 의해 포식작용 수준을 결정하였다. 포식작용 수준을 대조군(배지 단독)으로부터의 %로 제시한다. 도 9a에서 실증된 바와 같이, 상이한 ILT2 차단 항체는 대식구에 의한 HLA-G 양성 A375 세포의 포식작용을 증강시킬 수 있었다. 또한, 대식구가 종양 세포의 포식작용을 증강시키는 능력을 실시간 IncuCyte® 분석 시스템을 사용하여 조사하였다. 표적 세포주를 pHrodo™ Red 세포 표지화 염료로 표지하고, 세척하고, 반복되는 다양한 처리와 함께 대식구에 첨가하였다. IncuCyte® pHrodo™ Red 세포 표지화 염료의 형광은 산성 환경, 예컨대 포식소체에 내재하는 환경에서 증가되며, 이에 따라 형광의 측정에 의해 포식작용 이벤트의 정량을 가능하게 한다. IncuCyte® 기기로 형광 빨간색 신호 세기 및 상 이미지에 대해 30분마다 검정 플레이트를 샘플링하였다. 포식작용 이벤트는 빨간색 형광 신호의 축적으로 반영되며, 포식작용 속도는 빨간색 형광 신호 축적의 동력학으로부터 반영되었다. 상기 실시간 시스템을 사용하여, 인간화 항-ILT2 항체가 HLA-G 양성 A375 세포의 포식작용을 증강시키는 능력을 확인하였다(도 9b). 또한, IncuCyte® 시스템을 사용하여, 생성된 차단 ILT2 항체가 HLA-G 양성뿐만 아니라 다양한 MHC-I 양성(WT) 암 세포주 모두의 포식작용을 증강시킬 수 있음을 실증하였다(도 9c).
암 세포의 포식작용에 대한 생성된 ILT2 항체와 항체-의존적 세포성 포식작용(ADCP) 유도 항체인 에르비툭스의 조합 효과를 상술된 IncuCyte® 실시간 시스템을 사용하여 조사하였다. ILT2 차단 항체와 에르비툭스의 조합은 각각의 항체의 단독 활성에 비해 HLA-G를 과발현하는 암 세포주의 포식작용을 유의미하게 증가시켰다(도 9d). 실제로, 에르비툭스 및 15G8 인간화 항체의 조합은 상승적 효과를 가졌고, 조합 처리의 포식작용에서의 증가는 단순히 부가적인 것보다 컸다.
실시예 5
선택된 ILT2 항체가 HLA-G에 의해 억제될 수 있는 T 세포 활성을 복원할 수 있음
생성된 항-ILT2 항체가 HLA-G에 의해 억제된 T 세포 활성을 복원하는 능력을 조사하기 위해, 인간 CD8 T 세포를 야생형 721.221 세포(221 WT) 또는 가용성 HLA-G5(221-HLA-G)를 발현하는 721.221 세포와 공동-인큐베이션하였다. T 세포로부터의 IFNγ 분비 수준을 표준 ELISA를 사용하여 5일 후 측정하였다. 결과는 221-HLA-G 단독의 효과를 초과하는 배율%로 실증되며 4회 독립적 실험의 평균을 나타낸다. 도 10a에 나타낸 결과는 몇몇 ILT2 항체가 HLA-G-억제 T 세포 활성을 복원할 수 있음을 실증한다. 이를 또한 A375-HLA-G-OKT3 세포와의 인큐베이션으로 평가하였다. 72시간 후 인간 그랜자임 B의 분비를 또한 측정하였고 용량 의존적 방식으로 15G8 항체의 존재 하에 증가됨을 확인하였다(도 10b).
실시예 6
선택된 ILT2 항체가 HLA-G 및 MHC-I-양성 종양 세포에 대한 NK 세포독성을 증강시킬 수 있음
NK 세포를 다양한 표적 암 세포주와 인큐베이션하는 시스템에서 생성된 항-ILT2 항체가 NK 세포 효과기 활성을 증강시키는 능력을 평가하였다. 세포를 7.5:1의 표과기-대-표적 비로 5시간 동안 공동-인큐베이션한 후, 형광측정 LDH 검출 키트를 사용하여 세포독성 수준을 검출하였다. 특이적 세포독성%를 하기와 같이 계산하였다:
Figure pct00003
도 11a에 실증된 바와 같이, 본 발명의 ILT2 항체는 용량-의존적 방식으로 HLA-G 양성 세포 및 다양한 MHC-I-양성 암 세포주 모두에 대한 NK 세포의 세포독성을 유의미하게 증강시킬 수 있었고(도 11b) 인터페론 감마(도 11d) 분비를 또한 측정하여 용량-의존적 방식으로 증가하는 것을 확인하였다. 일차 NK 세포를 표적 HLA-G+ 흑색종 세포와 공동-배양한 후 IFNγ, ILT2, CD56, 및 CD107A의 발현에 대해 FACS에 의해 분석하였다. ILT2 양성, CD56 양성, NK 세포 집단을 구체적으로 분석하였고 IFNγ 발현 및 막 CD107A 발현에서의 용량 의존적 증가를 관찰하였다(도 11e 내지 도 11f). 각각의 실험을 별도로 도시한 경우, ILT2 양성 세포% 및 IFNγ 및 CD107A의 증가된 발현 간 연관성이 명확하게 자명하였다(도 11g 내지 도 11h).
실시예 7
ILT2 항체가 염증성 대식구의 생성을 증가시킴
대식구의 성숙에 대한 차단 ILT2의 효과를 시험관내 조사하였다. 건강한 공여자로부터 단리된 단핵구를 5일 동안 M-CSF(50 mg/㎖)의 존재 하에 분화시켜 인간화 차단 ILT2 항체 또는 대조군 IgG의 존재 하에 성숙 대식구(M0)를 생성하였다. 대식구를 LPS(50 ng/㎖)의 존재 하에 추가 분화시켜 M1 대식구를 생성하거나 IL-4(25 ng/㎖)와 함께 추가 분화시켜 M2 대식구를 생성하였다. 도 12에서 실증된 바와 같이, 대식구의 성숙 공정 동안 ILT2 차단 항체의 존재는 이들이 M0, M1 또는 M2 대식구로 분화되는지와 무관하게, 평가된 대부분의 공여자의 대식구 상에서 HLA-DR(M1 염증성 대식구의 마커)의 발현을 증가시켰다. 또한, M1 대식구로 분화된 대식구도 평가된 대부분의 공여자에서 증가된 CD80 수준을 가졌다. 종합하면, 이들 결과는 선택된 ILT2 길항제 항체가 보다 염증성 M1 표현형을 갖는 대식구를 나타내는, 더 높은 수준의 HLA-DR 및 CD80을 나타내는 대식구를 유도할 수 있음을 실증한다.
실시예 8
ILT2 차단 항체가 환자로부터의 종양 세포에 대한 면역 세포의 활성을 증강시킴
생성된 항-ILT2 항체의 활성을 암 환자(RCC 및 H&N)로부터의 종양 샘플로 생체외 시스템에서 조사하였다. 항체가 환자로부터의 종양 세포의 포식작용을 증가시키는 능력을 평가하기 위해, 단핵구로부터 생성된 대식구를 종양 샘플로부터 단리된 종양 세포와 인큐베이션하였다. 포식작용 수준을 상기에 상세히 나타낸 바와 같이 IncuCyte® 실시간 분석을 사용하여 조사하였다. 도 13a에 실증된 바와 같이, ILT2 항체는 상이한 암 적응증으로부터의 환자로부터 종양 세포의 포식작용을 증강시킬 수 있었다. 또한, 효과는 용량 의존적이었고, 자가 대식구와도 존재하며, RCC(도 13b) 및 H&N로부터의 편평상피 세포 암종(도 13c) 둘 다에 대해 나타났다. 또한, ILT2 항체가 PBMC의 활성을 증강시키는 효과를 조사하였다. 환자로부터의 종양 샘플의 단세포 현탁액을 IL-2의 존재 하에 동일한 환자로부터 단리된 PBMC(활성화된 PBMC)와 인큐베이션하였다. 도 14g에서 실증된 바와 같이, 종양 세포의 존재 하에 전염증성 TNF-a 사이토카인의 PBMC 분비는 ILT2 항체의 존재 하에 상승하였다. 종합하면, 이들 결과는 차단 ILT2 항체가 다양한 암 적응증으로부터의 종양 세포에 대해 면역 세포의 활성을 증가시키는 능력을 실증한다.
실시예 9
ILT2 차단 항체가 PD-1/PD-L1 치료법과 조합될 수 있음
ILT2 및 PD-1은, 대부분에 있어서, 말초혈 세포 및 종양 미세환경 체류 면역 세포를 모두 포함하는 상이한 면역 세포 상에서 발현된다(도 14a). CRC 환자로부터의 종양-내 CD8 양성 T 세포에서 ILT2 및 PD-1 발현의 분석은 T 중추 메모리 세포(Tcm) 및 고갈된 T 세포(Tex)가 모두 고수준의 PD-1(도 14b)을, 그러나 저수준의 ILT2(도 14c)를 발현함을 확인하였다. CD45RA 재-발현 T 세포(TEMRA)는 정확히 반대 패턴인 고수준의 ILT2 및 저수준의 PD-1 발현을 나타내었다. 상기 이분법은 암 특이적 현상이 아니었으며, 건강한 공여자의 혈액으로부터의 큰 백분율(83%)의 TEMRA 세포는 ILT2 양성인 반면 작은 백분율(17%)의 전체 CD8 양성 T 세포는 양성임이 확인되었다(도 14d). 그럼에도 불구하고, ILT2 발현은 TME에서의 T 세포에서 증강되었다. 단세포 현탁액을 식도암 환자로부터 단리된 종양의 효소적 소화에 의해 생성하였다. FACS 분석은 큰 비율의 CD8 양성 종양 침윤 림프구(TIL)가 TEMRA 세포(50%)이며 이들 TEMRA 세포는 100% ILT2 양성이지만, 거의 완전하게 PD-1 음성(95%)임을 나타내었다(도 14e).
본 발명의 항-ILT2 항체 및 항-PD-1의 조합의 효과를 10명의 건강한 공여자로부터의 SEB-활성화(10 ng/㎖) PBMC에서 평가하였다. 막 CD107a의 발현을 증가된 세포독성에 대한 마커로 사용하였다. 전반적으로, 15G8 항체는 표면 CD107a에서 평균적으로 작은 증가를 생성한 반면, 항-PD-1은 용량-의존적인 다소 더 큰 반응을 생성하였다(도 14f). 2개 항체의 조합은 평균적으로 증가된 CD107a 수준을 생성하였다; 그러나, 이들 변화는 특정 공여자 샘플에 기반하여 가변적이었다. 도 14g는 3개의 예시적 샘플을 제시한다. 첫 번째 공여자는 항-PD-1이 15G8과 조합된 경우 부가적 효과를 보였고, 전체 CD107a 수준은 각각의 항체 단독 효과의 합과 대략 동일하였다. 두 번째 공여자는 항-ILT2에 대해서보다 항-PD-1에 대해 더 강력한 반응을 가졌으나, 예상치 못하게 2개 항체의 조합은 부가적인 효과보다 컸다. 항-PD-1은 발현에서 19% 증가를 생성하였고, 항-ILT2는 3.7% 증가를 생성하였으나, 조합된 처리는 33.2% 증가를 유도하였다. 상기 상승적 효과는 공여자 #3의 세포에서 더욱 더 현저하였다. 공여자 #3에서 15G8은 항-PD-1보다 더 효과적이었고(13.1% 증가 대 9.3% 증가) 조합된 치료법은 크게 더 효과적이어서(41%) 단순히 부가적 조합으로부터 예측될 효과의 거의 2배를 생성하였다.
PD-1 차단 항체 및 생성된 ILT2 항체를 이용한 환자 종양 세포의 조합 처리를 다음으로 평가하였다. 다양한 환자 암 세포를 항-PD1 항체, 본 발명의 항체 및 이의 조합의 존재 하에 자가 PBMC와 인큐베이션하였다. IgG를 대조군으로 사용하고 전염증성 분자의 분비를 판독으로서 측정하였다. 전염증성 사이토카인의 증강된 분비가 조합 처리에서 관찰되었다(도 14h 내지 도 14j). 인간화 항체 15G8에 의한 첫 번째 환자로부터의 결장 샘암종 세포의 처리는 IgG 대조군에 비해 IFNγ 분비를 전혀 증강시키지 않은 반면, 항-PD-1은 사이토카인 분비에서 강력한 증가를 생성하였다(도 14h). 그러나 예상치 못하게도, 항-PD-1과 ILT2 항체의 조합은 분비를 50% 초과만큼 증가시켰다. 두 번째 환자는 ILT2 항체 또는 항-PD-1에 의해 유도된 작은 증가를 갖고 2개 항체가 병용되는 경우 존재하는 증강된 상승적 증가를 갖는 유사한 경향을 나타내었다(도 14i). GM-CSF 발현은 대조군 대비 어느 한 항체 단독에 의해서는 변경되지 않았으나, 놀랍게도, 2개 항체의 조합은 대조군 GM-CSF 수준의 거의 100%의 강력한 증가를 생성하였다(도 14j).
다음으로 혼합 림프구 반응을 사용하여 조합 치료법을 평가하였다. 수지상 세포 및 CD8 양성 T 세포를 상이한 건강한 공여자로부터 단리하고 H&N 암 환자로부터 단리된 단핵구로부터 대식구를 생성하였다. 세포를 나타낸 처리로(각각 20 ㎍/㎎), 5:1의 효과기 세포 대 표적 비로 조합하였다. 항-ILT2 항체 또는 항-PD-1 항체가 존재하는 경우 T 세포에 의한 IFNγ 분비가 증강되었고 상기 효과는 두 항체의 병용으로 증가되었다(도 14k 내지 도 14l). 수지상 세포 배양(도 14k) 대비 대식구 배양(도 14l)에서 더 큰 축적 효과가 관찰되었다. 이들 결과는 항-ILT2 및 항-PD-1 치료법이 면역 세포 염증성 반응의 증강에서 상승적이고 드 노브 효과를 가짐을 명확히 나타낸다.
실시예 10
ILT2 차단 항체가 생체내 종양 부담을 감소시킴
항-ILT2 항체의 유효성을 생체내 모델에서의 이종이식편에서 조사하였다. 면역 손상된 SCID-NOD 또는 NSG 마우스에 암 세포주(A375-HLA-G, A375-WT, COLO-320-HLA-G)를 접종하고 건강한 공여자의 혈액으로부터 생성된 인간 대식구를 ILT2 항체의 존재 하에 마우스 내로 주사하였다. 도 15a에 실증된 바와 같이, 생성된 ILT2 항체의 투여는 상기 모델에서 유의미한 종양 억제를 야기하였고 이는 상기 시스템에서 인간 대식구의 활성에 의해 매개될 가능성이 가장 높다. 또한, 항-종양 유효성이 HLA-G-양성뿐만 아니라 MHC-I-양성 종양 세포에서 관찰되었다.
항-ILT2 항체의 유효성을 또한 생체내 모델에서 폐 병소 흑색종 이종이식편에서 조사하였다. 면역 손상된 SCID-NOD 마우스에 흑색종 세포(MEL526-HLA-G)를 접종하였다. 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된 인간 PBMC를 접종 1일 후 시작하여 선택 ILT2 항체의 존재 하에 마우스 내로 주사하고 2일, 10일, 18일에 반복하였다(도 15b). ILT2 항체는 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 18일, 22일 및 25일에 투여하였다. 도 15c에 실증된 바와 같이, 생성된 ILT2 항체의 투여는 종양 세포의 전이에서 유의미한 감소를 야기하였고, 이는 마우스의 폐 내 검은색 병소의 형성에 의해 나타난다. ILT2 항체로 처리한 마우스의 폐는 대조군 IgG로 처리된 마우스에 비해 이러한 병소를 훨씬 적게 갖는다. 상기 효과는 또한 이들 마우스에서 폐의 중량 감소로 실증되며(도 15d) 투여된 항체에 의한 ILT2의 억제와 조합되어 마우스에 투여된 인간 림프구에 의해 매개될 가능성이 가장 높다. 따라서, 항-ILT2 항체는 전이 및 종양 형성의 방지에서 효과적이었다.
다음으로, 이미 형성된 종양의 치료에서 새로운 항체의 효과를 생체내 마우스 모델에서 동일하게 평가하였다. SCID-NOD 마우스를 이전과 같이 MEL526-HLA-G 세포로 IV 투여에 의해 그래프팅하였다. 15일 후, 건강한 공여자로부터 단리된 인간 PBMC를 관련 마우스 군에 투여하였고 상기 투여를 25일, 35일 및 51일에 반복하였다(도 15e 참고). 항체,(ILT2 항체, 항-PD-1 항체 또는 둘의 조합)를 14일, 17일, 20일, 24일, 27일, 30일, 34일, 37일 및 50일에 투여하였다(도 15e 참고). 53일차에 마우스를 희생시키고, 폐를 칭량하였다. 평가 마우스의 폐 중량에서 나이브 마우스 폐 중량을 빼서 종양 중량을 계산하였다. 항-PD-1 항체는 유의미하게는 아니지만, 종양 중량을 감소시킨 반면, ILT2 항체 및 조합 처리는 유의미한 효과를 가졌다(도 15f).
종양 유래 CD8 T 세포, TEMRA 세포 및 NK 세포를 CD107A 및 CD69 발현에 대해 평가하였다. 전체 CD8 T 세포에서, 항-PD-1 항체는 CD107A 발현에서 유의미하지 않은 증가를 유도한 반면, 조합 치료법이 아닌 ILT2 항체는 유의미한 변화를 유도하였다(도 16a). TEMRA 세포에서, ILT2 항체 및 조합 치료법은 둘 다 유의미한 증가를 유도하였다(도 16b). NK 세포에서, 항-PD1 및 항-ILT2 항체는 모두 CD69 양성 세포의 백분율을 유의미하게 증가시켰으나, 놀랍게도 조합 치료법은 크게 증강된 효과를 가졌고, CD69 양성 세포의 전체 백분율은 어느 한 치료법 단독의 조합에서보다 컸다(도 16c). 놀랍게도, CD69 발현을 CD8 T 세포에서 조사한 경우, 항-PD1도 항-ILT2도 발현을 증가시키지 않았으나, 조합 처리는 CD69 발현에서 고도로 유의미한 증가를 유도하였다(도 16d). 또한, ILT2 항체의 효과는 ILT2 발현과 연관되는 것으로 결정되었다. 실험을 저 ILT2 발현 또는 고 ILT2 발현을 갖는 PBMC를 수여받은 마우스 내로 분류했을 때, 활성화 마커에서 유의차가 관찰되었다. TEMRA 세포에서 고 ILT2 발현 PBMC에는 저 ILT2 발현 PBMC 대비 2배를 초과하는 CD107A 발현이 포함되었다(도 16e). 유사하게, NK 세포를 조사한 경우, 고 ILT2 발현 PBMC는 조합 처리가 투여된 경우 거의 90%의 세포가 CD69를 발현하도록 유도하였다; 반면에 저 ILT2 발현 PBMC는 40% 미만의 NK 세포가 CD69를 발현하도록 유도하였다(도 16f). 따라서, PBMC에서 ILT2의 발현 수준은 항체의 가장 강력한 효과를 위해 필수적이다.
실시예 11
생체내 인간화 H&N 모델
두 번째 생체내 모델에서, 인간화 마우스(인간 CD34+ 그래프팅 마우스)에 A253-HLA-G 세포를 접종하였다. 종양이 80제곱밀리미터의 크기에 도달하면, 마우스에 대조군 IgG 또는 ILT2 항체(15G8, 둘 다 10 mg/kg)를 처리하였다. 43일까지 처리를 주 2회 반복하고(도 17a) 종양을 다양한 시점에 캘리퍼에 의해 측정하여 종양 크기를 결정하였다. ILT2 항체는 마우스 4마리 중 2마리(마우스 # 23 및 28)에서 종양 성장을 완전히 방해하였고, 43일경 종양이 박멸되었다(도 17b). 처리에 대한 상이한 반응이 마우스의 면역 세포 내 ILT2의 상이한 발현 수준에 기인하였는지를 결정하기 위해, 말초혈로부터의 CD8 T 세포를 기준선에서 ILT2 발현에 대해 검정하였다. 실제로, 완전 반응을 가진 두 마리 마우스 모두 ILT의 고발현을 갖는 T 세포를 가졌고, 나머지 2마리 마우스는 유의미하게 더 낮은 발현 수준을 가졌다(도 17c). 또한, 처리 후 TME를 조사함으로써, 반응체를 비-반응체와 구별하는 반응의 3개의 다른 약리역학적 마커인 T 세포에서의 CD107A 발현(도 17d), M1/M2 대식구 비(도 17e), 및 전체 CD80 양성 수지상 세포(도 17f)를 실증하였다. 이들 결과는 항-ILT2가 종양 미세환경의 골수 및 림프 구획에서 변화를 생성하며 또한 수지상 세포가 항원을 제시하고 보다 많은 T 세포를 종양으로 모집하는 능력을 증가시킬 수 있다는 사실을 지적한다.
실시예 12
15G8 인간화 항체의 에피토프 맵핑
15G8 항체를 에피토프 맵핑을 위해 발송하여 이것이 결합하는 ILT2 상의 위치를 결정하였다. 맵핑은 MAbSilico 회사에서 수행하였다. 사용된 ILT2의 구조는 하기 구조를 사용하여 모델링하였다: 6AEE(4개의 Ig-유사 도메인, 일부 루프는 소실됨), 1VDG(미공개, 도메인 1 및 2), 1G0X(도메인 1 및 2) 및 4LL9(도메인 3 및 4). 6AEE 및 1G0X 구조는 문헌[Wang, Q., et al.,(2019). "Structures of the four Ig-like domain LILRB2 and the four-domain LILRB1 and HLA-G1 complex." Cell. Mol. Immunol.]에서 취했으며, 4LL9 구조는 문헌[Chapman, T. L., et al., (2000). "Crystal structure and ligand binding properties of the D1D2 region of the inhibitory receptor LIR-1 (ILT2)" Immunity, 13(5), 727-736]에서 취했다. 영역 D1은 ILT2의 잔기 24 내지 121로 정의되었다. 영역 D2는 ILT2의 잔기 122 내지 222로 정의되었다. 영역 D3은 ILT2의 잔기 223 내지 321로 정의되었다. 영역 D4는 ILT2의 잔기 322 내지 409로 정의되었다. 항체의 3D 모델은 Modeller를 사용하여 구축하였다.
상위 30 순위 도킹 포즈에 기반하여, 표적의 잔기를 에피토프에 속할 이의 확률에 대해 스코어링하였다. 에피토프에 속한 가능성이 높은 잔기를 도 18a에서의 서열에 그리고 도 18b에서의 표적의 구조 상에 나타낸다. 이들 잔기로부터, 4개의 주요 상호작용 영역이 표적 상에서 정의된다(도 18c). 모든 4개의 이러한 상호작용 영역이 ILT2의 사이도메인 섹션에서 확인되며, 이는 D1 및 D2 간 힌지 섹션이다. 검증 돌연변이를 이들 영역 내에서 선택하였고 표 3에 요약한다. 이들 돌연변이를 전장 ILT2 또는 절단된 D1+D2 단백질 내에서 생성하고 15G8 항체의 결합을 평가한다. 돌연변이체에 대한 결합 소실 또는 감소는 영역이 15G8 항체의 진정한 에피토프임을 시사한다.
Figure pct00004
대부분의 ILT2 항체의 결합 에피토프는 알려져 있지 않지만, 국제 특허 공보 WO2020/136145는 다양한 항체에 대한 에피토프 정보를 개시한다. 하나는 D1 영역 내에서 그리고 하나는 D4 영역 내에서, 2개의 일반적 결합 영역이 확인되었다. 특히 3H5, 12D12 및 27H5로 명명된 3개의 항체는 D1에서의 E34, R36, Y76, A82 및 R84에서 치환을 갖는 돌연변이체에 대한 결합 소실을 특징으로 하였다. 이들 항체 중 하나인 3H5는 D1의 G29, Q30, T32, Q33 및 D80에서 치환을 갖는 돌연변이에 대해 감소된 결합을 나타내었다. 이들 잔기는 D1 영역에만 있으며, 모두 15G8 항체의 결합 에피토프로 정의된 4개 영역(모두 사이도메인 내임)의 밖에 있다(도 18a에서 서열은 하나의 아미노산 뒤에서 시작하므로, 예를 들어, WO2020/136145의 E34는 도 18a에서 E33임을 주지하라). 따라서, 항체 15G8은 WO2020/136145 공보의 항체와 상이한 3-차원 에피토프에 결합한다(도 18d).
흥미롭게도, D1 및 D2 간 사이도메인인 15G8 에피토프로 정의된 영역이 HLA와의 복합체인 경우 베타-2-마이크로글로불린(B2M)과 결합하는 ILT2의 주요 상호작용 영역으로서 확인되었다(문헌[Kuroki et al., "Structural and functional basis for LILRB immune checkpoint receptor recognition of HLA-G isoforms", J. Immuno., 2019, Dec. 15;203(12):3386-3394] 참고)(도 18e 내지 도 18f). 실제로, 잔기 G97, A98, Y99, I100, Q125 및 V126은 Kuroki 등에 의해(문헌[Kuroki]에서 보충 도 S2) B2M과 상호작용하는 것으로 구체적으로 확인되었다. 이들 잔기는 15G8에 대한 상호작용 영역 3 및 4 내에 속하며 모두 에피토프의 매우 크게 가능성 높은 또는 고도로 가능성 높은 잔기로 간주된다. 이는 15G8이 B2M-의존적 방식으로 HLA에 대한 ILT2의 결합을 억제함을 제시하며, 실제로 B2M으로의 직접적인 ILT2 결합을 차단한다. 대조적으로, 3H5, 12D12 및 27H5 항체는 HLA-G의 α3 도메인과 상호작용하는 ILT2의 N-말단 D1 영역에 결합한다(문헌[Kuroki]에서의 보충 도 S2 참고). 이는 Kuroki 등이 ILT2에 대한 주요 상호작용 부위가 B2M 부위이며 α3 도메인에 대한 결합이 부가적이고 가요성임을 확인하였으므로 매우 중요하다. 이는 T 세포, NK 세포 및 대식구/수지상 세포 기능에 효과를 일으키는 15G8의 고유한 능력을 설명할 수 있다; 이는 ILT2의 이차 부위가 아니라 주요 상호작용 부위를 차단한다.
포식작용에 대해 임의의 효과를 갖는 것으로 확인된 유일한 ILT2 항체는 GHI/75이며, 이는 항-CD47 차단 매개된 암 세포 포식작용을 증강시키는 것으로 나타났으나, 그 자체에 대해 효과를 갖는 것으로 나타나지 않았다(문헌[Barkal et al., "Engagement of MHC class I by the inhibitory receptor LILRB1 suppresses macrophages and is a target of cancer immunotherapy", Nat. Immunol. Jan;19(1):76-84] 참고). B2M의 제거는 증가된 포식작용에 대해 효과를 갖지 않았으므로 조합된 GHI/75 및 항-CD47 효과는 B2M 의존적인 것으로 확인되지 않았다. 따라서, 포식작용에 대한 15G8 단독의 효과(도 13a 내지 도 13c)는 B2M 의존적일 수 있으며, 이것이 상기 항체의 고유한 능력을 설명할 것이다. 이에 관해 본 발명의 항체의 우수성을 직접 평가하였다. A375 또는 외인성 HLA-G를 발현하는 SKMEL28 암 세포를 IgG 대조군, 본 발명의 항체, 또는 GHI/75의 존재 하에 대식구와 공동배양하였다. HP-F1 항체를 또한 A375 세포에서 평가하였다. PKH67-FITC로 염색된 암 세포주를 나타낸 항체의 존재 하에 eFluor 670-APC로 염색된 대식구와 인큐베이션하였다. 포식작용 수준을 표적 세포의 포식을 시사하는, 이중 염색된 대식구%에 의해 결정하였다. IgG 대조군 대비 포식작용의 증가%를 계산하였다. 본 발명의 모든 3개 항체는 두 세포 유형에서 모두 대조군에 비해 포식작용을 증가시켰고(도 19a 내지 도 19b), 항체 간 및 세포 유형 간 일부 변동성을 가졌다. 예상된 바와 같이, GHI/75도 HP-F1도 포식작용에 대해 임의의 효과를 갖지 않았다. 이는 본 발명의 항체가 단일치료법으로서 포식작용을 증강시킬 수 있는 최초의 항-ILT2 항체임을 확인시켜준다.
이는 GHI/75 및 다른 상업적 항체의 에피토프의 질문을 불러일으킨다. 이들 항체의 에피토프는 공개되지 않았으나, 15G8 및 GHI/75 그리고 HP-F1가 동시에 ILT2에 결합할 수 있는지를 확인하기 위해 경쟁 ELISA 검정을 수행하였다. 바이오틴화 15G8 항체를 ILT2 결합 ELISA에서 일정한 농도(1 ㎍/㎖)로 사용하였다. GHI/75 및 HP-F1을 증가하는 농도로 첨가하고 경쟁을 평가하였다. 이들 2개 항체가 첨가된 양과 무관하게, 어느 것도 ILT2로의 결합에 대해 15G8과 경쟁하지 않았다(도 19). 대조적으로, 네이키드(비바이오틴화) 15G8을 첨가한 경우, 결합은 예상된 바와 같이 용량 의존적 방식으로 감소하였다. 이는 GHI/75 및 HP-F1이 15G8과 상이한 에피토프에 결합함을 시사한다. 이는 15G8을 B2M과의 상호작용을 특이적으로 차단하기 위해, 그리고 암에 대해 T 세포, NK 세포 및 대식구/수지상 세포를 동시에 활성화/모집할 수 있는, 상기 에피토프에 결합하는 것으로 지금까지 확인된 최초의 항-ILT2 항체로 만든다.
구체적 구현예의 상기 설명은 다른 연구자가, 현재의 지식을 적용함으로서, 과도한 실험 없이 그리고 일반적 개념에서 벗어나지 않고 이러한 구체적 구현예를 다양한 적용을 위해 용이하게 변형하고/하거나 적응시킬 수 있는 본 발명의 일반적 성질을 매우 충분히 드러낼 것이며, 이에 따라, 이러한 적응 및 변형이 개시되는 구현예의 균등부의 의미 및 범위 내에서 이해되어야 하며 그렇게 의도된다. 본원에서 채택되는 어법 또는 용어는 설명을 위한 것이며 제한을 위한 것이 아님이 이해되어야 한다. 다양한 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 물질, 및 단계는 본 발명에서 벗어나지 않고 다양한 대안적 형태를 취할 수 있다.
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Synthetic <400> 37 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca ggacaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctcctac acatcaagat tgcactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcccacgtt cggctcgggg 300 acaaagttgg aaataaaa 318 <210> 38 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 38 gacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc ggacctctca ggacatctcc aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120 ggcaaggccg tgaagctgct gatctcctac acctccagac tgcactctgg cgtgccctcc 180 agattttctg gctctggatc tggcaccgac tacaccctga ccatcagttc tctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag ggcaacaccc tgcctacctt tggccagggc 300 accaagctgg aaatcaag 318 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 39 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctac ttgtctgtat ctctaggagg cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ccacattaat aattggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 40 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr 1 5 10 15 Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln 20 25 30 Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg 35 40 45 Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile 50 55 60 Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr 65 70 75 80 Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly 85 90 95 Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn 100 105 110 Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp 115 120 125 Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu 130 135 140 Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val 145 150 155 160 Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr 165 170 175 Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu 180 185 190 Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro 195 200 205 Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser 210 215 220 Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240 Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala 245 250 255 Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg 260 265 270 Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp 275 280 285 Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu 290 295 300 Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu 305 310 315 320 Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu 325 330 335 Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln 340 345 350 Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala 355 360 365 Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu 370 375 380 Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu 385 390 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ser 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp 1 5 10 15 <210> 45 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile 1 5 10 15 Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr 20 25 30 Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr 35 40 45 Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser 50 55 60 Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr 85 90 95 Gly Ala <210> 47 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser 1 5 10 15 Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly 20 25 30 Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu Asn 35 40 45 Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly 50 55 60 Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu 85 90 95 Leu Val Leu Gly Val 100

Claims (51)

  1. 하기와 같은, 3개의 중쇄 CDR(CDR-H) 및 3개의 경쇄 CDR(CDR-L)을 포함하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편:
    a. CDR-H1은 SEQ ID NO: 13(SGYYWN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 14(YISYDGSNNYNPSLKN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 15(GYSYYYAMDX)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 16(RTSQDISNYLN)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 17(YTSRLHS)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 18(QQGNTLPT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 식 중 상기 X는 A, C 및 S로부터 선택되거나;
    b. CDR-H1은 SEQ ID NO: 1(DHTIH)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 2(YIYPRDGSTKYNEKFKG)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 3(TWDYFDY)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 4(RASESVDSYGNSFMH)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 5(RASNLES)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 6(QQSNEDPYT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나;
    c. CDR-H1은 SEQ ID NO: 7(GYTFTSYGIS)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, CDR-H2는 SEQ ID NO: 8(EIYPGSGNSYYNEKFKG)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-H3은 SEQ ID NO: 9(SNDGYPDY)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L1은 SEQ ID NO: 10(KASDHINNWLA)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L2는 SEQ ID NO: 11(GATSLET)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, CDR-L3은 SEQ ID NO: 12(QQYWSTPWT)에 나타낸 아미노산 서열을 포함함.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 19(QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGSTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARTWDYFDYWGQGTTLTVSS), SEQ ID NO: 21(QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWVGEIYPGSGNSYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARSNDGYPDYWGQGTTLTVSS) 및 SEQ ID NO: 23(DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDXWGQGTSVTVSS)으로부터 선택되며, 식 중 상기 X는 A, C 및 S로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 20(DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK), SEQ ID NO: 22(DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK), SEQ ID NO: 24(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPTFGQGTKLEIK) 및 SEQ ID NO: 45(DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLISYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPTFGSGTKLEIK)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편가 인간화되며, 상기 X가 A 및 S로부터 선택되는 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 X가 A이며, SEQ ID NO: 15가 GYSYYYAMDA(SEQ ID NO: 25)이고 SEQ ID NO: 23이 DVQLQGSGPGLVKPSETLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGKKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRITISRDTSKNQFSLKLNSVTAADTATYYCAHGYSYYYAMDAWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 28)인 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. VKKGQFPIPSITWEH(SEQ ID NO: 41), LELVVTGAYIKPTLS(SEQ ID NO: 42), VILQCDSQVAFDGFS(SEQ ID NO: 43) 및 WYRCYAYDSNSPYEW(SEQ ID NO: 44)로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 인간 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1(ILT2) 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 에피토프가 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44를 포함하는 3-차원 에피토프인 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. ILT2에 결합하고 상기 ILT2 및 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 간 직접적 상호작용을 억제하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 상기 B2M과의 ILT2의 직접적 상호작용의 억제를 통해 상기 ILT2 및 HLA 단백질 또는 MHC-I 단백질의 상호작용을 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 HLA가 HLA-G인 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. ILT2에 결합하며 암을 앓는 대상체에서 하기 중 적어도 세 가지를 유도하는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편:
    a. 증가된 자연 살해(NK) 세포 세포독성;
    b. 증가된 T 세포 세포독성, 증식, 또는 둘 다;
    c. 증가된 대식구 포식작용, 증가된 M1 염증성 대식구의 생성, 감소된 M2 저해성 대식구의 생성 또는 이의 조합; 및
    d. 증가된 상기 암의 종양으로 귀소하는 수지상 세포, 증가된 수지상 세포 활성화 또는 이의 조합.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암이 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암인 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ILT2 결합, 항-종양 T-세포 반응의 유도/증강, T-세포 증식의 증가, 암-유도 저해성 골수 활성의 감소, 자연 살해 세포 세포독성의 증가, 대식구 포식작용의 증가, M1 염증성 대식구의 생성 증가, M2 억제성 대식구의 생성 감소, 종양 미세환경에서 수지상 세포수의 증가, 수지상 세포 활성화의 증가, HLA-G 발현 암의 치료, 및 MHC-I 발현 암의 치료 중 적어도 하나에서 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하기 위해 옵소닌화제와 병용하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하기 위해 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법과 병용하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. 이를 필요로 하는 대상체에서 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 옵소닌화제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제14항 또는 제17항에 있어서, 상기 옵소닌화제가 EGFR 억제제이며, 선택적으로 상기 EGFR 억제제가 세툭시맙인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 항-PD-L1/PD-1 기반 면역치료법을 상기 대상체에 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 이를 필요로 하는 대상체에서 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하는 방법으로서,
    a. 상기 대상체에서 ILT2 또는 가용성 HLA-G의 발현이 사전 결정된 역치 초과임을 확인하는 단계; 및
    b. ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제를 상기 대상체에 투여하는 단계;
    를 포함하며, 이에 의해 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 확인 단계는 상기 투여 단계 전에 상기 대상체에서 상기 ILT2 또는 가용성 HLA-G의 발현을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, ILT2의 발현을 확인하는 단계를 포함하며 상기 ILT2의 발현이 상기 대상체의 면역 세포 내에서 일어나는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 면역 세포가 말초혈 면역 세포 및 종양내 면역 세포로부터 선택되는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 면역 세포가 CD8 양성 T 세포, 대식구, NK 세포 및 TEMRA 세포로부터 선택되는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 말초혈 CD8 양성 T 세포인 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 HLA-G의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법을 상기 대상체에 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 이를 필요로 하는 대상체에서 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암을 치료하는 방법으로서,
    a. ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 제제를 상기 대상체에 투여하는 단계; 및
    b. 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법을 상기 대상체에 수행하는 단계;
    를 포함하며, 이에 의해 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  29. HLA-G, MHC-I 또는 둘 다를 발현하는 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 방법으로서, 상기 암 세포를 ILT2 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ILT2 기반 면역 저해를 억제하는 상기 제제가 ILT2 길항제인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 ILT2 길항제가 ILT2에 특이적으로 결합하고 ILT2-매개 면역 세포 저해를 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-L1/PD-1 기반 면역치료법이 항-PD-1 차단 항체인 방법.
  34. 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법에 불응성인 방법.
  35. 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 옵소닌화제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 옵소닌화제가 EGFR 억제제이며, 선택적으로 상기 EGFR 억제제가 세툭시맙인 방법.
  37. 암을 앓는 대상체를 치료하기 위해 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법과 병용하기 위한, ILT2에 결합하고 ILT2-매개 면역 세포 저해를 억제하는 제제를 포함하는 약학 조성물.
  38. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물.
  39. 제제를 제조하는 방법으로서,
    ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 상기 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화 및 증가된 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계, 및 상기 증가된 포식작용, 상기 증가된 활성, 상기 증가된 생성, 상기 감소된 생성, 상기 모집, 상기 증가된 활성화, 상기 감소된 활성 및 상기 증가된 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계; 또는
    제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
    i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
    ii. 상기 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화 및 증가된 암 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 적어도 두 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계; 및
    iii. 상기 증가된 포식작용, 상기 증가된 활성, 상기 증가된 생성, 상기 감소된 생성, 모집, 상기 증가된 활성화, 상기 감소된 활성 및 상기 증가된 세포독성 중 적어도 두 가지를 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
    를 포함하며, 이에 의해 제제를 제조하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 제제가 증가된 대식구에 의한 암 세포의 포식작용, 증가된 암 세포에 대한 T 세포 활성, 증가된 M1 대식구의 생성, 감소된 M2 대식구의 생성, 증가된 수지상 세포의 종양 미세환경으로의 모집, 증가된 수지상 세포 활성화 및 증가된 자연 살해(NK) 세포 세포독성 중 세 가지를 유도하는 능력을 평가하는 단계 및 적어도 세 가지를 유도하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제제를 제조하는 방법으로서,
    ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 상기 제제가 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 능력을 평가하는 단계 및 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계; 또는 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
    i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
    ii. 상기 제제가 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 능력을 평가하는 단계; 및
    iii. 암 세포에 대한 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법의 유효성을 증가시키는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
    를 포함하며, 이에 의해 제제를 제조하는 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효성 증가가 전염증성 사이토카인 분비에서의 상승적 증가를 포함하거나 상기 증가된 세포독성이 전염증성 사이토카인 분비에서의 증가를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인이 GM-CSF, TNFα 및 IFNγ로부터 선택되는 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효성 증가가 T 세포 활성화, 세포독성 또는 둘 다의 상승적 증가를 포함하는 방법.
  45. 제39항, 제40항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성화, 세포독성 또는 둘 다의 상기 증가가 증가된 막 CD107a 발현을 포함하는 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효성 증가가 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법에 대한 불응성 암을 항-PD-L1/PD-1 기반 치료법에 반응하는 암으로 전환시키는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포가 HLA-G 또는 MHC-I 발현 암인 방법.
  48. 제제를 제조하는 방법으로서,
    ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 상기 제제가 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 능력을 평가하는 단계 및 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계; 또는 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 하기에 의해 선택된 제제의 서열인, 단계:
    i. ILT2 세포외 도메인 또는 이의 단편에 결합하는 제제를 수득하는 단계;
    ii. 상기 제제가 ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 능력을 평가하는 단계; 및
    iii. ILT2 및 B2M 간 상호작용을 억제하는 적어도 하나의 제제를 선택하는 단계;
    를 포함하며, 이에 의해 제제를 제조하는 방법.
  49. 제제를 제조하는 방법으로서, 하기 단계:
    SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 ILT2 에피토프에 결합하는 제제를 수득하는 단계, 또는 제제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 핵산 서열은 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44로부터 선택되는 인간 ILT2의 서열 내 ILT2 에피토프에 결합하는 제제를 수득함으로써 선택된 제제의 서열인, 단계를 포함하며; 이에 의해 제제를 제조하는 방법.
  50. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
  51. 제50항에 있어서, 발현 벡터인 핵산 분자.
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