KR20210092201A - 사이토카인을 분비하기 위한 변형된 pdc 계통 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사이토카인을 분비하기 위한 유전적으로 변형된 PDC(형질세포양 수지상 세포) 및, 면역요법에서 항원 특이적 세포의 확장을 증가시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사이토카인(cytokine)을 분비하기 위해 유전적으로 변형된(genetically modified) 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell; PDC) 계통(line), 및 면역요법(immunotherapy)에서 항원 특이적 세포의 확장(expansion)을 증가시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
항원 특이적 세포의 생산을 촉진하는 것을 추구하는 면역요법 접근법이 공지되어 있다. 공여자(donor) 단핵 세포(mononuclear cell; MNC), 특히 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)로부터 항원 특이적 세포독성 세포를 유도하기 위해 형질세포양 수지상 세포(PDC) 계통("PDC*계통"이라 함)을 사용하는 접근법은, 본 발명자에 의해 개발되었다(WO 2009/138489). 이러한 접근법은 MNC를 조사된(irradiated) 및 항원 로딩된(antigen-loaded) "PDC*계통"의 존재 하에 배양하는 것으로 구성되어 있으며, 단핵 세포는 "PDC*계통"과 적어도 하나의 HLA 분자를 공유한다(예를 들어, HLA-A2).
본 출원인이 수행한 작업은 이러한 치료적 접근법(therapeutic approach)의 매력 및 흑색종(melanoma) 또는 폐 암(lung cancer)과 같은 암의 면역요법 치료에서 이의 상당한 잠재력을 보여주었다(Aspord et al., 2012, 미공개 데이터).
항원 특이적 세포의 확장을 유도하는 능력은 이러한 신규한 치료적 접근법의 실행에 결정적인 인자이다. 특히, 출원 WO 2009/138489로부터, 이러한 확장을 위해 사이토카인의 존재가 필요하다는 것이 공지되어 있다. 기재된 실험 프로토콜(experimental protocol)은, 첫 번째 주에, 사이토카인 없이 수행된 MNC와 조사되고 항원 로딩된 PDC*계통의 공동 배양, 이후 두 번째 주에, 조사된 항원 로딩된 PDC*계통 및 IL-2를 사용한 새로운 자극으로 구성된다.
다양한 면역 반응의 발달 메커니즘에서 사이토카인의 중요성은 특히, IL-2 및 IL15에 대해 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다(Waldmann, Nat Rev 2006). IL-2는 주로 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 반면, IL-15 및 이의 관련 수용체 IL-15Ra(Dubois et al., 2002)는 단핵구 또는 골수 수지상 세포 (myeloid dendritic cell; MDC)에 의해 생성된다(Jakobisiak et al., 2011). 항종양 반응의 유도에서 (NK, 항체 또는 항원 특이적 T) IL15를 생산하기 위한 시험관 내(in vitro)-생성된 MDC의 일시적 또는 영구적 변형은 세포 기능을 향상시키기 위한 목적으로 기재되었다(van den Bergh et al., 2015, Steel et al (2010) 또는 Zhang et al. (2014)).
MDC 및 PDC 둘 모두가 항원 제시 세포(antigen-presenting cell)이더라도, 이들은 병원체 또는 항원의 기원 및 일반적으로 환경적 맥락에 따라 다른 유형의 면역 반응을 유도할 수 있는 두 가지의 다른 세포 유형이며, 다음의 다수의 특징으로 구별된다: 특히, 기원, 조직 국재화, Toll 유사 수용체 발현, 사이토카인 생산. IL15를 발현하도록 변형된 MDC에 대한 이러한 논문 중 어느 것도 PDC를 사용할 가능성을 언급하지 않거나, IL15 또는 심지어 IL2에 의한 PDC에 대한 적어도 동등한 효과를 고려하지도 않는다.
WO 2009/138489에 기술된 종래의 활성화 및 확장 방법은 이미 특히 높은 수준의 확장을 달성하지만 (Aspord et al., 2010), 항원 특이적 세포 확장 수준에서 이러한 신규한 치료적 접근법을 개선하는 것이 여전히 유리하다.
따라서 본 발명은 인터류킨 15 (interleukin 15; IL15) 및 인터류킨 2 (IL2)로부터 선택된 사이토카인을 발현하도록 유전적으로 변형된 신규한 PDC 계통에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 PDC 세포는 펩타이드 형태의, 하나 이상의 항원으로 로딩된다.
본 발명은 또한 항원 특이적 세포, 특히 단핵 세포 (MNC), 더욱 특히 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 증폭하기 위한 신규한 유전적으로 변형된 PDC 계통의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 한편으로는 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 PDC 계통 및 다른 한편으로는 단핵 세포(MNC)를 포함하며, 특히 면역요법에 의한 질환의 치료에서 동시에 사용하기 위한 조합 제품(combination product) 또는 키트(kit)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 PDC 계통 및 이의 투여에 적합한 비히클(vehicle)을 포함하는 백신 조성물(vaccine composition)에 관한 것이다.
도 1은 비형질도입된(non-transduced) PDC*계통(왼쪽) 또는 IL-2 또는 IL-15를 인코딩하는(encoding) 레트로바이러스(retroviral) 상청액으로 형질도입된 CD34 분자의 발현의 측정을 나타낸다.
도 2는 IL2 또는 IL15 레트로바이러스 상청액으로 형질도입된 PDC*계통에 의한 IL2 또는 IL15의 발현을 나타낸다. 사이토카인은 전령(messenger) RNA 수준(a, G6PDH로 표준화됨) 또는 형질도입된 세포의 상청액(b, pg/ml)에서 검출된다.
도 3은 변형되지 않거나 IL2 또는 IL15으로 유전적으로 변형된, 멜란-A 항원으로 로딩된, PDC 계통, 및 3명의 건강한 공여자로부터의 단핵 세포의 14일 공동 배양 후 항-멜란-A CD8+ T 세포의 확장을 나타낸다. 항-멜란-A CD8+ T 세포는 HLA-A2/멜란-A 다량체(multimer)를 사용하여 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 검출된다. a에서, 대표적인 실험을 나타내고; b에서, 3개 실험의 결과를 나타낸다(% CD8+ 다량체 세포).
도 4는 14일 공동 배양으로부터의 CD8+ 세포의 기능을 나타낸다. 세포 독성 세포의 기능은 사용된 멜란-A 유래 펩타이드로 로딩된 표적 계통 (T2)에 의한 자극 후 세포질내(intracytoplasmic) IFNγ의 검출에 의해 객관화된다. a에서, 상이한 계통으로 수득된 모든 특이적 및 비특이적 CD8+ 세포에서 사이토카인의 세포질내 검출의 도시. b에서, 각 계통으로 생성된 비특이적(다량체-) 및 특이적(다량체+) 세포에서 IFNγ-양성 CD8+ 세포의 백분율.
도 2는 IL2 또는 IL15 레트로바이러스 상청액으로 형질도입된 PDC*계통에 의한 IL2 또는 IL15의 발현을 나타낸다. 사이토카인은 전령(messenger) RNA 수준(a, G6PDH로 표준화됨) 또는 형질도입된 세포의 상청액(b, pg/ml)에서 검출된다.
도 3은 변형되지 않거나 IL2 또는 IL15으로 유전적으로 변형된, 멜란-A 항원으로 로딩된, PDC 계통, 및 3명의 건강한 공여자로부터의 단핵 세포의 14일 공동 배양 후 항-멜란-A CD8+ T 세포의 확장을 나타낸다. 항-멜란-A CD8+ T 세포는 HLA-A2/멜란-A 다량체(multimer)를 사용하여 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 검출된다. a에서, 대표적인 실험을 나타내고; b에서, 3개 실험의 결과를 나타낸다(% CD8+ 다량체 세포).
도 4는 14일 공동 배양으로부터의 CD8+ 세포의 기능을 나타낸다. 세포 독성 세포의 기능은 사용된 멜란-A 유래 펩타이드로 로딩된 표적 계통 (T2)에 의한 자극 후 세포질내(intracytoplasmic) IFNγ의 검출에 의해 객관화된다. a에서, 상이한 계통으로 수득된 모든 특이적 및 비특이적 CD8+ 세포에서 사이토카인의 세포질내 검출의 도시. b에서, 각 계통으로 생성된 비특이적(다량체-) 및 특이적(다량체+) 세포에서 IFNγ-양성 CD8+ 세포의 백분율.
발명의 상세한 설명
따라서 본 발명은 IL15 및 IL2로부터 선택된 사이토카인을 발현하도록 유전적으로 변형된 신규한 PDC 계통에 관한 것이다.
유전적으로 변형되기 위해 본 발명에 따라 유용한 PDC 계통(초기 PDC 계통이라고도 함)은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있으며, 특히 EP 1 572 989 및 WO 2009/138489에 기재되어 있다. 특히, 이는 PDC 백혈병 세포에서 수득한 세포이다. 특히 CNCM (국립 미생물 배양 콜렉션(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 75015 파리, 루 두 닥터 로우(Docteur Roux) 25 소재, 파스퇴르 연구소(Institut Pasteur))에 번호 2938 및 3110 하에 기탁된 GEN2.2 및 GEN3 계통 및 PDC 백혈병 세포에서 유래된 모든 계통이 언급될 수 있다.
"PDC 백혈병 세포로부터 유래된 계통"은 PDC 백혈병 세포를 면역 결핍(immunodeficient) 마우스에 주입한 후 종양 결절(tumor nodule)로부터 유래된 계통을 의미하며, 이러한 결절을 조각내어(dilacerating) 상기 계통의 성장을 촉진하는 합성 배지에서 배양되는 세포 현탁액을 수득한다.
"IL15 및 IL2로부터 선택된 사이토카인의 발현"은, 본 발명에 따라, 유전적으로 변형된 계통에 의한 사이토카인의 분비를 의미한다.
사이토카인의 서열은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. IL2의 경우 UniProtKB 항목(entry) P60568 하에 식별(identifying)된 단백질 서열 및 Ensembl 항목 ENSG00000109471에서 식별된 인코딩 서열, IL-15의 경우 UniProtKB 항목 P40933 하에 식별된 단백질 서열 및 Ensembl 항목 ENSG00000164136 하에 식별된 인코딩 서열을 특히 언급할 수 있다. 상기 서열과 동일한 활성을 갖는 이러한 사이토카인의 변이체(variant) 또는 단편(fragment)도 본 발명의 일부이다. 바람직하게는, 사이토카인은 상기에서 식별된 인간 사이토카인이다.
"유전적으로 변형된 PDC 계통"은, 본 발명에 따라, 유전자의 계통의 게놈으로의 통합을 가능하게 하는 바이러스 입자(viral particle)로 형질도입된 임의의 계통을 의미하며, 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 렌티바이러스(lentivirus) 또는 레트로바이러스(retrovirus)일 수 있다. 바람직하게는, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus; Mo-MLV) 유형의 레트로바이러스가 사용된다. HEK 293T 캡슐화(encapsulation) 계통에 의해 생산되는 이러한 레트로바이러스 입자는, 자연적으로 또는 형질감염 후에 레트로바이러스 gag/pol 및 env 서열을 발현한다.
당해 분야의 기술자는 관심 유전자(들) 및 조절 요소에 대한 코딩 서열, 특히 유전적으로 변형된 포유 동물 세포에서 사이토카인의 발현을 허용하는 데 사용되는 서열을 포함하는 바이러스 입자를 제조하는 방법을 알 것이다. 바이러스의 세포로의 진입을 허용하는 바이러스 외피(viral envelope) 서열, 예컨대 4070A, MK-G, HA, LCMV, RD114, HIV, VSV, MLV, GALV, BAEV), 관심 유전자의 전사의 개시를 허용하는 프로모터 서열, 예컨대 긴 말단 반복(long terminal repeat; LTR) 서열(변형 여부에 관계 없음), PGK, EF-1, CMV, SFFV, RSV, 또는 SV40, 형질도입 효율을 향상시키는 서열, 예컨대 cPPT, 번역을 용이하게 하거나 개시하는 서열, 예컨대 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열 (Pelletier, Nature 1988), 또는 코작(Kozak) 서열 (Kozak, Nucl acid Res 1991), 단백질 발현을 촉진하는 서열, 예컨대 WPRE 서열 (Donello et al., J. Virol 1998)이 특히 언급될 수 있다. 바람직하게는, LTR, IRES, 코작 및 WPRE 서열이 사용될 것이다.
IL15 및 IL2로부터 선택된 사이토카인을 발현하도록 유전적으로 변형된 신규한 PDC 계통을 수득하기 위해 바이러스 입자로 PDC 세포를 형질도입하는 방법이 또한 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 다가양이온성 제제(polycationic agent), 예컨대 폴리브렌 또는 DOGS (디옥타데실아미도글리실스페르민), 또는 바이러스와 관심 세포 사이의 접촉을 촉진하는 제제, 예컨대 피브로넥틴 단편 (RetroNectin)이 특히 언급될 수 있다. 바람직하게는 RetroNectin을 사용하는 방법이 사용된다.
바람직하게는, 사이토카인 단독이 발현된다. 특정한 경우, 특히 IL15의 경우, PDC 계통은 또한 사이토카인 수용체, 특히 IL15Ra 수용체를 발현한다. IL15Ra 수용체, 특히 이의 단백질 서열은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명에 따라 변형된 PDC 계통이 상기 수용체를 발현하지 않는 경우, PDC 계통은 또한 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 상기 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 변형된 PDC는 특히 항원 특이적 세포, 특히 단핵 세포 (MNC), 더욱 특히 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 증폭에 유용하다.
이들이 직접 사용될 수 있지만, 본 발명에 따른 변형된 PDC 세포는 바람직하게는 항원, 특히 펩타이드 항원과 결합된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항원"은 면역계의 세포에 의해 인식되고 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 정의한다. 본 발명에 따른 항원은 천연 또는 변형된, 종양 또는 미생물 (특히 박테리아 또는 바이러스) 항원, 예컨대 펩타이드, 단백질, 당 펩타이드(glycopeptide), 당 단백질(glycoprotein), 인산화 단백질일 수 있다.
당해 분야의 기술자는 치료될 질환에 따라 변형된 PDC 계통과 결합할 항원(들)을 선택할 것이다.
본 발명의 바람직한 구현에서, 항원은 종양 또는 바이러스 기원의 항원성 단백질로부터 수득할 수 있는 펩타이드이다. 이러한 펩타이드는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고, 다수의 특허 출원 또는 특허, 특히 EP 1 485 719, EP 2 113 253, US 7,087,712, US 7,528,224, WO 94/020127, WO 95/02553, WO 98/22589, WO 2000/003693, WO 2000/020445, WO 2000/052163, WO 2000/078806, WO 2004/067023, WO 2007/036638, WO 2007/039192, WO 2008/045286, WO 2011/012720, WO 2015/0965572 및 WO 2016/179573에 기재되어 있다.
사용될 수 있는 다수의 종양 항원은 또한 예를 들어, 주소http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/ 또는 https://docs.google.com/spreadsheets/u/1/d/1BFn5_mu7ogUh35NsLUozj9EB2rbLtj7XjMyt7BoYNxg/pubhtml?widget=true&headers=false#gid=1609210712에서와 같은, 온라인에서 이용 가능한 데이터베이스, 또는 Djureinovic et al. (JCI Insight. 2016;1(10):e86837)와 같은 간행물에 기재되어 있다.
유사하게, 사용될 수 있는 다수의 바이러스 항원이 또한 예를 들어, 주소https://www.iedb.org/ 또는 http://crdd.osdd.net/raghava/antigendb/에서와 같은, 온라인에서 이용가능한 데이터베이스에 기재되어 있다.
본 발명의 특정 실시양태에 따르면, 종양 항원으로부터 수득할 수 있는 펩타이드는, 단독으로 또는 조합하여, 변형되거나 변형되지 않은, 항원 CEA, NY-BR1, Her-2/Neu, PSA, RAGE-1, PRAME, TRP-2, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-C1, MAGE-C2, 멀티(Multi)-MAGE, MUC-1, p53, hTERT, 서비빈(survivin), 멜란(Melan)-A/MART-1, GP100, 티로시나아제(Tyrosinase), CAMEL 또는 NY-ESO1의 서열에 포함된 펩타이드로부터 선택될 수 있다. 유사하게, 핵산 서열의 새로운 판독 프레임(reading frame)에 의해 생성된 전령 RNA의 전사로부터 생성된 단백질 또는 돌연변이된 단백질 중에서 선택된 임의의 항원 (신생 항원).
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 바이러스 항원으로부터 수득할 수 있는 펩타이드는, 단독으로 또는 조합하여, 변형되거나 변형되지 않은, HIV 바이러스의 항원 env, nef, gp41, gp120, gag 또는 pol, HBV 바이러스의 HBc 또는 HBs, HCV 바이러스의 코어(core), NS3 또는 NS5, 인플루엔자 바이러스의 Flu M1, CMV 바이러스의 CMVpp65, EBV 바이러스의 BMLF1, LMP2, EBNA-2 또는 EBNA-3a, BKV 바이러스의 LTA 또는 VOP1, 하탄(Hatan) 바이러스의 핵 단백질(nucleoprotein), 뎅기열(Dengue) 바이러스의 NS3, HPV 바이러스의 E6 및 E7, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스의 단백질 E, NS3 또는 BS4b의 서열에 포함된 펩타이드로부터 선택될 수 있다.
멜란-A, gp100, 티로시나아제, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, 멀티-MAGE, CTAG2, CTAG1, 서비빈, Her-2/Neu, hTERT 및 MUC1이 우선적으로 언급될 수 있다.
본 발명의 첫 번째 바람직한 실시양태에 따르면, 유전적으로 변형된 PDC 세포에는 하나 이상의 항원이 로딩된다. 이는 또한 펄스화(pulsed)되는 것으로, 즉 하나 이상의 항원과 함께 배양되는 것으로 말해질 것이다.
따라서 본 발명은 상기 열거된 항원 중 하나가 로딩된, 상기 및 실시예에서 정의된 바와 같은 유전적으로 변형된 PDC 계통에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 세포는 또한 상기 항원을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 유전적 변형 도구는 PDC 세포가 사이토카인을 발현하도록 변형하는 데 사용되는 도구와 동일하다. 항원의 경우, 당해 분야의 기술자는 또한 항원이 세포 수준에서 발현되도록 하는 유전적 요소를 선택하여 시험관 내 또는 생체 내(in vivo)에서 이들이 에피토프로 변환되고 HLA 분자에 의해 제시되도록 할 것이다. 이러한 요소는 또한 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다 (Hu, Immunological review 2011).
치료용으로, 상기 및 하기 정의된 바와 같이, 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 PDC 계통은, 조사된 계통(irradiated line)이다.
본 발명에 따른 형질전환된 PDC 계통의 성장 및 증식 능력(multiplication capability)을 억제하기 위한 조사 방법 및 조건은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있으며, 특히 WO 2009/138489에 기재되어있다.
본 발명은 또한 항원 특이적 세포, 특히 단핵 세포 (MNC), 더욱 특히 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 증폭하기 위한 신규한 유전적으로 변형된 PDC 계통의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 요법, 특히 면역요법에 의한 질환의 치료에 사용하기 위한 신규한 유전적으로 변형된 PDC 계통에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 한편으로는 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 PDC 계통 및 다른 한편으로는 단핵 세포 (MNC)를 포함하며, 특히 면역요법에 의한 질환의 치료에서 동시에 사용하기 위한 조합 제품 또는 키트에 관한 것이다.
치료되는 질환은 본질적으로 본 발명에 따른 계통과 관련된 항원에 따라 다를 것이며, 예를 들어, 종양 항원은 암의 치료에 사용되고 바이러스 항원은 바이러스 감염의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 PDC 계통 및 이의 투여에 적합한 비히클을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조사되고 펄스화된 유전적으로 변형된 PDC 계통이 치료를 필요로 하는 환자 내로 주입(injecting)되는 것을 특징으로하는, 암 및/또는 감염성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 환자의 항원 특이적 세포 및 PDC는 적어도 하나의 주요 조직 적합성 복합체 (one major histocompatibility complex; MHC) 대립 유전자(allele)를 공유한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 PDC 계통을 적어도 하나의 항원과 함께 인큐베이션(incubation)함으로써 수득된 특이적 효과기(effector)를 치료가 필요한 환자 내로 주입되는 것을 특징으로하는, 암 및/또는 감염성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 가능하게는 조사된, 펄스화된 PDC는 이후 상기 환자의 항원 특이적 세포와 접촉하여 배양되고, PDC 및 항원 특이적 세포는 적어도 하나의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 대립 유전자를 공유한다.
"특이적 효과기"는, 본 발명에 따라, 특이적 항원 또는 이러한 항원으로부터 유래된 생성물, 특히 세포 독성 효과기 및 보다 특히 사용된 항원에 특이적인 T 세포, 특히 CD8+를 인식할 수 있는 면역 세포를 의미한다.
이러한 방법은 특히 WO 2009/138489에 기재되어있다.
실시예
실시예 1: IL-2 또는 IL15를 발현하도록 유전적으로 변형된 PDC*계통의 계통의 생성.
IL2 (서열번호 1) 및 IL15 (서열번호 2)를 인코딩하는 관심 유전자 서열은 ThermoFischer (https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis.html)에 의해 합성되었고 DH5알파 박테리아 (NEB)의 형질전환 후 플라스미드 증폭을 허용하는 플라스미드에 제공되었다. 관심 서열(IL2 또는 IL15)은 Gibson 어셈블리 기술(Assembly technology) (NEB)을 사용하여 플라스미드 SFG△CD34 (Quintarelli, Blood 2007, Dr. M. Pule에 의해 관대히 제공됨)로 Sal-I와 Mul-I 제한 부위(restriction site) 사이에 서브클로닝(subcloning)되었다. SFG△CD34 플라스미드 (세포질내 도메인 없음)에서 절두된(truncated) CD34 서열의 존재는 관심 유전자를 발현하는 세포의 선택을 허용한다. 레트로바이러스 현탁액은 이후 HEK-293T 계통을 GeneJuice (VWR)의 존재 하에 SFG△CD34-IL2 또는 SFG△CD34-IL15 플라스미드 및 MoMLV gag-pol pEQ-PAM3(-E) 및 RD114 env 발현 플라스미드(Dr. M. Pule 및 Dr. M. Collins (Cosset, J Virol 1995)에 의해 관대히 제공됨)로 3회 형질감염하여 수득되었다.
PDC 계통의 세포를 후속적으로 RetroNectin (Takara)의 존재 하에 IL2 또는 IL15에 해당하는 레트로바이러스 상청액으로 형질도입하고 형질도입 효율을 반영하는, CD34 발현을 측정하였다. 이러한 계통은 PDC 백혈병 환자의 세포에서 유래되었고(Chaperot, Blood 2001), 그 환자로부터 GEN2.2 및 GEN3 계통이 유래되었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 90% 이상의 PDC*계통이 형질도입되었다.
이러한 CD34 발현은 IL2 또는 IL15 유전자의 발현과 관련이 있다. 실제로, RT-qPCR 분석(TaqMan 기술, Roche)은 G6PDH 유전자와 비교하여, IL2 또는 IL15에 대해 각각 20 또는 30 초과의 인자만큼 높은 상대적 발현을 나타낸다(도 2a). 또한, CBA (BD) 또는 ELISA (R&D) 기술을 사용하면, 두 사이토카인 모두가 해당하는 유전적으로 변형된 계통의 상청액에서 가용성(soluble) 형태로 IL2 및 IL15에 대해 각각 20,000 pg/ml 및 2,500 pg/ml의 농도로 생성되는 것으로 밝혀졌다(도 2b).
실시예 2 : 종양 펩타이드가 로딩된 형질도입된 계통과 MNC의 공동 배양 후 CD8+ 림프구의 확장.
변형된 계통의 능력을 이후 HLA-A2+ 건강한 공여자 단핵 세포 (MNC)와의 공동 배양을 사용하여 평가하였다. 요약하면, 유전적으로 변형된 및 변형되지 않은 PDC 계통으로부터의 세포에 멜란-A26L-35 펩타이드를 로딩하고, 조사한 후, 24 웰 플레이트(well plate)에서 MNC와 함께 14일 동안 배양하였다. 웰 당 2 백만 MNC (10/1 또는 20/1)에 상이한 양의 PDC 계통 세포를 첨가하였다. D7에서, 세포는 가용성 IL-2의 존재 하에 멜란-A-로딩된 PDC 계통으로 재자극(restimulating)되었다. D14에서, 항-멜란-A CD8+ 림프구의 확장은 형광 색소 표지된(fluorochrome-labeled) 멜란-A/A2 덱스트라머(dextramer)(다량체) 및, 항-CD3 및 CD8 항체 (Beckman Coulter)를 사용하여 측정된다.
도 3에 제시된 결과는 PDC 계통에 의한 IL2 또는 IL15의 발현이 변형되지 않은 계통보다 더 강한 확장을 허용함을 나타낸다. 이러한 증가는 평균적으로 3.7 이상의 인자이다.
실시예 3 : IL2 또는 IL15에 의해 변형되거나 변형되지 않은 PDC 계통으로 생성된 효과기의 작용성(functionality) : 세포질내 IFNγ 발현.
IL-2 또는 IL15에 의해 형질도입되거나 형질도입되지 않은, 멜란-A-로딩된 PDC 계통의 존재 하에 14일 공동 배양 후 증폭된 T 세포를 멜란-A/A2 덱스트라머(다량체)로 표지(labelling)하고 탈과립(degranulation) 억제제인 GolgiSTOP (Beckton Dickinson)의 존재 하에 4시간 동안 멜란-A-로딩된 T2 표적 계통으로 재자극하였다. 이후 세포를 항-IFNγ 항체 (Becton Dickinson) 및 항-CD3 및 CD8 항체로 표지하였다. 도 4a는 다량체 표지된 세포에 따라 IFNγ 양성 세포의 정보를 나타내는 수득된 표현형(phenotyping)을 나타낸다. 도 4b는 T2/멜란-A 계통(lineage)으로 자극한 경우 멜란-A 특이적 세포(다량체+)만이 IFNγ를 생성함을 나타낸다. 결과는 IL2 또는 IL15를 발현하도록 변형된 PDC 계통의 존재 하에 증폭된 멜란-A-특이적 림프구가 변형되지 않은 계통으로 증폭된 멜란-A-특이적 림프구보다 1.8 내지 2.1배 더 많은 IFNγ를 분비함을 나타낸다.
참조 문헌
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<120> MODIFIED PDC LINE FOR SECRETING A CYTOKINE
<130> IPA210418-FR
<150> FR 1859773
<151> 2018-10-23
<160> 2
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga 462
<210> 2
<211> 489
<212> DNA
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gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480
acttcttga 489
Claims (13)
- 인터류킨 15(interleukin 15; IL 15) 및 인터류킨 2(IL2)로부터 선택된 사이토카인(cytokine)을 발현하도록 유전적으로 변형된(genetically modified) PDC 계통(line)
- 제1항에 있어서, 초기 PDC 계통이 백혈병 형질세포양 수지상 세포(leukemic plasmacytoid dendritic cell)로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형이 바이러스 입자(viral particle)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 단독이 발현되는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항원으로 로딩(loading)되는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 하나 이상의 항원을 발현하도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 항원이 펩타이드 항원인 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조사(irradiating)되는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 항원 특이적 세포(antigen-specific cell)의 시험관 내 증폭(in vitro amplification)을 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따르는 유전적으로 변형된 PDC 계통의 용도.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 요법(therapy)에 사용하기 위한, 유전적으로 변형된 PDC 계통.
- 한 편으로는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따르는 유전적으로 변형된 PDC 계통 및 다른 한 편으로는 항원 특이적 세포를 포함하는, 조합 제품(combination product) 또는 키트(kit).
- 제11항에 있어서, 면역요법(immunotherapy)에 의한 질환의 치료에서 동시에 사용하기 위한, 조합 생산물 또는 키트.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따르는 유전적으로 변형된 PDC 계통 및 이를 투여하기 위한 적합한 비히클(vehicle)을 포함하는 백신(vaccine) 조성물.
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