WO2019031923A2 - miR-150 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물 및 면역 증진제 스크리닝 방법 - Google Patents

miR-150 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물 및 면역 증진제 스크리닝 방법 Download PDF

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Definitions

  • a pharmaceutical composition for enhancing immunological activity comprising an miR-150 inhibitor as an active ingredient and a method for screening an immunostimulating agent
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for enhancing immunological activity comprising an miR-150 inhibitor as an active ingredient and a method for screening an immunostimulating agent. Further, there is provided a method for screening an immunostimulatory agent capable of enhancing immune response by controlling the expression level of miR-150.
  • the memory CD8 + T cell response is one of the most important responses needed to protect the body from clinical illnesses when re-infected with pathogens.
  • Antigen-specific memory CD8 + T cell antagonists have improved memory cell CD8 + T cell proliferative capacity compared to primary CD8 + T cell antagonists, and thus have a specific activity that is faster than the exposure of previously exposed human antigens It can cause strong immune reaction.
  • Specific antigen-specific memory CD8 + T cells differentiate into memory cells, Long-lasting and sustained (John Wherry and Raf i Ahmed, 2004).
  • many studies have been conducted on vaccines for the prevention of infectious agents and cancers. However, many vaccines reported so far have not achieved optimal immunity against pathogenic bacteria due to inefficient development of memory CD8 + T cells. Therefore, a new method is needed for the efficient production of antigen-specific memory CD8 + T cells.
  • the inventors have continued to study for the generation of effective antigen-specific memory CD8 + T cells and have found that memory-specific CD8 + T cell differentiation is promoted in mice lacking specific microRNAs (miRs).
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that the promoted memory CD8 + T cells can effectively protect individuals from viruses or pathogens.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for promoting immunological activity comprising miR-150 (mi cro RNA-150) inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing immunological activity comprising miR-150 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a cancer or infectious disease comprising an miR-150 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of enhancing immunological activity comprising the step of administering a miR-150 inhibitor to a subject.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating cancer or an infectious disease comprising administering to a subject an miR-150 inhibitor.
  • the present invention also provides a method for screening a drug for enhancing immune activity.
  • the present invention showed that the induction of differentiation of memory CD8 + T cells was improved in miR-150 deficient mice. Moreover, it was confirmed that the memory CD8 + T cell differentiation was induced regardless of the type of pathogen in miR-150 deficient mice. Accordingly, a composition comprising a substance that inhibits miR-150 as an active ingredient can be effectively used as an immunostimulating agent in the prevention or treatment of cancer or an infectious disease.
  • Figures la and lb are graphs showing the results of measurement of miR-150-5p expression in P14 cells after acute viral (LCMV) infection.
  • Figure 2 shows the frequency and phenotype of CD8 + T cells in the blood of WT and miR-150 deficient (KO) mice after acute viral infection.
  • MHC histocompatibility complex
  • N 5 / group; * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001).
  • the number of plots represents the percentage of population in the displayed population or each quadrant.
  • the numbers in parentheses indicate the percentage of populations expressing CD127 or CD62L in GP33 cells (FIG. 4).
  • the number of plots represents the proportion of individuals in each quadrant.
  • Figures 6 and 7 show CD8 + T cell differentiation after infection with WT and miR-150 deficient (KO) mice with W-GP33 and LM-GP33 (* ⁇ ⁇ 0.05; ** ⁇ ⁇ 0.01 ; *** ⁇ ⁇ 0.001).
  • the number of plots represents the percentage of the quadrant corresponding to GP33 cells.
  • the bar graph represents the numerical average of the plots.
  • FIGS. 8 to 10 show whether the differentiation of miR-150 K0 mouse blood-borne CD8 + T cells is also present in peripheral tissues.
  • the bar graph represents the average of the numbers of the plots, and ** is pO .01 (FIG. 8).
  • ⁇ 5 / group, and * ⁇ ⁇ 0.05, ** ⁇ ⁇ 0.01 and *** ⁇ ⁇ 0.001.
  • Figures 11a and lib confirm the ability of the effector cytokines to produce when antigen-specific CD8 + T cells were re-exposed on in ro in miR-150 K0 mice.
  • SP means spleen and LG means lung.
  • Figure 12 evaluates the Be 1-2 and expression of granzyme B in GP33 _ and GP276--specific CD8 + T cells.
  • Figure 13 shows the essential role of miR-150 in regulating memory CD8 + T cell differentiation
  • the experimental procedure for the analysis is schematized.
  • the numeral of the plot indicates a percentage.
  • the number of plots represents the number of individuals present in each quadrant, and the numbers in parentheses indicate the percentage of CD127 cells for each donor population.
  • Figure 16 is a further analysis of CD62L expression in donor P14 cells to determine the effect of facilitated CD127 conversion on T EM and T CM formation.
  • 17 is a schematic representation of an experimental procedure to analyze the essential role of miR-150 in regulating memory CD8 + T cell differentiation by a separate metastasis model.
  • Figures 18 and 19 show the effect of single donor cells on WT and miR-150 KO recipient mice (* p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001). In this case, the number of plots in FIG. 19 represents the number of individuals existing in each quadrant.
  • the number of plots in FIG. 21 represents the percentage of donor P14 cells in CD8 + T cells of recipient mice.
  • the number of plots represents the number of individuals present in each quadrant, and the numbers in parentheses represent the percentage of CD127 cells for each donor population.
  • the plot of the plot represents the number of individuals present in each quadrant, and the bar graph represents the percentage (above) and MFI (below) of cytokine expressing cells.
  • FIG. 25 is a diagram illustrating a process of confirming the effect of memory cell differentiation of miR-150 K0 CD8 + T cells on the memory response to an antigen.
  • Figure 27 is a schematic illustration of the process of identifying the ability of memory P14 cells to protect individuals from pathogenic infections.
  • 31 is a diagram illustrating a process for confirming the effect of miR-150 K0-storing CD8 + T cells on tumor progression.
  • Fig. 33 shows the result of confirming a miR-150-target gene encoding a regulatory factor involved in memory CD8 + T cell differentiation.
  • FIG. 34 shows the results of measurement of Foxol expression in P14 cells infected with LCMV Arm in WT P14 and miR-150 K0 P14 mice.
  • FIG. 35 is a diagram illustrating the process of identifying the dynamics of Foxol expression in CD8 + T cells according to the presence or absence of miR-150.
  • FIG. 36 and FIG. 37 show the results of dynamics analysis of Foxol expression in CD8 + T cells depending on the presence or absence of miR-150.
  • the number of plots represents the number of individuals existing in each quadrant.
  • the number of histograms shows the percentage of Foxol and TCF1 cells in P14 cells (*** p ⁇ 0.001).
  • Figure 38 is a graphical depiction of the process of determining whether Foxol and TCFl inhibition is mediated by miR-150.
  • Figure 39 shows the results of confirming whether Foxol and TCFl inhibition are mediated by miR-150.
  • Figure 40 depicts an experimental procedure for transfecting miR-150 K0 CD8 + T cells with Foxol shRNA as a retrovirus.
  • FIG. 41 shows the results of confirming whether inhibition of Foxol affects TCF1 expression.
  • Figure 42 shows the miR-150 binding sequence of Foxola 3 ' UTR using mi croRNA target prediction program.
  • Figure 43 shows the AANAT-reporter system used to determine whether inhibition of the Foxol protein level is due to miR-150 bound to the 3 'UTR of Foxol mRNA.
  • Figures 44 and 45 show the results of confirming whether miR-150 directly inhibits Foxol expression.
  • Figure 46 is a schematic illustration of an experimental procedure for analyzing the effect of Foxol overexpression on memory CD8 + T cell differentiation.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing immunological activity comprising miR-150 (mi cro RNA-150) inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a cancer or infectious disease comprising an miR-150 inhibitor as an active ingredient.
  • miRNAs produce two types of mature miRNAs from precursors: '_3 ⁇ ' or '-5 ⁇ ' when they originate from different arms (3 'arm or 5' arm) of the same pre-mi croRNA. Is added to the rear to name miR-n-3p or miR-n-5p.
  • n is a number and generally indicates a naming sequence.
  • miR-121a and miR-121b were generated from their respective precursors mi r_121a and mi r-121b, and their sequence was also very high similar.
  • miR-121a and miR-121b were generated from their respective precursors mi r_121a and mi r-121b, and their sequence was also very high similar.
  • miR-121a and miR-121b were generated from their respective precursors mi r_121a and mi r-121b, and their sequence was also very high similar.
  • mi r_ represents the pre-miRNA
  • miR- in the upper case represents the mature miRNA.
  • miR-150 used in one embodiment of the invention is hsa mi miR-150-5p, which is a mature miRNA generated from the precursor hsa-mi r-150.
  • the miR-150 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (hsa-miR-150-5p) and SEQ ID NO: 2 (hsa-miR-150-3p) Nucleic acid sequence.
  • miR-150 having the above sequence binds directly to Foxine mRNA, which is a protein involved in memory CD8 + T cell differentiation, inhibits the expression of Fox, And the expression of Foxol was regulated according to the presence or absence of the tumor.
  • cancer &quot refers to a cancer selected from the group consisting of gastric cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myelogenous leukemia, , Salivary gland cancer, and lymphoma.
  • gastric cancer liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myelogenous leukemia, , Salivary gland cancer, and lymphoma.
  • present invention is not limited thereto.
  • infectious disease is intended to encompass all types of infectious diseases including hepatitis B, hepatitis C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, , But is not limited thereto.
  • the invention provides a method of enhancing immune activity comprising administering a miR-150 inhibitor to a subject.
  • the administration may be intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, intranasal, And rectum, but it is not limited thereto.
  • the composition may comprise an aqueous or physiologically compatible body fluid suspension or solution.
  • the carrier or vehicle is physiologically acceptable and can be added to the composition and delivered to the patient, which does not adversely affect the electrolyte of the patient. Therefore, physiological saline can be generally used as a carrier for the preparation.
  • the method of enhancing the immunological activity of the present invention may also include administering another drug or a physiologically active substance having the effect of enhancing the immunological activity in combination with the above pharmaceutical composition so that the route of administration,
  • the dose may be determined depending on the type of disease, the disease state of the patient, the purpose of treatment or prevention, and other drugs or physiologically active substances used in combination.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating cancer or an infectious disease comprising administering to a subject an miR-150 inhibitor.
  • the administration may be carried out through any route selected from the group consisting of intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, intramuscular, intrapulmonary and rectal But is not limited thereto.
  • the method for preventing or treating cancer or infectious disease of the present invention may include administering another drug or physiologically active substance having the effect of preventing or treating cancer or an infectious disease in combination with the above pharmaceutical composition,
  • the route of administration, the time of administration, and the dose may be determined depending on the type of the disease, the disease state of the patient, the purpose of treatment or prevention, and other drugs or physiologically active substances used in combination.
  • the present invention provides a method of identifying a CD8 + T cell, comprising: (a) treating a candidate substance to isolated CD8 + T cells; And (b) selecting the treated candidate substance when the miR-150 expression level in the treated cell is reduced to a significant level as compared with the untreated control.
  • the present invention also provides a method for screening a drug for enhancing immune activity.
  • the present invention provides an immunostimulant that enhances immunity by administering a substance screened by the above-described method to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for cancer or an infectious disease which enhances immunity by administering the screening substance to an individual in need thereof.
  • mice All mice were backcrossed with C57BL / 6J mice for at least 10 generations. All animals were tested and stored in aseptic hospital facilities at the Laboratory Animal Research Center, Yonsei University. P14 transgenic mice, Thyl.l or Ly5.1 congenic mice, and miR-150 K0 (knock-out) mice were purchased from Emory Vaccine Center (Atlanta, GA, USA), POSTECH ), And Korea Biotechnology Research Institute (Daejeon, Korea).
  • mice All C57BL / 6J mice were purchased from the Medical Research Institute of Toko University (Toko, Japan). Male mice, 5 to 6 weeks of age, were used in the experiments. In the case of primary infection, male mice 5-8 weeks of age are treated with LCMV Arm [2 x 10 5 pfu (plaque-forming units)], Listeria monocytogenes [5,000 cfu (colony forming units) And infected with Vaccinia virus (2 X 10 7 pfu) expressing GP33 through the vein.
  • LCMV Arm 2 x 10 5 pfu (plaque-forming units)
  • Listeria monocytogenes [5,000 cfu (colony forming units)
  • Vaccinia virus (2 X 10 7 pfu) expressing GP33 through the vein.
  • mice with memory cells were infected with W-GP33 (2 X 10 7 pfu) or LM-GP33 (5000 cfu). Mice were anesthetized via inhalation of isoflurane.
  • Example 3 Flow cytometry and cell staining
  • Example 6 Cell Isolation and Cell Transplantation
  • CD8 + T cells or P14 cells were isolated by negative selection method of MACS technique (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) to concentrate CD8 + T cells or P14 cells used for in vitro or in vivo analysis.
  • MACS technique Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany
  • the inherent function of miR-150 To analyze, the same number (5,000) of miR-150 K0 P14 cells (Thyl.l + /1.1+) and ⁇ P14 cells (Thyl.l + /1.1 + ) were transfected with miR-150 or WT recipients simultaneously or were each injected into the mice (Thyl.2 + /1.2 +).
  • WT P14 CD8 + T cells (Ly5.1 + ) were isolated from infected WT P14 mice after infection with LCMV Arm 12 hours prior to isolation. (MSCV_Foxol-IRES-Thyl. 1) or retrovirus (MSCV-Thyl. L) containing the Thyl. L gene, including the Foxol and Thyl.l genes, to overexpress Fox in activated WTP14CD8 + Were used to transfect cells in vitro. 5 X 10 4 cells of each group of transfected CD8 + T cells were infected with infectious-matched recipient mice (Thyl.2 +). Example 7.
  • HEK293ft cells (3x10 5 ) were inoculated into 12-well plates with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM; Wei gene Biotech, Seoul, Korea) and cultured overnight. Upon reaching 70% confluence, the FoxRla 3 'UTR coupled miR-150 mimetics (Cat #: MIR 6000; Mirus Bio, Madison, WI, USA) Or an AANAT plasmid containing the miR-150 mutant (5p-UACCGAUACCCUUGUACCAGUG-3p; SEQ ID NO: 3) was co-transfected into the cells. Opti-MEM solution (Gibco; Thermo Fisher Scientific) was also used as a negative control.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • AANAT plasmid containing the miR-150 mutant 5p-UACCGAUACCCUUGUACCAGUG-3p; SEQ ID NO: 3
  • Opti-MEM solution
  • CD8 + T cells isolated from WT, miR-150 K0 or WTP14 mice were stimulated with CD3 / 28 Dynabeads and incubated for 6 or 12 hours with LCMVArm (Gibco; Thermo Fisher Scientific) Lt; / RTI > Activated CD8 + T cells were treated with recombinant retrovirus and mixed by pipetting with polybrene reagent (8 ug / mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA).
  • polybrene reagent 8 ug / mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA.
  • RPMI Roswell Park Memorial Instute
  • FBS fetal bovine serum
  • tissue pieces were obtained from mice infected with LM-GP33 or W-GP33.
  • the spleen and liver of LM-GP33-infected mice were immediately subjected to a NH 4 C1 lysis step using a 1% Triton X100 solution in a Tekmar Lab bag (Seward), and then a single cell suspension was prepared.
  • the suspension of the suspension was agar Plates were plated and incubated overnight at 37 ° C. The bacterial colonies were counted and the titer was calculated as cfu per weight (g) of incised tissue.
  • the ovaries of W-GP33-infected mice were kept in DMEM containing 1% FBS and the tissues were thoroughly homogenized using a homogenizer (Kinematica, Luzern, Switzerland). A dilution of ovary was added to Vero cells and stained, and the plate was gently tilted left and right. The infected Vero cells were covered with agarose gel, and incubated for 72 hours to remove the agar overlay. Then, the Vero cells were stained with a crystal violet solution. Plaques were counted and titered with pfu per body weight (g) of incised tissue.
  • Example 11 Selective immunotherapy of FBL leukemia
  • Tumor-bearing mice were prepared by intraperitoneal inoculation of FBL-Gag leukemia a (5 x 106 cells). Five days later, the mice cyclophosphamide (Cytoxan: 180 mg / kg) treated with, and after 12 hours, in vitro derived memory CD8 + T cells (capacity: 2 x l0 5 cells; low dose: 1 X 10 5 cells ) Into a recipient mouse. Survival monitoring was then performed. To produce in vitro CD8 + T cells, CD8 + T cells were isolated from TCR gag transgenic mice.
  • TCR gag CD8 + T cells were incubated with radioactively treated feeder cells and radioactively treated FBL-leukemia in complete medium (100 U / mL Penicillin / streptomycin, 10 mL 2 ⁇ M L-glutamine, and 30 ⁇ M 2-mercaptoethanol). Every 7 days, CD8 + T cells were stimulated under the same conditions. Five days after the third stimulation, CD8 + T cells prepared in were transplanted into tumor bearing mice for immunotherapy. Example 12. Statistical analysis
  • CD8 + T cells within the target miR-150- dependent down-regulation of the gene is CD8 + T cells does one intensively occur during the initial activation or maintenance of a stable storage banung, not in the effector phase of the peak Respectively.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the frequency of CD8 + and CD4 + T cells was slightly lower in miR-150 0 mice when compared to those observed in WT mice after 8 and 15 days of infection, respectively.
  • the frequency of CD8 + and CD4 + T cells was compared to that observed in WT mice 30 days after infection, the difference was not clear.
  • Experimental Example 1.3 Analysis of the differentiation of virus-specific CD8 + T cells
  • Virus-specific CD8 + T in order to analyze in detail the differentiation response of cells, together with the antibodies to the CD127 and CD62L T cell differentiation markers PBMCs, the major histocompatibility gene complex (MHC) class I restricted Db- GP 33 - 41 ( GP33) and GP 276 - to 286 (GP276) were stained with specific tetrahydro meoro. The 'results are shown in FIG. 3 to FIG.
  • MHC major histocompatibility gene complex
  • the frequency and number of GP33- or GP276-specific CD8 + T cells did not differ significantly between WT and K0 mice until 30 days after infection (FIG. 3).
  • memory / stem-related molecule expression central memory (T CM ): CD127 + CD62L +; Analysis of GP33-specific CD8 + T cells based on effector memory (T EM ): CD127 + CD62L- and effector (T E ): CD127 D62L-] showed that miR-150 K0 mice, A large number of T CM and T EM populations were produced, but fewer T E populations (FIG. 5). This implies that miR-150 deficiency induces improved memory CD8 + T cell differentiation.
  • miR-150 0 mice showed rapid differentiation of CD8 + T cells into memory progenitor cells.
  • W-GP33 and LM-GP33 infections we generated more memory subsets, including T CM and T EM , as compared to WT mice. This means that miR-150 K0 mice stimulate memory CD8 + T cell differentiation regardless of pathogen.
  • IFN- [gamma], TNF- [alpha], and IL-2 expression levels were higher in antigen-specific CD8 + T cells obtained from miR-150 K0 mice as compared to levels observed in WT mice. Specifically, the proportion of IL-2 producing cells from IFN-Y-producing CD8 + T cells was significantly higher in miR-150 K0 mice as compared to those observed in WT mice.
  • miR-150 is because there is a possibility to have multiple targets in a variety of cells, differentiation into storage bulb of miR-150 in K0 mouse CD8 + T cells may be due to the human factor in the CD8 + T cells.
  • transplantation of P14 CD8 + T cells with or without miR-150 in WT or miR-150 K0 mice was performed.
  • WT P14 cells (Thyl.l + / ll + ) and miR-150 K0 P14 cells (Thyl.1 + ) were cultured to differentiate between WT and donor P14 CD8 + T cells derived from miR- / 1.2 + ) were used for other similar genotype markers.
  • WT P14 and miR-150 K0 P14 were transferred to WT or KO recipient mice (Thyl.2 + AL2 + ) at a 1: 1 ratio.
  • the cells were then infected with LCMV Arm. This process is shown in Fig.
  • the ratio of donor cell groups among total CD8 + T cells in blood was measured at post-infection (.i.). The results are shown in Fig. 14 and Fig.
  • CD62L expression was further analyzed in donor P14 cells in order to confirm whether the CD127 conversion promoted in Experimental Example 3.1 above continuously affected the enhancement of T EM and T CM formation. The results are shown in Fig.
  • the ratio of T EM and T CM group was significantly higher in miR-150 KO P14 cells compared to WT P14 cells.
  • WT P14 or miR-150 KO P14 cells were individually dosed into WT and miR-150 KO mice to confirm the effect of single donor cells. This process is shown in FIG. 17, and the results are shown in FIG. 18 and FIG.
  • miR-150 KO P14 cells showed improved T EM and T CM , similar to those observed in WT and miR-150 KO recipient mice when compared to WT P14 cells Respectively.
  • the frequencies of donor WT P14 and miR-150 KO P14 cells in CD8 + T cells were similar between the spleen and lung regardless of recipient mice (FIG. 21).
  • the ratio of CD127 + cells in both tissues was significantly higher in miR-150 KO P14 cells compared to the level of WT P14 cells, which is the result observed in both types of recipient mice 22).
  • the productivity of T CM and T EM groups in peripheral tissues of miR-150 KO P14 mice was superior to that of WT P14 mice.
  • miR-150 KO P14 cells were superior to WT P14 cells in both WT and K0 recipient mice . These results are consistent with the preferential differentiation of na ⁇ ve CD8 + T cells into miR-150 KO P14 cells into memory cells (Fig. 22) and showed a positive correlation between memory phenotype and effector function upon antigen re-exposure .
  • a key feature of memory CD8 + T cell function is that the protection and memory response is improved upon re-exposure to the same antigen.
  • antigen-specific CD8 + T cells in the miR-150 K0 mouse are able to increase the proliferative capacity and the ability of the effector cytokines to be produced, thus resulting in a better CD8 + T cell immune response upon re-exposure to the antigen.
  • Experimental Example 5.1 The effect of miR-150 K0 CD8 + T cell-mediated cell differentiation on memory antagonism of antigens
  • miR-150 KO P14 cells express 7 d.p. i. And 15 d.p. i., up to 9-fold higher than WT P14 cells, indicating a strong proliferative capacity of miR-150 KO P14 cells compared to WT P14 cells.
  • mice were injected with either W-GP33 or LM-GP33 after administering ⁇ memory P14 cells or miR-150 memory P14 cells.
  • the above process is shown in Fig. 27, and the results are shown in Fig. 28 to Fig.
  • miR-150 0 memory P14 cells were administered After receiving W-GP33, the donor cells in the spleen showed a significantly higher frequency of donor cells than the mice receiving WT memory P14 cells (FIG. 28).
  • the reverse transcription of vaccinia virus in the ovaries was lower in mice receiving miR-150 K0 memory P14 cells compared to mice receiving WT memory P14 cells, but the difference was not significant (Figure 29).
  • a decrease in bacterial titers was observed in the spleen and liver of mice bearing miR-150 K0-enriched P14 cells ( Figure 30). This result implies that qualitatively and quantitatively improved memory CD8 + T cells contribute to effective protection against viruses and bacterial pathogens.
  • mice immunized with the miR-150 K0 memory CD8 + T cells prolonged the survival in a dose-dependent manner when compared to mice immunized with WT memory CD8 + T cells.
  • the data showed that memory CD8 + T cell differentiation induced by miR-150 deficiency effectively induced anti-tumor immune responses, effectively protecting mice from tumor progression.
  • Experimental Example 6 Foxol regulation of miR-150 in CD8 + T cells
  • CD8 + T cells were down-regulated by miR-150, and Foxol expression in CD8 + T cells was inhibited by miR-150-mediated inhibition.
  • CD8 + T cells overexpressing Foxol promoted CD127 and CD62L conversion, and differentiated into T CM and T ffl rather than T E.
  • Increased frequency of memory CD8 + T cells by Foxol overexpression was 25 dp. i in the spleen and lung (Figs. 47A and 47B).
  • the accelerated memory phenotype of Foxol-overexpressing WT CD8 + T cells was similar to that of miR-150 K0 CD8 + T cells.

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Abstract

본 발명은 miR-150 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물 및 면역 증진제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, miR-150의 발현량을 조절함으로써, 면역 반응을 증진시킬 수 있는 면역 증진제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 일 실시예들을 통해, miR-150가 결핍된 마우스에서 기억 CD8+ T 세포의 분화 유도가 향상됨을 보였다. 또한, miR-150가 결핍된 마우스에서 기억 CD8+ T 세포 분화는 병원체의 종류에 관계없이 유도됨을 확인하였다. 따라서, miR-150를 저해시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역 증진제로 활용하여 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
miR-150 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물 및 면역 증진제 스크리닝 방법
【기술분야】
본 발명은 miR-150 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물 및 면역 증진제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한， miR-150의 발현량을 조절함으로써， 면역 반웅을 증진시킬 수 있는 면역 증진제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
【배경기술】
기억 CD8+ T 세포 반응은 병원체에 재감염 되었을 시 나타나는 임상 질환으로부터 인체를 보호하는 데 필요한 가장 중요한 반응 중 하나이다. 항원-특이적 기억 CD8+ T세포 반웅은 일차 CD8+ T세포 반웅과 비교하면 기억 CD8+ T 세포 증식 능력이 향상되어 있고 특이적인 활성을 갖기 때문에， 이전에 반웅했던 항원에 인체가 다시 노출될 경우 보다 빠르고 강력한 면역 반웅을 일으킬 수 있다. 특정 항원에 특이적인 기억 CD8+ T 세포가 기억 세포로의 분화 시에 항원 자극이 오래 지속 및 유지되어야 한다 (E . John Wherry and Raf i Ahmed, 2004) . 한편, 감염성 병원체와 암을 예방하기 위한 백신과 관련하여 많은 연구가 이루어져왔으나, 현재까지 보고된 많은 백신은 기억 CD8+ T 세포의 비효율적인 발달로 인해， 병원균에 대한 최적의 면역성을 얻지 못하게 되었다. 따라서， 항원-특이적 기억 CD8+ T 세포의 효율적인 생산을 위해서 새로운 방법이 필요한 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 효과적인 항원-특이적 기억 CD8+ T 세포의 생성을 위해 지속적으로 연구한 결과， 특정 micro RNA(miR)가 결핍된 마우스에서 기억 CD8+ T 세포 분화가 촉진됨을 발견하였다. 또한， 상기 촉진된 기억 CD8+ T 세포가 바이러스 또는 병원체로부터 개체를 효과적으로 보호할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 miR-150(mi cro RNA-150) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 miR— 150 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물올 제공한다.
또한， 본 발명은 miR-150 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 miR-150 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 활성을 증진시키는 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 miR-150 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 (a) 분리된 CD8+ T 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 세포에 miR-150 발현 수준이 미처리 대조군 대비 유의한 수준으로 감소된 경우， 처리된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는， 면역 활성 증진용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
- 또한， 본 발명은 (a) 분리된 CD8+ T 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 세포에 miR-150 발현 수준이 미처리 대조군 대비 유의한 수준으로 감소된 경우， 처리된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는， 암 또는 감염성 질환의 예방또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
【발명의 효과】 본 발명은 일 실시예들을 통해, miR-150가 결핍된 마우스에서 기억 CD8+ T 세포의 분화 유도가 향상됨을 보였다. 또한， miR-150가 결핍된 마우스에서 기억 CD8+ T 세포 분화는 병원체의 종류에 관계없이 유도됨을 확인하였다. 따라서, miR-150를 저해시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역 증진제로 활용하여 암 또는 감염성 질환의 예방또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 la 및 도 lb는 급성 바이러스 (LCMV) 감염 후， P14 세포에서 miR-150-5p 발현을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 급성 바이러스 감염 후， WT 및 miR-150 결핍 (K0)된 마우스의 혈액에서 CD8+ T세포 빈도와표현형을 관찰한 것이다.
도 3 내지 도 5는 PBMCs를 T 세포 분화 마커인 CD127 및 CD62L에 대한 항체와 함께 조직 적합 유전자 복합체 (MHC) 클래스 I Db-제한된 GP33 및 GP276에 특이적인 테트라머로 염색하여 바이러스-특이적인 CD8+ T 세포의 분화 반웅을 분석한 것이다 (n = 5/군; *p<0.05 ; **p<0.01 ; ***p<0.001. ) . 아때， 플롯의 숫자는 표시된 모집단 또는 각 사분면의 모집단의 백분율을 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 GP33 세포 중 CD127 또는 CD62L을 발현하는 개체군의 백분율을 나타낸다 (도 4) . 또한， 도 5에서 플롯의 숫자는 각사분면의 개체 비율을 나타낸다. 도 6 및 도 7은 WT 및 miR-150 결핍 (K0)된 마우스를 W-GP33 및 LM— GP33으로 감염시킨 후， CD8+ Τ 세포 분화를 관찰한 것이다 (*ρ<0.05 ; **ρ<0.01 ; ***ρ<0.001) . 이때, 플롯의 숫자는 GP33 세포에 해당하는 사분면의 백분율 나타낸다. 막대 그래프는 플롯의 숫자 평균을 나타낸다.
도 8 내지 도 10은 miR-150 K0 마우스 혈액 내 기억 CD8+ T 세포의 분화가 말초 조직에도 존재하는지 확인한 것이다. 이때， 막대 그래프는 플롯의 숫자의 평균을 나타내며， **는 pO .01(도 8)이다. 또한， 도 10에서 η = 5/군이며， *ρ<0.05 , **ρ<0.01 및 ***ρ<0.001 이다.
도 11a 및 도 lib는 miR-150 K0 마우스에서 항원-특이적인 CD8+ T 세포가 in ro 상에서 재-노출시， 이펙터 사이토카인의 생성능을 확인한 것이다. 이때， 각 히스토그램의 숫자는 평균 형광 강도 (MFI ) (위)와 양성 집단의 비율 (아래)을 나타낸다 (n = 5/군; *ρ<0.05; **ρ<0.01 ; ***ρ<0 · 001) . 이때, SP는 비장 (spleen)을 의미하고， LG는 폐 ( lung)를 의미한다.
도 12는 GP33_ 및 GP276-특이적인 CD8+ T 세포에서 Be 1-2 및 그랜자임 B의 발현을 평가한 것이다. 이때， 각 히스토그램의 번호는 Bcl-2의 MFI 및 바이러스 특이 CD8 T 세포상의 그랜자임 B 세포의 백분율을 나타낸다 (n = 5/군; *p<0.05 ; **p<0.01 ; ***p<0.001)
도 13은 기억 CD8+ T 세포 분화 조절에 대한 miR-150의 본질적인 역할을 분석하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 14 및 도 15는 miR-150 K0마우스 내 CD8+ T세포의 기억 전구로의 분화가 CD8+ T 세포의 내재적 인자의 변화로부터 유래되는지 확인한 것이다 (n = 5/군; *p<0.05 ; **p<0.01 ; ***p<0.001) . 이때， 도 14에서 플롯의 슷자는 백분율을 나타낸다. 또한， 도 15에서 플롯의 숫자는 각 사분면에 존재하는 개체 수를 나타내며， 괄호 안와 숫자는 각 공여자 개체군에 대한 CD127 세포의 백분율을 나타낸다.
도 16은 촉진된 CD127 전환이 TEM 및 TCM 형성에 미치는 영향 확인하기 위해, 도너 P14 세포에서 CD62L 발현을 추가 분석한 것이다. 이때, 플롯의 숫자는 각 사분면에 존재하는 개체 수를 나타낸다 (n = 5/군; *p<0.05; **p<0.01 ; ***p<0.001) . 도 17은 별도의 전이 모델에 의한 기억 CD8+ T 세포 분화의 조절에서 miR-150의 본질적안역할을 분석하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 18 및 도 19는 WT 및 miR-150 K0 리시피언트 마우스에서 단일 도너 세포의 효과를 관찰한 것이다 (*p<0.05 ; **p<0.01 ; ***p<0.001) . 이때， 도 19에서 플롯의 숫자는 각사분면에 존재하는 개체 수를 나타낸다.
도 20은 기억 전구체 CD8+ T 세포의 형성 및 TEM 및 TCM 집단의 형성이 항원-특이적인 기억 CD8+ T 세포 빈도에 미치는 영향을 확인한 것이다 (n = 5/군; *p<0.05; **p<0.01 ; ***p<0.001) . 도 21 및 도 22는 miR-150-매개된 CD8+ T 세포 분화의 내재적 조절이 CD8+ T 세포의 표현형과 기능에 미치는 영향을 확인한 것이다 (n = 5/군; *p<0.05) . 이때， 도 21에서 플롯의 숫자는 리시피언트 마우스의 CD8+ T 세포 중 도너 P14 세포의 백분율을 나타낸다. 또한， 도 22에서 플롯의 숫자는 각 사분면에 존재하는 개체 수를 나타내며， 괄호 안의 숫자는 각 도너 개체군에 대한 CD127 세포의 백분율을 나타낸다.
도 23 및 도 24는 miR-150의 CD8+ T 세포-특이적 결실이 CD8+ T 세포 이펙터 기능에 미치는 영향을 확인한 것이다 (n = 5/군; *p<0.05 ; **p<0.01) . 이때， 도 23에서, 플롯의 슷자는 각 사분면에 존재하는 개체 수를 나타내며， 막대 그래프는 사이토카인 발현 세포의 백분율 (위) 및 MFI (아래)를 나타낸다.
도 25는 miR-150 K0 CD8+ T세포의 기억 세포 분화가 항원에 대한 기억 반응에 미치는 영향을 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 26은 miR-150 K0 CD8+ T세포의 기억 세포 분화가 항원에 대한 기억 반웅에 미치는 영향을 확인한 것이다 (n = 4 내지 6/군) .
도 27은 병원성 감염으로부터 개체 보호를 위한 기억 P14 세포의 능력을 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 28 내지 도 30은 miR-150 K0 기억 CD8+ T 세포의 바이러스 및 박테리아 병원체에 대한 효과적인 보호능을 나타낸 것이다 (n = 4 내지 6/군) . 도 31은 miR-150 K0 기억 CD8+ Τ세포가종양 진행에 미치는 영향을 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 32는 miR-150 K0 기억 CD8+ T 세포가 종양 진행에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다 (n = 4내지 6/군; ***p<0.001) .
도 33은 기억 CD8+ T 세포 분화에 관여하는 조절 인자를 암호화하는 miR-150-타겟 유전자를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 WT P14 및 miR-150 K0 P14마우스에 LCMV Arm을 감염시키고， P14 세포 내 Foxol 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 miR-150의 존재 여부에 따른 CD8+ T세포 내 Foxol 발현의 역학 관계 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 36 및 도 37은 miR-150의 존재 여부에 따른 CD8+ T 세포 내 Foxol 발현의 역학 관계 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때， 도 36에서， 플롯의 숫자는 각 사분면에 존재하는 개체 수를 나타낸다. 또한， 도 37에서， 히스토그램의 숫자는 P14세포에서 Foxol 및 TCF1 세포의 백분율을 나타낸다 (***p<0.001) .
도 38은 Foxol 및 TCF1 억제가 miR-150에 의해 매개되는지 여부를 확인하는 과정을 도식화한 것이다.
도 39는 Foxol 및 TCF1 억제가 miR-150에 의해 매개되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 40은 miR— 150 K0 CD8+ Τ 세포에 레트로 바이러스로 Foxol shRNA를 형질 도입하는 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 41은 Foxol의 억제가 TCF1 발현에 영향을 미치는지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 mi croRNA 타겟 예측 프로그램을 사용하여 Foxola 3 ' UTR의 miR-150 결합서열을 나타낸 것이다.
도 43은 Foxol 단백질 수준의 억제가 Foxol mRNA의 3 ' UTR에 결합한 miR-150에 의한 것인지를 확인하기 위해 사용한 AANAT-리포터 시스템을 나타낸 것이다.
도 44 및 도 45는 miR-150이 Foxol 발현올 직접적으로 억제하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 기억 CD8+ T세포 분화에 대한 Foxol 과발현의 효과를 분석하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 47a 및 도 47b는 기억 CD8+ T 세포 분화 조절에서 in vivo Fox이의 기능적인 관련성을 관찰한 것이다. 이때， 플롯의 숫자는 각 사분면에 존재하는 개체 수를 나타내며 (도 47a 및 도 47b) , n = 5/군이다 (도 47a) . 또한， 도 47b에서, *p<0.05 , **p<0.01 , 및 ***ρ<0.0()1이다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명은 일 측면으로， miR-150(mi cro RNA-150) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 miR-150 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
miRNA는 전구체 (precursor )로부터 두 종류의 성숙한 miRNA (mature miRNA)가 생성되는데， 동일한 pre-mi croRNA의 서로 다른 arms (3 ' arm 또는 5 ' arm)에서 유래한 경우 ' _3ρ ' 또는 ' -5ρ '를 뒤쪽에 추가하여 miR-n-3p 혹은 miR— n-5p로 명명한다. 이때， n은 숫자이며， 일반적으로 명명한 순서를 나타낸다. 또한， 한두 개의 서열을 제외하고 거의 동일한 서열의 miRNA들은 소문자를 추가하여 명명하는데， 예를 들어， miR-121a와 miR-121b는 각각의 전구체인 mi r_121a와 mi r-121b에서 생성되었으며 서열도 매우 유사하다. 이때， "mi r_"은 pre-miRNA를 나타내며, 대문자가 있는 "miR-"은 성숙한 miRNA를 의미한다. 또한， 종에 따른 miRNA의 명명은 앞쪽에 표기하는데， 예를 들어， hsa-miR-123은 인간 (Homo sapiens) miRNA이고， oar-miR-123은 양 aries) miRNA이다.
본 발명의 일 실시예에서 사용한 miR-150의 정확한 명칭은 hsaᅳ miR-150-5p로서， 전구체인 hsa-mi r— 150으로부터 생성된 성숙한 miRNA이다. 상기 miR-150은 서열번호 l(hsa-miR-150-5p) 및 서열번호 2(hsa-miR-150-3p)의 핵산서열을 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서는， 상기의 서열을 갖는 miR-150이 기억 CD8+ T 세포 분화에 관여하는 단백질인 Fox이의 mRNA에 직접 결합하여 Fox이의 발현을 억제시킴을 확인함으로써， miR-150의 존재 여부에 따라 Foxol 발현이 조절됨을 확인하였다.
본 명세서에서 사용한 용어 "암' '은 위암, 간암， 폐암， 대장암， 유방암， 전립선암， 난소암, 췌장암， 자궁경부암, 갑상선암， 후두암, 급성 골수성 백혈병， 뇌종양， 신경모세포종， 망막 모세포종， 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
또한， 본 명세서에서 사용한 용어 "감염성 질환"은 B형 간염， C형 간염, 인간 파필로마 바이러스 (human papi l loma virus : HPV) 감염， 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환， 및 인플루엔자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 다른 측면으로， miR-150 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 활성을 증진시키는 방법을 제공한다.
이때, 상기 투여는 복강내, 정맥내， 근육내， 피하， 피내， 경구， 비내， 폐내 및 직장내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 약학적 조성물이 비경구적으로 제공되는 경우， 조성물은 수성 (aqueous) 이거나 생리학적으로 적용 가능한 체액 현탁액 또는 용액을 포함할 수 있다. 이에 따라， 담체 또는 운반체 (vehicle)가 생리학적으로 허용 가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있고, 이는 환자의 전해질에 악영향을 끼치지 않는다. 따라서， 제제를 위한 담체로서 일반적으로 생리식염수를 사용할 수 있다.
본 발명의 면역 활성을 증진시키는 방법은 상기 약학적 조성물과 병용하여 면역 활성 증진 효과를 갖는 다른 약물 흑은 생리학적 활성물질을 투여하는 것도 포함할 수 있는데， 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태， 치료 또는 예방의 목적， 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
또한， 본 발명은 miR-150 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방또는 치료하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 투여는 복강내， 정맥내， 근육내， 피하， 피내， 경구， 비내， 폐내 및 직장내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료하는 방법은 상기 약학적 조성물과 병용하여 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질을 투여하는 것도 포함할 수 있는데, 병용 투여의 경로， 투여시기， 및 투여용량은 질병의 종류， 환자의 질병 상태， 치료 또는 예방의 목적， 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
또한， 상기 암 또는 감염성 질환의 예시는 상술한 바와 같으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또 다른 측면으로, (a) 분리된 CD8+ T세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 세포에 miR-150 발현 수준이 미처리 대조군 대비 유의한 수준으로 감소된 경우， 처리된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는， 면역 활성 증진용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 (a) 분리된 CD8+ T세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 세포에 miR-150 발현 수준이 미처리 대조군 대비 유의한 수준으로 감소된 경우, 처리된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 감염성 질환 또는 의 예방또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 또 다른 측면으로， 상술한 방법으로 스크리닝된 물질을 이를 필요로 하는 개체에 투여하여 면역력을 증강시키는 면역 증강제를 제공한다.
또한， 상기 스크리닝 물질을 이를 필요로 하는 개체에 투여하여 면역력을 증강시키는 암또는 감염성 질환 치료제를 제공한다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 동물 연구 윤리
본 발명에서 수행되는 모든 동물 실험은 한국식품의약품안전관리본부 가이드라인에 따라 수행하였다. 또한， 본 발명에서 수행되는 모든 실험의 프로토콜은 연세대학교 동물실험운영위원회 (기관 허가 번호: 2013-0015， IACUC 감독 번호: 201507-32그 02)를 통해 검토 및 승인 받았다. 실시예 2. 동물 및 감염
모든 마우스는 적어도 10세대 동안 C57BL/6J 마우스를 역교배한 것이다. 모든 동물은 연세대학교 실험 동물 연구 센터의 무균 병원 시설에서 실험되었고 보관되었다. P14 유전자 도입 (transgenic) 마우스， Thyl.l 또는 Ly5.1 유사유전자형 (congenic) 마우스, 및 miR-150 K0(knock-out ) 마우스는 Emory Vaccine Center (Atlanta, GA, 미국)， POSTECH (포항， 한국)， 및 한국생명공학연구원 (대전， 한국)으로부터 각각 분양 받았다.
모든 C57BL/6J 마우스는 도코 대학 (도코， 일본)의 의학 연구소에서 구입하였다. 생후 5 내지 6주령 된 수컷 마우스를 실험에 사용하였다. 1차 감염의 경우， 5 내지 8주령 된 수컷 마우스는 LCMV Arm[2 x 105 pfu(plaque-forming units)] , GP33를 발현하는 Listeria monocytogenes [ 5 , 000 cfu(colony forming units)-] , 또는 GP33를 발현하는 백시니아 바이러스 (2 X 107 pfu)로 정맥을 통해 감염시켰다.
기억 반응 (recall response)을 유도하기 위해 , 기억 세포 (memory eel Is)를 받는 개체를 LCMV Arm(2 x 105 pfu) 또는 W-GP33(2 x 107 pfu)로 감염시켰다. 기억 보호 능력에 대한 실험을 위해, 기억 세포를 보유한 마우스를 W-GP33(2 X 107 pfu) 또는 LM-GP33(5000 cfu)로 감염시켰다. 마우스를 아이소플루레인 (isof lurane) 흡입을 통해 마취시켰다. 실시예 3. 유동 세포분석법 및 세포 염색법
PBMC 및 림프구를 수득한 후, 하기의 모노클로날 항체를 사용하여 세포 염색을 수행하였다: 항 -CD4(RM4-5, BD Biosciences (San Jose, CA, 미국)， 항 -CD8(53-6.7, BD BiosciencesCSan Jose, CA, 미국))， 항 -CD44(IM7, BD BiosciencesCSan Jose, CA, 미국))， 항- )90.2(53-2.1， BD BiosciencesCSan Jose, CA, 미국))， 항 -CD127(A7R34, BD Biosciences (San Jose, CA, 미국)) , 항 -Bel— 2(3F11, BD BiosciencesCSan Jose, CA, 미국)；)， 항 -IFN- γ (XMG1.2, BD BiosciencesCSan Jose, CA, 미국)) , 항 _TNF-a(MP6-XT22, BD BiosciencesCSan Jose, CA, 미국 ))， 및 항 -IL- 2 JES6— 5H4, BD BiosciencesCSan Jose, CA, 미국)) · 항 -CD90.K0X-7, BioLegend (San Diego, CA, USA)), 항 -CD45.1(A20, BioLegend (San Diego, CA, USA)) 및 항 -CD62L(MEL-14, BioLegend (San Diego, CA, USA)); 항 -Gzmb(MHGB04, Invitrogen(Carlsbad, CA, 미국)) 및 LIVE/DEAD 고정 가능한 죽은 세포 염색 키트(1 베0꿍61 :^131)3(1， CA, 미국) ) .
LCMV GP33 및 GP276 펩타이드가 접합된 H-2Db의 MHC 클래스 I 테트라머는 항원-특이적인 CD8+ T 세포군을 검출하는데 사용하였다. 제조사의 지침에 따라, Cytofix 고정 /투과 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 세포 내 사이토카인 염색을 수행하였다. 사이토카인을 염색하기 전， 골지 (golgi) 정지 /플러그 용액 (BD Biosciences)의 존재 하에 GP33 또는 GP276 펩타이드로 비장 세포를 5시간 동안 자극하였다. 항 -Foxol(L27) 및 항 -TCF C63D9) 염색을 위해, eBioscience(San Diego, CA, 미국)에서 구입한 고정 /투과 키트를 사용하였다. 유동 세포 분석법은 CANTO II 시스템 (BD Biosciences)을 사용하여 수행하였고, 유동 세포 분석법으로부터 수득한 데이터를 분석하기 위하여 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar, Ashland, OR, 미국)를 사용하였다. 실시예 4. 웨스턴 블롯
단백질 분해 M 버퍼 (로슈, 바젤， 스위스)에서 세포를 용해시켰다: 그 후， 세포 용해물을 10% 도데실황산나트륨 (SDS)-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동 [30%아크릴아마이드 -Bis 용액， 10% SDS용액, 1.5 M Tris HCKpH 8.8)， 1 M TrisHCl(pH6.8), 및 10%과황산암모늄 시그마]한후， 0.45-μΜ폴리비닐리덴 플루오 라이드 전달 막 (Millipore, Billerica, MA, 미국)에 옮겼다. 막을 각각의 항체와 함께 배양한 후， 홀스래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 항 -토끼 또는 항-마우스 IgG를 반응시켰다. 안정적인 퍼옥사이드 용액 및 루미날 (luminal)/인핸서 (enhancer) 용액 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 미국)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
폴리클로날 항-세로토닌 N-아세틸트랜스퍼라아제 AANAT(Abcam, Cambridge, 영국)， 항 -β-액틴 (C4, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 미국), 퍼옥시다아제-결합된 염소 항 -토끼 IgG Thenno Fisher Scientific), 및 항 -Foxol(C29H4; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 미국) 등의 항체를 단백질 검출을 위해 사용하였다. 실시예 5. 실시간정량중합효소연쇄반웅 (PCR)
CD8+ T 세포에서 miR과 mRNA 발현을 측정하기 위해， TRIzol RNA 분리 시약 (Ambion, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. miRs 및 cDNAs는 TaqMan microRNA 역전사 키트 (Applied Biosys terns, Foster City, CA, 미국)와 Transcriptor First-strand cDNA 합성 키트 (Roche)를 사용하여 각각 합성 하였다. 隱 u一 miRᅳ 150_5p의 발현은 TaqMan microRNA assay(Ap l ied Biosystems)를 사용하여 측정하였고/ 내인성 대조군으로 사용되는 U6의 발현량을 통해 표준화하였다. mRNA 발현은 iQ SY,BR Green supermix(Bio-Rad, Hercules, CA, 미국)를 사용하여 평가 하였다. 모든 정량 실시간 PCR은 CFX96 PCR 기기 (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였고， 발현 값은 사이클링 -역치 (-2AACt) 방법을 사용하여 비교 분석함으로써 평가하였다. 실시예 6. 세포분리 및 세포 이식
in vitro 또는 in vivo 분석에 사용하는 CD8+ T 세포 또는 P14 세포를 농축하기 위해 MACS 기술 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일)의 음성 선택 방법으로 CD8+ T 세포 또는 P14 세포를 분리하였다. miR— 150의 내재적인 기능을 분석하기 위해， 동일한 수 (5,000)의 miR-150 K0 P14 세포 (Thyl.l+ /1.2+) 및 Ψΐ P14 세포 (Thyl.l+ /1.1+)를 miR-150 0 또는 WT 리시피언트 (recipient) 마우스 (Thyl.2+ /1.2+)에 동시 또는 각각주입하였다.
in vivo상에서 Foxol 및 TCF1 발현을 측정하기 위해, miR-150 K0 및 Ψΐ P14 마우스로부터 동일한 수의 3x l06CD8+T세포를 각각의 리시피언트 마우스에게 정맥 내로 주사하였다. LCMV 및 W-GP33 감염에 대한 기억 반웅을 분석하기 위해， 리시피언트 마우스 각각에 5,000개 또는 5 X 104개의 기억 P14 세포를 주입하였다. 기억 P14 세포의 보호 능력을 분석하기 위해， 동일한 수 (5 X 104개)의 기억 P14 세포를 리시피언트 마우스에게 정맥 주사하였다.
in vivo 상에서 CD8+ T 세포 분화시 Fox이의 기능을 조사하기 위해， 분리 12시간 전에 LCMV Arm을 감염시킨 후, 감염된 WT P14 마우스로부터 WT P14 CD8+ T 세포 (Ly5.1+)를 분리하였다. 활성화된 WTP14CD8+T세포에서 Fox이을 과발현 시키기 위해， Foxol 및 Thyl.l 유전자를 포함하는 레트로바이러스 (MSCV_Foxol-IRES— Thyl.1) 또는 Thyl.l 유전자를 포함하는 레트로바이러스 (MSCV-Thyl.l)를 이용하여 in vitro 상에서 세포를 형질 감염시켰다. 형질 감염된 CD8+ T 세포 각 군의 5 X 104 세포를 감염된 (infect ion-matchd) 리시피언트 마우스 (Thyl.2+)에게 주입하였다. 실시예 7. 기억 CD8+ T세포 생성 in vivo 상에서 기억 CD8+ T 세포를 생성하기 위해， miR-150 K0 또는 FT 마우스로부터 수득한 동일한 수의 나이브 P14 세포 (5,000개)를 WT 또는 miR-150 R0 리시피언트 마우스에 정맥 내로 주사한후, LCMVArm(2x 105pfu)로 감염시켰다.30일 후， MACS를 통해 총 CD8+ T 세포를 분리하였고, FACS LSR II 1 분류 시스템 (BD Biosciences)을 사용하여 대량의 CD8+ T 세포로부터 기억 세포를 선별하였다. 각 세포 군의 순도는 FACS에 의해 >90%로 나타났다. 실시예 8. NAT-리포터 분석
HEK293ft 세포 (3x 105 개)를 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM; Wei gene Biotech, 서울， 한국)이 있는 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 70% 컨플루언스 (confluence)에 도달하면， 제조사의 프로토콜에 따라 TransIT_X2(Cat #： MIR 6000； Mirus Bio, Madison, WI , USA)를 사용하여， FoxRla 3' UTR이 결합된 miR-150 모방체 또는 miR-150 ·돌연변이체 (5p-UACCGAUACCCUUGUACCAGUG-3p; 서열번호 3)를 포함하는 1 의 AANAT 플라스미드를 세포에 동시 형질 감염시켰다. 또한 Opti-MEM 용액 (Gibco; Thermo Fisher Scientific)을 음성 대조군으로 이용하였다. 실시예 9. 레트로바이러스준비 및 세포 형질 도입
miR-150 및 Foxol shRNA의 과발현을 위해， Rafi AhmedCEmory Vaccine Center)로부터 MSCV-IRES-Thyl.1 및 pMKO .1-Thyl .1 레트로바이러스 백터를 구입하였다. Foxol shRNA는 pMKO.1-Thyl.1에 클로닝되었다. Addgene에서 구입한 백터로부터의 비번역 부위 (200 bp) 또는 Foxol 코딩 서열을 포함하는 miR-150는 MSCV-IRES-Thyl.1에 클로닝되었다. 레트로바이러스 유전자의 형질 전환을 위해， WT, miR-150 K0마우스 또는 WTP14마우스에서 분리된 CD8+T세포를 CD3/28 Dynabeads로 자극하였고， LCMVArm(Gibco; Thermo Fisher Scienti fic)으로 6시간또는 12시간 동안 감염시켰다. 활성화된 CD8+ T 세포를 재조합 레트로바이러스로 처리하였고， 폴리브렌 시약 (8 ug/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국)으로 파이펫팅하여 섞어주었다. CD8+ T 세포를 형질 전환시키기 위해， 세포를 1800 의 속도로 90분 동안 37 에서 원심 분리하였다. 원심 분리 후， 상층액을 제거하였고 세포를 2% 소태아 혈청 (FBS)이 보층된 Roswell Park Memorial Inst itute(RPMI ) 1640 배지로 세척하였다. 실시예 10. 적정
조직 적정 (titration)을 수행하기 위해, LM-GP33 또는 W-GP33에 감염된 마우스로부터 작은 조직 조각을 수득하였다. LM-GP33 감염된 마우스의 비장 및 간은 즉시 Tekmar Lab bag(Seward)에 있는 1% Triton X100 용액을 사용하여 NH4C1 용해 단계를 거친 후， 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 상기 현탁액의 회석액을 한천 플레이트에 도말하고 37°C에서 밤새 배양하였다. 박테리아성 콜로니를 계수하고, 절개된 조직의 중량 (g) 당 cfu로 역가를 계산하였다. W-GP33-감염된 마우스의 난소를 1% FBS가 포함된 DMEM에 보관하고， 균질기 (Kinemat ica, Luzern, 스위스)를 사용하여 조직을 완전히 균질화하였다. 난소의 희석액을 Vero 세포에 첨가하여 도말하였으며， 상기 플레이트를 부드럽게 왼쪽과 오른쪽으로 기울여주었다. 감염된 Vero 세포를 아가로오즈 겔로 덮어씌우고， 72시간 배양 후 한천 오버레이 (over lay)를 제거하였다. 그리고， 상기 Vero 세포를 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크 (plaques)를 계수하고, 절개된 조직의 체중 (g) 당 pfu로 역가를 계산하였다. 실시예 11. FBL 백혈병의 선택적 면역요법
종양 보유 마우스는 FBL-Gag 백혈병 ( leukemi a) (5 x 106 세포)을 복강내 접종하여 제조하였다. 5일 후， 마우스를 사이클로포스파마이드 (Cytoxan: 180 mg/kg)로 처리하고， 12시간후， in vitro유래 기억 CD8+ T세포 (고용량: 2 x l05 세포; 저용량: 1 X 105 세포)를 리시피언트 마우스에 넣어주었다. 이후， 생존 모니터링을 수행하였다. in vitro상에서 기억 CD8+ T세포를 제조하기 위해， CD8+ T세포를 TCRgag 형질 전환 마우스로부터 분리하였다. TCRgag CD8+ T 세포를 방사능 처리된 피더 ( feeder) 세포 및 방사능 처리된 FBL-백혈병과 함께 완전 배지 (100 U/mL 페니실린 /스트렙토마이신， 10 mL 2 μΜ L-글루타민， 및 30 μΜ 2-머랍토에탄올이 보충된 RPMI 1640)에서 배양하였다. 매 7일마다, CD8+ Τ세포를 동일한조건으로 자극하였다. 3번째 자극을 한지 5일 후， 면역요법을 위해 in 에서 제조된 CD8+ T 세포를 종양 보유 마우스에 이식하였다. 실시예 12. 통계 분석
대부분의 데이터는 GraphPad Pr i sm 5 소프트웨어 (GraphPad Software , LaJol la , CA, 미국)를 사용한 양측 분포로 Student's t 검정을 사용하여 분석하였다. p < 0.05는 생존 그래프를 제외한 실험에서 변화에 대해 유의한 것으로 간주한다. 생존 그래프는 log-rank test (Mantel— Cox)를 사용하여 분석하였다. 실험예 1. 급성 바이러스 감염 후 miR-150 결핍에 따른 기억 전구체 CD8+ T 세포의 생성능 평가
실험예 1.1. 항원-특이적 CD8+ T세포 내 miR-150의 발현 평가
T 세포 분화 동안 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 miR-150의 발현을 평가하기 위해， H-2Db 분자에 의해 제시된 TCR-인식' 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV) GP33 펩타이드를 발현하는 P14 CD8+ T 세포를 나이브 마우스에 넣어준 후, LCMV 암스트통 (Arm)로 마우스를 감염시켰다. 바이러스 감염 후， P14 세포에서 miR-150_5p 발현을 측정하였다. 그 결과를 도 la 및 도 lb에 나타내었다.
도 la 및 도 lb에 나타난 바와 같이， miR-150-5p는 이미 나이브 CD8+ T 세포에서 높은 수준으로 발현되었지만， 주효 세포 (ef fector cel l )에서 빠르게 하향 조절되었다. 또한， 기억 CD8+ T 세포에서， CD8+ T 세포 내 타겟 유전자의 miR-150-의존성 하향 조절은 CD8+ T 세포 반웅의 초기 활성화 또는 안정적인 기억 유지 동안 집중적으로 발생하나, 이펙터 단계의 최고점에서는 그렇지 않음을 보였다.
실험예 1.2. in wVo상에서 miR-150의 역할 확인
급성 바이러스 감염시， CD8+ T 세포 분화에서 miR-150의 in vivo 상에서의 역할을 확인하기 위해， WT와 miR-150 K0 마우스를 모두 LC V 바이러스로 감염시킨 후 혈액에서 CD8+ T 세포 빈도와 표현형을 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이， 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs) 내 총 CD8+ 및 CD4+ T세포의 백분율은 급성 바이러스 감염에 따라 변하였다. 또한， CD8+ 및 CD4+ T 세포의 빈도는 감염된 지 각각 8일 및 15일 후 WT 마우스에서 관찰된 것과 비교하였을 때 miR-150 0 마우스에서 약간 낮았다. 그러나， 감염된 지 30일 후， CD8+ 및 CD4+ T세포의 빈도를 WT마우스에서 관찰된 것과 비교하였을 때에는 차이가 뚜렷하지 않았다. 실험예 1.3. 바이러스 -특이 CD8+ T세포의 분화 반웅 분석
바이러스 -특이 CD8+ T 세포의 분화 반응을 자세하게 분석하기 위해， PBMCs를 T 세포 분화 마커인 CD127 및 CD62L에 대한 항체와 함께， 주요 조직 적합 유전자 복합체 (MHC) 클래스 I Db-제한된 GP33-41(GP33) 및 GP276-286(GP276)에 특이적인 테트라머로 염색하였다. 그'결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
도 3 내지 도 5에 나타난 바와 같이， GP33— 또는 GP276^ 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도 및 수 (absolute number )는 감염된 지 30일까지는 WT와 K0 마우스 간에 큰 차이가 없었다 (도 3) . 또한, miR-150 K0 마우스는 LCMV 감염 후 WT 마우스에서 관찰된 것과 비교했을 때， GP33_에 특이적인 CD127+ 또는 CD62L+ CD8+ T 세포의 빈도와 수를 현저하게 증가시켰다 (도 4) . 뿐만 아니라， 기억 /주효 -연관 분자 발현 [중앙 기억 (TCM) : CD127+CD62L+ ; 이펙터 기억 (TEM) : CD127+CD62L—； 및 이펙터 (TE) : CD127 D62L— ]에 근거한 GP33-특이적인 CD8+ T 세포에 대한 분석 결과 miR-150 K0 마우스가 WT 마우스와 비교했을 때， 많은 수의 TCM과 TEM 개체군을 생산했지만 TE 개체군은 적게 생산하였다 (도 5) . 이는 miR-150 결핍이 개선된 기억 CD8+ T 세포 분화를 유도함을 의미한다.
실험예 1.4. miR-150-결핍시 CD8+ T세포의 기억 -프론 분화유도 여부 확인 miR-150-결핍이 다른 급성 병원체에 감염된 마우스에서 관찰된 CD8+ T세포의 기억 -프론 (prone) 분화를 유도하는지 여부를 확인하기 위해， 마우스를 LCMV Arm 대신에 백시니아 바이러스 (W-GP33) 및 Listeria w( ocy i e 7es(LM— GP33)로 감염시켰다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이， LCMV Arm 감염과 유사하게， miR-150 0 마우스는 CD8+ T 세포의 기억 전구 세포로의 빠른 분화를 보였다. 또한， W-GP33 및 LM-GP33 감염의 경우， WT 마우스와 비교하였을 때 TCM 및 TEM을,포함한 더 많은 메모리 집단 (subset )을 생성하였다. 이는 miR-150 K0 마우스가 병원체에 관계없이 기억 CD8+ T 세포 분화를 촉진한다는 것을 의미한다.
결론적으로, 상기 실험예 1. 1 내지 1.4의 결과는 miR-150 결핍이 급성 바이러스 및 박테리아 감염 후 기억 CD8+ T 세포 분화에 유리하다는 것을 나타내었다. 실험예 2. miR-150 결핍시 말초 조직에서 기억 CD8+ T 세포로의 분화 촉진 확인
실험예 2.1. miR-150 K0마우스 혈액에서 관찰된 기억 CD8+ T세포의 분화가 말초 조직에서도 관찰되는지 여부 확인
miR-150 K0 마우스 혈액에서 관찰된 촉진된 기억 CD8+ T 세포 분화가 말초 조직에도 관찰되는지， 특히 감염 후기 (감염 이후 1개월) 동안에 관찰되는지를 확인하였다. CD8+ T 세포 반응이 바이러스 에피토프-특이적인 현상이라는 가능성을 배제하기 위해， GP276에 특이적인 테트라머를 사용하였다. 그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다.
도 8 내지 도 10에 나타난 바와 같이， CD8+ T 세포 중， GP33 및 GP276— 특이적인 세포의 비율 및 그들의 비장 및 폐 내에서의 수는 WT 및 K0 마우스간에 차이가 없었지만 (도 8 및 도 9)， GP33" 및 GP276 특이적인 CD8+ T 세포 중 CD127+ 또는 CD62L+ 군은 WT 마우스와 비교했을 때 miR-150 K0 마우스의 두 조직 모두에서 상당히 높았다 (도 10) . 특히， 항원-특이적인 CD8+ T 세포 중 TCM 군의 빈도와 수는 WT마우스와 비교하였을 때 miR-150 K0마우스의 두 조직에서 현저히 높았다.
실험예 2.2. in vitro상에서 재노출시， miR-150 K0마우스 내 항원-특이적인 CD8+ T세포의 이펙터 사이토카인 생성능 확인
현재까지 보고된 연구는 기억 CD8+ T 세포가 TEM 또는 세포에서 관찰되는 능력에 관한 동일한 항원으로 재자극할 때， 인터페론 ( IFN)- Y , 종양 과사 인자 (TNF)- a , 및 IL-2와 같은 이펙터 사이토카인을 생산하는 향상된 능력을 보임을 입증하였다. WT마우스와 비교했을 때， miR-150 K0마우스에서 높은 TCM세포 군이 관찰되었기 때문에， miR-150 K0 마우스에서 항원-특이적인 CD8+ T 세포가 in vitro 상에서 재노출시 이펙터 사이토카인의 생성에 대해 향상된 기능을 나타내는지에 대해 확인하였다. 그 결과를 도 11a 및 도 lib에 나타내었다.
도 11a 및 도 lib에 나타난 바와 같이， IFN- γ， TNF- α , 및 IL-2 발현 수준은 WT 마우스에서 관찰된 수준과 비교하였을 때， miR-150 K0 마우스에서 수득한 항원-특이적인 CD8+ T 세포에서 더 높았다. 구체적으로, IFN- Y -생성 CD8+ T 세포로부터의 IL-2 생성 세포의 비율은， WT 마우스에서 관찰된 것과 비교했을 때 miR-150 K0마우스에서 유의하게 더 높았다.
실험예 2.3. 증가된 메모리 표현형이 생존 및 세포독성에 미치는 영향 확인 증가된 메모리 표현형이 생존률 향상 및 세포 독성의 감소와 관련이 있음을 확인하기 위하여， GP33— 및 GP276— 특이적인 CD8+ T세포에서 Bcl-2 및 그랜자임 B의 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이， miR-150 K0 마우스의 CD8+ T 세포에서 관찰된 메모리 -프론 표현형과 관련하여， Bcl-2 발현은 WT 마우스에서 관찰된 수준과 비교했을 때， miR-150 K0마우스의 항원-특이적인 CD8+ T세포에서 더 높은 수준으로 증가하였다. 반면， 그랜자임 B 발현은 miR-150 K0마우스에서 더 낮았다.
결론적으로， 상기 실험예 2의 결과는 miR-150 결핍이 기억 CD8+ T 세포 분화를 촉진시키고 말초 조직에서 강력한 이펙터 기능을 부여한다는 것을 의미한다. 실험예 3. miR-150의 CD8+ T세포 분화조절 여부 확인
실험예 3.1. miR-150 K0마우스 내 CD8+ T세포의 기억 전구로의 분화가 CD8+ T 세포의 내재적 인자의 변화로부터 유래되는지 확인
miR-150은 다양한 세포에서 여러 타겟을 가질 가능성이 있으므로, miR-150 K0 마우스 내 CD8+T세포의 기억 전구로의 분화는 CD8+T세포의 내인적 요소에 기인할 수 있다. 이러한 점을 확인하기 위해， WT 또는 miR-150 K0 마우스에 miR— 150을 포함하거나 포함하지 않는 P14CD8+T세포의 이식을 수행하였다. 상기 실험에서, WT 및 miR-150 K0마우스 유래 도너 (donor) P14 CD8+ T세포를 구별하기 위해， WT P14 세포 (Thyl.l+/l.l+)와 miR-150 K0 P14 세포 (Thyl.1+/1.2+)에서 다른 유사유전자형 마커를 사용하였다. WT P14 및 miR-150 K0 P14를 1:1 비율로 하여 WT 또는 K0 리시피언트 마우스 (Thyl.2+AL2+)에 전달하였다. 이후， LCMV Arm으로 감염시켰다. 이 과정을 도 13에 나타내었다. 또한， 각 도너 P14 군의 빈도와 표현형을 비교하기 위해， 혈중 총 CD8+ T세포 중 각 도너 세포 군의 비율을 감염 후 (post infection, .i.) 다른 시점에서 측정하였다. 그 결과를 도 14및 도 15에 나타내었다.
도 14및 도 15에 나타난 바와 같이， 각 p.i.에서 CD8+T세포 중 miR-150 K0 P14세포의 백분율이 WT P14세포보다 약간 낮지만， WT P14세포 및 miR-150 0 P14 세포는 유사한 운동 프로파일 (kinetic profiles)을 나타내었다 (도 14). 그러나， CD127 전환율은 WT P14 세포에서 관찰된 것과 비교하였을 때 miR-150 0 P14 세포에서 크게 가속화되었으며， WT 및 miR-150 K0 리시피언트 마우스에서 모두 관찰되었다 (도 15). 실험예 3.2. CD127 전환율 향상이 및 TCM 형성에 미치는 영향 확인
상기 실험예 3. 1에서 촉진된 CD127 전환이 TEM 및 TCM 형성의 강화에 지속적으로 영향을 미치는지 확인하기 위하여， 도너 P14 세포에서 CD62L 발현을 추가 분석하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이， WT 및 miR-150 K0 리시피언트 마우스에서， WT P14 세포와 비교했을 때 miR-150 KO P14 세포는 TEM 및 TCM군의 비율이 유의하게 높게 나타났다.
실험예 3.3. 단일 도너 세포의 효과 확인
상기 WT 및 miR-150 K0 리시피언트 마우스에서， 단일 도너 세포의 효과를 확인하기 위하여， WT P14 또는 miR-150 KO P14 세포를 WT 및 miR-150 KO 마우스에 개별적으로 넣어주었다. 상기 과정을 도 17에 나타내었고， 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.
도 18 및 도 19에 나타난 바와 같이， miR-150 KO P14 세포는 WT P14 세포와 비교하였을 때， WT 및 miR-150 K0 리시피언트 마우스에서 관찰된 것과 유사하게， TEM 및 TCM이 향상된 것을 확인하였다. 또한， 분화 동안 항원-특이적인 CD8+ T 세포에서 miR-150의 내재적 역할을 확인하였다.
실험예 3.4. 기억 전구체 CD8+ T 세포의 형성 및 M 및 TCM의 형성이 항원-특이적인 기억 CD8+ T세포 빈도에 미치는 영향 확인 기억 전구체 CD8+ T 세포의 형성 및 ΤΕΜ 및 TCM의 형성 강화가 항원-특이적인 기억 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는지 여부를 확인하였다. 두 개의 다른 도너 세포 (WT P14 및 miR-150 KO P14 세포)를 WT 리시피언트 마우스에 공동 전이 (co-transfer)시키고 LCMV Arm 감염시킨 후， 혈액에서 CD8+ T세포 중 WT P14 및 miR-150 KO P14 세포의 빈도를 측정하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타난 바와 같이， 감염된 지 30일 이전에는 miR-150 KO P14 세포의 빈도가 WT P14 세포에서보다 약간 낮았으나， 그 시점부터 추세갸 바뀌어 빈도는 더 높은 수준으로 유지되었다. 상기 결과에서 miR-150 KO CD8+ T 세포에서 관찰된 메모리 -프론 표현형이 기억 CD8+ Τ 세포로 우선적으로 분화가 일어나며， 그 후 이들이 장기간유지됨을 확인하였다. 실험예 4. miR— 150이 말초 조직에 존재하는 CD8+ T 세포의 분화 및 기능 조절에 미치는 영향 확인
실험예 4.1. miR-150-매개된 CD8+ T세포분화의 내재적 조절이 CD8+ T세포의 표현형과 기능에 미치는 영향 확인
miR-150-매개된 CD8+ T 세포 분화의 내재적 요인이 감염 후 말초 조직에서 CD8+ T세포의 표현형과 기능에 영향을 미치는지를 조사하였다. 30 d .p . i (days post infect ion)에 비장과 폐에서 CD8+ T 세포의 빈도， 표현형 및 사이토카인 생산을 평가하였다. 상기 실험에서， WT P14 및 miR-150 KO P14 세포를 WT 또는 miR-150 K0 리시피언트 마우스에 공동 전이시켜 표현형 및 기능적으로 분석하였다. 그 결과를 도 21 및 도 22에 나타내었다.
도 21 및 도 22에 나타난 바와 같이 , CD8+ T세포 중 도너 WT P14 및 miR-150 KO P14 세포의 빈도는 리시피언트 마우스와 관계없이 비장과 폐 사이에서 유사하게 나타났다 (도 21) . 그러나， 상기 두 조직에서 CD127+ 세포의 비율은， WT P14 세포의 수준과 비교했을 때, miR— 150 KO P14 세포에서 유의하게 높았으며， 이는 두 유형의 리시피언트 마우스 모두에서 관찰된 결과이다 (도 22) . miR-150 KO P14 마우스의 말초 조직에서의 TCM 및 TEM군의 생성능은 WT P14마우스보다우수하였다.
실험예 4.2. miR-150의 CD8+ T세포-특이적 결실이 CD8+ T세포 이펙터 기능에 미치는 영향 확인
상기 실험예 2.2에서는 WT 마우스보다 miR-150 K0 마우스에서 생성된 항원-특이적인 기억 CD8+ T 세포가 이펙터 사이토카인을 생산하는 능력이 더 우수함을 확인하였다. 따라서， miR-150의 CD8+ T 세포-특이적 결실이 miR-150의 전체 (whole-body) 결실 후 관찰된 CD8+ T 세포의 이펙터 사이토카인 생산능과 유사한 결과를 나타내는지 여부를 조사하였다. 그 결과를 도 23 및 도 24에 나타내었다.
도 23 및 도 24에 나타난 바와 같이， in vitro 상에서 GP33 펩타이드로 재-자극시， IFN-γ 생성 세포의 빈도 및 IFN-γ의 발현 수준은 WT P14 및 miR-150 K0 P14 세포간에 차이가 없었으며， TNF- α 발현은 WT P14 세포에 비해 miR-150 O P14 세포에서 상당히 높았다 (도 23) . 특히， IL-2 생성 세포의 빈도와 IL-2 발현 수준은 WT P14 세포보다 miR-150 KO P14 세포에서 극적으로 증가하였다. IFN- γ， TNF- a 및 IL-2와 같은사이토카인을 동시에 생산하는 다기능 CD8+ T세포의 생성에 관하여， WT 및 K0 리시피언트 마우스 모두에서 miR-150 KO P14 세포가 WT P14 세포보다 우수하다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는 나이브 CD8+ T 세포의 miR-150 KO P14 세포 내 기억 세포로의 우선적인 분화와 일치하고 (도 22) 항원에 재-노출시 기억 표현형과 이펙터 기능 사이의 양의 상관 관계를 나타내었다.
결론적으로， 상기 결과는 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 miR-150 결핍이 기억 CD8+ T세포의 생성을 증진 시킨다는 것을 의미한다. 실험예 5. miR-150 결핍된 기억 CD8+ T 세포가 병원균 및 암에 대한 기억 반웅이 향상되는지 확인
기억 CD8+ T 세포 기능의 주요 특징은 동일한 항원에 재노출시 보호 기능 및 기억 반응이 향상시키는 것이다. 따라서， miR-150 K0 마우스 내 항원—특이적인 CD8+ T 세포는 증식 능력 및 이펙터 사이토카인의 생산능이 향상되므로， 항원에 대한 재노출시 더 우수한 CD8+ T세포 면역 반응이 증가할 수 있다. 실험예 5.1. miR-150 K0 CD8+ T 세포의 기억 세포 분화가 항원에 대한 기억 반웅에 미치는 영향확인
miR-150 KO CD8+ T 세포의 기억 세포로의 분화가 이전에 노출된 항원에 대해 개선된 기억 반웅을 촉진한다는 것을 입증하기 위하여， WT P14 및 miR-150 KO P14 세포를 동시에 투여한 후 IXMV Arm을 감염시켰다. 그리고, 30 d.p. i .에 두 종류의 P14세포를 분리하였다. P14 세포의 각 세트를 동일한 바이러스 (LCMV)로 감염시키고 7 d.p . i . 및 15 d.p . i .에 각 나이브 마우스에 투여하였다. 상기 과정을 도 25에 나타내었고， 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타난 바와 같이， miR-150 KO P14 세포는 7 d.p. i . 및 15 d.p. i .에 WT P14 세포에 비해 최대 9배 더 높은 증가를 나타내었고， 이는 WT P14 세포와 비교했을 때 miR-150 KO P14 세포의 강력한 증식 능력을 나타낸다.
실험예 5.2. 병원성 감염으로부터 개체 보호를 위한 기억 P14 세포의 능력 확인
병원성 감염에 대해 개체를 보호하기 위한 기억 P14 세포의 능력을 평가하기 위하여， 마우스에 ¥ΐ 기억 P14 세포 또는 miR-150 기억 P14 세포를 투여한 후 W-GP33 또는 LM-GP33로 접종하였다. 상기 과정을 도 27에 나타내었고， 그 결과를 도 28 내지 도 30에 나타내었다.
도 28 내지 도 30에 나타난 바와 같이， miR— 150 0 기억 P14 세포를 투여 받은 후 W-GP33 접종된 마우스는 WT 기억 P14 세포를 투여 받은 마우스보다 비장에서 도너 세포의 빈도가 유의하게 높음을 보였다 (도 28) . 또한， 난소에서 백시니아 바이러스의 역가는 WT 기억 P14 세포를 투여 받은 마우스와 비교했을 때 miR-150 K0 기억 P14 세포를 투여 받은 마우스에서 더 낮았으나， 그 차이는 유의하지 않았다 (도 29) . LM-GP33 접종의 경우, miR-150 K0 기억 P14 세포를 보유한 마우스의 비장과 간에서 박테리아 역가의 감소가 관찰되었다 (도 30) . 상기 결과는 질적 및 양적으로 향상된 기억 CD8+ T 세포가 바이러스 및 박테리아 병원체에 대한 효과적인 보호에 기여함을 의미한다.
실험예 5.3. miR-150 0기억 CD8+ T세포가종양진행에 미치는 영향 확인 miR-150 K0 기억 CD8+ T 세포가 마우스의 종양 진행 예방에 기여하는지 여부를 확인하기 위하여， FBL-Gag 백혈병 종양 모델을 사용하였다. FBL-Gag 종양 세포를 나이브 마우스에 접종하였고, 5일 후， 마우스를 사이톡산 (Cytoxan)으로 전처리하였다. 12시간 후， 종양 세포-접종된 마우스에 in vitro 배양으로부터 생성된 기억 CD8+ T 세포를 투여하였다. 상기 과정을 도 31에 나타내었고, 그 결과를 도 32에 나타내었다.
도 32에 나타난 바와 같이， 상기 miR-150 K0 기억 CD8+ T 세포로 면역화된 마우스는 WT 기억 CD8+ T 세포로 면역화된 마우스와 비교하였을 때 용량 -의존적으로 생존 기간이 연장되었다. 상기 데이터는 miR-150 결핍에 의해 유도된 기억 CD8+ T 세포 분화가 효과적으로 항 -종양 면역 반응을 유도함으로써， 종양 진행으로부터 마우스를 효과적으로 보호함을 나타내었다. 실험예 6. miR-150의 CD8+ T세포 내 Foxol조절
실험예 6.1. 기억 CD8 T+ 세포 분화에 관여하는 조절 인자를 암호화하는 miR-150-타겟 유전자 확인
여러 miR-타겟 예측 프로그램을 사용하여 기억 CD8 T+ 세포 분화에 관여하는 조절 인자를 암호화하는 miR-150-타겟 유전자를 스크리닝하였다. 그 결과를 도 33에 나타내었다.
in vitro및 in vivo자극 후에， miR-150은 CD8+ T세포에서 점진적으로 하향 조절되기 때문에， miR-150 타겟된 유전자의 발현은 WT CD8+ T 세포 내 단백질 수준에서 감소할 가능성이 높으나， 활성화 초기에는 miR-150 K0 CD8+ T 세포에서는 그렇지 않았다. 도 33에 나타난 바와 같이， WT 및 miR-150 K0 마우스로부터 정제된 나이브 CD8+ T세포의 in vitro상의 폴리클로날 TCR자극 후， 신호 전달 경로 유도 기억 전구 물질 중， Foxol 단백질의 발현이 WT CD8+ T 세포에서 점차적으로 하향 조절된 반면， 이 수준은 in vitro 활성화 후 3일까지 miR-150 K0 CD8+ T 세포에서 급격히 증가하였음을 확인하였다. 실험예 6.2. CD8+ T세포 내 miR-150—의존 Foxol조절 확인
in vivo 상에서 CD8+ T 세포 내 miR-150-의존 Foxol 하향조절이 관찰될 수 있는지 여부를 확인하였다. in vivo Foxol 발현을 분석하기 위하여， WT P14 및 miR-150 0 P14 마우스에 LCMV Arm을 감염시키고, 다른 시점에서 P14 세포 내 Foxol 발현을 측정하였다. 그 결과를 도 34에 나타내었다.
도 34에 나타난 바와 같이， in vitro 결과와 일치하게, Foxol 단백질의 발현은 감염된 지 2일 후에 WT P14 세포에서 관찰된 수준과 비교하였을 때 miR-150 K0 P14 세포에서 유의하게 높았다. 반면, 감염된 지 5일 후에， 상기 발현은 WT P14 세포뿐만 아니라 miR-150 0 P14 세포에서도 하향 조절되었다.
실험예 6.3. miR-150의 존재 여부에 따른 CD8+ T세포 내 Foxol 발현의 역학 관계 확인
miR-150의 존재 또는 부재 하에， CD8+ T 세포 내 Foxol 발현의 역학 관계를 모니터 및 비교하기 위하여 , 세포 증식의 추적을 가능하게 하는 염료로 표지된 WT P14 또는 miR-150 0 P14 세포를 나이브 마우스에 이식하였다. 이후, LCMV Arm으로 감염시켰다. 상기 실험예 6.2에서 in vivo 상의 Foxol 발현은 5 d.p . i . 이전에 최고조에 달했기 때문에 (도 34)， 3.5 d.p . i에 도너 P14 세포에서 Foxol 발현을 분석하였다. 상기 과정을 도 35에 나타내었다. 또한, 기억 T 세포 분화를 촉진하는 전사 인자인 TCF1의 단백질 수준을 측정하였다. 그 결과를 도 36 및 도 37에 나타내었다.
도 36 및 도 37에 나타난 바와 같이， Foxol 및 TCF1의 수준은 ¥ΐ P14 세포에서 관찰된 수준과 비교하였을 때 miR-150 K0 P14 세포에서 더 높게 나타났다. 또한， Foxol 수치는 miR-150 K0 P14 세포에서 약간 증가한 반면， WT P14 세포에서 감소하였다 (도 36) . TCF1 발현은 WT P14 세포에서 역학적으로 하향 조절되었지만， miR-150 K0 P14 세포에서 비교적 안정적으로 나타났다. 또한， Foxol 및 TCF1의 발현은 WT P14 세포에서 관찰된 수준과 비교하였을 때 miR-150 K0 P14 세포에서 유의하게 높은 발현을 나타내었다 (도 36) . 그러나， Foxol 및 TCF1 수준은 miR-150 K0 P14 세포에서 기억 단계 동안 회복하는 것으로 나타났으나, WT P14 세포에서는 나타나지 않았으며 (도 37)， 이는 기억 CD8+ T 세포에서 miR-150에 대한 또 다른 역할을 의미한다. 실험예 Ί. Foxol 억제는 Foxol 3' 비번역 영역 (UT )에 miR-150의 직접 결합에 의해 매개된다
실험예 7.1. Foxol 및 CF1 억제가 miR-150에 의해 매개되는지 여부 확인 분화 초기 단계에 활성화된 CD8+ T 세포에서 Foxol 및 TCF1의 억제가 miR-150에 의해 매개되는지 여부를 확인하기 위하여， in vitro 상에서 miR-150 K0 CD8+ Τ 세포로의 레트로 바이러스 형질 도입을 수행한 후， 형질도입 효율을 증가시키기 위한 자극을 가했다. 상기 과정을 도 38에 나타내었고， 그 결과를 도 39에 나타내었다.
도 39에 나타난 바와 같이， CD8+ T 세포에서 Foxol 단백질 수준은 miR-150에 의해 하향조절 되었으며， CD8+ T 세포에서 Foxol 발현이 miR-150-매개 억제됨을 확인하였다.
실험예 7.2. Foxol의 억제가 TCF1 발현에 영향을 미치는지 확인
상기 실험예 7.1에서， miR-150에 의해 매개된 Foxol 억제가 TCF1 발현에 영향을 미치는지를 확인하기 위해， Foxol short -hairpin RNA(shRNA)를 암호화하는 레트로바이러스로 miR-150 K0 CD8+ T세포를 형질 전환시켰다. 상기 과정을 도 40에 나타내었고， 그 결과를 도 41에 나타내었다.
도 41에 나타난 바와 같이， Foxol 억제는 Foxol 및 TCF1 발현을 약간 억제하는 것으로 나타났다.
실험예 7,3. Foxol 억제의 발생 원인 확인
miR-150-매개된 Foxol 억제가 Foxol mRNA에 miR— 150을 직접 결합시킴으로써 발생했는지 여부를 확인하였다. miR-150-타겟 서열이 Foxol mRNA 3 ' UTR에 존재하는지 확인하기 위해， 여러 가지 microRNA 타겟 예측 프로그램을 사용하였고, 이를 도 42에 나타내었다. Foxol 단백질 수준의 억제가 Foxol mRNA의 3 'UTR에 결합한 miR-150에 의한 것인지를 확인하기 위해， MNAT ralkylamine N-acetyl transferase)-리포터 시스템을 사용하였다. 상기 시스템을 도 43에 나타내었다. AANAT 단백질의 반감기가 매우 짧기 때문에， AANAT 단백질 리포터 시스템에서 단백질 축적을 제외시킴으로써 추적에 사용할 수 있다. miR-150-5p 유사체 (miR-150-5p WT)와 그 돌연변이 형태 (miR-150-5p MT)를 디자인하였고， WT Foxol 3 ' UTR(Foxola 3 ' UTR- WT) 또는 이의 돌연변이된 서열 (Foxola 3 ' UTR-MT)을 암호화하는 서열을 포함하는 AANAT 백터를 구성하였다 (도 42 및 도 43) .
도 44에 나타난 바와 같이， miR-150-5p WT 및 Foxola 3' UTR-WT의 조합만이 AANAT 단백질의 발현을 억제함으로써 miR-150-5p가 단백질 수준에서 Foxol의 발현을 억제할 수 있음을 나타내었다. 또한， 도 45에 나타난 바와 같이, Fox이의 mRNA 수준은 AANAT mRNA의 수준에 기초하여 변하지 않음을 나타내었다. 또한, 상기 결과는 miR-150-매개된 Foxol-TCFl의 억제는 기억 전구체 보다는 이펙트 세포로의 나이브 CD8+ T세포의 분화를 향상시킨다는 것을 나타내었다.
실험예 7.4. 기억 CD8+ T세포 분화조절에서 Foxol의 기능 평가
기억 CD8+ T 세포 분화 조절에서 miR-150이 직접적으로 타겟하는 Fox이의 in vivo 기능적인 관련성을 평가하였다. 활성화 초기 단계에서 miR-150 K0 CD8+ T 세포를 모방하기 위해， 이들의 활성화 동안 WT CD8+ T 세포에서 Fox이을 과발현하려고 시도하였다. 상기 목적을 위해， LCMV Arm으로 감염되어 ϊη νϊνο상에서 활성화된 WT P14 CD8+ Τ 세포는 Foxol 및 Thyl . l 유전자를 모두 포함하는 레트로 바이러스 (MSCV-Foxol-Thyl . l) 또는 Thyl . l 유전자만을 포함하는 레트로바이러스 (MSCV-Thyl . l)로 형질 감염시켰다. 이어서， 형질 전환된 WT P14 CD8+ T 세포의 각 군을 감염된 마우스에 각각 투여하였다. 상기 과정을 도 46에 나타내었다ᅳ 혈액 내 도너 pi4 CD8+ T 세포 중 레트로바이러스 투여된 군에서 표현형의 변화를 모니터하였다. 그 결과를 도 47a 및 도 47b에 나타내었다.
도 47a 및 도 47b에 나타난 바와 같이， Foxol을 과발현시킨 CD8+ T 세포는 CD127 및 CD62L 전환이 촉진되었고， TE 보다는 TCM 및 Tffl으로 분화되었다. Foxol 과발현에 의한 기억 CD8+ T 세포의 증가된 빈도는 25 d.p . i에 비장과 폐에서도 관찰되었다 (도 47a 및 도 47b) . Foxol을 과발현하는 WT CD8+ T 세포의 가속화된 기억 표현형은 miR-150 K0 CD8+ T세포와유사하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
mi -150(micro RNA-150) 저해제를 유효성분으로 포함하는 면역 활성 증진용 약학적 조성물ᅳ
【청구항 2]
miR-150(mi cro RNA-150) 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3]
제 2항에 있어서，
상기 암이 위암， 간암， 폐암， 대장암， 유방암， 전립선암， 난소암， 췌장암， 자궁경부암， 갑상선암， 후두암， 급성 골수성 백혈병， 뇌종양， 신경모세포종， 망막 모세포종， 두경부암， 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 것인， 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 2항에 있어서 상기 감염성 질환이 B형 간염， C형 간염, 인간 파필로마 바이러스 (human papi l loma virus : HPV) 감염， 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 감염， 바이러스성 호흡기 질환, 및 인플루엔자로 구성된 군에서 선택되는 것인， 약학적 조성물.
【청구항 5]
miR-150 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 활성을 증진시키는 방법 .
【청구항 6】
게 5항에 있어서，
상기 투여는 복강내， 정맥내， 근육내， 피하， 피내， 경구, 비내， 폐내 및 직장내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행되는 것인， 면역 활성을 증진시키는 방법.
【청구항 7】
miR-150 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료하는 방법 .
【청구항 8】
제 7항에 있어서,
상기 투여는 복강내， 정맥내， 근육내， 피하, 피내， 경구， 비내, 폐내 및 직장내로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행되는 것인， 암 또는 감염성 질환의 예방또는 치료하는 방법 .
【청구항 9】
(a) 분리된 CD8+ T세포에 후보물질을 처리하는 단계 ; 및
(b) 상기 처리된 세포에 miR-150 발현 수준이 미처리 대조군 대비 유의한 수준으로 감소된 경우, 처리된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는， 면역 활성 증진용 약물의 스크리닝 방법 .
【청구항 10】
(a) 분리된 CD8+ T세포에 후보물질을 처리하는 단계 ; 및
(b) 상기 처리된 세포에 miR-150 발현 수준이 미처리 대조군 대비 유의한 수준으로 감소된 경우， 처리된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는， 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법 .
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