CN116410931A

CN116410931A - 一种通用型car-t细胞的制备技术及其应用

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Publication number: CN116410931A
Application number: CN202111652757.5A
Authority: CN
Inventors: 李戊玲; 徐艳敏; 沈俊杰; 杨智
Original assignee: Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd; Chongqing Precision Biotech Co ltd
Current assignee: Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd; Chongqing Precision Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-07-11

Abstract

本发明属于细胞生物学、分子生物学以及药物研发技术领域，具体涉及一种通用型CAR‑T细胞的制备方法及其应用；具体涉及一种通用型CAR‑T细胞的制备技术及其应用，所述CAR‑T细胞表达CD62L；本发明提供的方法制备的DU‑CAR‑T可实现传统通用型CAR‑T细胞同样较低程度的GVH反应，同时发明的L‑CAR及通用型DU‑CAR在各方面均优于或不差于自体CAR细胞。

Description

一种通用型CAR-T细胞的制备技术及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物学、分子生物学以及药物研发技术领域，具体涉及一种通用型CAR-T细胞的制备方法及其应用。

背景技术

L-选择素(CD62L)基因编码属于粘附/归巢受体家族的细胞表面粘附分子,通常用作T细胞活化的标记物，在T细胞不断活化过程中由于其自我剪切机制的启动其在细胞上的表达不断下调，研究表明即使有下调现象，表达CD62L的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤能力也明显优于不表达CD62L的CTL(doi：10.1172/JCI24480 doi：10.1073/pnas.0503726102)，这可能得益于CD62L的归巢能力。但有研究也表明L-选择素与归巢并无关系，而与肿瘤内部治疗性T细胞的激活有关(doi：10.3389/fimmu.2019.01321)。文章(doi：10.3389/fimmu.2019.01321)使用的小鼠中过继免疫疗法，该研究使用过继免疫疗法的小鼠模型，以野生型小鼠CD8⁺T为对照，通过删除CD62L近膜端水解切割位点部分序列生成突变型CD62L转基因小鼠，该突变型转基因小鼠通过突变其水解片段从而增强L-选择素在小鼠CD8⁺T细胞上表达。研究结果表明突变型CD62L转基因小鼠提高了CD8⁺T细胞控制实体瘤生长的能力；但是，现有技术中，对在T细胞或者CAR-T细胞上过表达CD62L最后所达到的效果以及具体的机理是不清楚的。

CAR-T免疫疗法通过基因工程改造患者自体T淋巴细胞，使其表达嵌合抗原受体，能够有效克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，使得肿瘤细胞无处逃逸。目前，两种国内获批的带有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞产品均来自自体T细胞，这些被批准用于临床的自体CAR-T细胞必须在定制的基础上产生。但由于昂贵的生产费用和漫长的生产过程，这种自体T细胞生产平台仍然是大规模临床应用的重要限制因素，此外还存在生产失败等风险。同时，个性化、定制的自体CAR-T细胞生产过程也限制了在不同肿瘤类型上的广泛应用。因此，需要通用型同种异体T细胞来制备通用型CAR-T细胞，这些细胞可以作为“现成的”即用型治疗剂，用于大规模临床应用。通用型CAR-T细胞能够显著缩短治疗周期同时降低成本，移植物排斥相关反应与疗效问题通过基因编辑技术与干细胞移植供体来源T细胞等策略亦能逐步解决，因此未来的市场竞争也更有优势。

通用型CAR-T细胞是以健康供者的外周血中提取的T细胞为起始样品，利用基因编辑技术解决同种异体之间的免疫排斥问题，并同时在T细胞上装上特异靶向癌症靶点的CAR结构，最终可用于回输到同种异体癌症患者体内特异性靶向肿瘤细胞的一种异体移植活细胞药剂。

目前行业内均面临的一大困境的原因之一，这种制备方式生产的通用型CAR-T细胞体内存续较差，即使加大回输剂量或增加回输次数也很难达到理想的治疗效果，而自体CAR-T细胞回输剂量相对低一些，且缓解率更高，但通用型CAR-T细胞可以实现的即用型、现货类、治疗成本低等优势是自体CAR-T细胞无法实现的。因此，制备体内存续时间长的通用型CAR-T很有必要。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种体内存续时间长的T细胞，该细胞可用于进一步制备CAR-T细胞。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

T细胞，所述T细胞表达CD62L。

进一步，所述的T细胞中，所述T细胞表达CD44。

进一步，所述的T细胞，所述CD62L的氨基酸序列如SEQ ID NO.13任一所示。

进一步，所述的T细胞中，所述CD44的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

进一步，所述的T细胞中，所述T细胞的CD4基因和/或CD8基因被敲除和/或失活。所述的CD44基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的CD4基因和CD8基因部分靶点序列如SEQ ID NO.1-11展示，该序列不仅限于此处展示的序列，且包含人体12号染色体上CD4基因:6,789,528-6,820,799 forward strand中,人体2号染色体上CD8A基因:86,784,610-86,808,396 reverse strand中以及人体2号染色体CD8B基因:86,815,339-86,861,924reverse strand中；基因编辑靶点所在位置表1、表3-表5展示展示包含的任一区域内可对基因本身造成缺失的靶点序列。此外，为提高敲除效率，可在靶点序列首个碱基为非G的序列前，加上一个鸟嘌呤G。

所述的CD62L天然氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，

天然的或用天然序列表达的CD62L由于存在其在特定生理情况下(活化程度较高时)发生的自我切割导致降解或水解的模式，我们可利用其氨基酸替换、删除或其他截短等方式将其突变为以下非降解模式序列，从而增强其持续性。

Table1

Table2

本发明的目的之二在于提供上述T细胞的制备方法，该方法为提供一种持续性长的细胞提供了制备思路

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的T细胞的制备方法，选用以下两种任一方法获得目的细胞:(1)获得T细胞后，采用基因编辑的方法进行CD4和/或CD8基因的敲除和/或失活，感染包含CD62的病毒，获得目的细胞；(2)获得T细胞后，感染包含CD62的病毒，采用基因编辑的方法进行CD4和/或CD8基因的敲除和/或失活，获得目的细胞

进一步，所述T细胞为活化的和/或非活化的T淋巴细胞。

进一步，所述的T细胞中的CD4基因和/或CD8基因的敲除或失活时机为：在T细胞扩增之后，或在T细胞扩增之前。

进一步，所述的基因编辑技术是通过电转的方式或非电转的方式改造T细胞。

进一步，所述基因编辑技术包括Cas9、ZFN、TALEN。

目的之二方法下获得的T细胞。

本发明的目的之三在于提供一种长期存续能力高的CAR-T细胞，及其制备方法。上述细胞可商业化应用，该方法操作重现性好。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

由所述的T细胞制备的CAR-T细胞。

进一步，CAR-T细胞中的CAR包含有胞外域、跨膜域和胞内信号域。

进一步，所述CAR-T细胞为同种异体CAR-T细胞。

进一步，所述CAR-T细胞还表达膜结合的IL15。

进一步，所述CAR-T细胞还表达分泌细胞因子，所述细胞因子包括IL2、IL7、IL12、IL21、IL15。

进一步，所述CAR-T细胞还表达且可识别肿瘤微环境中分子的融合蛋白，所述融合蛋白的胞外结构识别PD1、PDL1、SIRPγ、SIRPδ、TIGIT。

进一步，所述CAR结构可被调控活化或失活，所述调控活化或失活的结构包括Peptide neo-epitope(PNE)、fluorescein(FITC)、10 amino acids(5B9 tag)、FITC-HM-3bifunctional molecule(FHBM)and scFv、Leucine ZipFv linked to antibody、Streptavidin 2(mSA2)biotin-binding domain。

进一步，所述CAR-T细胞可以识别实体瘤、血液系统肿瘤细胞/组织；所述CAR-T细胞的抗原识别区可以识别包含抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CLL-1(CLEC12A)、CD7、CD5、CD70、CD123、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、Mesothelin、MUC1、CLDN18.2、CDH17、Trop2、BCMA、NKG2D、PDL1、EGFR、EGFRVIII、PSCA、PSMA、MUC16、CD133、GD2、IL13R2、B7H3、Her2、CD30、SLAMF7、CD38、GPC3、WT1或TAG-72。

所述的CAR-T细胞的制备方法，选用以下两种任一方法获得目的细胞：

(1)收集获得T细胞，感染包含CD62和CAR结构的病毒，对感染CAR结构后的T细胞进行RNP电转，获得目的细胞；或

(2)收集获得T细胞，电转RNP该T细胞后，再感染包含CD62和CAR结构的病毒，获得目的细胞。

进一步，所述的制备方法，选用以下两种任一方法获得目的细胞：

(1)活化敲除或失活CD4和/或CD8基因的T细胞后,感染包含CD62L、CD44和CAR结构的病毒，对感染CAR结构后的T细胞进行RNP电转，获得目的细胞；或

(2)活化敲除或失活CD4和/或CD8基因的T细胞后电转RNP该T细胞后，再感染包含CD62L、CD44和CAR结构的病毒，获得目的细胞。

进一步，所述的制备方法，活化敲除或失活CD4和/或CD8基因时采用CRISPR/Cas9基因编辑技术改造T细胞；所述CRISPR/Cas9基因编辑技术中涉及的RNP复合物具体为含有CD4sgRNA和CD8sgRNA以及Cas9蛋白的RNP复合物。

进一步，所述的制备方法，所述Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比为1:2。

另，基于CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：1)构建含有目的基因片段(包含由不同启动子启动的针对特定肿瘤靶点的CAR结构序列和CD62L基因片段)的病毒载体；2)将病毒载体感染T细胞，获得目的细胞。

进一步，所述的方法，所述的步骤2)中以慢病毒感染、基因定点整合方式、脂质体转染、电转等方式增强CD62L基因的表达。

本发明的目的之四在于提供一种能制备长存续能力CAR-T细胞的重组载体。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

感染所述的CAR-T细胞的重组载体，所述重组载体包含CD62L和CAR结构。

进一步，所述的重组载体，所述重组载体包含CD62L、CD44和CAR结构。

进一步，所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体中选用表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体、RNA载体、质粒中的任一种。

本发明的目的之五在于提供细胞组合物，该细胞组合物有治疗作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

含有所述的T细胞和/或所述的CAR-T细胞的细胞组合物。

进一步，所述细胞组合物中含有的所述T细胞或所述CAR-T细胞的比例以数量计不低于不低于90％，80％，70％或60％。

进一步，细胞组合物，所述的细胞组合物可以是经过活化诱导的CIK细胞或NKT细胞。

本发明的目的之六在于提供几组应用，该应用为临床提供好的治疗思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的T细胞和或所述的CAR-T细胞和或所述的重组载体和或所述的细胞组合物在制备细胞治疗药物中的应用。

进一步，所述的应用中，所述的T细胞和/或所述的CAR-T细胞和/或所述的重组载体和/或所述的细胞组合物在制备治疗急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和/或皮肤癌的药物中的应用。

CD62L和/或CD44用于制备CAR-T细胞的活力提升剂中的应用。

CD62L和/或CD44用于制备CAR-T细胞分泌的LAG-3和PD-1因子的抑制剂。

在制备CAR-T细胞或时，CD62L和/或CD44基因作为肿瘤细胞杀伤的促进剂中的应用，所述CAR-T细胞为常规CAR-T细胞、不表达CD4和/或CD8基因的CAR-T细胞或通用型CAR-T细胞。

本发明所述CAR结构可以是常规的第一代、第二代、第三代CAR结构，也可以是改进的双CAR、可调控CAR结构(如FRB/FKBP12调控)等新型CAR结构。

本发明所述CAR结构包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，因而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如，NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如，CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRA、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如，CD16、和CD64；和Ly49受体，例如，LY49A、LY49C。所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或胞内信号结构域(例如，DAP12)相互作用。

本发明所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

本发明中的CAR-T可以采用专利201710305078.8、201710613317.6、201710618293.3、201510304389.3、201510648252.X、201810207761.2、201810934637.6、201811125906.0、201910407001.0、202010257762.5、202010259458.4、202010260805.5、202010260849.8、202010559366.8、202110556147.9以及其他公开的CAR-T结构中。

本发明中所述CAR-T结构中的铰链区序列可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4。

本发明中所述CAR-T结构中的跨膜区序列可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、CD80以及CD86。

本发明中所述CAR-T结构中的胞内信号区可来源于：CD3、CD137、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127。

本发明所述抗原识别区可以为识别靶抗原的配体/受体；ScFv可以是鼠源抗体或全人源抗体或人鼠嵌合抗体的ScFv，也可以是鲨鱼、羊驼或骆驼抗体等单域抗体，也可以是双特异性抗体，也可以是人工设计的识别特定靶点的靶点特异性纤连蛋白III型(FN3)结构域组合。

本发明中的CAR-T可以采用专利201710305078.8、201710613317.6、201710618293.3、201510304389.3、201510648252.X、201810207761.2、201810934637.6、201811125906.0、201910407001.0、202010257762.5、202010259458.4、202010260805.5、202010260849.8、202010559366.8、202110556147.9以及其他公开的CAR-T结构中此类双阴性通用型CAR-T细胞疗法的应用可适用于任意一种除CD62L靶点以外的CAR结构，且不受CAR其他靶点、结构的限制。

本发明中所公开的制备方法中活化后的T细胞可以通过病毒感染CAR结构，也可以使用转座子系统。

本发明中的DU-CAR-T指的是敲除或CD4和或CD8基因的通用型CAR-T细胞。

本发明中的L-19CAR指的是采用自体免疫细胞制备的表达CD62的CAR-T细胞。

本发明中，采用同种异体细胞制备的表达CD62的传统的通用型CAR-T为：CU-62-CAR-T；采用同种异体细胞制备的表达CD62的通用型CAR-T为：DU-62-CAR-T。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的双阴性通用型CAR-T细胞，不仅可以有效地表达于T淋巴细胞，而且能够加强CAR-T细胞的活性，增强CAR-T有效性，并且使CAR-T细胞有更优的表型，更低的衰竭表达，提高CAR-T细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗。

2)本发明提供了一种可选择的通用型CAR-T细胞候选细胞，不仅可以在体内、外有效杀伤肿瘤靶细胞，用于肿瘤的靶向治疗，并且有高于传统自体CAR-T细胞和传统通用型CAR-T细胞的抗肿瘤效果。

3)本发明提供的通用型CAR-T细胞，与传统通用型CAR-T细胞一样，在体外仅发生较低的GVH反应，可以用于制备同种异体CAR-T治疗，对CAR-T的临床应用以及肿瘤联合治疗新策略的开发具有重要的指导意义。

4)本发明提供的方法制备的DU-CAR-T可实现传统通用型CAR-T细胞同样较低程度的GVH反应，同时发明的L-CAR及通用型DU-CAR在各方面均优于或不差于自体CAR细胞。

附图说明

图1为敲除率检测结果；

图2为CAR阳性率检测结果；

图3为体外药效学检测结果；

图4为流式细胞仪检测结果；

图5为衰竭标志物检测结果；

图6为GVH强度检测结果；

图7为体内药效检测结果；

图8为流式检测结果；

图9为流式检测结果；

图10为体外药效学检测结果；

图11为因子检测结果；

图12为增值和活力检测结果；

图13为表型检测结果；

图14为衰竭标志物检测结果；

图15为活化标志物检测结果；

图16为流式细胞仪检测结果；

图17为体外药效学评价结果；

图18为表型检测结果；

图19为衰竭物检测结果；

图20为增值和活力检测结果；

图21为GVH强度检测结果；

图22为体内药效检测结果；

图23为RT-PCR小鼠血液中CAR-T拷贝数结果。

具体实施方式

本实施例中的磁珠分选采用生物素标记的CD4和CD8抗体，并偶联抗生物素的microbeads，或采用CD4和CD8阳性磁珠，过柱分选，此外，采用流式分选仪器或其他可获得需要部分的方式进行分选均可，最后选择需要阴性部分即可。流式检测敲除效率和分选纯度所用抗体：CD3：PE-CY7、CD4：FITC、CD8：BV510。本发明中所述双阴性CAR-T细胞制备方法：1、获取CD4和/或CD8单阳性T细胞，活化数小时后感染包含CD62L和CAR结构的病毒，培养数小时后对感染包含CD62L和CAR结构后的T细胞进行RNP电转，继续培养并分选出目的细胞；2、获取CD4和/或CD8单阳性T细胞，活化数小时后电转RNP到该T细胞后，培养数小时后感染包含CD62L和CAR结构的病毒，继续培养并分选出目的细胞

本专利中所使用的CAR的结构：胞外识别区(抗CD19 ScFv)-CD8来源铰链-CD8来源跨膜-胞内信号(CD137-CD3)

序列为：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPRLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGGGTRLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKALEWLGVIWGSETTYYNSSLKTRLTISKDNSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGSSVTVSSLETTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

实施例1表达CD62L的T细胞和L-19CAR(嵌合抗原受体T细胞)细胞制备

CD62L分子可与任意靶点和结构的嵌合抗原受体(CAR)组合获得本发明所公开的技术效果，这里以靶向CD19的嵌合抗原受体为例进行具体应用说明。同样，所述载体可以是慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体、RNA载体、质粒中的任一种，这里以慢病毒载体为例进行说明：

1)CD62L表达载体构建

如SEQ ID NO.13所示的CD62L氨基酸序列所对应的基因片段，将上述目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。所述载体可以是慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体、RNA载体、质粒中的任一种。为阐述具体的制备方案，这里以慢病毒载体为例进行说明：

将获得的编码CD62L分子的基因序列用限制性内切酶NheI和XhoI(购自Thermo公司)双酶切，同时用限制性内切酶NheI和XhoI酶切慢病毒表达载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒(http://www.addgene.org/12252/),利用限制性内切酶NheI和XhoI酶同时酶切pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将合成的带有NheI和XhoI酶切位点的CD44序列片段用限制性内切酶NheI和XhoI酶同时酶切后，与上述回收得到的DNA片段进行连接，即可获得表达CD62L的载体。

2)表达CD62L和特异性识别肿瘤的CAR基因的载体构建

合成包含抗人CD19抗原的单链抗体ScFv，铰链区、跨膜区和胞内信号段的嵌合抗原受体序列。

然后以嵌合抗原受体序列和CD62L分子分别为模板进行PCR扩增，反应体系按KODFX NEODNA聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书加样，PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸30s，30个循环。将扩增产物用1％琼脂糖(w/v)凝胶进行鉴定。然后用回收试剂盒(Promega公司)进行DNA片段回收，具体方法见说明书，回收获得嵌合抗原受体和CD44分子片段，将DNA回收片段送测序。

(2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：靶向CD19CAR-连接肽(多顺反子结构)-CD62L

将克隆获得的编码嵌合抗原受体和CD62L的基因序列用限制性内切酶NheI和XhoI(购自Thermo公司)双酶切，同时用限制性内切酶NheI和XhoI酶切慢病毒表达载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒(http://www.addgene.org/12252/),利用限制性内切酶NheI和XhoI酶同时酶切pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将合成的带有NheI和XhoI酶切位点的嵌合抗原受体和CD62L序列片段用限制性内切酶NheI和XhoI酶同时酶切后，与上述回收得到的DNA片段进行连接，即可获得同时装载有嵌合抗原受体和CD62L分子的载体。

上述CAR分子与CD62L分子使用多顺反子结构连接，所述多顺反子结构为自剪切多肽或内部核糖体进入位点IRES，所述自剪切多肽为T2A、P2A、E2A或F2A。这里以P2A为例，获得靶向CD19CAR-P2A-CD62L的表达载体。

酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体和CD62L分子的慢病毒载体。将慢病毒载体取5μL转化大肠杆菌TOP10，30℃培养16h后挑取单克隆，挑取的单克隆在30℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。抽提的质粒经限制性内切酶HindIII酶切电泳鉴定。

3)步骤2)和3)获得载体进行慢病毒制备

(1)慢病毒的包装

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：用含10％FBS(w/v)的DMEM培养基培养293T细胞至较佳状态；然后将293T细胞以1×105/cm2的密度传至1个75cm2的培养瓶中培养22h，保证转染时细胞汇合度为70-80％；再用预热的含2％FBS(w/v)的DMEM培养基换液，培养2h备用；将680μL ddH2O、20μg慢病毒载体(步骤1)和2)所述的载体)、100μL2.5mM CaCl2加入15mL离心管中，混合均匀，混匀后用移液器向混合液中逐滴加入2×HBS，同时用10mL移液器吹打混匀，混匀后室温静置15min，然后将混合液逐滴加入上述制备的细胞中，继续培养12-16h后，用含10％FBS(w/v)的DMEM培养基更换培液。细胞在培养48h、72h后分别收集细胞上清用于病毒纯化。

(2)慢病毒的纯化

将病毒上清收集在50ml离心管中，3000r/min离心10min然后用0.45μm滤膜过滤，滤液3000r/min离心10min后转移至新的50mL离心管；根据病毒上清量，分别加入50％PEG6000(w/v)、4M NaCl，再用医用盐水定容到总体积35mL(PEG6000终浓度为8.5％、NaCl终浓度为0.3M)，4℃冰箱静置90min，30min/次颠倒混匀；样品于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用200μL含10％FBS的DMEM培养基重悬病毒，1.5mL EP管分装，每管40μL，-80℃保存备用。

(3)慢病毒滴度测定

A、病毒感染293T细胞

提前12h将293T细胞铺板至含10％FBS(w/v)DMEM培养液的24孔板中，确保感染病毒前细胞汇合度在40％-70％之间，且细胞状态佳。向每个孔中加入1μL的6□g/mLPolybrene溶液，而后取已纯化的慢病毒载体1μL，用医用生理盐水稀释10倍制成工作液分别加入对应孔中，24h后用含10％FBS(w/v)的DMEM培养基换液，感染72h后1000r/min离心5min以收集细胞，抽提基因组。

B、抽提基因组

将收集的细胞用PBS重悬，1000r/min离心5min，弃尽上清，重复1次；再用200μLPBS重悬细胞，并加入20μL蛋白酶K，200μL AL裂解液，吹打混匀，56℃孵育10min；然后加入200μL预冷的乙醇，上下颠倒混匀，将溶液转移至过滤柱中，室温静置1min，8000r/min离心1min，弃尽上清；接着加入700μL AW1溶液，8000r/min离心1min，弃尽上清；再加入500μLAW2溶液，8000r/min离心1min，弃尽上清，并将过滤柱转移至新的1.5mL EP管中，开盖静置1min以挥发乙醇；加入50μL灭菌ddH2O(60℃预热)，静置2min，12000r/min离心1min。(基因组抽提试剂盒为QIAamp DNA Blood Mini Kit购于Qiagen公司)。

C、qRT-PCR测定病毒滴度

反应体系如下：

Premix Ex Taq^TM II(2×)10μL，上游引物(GAG up)1μL，下游引物(GAG dn)1μL，抽提的基因组1μL，RNase-Free dH2O 7μL，每个样品、标准品至少3个重复孔。然后按如下程序进行扩增：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度，结果用TU/mL表示。

4)慢病毒感染T细胞

(1)人外周血单核细胞的分离

用加有抗凝剂的采血管采集正常人外周血约60mL，分装于两个50mL离心管，每管各30mL，分别加入7.5mL羟乙基淀粉稀释。离心管室温静置自然沉降约30min，收集上层血浆，而后1400r/min离心15min后用生理盐水重悬沉淀。将细胞悬液以体积比1:1的比例小心加载到淋巴细胞分离液上，400g梯度离心15min，离心机降速DEC设置为5。离心后，离心管由上至下分为四层，即血浆层、环状乳白色外周血淋巴细胞(PBMC)层、透明分离液层和红细胞层。小心吸取第二层的PBMC至新离心管并用生理盐水洗涤2次，第一次400g离心10min，第二次1100r/min离心5min，而后以生理盐水重悬细胞，移液器吸取PBMC细胞悬液并转移至培养瓶中，以含有10％FBS(w/v)的RPMI 1640完全培养基培养。

(2)慢病毒载体感染T淋巴细胞

用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，第1天加入抗CD3单克隆抗体活化；前3天进行慢病毒感染；分别加入5感染复数(MOI)的1)和2)所述的慢病毒载体，未感染的外周血淋巴细胞(PBMC)作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/mL重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。

在有些实施例中，共表达CD62L和CAR的T细胞还可以采用如下方案制备：

A、采用上述步骤1)的方案制备表达CD62L的T细胞，获得表达CD62L的T细胞后进一步，在CD62L的T细胞上转导CAR基因，获得同时表达CD62L和CAR的T细胞。

B、采用与上述步骤2)类似的步骤获得表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)，不同之处在于表达CAR的载体不包含CD62L的基因，进一步在获得的CAR-T细胞基础上再转导CD62L基因，获得同时表达CD62L和CAR的T细胞。

CD62L和CAR的表达如图16所示，CD62L和CAR均可在T细胞正常表达

实施例2.DU-L-19CAR的制备

1、基因敲除实验

采用Lonza电转仪器或Neon等其他电转仪器，选择适合电转T细胞电转程序。Cas9蛋白：sgRNA摩尔比例为1:2或其他适合比例均可，RNP需体外孵育数分钟，并与电转buffer重悬的适量T细胞混合均匀转入电转杯，进行电转；完成电转并转入含适量培养基的培养瓶中继续培养。电转后72h即可孵育带可检测荧光标记的CD4或CD8流式抗体并进行流式检测敲除效率。图1为展示的所用靶点中，敲除效率的展示，不同条件下其他靶点亦可能产生较好敲除效果或更好的敲除效果。

发明中部分所用靶点序列如SEQ ID NO.1-11展示，该序列不仅限于此处展示的序列，任何敲除CD4和CD8的基因区域内的可对基因本身造成缺失的靶点序列都可以，且包含人体12号染色体上CD4基因:6,789,528-6,820,799 forward strand中,人体2号染色体上CD8A基因:86,784,610-86,808,396 reverse strand中以及人体2号染色体CD8B基因:86,815,339-86,861,924 reverse strand中；基因编辑靶点所在位置表1展示及表3-表5所包含的任一区域内可对基因本身造成缺失的靶点序列。

Table1

序列ID	序列名称	序列
			SEO ID NO.1	sg4-1	TGAACCGGGGAGTCCCTTTT
SEO ID NO.2	sg4-2	CCCTTTTAGGCACTTGCTTC
			SEO ID NO.3	sg4-3	AGTGGTGCTGGGCAAAAAAG
SEO ID NO.4	sg4-4	TCTGGTTGGAGTTTTTCCAG
			SEO ID NO.5	sg4-5	TCAGGGAAAGAAAGTGGTGC
SEO ID NO.6	sg4-6	CTCCTCCCAGCAGCCACTCA
			SEO ID NO.7	sg8-1	GACCGCCTTGCTCCTGCCGC
SEO ID NO.8	sg8-2	GGCAGGAGCAAGGCGGTCAC
			SEO ID NO.9	sg8-3	TCACGGAGCAGCAAGGCCAG
SEO ID NO.10	sg8-4	GGCCAGCGGCAGGAGCAAGG
			SEO ID NO.11	sg8-5	CAAGGCCAGCGGCAGGAGCA

Table2

Table 3

Table 4

Table 5

2、DU-L-19CAR的获取方法：起始样品为健康人外周血。用磁珠或流式分选CD4/CD8单阳性T细胞，用包含CD3、CD28的抗体的Dynabeads进行持续刺激48h，于24h感染含CAR的慢病毒，于48h电转靶向CD4和CD8的sgRNA和Cas9蛋白的RNP混合物，于电转后72h进行流式或磁珠分选出DU-CAR-T细胞，培养液可用1640加适量因子(IL2和IL4(和/或)IL7(和/或)IL15(和/或)IL21)，或其他任意适合培养T细胞的培养基和细胞因子组合即可。

DU-L-19CAR的获取方法：获取CD4和/或CD8单阳性T细胞，活化数小时后感染包含CD62L和CAR结构的病毒，培养数小时后对感染后的T细胞进行RNP电转，继续培养并分选出目的细胞；2、获取CD4和/或CD8单阳性T细胞，活化数小时后电转RNP该T细胞后，培养数小时后感染包含CD62L和CAR结构的病毒，继续培养并分选出目的细胞。

实施例2 DU-19CAR的评价

1、CAR阳性率检测方法：PE标记的PL抗体。由图2可知，对19CAR上的CD4和CD8进行基因编辑，用磁珠分选出高纯度双阴性CAR-T细胞。未进行基因编辑组CD4与CD8比例分别为53.46％和43.43％，基因敲除后DT占比高达89.93％，磁珠分选后得到纯度高达99.94％的双阴性CAR-T细胞。并且这种操作不影响CAR结构在T细胞上的表达，DU-19CAR阳性表达量与19CAR组均在85％左右，而传统通用型CU-19CAR表达量为76％，略低于其他两组。

2、体外药效评价杀伤方法：采用固定效靶比铺板：E:T＝CAR-T:肿瘤细胞，在1640完全培养基中培养固定时间，采用荧光素酶裂解法检测靶细胞存活比例，并算出细胞毒性效率。干扰素-γ因子分泌水平检测用可用于检测该因子水平的试剂盒即可，详细操作参考各厂家生产的试剂盒说明书。

如图3体外药效学评价结果显示，DU-19CAR体外杀伤与传统的通用型CU-19CAR相当，在比例为1:4，杀伤时间为24h时，其杀伤效率均可达90％左右；但我们发明的新型通用型DU-19CAR组因子分泌水平是传统通用型CU-19CAR组的两倍，这说明我们的发明方法提高了其杀伤肿瘤的能力，有利于更强劲得攻击肿瘤细胞。

3、表型检测方法：流式细胞仪检测；抗体：CCR7：APC、CD45RA：BV421、CD45RO：Percp5.5；表型分类标准：T记忆干细胞：TSCM(CD45RA+CD45R0-CCR7+)、类T记忆干细胞：TSCM-Like(CD45RA+CD45R0+CCR7+)、效应记忆T：TEM(CD45RA-CD45R0+CCR7-)、中央记忆T：TCM(CD45RA-CD45R0+CCR7+)、效应T：TE(CD45RA+CD45R0-CCR7-)、其他(100％-TSCM-TSCM-Like-TEM-TCM-TE)。如图7，表型检测结果显示，与传统自体19CAR相比，通用型DU-19CAR各组分型分布比较接近，TSCM略低，但TE略高，有利于瞬时杀伤肿瘤细胞。

4、衰竭标志物检测方法：流式细胞仪检测；抗体：PD-1：APC、LAG-3：BV421、TIM-3：Percp5.5。如图5所示，在衰竭标志物检测表达量数据结果看，两组CAR均不表达TIM-3，但相较于传统自体19CAR，我们发明的通用型DU-19CAR上PD-1和LAG-3表达均更低，这也提示了我们发明的通用型DU-19CAR具有更持久的持续性，从而有利于提高抗肿瘤能力。

5、GVH强度测定方法：采用微球绝对计数的方法测定混合淋巴反应(MLR)，配置固定比例：供体细胞(CAR-T)：受体细胞(与供体细胞不同HLA分型的健康人PBMC)混合体系，用1640基础培养基进行培养8天，分别于0天和8天流式检测细胞绝对计数，根据细胞数目变化算出GVH相对强度。

检测结果如图6显示，我们发明的双阴性DU-19CAR可引起的GVH反应强度与传统通用型CAR-T细胞CU-19CAR相当，均明显弱于对照组自体CAR-T细胞19CAR和CT组。这一结果说明，我们的发明方法制备的DU-19CAR与传统通用型CAR-T细胞一样，可用于同种异体CAR-T免疫治疗。

6、体内药效学评价方法：于11day引进小鼠，对小数进行检疫等系列检测操作，完成并许可入组；于-3day进行5e5Nalm6-Luc-GFP靶细胞尾静脉注射；于day0进行随机分组后按照CAR-T有效细胞数量为2e6回输CAR-T细胞；之后每隔7天进行活体成像观察小鼠体内肿瘤清除情况。

体内药效结果如图7显示，19CAR和DU-19CAR组及CU-19CAR组与Control T组相比体内有明显的肿瘤抑制作用。DU-19CAR组和CU-19CAR组从荧光值曲线数据分析表明DU-19CAR组相比CU-19CAR组体内药效明显更优，而我们发明的DU-19CAR体内药效略优于自体组19CAR，这说明我们发明的新型通用型CAR-T细胞体内抗肿瘤效果不仅远优于传统通用型CAR-T细胞，并且相对传统自体CAR-T细胞也更好，这也是该发明的意外收获之一。

综上所述，本发明中设计的DU-19CAR进行体内外药效学评价、表型检测、衰竭marker检测，均证明我们的DU-19CAR在各方面均优于传统通用型CAR-T细胞；并且采用微球绝对计数的方法测定混合淋巴反应(MLR)，结果显示本发明中设计的新型通用型DU-19CAR可引起的GVH反应程度与传统通用型CAR-T细胞(CU-19CAR)相当，可用于同种异体回输治疗。

实施例3.自然DNT或由其制备的DN-CAR-T(DN-19CAR：天然的CD4^-CD8^-T细胞)与本发明中技术制备的通用型DU-CAR-T(DU-19CAR：经过基因编辑获得的CD4^-CD8^-T细胞)比较结果

自然DNT是指人体外周血中天然的不表达CD4和CD8的双阴性T细胞，这种细胞抗原提呈途径不受MHC限制，亦在同种异体应用中引起同种排斥的几率极低(占外周血总淋巴细胞1-5％)，但这部分细胞在人体外周血中存在比例极低，体外扩增难度高，针对适应症的治疗效果不可观。本发明中技术制备的通用型双阴性细胞最初来源是人体外周血中CD4单阳性或CD8单阳性T细胞(占外周血中总淋巴细胞40-80％)，这种细胞抗原提呈过程依赖于MHC限制性，无法直接用于同种异体应用，需要进一步操作使其不发生同种排斥反应，本发明通过基因编辑技术失活CD4和CD8，从而获得CD4^-CD8^-双阴性的T细胞，我们已在本发明中展示了这种细胞与传统通用型T细胞一样具备可应用于同种异体治疗的必备条件，见GVH相关数据。

1、自然DNT获取方法：起始样品：健康人外周血。①用磁珠去除CD4/CD8 SPT细胞(CD4或CD8细胞)，用包含CD3、CD28的抗体持续刺激24-48h，接着用含IL2和IL4(和/或)IL7(和/或)IL15(和/或)IL21的培养基进行富集培养。②用流式分选的方式分选出CD3⁺CD4^-/CD8^-T细胞，用包含CD3、CD28的抗体持续刺激24-48h，接着用含IL2和IL4(和/或)IL7(和/或)IL15(和/或)IL21的培养基进行富集培养。

DN-19CAR获取方法：获得自然DNT，培养24h感染含CAR慢病毒。

我们采集了6批不同来源健康人外周血，并将其PBMC分离出来，通过检测筛选了其中DNT含量最高的3批，筛选指标：CD3⁺CD4^-CD8^-，我们需要用来制备DU-19CAR的初始细胞为SPT，筛选指标：CD3⁺、CD4⁺/CD8⁺；结果如表6所示：

Table6

Donor编号	555	556	557	558	559	560
							DNT百分比(％)	4.97	2.9	3.19	13.8	8.07	16.85
SPT百分比(％)	94.82	96.67	96.38	85.79	91.56	82.68

分别以起始量为1e8计算，在细胞活化第6天，我们获取到的CAR-T细胞数目统计如表7展示。从表格数据可见，同样起始量PBMC，在筛选DNT较高比例批次后，可获取的DU-19CAR细胞至少是DN-19CAR细胞的3倍，最高可达到35倍以上。而在活化6天开始监测的增殖数据，由图15可知，在后期的增殖中，DN-19CAR细胞远不如DU-19CAR细胞。由此可见DU-19CAR细胞的应用范围更广，能够满足各种应用的需求，尤其是临床用用这种对细胞量要求较高的领域。由图8可知，DU-CAR-T细胞CAR阳性率为60％以上，远高于N-DN-CAR-T细胞的25.4％，即其有效细胞比例高，更有利于杀伤肿瘤细胞。

Table7

3、DU-19CAR获取方法：制备同前，磁珠分选采用生物素标记的CD4和CD8抗体，并偶联抗生物素的micro beads，过柱分选，如图9所示，选择阴性部分即可。流式检测敲除效率和分选纯度所用抗体：CD3：PE-CY7、CD4：FITC、CD8：BV510。

由图9可知，DU-19CAR细胞纯度比例高达100％，分选纯度高；DN-CAR-T细胞DNT比例为96.6％，这说明富集的方法获取的DNT纯度较高，但略低于我们的发明方法，这提示在安全性方面，我们的发明方法获取的DU-CAR-T细胞具有更大的优势。

4、体外药效学评价，如图10所示，效靶比为1:8时，杀伤结果显示我们发明的DU-19CAR与传统自体19CAR有统计学差异，同时我们发明的DU-19CAR与天然DNT制备的DN-19CAR有极其显著性统计学差异。这说明我们发明的DU-CAR-T细胞杀伤能力明显强于DN-CAR-T细胞，并且略优于自体CAR-T细胞组。

5、因子检测结果，如图11所示，采用任一可用于检测干扰素γ的试剂盒检测即可，检测杀伤后的上清培养基，方法参考各试剂说明书。结果显示我们发明的DU-19CAR与传统自体19CAR有显著性统计学差异，并且我们发明的DU-19CAR与天然DNT制备的DN-19CAR有极其显著性统计学差异。这从因子分泌的水平反映了我们发明的双阴性通用型CAER-T细胞具有更强的体外药效。

6、增殖和活力监测，从磁珠分选出高纯度双阴性DU-19CAR(活化day5或day6)开始监测。监测方法：各组取固定相同起始量(如1e6)细胞进行监测，之后每隔2-3天进行监测，一直到监测到有一组细胞不再继续增殖，且活力开始下降，整个监测过程中不可丢弃细胞。如图12所示，我们发明的通用型DU-CAR-T增殖能力和细胞活力均明显优于自然双阴性DN-Control T或由其制备的双阴性DN-19CAR细胞，这说明我们发明的制备方法获取的通用型DU-19CAR细胞增殖和活力均不会受到影响，甚至有令人惊喜的效果，而自然DNT增殖较差，难以快速达到治疗需求量，生产成本也大大提高，这意味着其临床转化利用较难。

7、表型、衰竭标志物、活化标志物检测：

1)表型检测结果，如图13显示，我们发明的DU-19CAR组TE比例明显高于DN-19CAR组，由于CAR-T作用时间较短，瞬时杀伤能力是药效的重要体现指标，因此在我们的杀伤结果中也体现为我们发明的DU-19CAR杀伤能力更强。

2)衰竭标志物检测结果，如图14显示，我们发明的DU-19CAR中三种衰竭分子表达量均低于DN-19CAR，这一结果提示我们发明的DU-19CAR具有更强的持续性，凋亡速度更慢，因此可以更好地发挥其抗肿瘤药效。

3)活化标志物检测方法：流式细胞仪检测；抗体：CD25：FITC、CD44：BV421、CD95：BV4711。活化标志物检测结果，如图15显示，除CD25体现少量差异外，CD95、及CD44均呈现相似表达。

实施例4.DN-L-19CAR以及L-19CAR的评价

1、CAR的表达

对L-19CAR细胞上的CD4和CD8进行基因编辑，用磁珠分选出高纯度DU-19CAR细胞，并且这种操作不影响CAR结构在T细胞上的表达。由图16可知，CAR表达量均高于70％，DU-L-19CAR分选后其双阴性CAR-T细胞的比例高达100％。

2、体外杀伤

采用固定效靶比铺板：E:T＝CAR-T:肿瘤细胞，在1640完全培养基中培养固定时间，采用荧光素酶裂解法检测靶细胞存活比例，并算出细胞毒性效率。干扰素-γ因子分泌水平检测用可用于检测该因子水平的试剂盒即可，详细操作参考各厂家生产的试剂盒说明书。

体外药效学评价结果，如图17显示，L-19CAR和DU-L-19CAR体外药效与自体19CAR相当，在效靶比为1:4，杀伤时间为24h时，其杀伤效率均可达到90％以上，因子分泌检测结果显示无差别。

3、表型结果

流式细胞仪检测；抗体：CCR7：APC、CD45RA：BV421、CD45RO：Percp5.5；表型分类标准：T记忆干细胞：TSCM(CD45RA+CD45R0-CCR7+)、类T记忆干细胞：TSCM-Like(CD45RA+CD45R0+CCR7+)、效应记忆T：TEM(CD45RA-CD45R0+CCR7-)、中央记忆T：TCM(CD45RA-CD45R0+CCR7+)、效应T：TE(CD45RA+CD45R0-CCR7-)、其他(100％-TSCM-TSCM-Like-TEM-TCM-TE)。

表型检测结果，如图18显示，与自体19CAR相比，L-19CAR与通用型DU-L-19CAR各组分型分布比较接近，TSCM略低，但TE略高，这有利于CAR-T瞬时杀伤能力的提高。

4、衰竭标志物

衰竭标志物检测方法：流式细胞仪检测；抗体：PD-1：APC、LAG-3：BV421、TIM-3：Percp5.5。

在衰竭标志物检测表达量数据结果，如图19中可以看出，几组CAR均不表达TIM-3，但相较于自体19CAR，我们发明的L-19CAR和通用型DU-L-19CAR上LAG-3和PD-1表达量均更低，这也提示了,我们发明的L-19CAR和通用型DU-L-19CAR具有更持久的持续性，距离细胞凋亡时间更长，从而有利于提高CAR-T细胞持续抗肿瘤能力。

5、增值以及活力检测：电转RNP后需要通过分选的方式对目的细胞进行纯化，该时间点一般在活化后5-7天进行，分选当天开始监测细胞活力，主要实施方式是通过细胞计数仪计数的方式获得固定时间点的细胞活力。为了保持实验一致性，19CAR和L-19CAR虽然不需要分选，均与DU-L-19CAR同一时间节点进行监测。

增殖和活力监测结果，如图20显示，表明我们发明的通用型DU-L-19CAR增殖能力和细胞活力优于自体19CAR，其中增殖倍数上，我们发明的DU-L-19CAR与其他两组拉开较大差距，增值速度明显优于自体19CAR组，细胞活力也高于自体19CAR组相当，这说明我们发明的制备方法有显著提高CAR-T细胞增殖能力的作用，该方法可用于进一步治疗应用。

6、GVH强度检测

采用微球绝对计数的方法测定混合淋巴反应(MLR)，配置固定比例：供体细胞(CAR-T)：受体细胞(与供体细胞不同HLA分型的健康人PBMC)混合体系，用1640基础培养基进行培养8天，分别于0天和8天流式检测细胞绝对计数，根据细胞数目变化算出GVH相对强度。

GVH强度检测结果，如图21显示，我们发明的双阴性DU-L-19CAR可引起的GVH反应强度均低于传统通用型CAR-T细胞CU-L-19CAR，并且均明显弱于对照组自体CAR-T细胞L-19CAR和19CAR组及CT组。这一结果说明，我们的发明方法制备的DU-L-19CAR与传统通用型CAR-T细胞一样适合用于同种异体CAR-T免疫治疗。

7、体内实验实验(DU-L-19CAR、L-19CAR和19CAR的对比)

于11day引进小鼠，对小数进行检疫等系列检测操作，完成并许可入组；于-3day进行5e5Nalm6-Luc-GFP靶细胞尾静脉注射；于day0进行随机分组后按照CAR-T有效细胞数量为2e6回输CAR-T细胞；之后每隔7天进行活体成像观察小鼠体内肿瘤清除情况。

体内药效结果，如图22显示，19CAR组和DU-L-19CAR组及L-19CAR组与Control T组相比体内有明显的肿瘤抑制作用。DU-L-19CAR组与L-19CAR组及19CAR组从荧光值曲线数据分析表明，DU-L-19CAR组及L-19CAR组相比19CAR组具有更好的体内药效。这说明我们的发明方法制备的L-19CAR组具有更好的药效。我们发明的通用型DU-L-19CAR不仅可以实现通用，并且比传统自体CAR-T细胞具有更好的药效，这对通用型CRA-T细胞治疗领域具有较强的启示作用。

此外，经检测RT-PCR小鼠血液中CAR-T拷贝数结果，如图23显示，我们发明的L-19CAR体内存续的CAR-T细胞是传统自体19CAR组的两倍以上，这足以说明的我们发明方法提高了CAR-T体内存续，从而进一步提高CAR-T体内持续性抗肿瘤能力。

综上所述，本发明设计的DU-L-19CAR-T进行体外药效学评价、增殖和活力监测以及GVH强度检测等结果表明，不论是在抗肿瘤效果，细胞增殖能力和细胞活力以及体内存续等方面均优于传统CAR-T。

序列表

<110> 重庆精准生物技术有限公司

重庆精准生物产业技术研究院有限公司

<120> 一种通用型CAR-T细胞的制备技术及其应用

<130> 2021.12.30

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaaccgggg agtccctttt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccttttagg cacttgcttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtggtgctg ggcaaaaaag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctggttgga gtttttccag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagggaaag aaagtggtgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcctcccag cagccactca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaccgccttg ctcctgccgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcaggagca aggcggtcac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcacggagca gcaaggccag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggccagcggc aggagcaagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caaggccagc ggcaggagca 20

<210> 12

<211> 742

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro

1 5 10 15

Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly

20 25 30

Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu

35 40 45

Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala

50 55 60

Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly

65 70 75 80

Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile

85 90 95

Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser

100 105 110

Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp

115 120 125

Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr

130 135 140

Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp

165 170 175

Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly

180 185 190

Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp

195 200 205

Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Thr Leu

210 215 220

Met Ser Thr Ser Ala Thr Ala Thr Glu Thr Ala Thr Lys Arg Gln Glu

225 230 235 240

Thr Trp Asp Trp Phe Ser Trp Leu Phe Leu Pro Ser Glu Ser Lys Asn

245 250 255

His Leu His Thr Thr Thr Gln Met Ala Gly Thr Ser Ser Asn Thr Ile

260 265 270

Ser Ala Gly Trp Glu Pro Asn Glu Glu Asn Glu Asp Glu Arg Asp Arg

275 280 285

His Leu Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ile Asp Asp Asp Glu Asp Phe Ile

290 295 300

Ser Ser Thr Ile Ser Thr Thr Pro Arg Ala Phe Asp His Thr Lys Gln

305 310 315 320

Asn Gln Asp Trp Thr Gln Trp Asn Pro Ser His Ser Asn Pro Glu Val

325 330 335

Leu Leu Gln Thr Thr Thr Arg Met Thr Asp Val Asp Arg Asn Gly Thr

340 345 350

Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile

355 360 365

His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr Ser Thr

370 375 380

Ile Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys

385 390 395 400

Glu Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro

405 410 415

Lys Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ser Ala His

420 425 430

Thr Ser His Pro Met Gln Gly Arg Thr Thr Pro Ser Pro Glu Asp Ser

435 440 445

Ser Trp Thr Asp Phe Phe Asn Pro Ile Ser His Pro Met Gly Arg Gly

450 455 460

His Gln Ala Gly Arg Arg Met Asp Met Asp Ser Ser His Ser Ile Thr

465 470 475 480

Leu Gln Pro Thr Ala Asn Pro Asn Thr Gly Leu Val Glu Asp Leu Asp

485 490 495

Arg Thr Gly Pro Leu Ser Met Thr Thr Gln Gln Ser Asn Ser Gln Ser

500 505 510

Phe Ser Thr Ser His Glu Gly Leu Glu Glu Asp Lys Asp His Pro Thr

515 520 525

Thr Ser Thr Leu Thr Ser Ser Asn Arg Asn Asp Val Thr Gly Gly Arg

530 535 540

Arg Asp Pro Asn His Ser Glu Gly Ser Thr Thr Leu Leu Glu Gly Tyr

545 550 555 560

Thr Ser His Tyr Pro His Thr Lys Glu Ser Arg Thr Phe Ile Pro Val

565 570 575

Thr Ser Ala Lys Thr Gly Ser Phe Gly Val Thr Ala Val Thr Val Gly

580 585 590

Asp Ser Asn Ser Asn Val Asn Arg Ser Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr

595 600 605

Phe His Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser Asp

610 615 620

Gly His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly

625 630 635 640

Pro Ile Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser

645 650 655

Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn Ser

660 665 670

Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn Ser Gly Asn

675 680 685

Gly Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly Glu Ala Ser

690 695 700

Lys Ser Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser Ser Glu Thr

705 710 715 720

Pro Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu Gln Asn Val

725 730 735

Asp Met Lys Ile Gly Val

740

<210> 13

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Ile Phe Pro Trp Lys Cys Gln Ser Thr Gln Arg Asp Leu Trp Asn

1 5 10 15

Ile Phe Lys Leu Trp Gly Trp Thr Met Leu Cys Cys Asp Phe Leu Ala

20 25 30

His His Gly Thr Asp Cys Trp Thr Tyr His Tyr Ser Glu Lys Pro Met

35 40 45

Asn Trp Gln Arg Ala Arg Arg Phe Cys Arg Asp Asn Tyr Thr Asp Leu

50 55 60

Val Ala Ile Gln Asn Lys Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Glu Lys Thr Leu

65 70 75 80

Pro Phe Ser Arg Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Trp Thr Trp Val Gly Thr Asn Lys Ser Leu Thr Glu Glu Ala Glu

100 105 110

Asn Trp Gly Asp Gly Glu Pro Asn Asn Lys Lys Asn Lys Glu Asp Cys

115 120 125

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130 135 140

Asp Ala Cys His Lys Leu Lys Ala Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys

145 150 155 160

Gln Pro Trp Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Val Glu Ile Ile Asn

165 170 175

Asn Tyr Thr Cys Asn Cys Asp Val Gly Tyr Tyr Gly Pro Gln Cys Gln

180 185 190

Phe Val Ile Gln Cys Glu Pro Leu Glu Ala Pro Glu Leu Gly Thr Met

195 200 205

Asp Cys Thr His Pro Leu Gly Asn Phe Ser Phe Ser Ser Gln Cys Ala

210 215 220

Phe Ser Cys Ser Glu Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ile Glu Glu Thr Thr

225 230 235 240

Cys Gly Pro Phe Gly Asn Trp Ser Ser Pro Glu Pro Thr Cys Gln Val

245 250 255

Ile Gln Cys Glu Pro Leu Ser Ala Pro Asp Leu Gly Ile Met Asn Cys

260 265 270

Ser His Pro Leu Ala Ser Phe Ser Phe Thr Ser Ala Cys Thr Phe Ile

275 280 285

Cys Ser Glu Gly Thr Glu Leu Ile Gly Lys Lys Lys Thr Ile Cys Glu

290 295 300

Ser Ser Gly Ile Trp Ser Asn Pro Ser Pro Ile Cys Gln Lys Leu Asp

305 310 315 320

Lys Ser Phe Ser Met Pro Leu Phe Ile Pro Val Ala Val Met Val Thr

325 330 335

Ala Phe Ser Gly Leu Ala Phe Ile Ile Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys

340 345 350

Lys Gly Lys Lys Ser Lys Arg Ser Met Asn Asp Pro Tyr

355 360 365

Claims

1.T细胞，其特征在于，所述T细胞表达CD62L。

2.根据权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞表达CD44。

3.根据权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD62L的氨基酸序列SEQ ID NO.13所示。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞的CD4基因和/或CD8基因被敲除和/或失活。

5.根据权利要求4所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞经过基因编辑获得。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞经过天然分离获得。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的T细胞，其特征在于，所述的T细胞的β2-微球蛋白、和/或HLA-I类分子共同亚基、和/或CIITA的基因失去功能或缺失。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞为同种异体T细胞。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的T细胞，其特征在于，所述的T细胞还表达HLA-E和/或HLA-G和/或HLA-F。

10.权1-9任意一项所述的T细胞的制备方法，其特征在于，选用以下两种任一方法获得目的细胞:(1)获得T细胞后，采用基因编辑的方法进行CD4和/或CD8基因的敲除和/或失活，感染包含CD62的病毒，获得目的细胞；(2)获得T细胞后，感染包含CD62的病毒，采用基因编辑的方法进行CD4和/或CD8基因的敲除和/或失活，获得目的细胞。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述T细胞为活化的和/或非活化的T淋巴细胞。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的T细胞中的CD4基因和/或CD8基因的敲除或失活时机为：在T细胞扩增之后，或在T细胞扩增之前。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的基因编辑技术是通过电转的方式或非电转的方式改造T细胞。

14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括CRISPR、ZFN、TALEN。

15.权利要求10-14任意一项所述的制备方法所得的T细胞。

16.由权利要求1-9任意一项或15所述的T细胞制备的CAR-T细胞。

17.根据权利要求16所述的CAR-T细胞，其特征在于，CAR-T细胞中的CAR包含有胞外域、跨膜域和胞内信号域。

18.根据权利要求16所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞为同种异体CAR-T细胞。

19.根据权利要求16所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞还表达膜结合的IL15。

20.根据权利要求16所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞还表达分泌细胞因子，所述细胞因子包括IL2、IL7、IL12、IL21、IL15。

21.根据权利要求16所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞还表达且可识别肿瘤微环境中分子的融合蛋白，所述融合蛋白的胞外结构识别PD1、PDL1、SIRPγ、SIRPδ、TIGIT。

22.根据权利要求16项所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR结构可被调控活化或失活，所述调控活化或失活的结构包括Peptide neo-epitope(PNE)、fluorescein(FITC)、10amino acids(5B9 tag)、FITC-HM-3bifunctional molecule(FHBM)and scFv、LeucineZipFv linked to antibody、Streptavidin 2(mSA2)biotin-binding domain。

23.根据权利要求16-22任意一项所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞可识别实体瘤、血液系统肿瘤细胞/组织；所述CAR-T细胞的抗原识别区可以识别包含抗原：CD19、CD20、CD22、CD33、CLL-1(CLEC12A)、CD7、CD5、CD70、CD123、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、Mesothelin、MUC1、CLDN18.2、CDH17、Trop2、BCMA、NKG2D、PDL1、EGFR、EGFRVIII、PSCA、PSMA、MUC16、CD133、GD2、IL13R2、B7H3、Her2、CD30、SLAMF7、CD38、GPC3、WT1或TAG-72。

24.权利要求16所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，选用以下两种任一方法获得目的细胞：

25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，选用以下两种任一方法获得目的细胞：

(1)收集获得T细胞后,感染包含CD62L、CD44和CAR结构的病毒，对感染CAR结构后的T细胞进行RNP电转，获得目的细胞；或

(2)收集获得T细胞后电转RNP该T细胞后，再感染包含CD62L、CD44和CAR结构的病毒，获得目的细胞。

26.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，RNP电转过程中，RNP复合物具体为含有CD4sgRNA和CD8sgRNA以及Cas9蛋白的RNP复合物。

27.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比为1:2。

28.感染权利要求16所述的CAR-T细胞的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含CD62L和CAR结构。

29.根据权利要求28所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含CD62L、CD44和CAR结构。

30.根据权利要求28所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体中选用表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体、RNA载体、质粒中的任一种。

31.含有权利要求1-9任意一项所述的T细胞和/或权利要求16-23任意一项所述的CAR-T细胞的细胞组合物。

32.根据权利要求31所述的细胞组合物，其特征在于，所述细胞组合物中含有的所述T细胞或所述CAR-T细胞的比例以数量计不低于不低于90％，80％，70％或60％。

33.根据权利要求31所述的细胞组合物，其特征在于，所述的细胞组合物可以是经过活化诱导的CIK细胞或NKT细胞。

34.权利要求1-9任意一项所述的T细胞和或权利要求16-23任意一下那个所述的CAR-T细胞和或权利要求28-30任意一项所述的重组载体和或权利要求31-33任意一项所述的细胞组合物在制备细胞治疗药物中的应用。

35.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的T细胞和或权利要求14所述的CAR-T细胞和或权利要求28所述的重组载体和或权利要求31所述的细胞组合物在制备治疗急性淋巴样白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌和/或皮肤癌的药物中的应用。

36.CD62L和/或CD44用于制备CAR-T细胞的活力提升剂中的应用。

37.CD62L和/或CD44用于制备CAR-T细胞分泌的LAG-3和PD-1因子的抑制剂。

38.在制备CAR-T细胞或时，CD62L和/或CD44基因作为肿瘤细胞杀伤的促进剂中的应用，所述CAR-T细胞为常规CAR-T细胞、不表达CD4和/或CD8基因的CAR-T细胞或通用型CAR-T细胞。